DE69225710T3

DE69225710T3 - Anregung von antworten zytotoxischer t-lymphozyten

Info

Publication number: DE69225710T3
Application number: DE69225710T
Authority: DE
Inventors: Syamal San Diego RAYCHAUDHURI; William H. Rancho Santa Fe RASTETTER
Original assignee: Idec Pharmaceuticals Corp
Current assignee: Idec Pharmaceuticals Corp
Priority date: 1991-07-25
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 2004-10-14
Anticipated expiration: 2012-07-25
Also published as: HU9400202D0; JPH06509344A; NO940218L; CA2113720A1; DE69225710D1; BG98410A; OA09880A; DE69225710T2; WO1993001831A1; RU2129439C1; FI940335A0; PH30906A; BR9206310A; KR100198868B1; SK282920B6; EP0596032B1; SK8994A3; ZA925614B; DK0596032T3; AU666127B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die zum Induzieren von cytotoxischen, T-Zell-vermittelten Antworten in Menschen und domestizierten oder landwirtschaftlichen Tieren nützlich sind.
Cytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) werden für den wichtigsten Abwehrmechanismus eines Wirts als Reaktion auf eine Vielzahl von Virusinfektionen und neoplastisches oder krebsartiges Wachstum gehalten. Diese Zellen eliminieren infizierte oder transformierte Zellen, indem sie Antigenfragmente in Verbindung mit verschiedenen Molekülen (als Moleküle der MHC-Klasse I bezeichnet) auf den infizierten oder transformierten Zellen erkennen. CTLs können experimentell durch cytoplasmatisches Beladen mit bestimmten löslichen Antigenen innerhalb spezifischer Zellen erzeugt werden. Eine Immunisierung mit dem löslichen Antigen allein ist im allgemeinen für eine spezifische Induktion cytotoxischer T-Lymphozyten nicht ausreichend.
Ein Verfahren, durch welches eine CTL-Antwort induziert werden kann, schließt die Anwendung rekombinanter Verfahrenstechniken ein, um die kritischen Bestandteile eines fraglichen Antigens in das Genom eines gutartigen infektiösen Agens zu inkorporieren. Das Ziel einer solchen Strategie ist es, Antigen-spezifische Antworten cytotoxischer T-Lymphozyten auf das gewünschte Epitop zu erzeugen, indem der Wirt einer milden, sich selbst limitierenden Infektion unterworfen wird. Chimäre Vektoren wurden beschrieben unter Verwendung von Vaccinia, Polio, Adeno- und Retroviren, sowie von Bakterien wie Listeria und BCG. Zum Beispiel beschreiben Takahashi et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3105, 1988, die Verwendung eines rekombinanten Vaccinia-Virus, welches das HIV-Hüllgen gp160 exprimiert, als ein mögliches Werkzeug für die Induktion von cytotoxischen T-Lymphozyten.
Ein zweites Verfahren, durch welches eine zellvermittelte Antwort induziert werden kann, schließt die Verwendung von Adjuvanzien ein. Das Fachgebiet scheint zwar übervoll von Diskussionen bezüglich der Verwendung von Adjuvanzien zu sein, doch ist auf diesem Fachgebiet unklar, ob eine zellvermittelte Immunität induziert worden ist und ob eine solche zellvermittelte Immunität eine cytotoxische T-Lymphozyten-Antwort einschließt. Die folgenden sind jedoch für verschiedene Publikationen auf diesem Gebiet repräsentativ.
Stover et al., 351 Nature 456, 1991, beschreibt eine CTL-Antwort auf β-Galaktosidase unter Verwendung von rekombinantem, ein β-Galaktosidase-Gen enthaltendem BCG. Es wurde aber keine derartige Antwort unter Verwendung von inkomplettem Freund-Adjuvans und β-Galaktosidase nachgewiesen.
Mitchell et al., 8 J. Clinical Oncoloay 856, 1990, beschreiben die Behandlung von Patienten mit metastasierendem Melanom mit einem als "DETOX" bezeichneten Adjuvans und allogeneischen Melanomlysaten, die während eines Zeitraums von sechs Wochen fünfmal verabreicht wurden. Bei einem kleinen Anteil dieser Patienten wurde eine Zunahme der cytotoxischen T-Zellen beobachtet. Die Autoren beschreiben einen Bedarf nach einer erhöhten Erzeugung von cytotoxischen T-Lymphozyten und schlagen eine kombinierte Therapie von Adjuvans mit Interleukin-2 sowie eine Vorbehandlung mit Cyclophosphamid vor, um den Spiegel an tumorspezifischen T-Suppressorzellen, die existieren könnten, zu vermindern. DETOX enthält detoxifiziertes Endotoxin (Monophosphoryl-Lipid A) aus Salmonella minnesota, Zellwandskelette von Mycobacterium phlei, Squalenöl und Emulgator.
Allison und Gregoriadis, 11, Immunology Today 427, 1990, merken an, dass das einzige Adjuvans, das "autorisiert für eine Verwendung" in menschlichen Impfstoffen ist, Aluminiumsalze (Alaun) sind, was nicht in gleichbleibender Weise eine zellvermittelte Immunität hervorruft. Allison und Gregoriadis stellen fest: "Es gibt [hier] daher einen Bedarf nach der Entwicklung von Adjuvanzien mit der Wirksamkeit von komplettem Freund-Adjuvans, doch ohne dessen verschiedenen Nebenwirkungen, wie Granulome". Sie stellen weiterhin fest, dass drei mögliche Strategien existieren, zum Beispiel die Verwendung von Liposomen, die Verwendung von Adjuvanzien, die als immunstimulierende Komplexe bezeichnet werden (ISCOMs, welche Saponin oder Quil A (ein Triterpenoid mit zwei Kohlenhydratketten), Cholesterin und Phosphatidylcholin einschließen), welche für eine Verwendung in einem Impfstoff gegen Influenza für Pferde autorisiert sind (Morein et al., Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenum Press, 153); und die Verwendung einer Emulsion (SAF) von Squalen oder Squalan (mit oder ohne ein Pluronic-Mittel) und Muramyldipeptid (MDP). SAF wird das Hervorrufen einer zellvermittelten Immunität bei Mäusen nachgesagt, obschon "lange davon ausgegangen wurde, dass Untereinheits-Antigene keine cytotoxischen T-Zell-(CTL)-Antworten hervorrufen können".
Takahashi et al., 344 Nature 873, 1990, beschreiben die Induktion von einer Restriktion durch Klasse II-unterworfenen Helfer- und cytotoxischen T-Lymphozyten durch die Verwendung von ISCOMs mit einer einzelnen subkutanen Immunisierung bei Mäusen. Sie stellen fest, dass Freund-Adjuvans, inkomplettes Freund-Adjuvans und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung keine cytotoxische T-Lymphozyten-Aktivität gegen die Ziele, an welchen sie interessiert waren, hervorriefen. Sie stellen fest, dass sie im Gegensatz zu den Ergebnissen mit anderen Formen von exogenem löslichen Proteinantigen gezeigt haben, dass es möglich ist, Antigen-spezifische, einer Restriktion durch MHC-Klasse I untennrorfene CD8⁺-, CD4^–-CTL durch eine Immunisierung mit exogenem intaktem Protein unter Verwendung von ISCOMs^* zu primen bzw. hervorzurufen. Sie stellen ebenfalls fest, dass die beschriebenen Experimente die Möglichkeit nahelegen, humane CTL unter Verwendung von ISCOMs, die HIV-Proteine enthalten, hervorzurufen und dass auf ISCOM beruhende Impfstoffe das lange gesuchte Ziel einer Induktion sowohl von CTL als auch von Antikörpern durch ein gereinigtes Protein erreichen könnten.
