DE69706593T2

DE69706593T2 - Verwendung von Plasmiden zur Herstellung eines Impfstoffs bei Mensch und Tier

Info

Publication number: DE69706593T2
Application number: DE69706593T
Authority: DE
Inventors: David Klatzmann; Jean-Loup Salzmann
Original assignee: Universite Pierre et Marie Curie
Current assignee: Universite Pierre et Marie Curie
Priority date: 1996-04-05
Filing date: 1997-04-07
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2017-04-08
Also published as: EP1138773A2; ATE205537T1; DE69706593D1; AU2394297A; ES2164309T3; FR2747046A1; JP2000508893A; CA2251027A1; CA2251027C; US6140114A; FR2747046B1; EP0799893B1; EP0799893A1; WO1997038118A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft vorbeugende oder therapeutische Impfstoffe, die aus viralen Partikeln gebildet sind, wie sie in vivo nach Expression von Genen, die von einem Plasmovirus umfasst sind, erhalten werden.
Ein Plasmovirus ist als ein Plasmid oder als ein viraler Vektor definiert, das/der die gesamten für die Neubildung eines viralen Partikels notwendigen Sequenzen nach einer Expression in vivo, in vitro oder ex vivo in einer Wirtszelle umfasst. Anders ausgedrückt: Die Einführung des Plasmovirus in die Wirtszelle transformiert diese in eine Virionen produzierende Verpackungszelle.
Die Impfung gegen Viren und insbesondere gegen Retroviren ist ein komplexer Vorgang. Einige Strategien haben sich mehr oder weniger als wirksam für eine Impfung gegen Onkoviren erwiesen, aber Tests von Impfstoffen gegen Lentiviren zeigen keine befriedigenden Ergebnisse. Ein Grund für diese Tatsache könnte sein, dass die gesamten Vorgänge, die zu einer Immunisierung gegen einen Virus führen, möglicherweise das Vorhandensein von physischen viralen Partikeln und die Produktion dieser Partikel von Wirtszellen erfordern. Einen sehr guten Beweis hierfür ist, dass die besten Impfergebnisse bei Affen gegen den SIV Virus mittels Verwendung von attenuierten Viren, die sich in geimpften Affen replizieren, erhalten worden sind. Eine Strategie für das therapeutische Impfen ist von Salk et al. mittels Verwendung von inaktivierten HIV Partikeln untersucht worden (Proc. Natl. Acad. Sci, USA (1991) 88: 3348-52). Diese Strategie hat sich aus zwei Gründen als unbefriedigend erwiesen. Erstens ist es schwierig, den HIV Virus in vivo in hinreichender Menge zu produzieren und das zweite ist, dass die Verfahren zur Inaktivierung besagter Viren - um wirksam zu sein - einen Teil der immunogenen Epitope der viralen Partikel zerstören.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, von der Wirtszelle virale Partikel produzieren zu lassen, die nahezu virale Partikel der Wildform reproduzieren, aber entweder attenuiert sind oder nicht die Fähigkeit besitzen, sich im Wirt zu replizieren.
Dieses Impfverfahren, das aus Injizieren eines Plasmovirus besteht, dessen Expression zur Bildung von viralen Partikeln führt, ist insbesonders in dem Fall interessant, wo die Impfung mit viralen Untereinheiten ergebnislos sein kann. Der diesem Verfahren zugrunde liegende Gedanke ist, dass es keine bessere Immunisierung gibt als die Immunisierung mit einem physischen Partikel, der infektiöse Partikel reproduziert. Das ist übrigens da der Fall, wo die Impfung gegen zahlreiche pathogene Agenzien und insbesondere Viren mit Hilfe von attenuierten Viren durchgeführt werden. Insbesondere im Falle einer HIV-Infektion zeigen alle gegenwärtigen Versuche, dass die einzige Möglichkeit ein Rhesusäffchen vor einer SIV-Infektion wirksam zu schützen, die Verabreichung eines attenuierten Stammes ist, der wirksam vor einer Challenge gegen einen anderen und pathogenen Virus schützt. Ein derartiges Verfahren, das für die Impfung des Menschen gegen HIV in der Disskussion ist, stößt auf verschiedenen Probleme bei Verwendung eines inaktivierten HIV, das, bei unvollständiger Inaktivierung oder Transkomplementationen oder Mutationen, wieder virulent werden könnte. Bei dieser Möglichkeit der Konstruktion eines Plasmovirus, das aus einem HIV-Capsid besteht und ohne eine bestimmte Anzahl an Genen, bis auf diejenigen, die eine Neubildung des physischen Partikels erlauben, müsste die Injektion eines derartigen Plasmids zur Herstellung aller Proteine, die zur Herstellung viraler Partikel notwendig sind, von den Zellen führen, ohne ein infektiöses Genom zu besitzen oder sogar leer zu sein. Dieses Verfahren könnte die Produktion in vivo eines nicht-attenuierten aber defekten Virus erlauben.
Es ist gezeigt worden, dass die Impfung mit Genen eine Immunantwort nach einer Injektion in der Maus auslösen kann (b. Wang et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4156, (1993) und Ulmer et al. Science, 1993, 259,1745-1749), aber die einzige beschrieben Antwort hiervon ist die Produktion von Antikörpern.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuartigen Impfstoff, der auf der Verabreichung in vivo eines oder mehrerer Plasmide beruht, die einzeln oder in Kombination, die Strukturgene umfassen, die für die Bildung eines physischen viralen Partikels notwendig sind, der entweder leer ist oder ein virales, defektes, attenuiertes oder kein Genom enthält. Die Erfindung beruht besonders auf der Verwendung des Plasmovirus für die in vivo Produktion von immunogenen viralen Partikeln bei menschlichen Individuen oder Tieren, die infiziert oder von einem Virus infiziert sein können.
