DE69836206T2

DE69836206T2 - Synthetische hiv gag gene

Info

Publication number: DE69836206T2
Application number: DE69836206T
Authority: DE
Inventors: W. John Rahway SHIVER; M. Mary-Ellen Rahway DAVIES; C. Daniel Rahway FREED; A. Margaret Rahway LIU; C. Helen Rahway PERRY
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1997-02-07
Filing date: 1998-02-03
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2018-02-04
Also published as: WO1998034640A3; JP2001512308A; PL335050A1; CN1252075A; ES2274566T3; IL131131A0; DK0969862T3; NO993810D0; CA2280195A1; KR20000070865A; DE69836206D1; EP0969862B1; AU6271198A; WO1998034640A2; EE9900343A; ATE342916T1; NO993810L; SK106699A3; EP0969862A2; AU743616B2

Description

Querverweis auf verwandte Anmeldungen

Nicht anwendbar

Erklärung bezüglich mit Bundesmitteln geförderter Forschung & Entwicklung

Nicht anwendbar

Verweis auf Mikrofilm-Anhang

Nicht anwendbar

Gebiet der Erfindung

HIV-Vakzine

Hintergrund der Erfindung
Das Human-Immunschwäche-Virus-1 (HIV-1) ist das ätiologische Agens des erworbenen Human-Immunschwäche-Syndroms (AIDS) und verwandter Störungen. HIV-1 ist ein RNA-Virus der Retroviridae-Familie und zeigt die 5'-LTR-gag-pol-env-LTR-3'-Organisation aller Retroviren. Darüber hinaus umfasst HIV-1 eine Handvoll Gene mit regulatorischen oder unbekannten Funktionen, einschließlich der tat- und rev-Gene. Das env-Gen codiert für das virale Hüll-Glycoprotein, das als ein Vorläufer von 160 Kilodalton (kD) (gp160) translatiert und dann von einer zellulären Protease gespalten wird, um das äußere 120-kD-Hüll-Glycoprotein (gp120) und das 41-kD-Transmembran-Hüll-Glycoprotein (gp41) zu ergeben. gp120 und gp41 bleiben assoziiert und werden auf den viralen Partikeln und der Oberfläche von HIV-infizierten Zellen präsentiert. gp120 bindet an den CD4-Rezeptor, der auf der Oberfläche von Helfer-T-Lymphozyten, Makrophagen und anderen Zielzellen vorliegt. Nachdem gp120 an CD4 gebunden hat, vermittelt gp41 das Fusionsereignis, das für den Viruseintritt verantwortlich ist.
Die Infektion beginnt, wenn gp120 auf dem viralen Partikel an den CD4-Rezeptor auf der Oberfläche von T4-Lymphozyten oder anderen Zielzellen bindet. Das gebundene Virus verschmilzt mit der Zielzelle und transkribiert sein RNA-Genom revers in die doppelsträngige DNA der Zelle. Die virale DNA wird in das genetische Material im Kern der Zelle inkorporiert, wo die virale DNA die Bildung neuer viraler RNA, viraler Proteine und neuer Viruspartikel steuert. Die neuen Partikel treten durch Knospung aus der Zielzellmembran aus und infizieren andere Zellen.
Die Zerstörung von T4-Lymphozyten, welche für die Immunverteidigung kritisch sind, ist eine Hauptursache der progressiven Immunstörung, welche die HIV-Infektion kennzeichnet. Der Verlust von Zielzellen beeinträchtigt die Fähigkeit des Körpers zur Bekämpfung der meisten Invasoren erheblich, hat jedoch eine besonders schwerwiegende Auswirkung auf die Verteidigung gegen Viren, Pilze, Parasiten und bestimmte Bakterien, einschließlich Mykobakterien.
HIV-1 tötet die Zellen, die es infiziert, durch Replikation, Knospung aus den Zellen und Zerstörung der Zellmembran. HIV-1 kann Zielzellen indirekt mittels des viralen gp120 abtöten, welches auf der Oberfläche einer infizierten Zelle präsentiert wird. Nachdem der CD4-Rezeptor auf T-Zellen eine starke Affinität für gp120 besitzt, können gesunde Zellen, die CD4-Rezeptor exprimieren, an gp120 binden und mit infizierten Zellen fusionieren, um ein Syncytium zu bilden.
HIV-1 kann auch normale zelluläre Immunverteidigungen gegen infizierte Zellen hervorrufen. Zytotoxische Verteidigungszellen können mit oder ohne Hilfe von Antikörpern eine infizierte Zelle zerstören, welche virale Proteine auf ihrer Oberfläche präsentiert. Schließlich kann freies gag- und gp120-Protein im Blut von Individuen zirkulieren, die mit HIV-1 infiziert sind. Das freie gp120-Protein kann an den CD4-Rezeptor von nicht-infizierten Zellen binden, was sie als infiziert erscheinen lässt und eine Immunreaktion hervorruft.
Die Infektion mit HIV-1 ist fast immer tödlich und derzeit gibt es keine Heilung für eine HIV-1-Infektion. Effektive Vakzine zur Verhütung einer HIV-1-Infektion sind noch nicht verfügbar. Aufgrund der Gefahr einer Reversion oder Infektion kann lebendes abgeschwächtes Virus wahrscheinlich nicht als Vakzin verwendet werden. Die meisten Untereinheits-Vakzin-Ansätze waren hinsichtlich der Verhütung einer HIV-Infektion nicht erfolgreich. Behandlungen für eine HIV-1-Infektion haben schwerwiegende Nebenwirkungen, obwohl sie das Leben einiger infizierter Personen verlängern. Somit besteht ein großer Bedarf für effektive Behandlungen und Vakzine zur Bekämpfung dieser tödlichen Infektion.
Impfung ist eine wirksame Form von Krankheitsverhütung und hat sich gegen verschiedene Typen einer viralen Infektion als wirksam erwiesen. Die Feststellung von Wegen, um HIV-1-Antigene dem humanen Immunsystem zu präsentieren, um eine schützende humorale und zelluläre Immunität hervorzurufen, ist eine schwierige Aufgabe. Bisher waren Versuche zur Herstellung eines effektiven HIV-Vakzins nicht erfolgreich. Bei AIDS-Patienten ist freies Virus nur auf niedrigen Niveaus vorhanden. Die Übertragung von HIV-1 wird durch Zell-zu-Zell-Wechselwirkung mittels Fusion und Syncytienbildung erhöht. Somit sind Antikörper, die gegen freies Virus oder virale Untereinheiten erzeugt wurden, im Allgemeinen bei der Eliminierung von virus-infizierten Zellen unwirksam.
Vakzine nutzen die Fähigkeit des Körpers, sich an ein Antigen "zu erinnern". Nach ersten Begegnungen mit einem gegebenen Antigen erzeugt das Immunsystem Zellen, welche eine immunologische Erinnerung an das Antigen für die Lebensspanne eines Individuums behalten. Eine anschließende Exposition gegenüber dem Antigen stimuliert die Immunreaktion und führt zu einer Eliminierung oder Inaktivierung des Pathogens.
Das Immunsystem behandelt Pathogene auf zwei Weisen: durch humorale und durch zellvermittelte Reaktionen. Bei der humoralen Reaktion erzeugen Lymphozyten spezifische Antikörper, welche an das Antigen binden und somit das Pathogen inaktivieren. Die zellvermittelte Reaktion beinhaltet zytotoxische und Helfer-T-Lymphozyten, welche infizierte Zellen spezifisch angreifen und zerstören.
Eine Vakzin-Entwicklung für das HIV-1-Virus ist problematisch, da HIV-1 einige der gleichen Zellen infiziert, die das Vakzin im Immunsystem aktivieren muss (d.h. T4-Lymphozyten). Es wäre von Vorteil, ein Vakzin zu entwickeln, das HIV inaktiviert, bevor eine Beeinträchtigung des Immunsystems eintritt. Ein besonders geeigneter Typ von HIV-Vakzin würde eine Anti-HIV-Immunreaktion hervorrufen, welche HIV-Varianten erkennt und welche bei HIV-positiven Individuen wirkt, welche am Beginn ihrer Infektion stehen.
Eine große Herausforderung für die Entwicklung von Vakzinen gegen Viren, insbesondere solche mit einer hohen Mutationsrate, wie z.B. das Human-Immunschwäche-Virus, gegen welche eine Hervorrufung neutralisierender und schützender Immunreaktionen wünschenswert ist, ist die Vielfältigkeit der viralen Hüllproteine bei verschiedenen viralen Isolaten oder Stämmen. Nachdem zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) bei sowohl Mäusen als auch Menschen in der Lage sind, Epitope zu erkennen, die von konservierten internen Virusproteinen stammen, und man annimmt, dass sie bei der Immunreaktion gegen Viren von Bedeutung sind, wurden Anstrengungen auf die Entwicklung von CTL-Vakzinen gerichtet, welche in der Lage sind, einen heterologen Schutz gegen unterschiedliche Virusstämme zu bieten.
Es ist bekannt, dass CD8⁺-CTLs virus-infizierte Zellen abtöten, wenn deren T-Zellrezeptoren virale Peptide erkennen, die mit MHC-Klasse I-Molekülen assoziiert sind. Die viralen Peptide stammen von endogen synthetisierten viralen Proteinen, unabhängig von dem Ort oder der Funktion des Proteins innerhalb des Virus. Somit können CTLs durch Erkennung von Epitopen von konservierten viralen Proteinen einen stammübergreifenden Schutz bieten. Peptide, die zur Assoziation mit MHC Klasse I für die CTL-Erkennung in der Lage sind, stammen von Proteinen, welche im Zytoplasma oder endoplasmatischen Retikulum vorhanden sind oder es passieren. Im Allgemeinen sind exogene Proteine, welche den endosomalen Prozessierungsweg einschlagen (wie im Falle von Antigenen, die von MHC- Klasse II-Molekülen präsentiert werden), nicht wirksam zur Hervorrufung von CD8⁺-CTL-Reaktionen.
Die meisten Versuche zur Hervorrufung von CTL-Reaktionen verwendeten replizierende Vektoren, um das Protein-Antigen innerhalb der Zelle zu bilden, oder konzentrierten sich auf die Einführung von Peptiden in das Zytosol. Diese Ansätze haben Beschränkungen, welche deren Brauchbarkeit als Vakzine einschränken können. Retrovirale Vektoren weisen Beschränkungen hinsichtlich der Größe und Struktur von Polypeptiden auf, welche unter Erhaltung des Vermögens des rekombinanten Virus zur Replikation als Fusionsproteine exprimiert werden können, und die Wirksamkeit von Vektoren wie Vaccinia für nachfolgende Immunisierungen kann durch Immunreaktionen gegen die Vektoren selbst beeinträchtigt werden. Auch weisen virale Vektoren und modifizierte Pathogene inhärente Risiken auf, welche deren Einsatz bei Menschen verhindern können. Ferner ist die Selektion von zu präsentierenden Peptid-Epitopen abhängig von der Struktur der MHC-Antigene eines Individuums und deshalb können Peptid-Vakzine aufgrund der Unterschiedlichkeit von MHC-Haplotypen in Populationen nicht verwandter Individuen eine begrenzte Wirksamkeit aufweisen.
Benvenisty, N., und Reshef, L., (PNAS 83, 9551–9555, (1986)] zeigten, dass CaCl₂-präzipitierte DNA, die intraperitoneal (i.p.), intravenös (i.v.) oder intramuskulär (i.m.) in Mäuse eingeführt wurde, exprimiert werden konnte. Die intramuskuläre Injektion von DNA-Expressionsvektoren ohne CaCl₂-Behandlung in Mäusen führte zur Aufnahme von DNA durch die Muskelzellen und Expression des von der DNA codierten Proteins. Die Plasmide wurden episomal aufrecht erhalten und replizierten nicht. Später wurde eine dauerhafte Expression nach intramuskulärer Injektion in Skelettmuskel von Ratten, Fischen und Primaten und Herzmuskel von Ratten beobachtet. Die Technik der Verwendung von Nukleinsäuren als Therapeutika wurde in WO90/11092 (4. Oktober 1990) berichtet, worin nackte Polynukleotide zur Impfung von Vertebraten verwendet wurden.
Für den Erfolg des Verfahrens ist es nicht erforderlich, dass die Immunisierung intramuskulär erfolgt. Die Einführung von Gold-Mikroprojektilen, die mit DNA, codierend für Human-Wachstumshormon (HGH) beschichtet waren, in die Haut von Mäusen führte zur Bildung von Anti-HGH-Antikörpern in den Mäusen. Ein Jet-Injektor wurde zur Transfektion von Haut-, Muskel-, Fett- und Brustdrüsengeweben von lebenden Tieren verwendet. Verschiedene Verfahren zur Einführung von Nukleinsäure wurden untersucht. Von Zhu et al. wurde gezeigt, dass die intravenöse Injektion eines DNA:kationisches Liposom-Komplexes in Mäusen zur systemischen Expression eines klonierten Transgens führte [Science 261: 209–211 (9. Juli 1993). Ulmer et al., [Science 259: 1745–1749, (1993)] berichteten über den heterologen Schutz gegen eine Influenzavirus-Infektion durch intramuskuläre Injektion von DNA, die für Influenzavirus-Proteine codierte.