Byars and Allison, 5 Vaccines 223, 1987, beschreiben die Verwendung von SAF*-1, welches TWEEN* 80, PLURONIC* L121 und Squalen oder Squalan mit oder ohne Muramyldipeptid einschließt, und legen die Folgerung aus ihren Daten nahe, dass die Formulierung mit Muramyldipeptid für menschliche und tierärztliche Impfstoffe nützlich sein wird. Booster-Injektionen des Adjuvans wurden ohne das Muramyldipeptid bereitgestellt. Das Muramyl, SAF, ISCOM, TWEEN und PLURONIC sind als Warenzeichen eingetragen. Es heißt, dass das Muramyldipeptid die Antikörperproduktion gegenüber der Verwendung des Adjuvans ohne Muramyldipeptid in signifikanter Weise erhöht. Die zellvermittelte Immunität wurde durch Hauttests, um die Induktion von T-Helferzellen zu bestimmen, als Hypersensibilität vom verzögerten Typ gemessen. Diese Hypersensibilität war stärker und länger anhaltend, wenn Muramyldipeptid im Adjuvans enthalten war. Ähnliche Adjuvanzien sind beschrieben bei Allison et al., US-Patent Nr. 4.770.874 (wo festgestellt wird, dass die Kombination von Muramyldipeptid und Pluronic-Polyol für das Hervorrufen einer starken zellvermittelten und einer humoralen Antwort gegen Eieralbumin wesentlich ist); Allison et al., US-Patent Nr. 4.772.466; Murphy-Corp. et al., 246 Science 1293, 1989 (wo festgestellt wird, dass die Verwendung von kombinierten Adjuvanzien mit Muramyldipeptid die Induktion sowohl der humoralen als auch der zellulären Waffen der Immunantwort verstärken könnte); Allison und Byars, 87 Vaccines 56, 1987 (wo festgestellt wird, dass die zellvermittelte Immunität durch SAF (mit Muramyldipeptid) hervorgerufen wird, wie gezeigt durch eine Hypersensibilität vom verzögerten Typ, durch proliferative Antworten von T-Zellen auf Antigene, durch die Herstellung von Interleukin-2 und durch einer genetischen Restriktion unterworfene spezifische Lyse von Zielzellen, die das immunisierende Antigen tragen); Allison und Byars, Immunopharmacology of Infectious Diseases: Vaccine Adjuvants and Modulators of Non-Specific Resistance 191–201, 1987; Morgan et al., 29 J. Medical Virology 74, 1989; Kenney et al., 121 J. Immunological Methods 157, 1989; Allison und Byars, 95 J. Immunological Methods 157, 1986 (wo gezeigt wurde, dass Aluminiumsalze und Mineralölemulsionen die Bildung von Antikörpern erhöhen, nicht aber die zellvermittelte Immunität; und wo gezeigt wurde, dass Muramyldipeptid-Formulierungen eine zellvermittelte Immunität hervorriefen); Byars et al., 8 Vaccine 49, 1990, wo festgestellt wird, dass ihre Adjuvans-Formlierung die humoralen Antworten in merklicher Weise erhöht und in einem geringeren Maß die zellvermittelten Reaktionen gegenüber dem Antigen Influenza-Haemagglutinin erhöht), Allison und Byars, 28 Molecular Immunology 279, 1991, wo festgestellt wird, dass die Funktion des Muramyldipeptids das Induzieren der Expression von Zytokinen und eine Erhöhung der Expression von Haupt-Histokompatibilitäts-(major histocompatibility – MHC)-Genen ist und dass bessere Antikörper- und zelluläre Antworten erhalten wurden als mit anderen Adjuvanzien und dass man hofft, festzustellen, ob ähnliche Strategien beim Menschen wirksam sind), Allison und Byars, Technology Advances in Vaccine Development 401, 1988 (welches eine zellvermittelte Immunität unter Verwendung von SAF beschreibt), Epstein et al., 4 Advance Drug Delivery Reviews 223, 1990 (welches einen Überblick über verschiedene Adjuvanzien, die bei der Herstellung von Impfstoffen verwendet werden, gibt), Allison und Byars, 95 J. Immunological Methods 157, 1986 (wo festgestellt wird, dass die Zugabe des Muramyldipeptids zum Adjuvans die zellvermittelten Antworten auf eine Vielzahl von Antigenen, einschließlich monoklonaler Immunglobuline und Virus-Antigene, merklich erhöht), und Morgan et al., 29 J. Medical Virology 74, 1989 (worin die Verwendung von SAF-1 für die Herstellung eines Impfstoffes gegen den Epstein-Barr-Virus beschrieben wird).
Kwak et al., Idiotype Networks in Biology and Medicine, Elsevier Science Publishers, S. 163, 1990, beschreiben die Verwendung von SAF ohne Muramyldipeptid als ein Adjuvans für einen B-Zell-Lymphom-Idiotyp in einem Menschen. Genauer gesagt wurde eine Emulsion von Pluronic L121, Squalan und 0,4% TWEEN-80 in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit dem Idiotyp verabreicht. Sie stellen fest: "Die Zugabe eines Adjuvans sollte ..... die humoralen Antworten weiter erhöhen und könnte außerdem die Induktion zellulärer Antworten erleichtern".
Zu weiteren immunologischen Präparationen zählen: Liposome (Allison et al., US-Patente Nrn. 4.053.585 und 4.117.113); cyclische Peptide (Dreesman et al., US-Patent Nr. 4.778.784); komplettes Freund-Adjuvans (Asherson et al., 22 Immunology 465, 1972; Berman et al., 2 International J. Cancer 539, 1967; Allison, 18 Immunopotentiation 73, 1973; und Allison, Non-Specific Factors Influencing Host Resistance 247, 1973); ISCOMs (Letvin et al., 87 Vaccines 209, 1987); nicht-ionische Blockpolymer-Agenzien enthaltende Adjuvanzien, hergestellt mit Mineralöl, einem oberflächenaktiven Mittel und TWEEN 80 (Hunter und Bennett, 133 J. Immunology 3167, 1984; und Hunter et al., 127 J. Immunology 1244, 1981); aus Mineralöl und Emulgator zusammengesetzte Adjuvanzien mit oder ohne abgetötete Mycobakterien (Sanchez-Pescador et al., 141 J. Immunology 1720, 1988), und andere Adjuvanzien, wie etwa ein lipophiles Derivat von Muramyltripeptid und ein kovalent mit einem rekombinanten Protein verknüpftes Muramyldipeptid (ebenda).
Zusammenfassung der Erfindung
Der Anmelder hat sichere und vorteilhafte Zusammensetzungen entdeckt, durch welche CTL-Antworten beim Menschen und domestizierten oder landwirtschaftlich wichtigen Tieren induziert werden können. Die Zusammensetzungen umfassen eine Antigen-Formulierung, die eine geringe oder keine Toxizität für Tiere aufweist, und der ein immunstimulierendes Peptid fehlt (z. B. Muramyldipeptid), dessen Anwesenheit die gewünschte zelluläre Antwort vermindern würde. Darüber hinaus sind die Zusammensetzungen einfach anzuwenden und erfordern kein übermäßiges Arbeiten in vivo, um existierende Zellen durch rekombinante DNA-Techniken zu verändern, um sie immunogen zu machen. Diese Feststellung ist überraschend, da es nicht zu erwarten stand, dass eine solche CTL-Antwort durch die Verwendung einer solchen Antigen-Formulierung, der immunstimulierende Peptide oder deren Äquivalente fehlen, induziert werden könnte. Die Befunde es Anmelders ermöglichen die Verwendung dieser Antigen-Formulierungen bei einem breiten Spektrum von krankhaften Zuständen oder als prophylaktische Mittel. Die Verabreichung einer solchen Antigen-Formulierung kann zum Beispiel der Behandlung viraler Erkrankungen dienen, bei denen eine CTL-Antwort wichtig ist, zum Beispiel bei der Behandlung einer HIV-Infektion oder von Influenza. Sie kann auch ausgedehnt werden auf die Verwendung bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen, Krebs, parasitären Infektionen und dergleichen. Als ein prophylaktisches Mittel ist die Antigen-Formulierung mit einem geeigneten Antigen für die Verhütung einer Infektion durch die Viren, die für die zuvor erwähnten viralen rkrankungen verantwortlich sind, insbesondere für die Prophylaxe einer HIV-Infektion und darüber hinaus für eine Prophylaxe bei Patienten mit einem Krebsrisiko, zum leispiel nach Resektion eines Primärtumors, nützlich.
Die Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, umfassend ein Antigen, gemischt rnit einer mikrofluidisierten Antigen-Formulierung, welche besteht aus:

(a) einem stabilisierenden Detergens, welches Polysorbat 80 ist,
(b) einem Mizellen-bildenden Mittel, welches Poloxamer 401 ist, und
(c) einem bioabbaubaren und biokompatiblen Öl, welches Squalan ist,

Die Erfindung stellt des weiteren Zusammensetzungen der Erfindung zur Verwendung bei der therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung eines Menschen oder eines domestizierten (z. B. Katze oder Hund) oder eines landwirtschaftlichen Tieres (z. B. eines Pferdes, einer Kuh oder eines Schweines) durch das Induzieren einer CTL-Antwort bereit.
Der Antigen-Formulierung fehlt jegliche immunstimulierende Peptidkomponente, oder sie weist hinreichend niedrige Spiegel eines solchen Bestandteils auf, so dass die gewünschte zelluläre Antwort nicht vermindert wird. Die Formulierung wird als eine stabile Öl-in-Wasser-Emulsion bereitgestellt, d. h. jeder der verschiedenen Bestandteile wird so ausgewählt, dass die Emulsion in dem Zustand einer Emulsion für die Dauer Fron wenigstens einem Monat, und bevorzugter von mehr als einem Jahr, ohne Phasentrennung verbleiben wird. Das Antigen und die Antigen-Formulierung werden zusammengemischt, um eine Mischung durch Mikrofluidisierung zu bilden. Die Zusammensetzung kann dem Tier in einer ausreichenden Menge, um eine CTL-Antwort in dem Tier zu induzieren, verabreicht werden. Eine solche Verabreichung ist nur einmal erforderlich.
Das "stabilisierende Detergens" ermöglicht den Bestandteilen der Emulsion, als eine stabile Emulsion zu verbleiben. Bei dem Detergens handelt es sich um Polysorbat 80 (TWEEN) (Sorbitan-mono-9-octadecenoat-poly(oxy-1,2-ethandiyl); hergestellt von ICI Americas, Wilmington, DE). Das Detergens wird gewöhnlich in einer Menge von etwa 0,05 bis 0,5%, bevorzugter von etwa 0,2%, bereitgestellt.
Das "Mizellen-bildende Mittel" ist in der Lage, die mit den anderen Bestandteilen gebildete Emulsion derart zu stabilisieren, dass eine mizellenartige Struktur gebildet wird. Bei dem Mittel handelt es sich um Poloxamer 401 (PLURONIC L121). Das Mittel wird bevorzugt in einer Menge zwischen 0,001 und 10%, am bevorzugtesten in einer Menge zwischen 0,001 und 5%, bereitgestellt.
Das Öl fördert das Zurückhalten des Antigens in der Öl-in-Wasser-Emulsion, d. h. stellt ein Vehikel für das gewünschte Antigen bereit. Bei dem öl handelt es sich um Squalan. Das Öl wird vorzugsweise in einer Menge zwischen 1 und 10%, am bevorzugtesten zwischen 2,5 und 5%, bereitgestellt. Es ist wichtig, dass das Öl bioabbaubar und biokompatibel ist, so dass der Körper das Öl im Laufe der Zeit abbauen kann und somit keine schädlichen Nebenwirkungen nach Verwendung des Öls, z. B. Granulome, sichtbar werden.