Unter einem attenuierten viralen Genom versteht man jedes virale Gemom, das so modifiziert ist, dass die Replikation wenig effizient ist, zum Beispiel eine Modifikation eines Gens, die die Infektion nur durch Kontakt aber nicht durch Dissemination erlauben würde, zum Beispiel eine Deletion des extrazellulären Teils des env Gens, um nur den transmembranen, fusiogenen Teil zu behalten.
Jede Modifikation des viralen Genoms, die in der Lage ist, dem Virus dieses Merkmal einer Attenuierung zu verleihen, kann durch einen Infektionstest einer Zellkultur bestimmt werden, wo mittels herkömmlicher Techniken der Gehalt an infektiösen Viren, der im Kulturüberstand beträchtlich reduziert ist, während die Zellzu-Zell-Infektion kaum durch diese Modifikation beeinflusst ist.
Die Konzeption eines Plasmovirus, das eine Neubildung viraler Partikel erlaubt, kann auf verschiedene Art und Weise angewandt werden gemäß den Eigenschaften, die man dem pharmazeutischen Endprodukt verleihen möchte.
Verschiedene Anwendungsformen des Plasmovirus können von dem Moment an in Frage kommen, wo auf einem gleichen Plasmid oder Vektor, oder auf mehreren assoziierten Plasmiden oder Vektoren, die gesamten Sequenzen, die nach Eindringen in Form von DNS oder RNS in die Zellen und Expression in diesen Zellen ein physisches virales Partikel erneut bilden.
Unter assoziierten Plasmiden oder Vektoren versteht man Plasmide, Vektor- oder Nucleinsäure-Sequenzen, deren Expression eindeutig gleichzeitig in den Zellen erfolgt und diese sind: entweder nicht verbunden oder direkt oder indirekt in kovalenter Weise gekoppelt oder nicht-gekoppelt.
Die Anwendungsformen werden gemäß der Funktion gewählt, die man dem aus dem Plasmovirus-Konstrukt neugebildeten Virion verleihen möchte.
Als Beispiel, wenn das Nucleocapsid-Gerüst von einem Retrovirus ist, versucht man innerhalb des Organismus eine ähnliche Situation wie bei einer physiologischen Infektion durch den Virus in dem Sinne zu schaffen, dass es einerseits eine Zelle des Organismus gibt, die die viralen Partikel produziert und folglich auf ihrer Oberfläche für den Retrovirus spezifische Antigene präsentiert, und andererseits in der äußeren Umgebung dieser Zeile retrovirale Partikel freigesetzt sind, die genau denen des HIV Virus gleichen mit der einzigen Ausnahme, dass diese Partikel attenuiert sind oder nicht in der Lage sind, sich zu replizieren. Die gesamten Elemente, die eine adäquate Immunantwort auf den betreffenden Virus zu erhalten erlauben, sind folglich gleichzeitig im Organismus vorhanden.
Die Anwendungsformen sind verschieden und können entweder die Sicherheit oder die Effizienz oder die Selektivität gegenüber einem Ziel oder die Expression eines bestimmten Transgens oder mehrere dieser Funktionen gleichzeitig in den Vordergrund stellen.
Der Vektor kann insbesondere das gag Gen oder die gag und env Gene oder schließlich die gag, pol und env Gene des Retrovirus enthalten, wobei diese Gene eventuell unter der Kontrolle unabhängiger und/oder spezifischer Promotoren stehen, wie auch die Transgene von Interesse unter der Kontrolle des einen oder anderen Promotors oder eines unabhängigen Promotors stehen. Ein Promotor wird als spezifisch oder unabhängig bezeichnet, wenn er sich vom Promotor des Virus unterscheidet, den man aus dem Plasmovirus, zum Beispiel aus einer LTR, neu bildet.
Gemäß einer Anwendungsform wird die Erfindung für die Immunisierung gegen einen Retrovirus, zum Beispiel HIV, verwendet und besteht darin, retrovirale Partikel, die die Hüllproteine des Virus aber ohne das virale Genom umfassen, von den Wirtszellen exprimieren zu lassen.
In einer anderen Anwendungsform verwendet man ein Plasmovirus, das die gesamten Sequenzen enthält, die zur Herstellung eines Virus von einer Wirtszelle notwendig sind (gag, pol und env Sequenz und besonders Sequenzen vom HIV1 oder/und HlV2 Virus) aber ohne die Verpackungssequenz W, wobei das pol Gen gegebenenfalls Mutationen in INT und/oder in RT enthält, was zur Neubildung eines leeren oder ein defektes Genom tragenden Partikels in der Ziel-Zelle führt.
In einer weiteren Anwendungsform verwendet man einen Plasmovirus, der die gag, pol Sequenzen umfasst und ein mutiertes oder mangelhaftes env Gen besitzt. Eine weitere Anwendungsform ist, wo das Plasmovirus mit der Verpackungssequenz ausgestattet ist aber ohne bestimmte Gene, insbesondere der reversen Transkriptase und/oder der Integrase, um mit der letzteren jegliche Fähigkeit zur Replikation und/oder zur Vermehrung in dem Organismus zu nehmen.
Beispiele für Konstrukte sind in den Fig. 1 bis 3 veranschaulicht, die die Erfindung allerdings nicht einschränken.
Es kann von Vorteil sein, ein Gen in das Konstrukt zu inserieren, und dessen Expression ist von Interesse:
- für die Impfbehandlung selbst, um die Immunreaktion zu verstärken, zum Beispiel um damit gleichzeitig die Auslösung einer zellulären und humoralen Reaktion zu fördern;
- um die Systemsicherheit zu erhöhen
- um die Entwicklung einer Immunreaktion gegen ein Epitop oder ein Antigen zu erlauben, für das die klassischen Systeme unbefriedigende Ergebnisse liefern. Das Gen kann entweder unter der Kontrolle der gag/pol Promotoren oder unter der Kontrolle des env Promotors inseriert sein. Wenn seine Expression unter der Kontrolle einer LTR des Retrovirus steht und damit das Nucleocapsid-Gerüst die Ψ Sequenz enthält, wird dieses Gen nach Transfektion der Ziel-Zellen in die gebildeten Virionen wieder integriert werden und seine Expression wird nach der Bildung des Virions in situ fortgesetzt werden können.
