DE69731075T2

DE69731075T2 - Gemisch aus rekombinanten vaccinia-vektoren als polygeur-impfstoff gegen hiv

Info

Publication number: DE69731075T2
Application number: DE69731075T
Authority: DE
Inventors: Julia Hurwitz; Christopher Coleclough; Randall Owens; Karen Slobod
Original assignee: St Jude Childrens Research Hospital
Current assignee: St Jude Childrens Research Hospital
Priority date: 1996-01-23
Filing date: 1997-01-23
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2017-01-24
Also published as: EP0876498B1; CZ229398A3; IL125497A0; JP2000504326A; DE69731075D1; BG102712A; US6086891A; CN1214083A; KR100571479B1; PL188641B1; JP2007259870A; EP0876498A1; HK1016218A1; CN1229501C; AU1829997A; TR199801418T2; PT876498E; KR19990081931A; IL156919A0; RO120268B1

Description

Die vorliegende Arbeit wurde teilweise durch die NCI Grants R01-CA57419-03 und dem Cancer Center Support Core Grant P30-CA21765 unterstützt. NIH-NIAID Grants AI-32529 und P01-AI31596-04. Demnach hat die U.S. Regierung gewisse Rechte an der vorliegenden Erfindung.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Poly-Env-Impfstoffe gegen das menschliche Immunschwächevirus (HIV), umfassend eine Mischung aus mindestens 4–40 und bis zu 10.000 rekombinanten Vaccinia Viren, die jeweils eine unterschiedliche Variante eines HIV-Hüllproteins exprimieren. Die Impfstoffe sind für die Impfung von Säugetieren, einschließlich Menschen geeignet, um unerwartet verstärkte zelluläre und/oder humorale Antworten gegen eine HIV-Infektion bereitzustellen. Zusätzlich betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung und Verwendung derartiger rekombinanter Vaccinia Viren und Poly-Env-Impfstoffe.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Im Jahre 2000 fordert das AIDS-Virus wahrscheinlich mehrere Zehnmillionen Leben, welches eine weltweite Gesundheitsfrage von höchster Priorität darstellt. [siehe De Vita, et al., AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment und Prevention, 3. Auflage, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1992); Wong-Staal, in Virology, Seiten 1529–1543; und Hirsch et al., in Virology, Seiten 1545–1570]. Das Design eines wirksamen HIV-Impfstoffes stellt für Immunologen eine besondere Herausforderung dar, da das Umkehrtranskriptaseenzym, das mit der Replikation von HIV zu tun hat, eine hohe Fehlerrate aufweist. Dies führt zu vielen mutierten HIV-Stämmen, die eine äußere Hülle oder Hüllproteine mit verschiedenen Proteinsequenzen aufweisen. Diese verschie denen Hüllproteine werden häufig als verschiedene Antigene durch das Säugetierimmunsystem erkannt, das mehr als 10⁹ neue Lymphozyten pro Tag für den einzigen Zweck, fremden Antigenen entgegenzuwirken, erzeugt. B- beziehungsweise T-Zellen stellen die humoralen und zellulären Komponenten der Immunantwort dar.
Ein gutes Beispiel für die qualitative Stärke derartiger Immunantworten wird in HIV-infizierten Patienten und in SIV-infizierten Makaken gezeigt. In jedem Fall kommen aufeinanderfolgende Runden mit Infektion, Immunität und Herstellung verschiedener HIVs oder SIVs vor. [Wrin, et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7: 211–219 (1994); Burns und Desrosiers, Cur. Topics Microbiol. Immunol. 188: 185–219 (1994)]. Mit jedem Zyklus nimmt die Verschiedenheit an HIV-antigenen Determinanten (und die entsprechenden Immunantworten) so zu, dass dieses Immunantworten einen breiten Bereich an SIV- und HIV-Varianten neutralisieren, und eine Superinfektion wird größtenteils verhindert.
Jedoch entwickeln AIDS-Patienten gefährdete Immunantworten, die unzureichend werden, um zu verhindern, dass die HIV-Virusinfektion das Immunsystem des Patienten überwindet. Dies kann teilweise auf die Herstellung von HIV-Varianten, deren verschiedene Hüllproteine nicht durch das Immunsystem des Patienten erkannt werden und daher einer Zerstörung entgehen, zurückzuführen sein (Sci. Amer. Aug. 1995, Seiten). Selbst wenn die Immunantwort zur Verhinderung einer de novo-Infektion in der Lage ist (zum Beispiel eine anhaltende Mutation des Virus an privilegierten maskierten Stellen), kann in solchen Fällen die HIV-Infektion schließlich die Immunantwort des Patienten überwältigen [Pantaleo et al., Nature 362: 355–358 (1993); Embretson. et al., Nature 362:359-362 (1993)].
Die Identifikation von B- und T-Zellen-antigenen Determinanten unter HIV-Proteinen bleibt unvollständig. Das NIV-Hüllprotein wurde dadurch charakterisiert, dass es variable (V1–V5) und konstante (C1–C5) Regionen aufweist. Ein Peptidvertreter der V3-Region wurde als die wichtigste neutralisierende Determinante (PND) bezeichnet [Javaherian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 6768–6722 (1989)], obwohl andere Regionen des Hüllproteins ebenfalls mit dem Hervorrufen einer Immunantwort zu tun haben. Das HIV-Hüllprotein mit voller Länge enthält ungefähr 850 bis 900 Aminosäu ren, wobei die Länge aufgrund von Hypermutation variiert [Starcich et al., Cell 45: 637 (1986)].
Die ersten in klinischen Tests bewerteten Impfstoffe gegen HIV wurden so entworfen, dass einzelne Hüllproteine oder Teile davon gegen das Immunsystem vorhanden sind. Neutralisierende Antworten gegen ein einzelnes oder wenige Hüllproteine erkannten jedoch keine verschiedenen HIV-Isolate und die Individuen wurden nicht vor einer Infektion geschützt [Belshe et al., J. Am. Med. Assoc. 272: 431-431 (1994); U.S. Patent Nr. 5,169,763; PCT-Veröffentlichung WO 87/06262; Zagury et al., Nature 332: 728–731 (1988); Kieny et al., Int. Conf. AIDS 5: 541 (1989); Eichberg, Int. Conf. AIDS 7: 88 (1991); Cooney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1882–1886 (1993); Graham et al., J. Infect. Dis. 166: 244–252 (1992); J. Infect. Dis. 167: 533–537 (1993); Keefer et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Ergänzungsband 2): S139–143 (1994); Gorse, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Ergänzungsband 2): 141–143 (1994); McElrath et al., J. Infect. Dis. 169: 41–47 (1994); Fauci, Science 264: 1072–1973 (Mai 1994)].
Dementsprechend besteht ein lange bemerkter und dringender Bedarf an der Entdeckung von Impfstoffen und Verfahren, die eine Immunantwort hervorrufen, die zur Behandlung oder Verhinderung von HIV-Infektionen ausreicht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beabsichtigt die Überwindung einer oder mehrerer Mängel in den betreffenden Fachgebieten. Insbesondere sorgt der Poly-Env-Impfstoff der Erfindung vorteilhafterweise für eine nachdrücklichere Immunantwort. Die Stärke der vorliegenden Erfindung liegt in ihrem Vermögen, B-Zellen-, Helfer-T-Zellen- und zytotoxische T-Zellen-Kompartimente der Immunantwort für eine wirksame humorale und zelluläre Immunität zu rekrutieren. Zum Beispiel ruft die vorliegende Erfindung eine große Breite an HIV-spezifischen Antikörperaktivitäten hervor. HIV-Neutralisationsassays zeigen, dass die hervorgerufenen Antikörper von ausgezeichneter Qualität sind. Überraschenderweise kann die Erfindung Immunantworten gegen „naive" HIV-Stämme, das heißt, HIV-Stämme, für die Hüllproteine in dem Poly-Env-Cocktail nicht eingeschlossen sind, erzeugen.
Zur Bereitstellung wirksamerer HIV-Impfstoffe stellt die vorliegende Erfindung Poly-Env-Impfstoffe zur Verfügung, die Mischungen aus mindestens 4 bis etwa 10.000, vorzugsweise 4 bis etwa 1.000 und bevorzugter etwa 10 bis etwa 100 verschiedene rekombinante Viren umfassen, wobei jedes eine unterschiedliche HIV-Hüllproteinvariante (EPV) (oder einen wesentlichen Teil davon), die sowohl konstante als auch variable Regionen des Hüllproteins einschließt, exprimiert. Jede der exprimierten Hüllproteinvarianten weist vorzugsweise eine Struktur und/oder eine Immunogenität auf, die zu derjenigen eines nativen HIV-Hüllproteins ähnlich ist, das in einer infizierten Zelle oder einer HIV-Lipiddoppelschicht, beispielsweise in oligomerer Form vorkommt. Ebenfalls werden Verfahren zur Herstellung und Verwendung derartiger rekombinanter Viren und Poly-Env-Impfstoffe zur Verfügung gestellt. Bei ihrer Verwendung als Impfstoffe induziert jedes der verschiedenen Hüllproteine vorzugsweise einen unterschiedlichen Teilsatz an B- und/oder T-Zellen, wobei jeder Teilsatz auf unterschiedliche Hüllproteine und daher auf multiple HIV-Varianten anspricht. Eine Mischung aus dieser Zahl, dem Typ und/oder der Struktur von Hüllproteinen ist ein nun entdecktes Verfahren, um eine starke, dauerhafte HIV-spezifische Immunantwort mit einem breiten Spektrum an neutralisierender Aktivität hervorzurufen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die rekombinanten Viren aus der Gruppe, bestehend aus Vaccinia, Kanarienpockenvirus, Adenovirus und Adenoassoziiertes Virus (AAV), ausgewählt. In einem spezifischen Beispiel (s. u.) wird der Vaccinia Virus zur Herstellung eines Poly-Env-Impfstoffes verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein rekombinanter Vaccinia Virus-Impfstoff der Erfindung subkutan verabreicht. Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass eine subkutane Verabreichung des Vaccinia Virus nicht zur Bildung einer Wunde führt, wodurch eine Freisetzung von infektiösem Vaccinia, das eine mögliche Bedrohung für eine immungefährdete Population ist, vermieden wird.
Ein rekombinanter Poly-Env-Impfstoff der Erfindung umfasst vorzugsweise ein Lysat von Virus-infizierten Wachstumszellen, zum Beispiel Vero-Zellen, das zusätzlich zu dem infektiösen Virus exprimierte Hüllproteinvarianten enthält. Ein Einschluß der Hüllproteinvarianten des Lysats, welcher die Immunantwort unterstützt, stellt eine besonderen Auszeichnung der vorliegenden Erfindung dar, weil im Allgemeinen ein Virus durch Reinigung aus dem Wachstumszelllysat entfernt wird.
In den Impfstoffen der Erfindung kann das EV-Nukleotid von Patienten, die mit einem HIV-Virus aus einem geographisch begrenzten Gebiet infiziert sind, von Patienten, die mit einem HIV-Virus aus verschiedenen Kladen infiziert sind, oder aus Laborisolaten von HIV isoliert werden.