Es ist bei der oben genannten Formulierung wichtig, dass eine Peptidkomponente, insbesondere ein Muramyldipeptid (MDP) fehlt. Ein derartiges Peptid wird die Induktion einer CTL-Antwort stören, falls es in einer größeren Menge als etwa 20 Mikrogramm pro normaler humaner Formulierungs-Verabreichung bereitgestellt wird. Es wird bevorzugt, dass solche Peptide trotz ihrer offensichtlichen Stimulation des humoralen Zweigs des Immunsystems vollständig von der Antigen-Formulierung abwesend sind. Das heißt, der Anmelder hat festgestellt, dass diese Peptide, obschon sie die humorale Antwort erhöhen können, von Nachteil sind, wenn eine cytotoxische T-Lymphozyten-Antwort gewünscht wird.
Der Anmelder glaubt, dass die obenstehenden Formulierungen in einer signifikanten Weise vorteilhaft gegenüber früheren Formulierungen (einschließlich ISCOMs, DETOX (eingetragendes Warenzeichen) und SAF) für die Verwendung bei Menschen sind. Anders als solche Formulierungen schließt die vorliegende Formulierung sowohl ein Mizellen-bildendes Mittel ein, als sie auch keine Peptide, Zellwandskelette oder bakterielle Zellbestandteile aufweist. Die vorliegende Formulierung induziert ebenfalls eine CTL-Antwort, die mit den früheren Formulierungen entweder nicht auftritt oder im Vergleich zu diesen Formulierungen wesentlich erhöht wird.
Mit "nicht-toxisch" ist gemeint, dass eine geringe oder keine Nebenwirkung der Antigen-Formulierung in dem behandelten Tier oder Menschen beobachtet wird. Fachleute mit üblicher Sachkenntnis im medizinischen oder tierärztlichen Fachbereich werden erkennen, dass dieser Begriff eine weite Bedeutung hat. Zum Beispiel kann in einem im wesentlichen gesunden Tier oder Mensch nur eine geringe Toxizität toleriert werden, wohingegen bei einem an einer tödlichen Erkrankung (mit einer Lebenserwartung von weniger als etwa drei Jahren) leidenden Menschen eine wesentlich höhere Toxizität toleriert werden kann.
Bei bevorzugten Ausführungsformen dient die Antigen-Formulierung zur Anwendung als Einzeldosis-Verabreichung des Gemischs; die Formulierung dient zur Verwendung bei der Behandlung eines Menschen oder Tieres, der oder das mit einem Virus infiziert ist und an einem oder mehreren Symptomen (wie im allgemeinen durch Ärzte im relevanten Gebiet festgestellt wird) einer Infektion durch das Virus leidet, wobei die Antigen-Formulierung für den Menschen oder das Tier nicht toxisch ist. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen wird das Antigen ausgewählt aus den antigenen Abschnitten der HIV-Antigene: gp120, gag, pol, Nef, Tat und Rev; den Malaria-Antigenen: CS-Protein und dem Sporozoiten-Oberflächen-Protein 2; den Hepatitis-B-Antigenen: Pre-S1, Pre-S2, HBc Ag und HBe Ag; den Influenza-Antigenen: HA, NP und NA; den Hepatitis-A-Oberflächen-Antigenen; den Herpes-Virus-Antigenen: EBV gp340, EBV gp85, HSV gB, HSV gH, dem frühen Proteinprodukt von HSV, Cytomegalovirus gB, Cytomegalovirus gH, und dem IE-Protein gp72; den Respiratory-Syncytial-Virus-Antigenen: F-Protein, G-Protein und N-Protein; und den Tumor-Antigenen Karzinom CEA, Karzinom-assoziiertem Mucin, Karzinom P21, Karzinom P53, Melanom MPG, Melanom p97, und dem Karzinom-Onkogen-Produkt Neu, dem Karzinom-Genprodukt p53, dem als MAGE bezeichneten Melanom-Antigen und dem mutierten p21 ras-Protein, welches in einer Vielzahl von malignen Tumoren präsentiert wird.
Gemäß anderen verwandten Aspekten stellt die Erfindung Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung eines Patienten vor, der mit dem HIV-Virus infiziert ist, der an Malaria leidet, der an Influenza leidet, der an Hepatitis leidet, der an einem Krebs leidet, der mit einem Herpes-Virus infiziert ist, oder der mit dem Respiratory-Syncytial-Virus infiziert ist, wobei die Zusammensetzungen ein geeignetes Antigen (z. B.
gewählt aus den vorstehend aufgeführten), gemischt mit einer der vorstehend genannten Antigen-Formulierungen, beinhalten.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen ersichtlich werden.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Zunächst werden kurz die Zeichnungen beschrieben werden.
Zeichnungen
1A bis 1C zeigen graphische Darstellungen von Daten, die eine CTL-Induktion durch verschiedene Ovalbumin-Formulierungen vergleichen: E : T steht für das Verhältnis von Effektor zu Ziel in allen Figuren.
2A und 2B zeigen graphische Darstellungen von Daten, die eine CTL-Induktion durch verschiedene β-Galaktosidase-Formulierungen vergleichen.
3 zeigt eine graphische Darstellung von Daten, die eine CTL-Induktion durch Ovalbumin in einem Liposom und in einer Antigen-Formulierung vergleicht.
4 und 5 zeigen graphische Darstellungen von Daten, die die Wirkung einer Depletion von CD4- und CD8-Zellen auf eine CTL-Induktion zeigen.
6 zeigt eine graphische Darstellung von Daten, die eine CTL-Induktion durch eine Mischung von Pluronic und TWEEN und einem Antigen zeigt.
7 zeigt eine graphische Darstellung von Daten, die eine CTL-Induktion mit einer Mischung von Squalan und TWEEN und einem Antigen zeigt.
8 zeigt eine graphische Darstellung von Daten, die die CTL-Induktion durch eine Mischung von Squalan und Pluronic und einem Antigen zeigt.
9 zeigt eine graphische Darstellung der Induktion von Anti-gp120IIIb-Antikörpern in Affen mit verschiedenen Antigen-Formulierungen; und
10A bis 10B zeigen graphische Darstellungen von Daten, die die für gp120 spezifische CTL-Antwort in Affen, die mit Vaccinia-gp120 und gp120-AF immunisiert wurden, vergleichen.
Antigen-Formulierung
Bei dieser Erfindung nützliche Antigen-Formulierungen sind oben allgemein beschrieben. Fachleute des Gebiets werden bei üblicher Sachkenntnis erkennen, dass äquivalente Formulierungen ohne weiteres herstellbar sind und erwartet werden kann, dass sie gleichwertige Eigenschaften bei der Induktion einer CTL-Antwort zeigen. Solche Formulierungen lassen sich ohne weiteres auf ihre Eigenschaften unter Anwendung von Verfahrensweisen entsprechend den in den nachstehenden Beispielen beschriebenen testen.
Es folgen Beispiele der Erfindung unter Verwendung einer Antigen-Formulierung (AF), die sich aus etwa 15% Squalan, 0,6% TWEEN 80 und 0,0045–3,75% Pluronic in einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (mit der Bezeichnung STP) zusammensetzt. Genauer gesagt enthielt eine Emulsion der AF: 150 mg Squalan, 0,045–37,5 mg Poloxamer 401 (PLURONIC L121), 6 mg Polysorbat 80 (TWEEN 80), 0,184 mg Kaliumchlorid, 0,552 mg einwertiges Kaliumphosphat, 7,36 mg Natriumchlorid, 3,3 mg zweiwertiges Natriumphosphat (wasserfrei), pro 1 ml Wasser, pH 7,4. Diese Emulsion wurde unter Anwendung eines Standardverfahrens mikrofluidisiert (Microfluidics Modell M110F) mit einem Rückdruckmodul bei 11–14.000 psi, unter allmählicher Rückkehr auf atmosphärischen Druck, Kühlen und Packen in Nasseis.
Bei anderen Beispielen wurde das Antigen mit der mikrofluidisierten Mischung aus Squalan (S), Pluronic (P) und TWEEN 80 (T) gemischt, um eine Endkonzentration von 5% Squalan, 0,2% TWEEN 80 bzw. 0,0015–1,25% Pluronic zu ergeben. Um die Subkomponenten, die für die Induktion einer Antigen-spezifischen Immunantwort erforderlich sind, zu bestimmen, wurden Squalan-TWEEN 80, Pluronic-TWEEN 80 oder Squalan-Pluronic bei denselben Konzentrationen wie für die Mischung aus drei Bestandteilen hergestellt. Pluronic, Squalan oder TWEEN 80 wurden auch einzeln hergestellt, um die Wirkung des einzelnen Bestandteils auf die CTL-Induktion zu bestimmen. Substitutionen mit TWEEN 20, TWEEN 40 oder Zwittergent für TWEEN 80 wurden ebenfalls vorgenommen, um die Wirkung verschiedener Derivate von TWEEN auf die CTL-Induktion in dem ova-System zu bestimmen. Substitutionen von Squalan in der Formulierung mit drei Bestandteilen wurden durch Eicoson oder Triconton vorge nommen, und eine Substitution für das Copolymer Pluronic in derselben Formulierung mit drei Komponenten wurde durch PEG 1000, Pluronic L62LF und die Tetronics 1501 und 150R1 vorgenommen. Als Formulierungen aus zwei Bestandteilen wurden verschiedene Analoga in verschiedenen Kombinationen gemischt und hinsichtlich einer für ova spezifischen CTL-Induktion getestet. Sie sind: eine Mischung von Cholesterin – TWEEN 80, Squalan – TWEEN 20, Pristan – TWEEN 80 oder Olivenöl – TWEEN 80. Für eine Stabilisierungsstudie wurde die mikrofluidisierte Mischung von Squalan – TWEEN 80 mit Dextrose zu einer Endkonzentration von 5% gemischt. In allen Fällen wurden die Kombinationen der Arzneimittelträger in einem Mikrofluidisierer gemischt, um eine stabile Emulsion herzustellen. In einigen Experimenten wurden die Formulierungen aus zwei Bestandteilen mit verschiedenen Konzentrationen von MDP für Induktionen der CTL- und der humoralen Antwort gemischt. Tabelle 1 beschreibt eine umfassende Liste der verschiedenen in dieser Untersuchung verwendeten Formulierungen. Lediglich die STP-Formulierung befindet sich innerhalb des Rahmens der Erfindung, weshalb die Ergebnisse für die anderen Formulierungen zu Vergleichszwecken angegeben sind.