Beispiele für Gene, deren Expression von Interesse mit der Impfbehandlung oder mit der Systemsicherheit verbunden ist, sind die folgenden:
a) ein Gen, das ein bedingtes Toxin codiert, zum Beispiel die Thymidin-Kinase oder ein funktionales Äquivalent: es ist heute bekannt (siehe zum Beispiel WO 95/22617), dass die Expression dieses Gens in Zellen während der Teilung, verbunden mit einer Ganciclovir-Behandlung, zum Tod dieser Zelle führt, die das Gen enthält, als Folge eines Einbaus vom Nucleosid-Analogon in die DNS der Zellen und eines darauffolgenden Stopps der Replikation. Der Vorteil, dieses Gen in das Plasmovirus einzufügen, ist gegebenenfalls eine gewollte oder zufällige virale Dissemination zu stoppen.
Jedes Thymidin-Kinase Derivat, das die Phosphorylierungsfunktion der TK beibehält, kann verwendet sein, was der Fall zum Beispiel bei verkürzten Derivaten ist, wie sie in der Patentanmeldung Nr. PCT/FR/95/01098 beschrieben sind. Allgemeiner, jedes Selbstmord-Gen oder selbst jedes Gen, dessen Produkt in der Lage ist, auf die Wirtszelle oder den Virus unter der Wirkung einer exogenen Substanz auf besagten Virus zu wirken, kann auf die selbe Art und Weise in den Vektor integriert sein.
b) Gene, die Immunmodulatoren codieren. Dies können zum Beispiel sein:
- Cytokin-Gene: da das Plasmovirus intravenös injiziert wird, würde ein Plasmovirus, das nicht Zellen transfizieren und die Neubildung eines infektiösen physischen Partikels erlauben würde, vom reticoloendothelialen System aufgenommen werden und das Vorhandensein von Genen, die Cytokine insbesonders Interleukine oder das G-CSF, GM-CSF codieren;
- oder ein Protein des MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex) müsste die Antigen-Präsentation fördern;
- oder co-stimulierende Moleküle wie B7-1 oder 87-2 (Jenkins MK et al., 1993, Curr. Opin. Immunol. 5: 361-367).
Das lokal sezemierte Produkt eines derartigen Gens kann gleichermaßen als solches eine Stimulation der Immunantwort auslösen.
c) Gene oder Nucleotid-Sequenzen, die Peptide, Polypeptide oder Proteine codieren, für die man eine Immunogenität auslösen oder steigern möchte: Es kann sich zum Beispiel nun um Haptene oder ein Antigen-Epitop handeln, gegen die man eine Immunisierung zu entwickeln versucht; das aus dem Plasmovirus neugebildete virale Partikel spielt dabei gewissermaßen eine Rolle als Adjuvans oder Träger, das dem bestimmten Antigen oder Epitop eine Immunogenität verleiht. Im letzteren Fall ist es besonders interessant, die Komplementärsequenz in eine Region des env Gens zu inserieren, was erlaubt, die Funktionalität des extra-membranen Teils des Hüllproteins zu erhalten, während die Struktur des bestimmten Epitops, das auf der Oberfläche des viralen Partikels exprimiert ist, erworben ist.
In all diesen Fällen ist es das in vivo neugebildete physische Partikel, das wie ein Impfstoff wirkt, das eine zelluläre oder humorale Antwort auslöst. Dieses Verfahren ist besonders für den Fall interessant, wo man einen schützenden Impfstoff gegen ein Virus untersucht, gegen das kein Impfstoff entwickelt werden konnte. Das ist besonders bei HIV und HTLV, Spumavirus oder Typ D Retrovirus der Fall, für die alle Versuche zur Entwicklung von Impfstoffen, was ihre Schutzwirkung anbetrifft, Fehlschläge waren (Medicin/Science, 1996, Nr. 1, Band 12, Seiten 87- 93). Daher ist in der vorliegenden Erfindung der Impfstoff besonders interessant, da das virale Genom des Plasmovirus ein Retrovirus-Genom ist und dass der codierende Vektor mindestens ein Strukturgen von HIV enthält.
Die Eigenschaften der Plasmoviren und folglich Verwendungen der Erfindung ergeben sich auch aus dem verwendeten Hülltyp. Denn das Hüllprotein vermittelt nicht nur die Effizienz bei Produktion von reifen infektiösen Partikeln, sondern erlaubt auch diesen Partikeln eine Infektionsspezifität (Tropismus) zu verleihen, denn dieses Protein vermittelt die Phänomene von Bindung des Virions an die Zelle über intermediäre Membranrezeptoren und ist an der Fusion der Virus- und Plasmid- Membran beteiligt, die die Freisetzung des Nucleocapsids im Cytoplasma der infizierten Zellen ermöglicht. Schließlich spielt die Hülle eine wichtige Rolle bei der Resistenz des Vektors auf die Inaktivierung durch das Komplement Auf diese Weise kann man über das Nucleocapsid-Gerüst das Infektionsspektrum des Vektors modifizieren, indem man das Hüllprotein modifiziert, was folglich die Anpassung der Impfstrategie erlaubt, die man durchführen möchte.
Als Beispiel, es konnte festgestellt werden, dass Vektoren, die das env Gen des VSV (Virus stoma vesiculosa) enthalten, einen beachtlichen Tropismus gegen Ziel-Zellen besitzen, wobei dieses Merkmal des ubiquitären Typs aus der Art des Membranrezeptors dieser Hülle resultiert. Im Gegensatz dazu besitzen env Gene, die von ekotropen Viren abstammen, ein viel engeres Spezifitätsspektrum.
Ein Gen oder ein Genfragment, das ein Peptid, ein Polypeptid oder ein Protein codiert, kann gleichermaßen im N-terminalen Teil des env Gens inseriert sein, wie es von VALSESIA-WITTMANN et al. Journal of Virology, (1996), Seiten 2059-2064, beschrieben worden ist, und ohne mit der Bindung des Virions an seinen Rezeptor auf den Ziel-Zellen zu interferieren. Im Falle der Neubildung des viralen Partikels wird das Peptid oder Polypeptid, das aus der Transduktion des inserierten Gens oder des Fragments resultiert, kovalent an den N-Terminus der viralen Hülle gebunden sein, sozusagen am Extramembranteil des Partikels.