Die vorliegenden Erfinder haben entdeckt, dass Poly-Env-Impfstoffe der vorliegenden Erfindung eine unerwartet verstärkte Immunantwort durch die Expression und/oder das Vorhandensein multipler Hüllproteinvarianten, die jeweils sowohl konstante als auch variable Regionen enthalten, wobei sie vorzugsweise eine Struktur aufweisen, die im wesentlichen zu derjenigen eines nativen HIV-Hüllproteins ähnlich ist, hervorrufen. Die verstärkten Immunantworten erkennen HIV-Stämme, die zusätzlich zu denjenigen Stämmen vorhanden sind, die die in dem Poly-Env-Impfstoff bereitgestellten Hüllproteine exprimieren. Das Ziel eines derartigen Impfstoffes ist daher, verstärkte Immunantworten gegen einen großen Bereich von HIV-Stämmen bereitzustellen, wobei die Immunantworten zur Behandlung oder Verhinderung einer Infektion (oder einer fortgesetzten Infektion aufgrund von Mutation) durch verschiedene Stämme des Virus geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Env-Variante (EV)-Nukleinsäure zur Verfügung, die mindestens eine antigene Determinante einer Hüllproteinvariante (EPV) kodiert (oder dazu komplementär ist). Die EPV wird vorzugsweise durch ein rekombinantes Virus kodiert, das weiterhin in einem Poly-Env-Impfstoff der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird. Die Nukleinsäurevariante umfasst mindestens eine Mutation, die der kodierten EPV unterschiedliche antigene Eigenschaften oder eine dreidimensionale Struktur verleiht.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Impfstoffzusammensetzung bereit, die einen Poly-Env-Impfstoff der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst. Die Impfstoffzusammensetzung umfasst weiterhin ein Hilfsmittel und/oder ein Zytokin, das eine Immunantwort des Poly-Env-Impfstoffs gegen mindestens einen HIV-Stamm in einem Säugetier, dem die Impfstoffzusammensetzung verabreicht wurde, verstärkt. Ein Poly-Env-Impfstoff der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, eine Immunantwort, einschließlich mindestens einer von einer humoralen Immunantwort (zum Beispiel Antikörper) und einer zellulären Immunantwort (zum Beispiel Aktivierung von B-Zellen, Helfer-T-Zellen und zytotoxische T-Zellen (CTLs)) auszulösen.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen eine HIV-Infektion in einem Säugetier zu Verfügung, das einer HIV-Infektion vorbeugt, wobei das Verfahren das Verabreichen einer Impfstoffzusammensetzung umfasst, die einen Poly-Env-Impfstoff der vorliegenden Erfindung umfasst, und die den Säuger gegen eine klinische HIV-verwandte Pathologie, die durch Infektion von mindestens einem HIV-Stamm verursacht wird, schützt.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen eine HIV-Infektion in einem Säugetier für eine Therapie einer HIV-Infektion zur Verfügung. Das Verfahren umfasst das Verabreichen einer Zusammensetzung an ein Säugetier, umfassend einen inaktivierten oder abgeschwächten Poly-Env-Impfstoff der vorliegenden Erfindung, wobei die Zusammensetzung im Vergleich zu Kontrollen in dem Säugetier eine verstärkte Immunantwort gegen eine klinische Viruspathologie, die durch Infektion mit mindestens einem HIV-Stamm verursacht wurde, hervorruft.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das vorbeugende oder therapeutische Verfahren zum Hervorrufens einer Immunantwort gegen HIV das Verabreichen einer wirksamen Menge eines weiteren (zum Beispiel zweiten) Poly-Env-Impfstoffs, der mindestens 4 bis ungefähr 10.000 verschiedene rekombinante Viren umfasst, wobei darin die rekombinanten Viren von einer von den rekombinanten Viren des vorhergehenden Impfstoffs verschiedenen Spezies sind, und jedes der rekombinanten Viren in dem Poly-Env ein Env-variantes Nukleotid umfasst, das eine unterschiedliche Hüllproteinvariante eines HIV-Hüllproteins kodiert.
Die HIV-spezifische Immunantwort, die mit dem Poly-Env-rekombinanten Virus-Impfstoff der Erfindung erzeugt wird, kann durch Initiieren oder Verstärken einer humoralen oder zellulären Immunantwort oder beidem durch Verabreichung einer wirk samen Menge von mindestens einem rekombinantem HIV-Env-Protein oder eines DNA-Impfstoffs oder beidem verstärkt werden. Das rekombinante Protein oder ein DNA-Impfstoff ist vorzugsweise ebenfalls ein Poly-Env-Impfstoff. Jede der hierin zur Verfügung gestellten Impfstoffstrategien kann in beliebiger Reihenfolge bereitgestellt werden. Zum Beispiel kann eine Initiierung in einer Versuchsperson mit einem rekombinanten Virus-Poly-Env-Impfstoff, gefolgt von Verstärkung mit einem DNA-Impfstoff mit einer letzten Verstärkung mit einem rekombinanten Proteinimpfstoff, durchgeführt werden. Das rekombinante HIV-Env-Protein ist vorzugsweise eine Beimischung zu einem Hilfsmittel. In einer spezifischen Ausführungsform, die untenstehend anhand von Beispielen erläutert ist, wird das rekombinante HIV-Env-Protein intramuskulär verabreicht. Ein DNA-Impfstoff wird vorzugsweise mit einer Genkanone verabreicht.
Die vorstehenden Verfahren der Erfindung stellen den Ansporn zur gentechnischen Herstellung eines neuen Plasmidvektors bereit. In einem Folgeaspekt stellt die vorliegende Erfindung ein bifunktionelles Plasmid zur Verfügung, das als ein DNA-Impfstoff und als ein rekombinanter Vektor dienen kann, wobei es eine heterologe Einschubstelle unter der Kontrolle von sowohl einer Expressionskontrollsequenz vom Tier als auch einer viralen Epxressionskontrollsequenz umfasst. Die Expressionskontrollsequenz vom Tier ist vorzugsweise ein unmittelbar früher Cytomegalievirus (CMV)-Promotor und die Virusexpressionskontrollsequenz ein früher Vaccinia Virus-Promotor, ein später Vaccinia Virus-Promotor oder beides.
Weitere Ziele, Merkmale, Vorteile, Verwendungen und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der nachfolgenden genauen Beschreibung und den die vorliegende Erfindung betreffenden Beispielen offenbar werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Schematische Darstellung der Orientierung des HIV-1-Gens in einem Vaccinia Virusgenom. Das HIV-1-Hüllgen ist zwischen den rechten und linken Segmenten des Thymidinkinaselocus lokalisiert. Eine HindIII-Stelle kommt an dem C-Ende des HIV-1-Hüllgens vor. Der geeignete Einschub ergibt ein HindIII-Fragment mit ei ner Größe von näherungsweise 7 kb. Southern-Blots mit diesem Muster bestätigten die Position und die richtige Orientierung des HIV-1-Hüllgens.
2. Graphische Darstellung von Daten, die zeigen, dass die HIV-spezifische Antikörperantwort in Säugetiermodellen lang anhaltend ist. Die Ergebnisse repräsentativer Mausseren, die in dem ELISA für HIV-spezifische Antikörper getestet wurden, werden gezeigt. Jede Probe wurde vor dem Assay auf HIV-1-beschichteten ELISA-Platten 1 : 100 (ausgefüllte Balken), 1 : 1.000 (schraffierte Balken) und 1 : 10.000 (nicht gefüllte Balken) verdünnt. Von Testmäusen wurden nach der Injektion von 10⁷ pfu eines Vaccinia Virus-Konstrukts, das ein Hüllprotein von HIV-1 exprimiert, zu verschiedenen Zeiten Proben genommen (1 Monat, 4 Monate und 6 Monate). Die Kontrollmaus wurde mit einem Vaccinia Virus, der keine Hüllproteinsequenz enthielt, immunisiert. Es werden Standardfehlerbalken gezeigt.
3. Graphische Darstellung von Daten, die zeigen, wie die Vaccinia Virusdosis die Induktion von mindestens einer Immunantwort, einschließlich der HIV-spezifischen Antikörperproduktion, beeinflusst. Repräsentative Mausserumproben, wurden durch den ELISA auf HIV-1-beschichteten Platten getestet. Von Testmäusen die mit 10⁵, 10⁶ und 10⁷ pfu eines Vaccinia Viruskonstrukts, das ein HIV-1-Hüllprotein exprimiert, injiziert worden waren, wurden Serumproben genommen. Die Serumproben wurden näherungsweise drei Wochen nach der Injektion getestet. Jede Probe wurde vor dem Assay auf HIV-1-beschichteten ELISA-Platten 1 : 100 (ausgefüllte Balke), 1 : 1.000 (schraffierte Balken) und 1 : 10.000 (nicht gefüllte Balken) verdünnt. Es werden Standardfehlerbalken gezeigt.
4. Graphische Darstellung von Daten, die zeigen, dass das Mischen von Vaccinia Virus-Konstrukten das Hervorrufen von HIV-spezifischem Antikörper in injizierten Säugetieren nicht gefährdet. Repräsentative Mausserumproben wurden durch den ELISA näherungsweise 2 Monate nach der Injektion von 10⁷ pfu Vaccinia Virus, das das HIV-1-Hüllprotein(e) exprimiert, getestet. „Einzeln" identifiziert eine Probe von einer Maus, die einen einzelnen Vaccinia Virus erhielt. „Gemisch" stellt eine Probe von einer Maus dar, die ein Gemisch von Vaccinia Viren, die fünf verschiedene Hüllproteine exprimieren, erhielt. Jede Probe wurde vor dem Assay auf HIV-1-beschichteten ELISA-Platten 1 : 100 (ausgefüllte Balken), 1 : 1.000 (schraffierte Balken) und 1 : 10.000 (nicht gefüllte Balken) verdünnt. Es werden Standardfehlerbalken gezeigt.
5. Herstellung einer neuen Vaccinia Virus-Rekombination durch Substitution der pEvenv4 BH10-Sequenzen gegen PCR-Produkte. Das Verfahren der Sequenzsubstitution wird gezeigt. Die jeweiligen BH10-Env-Sequenzen wurden an den einmalig vorhandenen Enzymrestriktionsstellen von KpnI und BsmI gegen PCR-Produkte substituiert. Nach dem Schneiden von Plasmid und Ligation mit PCR-Produkten wurden neue Plasmide mit dem Wildtyp-VV unter Erzeugung von VV-Expressionsvektoren rekombiniert.
6. Reaktionen in dem Abbott-ELISA nach Immunisierung. Von allen vier Schimpansen wurden Seren mit dem klinischen Abbott-Assay getestet (siehe unten, Materialien und Verfahren). Die Ergebnisse für jede Serumprobe (Y-Achse) wurden für jedes Testdatum (X-Achse) aufgezeichnet. Starke Reaktionen wurden in Schimpansen beobachtet, die mit dem gemischten VVenv-Impfstoff immunisiert worden waren.
7. Karte eines bifunktionellen Plasmids, das sowohl als ein DNA-Impfstoff als auch als ein VV-Rekombinationsvektor wirken kann. Das Vorhandensein des unmittelbar frühen Cytomelagievirus (CMV)-Promotors und der späten und frühen Vaccinia Virus (VV)-Promotoren gestattet die Expression des fremden Gens in sowohl Säugtierzellen als auch VV-infizierten Zellen.