TABELLE 1
Die Syntex-Adjuvans-Formulierung (mikrofluidisiert, SAFm) wurde als eine Adjuvans-Kontrolle verwendet und besteht aus zwei Teilen. Teil 1 besteht aus Phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend eine Endkonzentration von 5% Squalan, 1,25% Pluronic und 0,2% TWEEN 80 (Vehikel oder 1-SAF). Teil II besteht aus N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (Thr-MDP), einem Derivat des Zellwandbestandteils von Mycobacterium. Zum Zweck einer Immunisierung wird das Antigen mit dem mikrofluidisierten Vehikel (Teil 1) gemischt, um eine homogene Emulsion zu erhalten. MDP wird zugegeben, um SAFm zu fertigen, und kurz gevortext. Die MDP-Konzentration in der Mischung wurde variiert, um zu bestimmen, ob es eine Optimalkonzentration für eine CTL-Induktion gab. Als eine Adjuvans-Kontrolle wurden Mäuse ebenfalls mit löslichen Antigenen, gemischt mit Alaun gemäß der Gebrauchsanweisung des Herstellers (Pierce Chemical, Rockford, IL) oder mit komplettem Freund-Adjuvans (CFA), immunisiert.
Die STP-Antigen-Formulierung wird für eine Induktion der cytotoxischen T-Lymphozyten-Antworten in Mäusen verwendet. Fachleute werden bei üblicher Sachkenntnis bemerken, dass ein solches Mäuse-Modell darauf hindeutet, dass äquivalente Experimente oder Behandlungen in ähnlicher Weise cytotoxische T-Lymphozyten-Antworten in Menschen, in domestizierten oder in landwirtschaftlichen Tieren induzieren werden. Die Menge der Antigen-Formulierung und des Antigens, welches nützlich ist, um die gewünschte zelluläre Antwort zu erzeugen, kann empirisch durch Standardverfahren, wie Fachleuten des Fachgebietes bei üblicher Sachkenntnis bekannt, ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden. Daher können, falls es gewünscht wird, die Nebenwirkungen der Behandlung mit einer solchen Mischung zu minimieren, Fachleute bei üblicher Sachkenntnis einen Minimalspiegel einer solchen Mischung zur Verabreichung an einen Menschen, ein domestiziertes oder ein landwirtschaftliches Tier bestimmen, um eine CTL-Antwort hervorzurufen und dadurch eine Immunität gegen ein gewünschtes Antigen zu erzeugen. Bei normaler Verwendung wird eine solche Mischung durch ein beliebiges aus einer Anzahl von Standardverfahren injiziert, besonders bevorzugt ist jedoch eine intramuskuläre Injektion an einem Ort, welcher es der Emulsion gestatten wird, in einer stabilen Form während eines Zeitraums von einigen Tagen oder einigen Wochen zu verbleiben.
Methoden
Die folgenden Materialien und Methoden wurden in den nachstehend angegebenen Beispielen eingesetzt, falls nicht anders angemerkt:
Mäuse
Weibliche C57BL/6 (H-2^b)- und BALB/c (H-2^d)-Mäuse wurden von Harlen Spraque (San Diego, Kalifornien) erworben.
Antigene
Ovalbumin (ova, Güteklasse VII, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde in der nativen Form verwendet. β-Galaktosidase (β-gal, Güteklasse VIII, BRL) wurde in einer nativen Form und nach Kochen in 1 M NaOH während 2 Min., um einen alkalischen Verdau zu ergeben, verwendet. Rekombinantes gp120 wurde von American Biotechnology erworben.
Tumorzellen und Transfektanten
Die verwendeten Tumorzellen waren die Ia^–-Linien EL4 (C57BL/6, H-2^b Thymom) und P815 (DBA/2, H-2^d Mastozytom). Die Ableitung der ova-erzeugenden EL4-Transfektante EG7-ova ist zuvor von Moore et al., 54 Cell 777, 1988, beschrieben worden. Die β-gal-erzeugende Transfektante P13.1 wurde durch eine Elektroporation von 10⁷ P815-Zellen in 1 ml Phosphat-gepufFerter Kochsalzlösung (PBS) mit 10 mg an mit PstI linearisiertem pCH110 (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) und 1 mg mit PvuI linearisiertem pSV2 neo (Southern et al., 1 J. Mol. Appl. Genet. 327, 1982), gefolgt von einer Selektion in 400 μg/ml des Antibiotikums G418, abgeleitet. Die Transfektante C3-4 wurde von dem BALB/c-Hybridom Igm 662 durch Transfizieren mit einem das β-gal-Gen, fusioniert mit dem dritten und vierten Exon der IgM-Schwerkette, kodierenden Plasmid (Rammensee et al., 30 Immunogenetics, 296, 1989) abgeleitet. Der gp160IIIb exprimierende 3T3-Fibroblast 15–12 wurde von Dr. Germain vom NIH (Bethesda, MD) bereitgestellt. Die K^b-transfizierte L-Zelllinie wurde von Dr. Carbone, Monash University, Australien, bereitgestellt. Die mit D^d und L^d transfizierten L-Zelllinien wurden von Dr. Ted Hensen, Washington University, St. Louis, bereitgestellt.
Immunisierung
Mäuse wurden intravenös mit 200 μl einer Suspension von 25 × 10⁶ Splenozyten nach einer cytoplasmatischen Beladung, wie von Moore et al. supra und Carbone et al., J. Exp. Med. 169: 603, 1989, beschrieben, immunisiert. Für eine Immunisierung mit der ova-Antigen-Formulierung oder der β-Gal-Antigen-Formulierung wurden 30 μg jedes Protein-Antigens pro Maus subkutan in den Fußballen und die Schwanzbasis injiziert.
Jede Injektion besteht aus 67 μl der mikrofluidisierten Antigen-Formulierung (hergestellt nach Standardverfahren) und 30 μg des Protein-Antigens in einem Endvolumen von 200 μl. Das Endvolumen wurde mit HBSS vervollständigt, siehe Handbuch von Whittaker (Welkersville, MD). MDP wurde in Konzentrationen zwischen 0 und 300 μg bereitgestellt. Wo angegeben, wurden die Mäuse mit löslichen Antigenen in CFA oder in Alaun in einem Gesamtvolumen von 200 μl immunisiert.
Stimulierung von Effektorpopulationen in vitro
Milzzellen (30 × 10⁶) von normalen oder von immunisierten Mäusen, welche wenigstens 14 Tage zuvor geprimt bzw. sensibilisiert worden waren, wurden mit 1,5 × 10⁶ EG7-ova (bestrahlt mit 20 000 rad) für Antworten gegen ova oder mit 1,5 × 10⁶ C3-4-Zellen (bestrahlt mit 20 000 rad) für Antworten gegen β-gal in 24-Well-Platten bei 37°C in 7% CO₂/Luft inkubiert. Alle Gewebekulturen wurden in einem Vollmedium, bestehend aus IMDM-Medium, siehe Handbuch von Whittaker (Welkersville, MD), ergänzt mit 10 fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM Glutamin, Gentamycin und 2 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol, durchgeführt. Für die Depletionsexperimente in vitro wurden in vivo-geprimte oder in vitro-stimulierte Milzzellen mit monoklonalen Antikörpern (mAbs) RL.172 (Anti-CD4) oder mAbs 3.168 (Anti-CD8) zur Entfernung von CD4⁺- oder CD8⁺-T-Zellen behandelt (Sarmiento et al., 125 J. Immunol. 2665, 1980, und Ceredig et al., 314 Nature 98, 1985). Der mAb RL.172 und der mAb 3.168 wurden von Dr. Jonathan Sprent in der Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA, erhalten.
Milzzellen (30 × 10⁶) von normalen oder von immunisierten Mäusen, welche wenigstens 21 Tage zuvor geprimt worden waren, wurden mit 1,5 × 10⁶ 15–12-Zellen (behandelt mit 200 μg Mitomycin C während 45 Minuten pro 10⁸-Zellen) oder mit 500 μg 18IIIb-Peptid, enthaltend das dominante CTL-Epitop, in Balb/c-Mäusen in komplettem IMDM-Medium inkubiert (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), enthaltend 10% vorgescreentes FCS (ICN Flow, ICN Biochemicals Inc., Costa Mesa, CA), 2 mM Glutamin, Gentamycin und 2 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol. Für die Stimulierung in vitro mit Peptiden, wurden Milzzellen in komplettem IMDM, enthaltend 5% ConA-Überstand, kultiviert.
Für die Depletionsexperimente wurden in vivo geprimte oder in vitro stimulierte Milzzellen mit den mAbs RL.172 (Anti-CD4) oder mAbs 3.168 (Anti-CD8) in Anwesenheit gering tox. Komplements vom Kaninchen (Cederlane Laboratories, Ltd., Hornby Ontario, Canada) für eine Entfernung von CD4⁺ oder CD8⁺-T-Zellen (22, 23) behandelt. Der mAb RL.172 und der mAb 3.168 waren ein Geschenk von Dr. Jonathan Sprent in der Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA.
Cytotoxizitäts-Assay
Zielzellen (1 × 10⁶) wurden mit 100 μCi [⁵¹Cr]-Natriumchromat 60 Minuten lang markiert. Für die mit Peptid gepulsten Ziele wurden 50 μl einer Peptidlösung von 1 mg/ml in HBSS während des Markierens der Ziele mit ⁵¹Cr zugegeben. Nach dem Waschen wurden 10⁴ markierte Ziele und Verdünnungsreihen von Effektorzellen in 200 μl RP10 für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. 100 μl des Überstandes wurden gesammelt und die spezifische Lyse wurde bestimmt als: Prozent spezifische Lyse = 100 × {(Freisetzung durch CLT – spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung – spontane Freisetzung)}. Die spontane Freisetzung in Abwesenheit von cytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) war kleiner als 25% der maximalen Freisetzung durch Detergens in allen Experimenten.