Diese Eigenschaft kann vorteilhafterweise verwendet werden, um dem aus dem Plasmovirus neugebildeten Partikel verschiedene Eigenschaften zu verleihen, die insbesondere die folgenden sein können:
a) Auslösen einer zellvermittelten Immunreaktion.
Wenn das Peptid, Polypeptid oder Protein, was hier als "Insert" bezeichnet ist, auf der Oberfläche des neugebildeten viralen Moleküls exprimiert ist, kann dies zu einer zellvermittelten Immunstimulation mittels Aktivierung von T-Zellen und gleichzeitiger Aktivierung von Makrophagen oder von Antikörper produzierenden. B- Zellen führen. Diese Fähigkeit kann daher genutzt werden, um die Immunogenität des so neugebildeten viralen Partikels zu erhöhen. Wenn das Insert ein Impf-Antigen ist, kann das aus dem Plasmovirus neugebildete Partikel nun ein Adjuvans sein, das die Immunantwort als solches auf das auf der Oberfläche des Partikels exprimierte Antigen erhöht.
b) Auslösen einer Immunantwort gegen ein Hapten:
Ein Hapten ist eine Antigen-Determinante ohne selbst ein Immunogen zu sein. Eine Antigenreaktion gegen Haptene wird ausgelöst und/oder durch die Kopplung des Haptens an einen Träger ("Carrier") verstärkt, der zum Beispiel Albumin, PPD (gereinigte Protein-Derivate von Tuberculin) oder KLH sein kann. Im Allgemeinen wird der Träger von den T-Lymphocyten wiedererkannt, wenn das Hapten mit den B- Zellen in Wechselwirkung tritt. Die Polypeptid-Haptene sind dann gute Kandidaten als "Inserts".
c) Ausrichtungsfunktion
Wenn das "Insert" nach seiner Affinität für einen spezifischen Rezeptor einer Ziel-Zelle ausgewählt ist, die in einem Orgän entweder eingefügt oder isoliert ist, kann das virale Partikel, das dieses "Insert" exprimiert, folglich vorzugsweise auf das gegebene Ziel gerichtet sein, um dort spezifisch seine Wirkung auszulösen. Wenn die Wirkung einfach das Auslösen einer zellulären oder humoralen Immunreaktion ist, kann das Ausrichten direkt auf die T-Zellen erfolgen. Wenn dagegen ein Transgen in das Plasmid inseriert ist, wie es zum Beispiel in Fig. 2 dargestellt ist, erlaubt das Ausrichten, das betreffende Gen in die Zelle zielen, in der es exprimiert werden soll, um eine optimale Immunogenität von dem Zeitpunkt an zu erhalten, wo das virale Partikel Infektionseigenschaften gegen diese Ziel-Zelle hat.
d) die oben beschriebenen drei Eigenschaften sind nicht gut verstanden, schließen einander aus und können einander ergänzen um damit Impfpartikel herzustellen, die eine Immunogenität und/oder eine gesteigerte Spezifität zeigen.
Auf die selbe Weise ist gezeigt worden, dass ein Protein vom Herpes simplex Virus (HSV-1), als US-11 bezeichnet, in der Lage ist, in trans die Expression des Glycoproteins der Retrovirushülle und insbesondere von HIV oder von HTLV zu aktivieren (J. Diaz et al. (1996), Nature 379: 273). Die Einbeziehung des Gens, das Us11 in dem Plasmovirus entweder in Abhängigkeit des retroviralen Promotors oder in Abhängigkeit eines anderen Promotors codiert, zum Beispiel der pCMV Promotor, der für die Transkription eines Strukturgens des Retrovirus verwendet ist, ist besonders interessant.
Außerdem und entsprechend des Gens oder Genfragments, das man exprimieren möchte, können die Ziel-Zellen, die man anvisieren möchte, das env Gen und die Insertionsstelle festgelegt werden.
Ein erstes Konstrukt-Beispiel des Plasmovirus für die Verwendung in der Erfindung ist in Fig. 1 gezeigt. Es umfasst:
a) die gag und pol Gene unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors;
b) ein env Gen gleichermaßen unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors;
c) ein Polyadenylierungssignal, das sich von der LTR des betreffenden Virus unterscheidet, vom Typ SV40, TK, HBV, ...
d) gegebenenfalls die Ψ Sequenz
e) gegebenenfalls ein Gen oder Genfragment von Interesse, dessen Expression entweder vom Promotor in a) oder vom Promotor in b) abhängt oder auf einer unabhängigen Expressionskassette.
In diesem Konstrukt ist jegliche Neubildung des viralen Genoms bei Fehlen der LTR nicht möglich. Diese Strategie ist für "einfache" Viren geeignet, die wenige Leserahmen besitzen. In anderen Ausführungen kann jedes notwendige Protein in einer unabhängigen Expressionskassette platziert sein. Für komplexe Viren wie das HIV können mehrere Kassetten aufeinanderfolgen (gag/pol, env, tat, rev, nef).
Ein anderes Beispiel für Plasmoviren für die Verwendung der Erfindung ist in der Fig. 2 gezeigt und kann umfassen:
a) ein env Gen eines Retrovirus unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors,
b) ein defektes retrovirales Genom, das die LTR Sequenzen, die gag und pol Gene, gegebenenfalls die Ψ Sequenz umfasst,
c) gegebenenfalls ein Gen oder Genfragment von Interesse, dessen Expression entweder vom Promotor in a) oder vom Promotor in b) abhängt,
d) gegebenenfalls das Us11 Gen von HSV;
Dieses Nebenkonstrukt von Plasmoviren, das schon bei Stand der Technik beschrieben ist, erlaubt die Expression eines Fremdgens von der transduzierten Zelle, das zum Beispiel ein immunstimulierendes Protein codierendes Gen sein kann. Außerdem werden in einer Ausführung Ψ+ von diesem Konstrukt infektiöse aber defekte Partikel produziert. Folglich können Zellen infiziert werden und von neuem die für die Bildung viraler Partikel notwendigen Proteine exprimieren. Wenn diese Zelten Antigen präsentierende Zellen sind, kann dies besonders vorteilhaft sein.