GENAUE BESCHREIBUNG DER OFFENBARUNG
Entdeckung unerwartet verstärkter Immunantworten gegen gemischte HIV-Poly-Env-Impfstoffe
Frühere Versuche, Impfstoffe gegen verschiedene HIV-Stämme bereitzustellen, richteten sich auf eine oder mehrere variable Regionen mit gp120 oder gp160. Es wurde erwartet, dass derartige variable Regionen, die in einem Impfstoff zur Verfügung gestellt werden, für einen breiten Schutz gegen eine HIV-Infektion sorgen würden. Derartige Impfstoffe waren jedoch nicht erfolgreich, wenn die Impfstoff-induzierte Immunantwort nicht viele verschiedene HIV-Stämme erkennt. Daher besteht ein ent scheidender Bedarf an der Bereitstellung von Impfstoffen, die Immunantworten gegen multiple HIV-Stämme hervorrufen, so dass die Impfstoffe zur Behandlung und/oder Verhütung von HIV geeignet sind.
Die vorliegenden Erfinder entdeckten, dass unerwartet verstärkte primäre und sekundäre (Verstärkung) Immunantworten gegen mehrere oder viele verschiedene HIV-Stämme durch die Verwendung von Poly-Env-Impfstoffen induziert werden können, die eine Mischung aus mindestens 4 bis zu soviel wie 1.000 und möglicherweise soviel wie 10.000 rekombinanten Viren enthält, wobei jedes eine unterschiedliche Hüllproteinvariante (EPV) kodiert. Der Impfstoff kann ebenfalls durch die Viren exprimierte EPVs enthalten, wie sie zum Beispiel in den zur Virusproduktion verwendeten Wirtszellen erzeugt werden.
Die Begriffe „initiieren" oder „primär" und „Verstärkung" oder „verstärken" werden hierein verwendet, um auf die Anfangs- beziehungsweise nachfolgenden Immunisierungen hinzuweisen, das heißt gemäß den Definitionen, die diese Begriffe normalerweise in der Immunologie aufweisen.
Die EPV kodierende Nukleinsäure (Hüllvariante (EV)-Nukleinsäure) kann von derselben oder einer unterschiedlichen Population (zum Beispiel geographisch) von Menschen, die mit HIV infiziert sind, isoliert werden. Alternativ dazu können die verschiedenen EV-Nukleinsäuren von jeder Quelle erhalten werden und basierend auf dem Screening der Sequenzen bezüglich Unterschiedenen in der kodierenden Sequenz oder durch Bewertung von Unterschieden bei hervorgerufenen humoralen und/oder zellulären Immunantworten gegen mehrfache HIV-Stämme gemäß bekannten Verfahren in vitro oder in vivo ausgewählt werden.
Die ursprüngliche Entdeckung betraf rekombinante Vaccinia Virus-Impfstoffe. Wie es jedoch dem Durchschnittfachmann ohne weiteres klar ist, kann jedes rekombinante Virus zum Exprimieren von Poly-Env-Antigenen für einen Impfstoff der Erfindung verwendet werden. Weiterhin kann die Verwendung von multiplen viralen Impfstoffen anti-virale Immunantworten vermeiden, die eine Verstärkung des viralen Impfstoffs (aufgrund einer möglichen Verstärkung einer starken Anti-Virus-Antwort) weniger wirksam machen könnten.
Wie es dem Fachmann ohne weiteres klar ist, haben die Erfinder festgestellt, dass das Verstärken mit rekombinantem HIV-Env-Protein oder Proteinen, vorzugsweise Proteinen, die Immunisierungsverfahren der Erfindung weiterhin verstärken. Das HIV-Env-Protein oder die Proteine können den in dem Poly-Env-Impfstoff exprimierten HIV-Env-Proteinen entsprechen oder sie können verschiedene HIV-Env-Proteine sein.
Entsprechend ist dem Fachmann klar, dass die Immunisierungsverfahren der vorliegenden Erfindung durch Verwendung eines DNA-Impfstoffs verstärkt werden. Der DNA-Impfstoff kann als eine Verstärkung, zum Beispiel wie vorstehend in Bezug auf die rekombinanten HIV-Proteine beschrieben ist, verwendet werden. Alternativ dazu kann der DNA-Impfstoff zum Initiieren von Immunität mit dem rekombinanten viralen Impfstoff oder Impfstoffen, die zum Verstärken der Anti-HIV-Immunantwort verwendet werden, verwendet werden. Wie bei dem rekombinanten Env-Proteinimpfstoff zur Verstärkung kann der DNA-Impfstoff einen oder mehrere Vektoren zur Expression von einem oder mehreren HIV-Env-Genen umfassen. Zusätzlich können die HIV-Env-Gene den Genen entsprechen, die durch den rekombinanten Virus-Impfstoff exprimiert werden, oder sie können verschieden sein. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Vektoren zur Expression in dem rekombinanten Virus-Impfstoff und in transfizierten Säugetierzellen als Teil eines DNA-Impfstoffs hergestellt.
Es wurde festgestellt, dass diese Immunantwort (humoral und/oder zellulär) für einen breiteren Bereich an Stämmen eines infektiösen Virus, wie zum Beispiel HIV, wirksam ist, und dass sie nicht auf die Virusstämme eingeschränkt ist, die die spezifischen Hüllprotein-Varianten (EPVs) exprimieren, die durch den Poly-Env-Impfstoff bereitgestellt sind. Die vorliegende Erfindung stellt daher multiple EPVs, die durch einen rekombinanten viralen Impfstoff kodiert werden, der unerwartet verstärkte Immunantworten gegen multiple HIV-Stämme ergibt, bereit.
Poly-Env-Imgfstoffe und Impfung
Die vorliegende Erfindung stellt daher in einem Aspekt Poly-Env-Impfstoffe unter Verwendung von Gemischen von mindestens vier und von bis zu 10.000 verschiede nen rekombinanten Vaccinia Viren zur Verfügung, wobei jedes eine unterschiedliche Hüllprotein-Variante oder einen antigenen Teil davon exprimiert, zur Verfügung. Wie dem Fachmann ohne weiteres klar ist könnten 4 bis ungefähr 1.000 oder vorzugsweise ungefähr 10 bis ungefähr 100 verschiedene rekombinante Viren verwendet werden. Dem Durchschnittsfachmann wird weiterhin ohne weiteres klar sein, dass weitere Viren für Impfstoffe verwendet werden können. Beispiele für geeignete Viren, die zusätzlich zu Vaccinia als rekombinante virale Wirte für Impfstoffe wirken können, umfassen den Kanarienpockenvirus, Adenovirus oder den Adeno-assoziierten Virus. Es werden ebenfalls Verfahren zur Herstellung und Verwendung derartiger Poly-Env-Impfstoffe zur Verfügung gestellt.
Ein Poly-Env-Impfstoff der vorliegenden Erfindung induziert mindestens eine einer humoralen und einer zellulären Immunantwort in einem Säugetier, dem der Poly-Env-Impfstoff verabreicht worden ist, jedoch ist die Reaktion auf den Impfstoff subklinisch oder sie bewirkt eine Verstärkung von mindestens einer Immunantwort gegen mindestens einen HIV-Stamm derart, dass die Impfstoffverabreichung für Impfungszwecke geeignet ist.
Virale Impfstoffe. Verschiedene gentechnisch hergestellte Viruswirte („rekombinante Viren") können zur Herstellung vonviralen Poly-Env-Impfstoffen zur Verabreichung von HIV-Poly-Env-Antigenen verwendet werden. Virale Impfstoffe sind besonders vorteilhaft darin, dass die virale Infektionskomponente eine starke Immunantwort fördert, die auf die Aktivierung von B-Lymphozyten, Helfer-T-Lymphozyten und zytotoxischen T-Lymphozyten zielt. Zahlreiche Virusspezies können als die rekombinanten Viruswirte für die Impfstoffe der Erfindung verwendet werden. Ein bevorzugter rekombinanter Virus für einen viralen Impfstoff ist der Vaccinia Virus [internationale Patentveröffentlichung WO 87/06262, 22. Oktober 1987 von Moss et al.; Cooney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1882–6 (1993); Graham et al., J. Infect. Dis. 166: 244–52 (1992); McElrath et al., J. Infect. Dis. 169: 41–7 (1994)]. In einer weiteren Ausführungsform kann das rekombinante Kanarienpockenvirus verwendet werden [Pialoux et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 11: 373–81 (1995), erratum in AIDS Res. Hum. Retroviruses 11: 875 (1995); Andersson et al., J. Infect. Dis. 174: 977–85 (1996); Fries et al., Vaccine 94: 428–34 (1996); Gonczol et al., Vaccine 13: 1080–5 (1995)]. Eine weitere Alternative ist das defekte Adenovirus oder das Adenovirus [Gilardi- Hebenstreit et al., J. Gen. Virol. 71: 2425–31 (1990); Prevec et al., J. Infect. Dis. 161: 27–30 (1990); Lubeck et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6763–7 (1989); Xiang et al., Virology 219: 220–7 (1996)]. Weitere geeignete virale Vektoren umfassen Retroviren, die in Zellen mit amphotropem Wirtsbereich verpackt sind [siehe Miller, Human Gene Ther. 1: 5–14 (1990); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, § 9] und einen abgeschwächten oder defekten DNA-Virus, wie zum Beispiel aber nicht eingeschränkt auf das Herpes-simplex-Virus (HSV) [siehe zum Beispiel Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2: 320–330 (1991)], Papillomavirus, Epstein Barr-Virus (EBV), Adeno-assoziiertes Virus (AAV) [siehe zum Beispiel Samulski et al., J. Virol. 61: 3096–3101 (1987); Samulski et al., J. Virol. 63: 3822–3828 (1989)] und dergleichen.
DNA-Impfstoffe. Eine Alternative zu einem üblichen Impfstoff, der ein Antigen und ein Hilfsmittel umfasst, betrifft die direkte in vivo Einführung einer das Antigen kodierenden DNA in Gewebe einer Versuchsperson zur Expression des Antigens durch die Zellen des Gewebes der Versuchsperson. Derartige Impfstoffe werden hierein als „DNA-Impfstoffe" oder als „auf Nukleinsäure basierende Impfstoffe" bezeichnet. DNA-Impfstoffe sind in der internationalen Patentveröffentlichung WO 95/20660 und in der internationalen Patentveröffentlichung WO 93/19183 beschrieben. Die Fähigkeit von direkt injizierter DNA, die ein virales Protein zum Hervorrufen einer schützenden Immunantwort kodiert, ist in zahlreichen experimentellen Systemen gezeigt worden [Conry et al., Cancer Res., 54: 1164–1168 (1994); Cox et al., Virol. 67: 5664–5667 (1993); Davis et al., Hum. Mole. Genet. 2: 1847–1851 (199.3); Sedegah et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 9866–9870 (1994); Montgomery et al., DNA Cell Bio., 12: 777–783 (1993); Ulmer et al., Science, 259: 1745–1749 (1993); Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 4156–4160 (1993); Xiang et al., Virology, 199: 132–140 (1994)]. Untersuchungen zum Bewerten dieser Strategie bei der Neutralisation des Influenzavirus haben sowohl Hüll- als auch innere virale Proteine zum Induzieren der Herstellung von Antikörpern verwendet, jedoch konzentrierten sie sich insbesondere auf das virale Hämagglutininprotein (HA) [Fynan et al., DNA Cell Biol., 12: 785–789 (1993A); Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 11478–11482 (1993B); Robinson et al., Vaccine, 11: 957 (1993); Webster et al., Vaccine, 12: 1495–1498 (1994)].