Bestimmung der Antikörper-Antworten in Mäusen und Affen
Jede Vertiefung von 96-Well-Platten mit U-förmigem Boden (Costar, Cambridge, MA) wurde mit 150 ng ova oder gp120 in 50 μl HBSS beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. Zur Bestimmung der Anti-gp120- und Anti-ova-Antikörper-Antworten in Mäusen wurden die Platten mit 1% BSA eine Stunde lang geblockt. In Reihe verdünnte Sera wurden in 25 μl Volumen pro Vertiefung hinzugegeben und 2 Stunden lang inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und 50 μl einer Verdünnung von 1 : 1000 von Ziege-Anti-Maus-IgG, konjugiert mit HRPO (SBT, Alabama) in 1% BSA, wurden pro Vertiefung zugegeben. Nach 1 h Inkubation wurden die Platten gewaschen, und 100 μl des Substrates wurden pro Vertiefung zugegeben. Die OD₄₀₅ wurde nach 10 bis 15 Minuten aufgenommen. Zur Bestimmung der Anti-gp120-Antikörper-Antwort der Affen waren alle Schritte dieselben, außer dass sowohl das Blocken der Platten als auch das Verdünnen der Sera in 5% normalem Ziegenserum in Hank's balancierter Salzlösung durchgeführt wurden.
Peptidsynthesen
Synthetische Peptide, entsprechend den Aminosäuresequenzen 253–276 (Sequenzauflistung Nr. 1: EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER; wobei der Standardcode aus einem Buchstaben verwendet wird, um jede Aminosäure darzustellen) von Ovalbumin (ova 253–276), den Aminosäuresequenzen 84–102 des Myelin-Basischen-Proteins (MBP 84–102) (Sequenzauflistung Nr. 2: DENPVVHFFKNIVTPRTPP) und synthetische Peptide, den Aminosäuresequenzen 308–322 (18IIIb-Sequenz) von gp120IIIb entsprechend, wurden durch eine Festphasen-Peptidsynthese unter Verwendung eines Applied Biosystems 430A-Synthesizers zusammengebaut. Die Aminosäuren wurden über vorgebildete symmetrische Anyhdride gekoppelt, mit der Ausnahme von Asparagin, Glutamin und Arginin, welche als Hydroxybenzotriazolester gekoppelt wurden. Die Kopplungseffizienz wurde durch eine Ninhydrinreaktion gemäß dem Verfahren von Kaiser et al., 34 Anal. Biochem. 595, 1970, überwacht. Die Peptide wurden von dem Träger mit HF gemäß dem "niedrig-hoch-"Verfahren, das von Tam et al., 21 J. Am. Chem. Soc. 6442, 1983, beschrieben wurde, freigesetzt, und die Peptide wurden von dem Harz mit 10%-iger Essigsäure extrahiert. Nach einer Lyophilisierung wurden die Peptide auf einer Sephadex^®-G-25-Säule entsalzt, und Proben der Peptide wurden dann HPLC-gereinigt durch eine Umkehrphasen-Chromatographie auf einer präparativen Vydac C-18-Säule. Die gereinigten Peptide (98%) wurden in HBSS mit einer Endkonzentration von 10 mg/ml solubilisiert und auf die gewünschte Konzentration in dem Vollmedium verdünnt.
CNBr-Verdau
Proben eines Proteins (z. B. β-Glaktosidase) wurden mit einem 100-fachen molaren Überschuss von Cyanogenbromid in einer Lösung von 100 mM Trifluoressigsäure behandelt. Die Reaktion durfte 18 Stunden lang bei Raumtemperatur (etwa 20°C) unter Rotation ablaufen. Nach der vorgeschriebenen Reaktionszeit wurden die Peptidfragmente von dem Reaktanten unter Verwendung einer SEP-PAK C-18-Vorrichtung (Waters) getrennt, mit 95% Acetonitril eluiert und lyophilisiert.
Alkalischer Verdau
Proteinproben (z. B. β-Galaktosidase) wurden mit 1 N NaOH behandelt und 2 Minuten lang gekocht, woraufhin die resultierenden Peptidfragmente von den Reaktanten unter Verwendung einer C-18 SEP-PAK-Vorrichtung (Waters) getrennt und mit 95 Acetonitril eluiert und lyophilisiert wurden.
Beispiel 1: Der Restriktion durch Klasse I unterworfenes CTL-Priming
Moore et al., 113 UCLA Symp. Mol. Cell. Biol., 1989, und Carbone und Bevan, 171 J. Exp. Medicine 377, 1990, zeigen, dass mit, cytoplasmatisch mit löslichem ova beladenen, Milzzellen immunisierte Mäuse für eine ova-spezifische, einer Restriktion durch Klasse I unterworfene CTL-Antwort geprimt wurden. Der ova exprimierende EL4-Transfektant EG7-ova wurde für die Stimulation in vitro von in vivo geprimten Milzlymphozyten verwendet und ebenfalls als ein Ziel für das ova-spezifische CTL vermittelte Abtöten verwendet. Diese Untersuchung zeigte ebenfalls, dass durch den Transfektanten EG7-ova induzierte oder durch cytoplasmatisch mit ova beladene Milzzellen induzierte CD8⁺-Effektoren eine Determinante, die durch das Peptid ova 258–276 kartiert wird, in dem Kontext von H-2K^b, erkennen, EG7-ova lysieren und ebenfalls EL4-Zellen, welche mit ova 258–276 überzogen sind, abtöten. Daher wurde, um zu untersuchen, ob ein endogener, einer Restriktion durch Klasse I unterworfener CD8⁺-T-Zell-Weg durch ein lösliches Antigen induziert werden kann, das obengenannte System verwendet, um zu bestimmen, ob gewisse Antigen-Formulierungen verwendet werden können, um lösliche Antigene in einen der Restriktion durch Klasse I unterworfenen Weg zu treiben.
a) ova
C57BL/6-Mäuse wurden einmal mit verschiedenen Mengen ova (30 μg-1 mg pro Maus) mit oder ohne eine Antigen-Formulierung immunisiert. Die Mäuse wurden subkutan und in die Schwanzbasis injiziert. Milzzellen wurden von den immunisierten Mäusen wenigstens zwei Wochen nach dem Immunisierungen entnommen und in vitro mit den EG7-ova-Transfektanten stimuliert. Eine ova-Konzentration von nur 30 μg war genauso wirksam wie eine Dosis von 1 mg. Daher wurden die CTL-Untersuchungen routinemäßig mit Milzzellen von Mäusen, die mit 30 μg ova geprimt worden waren, durchgeführt. Nach fünf Tagen der Kultur in vitro mit EG7-ova wurde das Priming durch das Vorhandensein von für ova spezifischen Effektoren, die in der Lage waren, EG7-ova zu lysieren, bestimmt.
Mit bis zu 1 mg löslichem ova in HBSS injizierte Mäuse zeigten kein Anzeichen für ein CTL-Priming (1A). Mäuse jedoch, die mit 30 μg ova in der oben beschriebenen Antigen-Formulierung immunisiert worden waren (gezeigt als AF in den Figuren) zeigten eine signifikante, für die Transfektante spezifische CTL-Antwort (1C). Darüber hinaus war das Ausmaß des Abtötens von EG7-ova durch die mit ova-AF immunisierten Milzzellen dem von mit ova-beladenen Milzzellen immunisierten Mäusen vergleichbar (1B).
Dass die Spezifität des CTL-Primings in vivo Antigen-spezifisch war, wurde durch die Unfähigkeit der Milzzellen aus mit β-Galaktosidase immunisierten Mäusen gezeigt, eine sekundäre CTL-Antwort in vitro zu manifestieren, wenn sie mit EG7-ova stimuliert wurden. Keine für ova spezifische CTL-Induktion wurde beobachtet.
b) β-Galaktosidase
Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung eines anderen löslichen Protein-Antigens, β-gal, erhalten. Für das Testen einer β-gal-spezifischen CTL-Antwort war das verwendete Ziel eine von BALB/c abgeleitete β-gal-exprimierende C3-4-Transfektante. Eine Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit löslichem β-gal ergab eine Hintergrund-CTL-Antwort. Daher wurde das Ernten für die Bestimmung der spezifischen CTL-Antwort um wenigstens acht Wochen verschoben, bevor die Milz-Lymphozyten geerntet und während fünf Tagen in Anwesenheit bestrahlter C3-4-Transfektanten kultiviert wurden.
Die 2B zeigt, dass 30 μg β-Galaktosidase in der AF eine starke spezifische CTL-Antwort gegen die Transfektante erzielten. Bei einem Effektor-zu-Ziel-Verhältnis (E : T) von 3 : 1 zeigten die mit β-gal-AF immunisierten Mäuse etwa 80% spezifisches Abtöten von C3-4. Jedoch wurde nur 20% Abtöten desselben Zieles mit Effektoren, die aus mit β-gal in HBSS immunisierten Mäusen isoliert worden waren, bei demselben E : T-Verhältnis erreicht (2A). Da weder EL4 noch P815 Genprodukte der MHC-Klasse II exprimieren und die Lyse eine syngeneische Restriktion aufweist, sind diese für ova und β-gal spezifischen Effektoren einer MHC-Klasse-I-Restriktion unterworfen.
Um die Nützlichkeit der Antigen-Formulierung zu zeigen, wurden Mäuse mit löslichem ova, eingeschlossen in zwei Arten von Liposomen, von denen eines ein pH-sensitives Liposom war, immunisiert. Eine Woche später wurden die Milzzellen, wie vorausstehend beschrieben, in vitro stimuliert und gegen ⁵¹Cr-markierte EG7-ova oder EL-4 getestet. 3 zeigt ein repräsentatives Ergebnis, das aufzeigt, dass ova in einem Liposom Mäuse nicht für eine wesentliche CTL-Induktion primen konnte. Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, wenn das ova in Alaun eingeimpft wurde.