Eine andere Anwendungsform eines Vektors für die Verwendung der Erfindung kann umfassen:
a) die gag, pol und/oder env Gene eines Retrovirus unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors;
b) ein defektes, retrovirales Genom, das LTR Sequenzen, die Ψ Sequenz umfasst,
c) gegebenenfalls ein Gen oder Genfragment von Interesse, dessen Expression entweder vom Promotor in a) oder vom Promotor in b) abhängt,
d) gegebenenfalls das Us11 Gen von HSV;
Ein anderes Beispiel für ein Plasmovirus ist in Fig. 3 dargestellt und dieses umfasst ein attenuiertes virales Genom, ohne die Ψ Sequenz und die verschiedenen Umänderungen sind in das Genom eingeführt, um das Auftreten von replikativen Viren zu vermeiden. Die 3' LTR ist durch eine andere Polyadenylierungsstelle ersetzt; Mutationen (Punktmutationen, Deletionen, Änderung des Leserasters) sind in einem oder mehreren Nicht-Strukturproteinen (RT inverse Transkriptase, IN Integrase) gemacht worden. Diese Strategie ist für komplexe Genome wie HIV, die eine große Anzahl an Proteinen besitzen, besonders geeignet; ihre Synthese, die komplex ist, bleibt folglich unter der entsprechenden Kontrolle der 5' LTR von HIV.
Bei allen Konstrukten (Fig. 1, 2, 3) kann man zu dem Plasmid eine oder mehrere Expressionskassetten, die die Immunantwort fördernde Gene codieren, hinzufügen. Außerdem können die Elemente, die die Expression des Plasmids fördern, gleichermaßen hinzugefügt sein: ITR von AAV, Sequenzen, die die Replikation des Plasmids fördern können (Replikationsursprung von EBV oder SV40 fördern und EBNA Expressionskassette oder T-Antigen zum Beispiel)...
Die vorliegende Erfindung umfasst gleichermaßen die Verwendung eines oder mehrerer Plasmoviren, wie oben definiert, zur Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung, insbesondere eines Impfstoffes, zur Prophylaxe und/oder Therapie von Individuen, die mit einem Virus infiziert sind oder infiziert werden können, mittels Verabreichung des oder der besagten Plasmoviren in vivo.
Die betreffenden Subjekte sind Menschen und Tiere und die immunogenen Zusammensetzungen oder Impfstoffe können in den Bereich der Human- oder Veterinärmedizin fallen.
Diese Zusammensetzung ist besonders dann immunogen, wenn die Injektion des Vektors, der das defekte virale Genom umfasst, die Neubildung eines physischen viralen Partikels erlaubt, der in der Lage ist, eine zelluläre und/oder humorale Immunantwort auszulösen.
Das defekte virale Genom und die Sequenzen, die das oder die Gene codieren, die die Neubildung der viralen Hülle erlauben, können von einem oder zwei Vektoren umfasst sein, die in der Zusammensetzung miteinander verknüpft sind und können mit dem Fachmann bekannten Mitteln, insbesondere die in der Patentanmeldung WO 95/26411 beschrieben sind, verbunden sein. In diesem Fall bezieht sich der Ausdruck Plasmovirus auch auf einen einzelnen Vektor, der außerdem die spezifischen Sequenzen des defekten viralen Genoms und die Sequenzen, die das oder die Strukturproteine, und auch gegebenenfalls die Sequenzen, die die oben erwähnten exogenen Gene codieren, umfasst, entweder um die Immunogenität zu erhöhen oder um die Systemsicherheit zu verbessern oder letztendlich um eine bessere Expression der viralen Hüllproteine zu erlauben.
Gegebenenfalls kann man zur Herstellung der immunogenen Zusammensetzung ein an das Plasmovirus gebundenes Impf-Adjuvans verwenden. Die Adjuvanzien können verschiedene Typen umfassen: Manche fördern die klassische Immunantwort wie ein Adjuvans vom Typ N-Acetyl-muramyl, das an ein Peptid wie MDP oder an dessen verschiedene Derivate gebunden ist, wie in CRS Critical Reviews in Immunology, 1988, Vol. 8, Seiten 83-100 beschrieben. Andere Adjuvans- Typen können ebenfalls in Betracht kommen, wie diejenigen, die das Eindringen der Nucleinsäure-Sequenzen in die Zellen fördern; schließlich kann das Plasmovirus in der immunogenen Zusammensetzung an eine bekannte Sequenz gebunden sein, als entweder vermutlich T-abhängig oder alternativ gebunden oder in Liposomen eingeschlossen, Es kann auch in wässrigem oder öligem Milieu in Form von subkutanen, intramuskulären oder intravenösen Injektionen mittels "Pellets" (biologisch abbaubare Polymere, die das Produkt enthalten) und/oder mittels Implantation eines Freisetzungssystems, das mit Hilfe einer Mikropumpe arbeitet, verabreicht sein. Andere Adjuvanzien können, wie PAO, allein oder an Lecithin gebunden (EP445-710), ZN(OH) oder HBW538 (Drugs experimental clinical research (1991) 17 (9): 445450) an Aluminiumhydroxid (Al(OH)&sub3;) gebunden, kovalent oder nichtkovalent am Wirkstoff der Zusammensetzung gebunden sein. Die immunogene Zusammensetzung, von der ein Wirkstoff das Plasmovirus ist, ist gleichermaßen durch die Tatsache gekennzeichnet, dass das defekte virale Genom Träger eines Selbstmord-Gens ist, um die Sicherheit des Systems gegebenenfalls durch Zugabe von Ganciclovir zu erreichen, da man die Proliferation des besagten Virus verhindern möchte.