Eine Impfung durch direktes Einführen von DNA, die ein HIV-Env-Protein zum Hervorrufen einer schützenden Immunantwort kodiert, erzeugt sowohl Zell-vermittelte als auch humorale Antworten. Dies ist zu den Ergebnissen analog, die mit lebenden Viren erhalten wurden [Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 9519–9523 (1994); Ulmer, 1993, s. o.; Wang, 1993, s. o.; Xiang, 1994, s. o.]. Untersuchungen mit Frettchen weisen darauf hin, dass DNA-Impfstoffe gegen konservierte innere virale Proteine des Influenzavirus zusammen mit Oberflächenglycoproteinen gegen antigene Varianten des Influenzavirus wirksamer sind, als entweder inaktivierte oder Subvirion-Impfstoffe [Donnelly et al., Nat. Medicine, 6: 583–587 (1995)]. Tatsächlich wurden reproduzierbare Immunantworten gegen Nukleoprotein kodierende DNA in Mäusen berichtet, die für das Tier im Wesentlichen lebenslang andauern [Yankauckas et al., DNA Cell Biol., 12: 771–776 (1993)].
Wie aus dem Stand der Technik gut bekannt ist, kann eine große Zahl von Faktoren die Leistungsfähigkeit der Expression von Antigengenen und/oder die Immunogenität von DNA-Impfstoffen beeinflussen. Beispiele für derartige Faktoren umfassen die Reproduzierbarkeit der Impfung, die Konstruktion des Plasmidvektors, die Wahl des Promotors, der zur Lenkung der Antigen-Genexpression verwendet wird, und die Stabilität des eingeschobenen Gens. In Abhängigkeit von ihrem Ursprung unterscheiden sich Promotoren in der Gewebespezifität und in der Leistungsfähigkeit zur Initiierung einer mRNA-Synthese [Xiang et al., Virology, 209: 564–579 (1994); Chapman et al., Nucle. Acids. Res., 19: 3979–3986 (1991)]. Bis heute waren die meisten DNA-Impfstoffe in Säugetiersystemen von viralen Promotoren abhängig, die vom Cytomegalievirus (CMV) abstammten. Diese wiesen eine gute Leistungsfähigkeit bei sowohl einer Muskel- als auch Hautimpfung bei einer Anzahl von Säugetierspezies auf. Ein weiterer Faktor, von dem bekannt ist, dass er die durch die DNA-Immunisierung hervorgerufene Immunantwort beeinflusst, ist das Verfahren der DNA-Abgabe; parenterale Wege können niedrige Gentransferraten ergeben und eine beträchtliche Veränderlichkeit der Genexpression erzeugen [Montgomery, 1993, s. o.]. Eine Hochgeschwindigkeitsimpfung von Plasmiden unter Verwendung einer Genkanone verstärkte die Immunantworten von Mäusen [Fynan, 1993B, s. o.; Eisenbraun et al., DNA Cell Biol., 12: 791–797 (1993)] vermutlich aufgrund einer größeren Leistungsfähigkeit der DNA-Transfektion und einer wirksameren Antigendarstellung durch dendritische Zellen. Es können ebenfalls Vektoren, die den auf einer Nuklein säure basierenden Impfstoff der Erfindung enthalten, in den gewünschten Wirt oder durch andere aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren, wie zum Beispiel Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Calciumphosphatfällung, Lipofectin (Lysosomfusion) oder einen DNA-Vektortransporter eingeführt werden [siehe zum Beispiel Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963–967 (1992); Wu und Wu, J. Biol. Chem. 263: 14621–14624 (1988); Hartmut et al., kanadische Patentanmeldung Nr. 2,012,311, angemeldet am 15. März 1990].
Bifunktionelle Plasmide für Virus- und DNA-Impfstoffe. Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die gentechnische Herstellung bifunktioneller Plasmide, die als ein DNA-Impfstoff und als ein rekombinanter Virusvektor dienen können. Eine direkte Injektion der gereinigten Plasmid-DNA, das heißt als ein DNA-Impfstoff, würde eine Immunantwort gegen das durch das Plasmid in den Versuchspersonen exprimierte Antigen hervorrufen. Das Plasmid würde ebenfalls in lebenden rekombinanten Viren als Immunisierungsvehikel verwendbar sein.
Das bifunktionelle Plasmid der Erfindung stellt ein heterologes Gen oder eine Einschubstelle für ein heterologes Gen unter der Kontrolle von zwei unterschiedlichen Expressionskontrollsequenzen: eine Expressionskontrollsequenz vom Tier und eine virale Expressionskontrollsequenz, zur Verfügung. Der Begriff „unter der Kontrolle" wird in seinem üblichen Sinne, das heißt im Sinne von funktionsfähig oder funktionsfähig damit assoziiert, in dem Sinne verwendet, dass die Expressionskontrollsequenz, wie zum Beispiel ein Promotor, für die Expression eines heterologen Gens sorgt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Expressionskontrollsequenz vom Tier ein Säugetierpromotor (Affenpromotoren werden ebenfalls in der vorliegenden Erfindung betrachtet); in einer spezifischen Ausführungsform ist der Promotor ein unmittelbar früher Cytomegalievirus (CMV)-Promotor (siehe 7). In einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist der Viruspromotor ein früher Vaccinia Virus-Promotor oder ein später Vaccinia Virus-Promotor oder vorzugsweise beides (7). Die Versuchspersonen könnten mit einem vielstufigen System geimpft werden, wobei das bifunktionelle Plasmid als DNA und zu einem unterschiedlichen Zeitpunkt aber in beliebiger Reihenfolge als ein rekombinanter Virusimpfstoff verabreicht wird. Die Erfindung betrachtet einzelne oder mehrfache Verabreichungen des bifunktionellen Plasmids als DNA-Impfstoff oder als rekombinanter Virusimpfstoff oder als bei des. Dieses Impfungssystems kann mit einer Verabreichung rekombinanter Proteinimpfstoffe (s. u.) betrachtet werden oder es kann mit zusätzlichen Impfstoffvehikeln verwendet werden.
Wie dem Durchschnittsfachmann ohne weiteres klar ist, können die bifunktionellen Plasmide der Erfindung als Pole-Env-Impfstoffvektoren verwendet werden. Durch Einschub von mindestens 4 bis ungefähr 10.000, vorzugsweise 4 bis 10.000 und bevorzugter 10 bis 100 verschiedener HIV-Env-Gene in bifunktionelle Plasmide wird daher ein entsprechender Satz an bifunktionellen Plasmiden, die als Poly-Env-Impfstoffe verwendbar sind, hergestellt.
Rekombinante Proteinimpfstoffe. Eine aktive Immunität, die durch Impfung mit einem HIV-Env-Protein oder Proteinen gemäß der vorliegenden Erfindung hervorgerufen wird, kann eine zelluläre oder humorale Immunantwort initiieren oder verstärken. Das HIV-Env-Protein oder Proteine oder deren antigene Fragmente können zur Herstellung eines Impfstoffs in einer Beimischung mit einem Hilfsmittel hergestellt werden.
Der Begriff „Hilfsmittel" bezieht sich auf eine Verbindung oder ein Gemisch, das die Immunantwort gegen ein Antigen verstärkt. Ein Hilfsmittel kann als ein Gewebedepot dienen, das das Antigen langsam freisetzt, und ebenfalls als ein Aktivator für ein lymphartiges System, der die Immunantwort nicht spezifisch verstärkt (Hood et al., Immunology, Zweite Auflage, 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, S. 384). Häufig wird es einer primären Herausforderung nur mit einem Antigen in Abwesenheit eines Hilfsmittels misslingen, eine humorale oder zelluläre Immunantwort hervorzurufen. Hilfsmittel umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf das vollständige Freundsche Adjuvans, das unvollständige Freundsche Adjuvans, Saponin, Mineralgele, wie zum Beispiel Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie zum Beispiel Lysolecithin, plurone Polyole, Polyanionen, Peptide, Öl oder Kohlenwasserstoffemulsionen, Schlüssellochnapfschneckenhämocyanine, Dinitrophenol und möglicherweise brauchbare Hilfsmittel, wie zum Beispiel BCG (bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum. Die Auswahl eines Hilfsmittels hängt von der Versuchsperson ab, die geimpft werden soll. Es wird vorzugsweise ein pharmazeutisch verträgliches Hilfsmittel verwendet. Zum Beispiel sollte ein Impfstoff für einen Menschen Öl- oder Kohlenwasserstoffemulsionshilfsmittel, einschließlich dem voll ständigen und dem unvollständigen Freundschen Adjuvans vermeiden. Ein Beispiel für ein Hilfsmittel, das zur Verwendung bei Menschen geeignet ist, ist Alaun (Aluminiumoxidgel). In einer spezifischen Ausführungsform, s. u., wird ein rekombinantes HIV-Env-Protein intramuskulär in Alaun verabreicht. Alternativ dazu kann der rekombinante HIV-Env-Protein-Impfstoff subkutan, intradermal, intraperitoneal oder über andere verträgliche Wege zur Verabreichung eines Impfstoffs verabreicht werden.
Impfstoffverabreichung. Gemäß der Erfindung kann eine Immunisierung gegen HIV mit einem rekombinanten viralen Impfstoff der Erfindung allein oder in Kombination mit einem DNA-Impfstoff oder einem rekombinanten Proteinimpfstoff oder beidem erreicht werden. In einer spezifischen Ausführungsform wird das rekombinante HIV-Env-Protein intramuskulär zur Verstärkung der Immunantwort zur Verfügung gestellt.
Jede Dosis des Virusimpfstoffs kann dieselben 4 bis 10.000. vorzugsweise 4 bis 1.000 und bevorzugter 10 bis 100 unterschiedlichen rekombinanten Viren enthalten, wobei jedersein unterschiedliches HIV-Env-Gen exprimiert. Alternativ dazu können die Viren in nachfolgenden Impfstoffen unterschiedliche HIV-Env-Gene exprimieren. In einer weiteren Ausführungsform können die nachfolgenden viralen Poly-Env-Impfstoffe einige Viren aufweisen, die ihnen gemeinsam sind, und andere, die sich von dem vorherigen Impfstoff unterscheiden. Zum Beispiel kann der initiierende Impfstoff Vaccinia Viren enthalten, die HIV-Env-Proteine exprimieren, die willkürlich mit 1–10 bezeichnet werden. Ein zweiter (Verstärkungs-) Impfstoff kann Vaccinia Viren (oder vorzugsweise ein unterschiedliches Virus, wie zum Beispiel ein Kanarienpocken- oder Adenovinus) enthalten, die die HIV-Env-Proteine 6–15 oder 11–20, usw. exprimieren.