Beispiel 2: Erkennung des Epitops durch CTL
Carbone und Bevan, supra, zeigten, dass in C57BL/6-Mäusen durch eine EG7-ova-Transfektante und durch cytoplasmatisch mit ova beladene Splenozyten induzierte CTLs EL4-Zellen, die mit dem Peptid ova 258–276 überzogen sind, erkennen. Um zu bestimmen, ob lösliches Ovalbumin in der AF ähnliche CTL-Antworten induziert, wurden Milzzellen aus immunisierten Mäusen präpariert und in vitro mit EG7-ova stimuliert. Die Effektoren wurden gegen EL4-Zellen, die mit dem Peptid ova 253–276 überzogen waren oder mit einem Kontrollpeptid, abgeleitet aus Myelin-Basischem-Protein (MBP 84–102), getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass ova-AF CTLs mit einer ähnlichen Spezifität wie derjenigen, die durch Transfektanten oder durch cytoplasmatisch belandenes ova geprimt wurden, primte (1A, 1B und 1C). Mit ova-AF geprimte Effektorzellen lysierten wirksam EG7-ova und untransfizierte EL4-Zellen, überzogen mit 50 μg/10⁸ Zellen des ova-Peptids, lysierten aber nicht mit 50 μg/10⁸ Zellen MBP-Peptid überzogene EL4-Zellen.
In dem β-Galaktosidase-System zeigten Carbone und Bevran, supra, an, dass eine β-gal-exprimierende Transfektante und cytoplasmatisch mit löslicher β-Galaktosidase beladene Splenozyten CTLs induzierten, welche β-gal-exprimierende transfektante und nicht-transfektante P815-Zellen, überzogen mit Alkali-verdauter β-Galaktosidase, lysierten. Lösliche β-Galaktosidase induziert CTL mit einer ähnlichen Spezifität, wenn sie in der AF eingeimpft wird (2).
Beispiel 3: CTL-Effektoren sind CD8⁺-T-Zellen
Dass lösliche Proteinantigene in der AF CD8⁺-Effektor-T-Zellen induzieren, wurde wie folgt gezeigt. Splenozyten von immunisierten Mäusen wurde fünf Tage lang mit bestrahlten Transfektanten in vitro kultiviert. Danach wurden die Zellen geerntet und die CD4⁺- oder CD8⁺-T-Zellen unter Verwendung von monoklonalen Anti-CD4- oder Anti-CD8-Antikörpern zuzüglich Komplement depletiert. Depletierte Populationen wurden dann gegen ⁵¹Cr-EG7-ova in dem ova-System oder ⁵¹Cr-P13.1 in dem β-gal-System getestet. Die in der 4 gezeigten Daten zeigen an, dass in dem ova-System eine Depletion der CD8⁺-T-Zellen die durch die gesamte Effektor-Zellpopulation verliehene cytolytische Aktivität aufhob. Eine Depletion der CD4⁺-T-Zellpopulation hatte jedoch keinerlei Auswirkung auf die Lyse von EG7-ova.
In einer ähnlichen Weise hob in dem β-gal-System eine Depletion der CD8⁺-T-Zellen die cytolytische Aktivität der mit der β-gal-Antigen-Formulierung immunisierten Milzzellen auf (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 4: Lösliches ova in der AF primt CD8⁺-T-Zellen
Um zu zeigen, dass ova-AF CD8⁺-T-Zellpopulationen in vivo primt und kritisch ist für eine sekundäre Antwort in vitro, wurden CD4⁺- oder CD8⁺-Populationen aus Milzen von mit ova-AF immunisierten Mäusen und aus naiven bzw. naturbelassenen Mäusen depletiert. Diese behandelten Populationen wurden dann in vitro mit EG7-ova allein oder in einer Kombination von CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen aus mit ova-AF immunisierten Mäusen oder in verschiedenen Kombinationen von CD4⁺- oder CD8⁺-T-Zellen aus ova- AF-immunisierten Mäusen mit den CD4⁺- oder CD8⁺-Zellen von naiven Mäusen stimuliert. Die 5 zeigt, dass geprimte CD8⁺-Zellen wesentlich für die Manifestation einer sekundären CTL-Antwort in vitro sind. Diese Daten weisen ebenfalls darauf hin, dass für die wirksame sekundäre CTL-Antwort in vitro CD4⁺-T-Zellen erforderlich sind. CD4⁺-Zellen sind nicht für das Priming nötig.
Die oben genannten Beispiele zeigen die Wirkung der Antigen-Formulierung auf die Induktion von einer Restriktion der Klasse I unterworfenen CTL-Antworten gegen lösliche Protein-Antigene. Das von der Antigen-Formulierung vermittelte lösliche Antigen induzierte ein CTL-Priming und ist bezüglich der Aktivität zu dem durch die Transfektanten und die cytoplasmatisch mit löslichem ova oder β-gal beladenen Splenozyten induzierten ähnlich. In dem Ovalbumin-System induzierten EG7-ova, cytoplasmatisch beladene ova-Splenozyten und ova-AF: (a) einer Restriktion der Klasse I unterworfene CD8⁺-CTL, (b) CTL, welche mit dem synthetischen Peptid ova 253–276 sensibilisierte Ziele erkennen, und (c) langlebige CTL nach nur einer Immunisierung. In dem β-Galaktosidase-System induzierte die β-gal-AF CTL, welche die β-gal exprimierende Transfektante C3-4 erkennen und ebenfalls die nicht transfizierten, mit Alkali-verdautem β-gal sensibilisierten P815-Zellen erkennen. Das ist analog zu dem, was mit CTL, die durch eine Immunisierung mit cytoplasmatisch mit β-Galaktosidase beladenen Milzzellen induziert wurden, beobachtet wurde. Die Induktion von für ova spezifischen CTL durch die Antigen-Formulierung ist einzigartig, weil weder ova, eingeschlossen in einem pH-sensitiven Liposom, noch in Alaun (Daten nicht gezeigt) ein CTL-Priming in vivo induzieren konnte.
Diese beiden Beispiele zeigen, dass die vorausstehend verwendete Antigen-Formulierung und ihre Äquivalente nützlich bei einer Therapie für den Menschen und bei der Impfstoffentwicklung für die Induktion von CTL bei unterschiedlichen Krebsarten und viralen Erkrankungen sind.
Beispiel 5
Dies ist ein spezifisches Beispiel, um die Anwendung der obengenannten AF auf die Erzeugung eines der Restriktion der Klasse I unterworfenen CTL-Primings durch lösliches gp120 von HIV zu zeigen.
Die gp160IIIb exprimierende Zelllinie (15–12) wurde in der von Balb/c-Fibroblasten abgeleiteten 3T3-Zelllinie erzeugt. Sie wurde von den Doktoren Ron Germain und Jay Berzofsky, National Institute of Health, Bethesda, M. D., erhalten. Die gp160 exprimierende Zelllinie wurde für eine Stimulation in vitro von in vivo geprimten Milzlymphozyten verwendet, und ebenfalls verwendet als ein Ziel für eine gp160-spezifische CTL-Induktion. In vielen Experimenten wurde das 18IIIb-Peptid, welches das dominante CTL-Epitop enthält, für eine Stimulation in vitro verwendet. Für die Peptid-Restimulation in Kultur wurde IL-2 in das Medium zugegeben. Balb/c-Mäuse wurden einmal mit 1 μg gp120 pro Maus mit oder ohne AF immunisiert. Die Mäuse wurden subkutan und in die Schwanzbasis injiziert. Milzzellen wurden von den immunisierten Mäusen drei Wochen nach der Immunisierung entnommen und in vitro mit bestrahlten gp160-Transfektanten oder mit dem 18IIIb-Peptid stimuliert. Nach fünf Tagen der Kultur in vitro wurde das Priming durch die Anwesenheit spezifischer Effektoren, die in der Lage waren, gp160-Transfektanten und nicht die nicht-transfizierten Zelllinien zu lysieren, überprüft. In einigen Experimenten wurden vac:gp160-infizierte P815-Zellen als ein Ziel verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4A gezeigt, wo die CTL-Antwort mit AF und gp120 potenziert wird. Es muss zur Kenntnis genommen werden, dass in dem gp120-System die Optimal-AF-Formulierung für eine gp-120-spezifische CTL-Induktion (nach einer Immunisierung mit 1 μg gp120 in der AF) diejenige ist, welche kein oder minimal Pluronic enthält. Wenn die Mäuse jedoch mehrere Male mit 5 μg gp120 in einer AF mit einer höheren Konzentration von Pluronic (3,75%) immunisiert wurden, war eine wesentliche CTL-Induktion ersichtlich (Daten nicht gezeigt).
Das folgende Beispiel zeigt die Verwendung von Antigen-Formulierungen außerhalb des Rahmens der Erfindung mit Verwendung von nur einem oder zwei Bestandteilen. Diese Beispiele zeigen, dass CTL-Antworten mit nur zwei der obengenannten drei Bestandteile induziert werden können.
Beispiel 6: Bestimmung der kritischen, für eine CTL-Induktion notwendigen Bestandteile
Um zu bestimmen, ob all die obengenannten Bestandteile nötig für eine Antigenspezifische CTL-Induktion sind, wurden Mäuse mit Ovalbumin in einer mikrofluidisierten Formulierung von verschiedenen Kombinationen von zwei der drei Bestandteile, die in der obengenannten AF präsentiert wurden, immunisiert, wobei PBS anstelle des dritten Bestandteils eingesetzt wurde. Verwendete Kombinationen mit zwei Bestandteilen waren wie folgt: Squalan/TWEEN in PBS, Squalan/Pluronic in PBS, oder Pluronic/TWEEN in PBS. Ein anderer Satz von Gruppen wurde eingeschlossen, worin Mäuse mit ova, formuliert in einem Ein-Komponenten-System, immunisiert wurden, d. h. nur Squalan in PBS, Pluronic in PBS oder TWEEN in PBS.