Zur Herstellung der immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung kann das Plasmovirus entweder nackte oder verpackte DNS oder nackte DNS sein, die mit einer Zelle einer Verpackungszelllinie oder einer noch zu etablierenden Zelllinie assoziiert ist, die zum Beispiel aus Fibrobtasten-Zelllinien, wie die Linie 3T3, oder Zellinien, die in der Lage sind, als Suspension kultiviert zu werden, wie Myelomzellen, die Vero-Zellen oder die MRCS Zellen, ausgewählt sein können. In diesem Fall besteht die immunogene Zusammensetzung aus Plasmovirus und der Wirtszelle, die in diesem Fall wie ein Zelltransplantat wirkt und die Produktion des viralen Partikels erlaubt, der wiederum selbst das Auslösen einer Impfreaktion erlaubt.
Man verwendet für die Immunisierung 0,1 bis 1000 ug Nucleinsäure des Vektors pro Dosis und vorzugsweise 10 bis 500 ug pro Dosis. Diese Dosierung ist als Einheitsdosis zu verstehen, die für Menschen bestimmt ist.
Für die Verwendung der Erfindung kann das Plasmovirus gleichermaßen ein Virus wie der Adenovirus oder der AAV (Adeno-assoziiertes Virus) sein, das defekt ist und alle für die Neubildung eines Retrovirions notwendigen Sequenzen umfasst; anders ausgedrückt, das defekte Virus, das die retroviralen Sequenzen umfasst, spielt die Transport Rolle gegenüber den Zellen, auf die bevorzugt gezielt werden soll.
Zum Beispiel besitzt das AAV einen besonderen Tropismus für die Muskelzellen, die eine große immunogene Fähigkeit besitzen; das Einführen des Genoms, das die retroviralen Sequenzen umfasst, in diesen Zelltyp kann dadurch die Impfwirkung steigern.
In dieser Anwendungsform verwendet man 100 bis 10&sup6; defekte virale Partikel pro Einheitsdosis, die vorzugsweise für den Menschen bestimmt ist.
Die Herstellung einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann zur Anwendung eines Verfahrens zur aktiven Immunisierung von Individuen gegen eine virale Infektion bestimmt sein, wobei besagtes Verfahren aus Injizieren eines Plasmovirus, der die für die Neubildung eines viralen Partikels notwendigen Strukturgene umfasst, in ein Individuum besteht.
Das injizierte Plasmovirus kann außerdem ein virales oder retrovirales Genom, vorzugsweise ein defektes Genom, und nicht-codierende und/oder regulatorische Sequenzen des Virus oder des Retrovirus und gegebenenfalls eine Verpackungssequenz umfassen. Die retroviralen Genome, die im Rahmen eines Impfverfahrens bevorzugt sind, sind Genome des Lentivirus, Oncomavirus, Spumavirus oder Typ D Retrovirus. In diesem Fall sind ebenfalls die für die Bildung des viralen Partikels notwendigen Strukturgene vorzugsweise die gag und/oder pol codierenden Gene. Das env Gen ist entsprechend des festgelegten Zwecks für das Plasmovirus ausgewählt, wobei verschiedene Beispiele weiter oben genannt sind. Das env Gen kann so rekombiniert sein, dass eine Chimäre hergestellt wird, die gleichzeitig die Anhaftungsfunktion vom Virion am Rezeptor der Ziel-Zellen und eine Rezeptorstelle für das Insert in dem env Molekül umfasst. Wie es weiter oben erwähnt ist, kann es gleichermaßen von Vorteil sein, dem Plasmovirus das Us11 Gen von HSV1 hinzuzufügen, um auf diese Weise die Synthese der Strukturproteine zu stimulieren.
Die verschiedenen Anwendungsformen der verwendeten Vektoren für die Impfung sind oben beschrieben worden.
Wenn das retrovirale Genom ohne die Verpackungssequenz ist, sind nun die neugebildeten physischen Partikel ohne Genom. Im Gegensatz dazu, wenn das virale Genom diese Verpackungssequenz umfasst, kann es interessant sein, den Vektor so zu konstruieren, dass in Abhängigkeit des retroviralen Promotors ein Gen von Interesse zugefügt ist, um auf diese Weise die Sicherheit des Systems zu erhöhen oder die Immunantwort auf den Impfstoff zu verstärken.
Diese Immunisierung kann nach perkutaner oder subkutaner, intramuskulärer oder intravenöser Injektion einer immunogenen Zusammensetzung, wie oben beschrieben, erhalten werden.
Die Verwendung des Plasmovirus gemäß der Erfindung ist insofern vorteilhaft, da die Herstellung und die Konservierung von Nucleinsäuren für die Verwendung einfacher ist als die Herstellung und Konservierung kompletter viraler Partikel.
Sie ist zum einen aus wirtschaftlicher Sicht und zum anderem aus Sicherheitsgründen besonders interessant. Tatsächlich ist die Herstellung von Plasmoviren einfach und die Stabilität und die Reproduzierbarkeit entspricht den Produktionsvorschriften von Medikamenten besser. Außerdem erlaubt sie die Manipulation viraler Partikel zu vermeiden, die bei einem Herstellungsschritt zum Beispiel von Lebendimpfstoffen mit attenuierten oder inaktivierten vollständigen Viren gefährlich sein könnten.
Der Fachmann kann von Fall zu Fall die geeignetesten Techniken zur Transfektion von verschiedenen Zelltypen anwenden. Die unten angeführten Beispiele wie auch die Schemas und deren Legenden dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne ihren Umfang zu beschränken.
Das nachfolgende Beispiel wie auch das Vergleichsbeispiel zeigen die Wirksamkeit des Impfverfahrens an einem Tiermodell.
In diesem Beispiel stellt die Fig. 4 das Plasmid pBMG3 dar, das ein HSV1-TK Gen unter der Kontrolle eines 5' LTR Mo-MuLV Promotors aufweist.
Die Fig. 5 stellt das Plasmid pNP-2 dar.
Die Fig. 6 gibt die Gewichtsänderungen von Tieren an, die mit Hilfe der Konstrukte geimpft wurden und mit dem murinen myeloproliferativen Leukämie-Virus infiziert wurden. Auf der Abszisse sind die Versuchstage und auf der Ordinate sind die Gewichtsveränderung der Tiere aufgetragen.