Ein DNA-Impfstoff oder ein rekombinanter Proteinimpfstoff kann ein einzelnes HIV-Env-Proteinantigen oder multiple Antigene aufweisen. Ein DNA- oder rekombinanter Proteinimpfstoff zur Verwendung in der Erfindung umfasst vorzugsweise mehr als ein HIV-Env-Proteinantigen. Wie mit den nachfolgenden viralen Impfstoffen können das HIV-Env-Protein oder das Protein eines DNA-Impfstoffs oder ein rekombinanter Proteinimpfstoff einem HIV-Env-Protein entsprechen, das in dem viralen Poly-Env-Impfstoff exprimiert wird, oder sie können von jedem der Poly-Env-Env-Proteine verschieden sein.
Im Allgemeinen betrachte eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung die Bereitstellung der größtmöglichen Vielfalt in jedem Impfungsprotokoll, um den Empfänger der größten Zahl an HIV-Env-Proteinen auszusetzen und um dadurch für die größte Chance einer neutralisierenden Kreuzreaktivität mit einem naiven HIV-Isolat zu sorgen.
Hüllprotein-Varianten
Wie vorstehend angemerkt wurde, kann eine EPV zur Verwendung in den Impfstoffen der Erfindung von geographisch lokalen Isolaten oder Kladen oder von geographisch verschiedenen Isolaten, das heißt unterschiedlichen Kladen, erhalten werden. Wie dem Fachmann ohne weiteres klar ist, weist das Erhalten von Env-Nukleotiden (das heißt Gene) von natürlichen Isolaten zahlreiche Vorteile auf: die Isolate sind leicht verfügbar, die EPVs entsprechen den natürlich vorkommenden Proteinen, gegen die eine Immunität erwünscht ist, und HIV-Mutationen können leicht von neuen Isolaten eingefangen werden.
Eine EPV umfasst ebenfalls Polypeptide, die eine immunogene Aktivität aufweisen, die durch eine Aminosäuresequenz einer EPV-Aminosäuresequenz, wie mindestens ein Epitop oder antigene Determinante, hervorgerufen wird. Diese Aminosäuresequenz entspricht im Wesentlichen mindestens einem 10–900 Aminosäurefragment und/oder Consensus-Sequenz einer bekannten HIV-EPV. Eine derartige EPV kann eine Gesamthomologie oder Identität von mindestens 50% im Vergleich zu einer bekannten Hüllprotein-Aminosäuresequenz, wie zum Beispiel eine Homologie von 50–99% oder einen beliebigen Bereich oder Wert darin aufweisen, während sie eine immunogene Antwort gegen mindestens einen HIV-Stamm hervorruft.
Die prozentuale Homogenität kann zum Beispiel durch Vergleich der Sequenzinformation unter Verwendung des GAP-Computerprogramms, Version 6.0, erhältlich von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) bestimmt werden. Das GAP-Programm verwendet das Anordnungsverfahren von Needleman und Wunsch [J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)], entsprechend der Überarbeitung von Smith und Waterman [Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]. Kurz gesagt, das GAP-Programm defi niert Ähnlichkeit als die Zahl angeordneter Symbole (das heißt, Nukleotide oder Aminosäuren), die ähnlich sind, geteilt durch die Gesamtzahl der Symbole in der kürzeren der zwei Sequenzen. Die bevorzugten voreingestellten Parameter für das GAP-Programm umfassen: (1) eine unitäre Vergleichsmatrix (die einen Wert von 1 für Identitäten und 0 für Nicht-Identitäten enthält) und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986) entsprechend der Beschreibung von Schwartz und Dayhoff, Hrsg., Atlas of Protein Sequences and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC (1979), Seiten 353–358; (2) einen Abzug von 3,0 für jede Lücke und einen zusätzlichen Abzug von 0,10 für jedes Symbol in jeder Lücke; und (3) keinen Abzug für Endlücken.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine EPV der vorliegenden Erfindung eine variante Form von mindestens einem HIV-Hüllprotein. Die EPV umfasst vorzugsweise gp120 und die Oligomerisierungsdomäne gp41, wie gp140 [Hallenberger, et al., Virology 193: 510–514 (1993)].
Bekannte HIV-Hüllproteine enthalten ungefähr 750 bis 900 Aminosäuren. Beispiele für derartige Sequenzen sind leicht aus kommerziellen und institutionellen HIV-Sequenz-Datenbanken, wie zum Beispiel GENBANK, oder veröffentlichten Zusammenstellungen erhältlich, wie zum Beispiel Myers et al., Hrsg., Human Retroviruses and AIDS, A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, Band I und II, Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos, NM (1993). Substitutionen oder Einschübe einer EPV zum Erhalten einer zusätzlichen EPV, die durch eine Nukleinsäure zur Verwendung in einem rekombinanten Virus oder Poly-Env-Impfstoff der vorliegenden Erfindung kodiert wird, kann Substitutionen oder Einschübe von mindestens einem Aminosäurerest (zum Beispiel 1–25 Aminosäuren) umfassen. Alternativ dazu kann mindestens eine Aminosäure (zum Beispiel 1–25 Aminosäuren) aus einer EPV-Sequenz deletiert werden. Derartige Substitutionen, Einschübe oder Deletionen werden vorzugsweise basierend auf einer Sequenzbestimmung von Hüllproteinen, die durch Nukleotidsequenzierung von mindestens einer EPV-kodierenden Nukleinsäure aus einem mit HIV infizierten Individuum erhalten wurden, identifiziert.
Nicht einschränkende Beispiele für derartige Substitutionen, Einschübe oder Deletionen werden vorzugsweise durch die Amplifikation von Env-DNA- oder RNA-Sequenzen von HIV-1-infizierten Patienten erzeugt, die durch routinemäßiges Experimentieren bestimmt werden können, um modifizierte strukturelle und funktionelle Eigenschaften eines Hüllproteins oder einer EPV bereitzustellen. Die so erhaltenen EPVs weisen im Vergleich zu der ursprünglichen EPV vorzugsweise unterschiedliche antigene Eigenschaften auf. Derartige antigene Unterschiede können durch geeignete Assays bestimmt werden, wie zum Beispiel durch Testen mit einer Auswahl monoklonaler Antikörper, die für HIV-Hüllproteine spezifisch sind, in einem ELISA-Assay.
Jede Substitution, Einschub oder Deletion kann verwendet werden, solange das resultierende EPV-Protein Antikörper hervorruft, die an HIV-Hüllproteine binden, wobei jedoch die EPV ein Muster aufweist, das sich von Antikörpern unterscheidet, die durch eine zweite EPV hervorgerufen werden. Jede der vorstehenden Substitutionen, Einschübe oder Deletionen kann ebenfalls modifizierte oder ungewöhnliche Aminosäuren umfassen, wie sie zum Beispiel in 37 C. F. R. § 1.822(p)(2) zur Verfügung gestellt werden.
Die folgende Tabelle 1 stellt nicht einschränkende Beispiele alternativer Varianten von Hüllproteinen von HIVs dar, die durch einen erfindungsgemäßen rekombinanten Virus kodiert werden können.
Dementsprechend können basierend auf den vorstehenden Beispielen für spezifische Substitutionen alternative Substitutionen durch routinemäßiges Experimentieren ausgeführt werden, um alternative EPVs der vorliegenden Erfindung zur Verfügung zu stellen, beispielsweise durch Ausführen von einer oder mehreren Substitutionen, Einschüben oder Deletionen in Hüllproteinen oder EPVs, die zu verschiedenen Immunantworten führen.
Aminosäuresequenzvariationen in einer EPV der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel durch Mutationen in der DNA hergestellt werden. Derartige EPVs umfassen zum Beispiel Deletionen, Einschübe oder Substitutionen von Nukleotiden, die verschiedene Aminosäurereste innerhalb der Aminosäuresequenz kodieren. Offensichtlich müssen Mutationen, die in einer EPV-kodierenden Nukleinsäure gemacht werden, die Sequenz nicht außerhalb des Leserahmens einbauen und werden vorzugsweise keine komplementären Domänen erzeugen, die sekundäre mRNA-Strukturen erzeugen könnten [siehe zum Beispiel Ausubel (1995 Rev., s. u.; Sambrook (1989), s. u.].
Eine EPV-kodierende Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls durch Amplifikation oder ortsspezifische Mutagenese von Nukleotiden in einer DNA oder RNA, die ein Hüllprotein oder eine EPV kodieren, und danach durch Synthese oder Umkehrtranskription der kodierenden DNA zur Herstellung einer eine EPV kodierenden DNA oder RNA, [siehe zum Beispiel Ausubel (1995 Rev.), s. u.; Sambrook (1989), s. u.] basierend auf der Lehre und der hierein dargestellten Anleitung, hergestellt werden.
Rekombinante Viren, die EPVs der vorliegenden Erfindung exprimieren, rekombinante EPVs oder dafür kodierende Nukleinsäurevektoren umfassen einen endlichen Satz an EPV-kodierenden Sequenzen als Substitutionsnukleotide, die, basierend auf den Lehren und der hierin dargestellten Anleitung, ohne übermäßiges Experimentieren routinemäßig von einem Durchschnittsfachmann erhalten werden können. Für eine genaue Beschreibung der Proteinchemie und Struktur, siehe Schulz, G. E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY (1978), und Creighton, T. E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, CA (1983). Für eine Darstellung von Nukleotidsequenzsubstitutionen, wie zum Beispiel Codonbevorzugungen, siehe Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc., New York, NY (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995) (nachstehend, „Ausubel (1995 Rev.)") bei §§ A.1.1–A.1.24, und Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) in den Anhängen C und D.
Der Durchschnittsfachmann, der in Besitz der hier dargestellten Lehren und Anleitung ist, wird daher wissen, wie andere Aminosäurereste an anderen Positionen einer Env-DNA oder RNA zu substituieren sind, um alternative EPVs, einschließlich Varianten durch Substitution, Deletion oder Insertion, zu erhalten.
Screening-Assays für die HIV-Aktivität
Zum Screening der Anti-HIV-Aktivität von Seren oder Zellen von einem mit einem Impfstoff der Erfindung immunisierten Individuum kann jeder bekannter und/oder geeignete Screening-Assay, wie er aus dem Stand der Technik bekannt ist, verwendet werden. Bekannte HIV-Assays umfassen zum Beispiel virale Infektiositätsassays [siehe zum Beispiel Chesebro et al., J. Virol. 62: 3779–3788 (1988); Aldovini et al., Hrsg., Techniques in HIV Research Seiten 71–76 (1990)]; Neutralisationsassays [siehe zum Beispiel Golding et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10: 633–643 (1994); Hanson., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10: 645–648 (1994); Laal et al., Res. Hum. Retrovir. 9: 781–785 (1993); Hanson, J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7: 211–219 (1994)]; peripherale mononukleare (PMN) Zellassays [siehe zum Beispiel Arduino et al., Antimicrob. Agents Chemother. 37: 1095–1101 (1990); und zytotoxische T-Lymphozyten (CTL)-Assays [siehe Hammond et al., J. Exp. Med. 176: 1531–1542 (1992); McElrath et al., J. Virol. 68: 5074–5083 (1994); Walker et al., Cell Immunol. 119: 470–475 (1989); Weinhold et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 8: 1373 (1992)]. Weitere geeigneten Aktivitäten, allein oder in einer beliebigen Kombination umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf eine quantitative und/oder qualitative Messung der Transkription, Replikation, Translation, Virioneinbau, Virulenz, virale Ausbeute und/oder Morphogenese.