Die obengenannten Drei-Komponenten-Antigen-Formulierungen bestehen aus: 0,300 g TWEEN 80 (Aldrich, WI), 1,875 g Pluronic L121 (BASF, NJ) und 7,5 g Squalan (Aldrich, WI), mit PBS auf 50 ml gebracht.
Die Zwei-Komponenten-Formulierungen waren:
Squalan/TWEEN: 0,300 g TWEEN 80 und 7,5 g Squalan, auf 50 ml gebracht mit PBS. Pluronic/TWEEN: 1,875 g Pluronic L121 und 0,300 g TWEEN 80, auf 50 ml gebracht mit PBS.
Pluronic/Squalan: 1,875 g Pluronic L121 und 7,5 g Squalan, auf 50 ml gebracht mit PBS.
Die Drei-Komponenten-Formulierungen mit variierender Pluronic-Konzentration waren wie folgt beschaffen:
Die Squalan- und TWEEN-Konzentrationen wurden beibehalten wie zuvor, doch wurde die Konzentration von Pluronic geändert.
Die Proben wurden dann durch einen Mikrofluidisierer, Modell 110T, Microfluidics Corp., verarbeitet und in Flaschen abgefüllt und bei 4°C bis zur Verwendung gelagert.
Ovalbumin (ova, Sigma, MO) wurde gewogen und auf eine Lösung von 0,3 mg/ml in HBSS (Whittaker, supra) gebracht. Die Stammlöung von 0,3 mg/ml wurde mit den Zwei-Komponenten-Formulierungen in den folgenden Mengen kombiniert: 5 Teile Ovalbumin-Lösung von 0,3 mg/ml, 3,3 Teile der 2-Komponenten-Formulierung und 1,7 Teile HBSS. In einer ähnlichen Weise wurden β-gal und HIV gp120 mit der AF gemischt.
Die Formulierung wurde gevortext und bis zur Injektion auf Eis gehalten. Alle Lösungen wurden direkt vor der Injektion kombiniert.
Jede Maus empfing 220 μl einer Formulierung, welche 30 μl ova enthielt, durch eine Injektion subkutan und in die Schwanzbasis. Die Mäuse wurden wenigstens zwei bis vier Wochen vor der Ernte der Milz ruhen gelassen. Zwei Wochen nach den Immunisierungen wurden die Milzzellen präpariert und in vitro mit bestrahltem EG7-ova stimuliert. Nach fünf Tagen in Kultur wurde das Vorhandensein von für ova spezifischen CTLs durch das Testen gegen ⁵¹Cr-EG7-ova oder ⁵¹Cr-EL4 in einem 4-stündigen ⁵¹Cr-Freisetzungsassay gemessen. Die in den 6 bis 8 dargestellten Daten zeigen, dass in dem mikrofluidisierten Zwei-Komponenten-System formuliertes Ovalbumin für ova spezifische CTLs in vivo Primen kann.
Wir evaluierten des weiteren den relativen Beitrag der einzelnen Bestandteile hinsichtlich ihrer Fähigkeit, CTLs zu induzieren, wenn sie mit Protein-Antigenen kombiniert werden. Zum Zweck der Immunisierung wurde lösliches Antigen mit mikrofluidisierten Arzneimittelträgern gemischt, um eine stabile homogene Emulsion mit Teilchengrößen in einem Bereich von 250–300 nm zu erhalten. Um die Bestandteile der Squalan-TWEEN 80-Pluronic-(STP-)-Formulierung, die für eine CTL-Induktion verantwortlich sind, weiter zu bestimmen, immunisierten wir Mäuse mit ova in einer Squalan-TWEEN 80-(ST-)-Mischung, in einer Pluronic-TWEEN 80-(PT-)-Mischung oder in einer Squalan-Pluronic-(SP-)-Mischung und als eine Kontrolle in Squalan (S), TWEEN 80 (T) oder Pluronic (P). Mäuse wurden ebenfalls mit ova-SAFm (70 μg MDP enthaltend) oder ova-Alaun als Adjuvanskontrollen immunisiert. Als eine Positivkontrolle wurden Mäuse mit Milzzellen, die cytoplasmatisch mit löslichem ova beladen worden waren, immunisiert. Andere Kombinationen und Substitute wurden ebenfalls verwendet, und die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass 30 μg ova in Verbindung mit STP oder ST eine einer Restriktion der Klasse I unterworfene CTL-Antwort in Mäusen primt. Das Priming der für ova spezifischen CTL durch ova in STP oder durch ova in ST scheint besser zu sein als dasjenige, das durch Milzzellen, die cytoplasmatisch mit löslichem ova beladen wurden, induziert wird. ova in PT oder in SP konnte für ova spezifische CTL-Antworten in Mäusen induzieren, jedoch in einer nicht konsistenten Weise und schwach. Anders als SAFm beeinträchtigte die Zugabe von MDP zu der ST-Formulierung die für ova spezifische Induktion von CTL in Mäusen nicht (Tabelle 2). Keine für ova spezifische Induktion von CTL trat auf, wenn Mäuse mit ova, gemischt mit den einzelnen Bestandteilen S, P oder T, immunisiert wurden oder wenn die Mäuse mit ova-SAFm oder mit ova-Alaun immunisiert wurden. Mit bis zu 1 mg ova (a) in HBSS, (b) in SAFm oder (c) absorbiert an Alaun, immunisierte Mäuse primten keine für ova spezifischen CTLs.
Tabelle 2
Beispiel 7: Für eine ova-spezifische Antikörperproduktion notwendige Bestandteile
Die Mäuse wurden dreimal in Intervallen von 2 Wochen mit 30 μg ova in HBSS, STP, ST, PT oder SP immunisiert. Als Positivkontrolle wurden Mäuse auch mit ova-SAFm immunisiert, da SAFm bekanntermaßen eine starke Antikörperantwort induziert. Sieben Tage nach den zweiten und dritten Immunisierungen wurde den Mäusen Blut abgenommen, und die Seren wurden bezüglich einer für ova spezifischen Antikörperantwort getestet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 gezeigt. Sie zeigen an, dass Mäuse, die mit ova in STP, ST oder SAFm immunisiert wurden, ähnliche Anti-ova-Antworten nach drei Immunisierungen zeigen.
Tabelle 3
Beispiel 8: Induktion von HIV-gp120-spezifischen CTL
HIV gp120IIIb wurde verwendet als ein drittes Antigen-System, um eine CTL-Induktion in STP oder anderen als Variationen der 2- und 3-Komponenten-Formulierung zu bestimmen. Mäuse wurden mit 1 μg gp120IIIb in HBSS, STP, PT oder in ST immunisiert. Als Kontrolle wurden Mäuse mit 1 μg gp120IIIb in SAFm oder CFA (Komplettes Freund-Adjuvans) (Tabelle 4B) immunisiert. Drei Wochen nach der Immunisierung wurden die Milzzellen präpariert und in vitro durch die mit Mitomycin behandelten Transfektantenzellen 15–12 oder mit dem 18IIIb-Peptid stimuliert. Nach einer fünftägigen Kultur wurden die resultierenden Effektorzellen gegen mit Vaccinia:gp160IIIb oder mit parentalem Vaccinia infizierte P815-Zellen als Ziele getestet. Die Ergebnisse zeigen an, dass das gp120-Squalan-TWEEN 80 in einer konsistenten Weise eine für gp120 spezifische CTL-Antwort in Mäusen induzierte (Tabellen 4A und 4B). CFA oder SAFm waren jedoch nicht in der Lage, für gp120 spezifische CTL zu induzieren (Tabelle 4B). In einer getrennten Untersuchung wurde gp120 in ST mit variierten Dosen von Pluronic von 0,0015% bis 1,5% bezüglich einer CTL-Induktion getestet.
Tabelle 4A
Tabelle 4B
Beispiel 9: Induktion von für gp120 spezifischen humoralen Antworten in Mäusen
Für die Induktion von humoralen, für gp120 spezifischen Antworten wurden Mäuse mit 1 μg gp120IIIb dreimal in Intervallen von zwei Wochen immunisiert. Die Tiere wurden ausgeblutet und hinsichtlich des Vorhandenseins von gp120IIIb nachweisenden IgG-Antikörpern in einem Festphasen-ELISA-Assay getestet. Die Ergebnisse von Experiment 1 zeigen, dass gp120- in ST oder PT bessere Immunogene sind als gp120-HBSS, gp120-SAFm (Tabelle 5) oder gp120-STP. Die Ergebnisse in dem Experiment 2 zeigen jedoch, dass gp120 in ST oder in STP (Konzentrationen von Pluronic von 1,5 oder 3,75% enthaltend) Antikörper-Antworten mit hohem Titer induzieren kann.
Tabelle 5
Beispiel 10: gp120-spezifische Antikörper-Antworten in Affen
Affen (zwei pro Gruppe) wurden mit gp120-SAFm, gp120-SPT, gp120-ST oder gp120-HBSS immunisiert. Als eine Kontrolle wurde eine Gruppe von Affen mit rekombinanten Vaccinia, gp160IIIb enthaltend, immunisiert. Die Affen wurden in zweiwöchigen Intervallen immunisiert, und zwei Wochen und drei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurde Blut abgenommen. Prä- und Immunserum von jedem Affen wurden in Reihe verdünnt und auf eine Anti-gp120-Aktivität in einem ELISA, wie in dem Materialien- und Methodenteil beschrieben, getestet. Die Daten (9) zeigen an, dass mit gp120-STP oder gp120-SAFm immunisierte Affen ähnliche Antworten bei den Affen induzierten. Ein mit gp120-ST immunisierter Affe induzierte eine Anti-gp120-Antwort, ähnlich zu der gp120-SAFm- oder gp120-SPT-immunisierten Gruppe. Ein mit gp120-ST immunisierter Affe induzierte keine starke Anti-gp120-Antwort nach zwei Immunisierungen.