Der Bedarf für spezifische therapeutische und prophylaktische Mittel, welche in der Lage sind, gewünschte Immunreaktionen gegen Pathogene und Tumorantigene hervorzurufen, wird von der vorliegenden Erfindung gestillt. Von besonderer Bedeutung bei diesem therapeutischen Ansatz ist das Vermögen zur Induktion von T-Zell-Immunreaktionen, die Infektionen oder eine Krankheit verhindern können, welche sogar von Virusstämmen verursacht werden, die zu dem Stamm, aus dem das Antigen-Gen erhalten wurde, heterolog sind. Dies ist von besonderer Bedeutung in Hinblick auf HIV, nachdem erkannt wurde, dass dieses Virus schnell mutiert, und viele virulente Isolate identifiziert wurden [siehe beispielsweise LaRosa et al., Science 249: 932–935 (1990), welche 245 separate HIV-Isolate identifizierten]. Als Reaktion auf diese erkannte Unterschiedlichkeit versuchten Forscher CTLs auf Basis einer Peptid-Immunisierung zu erzeugen. So berichteten Takahashi et al. [Science 255: 333–336 (1992)] über die Einführung von breit kreuzreaktiven zytotoxischen T-Zellen, die eine HIV-Hüll(gp160)-Determinante erkannten. Diese Forscher erkannten jedoch die Schwierigkeit bei der Erzielung einer wirklich kreuzreaktiven CTL-Reaktion und postulierten, dass es eine Dichotomie zwischen dem Priming oder der erneuten Stimulation von T-Zellen, welches) sehr stringent ist, und der Hervorrufung einer Effektorfunktion, einschließlich Zytotoxizität, von bereits stimulierten CTLs gibt.
Wang et al. berichteten über die Hervorrufung von Immunreaktionen bei Mäusen gegen HIV durch intramuskuläre Impfung mit einem klonierten, genomischen (ungespleißten) HIV-Gen. Jedoch war das Niveau der Immunreaktionen, das bei diesen Studien erzielt wurde, sehr niedrig. Darüber hinaus wurde bei dem DNA-Konstrukt von Wang et al. ein im Wesentlichen genomisches Stück von HIV verwendet, das für zusammenhängende Tat/rev-gp160-Tat/rev-Codierungssequenzen codierte. Wie detailliert im folgenden beschrieben, ist dies ein suboptimales System für den Erhalt einer hohen Expression des gp160. Es ist auch potentiell gefährlich, da die Expression von Tat zum Fortschritt des Kaposi-Sarkoms beiträgt.
WO 93/17706 beschreibt ein Verfahren zur Impfung eines Lebewesens gegen ein Virus, wobei Trägerpartikel mit einem Gen-Konstrukt beschichtet wurden und die beschichteten Partikel unter Beschleunigung in Zellen eines Lebewesens eingebracht wurden. Bezüglich HIV wurde im Wesentlichen das gesamte Genom, abzüglich der langen terminalen Repeats, für die Verwendung vorgeschlagen. Das Verfahren repräsentiert erhebliche Risken für die Empfänger. Es wird allgemein angenommen, dass Konstrukte von HIV weniger als etwa 50% des HIV-Genoms enthalten sollten, um die Sicherheit des Vakzins zu gewährleisten; dies stellt sicher, dass enzymatische Gruppierungen und virale regulatorische Proteine, von denen viele unbekannte oder schlecht verstandene Funktionen aufweisen, eliminiert wurden. Somit bleibt eine Anzahl von Problemen, wenn ein brauchbares humanes HIV-Vakzin aus der Gen-Transporttechnologie entwickelt werden soll.
Die vorliegende Erfindung berücksichtigt jedes der bekannten Verfahren zur Einführung von Polynukleotiden in lebendes Gewebe, um die Expression von Proteinen zu induzieren. Jedoch stellt diese Erfindung ein neues Immunogen zur Einführung von HIV- und anderen Proteinen in den Antigen-Prozessierungsweg bereit, um effizient HIV-spezifische CTLs und Antikörper zu erzeugen. Das Pharmazeutikum ist wirksam als Vakzin zur Induktion sowohl zellulärer als auch humoraler Anti-HIV- und HIV-neutralisierender Immunreaktionen. In der vorliegenden Erfindung werden die oben angesprochenen Probleme angegangen und gelöst durch die Bereitstellung von Polynukleotid-Immunogenen, welche, bei Einführung in ein Lebewesen, die effiziente Expression von HIV-Proteinen und -Epitopen steuern, ohne die begleitenden Risiken, die mit jenen Verfahren verbunden sind. Die so hervorgerufenen Immunreaktionen sind wirksam bei der Erkennung von HIV, der Inhibierung der HIV-Replikation, der Identifizierung und Abtötung von Zellen, die mit HIV infiziert sind, und weisen Kreuzreaktivität gegenüber vielen HIV-Stämmen auf.
Die Codon-Paarungen von Organismen sind in hohem Maße nicht-statistisch und unterscheiden sich von Organismus zu Organismus. Diese Information wird dazu verwendet, um veränderte oder synthetische Gene mit gewünschten Niveaus an Translationseffizienz zu konstruieren und exprimieren, um festzustellen, welche Regionen in einem Genom proteincodierende Regionen sind, um translationale Unterbrechungsstellen in heterologe Gene einzuführen und um die Beziehung oder den verwandtschaftlichen Ursprung von Nukleotidsequenzen zu ermitteln.
Die Expression fremder heterologer Gene in transformierten Organismen ist nun allgemein bekannt. Eine große Anzahl von Säugergenen, einschließlich beispielsweise Maus- und Humangene, wurde erfolgreich in einzellige Organismen eingeführt. Die Standardtechniken in dieser Hinsicht umfassen die Einführung des zu exprimierenden fremden Gens in einen Vektor, wie z.B. ein Plasmid oder einen Phagen, und die Verwendung des Vektors zur Einführung des Gens in einen Organismus. Die nativen Promotoren für solche Gene werden gewöhnlich durch starke Promotoren ersetzt, welche mit dem Wirt, in den das Gen eingeführt wird, kompatibel sind. Eine Proteinsequenzierungsapparatur erlaubt die Aufklärung der Aminosäuresequenzen von sogar winzigen Mengen an nativem Protein. Anhand dieser Aminosäuresequenzen können DNA-Sequenzen, welche für jene Proteine codieren, abgeleitet werden. Die DNA-Synthese ist ebenfalls ein sich schnell entwickelndes Gebiet und synthetische Gene, die diesen abgeleiteten DNA-Sequenzen entsprechen, können unschwer konstruiert werden.
Trotz der wachsenden Kenntnis von Expressionssystemen und rekombinanter DNA verbleiben erhebliche Hindernisse, wenn man versucht, ein fremdes oder synthetisches Gen in einem Organismus zu exprimieren. Viele native aktive Proteine sind beispielsweise in einer Weise glycosyliert, die sich von derjenigen unterscheidet, welche auftritt, wenn sie in einem fremden Wirt exprimiert werden. Aus diesem Grund können eukaryotische Wirte, wie z.B. Hefe, gegenüber bakteriellen Wirten zur Expression vieler Säugergene bevorzugt sein. Das Glycosylierungsproblem ist Gegenstand fortgesetzter Forschung.
Ein weiteres Problem ist schlechter verstanden. Oft geschieht die Translation eines synthetischen Gens, selbst in Kopplung mit einem starken Promotor, viel weniger effizient als man erwarten würde. Das gleiche gilt häufig für exogene Gene, die für den Expressionsorganismus fremd sind. Selbst wenn das Gen in einer ausreichend effizienten Weise transkribiert wird, dass gewinnbare Mengen des Translationsprodukts gebildet werden, ist das Protein oft inaktiv oder unterscheidet sich auf andere Weise in seinen Eigenschaften von dem nativen Protein.
Es ist bekannt, dass das letztere Problem gewöhnlich auf Unterschiede bei der Proteinfaltung in verschiedenen Organismen zurückzuführen ist. Die Lösung für dieses Problem war schwer zu finden und die Mechanismen, welche die Proteinfaltung kontrollieren, sind schlecht verstanden.
Die mit der Translationseffizienz verbundenen Probleme sind mutmaßlich auf Codon-Kontext-Effekte zurückzuführen. Die protein-codierenden Regionen von Genen in allen Organismen sind einer großen Vielfalt von funktionellen Beschränkungen unterworfen, von denen einige von dem Erfordernis zur Codierung eines richtig funktionierenden Proteins sowie geeigneten translationalen Start- und Stoppsignalen abhängen. Jedoch wurden mehrere Merkmale von protein-codierenden Regionen beobachtet, welche in den Begriffen dieser Beschränkungen nicht ohne weiteres verstanden werden. Zwei wichtige Klassen solcher Merkmale sind diejenigen, welche die Codon-Verwendung und den Codon-Kontext betreffen.
Es ist bekannt, dass es bei der Codon-Verwendung starke Bevorzugungen gibt und diese zwischen unterschiedlichen Organismen beträchtlich variiert. Es wurde gezeigt, dass Codon-Verwendungsmuster in Bezug zur relativen Häufigkeit von tRNA-Isoakzeptoren stehen. Gene, die für Proteine mit hoher Häufigkeit codieren, zeigen gegenüber denen für Proteine mit niedriger Häufigkeit Unterschiede in ihrer Codon-Bevorzugung. Die Möglichkeit, dass Bevorzugungen der Codon-Verwendung die Peptidverlängerungsraten ändern, wurde ausgiebig erörtert. Obwohl Unterschiede der Codon-Verwendung mit Unterschieden in den Translationsraten assoziiert sind, war es schwierig, direkte Effekte der Codon-Auswahl auf die Translation zu demonstrieren. Andere postulierte Beschränkungen hinsichtlich der Codon-Verwendungsmuster beinhalten die Maximierung der Translationsgenauigkeit und Optimierung der kinetischen Effizienz der Proteinsynthese.
Abgesehen von der nicht-statistischen Verwendung von Codons haben sich beträchtliche Indizien angesammelt, dass die Codon/Anticodon-Erkennung durch Sequenzen außerhalb des Codons selbst beeinflusst wird, ein Phänomen, das als "Codon-Kontext" bezeichnet wird. Es gibt einen starken Einfluss benachbarter Nukleotide auf die Wirksamkeit der Suppression von Nonsense-Codons sowie Missense-Codons. Offensichtlich erfordert die Häufigkeit der Suppressoraktivität in natürlichen Bakterienpopulationen sowie die Verwendung von "Terminations"-Codons zur Codierung von Selenocystein und Phosphoserin, dass die Termination kontext-abhängig ist. Von ähnlichen Kontext-Effekten wurde gezeigt, dass sie die Translationsgenauigkeit sowie die Effizienz der Translationsinitiation beeinflussen.
Statistische Analysen von protein-codierenden Regionen von E. coli demonstrierten eine weitere Manifestation des "Codon-Kontexts". Die Anwesenheit eines speziellen Codons an einer Position beeinflusst stark die Häufigkeit des Auftretens bestimmter Nukleotide in benachbarten Codons und diese Kontext-Beschränkungen unterscheiden sich bei Genen mit einem hohen Expressionsniveau deutlich von denen mit einem niedrigen Expressionsniveau. Obwohl der Kontext-Effekt erkannt wurde, ist der Voraussagewert der statistischen Regeln bezüglich bevorzugter Nukleotide neben Codons relativ gering. Dies beschränkte die Brauchbarkeit solcher Nukleotid-Bevorzugungsdaten für die Auswahl von Codons, um gewünschte Niveaus an Translationseffizienz zu bewirken.
Das Aufkommen von Geräten zur automatischen Nukleotidsequenzierung machte große Mengen an Sequenzdaten für eine große Vielfalt von Organismen verfügbar. Das Verständnis dieser Daten ist mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden. Beispielsweise ist es wichtig, die codierenden Regionen des Genoms zu identifizieren, um die genetischen Sequenzdaten in Beziehung zu Proteinsequenzen zu setzen. Darüber hinaus ist die Herkunft des Genoms bestimmter Organismen von erheblichem Interesse. Es ist bekannt, dass die Genome einiger Organismen gemischter Herkunft sind. Einige Sequenzen, die viralen Ursprungs sind, sind nun stabil in das Genom eukaryotischer Organismen inkorporiert. Die viralen Sequenzen selbst könnten von irgendeiner anderen, im Wesentlichen nicht verwandten Spezies stammen. Ein Verständnis der Herkunft eines Gens kann beim Ziehen angemessener Analogien zwischen verwandten Genen und ihren Translationsprodukten in anderen Organismen von Bedeutung sein.
Es gibt einen Bedarf für ein besseres Verständnis von Codon-Kontext-Effekten auf die Translation und für ein Verfahren zur Feststellung der geeigneten Codons für irgendeinen gewünschten Translationseffekt. Es besteht auch Bedarf für ein Verfahren zur Identifizierung codierender Regionen des Genoms anhand von Nukleotidsequenz-Daten. Es gibt auch einen Bedarf für ein Verfahren zur Steuerung der Proteinfaltung und zur Gewährleistung, dass ein fremdes Gen bei der Expression in einem Wirt angemessen gefaltet wird. Gene, die entsprechend gewünschten Translationseffizienzen verändert oder konstruiert wurden, wären von beträchtlichem Wert.