I. Verwendetes Versuchsmodell:

Das verwendete Versuchsmodell ist die Auslösung einer Megakaryocytenleukämie bei der Maus. Diese Leukämie ist durch eine Infektion der Maus mit einem pathogenen Retrovirus vom Typ MPLV ausgelöst. Der MPLV Virus stammt von murinen Leukämie-Viren vom Typ Friend ab. Diese besitzen LTR-Sequenzen, die sich von den des Moloney Virus-Typs unterscheiden, sie besitzen aber sehr eng verwandte Strukturprotein-Sequenzen. Es ist deshalb möglich, gegen das MPLV unter Verwendung von Proteinen, die vom Moloney Virus abstammen, zu impfen.
Ein derartiges Virus umfasst ein v-mpl Onkogen, das der Ligand vom Thrombopoietin ist. Nach Infektion mit einem derartigen Virus entwickelt die Maus in einigen Wochen die Megakaryocytenleukämie. Diese Krankheit ist durch eine Milz- und Lebervergrößerung gekennzeichnet; genauer, nach der viralen Infektion sammeln sich außergewöhnlich viele Lymphocyten in der Milz. Eine Impfwirkung kann durch das Ausbleiben einer Gewichtszunahme der Milz, der Leber und des ganzen Tieres nach einer Challenge mit dem pathogenen Virus abgeschätzt werden.

II. In diesem Modell verwendete Plasmoviren:

Die Impfung ist mit drei verschiedenen Plasmoviren durchgeführt worden. Es sind die folgenden:
- Das pNP-2 Plasmid, in Fig. 5 dargestellt, ist ein Plasmid mit 10.380 Basenpaaren. In diesem Plasmid ist in das erste Codon ATG des env Gens von einem Provirus, das vom Moloney-Virus abstammt, eine Punktmutation eingefügt worden, um den Sinn des korrespondierenden Codons in dem pol Gen zu erhalten, das sich überlagert. Einige Basenpaare stromabwärts des Stop-Codons des pol Gens ist ein HSV1-TK Gen so inseriert worden, dass jede Sequenz des env Gens zwischen dem Stop-Codon des Transgens und dem Polypurin-Teil der LTR in 3' entfernt worden ist. In einem derartigen Konstrukt werden die gag und pol Gene aus einer nicht geschnittenen, genomischen RNS erhalten, während das Transgen von einer gespleißten RNS transkribiert wird, unter Verwendung von Donor- und Akzeptorspleißstellen der Provirus-Wildform. Eine Expressionskassette des env Gens ist dann konstruiert worden, um die Möglichkeit einer Rekombination, die zu infektiösen Viren führen würde, zu vermindern;
pBMC-3, dargestellt in Fig. 4, ist das gleiche Plasmid wie das pNP-2 Plasmid, enthält aber zusätzlich das ekotrope env Gen;
Das Plasmid pBPXT4, in dem das humane CD4 Gen eingebaut ist und ohne env Gen ist, hier nicht dargestellt, diente als Kontrolle.