Spezifische Ausführungsform: EPVs kodierender rekombinanter Vaccinia Virus, Poly-Env-Impfstoffe und Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung
Überblick. Rekombinante Vaccinia Viren (VV), die HIV-Hüllproteine (zum Beispiel gp41, gp120 und/oder gp160 oder einen Teil davon) kodieren, stellen Materialien zur Verfügung, die für die Herstellung und das Testen der gemischten Impfstoffe, die mindestens eine einer humoralen oder zellulären Immunantwort gegen das Virus induzieren, sowie für Analysen der B-Zellen und CTL-Determinanten verwendbar sind.
Ein Poly-Env-Impfstoff der vorliegenden Erfindung besteht aus einer Mischung von n verschiedenen rekombinanten Vaccinia Viren, wobei n eine ganze Zahl von ungefähr 4 bis ungefähr 10.000 (oder jeder Bereich oder Wert darin) ist, worin jedes Vaccinia-Vektorkonstrukt eine Variante eines HIV-1-Hüllproteins (EPV) exprimiert (zum Beispiel gp41, gp120 oder gp160). Der rekombinante Vaccinia Virus kodiert funktional eine EPV und wird durch Rekombination von Wildtyp VV mit einem Plasmid hergestellt. Multiple verschiedene EPV-kodierende Plasmide können durch Substitution einer EPV-kodierenden Sequenz gegen eine andere, zum Beispiel unter Verwendung eines Restriktionsfragments oder Mutagenese, hergestellt werden.
Herstellung rekombinanter Vaccinia Viren. Verfahren zur Herstellung einzelner Plasmide (wobei jedes eine einmalig vorkommende HIV-Proteinsequenz exprimiert) können eine DNA- oder RNA-Amplifikation zur Substitution isolierter Sequenzen einer Hüllproteinvariante in einen Vektor (zum Beispiel pVenv4 oder pVenv1 [Hallenberger et al., Virology 193: 510–514 (1993)]) verwenden, wobei der Vektor eine bekannte HIV-Hüllproteinsequenz (zum Beispiel erhältlich von dem NIAID AIDS Research & Reference Reagent Program, Rockville, MD) kodiert.
Verfahren zur Amplifikation einer RNA oder DNA sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und können erfindungsgemäß ohne übermäßiges Experimentieren, basierend auf den Lehren und der hierin dargestellten Anleitung, verwendet werden. Bekannte Verfahren der DNA- oder RNA-Amplifikation umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf eine Polymerasekettenreaktion (PCR) und verwandte Amplifikationsprozesse (siehe zum Beispiel die U.S. Patente mit den Nummern 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188, von Mullis 4,795,699 und 4,921,794 von Tabor et al; 5,142,033 von Innis; 5,122,464 von Wilson et al.; 5,091,310 von Innis; 5,066,584 von Gyllensten et al; 4,889,818 von Gelfand et al.; 4,994,370 von Silver et al; 4,766,067 von Biswas; 4,656,134 von Ringold) und die RNA-vermittelte Amplifikation, die Antisense-RNA zu der Zielsequenz als Templat für eine doppelsträngige DNA-Synthese verwendet (U.S. Patent Nr. 5,130,238 von Malek et al, mit dem Markennamen NASBA).
Rekombinante Vaccinia Virus-Konstrukte, die über diesen Weg hergestellt wurden, können für Immunisierungen und zum Hervorrufen von HIV-spezifischen T- und/oder B-Zellenantworten verwendet werden. Primer verwenden konservierte HIV-Sequenzen und amplifizieren daher erfolgreich Env-Gene aus vielen verschiedenen HIV-1-Patientenproben. Diese hier beschriebenen Grundtechniken können ähnlich mit PCR oder anderen Arten von Amplifikationsprimern verwendet werden, um kleinere oder größere Stücke der Env-Sequenzen aus Feldisolaten dafür, die in Vektoren gefunden wurden, die ein HIV-Hüllprotein kodieren, zu substituieren. Siehe zum Beispiel Ausubel; s. u. Sambrook, s. u.
EPV-kodierende Nukleinsäuren. Die Technik beginnt mit der Isolierung von DNA aus HIV-infizierten Zellen und der Amplifikation von Env-Sequenzen durch PCR. PCR- oder andere Amplifikationsprodukte liefern das einfachste Mittel zur Isolierung von HIV-Sequenzen, jedoch können alle anderen geeigneten und bekannte Verfahren, wie zum Beispiel Klonierung und Isolierung einer EPV-kodierenden Nukleinsäure oder Proteine verwendet werden (siehe Ausubel, s. u.; Sambrook, s. u.). Zur Erleichterung der Genklonierung werden Enzymrestriktionsstellen vorzugsweise in die PCR oder andere Amplifikationsprimersequenzen eingebaut.
Isolierte DNA für eine PCR kann aus multiplen Virusquellen, einschließlich frischem oder gefrorenem Vollblut von HIV+-Patienten und Zellen, die in vitro mit Virusisolaten infiziert worden sind, hergestellt werden.
Zur Herstellung neuer HIV-Env-Konstrukte wird die Polymerasekettenreaktion (PCR) vorzugsweise zur Amplifikation von 100–2700 Basenpaaren (bp) eines Env-Gens aus jeder unterschiedlichen HIV-Patientenprobe verwendet. Die PCR-Primer können gut konservierte HIV-Sequenzen darstellen, die zur Amplifikation von Env-Genen aus bekannten Proben von Env-Genen, isolierten HIVs oder aus verschiedenen HIV-Patientenproben geeignet sind. Die amplifizierte DNA umfasst vorzugsweise einen Teil, der 10–900 (wie zum Beispiel 100–400, 400–600 oder 600–900 oder jeden Bereich oder Wert darin) Aminosäuren von gp120 und gp41 (die beide gp160 bilden) kodiert. Vorzugsweise sind eine oder mehrere der variablen Regionen (V1–V5) und konstanten Regionen (C1–C5) der Hülle, besonders bevorzugt die meisten der V1-, C1-, V2-, C2-, V3-, C3-, V4-, C4- und V5-Regionen in den PCR-Produkten enthalten. Zusätzlich können die amplifizierten Sequenzen 1–200 Aminosäuren jenseits der Spaltungsstellte für gp120/gp41 kodieren. Vorzugsweise wird der größte Teil oder das gesamte Env-Gen amplifiziert. Optional fehlt der amplifizierten gp120-kodierenden Sequenz ein Teil oder alle Sequenzen, die die Transmembrandomäne und/oder die zytoplasmatische Schwanzdomäne kodieren [siehe zum Beispiel Hallenberger et al. (1993)].
Die PCR-Primer können so konstruiert werden, dass die Restriktionsenzymstellen die Hüllgensequenz in dem Vaccinia-Plasmid so flankieren, dass sie in die amplifizierten DNA-Produkte eingebaut werden. Unter Verwendung gut bekannter Substitutions-Klonierungstechniken können Vaccinia-Plasmidderivate, die Sequenzen von Hüllprotein-Varianten von 1–10.000 Patienten exprimieren, durch Substitution eines entsprechenden Teils der Env-Sequenz in dem Vaccinia-Plasmid gegen einen Teil einer EPV-kodierenden Sequenz des Patienten, wie zum Beispiel durch Verwendung von Restriktionsfragmenten für die Substitution, erzeugt werden. Zum Beispiel werden das pVenv4-Plasmid und die PCR-Produkte mit KpnI und BsmI behandelt, um eine Sequenz zu erhalten, die ein abgeschnittenes gp160 mit den Aminosäuren 1–639 kodiert, der sowohl die Transmembrandomäne als auch die zytoplasmatische Schwanzdomäne von gp41 fehlt [siehe zum Beispiel Hallenberger et al. (1993)].
Nach der Ligation des PCR-Produkts und der pVenv-Produkte werden bakterielle Wirtszellen mit der Ligationsmischung über jedes aus einer Zahl von Verfahren, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, einschließlich zum Beispiel Elektroporation, transformiert und rekombinante Kolonien werden gesammelt und durch Sequenzierung untersucht.
Rekombinante Vaccinia Virus-Konstrukfe, die HIV-Hüllproteine kodieren. Das EPV-kodierende Vaccinia wird dann mit einem Wildtyp-Virus in einer Wirtszelle rekombiniert und die EPV-exprimierenden Virusplaques werden ausgewählt und Virusstämme werden hergestellt. Die Virusstämme, wie VVenvs, die jeweils eine unterschiedliche EPV-kodierende Sequenz enthalten, werden dann unter Verwendung von mindestens 4–40 und bis zu ungefähr 10.000 rekombinanten Viren zur Bildung eines Poly-Env-Impfstoffs der vorliegenden Erfindung gemischt.
Die rekombinanten Vaccinia-Plasmide, die die EPV-Sequenzen enthalten, werden dann optional sequenziert oder mit HIV-Hüllprotein-spezifischen Antikörpern zur Identifikation verschiedener EPVs gescreent. Eine Sequenzierung durch das Didesoxykettenabbruchverfahren von Sanger wird bevorzugt. Das Verfahren wird vorzugsweise ausgehend von früher beschriebenen Verfahren angepasst [Sambrook et al. (1989), s. u.; United States Biochemical, Sequenase Version 2.0 – DNA Sequencing Kit, Neunte Auflage, Amersham Life Science, Inc., (1994)] und sollte näherungsweise 50–300 bp ausgehend von der Primerposition lesen.
Verfahren für die Herstellung von VV-Expressionsvektoren sind aus dem Stand der Technik gut bekannt [siehe zum Beispiel Mackett, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 7415–7419 (1982); Panicali, D., und Paoletti, E., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 4927–4931 (1982); U.S. Patent Nr. 4,169,763; Mazzara, G. P. et al., Methods in Enz. 217: 557–581 (1993), Ausubel et al., s. u., bei §§ 16.15–16.19]. Der früher beschriebene pSC11-Vektor [Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3403–3409 (1985)] kann vorzugsweise zur Erzeugung eines Env-kodierten Plasmids, wie zum Beispiel pVenv4 verwendet werden.
Als viraler Vektor weist das Vaccinia Virus eine Zahl von brauchbaren Charakteristika auf, einschließlich der Fähigkeit, die das Klonieren großer Fragmente einer fremden DNA (größer als 20 Kb) erlaubt, der Beibehaltung der Infektiosität nach dem Einschub einer fremden DNA, eines weiten Wirtsbereichs, eines relativ hohen Proteinsyntheseniveau und geeigneter Transport-, Sekretions-, Verarbeitungs- und posttranslationaler Modifikationen, wie es von der Primärstruktur des exprimierten Proteins und der Wirtszellverwendung vorgeschrieben ist. Zum Beispiel treten eine N-O- Glycosylierung, Myristylierung und eine Spaltung sowie Aggregate von exprimierten Proteinen artgetreu auf.