Ein weiterer Aspekt der Praxis rekombinanter DNA-Techniken zur Expression von Proteinen von industriellem und pharmazeutischem Interesse durch Mikroorganismen ist das Phänomen der "Codon-Präferenz". Obwohl früher festgestellt wurde, dass die existierende Maschinerie zur Genexpression in genetisch transformierten Wirtszellen "arbeiten" wird, um ein gewünschtes Produkt zu ergeben, können die in einem Mikroorganismus erhaltenen Expressionsniveaus Gegenstand einer großen Variation sein, teilweise abhängig von spezifischen alternativen Formen des aminosäure-spezifizierenden genetischen Codes, der in einem inserierten exogenen Gen vorliegt. Ein "Triplett"-Codon von vier möglichen Nukleotid-Basen kann in 64 varianten Formen auftreten. Dass diese Formen die Message für nur 20 unterschiedliche Aminosäuren (sowie Transkriptionsinitiation und -termination) bereitstellen, bedeutet, dass einige Aminosäuren von mehr als einem Codon codiert werden können. In der Tat haben einige Aminosäuren bis zu sechs "redundante" alternative Codons, während einige andere ein einziges erforderliches Codon aufweisen. Aus nicht vollständig verstandenen Gründen liegen alternative Codons keineswegs gleichmäßig in der endogenen DNA unterschiedlicher Zelltypen vor und es erscheint eine variable natürliche Hierarchie oder "Präferenz" für bestimmte Codons in bestimmten Zelltypen zu geben.
Als ein Beispiel wird die Aminosäure Leucin durch irgendeines von sechs DNA-Codons, einschließlich CTA, CTC, CTG, CTT, TTA und TTG (welche jeweils den mRNA-Codons CUA, CUC, CUG, CUU, UUA und UUG entsprechen), spezifiziert. Eine erschöpfende Analyse von Genom-Codon-Häufigkeiten für Mikroorganismen offenbarte, dass die endogene DNA von E. coli am häufigsten das leucin-spezifizierende Codon CTG enthält, während die DNA von Hefen und Schleimpilzen am häufigsten ein leucin-spezifizierendes TTA-Codon einschließt. In Anbetracht dieser Hierarchie wird allgemein angenommen, dass die Wahrscheinlichkeit des Erhalts hoher Expressionsniveaus eines leucin-reichen Polypeptids durch einen E. coli-Wirt bis zu einem gewissen Grad von der Häufigkeit der Codon-Verwendung abhängen wird. Beispielsweise wird ein an TTA-Codons reiches Gen aller Wahrscheinlichkeit nach in E. coli schlecht exprimiert werden, wohingegen ein an CTG reiches Gen wahrscheinlich das Polypeptid stark exprimieren wird. Gleichermaßen würde, wenn Hefezellen die vorgesehenen Transformationswirtszellen zur Expression eines leucinreichen Polypeptids sind, ein bevorzugtes Codon zur Verwendung in einer inserierten DNA TTA sein.
Seed et al. (WO 96/09378 und Current Biology 1996, 6, 31) offenbaren eine verbesserte Expression von HIV-env-Proteinen in vitro nach Codon-Optimierung.
Die Implikationen von Codon-Präferenzphänomenen hinsichtlich rekombinanter DNA-Techniken sind offensichtlich und das Phänomen mag dazu dienen, viele frühere Fehlschläge bei der Erreichung hoher Expressionsniveaus von exogenen Genen in erfolgreich transformierten Wirtsorganismen zu erklären – ein weniger "bevorzugtes" Codon kann wiederholt im inserierten Gen vorliegen und die Wirtszellmaschinerie für die Expression kann nicht so effizient arbeiten. Dieses Phänomen legt nahe, dass synthetische Gene, welche konstruiert wurden, um die bevorzugten Codons einer vorgesehenen Wirtszelle einzuschließen, eine bevorzugte Form von fremdem genetischem Material zur Durchführung rekombinanter DNA-Techniken bereitstellen.
Die funktionelle Vielfalt, welche eukaryotische Zellen typischerweise kennzeichnet, hängt von der strukturellen Differenzierung ihrer Membrangrenzen ab. Zur Bildung und Aufrechterhaltung dieser Strukturen müssen Proteine von ihrem Syntheseort im endoplasmatischen Retikulum an vorbestimmte Ziele in der ganzen Zelle transportiert werden. Dies erfordert, dass die transportierten Proteine Sortierungssignale aufweisen, welche von der für die Routenselektion verantwortlichen molekularen Maschinerie, die an den Zugangspunkten zu den Hauptverkehrswegen lokalisiert ist, erkannt werden. Sortierungsentscheidungen für die meisten Proteine müssen nur einmal getroffen werden, wenn sie ihre biosynthetischen Wege einschlagen, da ihre Endbestimmung, der zelluläre Ort, an dem sie ihre Funktion wahrnehmen, deren permanenter Aufenthaltsort wird.
Die Aufrechterhaltung der intrazellulären Integrität hängt teilweise von der selektiven Sortierung und dem akkuraten Transport von Proteinen an ihre korrekten Bestimmungsorte ab. Im Laufe der letzten wenigen Jahre wurde die Aufgliederung der molekularen Maschinerie für die Zielbestimmung und Lokalisierung von Proteinen eingehend untersucht. Definierte Sequenzmotive wurden bei Proteinen identifiziert, welche als "Adressetiketten" dienen können. Leader- oder Signalpeptide, wie z.B. dasjenige des Proteins des gewebespezifischen Plasminogenaktivators, tPA, dienen zum Transport eines Proteins in den zellulären sekretorischen Weg über das endoplamatische Retikulum und den Golgi-Apparat. Von einer Reihe von Sortierungssignalen wurde festgestellt, dass sie mit den zytoplasmatischen Domänen von Membranproteinen, wie z.B. Di-Leucin-Aminosäuremotive oder tyrosinbasierte Sequenzen, welche Proteine zu lysosomalen Kompartimenten dirigieren können, assoziiert sind. Für HIV hängt der Transport und Austritt von viralen Partikeln von der Myristoylierung des Glycinrests Nr. 2 am Aminoterminus von gag ab.
Zusammenfassung der Erfindung
Es werden synthetische DNA-Moleküle bereitgestellt, die für HIV-gag und Modifizierungen von HIV-gag codieren. Speziell wird ein DNA-Plasmid-Vakzinvektor gemäß dem hier folgenden Anspruch 1 bereitgestellt. Die Codons der synthetischen Moleküle umfassen die bevorzugten Codons der vorgesehenen Wirtszelle. Die synthetischen Moleküle stellen bevorzugte Formen von fremdem genetischen Material bereit. Die synthetischen Moleküle können als Polynukleotid-Vakzin verwendet werden, welches eine effektive Immunprophylaxe gegen eine HIV-Infektion durch neutralisierende Antikörper und zellvermittelte Immunität bereitstellt. Diese Erfindung stellt Polynukleotide bereit, welche bei direkter Einführung in einen Vertebraten in vivo, einschließlich Säuger wie Primaten und Menschen, die Expression von codierten Proteinen innerhalb des Lebewesens induzieren.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die relative Expression von gag und tPA-gag in Transfektanten der 293-Zelllinie nach Transfektion mit HIV-gag-DNA.
2 zeigt optimierte HIV-gag- und tPA-gag-DNA-Vakzin-vermittelte Serumreaktionen gegen gag in Mäusen.
3 zeigt Anti-gag-CTL-Reaktionen von Splenozyten, die aus Mäusen nach Impfung mit optimierter HIV-gag- oder tPA-gag-DNA erhalten wurden.
4 zeigt gag-Antigen-spezifische Zytokin-Sekretion von Splenozyten, erhalten aus Mäusen nach Impfung mit optimierter HIV-gag- oder tPA-gag-DNA.
5 zeigt Anti-HIV-gag-CTL aus Mäusen, die mit HIV-p55-gag-DNAs geimpft wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es werden synthetische DNA-Moleküle, die für HIV-gag codieren, und synthetische DNA-Moleküle, die für modifizierte Formen von HIV-gag codieren, bereitgestellt. Die Codons der synthetischen Moleküle sind so gestaltet, dass die von der vorgesehenen Wirtszelle bevorzugten Codons verwendet werden. Die synthetischen Moleküle können als Polynukleotid-Vakzin verwendet werden, welches eine effektive Immunprophylaxe gegen eine HIV-Infektion durch neutralisierenden Antikörper und zellvermittelte Immunität bereitstellt. Die synthetischen Moleküle können als immunogene Zusammensetzung verwendet werden.
Diese Erfindung stellt Polynukleotide bereit, welche bei direkter Einführung in einen Vertebraten in vivo, einschließlich Säuger wie Primaten und Menschen, die Expression codierter Proteine innerhalb des Lebewesens induzieren.
Wie hier verwendet, ist ein Polynukleotid eine Nukleinsäure, welche essentielle regulatorische Elemente enthält, so dass sie nach Einführung in eine lebende Vertebratenzelle in der Lage ist, die zelluläre Maschinerie zu steuern, um Translationsprodukte zu bilden, welche von den Genen, die das Polynukleotid umfasst, codiert werden. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Polynukleotid eine Polydesoxyribonukleinsäure, die mindestens ein HIV-Gen in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem transkriptionalen Promotor umfasst. Wenn das von dem Polynukleotid codierte Protein eines ist, welches normalerweise in dem Lebewesen nicht vorkommt, außer unter pathologischen Zuständen (d.h. ein heterologes Protein), wie z.B. Proteine, die mit Human-Immunschwäche-Virus (HIV), dem ätiologischen Agens von erworbenem Immunschwäche-Syndrom (AIDS), assoziiert sind, wird das Immunsystem des Lebewesens aktiviert, um eine schützende Immunreaktion zu starten. Nachdem diese exogenen Proteine von den Geweben des Lebewesens gebildet werden, werden die exprimierten Proteine von dem Haupthistokompatibilitätssystem, MHC, analog zu der Weise beim Stattfinden einer tatsächlichen Infektion mit dem verwandten Organismus (HIV) prozessiert. Das Ergebnis ist, wie in dieser Offenbarung gezeigt, die Induktion von Immunreaktionen gegen das zugehörige Pathogen.
Dementsprechend haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren hergestellt, welche bei Einführung in das biologische System die Expression von HIV-Proteinen und -Epitopen induzieren. Die induzierte Antikörperreaktion ist spezifisch für das exprimierte HIV-Protein und neutralisiert auch HIV. Darüber hinaus werden zytotoxische T-Lymphozyten, welche HIV-infizierte Zellen spezifisch erkennen und zerstören, induziert.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht ein Verfahren zur Verwendung eines Polynukleotids, welches, nach Einführung in Säugergewebe, die Expression diskreter Genprodukte in einer einzigen Zelle in vivo induziert. Die vorliegende Erfindung stellt eine andere Lösung bereit, welche nicht mehrere Manipulationen von rev-abhängigen HIV-Genen, um rev-unabhängige Gene zu erhalten, erfordert. Das hier beschriebene rev-unabhängige Expressionssystem ist als solches an sich von Nutzen und ein System zur Demonstration der Expression eines einzelnen gewünschten Genprodukts in einer einzelnen Zelle in vivo.
Nachdem viele der Anwendungen der vorliegenden Erfindung eine antivirale Impfung betreffen, werden die Polynukleotide häufig als Polynukleotid-Vakzin oder PNV bezeichnet. Dies bedeutet nicht, dass zusätzliche Anwendungen dieser Polynukleotide, bei der Immunstimulation oder in Antitumor-Therapien, als außerhalb des Rahmens der Erfindung betrachtet werden.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Gen, das für ein HIV-gag-Antigen codiert, in einen Expressionsvektor inkorporiert. Der Vektor enthält einen transkriptionalen Promotor, der von einer eukaryotischen RNA-Polymerase erkannt wird, und einen transkriptionalen Terminator am Ende der für das HIV-Gen codierenden Sequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor der Cytomegalovirus-Promotor mit der Intron A-Sequenz (CMV-intA), obwohl Fachleute auf dem Gebiet erkennen werden, dass irgendwelche einer Reihe anderer bekannter Promotoren, wie z.B. der starke Immunglobulinpromotor oder andere eukaryotische Genpromotoren, verwendet werden können. Ein bevorzugter transkriptionaler Terminator ist der Rinderwachstumshormon-Terminator. Die Kombination von CMVintA-BGH-Terminator ist besonders bevorzugt.