III. Prophylaktische Schutzwirkung der Plasmide im Tierversuch:

Die adulten Mäuse erhielten intramuskuläre Injektionen, wie von Ulmer at al. in Science, 1993, 259: 1745-1749 beschrieben.
Die Injektionen mit jeweils 100 ug Plasmid, präpariert nach Qiagen-Protokoll, pro Maus sind dreimal in einwöchigem Abstand wiederholt worden.
Als Kontrolle für die Impfwirkung ist einer Gruppe von Mäuse eine Plasmid- DNS injiziert worden, die sich von der MPLV Virus DNS vollkommen unterscheidet
Nach Abschluss des Impfverfahrens ist den Tieren ein Kulturüberstand einer den MPLV Virus produzierenden Zelllinie intravenös injiziert worden.
Dieser unverdünnte Überstand besitzt eine reverse Transkriptase Aktivität (RT) von 66.152 CPM/10&sup6; Zellen. Dieser Überstand wurde 100fach verdünnt und 200 ul sind den Mäusen intravenös injiziert worden und der Zeitpunkt der Injektion entspricht der Zeit 0 des Graphen von Fig. 6.
Vier Tiergruppen sind behandelt worden: jede Gruppe bestand am Versuchsbeginn, sozusagen bei der ersten Impfung, aus fünf 10 Wochen alten dBA/2 Mäusen.
Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Injektion der MPLV-Partikel wurden die Tiere entweder gewogen, wenn sie noch lebten, und/oder getötet und es wurde die Milz beziehungsweise die Leber gewogen. Die Zeitpunkte von Messung und Entnahme erfolgte am Tag 7, 14, 21, 28 und 35.

IV. Ergebnisse:

Die Figur zeigt die Gewichtsänderung der Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Challenge durch die MPLV-Partikel. Die weißen Kreise repräsentieren die Ergebnisse, die nach einer Impfung mit dem pBMC-3 Plasmid erhalten wurden. Die schwarzen Kreise repräsentieren die Ergebnisse, die nach einer Impfung mit pNP-2 erhalten wurden. Die weißen Quadrate repräsentieren die Ergebnisse, die mit pBXT4, einem die cDNS von humanem CD4 tragenden Plasmid, erhalten wurden, und die schwarzen Quadrate repräsentieren die Kontrolle, wo die Mäuse vor der Injektion viraler Partikel nicht geimpft worden sind.
In die Tabelle unten ist jeweils das Gewicht von Milz und Leber nach Entnahme, 21 Tage nach der Injektion viraler Partikel angegeben.

Fazit:

Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Impfung mit pBMC-3 insofern wirksam ist, als eine Gewichtszunahme weder bei der Maus, bei der Milz noch bei der Leber festgestellt werden konnte. Im Gegensatz dazu führte die Verwendung der drei anderen Plasmoviren zu einer mehr als 10fachen Gewichtszunahme der Milz, was auf eine Entwicklung der Krankheit und Ineffizienz der Impfung deutet. Dieses Ergebnis zeigt eindeutig, dass das Plasmovirus als Bestandteil einer Zusammensetzung zur Bildung eines Wirkstoffs führt, der in der Lage ist, der pathogenen Wirkung einer viralen Infektion vorzubeugen.

Claims

1. Verwendung eines oder mehrerer Plasmide, die, einzeln oder in Kombination, die Sequenzen von viralen Strukturgenen umfassen, die nach Expression in einer Zelle zur Neubildung eines viralen Partikels, das leer ist oder ein für die Replikation defektes Genom enthält, notwendig sind, zur Herstellung einer Zusammensetzung, die zur Verwendung in einem Impfverfahren beim Menschen oder Tier durch Verabreichen des oder besagter Plasmide an einen Menschen oder an ein Tier bestimmt ist.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten Sequenzen in dem oder den Plasmiden unter Kontrolle unabhängiger und/oder spezifischer Promotoren oder einer LTR stehen.

3. Verwendung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das virale Partikel ein retrovirales Partikel ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das retrovirale Partikel ein HIV, ein HTLV, ein Spumavirus oder ein Typ D Retrovirus ist.

5. Verwendung eines Plasmids nach einem der vorausgehenden Ansprüche, das eine Sequenz umfasst, die ein gag Protein eines Retrovirus codiert.

6. Verwendung eines Plasmids nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das eine Sequenz, die ein gag Protein codiert, und eine Sequenz eines Retrovirus umfasst, die ein env Protein codiert.

7. Verwendung eines Plasmids nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das eine Sequenz, die ein gag Protein codiert, eine Sequenz, die ein pol Protein codiert, und eine Sequenz eines Retrovirus umfasst, die ein env Protein codiert.

8. Verwendung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Neubildung des viralen Partikels notwendigen Sequenzen ohne Verpackungssequenz sind.

9. Verwendung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Neubildung des viralen Partikels notwendigen Sequenzen ohne invertierte terminale Wiederholungssequenzen (LTR) des Virus sind.

10. Verwendung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die Plasmide außerdem eine Nucleinsäure umfassen, die ein Peptid, Polypeptid oder Protein codiert, gegen das eine Immunisierung erstrebt ist.

11. Verwendung nach Anspruch 6, 7 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Peptid, Polypeptid oder Protein an das besagte env Protein fusioniert ist und dass das besagte Peptid, Polypeptid oder Protein an der Oberfläche des neugebildeten viralen Partikels exprimiert wird.

12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die Plasmide außerdem eine Nucleinsäure umfassen, die einen Immunmodulator, vorzugsweise ein Cytokin oder ein Protein des Haupthistokompatibilitätskomplexes, codiert.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die Plasmide außerdem eine Nucleinsäure umfassen, die ein bedingtes Toxin codiert.

14. Verwendung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die Plasmide außerdem eine Nucleinsäure umfassen, die das Protein Us11 von HSV-I codiert.

15. Verwendung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die Plasmide intramuskulär verabreicht werden.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die Plasmide intravenös oder subkutan verabreicht werden.

17. Verwendung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die gesamten zur Neubildung des viralen Partikels notwendigen Sequenzen von einem einzigen Plasmid umfasst sind.

18. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das virale Partikel ein retrovirales Partikel ist und dass das, die oder mehrere Plasmide durch einen Adenovirus- Vektor oder AAV ersetzt sind.