Beispiel 11: gp120-spezifische CTL-Antworten in Affen
Affen wurden mit 30 μg–50 μg von HIV gp120 in AF oder in HBSS mehrere Male immunisiert. Als eine Kontrolle wurden Affen ebenfalls mit rekombinantem gp160 in Vaccinia immunisiert. Unsere vorläufigen Ergebnisse zeigen an, dass 1/2 Affen, immunisiert mit dem gp120-AF, und 1/2 Affen, immunisiert mit dem gp160:Vaccinia, ein bevorzugtes Abtöten der vac:gp160-infizierten autologen Zielzellen zeigten (10A und 10B).
Andere Ausführungsformen finden sich in den nachfolgenden Ansprüchen.
ISCOM, TWEEN, TEEPOL, EICOSANE, SAF, DETOX, PLURONIC und TETRONIC wurden als eingetragene Warenzeichen bestätigt. Es wird angenommen, dass diese in einem oder mehreren der Vertragsstaaten registriert wurden.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Zusammensetzung, umfassend ein Antigen, gemischt mit einer mikrofluidisierten Antigen-Formulierung, welche besteht aus: (a) einem stabilisierenden Detergenz, welches Polysorbat 80 ist, (b) einem Mizellen-bildenden Mittel, welches Poloxamer 401 ist, (c) einem bioabbaubaren und biokompatiblen Öl, welches Squalan ist, wobei der Antigen-Formulierung eine immunstimulierende Peptidkomponente fehlt und sie als eine stabile Öl-in-Wasser-Emulsion formuliert ist, und wobei die Zusammensetzung eine zytotoxische T-Lymphozyten-Antwort bei einem Menschen oder einem domestizierten oder landwirtschaftlichen Tier induziert, wobei das Antigen nicht ein Albumin, ein β-Zelllymphom-Antigen, HIV gp160 oder ein immunologisches Derivat davon, oder Glycoprotein D vom Herpes simplex-Virus oder ein immunologisches Fragment davon ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Antigen-Formulierung im wesentlichen aus dem Detergenz, dem Mittel und dem Ö1 besteht.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Antigen-Formulierung für Menschen und domestizierte oder landwirtschaftliche Tiere nicht toxisch ist.
Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Antigen aus folgenden Antigenen oder antigenen Anteilen davon gewählt ist: den HIV-Antigenen: gp120, gag, pol, Nef, Tat und Ref; den Malaria-Antigenen: CS-Protein und dem Sporozoiten-Oberflächenprotein 2; den Hepatitis B- Antigenen: Pre-S1, Pre-S2, HBc Ag und HBe Ag; den Influenza-Antigenen: HA, NP und NA; den Hepatitis A-Oberflächen-Antigenen; den Herpesvirus-Antigenen: EBV gp340, EBV gp85, HSV gB, HSV gH, dem frühen Proteinprodukt von HSV, Cytomegalievirus gB, Cytomegalievirus gH, und dem IE-Protein gP72; den humanen Papillomavirus-Antigenen E4, E6 und E7; den Respiratory-Syncytial-Virus-Antigenen; F-Protein, G-Protein und N-Protein, und den Tumor-Antigenen: Karzinom CEA, Karzinom-assoziiertem Mucin, Karzinom P21, Karzinom P53, Melanom MPG, Melanom P97, MAGE-Antigen, dem Karzinom-Onkogenprodukt Neu, dem Karzinom-Genprodukt p53, dem Prostata-spezifischen Antigen (PSA) und dem Prostata-assoziierten Antigen und dem mutierten ras-Protein p21.
Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Detergenz in einer Menge von 0,05 bis 0,5% vorhanden ist.
Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Öl in einer Menge von 1 bis 10% vorhanden ist.
Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, zur Verwendung bei der therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung eines Menschen oder eines domestizierten oder landwirtschaftlichen Tieres durch die Induktion einer zytotoxischen T-Lymphozyten-Antwort.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, zur Verwendung bei der Behandlung eines Menschen oder eines domestizierten oder landwirtschaftlichen Tieres, infiziert mit einem Virus und leidend an einem oder mehreren Symptomen einer Infektion durch dieses Virus.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7 oder Anspruch 8, enthaltend ein HIV-Antigen, zur Verwendung bei der Behandlung eines mit dem HIV-Virus infizierten Patienten.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, wobei das HIV-Antigen gewählt ist aus: gp120, gag, pol, Nef, Tat und Ref.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, enthaltend ein mit Malaria assoziiertes Antigen, zur Verwendung bei der Behandlung eines an Malaria leidenden Patienten.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, wobei das Malaria-assoziierte Antigen ausgewählt ist aus dem CS-Protein und dem Sporozoiten-Obertlächenprotein 2.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7 oder Anspruch 8, enthaltend ein Influenza-assoziiertes Antigen, zur Verwendung bei der Behandlung eines an Influenza leidenden Patienten.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 13, wobei das Influenza-assoziierte Antigen ausgewählt ist aus HA, NP und NA.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7 oder Anspruch 8, enthaltend ein Hepatitis-assoziiertes Antigen, zur Verwendung bei der Behandlung eines an Hepatitis leidenden Patienten.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, wobei das Hepatitis-assoziierte Antigen ausgewählt ist aus dem Oberflächenantigen von Hepatitis-A, Pre-S1, Pre-S2, HBc Ag und HBe Ag.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, enthaltend ein mit Krebs assoziiertes Antigen, zur Verwendung bei der Behandlung eines an Krebs leidenden Patienten.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei das Krebs-assoziierte Antigen ausgewählt ist aus: Karzinom CEA, Karzinom-assoziiertem Mucin, Karzinom P21, Karzinom P53, MAGE-Antigen, Melanom MPG, Melanom p97, Karzinom- Onkogenprodukt Neu, Karzinom-Genprodukt p53 und mutiertem ras-Protein p21.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7 oder Anspruch 8, enthaltend ein Herpes-Virus-Antigen, zur Verwendung bei der Behandlung eines mit Herpes-Virus infizierten Patienten.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 19, wobei das Herpes-Virus-Antigen ausgewählt ist aus: EBV gp340, EBV gp85, HSV gB, HSV gH, dem frühen Proteinprodukt von HSV, Cytomegalievirus gB, Cytomegalievirus gH und dem IE-Protein gP72.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7 oder Anspruch 8, enthaltend ein Respiratory-Syncytial-Virus-Antigen, zur Verwendung bei der Behandlung eines mit dem Respiratory-Syncytial-Virus infizierten Patienten.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 20, wobei das Respiratory-Syncytial-Virus-Antigen ausgewählt ist aus: F-Protein, G-Protein und N-Protein.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, zur Verwendung bei der prophylaktischen Behandlung eines Patienten.
Verwendung eines Antigens und einer mikrofluidisierten Antigen-Formulierung, bestehend aus: (a) einem stabilisierenden Detergenz, welches Polysorbat 80 ist, (b) einem Mizellen-bildenden Mittel, welches Poloxamer 401 ist, und (c) einem bioabbaubaren und biokompatiblen Öl, welches Squalan ist, wobei der Antigen-Formulierung eine immunstimulierende Peptidkomponente fehlt und sie als eine stabile Öl-in-Wasser-Emulsion formuliert ist, wobei das Antigen nicht ein Albumin, ein β-Zelllymphom-Antigen, HIV gp160 oder ein immunologisches Derivat davon, oder Glycoprotein D vom Herpes simplex-Virus oder ein immunologisches Fragment davon ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung eines Menschen oder eines domestizierten oder landwirtschaftlichen Tieres durch das Induzieren einer zytotoxischen T-Lymphozyten-Antwort.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung eines Menschen oder eines domestizierten oder landwirtschaftlichen Tieres durch das Induzieren einer zytotoxischen T-Lymphozyten-Antwort.
Verwendung gemäß Anspruch 24 oder 25, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung eines Menschen oder eines domestizierten oder landwirtschaftlichen Tieres, infiziert mit einem Virus und leidend an einem oder mehreren Symptomen einer Infektion durch dieses Virus.
Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 24 bis 26, bei der Herstellung eines ein HIV-Antigen enthaltenden Medikaments, zur Verwendung bei der Behandlung eines mit dem HIV-Virus infizierten Patienten.
Verwendung gemäß Anspruch 24 oder 25, bei der Herstellung eines ein Malariaassozüertes Antigen enthaltenden Medikaments, zur Verwendung bei der Behandlung eines an Malaria leidenden Patienten.
Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 24 bis 26, bei der Herstellung eines ein Influenza-assoziiertes Antigen enthaltenden Medikaments, zur Verwendung bei der Behandlung eines an Influenza leidenden Patienten.
Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 24 bis 26, bei der Herstellung eines ein Hepatitis-assoziiertes Antigen enthaltenden Medikaments, zur Verwendung bei der Behandlung eines an Hepatitis leidenden Patienten.
Verwendung gemäß Anspruch 24 oder 25, bei der Herstellung eines ein Krebsassoziiertes Antigen enthaltenden Medikaments, zur Verwendung bei der Behandlung eines an Krebs leidenden Patienten.
Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 24 bis 26, bei der Herstellung eines ein Herpesvirus-Antigen enthaltenden Medikaments, zur Verwendung bei der Behandlung eines mit Herpes-Virus infizierten Patienten.
Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 24 bis 26, bei der Herstellung eines ein Respiratory-Syncytial-Virus-Antigen enthaltenden Medikaments, zur Verwendung bei der Behandlung eines mit Respiratory-Syncytial-Virus infizierten Patienten.
Verwendung gemäß Anspruch 24 oder 25, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der prophylaktischen Behandlung eines Patienten.