Zur Unterstützung der Herstellung der Polynukleotide in prokaryotischen Zellen ist auch vorzugsweise ein Antibiotikaresistenzmarker unter der transkriptionalen Kontrolle eines prokaryotischen. Promotors in dem Expressionsvektor eingeschlossen, so dass die Expression des Antibiotikums nicht in eukaryotischen Zellen stattfindet. Ampicillinresistenzgene, Neomycinresistenzgene und andere pharmazeutisch annehmbare Antibiotikaresistenzmarker können verwendet werden. Zur Unterstützung der Produktion hoher Niveaus des Polynukleotids mittels Fermentation im prokaryotischen Organismen ist es vorteilhaft, dass der Vektor einen prokaryotischen Replikationsursprung enthält und eine hohe Kopienzahl aufweist. Eine Reihe von im Handel erhältlichen prokaryotischen Klonierungsvektoren bietet diese Vorteile. Es ist wünschenswert, nicht-essentielle DNA-Sequenzen zu entfernen. Es ist ebenfalls wünschenswert, dass die Vektoren nicht zur Replikation in eukaryotischen Zellen in der Lage sind. Dies minimiert das Risiko der Integration von Polynukleotid-Vakzin-Sequenzen in das Genom des Empfängers. Gewebespezifische Promotoren oder Enhancer können eingesetzt werden, wann immer es wünschenswert ist, die Expression des Polynukleotids auf einen speziellen Gewebetyp zu beschränken.
In einer Ausführungsform wird der Expressionsvektor pnRSV verwendet, wobei das lange terminale Repeat (LTR) des Rous-Sarkoma-Virus (RSV) als Promotor verwendet wird. In einer anderen Ausführungsform wird V1, ein mutierter pBR322-Vektor, in welchen der CMV-Promotor und der BGH-Transkriptionsterminator kloniert wurden, verwendet. In einer weiteren Ausführungsform wurden die Elemente von V1 und pUC19 kombiniert, um einen Expressionsvektor mit der Bezeichnung V1J zu erzeugen. In V1J oder einen anderen wünschenswerten Expressionsvektor ist ein HIV-Gen, gag, kloniert, welches eine Anti-HIV-Immunreaktion induzieren kann. In einer weiteren Ausführungsform ist das Ampicillin-Resistenzgen aus V1J entfernt und durch ein Neomycin-Resistenzgen ersetzt, um V1J-neo zu erzeugen, worin das HIV-gag-Gen kloniert wurde zur Verwendung gemäß dieser Erfindung. In einer weiteren Ausführungsform ist der Vektor V1Jns, welcher mit V1Jneo identisch ist, mit der Ausnahme, dass eine nur einmal vorkommende Sfi1-Restriktionsstelle in die einzige Kpn1-Stelle an Position 2114 von V1J-neo eingeführt wurde. Das Auftreten von Sfi1-Stellen in humaner genomischer DNA ist sehr gering (etwa eine Stelle pro 100.000 Basen). Somit erlaubt dieser Vektor eine sorgfältige Überwachung der Expressionsvektor-Integration in Wirt-DNA einfach durch Sfi1-Verdauung von extrahierter genomischer DNA. In einer weiteren Verfeinerung ist der Vektor V1R. Bei diesem Vektor wurde möglichst viel nicht-essentielle DNA "weggeschnitten", um einen sehr kompakten Vektor zu erzeugen. Dieser Vektor ist ein Derivat von V1Jns. Dieser Vektor erlaubt die Verwendung größerer Inserts mit weniger Bedenken, dass unerwünschte Sequenzen codiert werden, und optimiert die Aufnahme durch Zellen.
Eine Ausführungsform dieser Erfindung inkorporiert Gene, die für HIV-gag aus im Labor adaptierten Stämmen von HIV wie IIIB oder CAM-1 codieren. Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass die Verwendung von Genen aus anderen Stämmen von HIV-1- oder HIV-2-Stämmen mit analoger Funktion zu den Genen von HIV-1 erwartungsgemäß Immunreaktionen hervorrufen wird, die den hier für HIV-1-Konstrukte beschriebenen analog sind. Die Klonierungs- und Manipulierungsverfahren für den Erhalt dieser Gene sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Sequenzen für viele Gene vieler HIV-Stämme sind nun öffentlich bei GENBANK verfügbar und solche primären Feldisolate von HIV sind vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) verfügbar, welches mit Quality Biological, Inc., [7581 Lindbergh Drive, Gaithersburg, Maryland 20879] einen Vertrag geschlossen hat, um diese Stämme verfügbar zu machen. Solche Stämme sind auch von der World Health Organization (WHO) [Network for HIV Isolation and Characterization, Vaccine Development Unit, Office of Research, Global Programme on AIDS, CH-1211 Genf 27, Schweiz] erhältlich. Anhand dieser Arbeit werden Fachleute auf dem Gebiet erkennen, dass eine der Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Systems für sowohl in vivo- als auch in vitro-Tests und -Analyse ist, so dass eine Korrelation der HIV-Sequenzvielfalt mit der Serologie einer HIV-Neutralisation sowie anderen Parametern durchgeführt werden kann. Die Inkorporation von Genen aus primären Isolaten von HIV-Stämmen ergibt ein Immunogen, welches Immunreaktionen gegen klinische Isolate des Virus induziert und somit einen bisher nicht gestillten Bedarf auf dem Gebiet stillt. Ferner kann, wenn sich die virulenten Isolate verändern, das Immunogen modifiziert werden, um erforderlichenfalls neue Sequenzen zu reflektieren.
Um die Terminologie einheitlich zu halten, wird der folgenden Konvention zur Beschreibung von Polynukleotid-Immunogen-Konstrukten gefolgt: "Vektorbezeichnung-HIV-Stamm-Gen-zusätzliche Elemente". Die zusätzlichen Elemente, die dem Konstrukt hinzugefügt werden, sind detaillierter im folgenden beschrieben. Wenn sich der ätiologische Stamm des Virus verändert, kann das bestimmte Gen, welches für die Inkorporation in das Pharmazeutikum optimal ist, verändert werden. Jedoch ist, wie im folgenden demonstriert, die Stammvariabilität bei dem Immunogen und den Vakzinen dieser Erfindung im Vergleich mit den Gesamtvirus-Vakzinen oder Vakzinen auf Untereinheitspolypeptid-Basis weniger kritisch, da CTL-Reaktionen induziert werden, welche zum Schutz gegen heterologe Stämme in der Lage sind. Da das Pharmazeutikum leicht für die Einführung eines neuen Gens manipuliert wird, ist dies darüber hinaus eine Einstellung, welche unschwer mit den Standardtechniken der Molekularbiologie durchgeführt wird kann.
Der Begriff "Promotor", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Erkennungsstelle auf einem DNA-Strang, an welche die RNA-Polymerase bindet. Der Promotor bildet einen Initiationskomplex mit RNA-Polymerase, um die transkriptionale Aktivität zu initiieren und zu steuern. Der Komplex kann durch aktivierende Sequenzen, als "Enhancer" bezeichnet, oder durch inhibierende Sequenzen, als "Silencer" bezeichnet, modifiziert werden.
Der Begriff, "Leader", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine DNA-Sequenz am 5'-Ende eines Strukturgens, welche zusammen mit dem Gen transkribiert wird. Der Leader führt gewöhnlich dazu, dass das Protein eine N-terminale Peptidverlängerung aufweist, manchmal als Prosequenz bezeichnet. Für Proteine, die entweder für die Sekretion in das extrazelluläre Medium oder für eine Membran bestimmt sind, steuert diese Signalsequenz, welche im Allgemeinen hydrophob ist, das Protein in das endoplasmatische Retikulum, von dem aus es zum entsprechenden Bestimmungsort transportiert wird.
Der Begriff "Intron", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Abschnitt von DNA, der in der Mitte eines Gens vorkommt, welcher nicht für eine Aminosäure in dem Genprodukt codiert. Die Vorläufer-RNA des Introns wird ausgeschnitten und wird deshalb nicht in mRNA transkribiert oder in Protein translatiert.
Der Begriff "Kassette" bezieht sich auf die Sequenz der vorliegenden Erfindung, welche die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz enthält. Die Kassette ist dem Konzept nach einem Kassettenband ähnlich. Jede Kassette wird ihr eigene Sequenz aufweisen. So wird der Vektor durch Austausch der Kassette eine unterschiedliche Sequenz exprimieren. Aufgrund der Restriktionsstellen an den 5'- und 3'-Enden kann die Kassette leicht inseriert, entfernt oder durch eine andere Kassette ersetzt werden.
Der Begriff "3-untranslatierte Region" oder "3'-UTR" bezieht sich auf die Sequenz am 3'-Ende eines Strukturgens, welche gewöhnlich mit dem Gen transkribiert wird. Diese 3'-UTR-Region enthält gewöhnlich die Poly-A-Sequenz. Obwohl die 3'-UTR von der DNA transkribiert wird, wird sie vor der Translation in das Protein ausgeschnitten.
Der Begriff "nicht-codierende Region" oder "NCR" bezieht sich auf die Region, welche an die 3'-UTR-Region des Strukturgens angrenzt. Die NCR-Region enthält ein transkriptionales Terminationssignal.
Der Begriff "Restriktionsstelle" bezieht sich auf eine sequenz-spezifische Spaltstelle von Restriktionsendonukleasen.
Der Begriff "Vektor" bezieht sich auf einige Mittel, mit denen DNA-Fragmente in einen Wirtsorganismus oder ein Wirtsgewebe eingeführt werden können. Es gibt verschiedene Typen von Vektoren, einschließlich Plasmid, Bakteriophagen und Cosmide.
Der Begriff "wirksame Menge" bedeutet, dass ausreichend PNV zur Bildung der adäquaten Niveaus des Polypeptids injiziert wird. Ein Fachmann auf dem Gebiet erkennt, dass dieses Niveau variieren kann.
Zur Bereitstellung einer Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird der folgende Hintergrund bezüglich HIV bereitgestellt. Das Human-Immunschwäche-Virus hat ein Ribonukleinsäure (RNA)-Genom. Dieses RNA-Genom muss nach im Stand der Technik bekannten Verfahren revers transkribiert werden, um eine cDNA-Kopie zur Klonierung und Manipulation nach den hier gelehrten Verfahren zu erzeugen. An jedem Ende des Genoms befindet sich ein langes terminales Repeat, welches als Promotor wirkt. Zwischen diesen Termini codiert das Genom, in verschiedenen Leserahmen, gag-pol-env als hauptsächliche Genprodukte: gag ist das gruppenspezifische Antigen; pol ist die reverse Transkriptase oder Polymerase; ebenfalls von dieser Region codiert, in einem alternativen Leserahmen, wird die virale Protease, welche für die posttranslationale Prozessierung verantwortlich ist, beispielsweise von gp160 in gp120 und gp41; env ist das Hüllprotein; vif ist der Virion-Infektivitätsfaktor; rev ist der Regulator der Virion-Protein-Expression; neg ist der negative Regulationsfaktor; vpu ist der Virion-Produktivitätsfaktor "u"; tat ist der Transaktivator der Transkription; vpr ist das virale Protein r. Die Funktion jedes dieser Elemente wurde beschrieben.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung ist ein Gen, welches für ein HIV-gag-Protein codiert, direkt mit einem transkriptionalen Promotor verknüpft. Jedoch ist die Expression von gag in Abwesenheit von rev aufgrund mangelnden Exports aus dem Zellkern von nichtgespleißten Genen unterdrückt. Zur Verständnis dieses Systems muss der Lebenszyklus von HIV detaillierter beschrieben werden.
Im Lebenszyklus von HIV wird nach Infektion einer Wirtszelle das HIV-RNA-Genom revers in eine provirale DNA transkribiert, welche in die genomische Wirts-DNA als eine einzige transkriptionale Einheit integriert wird. Das LTR liefert den Promotor, welcher HIV-Gene in 5'- zu 3'-Richtung transkribiert (gag, pol, env), um ein ungespleißtes Transkript des gesamten Genoms zu bilden. Das ungespleißte Transkript fungiert als die mRNA, von der gag und pol translatiert werden, während ein begrenztes Spleißen für die Translation der env-codierten Gene stattfinden muss. Für das zu exprimierende regulatorische Genprodukt rev muss mehr als ein Spleißereignis stattfinden, da im genomischen Rahmen rev und env überlappen, wie in 1 gezeigt. Damit die Transkription von env stattfinden kann, muss die rev-Transkription aufhören und umgekehrt. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von rev für den Export von ungespleißter RNA aus dem Zellkern erforderlich. Damit rev in dieser Weise funktionieren kann, muss jedoch ein rev-Response-Element (RRE) auf dem Transkript vorhanden sein [Malim et al., Natur 338: 254–257 (1989)].
In dem Polynukleotid-Vakzin dieser Erfindung ist das obligatorische Spleißen bestimmter HIV-Gene ausgeschaltet durch die Bereitstellung vollständig gespleißter Gene (d.h. die Bereitstellung eines vollständigen offenen Leserahmen für das gewünschte Genprodukt ohne das Erfordernis von Umschaltungen im Leserahmen oder Eliminierung nichtcodierender Regionen; Durchschnittsfachleute auf dem Gebiet würden erkennen, dass sich beim Spleißen eines bestimmten Gens eine gewisse Variationsbreite in der resultierenden genauen Sequenz ergibt; solange jedoch eine funktionelle codierende Sequenz erhalten wird, ist dies akzeptabel). Somit wird in einer Ausführungsform die gesamte codierende Sequenz für gag so gespleißt, dass keine unterbrochene Expression eines jeden Genprodukts erforderlich ist.