Mehrere Variationen des Vaccinia-Vektors sind entwickelt worden und sind zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet (siehe zum Beispiel Ausubel et al., s. u. §§ 16.15–16.19). Am üblichsten wird nach dem Erhalten des Virusstamms (Ausubel, s. u. bei §§ 16.16) eine eine EPV kodierende Nukleinsäuresequenz unter die Kontrolle eines Vaccinia Virus-Promotors gebracht und zum Bewahren der Infektiosität in das Genom des Vaccinia integriert (Ausubel et al., s. u. bei § 16.17). Alternativ dazu kann die Expression erreicht werden, indem ein Plasmid, das das durch den Vaccinia-Promotor kontrollierte Gen; das ein EPV kodiert, enthält, in eine Zelle transfiziert wird, die mit dem Wildtyp-Vaccinia infiziert worden ist.
Die Wirtszelle und der Vaccinia-Vektor sind vorzugsweise für die Verwendung zur Impfung von Säugetieren und Menschen geeignet und dafür genehmigt. Diese rekombinanten Viren werden dann unter Verwendung bekannter Verfahren (Ausubel et al., s. u. bei § 16.18) charakterisiert. Bei einer weiteren Variante kann die Bakterienphagen-T7 RNA-Polymerasekette in das Genom von Vaccinia so eingebaut werden, dass die EPV-kodierenden Sequenzen unter der Kontrolle eines T7-Promotors entweder in transfiziertem Plasma, Plasmid oder in einem rekombinanten Vaccinia Virus exprimiert werden.
Die Verwendung von Pockenviruspromotoren wird bevorzugt, weil zelluläre und virale Promotoren gewöhnlich nicht durch den Vaccinia Transkriptionsmechanismus erkannt werden. In rekombinantem Vaccinia wird für Poly-Env-Impfstoffe vorzugsweise eine Zusammensetzung aus frühem/spätem Promotor verwendet, das es erwünscht ist, die EPV als ein Antigen zu exprimieren, das in mit rekombinantem Vaccinia Virus infizierten Wirtszellen in Assoziation mit der Haupthistokompatibilitätsklasse (MHC) I oder II vorhanden ist. Ein derartiges MHC-assoziiertes HIV-Hüllprotein wird dann zytotoxische T-Zellenziele bilden und in geimpften Säugetieren eine zytotoxische T-Zellenantwort und/oder eine humorale Antwort gegen die exprimierten HIV-EPVs initiieren. Dies liegt daran, dass die Fähigkeit der viralen Vaccinia-Vektoren zur Induktion einer MHC-Darstellung in Wirtszellen für diesen Antigentyp, im Infektionszustand spät weniger zu werden scheint. Die früh entstandenen Transkripte werden nach der Sequenz TTTTTNT abbrechen und führen zu einer unzulänglichen MHC-Darstellung.
Alternativ dazu können alle derartigen Terminationsmotive innerhalb der kodierenden Sequenz des Gens durch Mutagenese bei Verwendung eines frühen Pockenviruspromotors geändert werden, um die MHG-Darstellung der Hüllproteinantigene in Wirtszellen zu erhöhen (Earl et al., s. u., 1990). Zur Nachahmung der Vaccinia Virus-mRNAs werden normalerweise nichttranslatierte Signal- und 3'-endständige Sequenzen kurz gehalten, wenn sie in den Vaccinia-Plasmiden, in die HIV-EPV-kodierende Sequenzen eingebaut sind, verwendet werden.
Das zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vaccinia-Konstrukte verwendete Plasmid wurde vorzugsweise mit Restriktionsendonukleasestellen zum Einschub des Env-Gens stromabwärts des Vaccinia-Promotors entworfen (Ausubel et al., s. u., § 16.17). Bevorzugter enthält das Plasmid schon eine Hüllprotein-kodierende Sequenz, worin die Restriktionsstellen einmalig in der Nähe von jedem der Anfänge und Enden der Hüllprotein-kodierenden Sequenz vorkommen. Dasselbe Restriktionsfragment der EPV-kodierenden Sequenz kann dann die entsprechende Sequenz in dem Plasmid ersetzen. In derartigen Fällen kann der Hauptteil der EPV-kodierenden Sequenz nach der Entfernung des größten Teils oder der gesamten Hüllprotein-kodierenden Sequenz von dem Plasmid eingeschoben werden.
Das resultierende Vaccinia-Konstrukt (das die EPV-kodierende Sequenz und den Vaccinia-Promotor enthält) wird von Vaccinia-DNA flankiert, um eine homologe Rekombination zu erlauben, wenn das Plasmid in Zellen, die vorher mit einem Wildtyp-Vaccinia infiziert worden sind, transfiziert wird. Die flankierende Vaccinia Virus-DNA wird so gewählt, dass die Rekombination kein wesentliches virales Gen unterbricht.
Ohne Auswahl beträgt das Verhältnis von rekombinantem zu parenteralem Vaccinia Virus normalerweise 1 : 1000. Obwohl diese Häufigkeit hoch genug ist, um die Verwendung von Plaquehybridisierung (siehe Ausubel et al., s. u. bei §§ 6.3 und 6.4) oder Immunscreening (Ausubel et al., s. u. bei § 6.7) zum Auswählen von rekombinanten Viren zu erlauben, wurde eine Vielzahl von Verfahren zur Erleichterung der Identifikation eines rekombinanten Virus verwendet. Nichteinschränkende Beispiele für derartige Auswahl- oder Screeningtechniken sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe Ausubel et al., s. u. bei § 16.17). Normalerweise wird die Expressionskassette von Segmenten der Vaccinia-Thymidinkinase (TK)-Gene flankiert, so dass die Rekombination zur Inaktivierung von TK führt. Ein Virus mit einem TK^–-Phänotyp kann dann von solchen mit einem TK⁺-Phänotyp durch Infektion einer TK^–-Zelllinie in Gegenwart von 5-Bromdesoxyuridin (5-BrdU), das zum letalen Einbau in das Virusgenom durch TK phosphoryliert werden muss, unterschieden werden. Alternativ dazu oder zusätzlich dazu können rekombinante Viren durch die Coexpression eines gegen bakterielle Antibiotika resistenten Gens, wie zum Beispiel Ampicillin (amp) oder Guaninphosphoribosyltransferase (gpt) ausgewählt werden. Als ein weiteres Beispiel gestattet die Coexpression des Escherichia coli lac Z-Gens das Coscreening rekombinanter Virusplaques mit XgaI (Ausubel, s. u., § 16.17).
Die eine EPV der vorliegenden Erfindung exprimierenden Vaccinia Viren können optional gemäß bekannter Verfahren, wie zum Beispiel durch Wärme, Paraformaldehydbehandlung, Ultraviolettbestrahlung, Propiolactonbehandlung, Hybrid- oder Chimärenbildung oder durch andere bekannte Verfahren geschwächt oder inaktiviert werden [siehe zum Beispiel Zagury et al., Nature 332: 718–731 (1988); Ito et al., Cancer Res. 50: 6915–6918 (1990); Wellis et al., J. Immunol. 99: 1134–9 (1967); D'Honcht, Vaccine 10 (Ergänzungsband): 548–42 (1992); Selenka et al., Arch. Hyg. Bakteriol. 153: 244–253 (1969); Grundwald-Bearch et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117: 561–567 (1991)]. Zum Beispiel wird eine Inaktivierung durch Wärme bei 60°C den Virustiter beträchtlich verringern. Derartige Techniken zur Abschwächung sind bezüglich ihrer Sicherheit getestet, da eine unvollständige Inaktivierung zum Tod des Patienten führen könnte (Dorozynski und Anderson, Science 252: 501–502 (1991)].
Derartiges geschwächtes oder inaktiviertes rekombinantes Vaccinia soll bei Patienten mit geschwächtem gefährdetem Immunsystem verwendet werden, da bei Verabreichung von lebendem Vaccinia Komplikationen oder sogar Tod auftreten können.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Pharmazeutische Präparate der vorliegenden Erfindung, die zur Impfung oder zur parenteralen oder oralen Verabreichung geeignet sind, umfassen einen rekombinan ten Poly-Env-Virusimpfstoff, der mindestens 4 und bis zu ungefähr 10.000, vorzugsweise 4 bis ungefähr 1.000 und bevorzugter ungefähr 10 bis ungefähr 100 verschiedene rekombinante Viren in Form eines Zelllysats, einer Membran-gebundenen Fraktion, in teilweise gereinigter oder in gereinigter Form umfasst. Der Poly-Env-Impfstoff umfasst vorzugsweise ein das rekombinante Virus enthaltendes Zylllysat (oder Membran-gebundene Fraktionen davon), das weiterhin EPV-Proteine umfasst, die schon durch die rekombinanten Viren exprimiert wurden. Es wurde nun entdeckt, dass der Einschluß der exprimierten EPVs die primäre Antikörperantwort verstärkt.
Die Poly-Env-Impfstoffzusammensetzung kann in Form steriler wässriger oder nicht wässriger Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen und sie kann ebenfalls Hilfsmittel oder Arzneimittelträger, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, enthalten. Jedes der mindestens ungefähr 4–40 bis 10.000 verschiedenen Viren kodiert und exprimiert eine unterschiedliche EPV, wie hierin geschildert wurde. EPVs-kodierende DNA kann zum Darstellen von EPVs verwendet werden, die in einer spezifischen isolierten Gemeinschaft von AIDS-Patienten vorkommen. Zum Beispiel könnte ein Impfstoff Sequenzen aus Memphis, TN repräsentieren und auf eine Verwendung in Memphis, TN gerichtet sein. Impfstoffe, die so entworfen sind, dass sie geographisch eingeschränkte Gebiete repräsentieren, können ebenfalls zur Verwendung bei Gemeinschaften außerhalb der Zielgemeinschaft verwendbar sein.
Alternativ dazu können EPVs-kodierende DNAs ausgewählt werden, um geographisch entfernte Gemeinschaften, Städte oder Länder, wie zum Beispiel Kladen zu repräsentieren. Zum Beispiel können Mehrfachklone in einem Poly-Env-Impfstoff repräsentiert sein. Eine Poly-Env-Impfstoffzusammensetzung kann weiterhin Immunmodulatoren, wie zum Beispiel Cytokine umfassen, die eine Immunantwort gegen eine virale Infektion schwächen. Siehe zum Beispiel Berkow et al., Hrsg., The Merck Manual, fünfzehnte Auflage, Merck und Co., Rahway, NJ (1987); Goodman et al., Hrsg., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Achte Auflage, Pergamon Press, Inc. Elmsford, NY (1990); Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, dritte Auflage, AIDS Press, LTD., Williams und Wilkins, Baltimore, MD (1987); und Katzung, Hrsg. Basic and Clinical Pharmacology, fünfte Auflage, Appleton und Lange, Norwalk, CT (1992), wobei diese Verweise und die darin zitierten Verweise den Stand der Technik zeigen.