Die zweifachen humoralen und zellulären Immunreaktionen, welche gemäß dieser Erfindung hervorgerufen werden, sind besonders bedeutsam für die Inhibierung der HIV-Infektion, aufgrund der Neigung von HIV zur Mutation innerhalb der Population sowie innerhalb infizierter Individuen. Zur Formulierung eines effektiven schützenden Vakzins gegen HIV ist es wünschenswert, sowohl eine multivalente Antikörperreaktion gegen beispielsweise gp160 (env ist zu etwa 80% bei verschiedenen HIV-1-Klasse B-Stämmen konserviert, welche die vorherrschenden Stämme in humanen US-Populationen sind), das prinzipielle Neutralisationsziel auf HIV, als auch zytotoxische T-Zellen, welche mit den konservierten Abschnitten von gp160 und viralen inneren Proteinen, die von gag codiert werden, reagieren können, hervorzurufen. Wir haben ein HIV-Vakzin hergestellt, umfassend gp160-Gene, die aus üblichen Laborstämmen, aus vorherrschenden primären viralen Isolaten, die innerhalb der infizierten Population gefunden wurden, aus mutierten gp160, die zur Demaskierung von stammüber-greifenden neutralisierenden Antikörper-Epitopen konstruiert worden sind, und anderen repräsentativen HIV-Genen, wie z.B. den gag- und pol-Genen (~95% konserviert bei HIV-Isolaten), ausgewählt wurden.
Praktisch alle HIV-seropositiven Patienten, welche noch nicht bis zu einem Immunschwäche-Status fortgeschritten sind, beherbergen Anti-gag-CTLs, während etwa 60% dieser Patienten stammübergreifende gp160-spezifische CTLs zeigen. Die Menge von HIV- spezifischen CTLs, welche in infizierten Individuen, die zu dem als AIDS bekannten Krankheitszustand fortgeschritten sind, gefunden wird, ist jedoch viel niedriger, welches die Bedeutung unserer Befunde, dass wir stammübergreifende CTL-Reaktionen induzieren können, demonstriert.
Immunreaktionen, welche von unseren env- und gag-Polynukleotid-Vakzin-Konstrukten induziert werden, werden in Mäusen und Primaten demonstriert. Die Überwachung der Antikörperproduktion gegen env in Mäusen erlaubt die Bestätigung, dass ein gegebenes Konstrukt in geeigneter Weise immunogen ist, d.h. ein hoher Anteil geimpfter Tiere eine Antikörperreaktion zeigt. Mäuse bieten auch das einfachste Tiermodell, welches zum Testen der CTL-Induktion durch unsere Konstrukte geeignet ist, und werden deshalb zur Ermittlung, ob ein spezielles Konstrukt zur Hervorrufung einer solchen Aktivität in der Lage ist, verwendet. Affen (Afrikanische Grüne Meerkatze, Rhesus, Schimpansen) bieten weitere Spezies, einschließlich Primaten, zur Antikörperbewertung in größeren Nicht-Nagetieren. Diese Spezies sind auch für Antiseren-Neutralisierungsassays aufgrund der hohen Niveaus endogener neutralisierender Aktivitäten gegen Retroviren, die in Mausseren beobachtet werden, gegenüber Mäusen bevorzugt. Diese Daten demonstrieren, dass unsere Vakzine eine ausreichende Immunogenität verleihen, um in Experimenten in einem Schimpansen/-HIV_IIIB-Herausforderungsmodell, basierend auf bekannten schützenden Niveaus neutralisierender Antikörper für dieses System, einen Schutz zu erreichen. Jedoch bewegt sich die gegenwärtig entwickelnde und zunehmend akzeptierte Definition von Schutz in der wissenschaftlichen Gemeinschaft weg von der sog. "sterilisierenden Immunität", welche einen vollständigen Schutz vor einer HIV-Infektion zur Verhütung der Krankheit anzeigt. Eine Anzahl Korrelate dieses Ziels beinhalten verringerte Virustiter im Blut, wie gemessen durch PCR, reverse HIV-Transkriptase-Aktivität, durch Infektivität von Serumproben, mittels eines ELISA-Assays von p24- oder einer anderen HIV-Antigen-Konzentration im Blut, erhöhte CD4⁺-T-Zell-Konzentration und durch verlängerte Überlebensraten [siehe beispielsweise Cohen, J., Science 262: 1820–1821, 1993, hinsichtlich einer Erörterung der sich entwickelnden Definition von Anti-HIV-Vakzin-Wirksamkeit]. Die Immunogene der vorliegenden Erfindung rufen auch neutralisierende Immunreaktionen gegen infektiöse Isolate (klinische Isolate, primäre Feldisolate) von HIV hervor.
Ein ELISA-Assay wird verwendet, um festzustellen, ob optimierte gag-Vakzinvektoren, die entweder sekretiertes tPA-gag oder natives gag exprimieren, zur Produktion von gag-spezifischen Antikörpern wirksam sind. Eine erste in vitro-Charakterisierung der gag-Expression durch unsere Vakzinierungsvektoren wird bereitgestellt durch Immunoblot-Analyse von optimierten gag-transfizierten Zelllysaten. Diese Daten bestätigen und quanti fizieren die gag-Expression unter Verwendung von Anti-HIV-Antiseren, um die gag-Expression von Transfektantenzellen sichtbar zu machen.
Hervorrufung von CTL-Reaktionen. Virale Proteine, welche innerhalb von Zellen synthetisiert werden, führen zu MHC I-beschränkten CTL-Reaktionen. Jedes dieser Proteine ruft CTL in seropositiven Patienten hervor. Unsere Vakzine sind auch in der Lage, CTL in Mäusen und Rhesusaffen hervorzurufen. Die Immungenetik von Mausstämmen eignet sich für solche Studien, wie mit Influenza-NP demonstriert (siehe Ulmer et al., Science 259: 1745–1749, 1993). Mehrere Epitope wurden für die HIV-Proteine env, rev, nef und gag in Balb/c-Mäusen definiert (Frankel, F. R., et al., J. Immunol. 155, 4775–82 (1995)), wodurch in vitro-CTL-Kultur- und -Zytotoxizitäts-Assays erleichtert werden. Alternativ könnte das vollständige Gen, welches für gp160, gp120, pol oder gag codiert, verwendet werden. Hinsichtlich eines zusätzlichen Überblicks über diesen Gegenstand siehe z.B. HIV Molecular Immunology Database, 1995, Korber et al., Hrsg., (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM, USA). Wie hier verwendet, ist die T-Zell-Effektorfunktion assoziiert mit dem reifen T-Zell-Phänotyp, beispielsweise Zytotoxizität, Zytokin-Sekretion für die B-Zell-Aktivierung und/oder Induktion oder Stimulation von Makrophagen und Neutrophilen.
Messung von T_H-Aktivitäten. Von geimpften Tieren erhaltene Milzzellkulturen werden hinsichtlich der Erinnerung an spezifische Antigene durch Zugabe von entweder rekombinantem Protein oder Peptid-Epitopen getestet. Die Aktivierung von T-Zellen durch solche Antigene, präsentiert von begleitenden antigen-präsentierenden Milzzellen, APCs, wird durch Proliferation dieser Kulturen oder mittels Zytokin-Produktion überprüft. Das Muster der Zytokin-Produktion erlaubt auch eine Klassifizierung der T_H-Reaktion als Typ 1 oder Typ 2. Nachdem dominante T_H2-Reaktionen mit dem Ausschluss zellulärer Immunität bei immungeschwächten seropositiven Patienten korreliert zu sein scheinen, ist es möglich, den Typ einer Reaktion, welcher durch ein gegebenes PNV in Patienten hervorgerufen wird, festzustellen, was eine Manipulation der resultierenden Immunreaktionen erlaubt.
Auf Grundlage der obigen immunologischen Studien ist es vorhersagbar, dass unsere Vakzine in Vertebraten gegenüber einer Herausforderung durch virulentes HIV wirksam sind. Diese Studien werden in einem HIV_IIIB/Schimpansen-Herausforderungsmodell nach ausreichender Impfung dieser Tiere mit einem PNV-Konstrukt oder einer Mischung von PNV-Konstrukten, umfassend gp160_IIIB, gag_IIIB, nef_IIIB und REV_IIIB, durchgeführt. Der IIIB-Stamm ist in dieser Hinsicht nützlich, da der Schimpansentiter von tödlichen Dosen dieses Stammes festgestellt wurde. Jedoch werden dieselben Studien unter Verwendung eines beliebigen Stammes von HIV und der für den gegebenen Stamm spezifischen oder heterologen Epitope in Betracht gezogen. Ein zweites Impf/Herausforderungsmodell neben Schimpansen ist die scid-hu-PBL-Maus. Dieses Modell erlaubt das Testen des humanen Lymphozyten-Immunsystems und unseres Vakzins mit einer nachfolgenden HIV-Herausforderung in einem Maus-Wirt. Dieses System ist vorteilhaft, da es leicht zur Verwendung mit irgendeinem HIV-Stamm adaptiert wird und einen Nachweis des Schutzes gegen mehrere Stämme von primären Feldisolaten von HIV liefert. Ein drittes Herausforderungsmodell verwendet hybride HIV/SIV-Viren (SHIV), von denen bei einigen demonstriert wurde, dass sie Rhesusaffen infizieren und zu einer Immunschwächeerkrankung führen, die zum Tod führt [siehe Li, J., et al., J. AIDS 5: 639–646, 1992]. Die Impfung von Rhesusaffen mit unseren Polynukleotid-Vakzin-Konstrukten schützt gegen eine nachfolgende Herausforderung mit tödlichen Dosen an SHIV.
Die Schutzwirksamkeit von Polynukleotid-HIV-Immunogenen gegen eine nachfolgende virale Herausforderung wird demonstriert durch Immunisierung mit der nichtreplizierenden Plasmid-DNA dieser Erfindung. Dies ist von Vorteil, da kein infektiöses Agens involviert ist, die Assemblierung von Viruspartikeln nicht erforderlich ist und eine Determinanten-Selektion ermöglicht wird. Ferner wird, da die Sequenz von gag bei verschiedenen Stämmen von HIV konserviert ist, ein Schutz gegen eine nachfolgende Herausforderung durch sowohl einen virulenten Stamm von HIV, der homolog zu dem Stamm ist, aus dem das klonierte Gen erhalten wurde, als auch durch heterologe Stämme ermöglicht.
Die Erfindung bietet ein Mittel zur Induktion einer stammübergreifenden schützenden Immunität ohne die Notwendigkeit selbstreplizierender Agenzien oder Adjuvanzien. Darüber hinaus bietet eine Immunisierung mit den vorliegenden Polynukleotiden eine Reihe anderer Vorteile.
Die Leichtigkeit der Herstellung und Reinigung von DNA-Konstrukten ist günstig im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren der Proteinreinigung und erleichtert somit die Herstellung von Kombinations-Vakzinen. Demgemäß können Mehrfachkonstrukte, beispielsweise codierend für gp160, gp120, gp41, gag oder irgendein anderes HIV-Gen, hergestellt, gemischt und gemeinsam verabreicht werden. Nachdem die Proteinexpression nach DNA-Injektion aufrecht erhalten wird, kann die Dauer der B- und T-Zell-Erinnerung erhöht werden, wodurch eine langfristige humorale und zellvermittelte Immunität verliehen wird.
Standardtechniken der Molekularbiologie zur Herstellung und Reinigung von DNA-Konstrukten ermöglichen die Herstellung der DNA-Immunogene dieser Erfindung. Obwohl Standardtechniken der Molekularbiologie deshalb zur Herstellung der Produkte dieser Erfindung ausreichend sind, stellen die hier offenbarten speziellen Konstrukte neue Polynukleotid-Immunogene bereit, welche überraschenderweise eine stammübergreifende und Primär-HIV-Isolat-Neutralisierung ergeben, ein Ergebnis, das bisher mit Standard- Vakzinen auf der Basis von inaktiviertem ganzen Virus oder Untereinheitsprotein nicht erreichbar war.
Die Menge an exprimierbarer DNA oder transkribierter RNA, die in einen Vakzin-Empfänger eingeführt werden soll, wird von der Stärke der verwendeten transkriptionalen und translationalen Promotoren und der Immunogenität des exprimierten Genprodukts abhängen. Im Allgemeinen wird eine immunologisch oder prophylaktisch wirksame Dosis von etwa 1 ng bis 100 mg und vorzugsweise etwa 10 μg bis 300 μg direkt in Muskelgewebe verabreicht. Subkutane Injektion, intradermale Einführung, Impression durch die Haut und andere Verabreichungsweisen, wie z.B. intraperitoneale, intravenöse Abgabe oder Abgabe mittels Inhalation, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Es wird auch in Betracht gezogen, dass Booster-Impfungen vorzusehen sind. Nach der Impfung mit HIV-Polynukleotid-Immunogen wird ein Boosting mit HIV-Protein-Immunogenen wie den Genprodukten gp160, gp120 und gag ebenfalls in Betracht gezogen. Eine parenterale Verabreichung, wie z.B. intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder anderweitige Verabreichung von Interleukin-12-Protein, gleichzeitig mit der oder anschließend an die parenterale Einführung des PNV dieser Erfindung ist ebenfalls von Vorteil.
Das Polynukleotid kann nackt sein, d.h. nicht assoziiert mit irgendwelchen Proteinen, Adjuvanzien oder anderen Mitteln, welche einen Einfluss auf das Immunsystem des Empfängers haben. In diesem Fall ist es wünschenswert, dass das Polynukleotid in einer physiologisch annehmbaren Lösung vorliegt, wie z.B., jedoch nicht beschränkt auf, sterile Salzlösung oder sterile gepufferte Salzlösung. Alternativ kann die DNA mit Liposomen, wie z.B. Lecithin-Liposomen oder anderen im Stand der Technik bekannten Liposomen, als DNA-Liposom-Mischung assoziiert sein oder die DNA kann mit einem im Stand der Technik bekannten Adjuvans assoziiert sein, um Immunreaktionen zu verstärken, wie z.B. ein Protein oder ein anderer Träger. Agenzien, welche die zelluläre Aufnahme von DNA fördern, wie z.B., jedoch nicht beschränkt auf, Calciumionen, können ebenfalls vorteilhaft eingesetzt werden. Diese Agenzien werden hier allgemein als transfektionserleichternde Reagenzien und pharmazeutisch annehmbare Träger bezeichnet. Techniken zur Beschichtung von Mikroprojektilen, die mit Polynukleotid beschichtet sind, sind im Stand der Technik bekannt und in Zusammenhang mit dieser Erfindung ebenfalls von Nutzen.
Die folgenden Beispiele dienen nur zur Erläuterung und sollen die Erfindung in keiner Weise beschränken.
BEISPIEL 1
Heterologe Expression von späten HIV-Genprodukten
HIV-Strukturgene, wie z.B. env und gag, erfordern die Expression des regulatorischen HIV-Gens rev, um effizient Volllängenproteine zu produzieren. Wir haben festgestellt, dass die rev-abhängige Expression von gag niedrige Proteinniveaus ergab und dass rev selbst für Zellen toxisch sein kann. Obwohl wir relativ hohe Niveaus an rev-abhängiger Expression von gp160 in vitro erzielten, rief dieses Vakzin niedrige Niveaus an Antikörpern gegen gp160 nach einer in vivo-Immunisierung mit rev/gp160-DNA hervor. Dies kann auf den bekannten zytotoxischen Wirkungen von rev sowie einer erhöhten Schwierigkeit bei der Erhaltung der rev-Funktion in Myotubuli, die Hunderte von Kernen enthalten (das rev-Protein muss im selben Kern wie ein rev-abhängiges Transkript vorliegen, damit eine gag- oder env-Proteinexpression stattfinden kann), beruhen. Es war jedoch unter Verwendung ausgewählter Modifikationen des env-Gens möglich, eine rev-unabhängige Expression zu erhalten.
Im Allgemeinen wurde bei unseren Vakzinen primär HIV (IIIB, NM oder CAM-1)-env- und -gag-Gene für die Optimierung der Expression innerhalb unseres allgemeinen Vakzinierungsvektors V1Jns, umfassend einen CMV-"immediate-early" (IE)-Promotor, eine BGH-Polyadenylierungsstelle und ein pUC-Gerüst, eingesetzt. Variierende Effizienzen der rev-unabhängigen Expression, in Abhängigkeit davon, wie groß ein eingesetztes Gensegment ist (z.B. gp120 gegenüber gp160), können für env durch Ersatz seines nativen sekretorischen Leaderpeptids durch dasjenige aus dem Gen des gewebespezifischen Plasminogenaktivators (tPA) und Expression des resultierenden chimären Gens hinter dem CMVIE-Promotor mit dem CMV-Intron A erzielt werden.
Wie zuvor festgestellt, betrachten wir die Realisierung der folgenden Ziele als essentiell zur Maximierung unserer Chancen für einen Erfolg mit diesem Programm: (1) env-basierte Vektoren, die in der Lage sind, stärkere neutralisierende Antikörperreaktionen in Primaten hervorzurufen; (2) gag- und env-Vektoren, welche starke T-Lymphozyten-Reaktionen hervorrufen, wie charakterisiert durch CTL- und Helfer-Effektor-Funktionen in Primaten; (3) Verwendung von env- und gag-Genen aus klinisch relevanten HIV-1-Stämmen in unseren Vakzinen und Charakterisierung der immunologischen Reaktionen, insbesondere Neutralisierung primärer Isolate, die sie hervorrufen; (4) Demonstration von Schutz in einem Tier-Herausforderungsmodell, wie z.B. Schimpanse/HIV (IIIB) oder Rhesus/SHIV, bei Verwendung geeigneter optimierter Vakzine; und (5) Feststellung der Dauer von Immunreaktionen, die für den klinischen Einsatz geeignet sind. Ein signifikanter Fortschritt wurde bezüglich der ersten drei dieser Ziele gemacht und Experimente sind im Gang, um festzustellen, ob unsere jüngsten Vakzin-Konstrukte für gp160 und gag diese ersten Ergebnisse verbessern werden.
BEISPIEL 2
Vektoren für die Vakzin-Produktion
A. Expressionsvektor V1Jneo
Es war erforderlich, das für die Antibiotikaselektion von Bakterien, die V1J beherbergen, verwendete amp^r-Gen zu entfernen, da Ampicillin in großmaßstäblichen Fermentern nicht verwendet werden mag. Das amp^r-Gen aus dem pUC-Gerüst von V1J wurde durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen SspI und Eam1105I entfernt. Das verbleibende Plasmid wurde mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt, mit T4-DNA-Polymerse glattendig gemacht und dann mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase behandelt. Das im Handel erhältliche kan^r-Gen, abgeleitet von dem Transposon 903 und in dem Plasmid pUC4K enthalten, wurde mit Hilfe des Restriktionsenzyms PstI ausgeschnitten, mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt und mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Dieses Fragment wurde mit dem V1J-Gerüst ligiert und Plasmide mit dem kan^r-Gen in jeder Orientierung wurden erhalten, welche als V1Jneo # 1 und 3 bezeichnet wurden. Jedes dieser Plasmide wurde durch Restriktionsenzymverdauungsanalyse, DNA-Sequenzierung der Verbindungsbereiche verifiziert und von ihm gezeigt, dass es ähnliche Mengen an Plasmid wie V1J bildete. Die Expression heterologer Genprodukte für diese V1Jneo-Vektoren war ebenfalls vergleichbar mit V1J. V1Jneo # 3, hier im folgenden als V1Jneo bezeichnet, welcher das kan^r-Gen in der gleichen Orientierung wie das amp^r-Gen in V1J als Expressionskonstrukt enthält, wurde willkürlich von uns ausgewählt.
B) Expressionsvektor V1Jns:
Eine SfiI-Stelle wurde V1Jneo hinzugefügt, um Integrationsstudien zu erleichtern. Ein im Handel erhältlicher 13-Basenpaar-SfiI-Linker (New England BioLabs) wurde an der KpnI-Stelle innerhalb der BGH-Sequenz des Vektors hinzugefügt. V1Jneo wurde mit KpnI linearisiert, gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und mit dem glattendigen SfiI-Linker ligiert. Klonale Isolate wurden mittels Restriktionskartierung ausgewählt und mittels Sequenzierung über den Linker verifiziert. Der neue Vektor wurde als V1Jns bezeichnet. Die Expression heterologer Gene in V1Jns (mit SfiI) war mit der Expression der gleichen Gene in V1Jneo (mit KpnI) vergleichbar.
C) V1Jns-tPA:
Zur Bereitstellung einer heterologen Leader-Peptidsequenz für sekretierte Proteine und/oder Membranproteine wurde V1Jns modifiziert, um den Leader des für Humangewebe spezifischen Plasminogenaktivators (tPA) einzuschließen. Zwei synthetische komplementäre Oligomere wurden verschmolzen und dann in V1Jn ligierf, welcher mit BgIII verdaut worden war. Diese Oligomere haben überhängende Basen, die für die Ligierung mit BGIII-gespaltenen Sequenzen kompatibel sind. Nach der Ligierung ist die stromaufwärts gelegene BgIII-Stelle zerstört, während die stromabwärts gelegene BgIII-Stelle für nachfolgende Ligierungen erhalten bleibt. Sowohl die Verbindungsstellen als auch die gesamte tPA-Leader-Sequenz wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert. Um mit unserem konsensus-optimierten Vektor V1Jns (= V1Jneo mit einer SfiI-Stelle) konform zu gehen, wurde zusätzlich eine SfiI-Restriktionsstelle an der KpnI-Stelle innerhalb des BGH-Terminatorbereichs von V1Jn-tPA planiert, indem die KpnI-Stelle mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht wurde, gefolgt von Ligierung mit einem SfiI-Linker (Katalog-Nr. 1138, New England BioLabs). Diese Modifizierung wurde durch Restriktionsverdauung und Agarosegelelektrophorese verifiziert.
D) Herstellung des Vektors V1R:
In einem Versuch zur Fortsetzung der Optimierung unseres Basis-Vakzinierungsvektors stellten wir ein Derivat von V1Jns, als V1R bezeichnet, her. Der Zweck dieser Vektorkanstruktion war der Erhalt eines Vakzinvektors minimaler Größe, d.h. ohne überflüssige DNA-Sequenzen, welcher immer noch die insgesamt optimierten Charakteristiken der heterologen Genexpression und hohen Plasmidausbeuten behielt, welche V1J und V1Jns liefern. Es wurde anhand der Literatur sowie durch Versuche von uns festgestellt, dass (1) Regionen innerhalb des pUC-Gerüsts, welche den E. coil-Replikationsursprung umfassen, entfernt werden konnten, ohne die Plasmidausbeute aus Bakterien zu beeinflussen; (2) die 3'-Region des kan^r-Gens nach dem offenen Leserahmen von Kanamycin entfernt werden konnte, wenn statt dessen ein bakterieller Terminator inseriert wurde; und (3) ~300 bp von der 3'-Hälfte des BGH-Terminators ohne Beeinflussung seiner regulatorischen Funktion entfernt werden konnten (nach der ursprünglichen KpnI-Restriktionsenzymstelle innerhalb des BGH-Elements).
V1R wurde mit Hilfe von PCR konstruiert, um drei DNA-Segmente von V1Jns, repräsentierend den CMVintA-Promotor/BGH-Terminator, Replikationsursprung bzw. Kanamycinresistenzelemente, zu synthetisieren. Restriktionsenzyme, die für jedes Segment einmalig waren, wurden jedem Segmentende hinzugefügt unter Verwendung der PCR-Oligomere: SspI und XhoI für CMVintA/BGH; EcoRV und BamHI für das kan^r-Gen und BclI und SalI für den ori^r. Diese Enzymstellen wurden gewählt, da sie eine richtungsgesteuerte Ligierung jedes der PCR-abgeleiteten DNA-Segmente mit einem anschließenden Verlust jeder Stelle erlauben: EcoRV und SspI hinterlassen glattendige DNAs, welche für die Ligierung kompatibel sind, während BamHI und BclI komplementäre Überhänge zurücklassen, wie dies SalI und XhoI tun. Nach dem Erhalt dieser Segmente mittels PCR wurde jedes Segment mit den geeigneten, oben angegebenen Restriktionsenzymen verdaut und dann in einer einzigen Reaktionsmischung, die alle drei DNA-Segmente enthielt, zusammenligiert. Das 5'-Ende des ori^r war so gestaltet, dass die rho-unabhängige T2-Terminatorsequenz, die normalerweise in dieser Region gefunden wird, eingeschlossen war, so dass sie eine Terminationsinformation für das Kanamycinresistenzgen liefern konnte. Das ligierte Produkt wurde durch Restriktionsenzymverdauung (> 8 Enzyme) sowie DNA-Sequenzierung der Ligierungsverbindungsbereiche bestätigt. DNA-Plasmid-Ausbeuten und heterologe Expression unter Verwendung viraler Gene innerhalb von V1R scheinen ähnlich zu V1Jns zu sein. Die erreichte Nettoreduktion der Vektorgröße war 1346 bp (V1Jns = 4,86 kb; V1R = 3,52 kb).
BEISPIEL 3
Konstruktion synthetischer Gensegmente für eine erhöhte gag-Genexpression:
Gensequenzen wurden in Sequenzen mit identischen translatierten Sequenzen, jedoch mit einer alternativen Codon-Verwendung, wie definiert von R. Lathe in einem Forschungsartikel aus J. Molec. Biol., Bd. 183, S. 1–12 (1985) mit dem Titel "Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data: Theoretical and Practical Considerations", überführt. Die im folgenden beschriebene Methodik zur Erhöhung der Expression der HIV-gag-Gensegmente basierte auf unserer Hypothese, dass das bekannte Unvermögen zur effizienten Expression dieses Gens in Säugerzellen eine Folge der Gesamttranskriptzusammensetzung ist. Somit könnte die Verwendung alternativer Codons, welche für dieselbe Proteinsequenz codieren, die Beschränkung der Expression von gag aufheben. Das angewandte Verfahren des spezifischen Codon-Ersatzes kann wie folgt beschrieben werden:

1. Identifizierung der Platzierung von Codons für den richtigen offenen Leserahmen.
2. Vergleich des Wildtyp-Codons hinsichtlich der beobachteten Verwendungshäufigkeit durch humane Gene.
3. Falls das Codon nicht das am häufigsten eingesetzte Codon ist, Ersatz durch ein optimales Codon für hohe Expression in humanen Zellen.
4. Wiederholung dieser Prozedur bis das gesamte Gensegment ersetzt wurde.
5. Untersuchung der neuen Gensequenz auf unerwünschte Sequenzen, welche durch diese Codon-Ersetzungen erzeugt wurden (z.B. "ATTTA"-Sequenzen, unabsichtliche Schaffung von Intron-Spleiß-Erkennungsstellen, unerwünschte Restriktionsenzymstellen etc.) und Ersatz durch Codons, welche diese Sequenzen eliminieren.
6. Zusammenbau synthetischer Gensegmente und Test auf verbesserte Expression.

Diese Verfahren wurden angewandt zur Erzeugung der folgenden synthetischen Gensegmente für HIV-gag unter Schaffung eines Gens, das vollständig die optimale Codon-Verwendung für die Expression umfasste. Während die obige Prozedur eine Zusammenfassung unserer Methodik zur Konstruktion von codon-optimierten Genen für DNA-Vakzine liefert, versteht es sich für einen Fachmann, dass eine ähnliche Vakzin-Wirksamkeit oder erhöhte Expression von Genen durch kleinere Abweichung in dem Verfahren oder kleinere Variationen in der Sequenz erzielt werden können.
BEISPIEL 4
1. HIV-gag-Vakzin-Konstrukte:
Dies ist ein kompletter HIV-1 (CAM1)-gag-Orf, der optimale Codons umfasst.
BEISPIEL 5
In vitro-gag-Vakzin-Expression:
Die in vitro-Expression wurde in transfizierten Human-Rhabdomyosarkom (RD)- oder 293-Zellen für diese Konstrukte getestet. Die quantitative Bestimmung von gag aus transfizierten 293-Zellen zeigte, dass der Vektor V1Jns-opt-gag und V1Jns-tPA-opt-gag sekretiertes gag produzierte.
BEISPIEL 6
Assay für HIV-gag-zytotoxische T-Lymphozyten:
Die in diesem Abschnitt beschriebenen Verfahren erläutern den für geimpfte Mäuse verwendeten Assay. Ein im Wesentlichen ähnlicher Assay kann für Primaten verwendet werden, mit Ausnahme dessen, dass autologe B-Zelllinien zur Verwendung als Zielzellen für jedes Lebewesen etabliert werden müssen. Dies kann für Menschen unter Verwendung des Epstein-Barr-Virus und für den Rhesusaffen unter Verwendung des Herpes B-Virus erreicht werden.
Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) werden aus entweder frisch entnommenem Blut oder der Milz mittels FicoII-Hypaque-Zentrifugation zur Abtrennung von Erythrozyten von Leukozyten erhalten. Für Mäuse können auch Lymphknoten verwendet werden. Effektor-CTLs können aus den PBMC hergestellt werden durch entweder in vitro-Kultur in IL-2 (20 E/ml) und Concanavalin A (2 μg/ml) für 6–12 Tage oder mittels eines spezifischen Antigens unter Verwendung einer gleichen Anzahl bestrahlter antigen-präsentierender Zellen. Spezifisches Antigen kann entweder aus synthetischen Peptiden (gewöhnlich 9–15 Aminosäuren), die bekannte Epitope für die CTL-Erkennung des MHC-Haplotyps der verwendeten Tiere sind, oder Vacciniavirus-Konstrukten, die zur Expression des geeigneten Antigens manipuliert wurden, bestehen. Zielzellen können entweder syngene oder im MHC-Haplotyp übereinstimmende Zelllinien sein, welche behandelt wurden, um das geeignete Antigen zu präsentieren, wie für die in vitro-Stimulation der CTLs beschrieben. Für Balb/c-Mäuse wurde das gag-Peptid von Paterson (J. Immunol., 1995) in einer Konzentration von 10 μM eingesetzt, um CTL in vitro unter Verwendung bestrahlter syngener Splenozyten zu restimulieren, und kann zur Sensibilisierung von Zielzellen während des Zytotoxizitäts-Assays durch Inkubation mit 1–10 μM bei 37°C für etwa zwei Stunden vor dem Assay eingesetzt werden. Für diese H-2^d-MHC-Haplotyp-Mäuse ergibt die Maus-Mastozytom-Zelllinie P815 gute Zielzellen. Antigen-sensibilisierte Zielzellen werden mit Na⁵¹CrO₄, welches aus dem Innern der Zielzellen nach Abtötung durch CTL freigesetzt wird, durch Inkubation der Zielzellen für 1–2 Stunden bei 37°C (0,2 mCi für ~5 × 10⁶ Zellen), gefolgt von mehreren Waschungen der Zielzellen, beladen. CTL-Populationen werden mit Zielzellen in variierenden Verhältnissen von Effektorzellen zu Zielzellen, wie z.B. 100:1, 50:1, 25:1 etc., gemischt, zusammen pelletiert und 4–6 Stunden bei 37°C inkubiert, bevor die Überstände geerntet werden, welche dann mit einem Gammazähler hinsichtlich Freisetzung von Radioaktivität untersucht werden. Die Zytotoxizität wird berechnet als Prozentsatz der insgesamt freisetzbaren Zählimpulse aus den Zielzellen (erhalten mittels Behandlung mit 0,2% Triton X-100), wovon die spontane Freisetzung aus den Zielzellen subtrahiert wurde.
BEISPIEL 7
Assay für HIV-gag-spezifische Antikörper:
ELISA wurden entwickelt, um unter Verwendung von spezifischem rekombinantem p24-gag-Protein als Substrat-Antigene gegen HIV gebildete Antikörper nachzuweisen. 96-Mulden-Mikrotiter-Platten wurden bei 4°C über Nacht mit rekombinantem Antigen mit 2 μg/ml in PBS-Lösung (phosphatgepufferte Salzlösung) unter Verwendung von 50 μl/Mulde auf einer Schüttelplattform beschichtet. Die Antigene bestanden aus rekombinantem p24-gag (Intracell). Die Platten wurden viermal mit Waschpuffer (PBS/0,05% Tween-20) gespült, gefolgt von Zugabe von 200 μl/Mulde Blockierungspuffer (1% Carnation-Milchlösung in PBS/0,05% Tween-20) für eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln. Vorseren und Immunserum wurden im Blockierungspuffer auf den gewünschten Verdünnungsbereich verdünnt und 100 μl pro Mulde zugegeben. Die Platten wurden eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert und dann viermal mit Waschpuffer gewaschen.
Mit Meerrettichperoxidase konjugierte sekundäre Antikörper (Antirhesus-Ig, Southern Biotechnoloy Associates; Anti-Maus- und Anti-Kaninchen-Igs, Jackson Immuno Research), 1:2000 im Blockierungspuffer verdünnt, wurden dann jeder Probe mit 100 μl/Mulde zugegeben und eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Die Platten wurden viermal mit Waschpuffer gewaschen und dann durch Zugabe von 100 μl/Mulde einer Lösung von o-Phenylendiamin (o-PD, Calbiochem) mit 1 mg/ml in 100 mM Citratpuffer bei pH 4,5 entwickelt. Die Platten wurden hinsichtlich Extinktion bei 450 nm sowohl kinetisch (die ersten 10 Reaktionsminuten) als auch an Endpunkten nach 10 und 30 Minuten abgelesen (Thermo-max Mikroplattenleser, Molecular Devices).
BEISPIEL 8
T-Zell-Proliferations-Assays:
PBMCs werden erhalten und hisichtlich Erinnerungs-Reaktionen auf spezifisches Antigen getestet, wie bestimmt durch Proliferation in der PBMC-Population. Die Proliferation wird unter Verwendung von ³H-Thymidin überprüft, welches den Zellkulturen für die letzten 18–24 h Inkubation vor der Ernte zugegeben wird. Zellernter halten isotop-enthaltende DNA auf Filtern zurück, wenn die Proliferation stattgefunden hat, während ruhende Zellen das Isotop nicht inkorporieren, welches in freier Form nicht auf dem Filter zurückgehalten wird. Für entweder Nager- oder Primaten-Spezies werden 4 × 10⁵ Zellen in 96-Mulden-Mikrotiterplatten in insgesamt 200 μl vollständigem Medium (RPMI/10%iges fötales Kalbsserum) ausplattiert. Hintergrund-Proliferationsreaktionen werden bestimmt unter Verwendung von PBMCs und Medium allein, während unspezifische Reaktionen durch Verwendung von Lektinen wie Phytohämagglutin (PHA) oder Concanavalin A (ConA) in Konzentrationen von 1–5 μg/ml hervorgerufen werden, um als positive Kontrolle zu dienen. Spezifisches Antigen besteht entweder aus bekannten Peptidepitopen, gereinigtem Protein oder inaktiviertem Virus. Antigenkonzentrationen liegen im Bereich von 1–10 μM für Peptide und 1–10 μg/ml für Protein. Die lektin-induzierte Proliferation erreicht ihr Maximum nach 3–5 Tagen Zellkulturinkubation, während antigen-spezifische Reaktionen ihr Maximum nach 5–7 Tagen erreichen. Eine spezifische Proliferation findet statt, wenn Strahlungszählimpulse erhalten werden, die mindestens dreifach über dem Mediumhintergrund liegen, und wird oft als Verhältnis zum Hintergrund oder Stimulationsindex (SI) angegeben.
BEISPIEL 9
Die eingesetzten Strategien waren dazu bestimmt, sowohl zytotoxische T-Lymphozyten (CTL)- als auch neutralisierende Antikörper-Reaktionen gegen HIV zu induzieren, hauptsächlich gerichtet gegen die HIV-Genprodukte gag (~95% konserviert) und env (gp160 oder gp120; 70–80% konserviert). gp160 enthält die einzigen bekannten neutralisierenden Antikörper-Epitope auf dem HIV-Partikel, während die Bedeutung der Anti-env- und Anti-gag-CTL-Reaktionen unterstrichen wird durch die bekannte Assoziation des Beginns dieser zellulären Immunitäten mit der Clearance der primären Virämie nach einer Infektion, welche vor dem Auftreten neutralisierender Antikörper stattfindet (Koup et al., J. Virol. 68: 4650 (1994)) sowie eine Rolle für CTL bei der Erhaltung eines krankheitsfreien Status. Obwohl HIV für seine genetische Vielfalt bekannt ist, wurde gehofft, eine größere Breite neutralisierender Antikörper durch den Einschluss von sowohl mehreren repräsentativen env-Genen, abgeleitet aus klinischen Isolaten, als auch gp41 (~90% konserviert; enthält das stärker konservierte 2F5-Neutralisierungsepitop) zu erhalten, während das hoch konservierte gag-Gen breite stammübergreifende CTL-Reaktionen erzeugen sollte. Nachdem diese Impfstrategie sowohl starke humorale als auch zelluläre Immunität gegen HIV erzeugt (in nicht-humanen Primaten), bietet dieser Ansatz einzigartige Vorteile im Vergleich zu anderen verfügbaren Vakzinierungsstrategien für HIV.
A. HIV-1-gag-Polynukleotid-Vakzin-Entwicklung:
Auf Grundlage unserer Experimente für die HIV-env-Genexpression unter Verwendung von Genen, die aus optimalen Codons für die humane Expression bestanden, wurde ein synthetisches p55-gag-Gen (opt-gag) konstruiert und synthetisiert, welches durchgehend eine optimale Codon-Verwendung enthielt, was zu 350 stillen Mutationen (von insgesamt 1500 Nukleotiden) führte, und in V1R kloniert. Eine zweite Form des opt-gag-Vektors wurde ebenfalls konstruiert, welche die Sequenz enthielt, die für das tPA-Signalpeptid am NH₂-Terminus codierte, ähnlich dem oben für HIV-env beschriebenen, und auch ein nukleares Lokalisierungssequenzmotiv eliminierte, das sich an dieser Position im Wildtyp-Gen befand. Diese Modifizierung war dazu bestimmt, um zu testen, ob die Veränderung der normalen intrazellulären Transportmuster für gag in den sekretorischen ER/Golgi-Weg die Immunogenität des gag-DNA-Vakzins ändern konnte. Die Hinzufügung des tPA-Leaderpeptids zu gag verursachte die Sekretion viel höherer Niveaus an gag und das sekretierte Protein wanderte als Form mit höherem Molekulargewicht im Vergleich zu Wildtyp-gag. Dies zeigte an, dass eine posttranslationale Modifizierung, wahrscheinlich Glycosylierung, als Ergebnis der Modifizierung mit dem tPA-Leaderpeptid stattfand.
Mäuse, die mit einem der beiden optimierten p55-gag-Konstrukte (V1R-opt-gag ± tPA-Leader) oder V1R-gag (Wildtyp) immunisiert worden waren, wurden hinsichtlich Anti-gag-Peptid-CTL-Reaktionen nach einer Injektion (Impfdosen = 10, 3,3 oder 1 μg/Maus) getestet. Hohe Niveaus an Anti-gag-CTL wurden erzeugt durch beide V1R-opt-gag-DNAs bei allen Dosen, wobei V1R-tPA-opt-gag die höchste spezifische Abtötung (~85% bei E/T = 3 mit der Dosis von 1 μg) ergab. Ein Vergleich der Zytotoxizitätskurven bei allen DNA-Dosen demonstrierte, dass die V1R-tPA-opt-gag-Impfung ungefähr 100fach stärkere CTL-Reaktionen ergab als V1R-gag (Wildtyp). Insgesamt zeigten die Immunreaktionen für die drei Vakzingruppen dieselben relativen Wirksamkeiten für CTL-, T-Helfer- und Antikörper-Reaktionen (in der Reihenfolge von der größten zur niedrigsten Reaktion): V1R-tPA-opt-gag > V1R-opt-gag > V1R-gag (Wildtyp). Zusammenfassend waren die CTL-, humoralen und Helfer-T-Zell-Reaktionen viel höher für die opt-gag-Konstrukte, insbesondere mit einem tPA-Leader.
BEISPIEL 10
Behandlungsverfahren
Einer Person, die einer therapeutischen oder prophylaktischen Immunisierung gegen eine Infektion mit dem Human-Immunschwäche-Virus bedarf, wird HIV-DNA injiziert, welche für die Gesamtheit oder eines Teils des gag-Gens oder Kombinationen davon mit der Gesamtheit oder einem Teil der env- oder pol-Gene codiert. Die Injektion kann intraparenteral, subkutan, intramuskulär oder intradermal erfolgen. Die HIV-DNA kann als Primer der Immunreaktion verwendet werden oder als Booster der Immunreaktion. Die Injektion der DNA kann der Injektion der Person mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die inaktiviertes HIV, abgeschwächtes HIV, Zusammensetzungen, die HIV-abgeleitete Proteine umfassen, oder Kombinationen davon umfasst, vorangehen, begleiten oder folgen.
BEISPIEL 11
Behandlungsverfahren
Eine Person, die einer therapeutischen Behandlung für eine Infektion mit Human-Immunschwäche-Virus bedarf, wird mit einem Anti-HIV-Antivirusmittel oder Kombinationen davon behandelt. Dem behandelten Individuum werden die pharmazeutischen HIV-DNA-Zusammensetzungen der vorliegenden Offenbarung injiziert.

Claims

DNA-Plasmid-Vakzin-Vektor zur Verwendung für die Hervorrufung einer Immunreaktion gegen ein Human-Immunschwäche-Virus (HIV) in einem Säugerwirt, wobei der DNA-Plasmid-Vakzin-Vektor eine Polynukleotidsequenz umfasst, die für ein HIV-gag-Antigen codiert, und die Polynukleotidsequenz einen vollständigen offenen Leserahmen für das HIV-gag-Antigen wie in SEQ-ID-Nr. 1 angegeben umfasst.
DNA-Plasmid-Vakzin-Vektor nach Anspruch 1, wobei die Polynukleotidsequenz, die für ein HIV-gag-Antigen codiert, aus dem vollständigen offenen Leserahmen für das HIV-gag-Antigen wie in SEQ-ID-Nr. 1 angegeben besteht.
DNA-Plasmid-Vakzin-Vektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, welcher einen funktionsfähigen CMV-Immediate-Early-Promotor und ein CMV-Intron A 5' von der Polynukleotidsequenz, die für ein HIV-gag-Antigen codiert, umfasst.
DNA-Plasmid-Vakzin-Vektor nach Anspruch 3, welcher eine tPA-Signalsequenz 3' von dem CMV-Immediate-Early-Promotor/CMV-Intron A umfasst, und wobei die Polynukleotidsequenz, die für ein HIV-gag-Antigen codiert, 3' von der tPA-Signalsequenz liegt.
DNA-Plasmid-Vakzin-Vektor nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, welcher ferner eine funktionsfähige BGH-Terminationssequenz am 3'-Ende der Polynukleotidsequenz, die für ein HIV-gag-Antigen codiert, umfasst.
Pharmazeutische Formulierung, welche einen DNA-Plasmid-Vakzin-Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Verwendung eines DNA-Plasmid-Vakzin-Vektors nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Hervorrufung einer Immunreaktion gegen ein Human-Immunschwäche-Virus (HIV) in einem Säugerwirt.