Für den Durchschnittsfachmann versteht es sich von selbst, dass, wenn ein Poly-Env-Impfstoff der vorliegenden Erfindung einem Individuum zur Verfügung gestellt wird, er in einer Zusammensetzung vorliegen kann, die weiterhin mindestens eines von Salzen, Puffern, Hilfsmitteln oder anderen Substanzen umfassen kann, die zur Verbesserung der Wirksamkeit der Zusammensetzung erwünscht sind. Hilfsmittel sind Substanzen, die zur spezifischen Steigerung von mindestens einer Immunantwort verwendet werden können. Normalerweise werden das Hilfsmittel und die Zusammensetzung vor der Abgabe an das Immunsystem gemischt oder getrennt jedoch in dieselbe Stelle zur Immunisierung abgegeben. Hilfsmittel können grob in mehrere Gruppen, basierend auf ihrer Zusammensetzung eingeteilt werden. Diese Gruppen umfassen Ölhilfsmittel, Mineralsalze (zum Beispiel AlK(SO₄)₂, AlNa(SO₄)₂, AlNH₄(SO₄)₂, Siliziumdioxid, Kaolin und Kohlenstoff), Polynukleotide (zum Beispiel Poly-IC und Poly-AU-Nukleinsäuren) und bestimmte natürliche Substanzen (zum Beispiel Wachs D von Mycobacterium tubercolosis, Substanzen, die in Corynebacterium parvum oder Bordetella pertussis und Mitglieder der Gattung Brucella gefunden werden). Hilfsmittel, die unter diesen Substanzen besonderes verwendbar sind, sind die Saponine (zum Beispiel Quil A., Superfos A/S, Dänemark). Beispiele für Materialien, die zur Verwendung in den Impfstoffzusammensetzungen geeignet sind, sind zum Beispiel in Osol, A., Hrsg., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), Seiten 1324–1341 offenbart.
Eine pharmazeutische Poly-Env-Impfstoffzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann weiterhin oder zusätzlich mindestens eine antivirale chemotherapeutische Verbindung enthalten. Nicht einschränkende Beispiele können aus mindestens einem aus der Gruppe, bestehend aus Gammaglobulin, Amantadin, Guanidin, Hydroxybenzimidazol, Interferon-α, Interferon-β, Interferon-γ, Interleukin-16 (IL-16; Kurth, Nature, 8. Dezember 1995); Thiosemicarbazonen, Methisazon, Rifampin, Ribvirin, einem Pyridinanalogon (zum Beispiel AZT und/oder 3TC), einem Purinanalogon, Foscarbet, Phosphonoessigsäure, Acyclovir, Didesoxynukleosiden, einem Proteaseinhibitor (zum Beispiel Saquinavir (Hoffman-La Roche); Indinavir (Merck), Ritonavir (Abbott Labs); AG 1343 (Agouron Pharmaceuticals); VX-2/78 (Glaxo Wellcome)); Chemokinen, wie zum Beispiel RANTES, MIP1α oder MIP1β [Science 270: 1560–1561 (1995)] oder Ganciclovir ausgewählt werden. Siehe zum Beispiel Richman: AIDs Res. Hum. Retroviruses 8: 1065–1071 (1992); Annu. Rev. Pharmacol. Toxico 33: 149–164 (1993); Antimicrob. Agents Chemother 37: 1207–1213 (1993); AIDs Res. Hum. Retroviruses 10: 901 (1994); Katzung (1992), s. u., und die darin auf den Seiten 798–800 beziehungsweise 680–681 zitierten Verweise.
Pharmazeutische Verwendungen
Die Verabreichung eines Poly-Env-Impfstoffs (oder der Antiseren, die er hervorruft) kann für einen „prophylaktischen" oder „therapeutischen" Zweck und vorzugsweise für prophylaktische Zwecke sein. Wird er prophylaktisch zur Verfügung gestellt, wird die Lebend-Poly-Env-Impfstoffzusammensetzung vor jedem Nachweis oder einem Symptom einer HIV-Infektion oder einer AIDS-Erkrankung zur Verfügung gestellt. Die prophylaktische Verabreichung der Zusammensetzungen) dient zur Verhinderung oder Abschwächung jeglicher nachfolgender HIV-Infektion.
Bei einer therapeutischen Bereitstellung wird der Poly-Env-Impfstoff nach dem Nachweis eines Symptoms einer tatsächlichen Infektion zur Verfügung gestellt. Die Verabreichung eines Lebend-Poly-Env-Impfstoffs nach einer HIV-Infektion wird nur bereitgestellt, wenn festgestellt wurde, dass das Immunsystem des Patienten in der Lage ist, auf den Lebend-Poly-Env-Impfstoff zu reagieren, ohne, dass ein wesentliches Risiko für ungeeignete Komplikationen oder den Tod besteht, wobei die Verabreichung eines Lebendviruses in der erforderlichen Dosierung, die zur Schwächung jeder tatsächlichen HIV-Infektion dient, bereitgestellt wird.
Ist die Immunantwort des Patienten gefährdet, betrifft alternativ dazu eine therapeutische Verabreichung vorzugsweise die Verwendung einer abgeschwächten oder inaktivierten Poly-Env-Impfstoffzusammensetzung, wobei die rekombinanten Viren abgeschwächt oder inaktiviert sind, wie vorstehend geschildert ist. Siehe zum Beispiel Berkow (1987), s. u., Goodman (1990), s. u., Avery (1987), s. u. und Katzung (1992) s. u. Dorozynski und Anderson, Science 252: 501–502 (1991).
Eine Zusammensetzung soll „pharmazeutisch verträglich" sein, wenn ihre Verabreichung von einem empfangenden Patienten toleriert wird. Das Verabreichen eines derartigen Mittels in einer „therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge" be deutet, dass die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Impfstoff oder eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist physiologisch signifikant, wenn deren Vorhandensein zu einer nachweisbaren Veränderung in der Physiologie eines empfangenden Patienten, vorzugsweise durch Verstärkung einer humoralen oder zellulären Immunantwort gegen ein HIV, führt.
Der bereitgestellte „Schutz" muss nicht absolut sein, das heißt die HIV-Infektion oder AIDS-Erkrankung muss nicht vollständig verhindert oder ausgerottet sein, vorausgesetzt, dass es eine statistisch signifikante Verbesserung im Vergleich zu einer Kontrollpopulation gibt. Der Schutz kann auf eine Linderung der Schwere oder der Schnelligkeit des Ausbruchs von Symptomen der Krankheit eingeschränkt sein.
Pharmazeutische Verabreichung
Ein Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann gegen einen oder mehrere Stämme eines HIV eine Resistenz verleihen. Daher betrifft und stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel zur Verhinderung oder Schwächung einer Infektion durch mindestens einen HIV-Stamm zur Verfügung. Wie hierin verwendet wird, soll ein Impfstoff eine Krankheit verhindern oder schwächen, wenn dessen Verabreichung an ein Individuum entweder zur vollständigen oder teilweisen Schwächung (das heißt Unterdrückung) eines Symptoms oder eines Zustands der Krankheit oder zur vollständigen oder teilweisen Immunität des Individuums gegen die Krankheit führt.
Mindestens ein Poly-Env-Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann durch alle Mittel, die den beabsichtigten Zweck erreichen, unter Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie sie hierein beschrieben ist, verabreicht werden.
Eine Verabreichung einer derartigen Zusammensetzung kann zum Beispiel über verschiedene parenterale Wege, wie zum Beispiel subkutane, intravenöse, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intranasale, transdermale oder buccale Wege erfolgen. Eine subkutane Verabreichung wird bevorzugt. Eine parenterale Verabreichung kann über eine Bolus-Injektion oder über eine allmähliche Perfusion über die Zeit hinweg erfolgen. Siehe zum Beispiel Berkow (1989), s. u., Goodman (1990), s. u., Avery (1987), s. u. und Katzung (1992), s. u.
Eine typische Therapie zur Verhinderung, Unterdrückung oder Behandlung einer Krankheit oder eines Zustands, der durch eine zelluläre Immunantwort durch eine aktive spezifische zelluläre Immuntherapie gelindert werden kann, umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Impfstoffzusammensetzung, wie vorstehend beschrieben ist, die als eine einzelne Behandlung oder wiederholt als Dosierungen zur Erhöhung oder Verstärkung über eine Zeitdauer bis zu und einschließlich einer Woche bis zu ungefähr 24 Monaten verabreicht wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine „wirksame Menge" einer Impfstoffzusammensetzung eine, die ausreicht, um eine gewünschte biologische Wirkung, die in diesem Fall mindestens eine einer zellulären oder humoralen Immunantwort gegen HIV ist, zu erreichen. Es versteht sich von selbst, dass diese wirksame Dosierung von dem Alter, dem Geschlecht, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, der Art der gleichzeitigen Behandlung, falls vorhanden, von der Häufigkeit der Behandlung, und der Art der gewünschten Wirkung abhängt. Die Bereiche wirksamer Dosen, die nachstehend bereitgestellt sind, beabsichtigen keine Einschränkung der Erfindung und stellen bevorzugte Dosisbereiche dar. Die besonders bevorzugte Dosierung wird jedoch an den einzelnen Patienten angepasst, wie es sich von selbst versteht und wie sie ohne übermäßiges Experimentieren von dem Durchschnittsfachmann bestimmt werden kann. Siehe zum Beispiel Berkow (1987), s. u., Goodman (1990), s. u., Avery (1987), S. u., Ebadi, Pharmacology, Little, Brown und Co., Boston, MA (1985) und Katsung (1992), s. u.
Allgemein gesagt, wird die Dosierung für einen erwachsenen Menschen von ungefähr 10⁵–10⁹ Plaque-bildenden Einheiten (pfu)/kg oder Kolonie-bildenden Einheiten (CFU)/kg pro Dosis, wobei 10⁶–10⁸ bevorzugt ist, betragen. Unabhängig davon, welche Dosierung verwendet wird, sollte sie eine sichere und wirksame Menge entsprechend der Bestimmung durch bekannte Verfahren sein, die ebenfalls hierin beschrieben ist.
Versuchspersonen
Die Empfänger der Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können jedes Säugetier sein, das eine spezifische Immunität über eine zelluläre oder humorale Immunantwort gegen HIV erwerben kann, wobei die zelluläre Antwort durch ein Protein der MHC-Klasse I oder II vermittelt wird. Unter den Säugetieren sind die bevorzugten Empfänger Säugetiere der Ordnungen Primaten (einschließlich Menschen, Schimpansen, Menschenaffen, Affen). Besonders bevorzugte Empfänger sind Menschen. Die Versuchspersonen sind vorzugsweise mit HIV infiziert oder stellen ein Modell einer HIV-Infektion zur Verfügung [zum Beispiel Hu et al., Nature 328: 721–723 (1987)].
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde wird diese leichter durch Verweis auf die folgenden Beispiele verständlich, die erläuternd zur Verfügung gestellt werden und keine Einschränkung der vorliegenden Erfindung beabsichtigen.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: Herstellung von Vaccinia Virus-Vektoren für die HIV-Env-Proteinexpression
Nomenklatur. Ein rekombinantes Vaccinia Virus-Konstrukt wird alternativ hierin für Verweiszwecke als ein VVenv-Konstrukt bezeichnet, wobei spezifische Vaccinia Virus-Konstrukte entsprechend einem Patienten oder einer Datenbank (zum Beispiel ATCC oder die Genbankquelle der Env-DNA in dem Konstrukt) bezeichnet sind. Zum Beispiel würde VVenv-Doe auf ein Vaccinia Virus-Vektorkonstrukt mit env-Sequenzen von dem Patienten Doe verweisen und VVenv-U28305 würde auf einen Vaccinia Virus-Vektor mit env-Sequenzen, die in der Genbank mit der Zugangsnummer U28305 gefunden wurden, verweisen.
Der Poly-Env-Impfstoff besteht aus 4–100 verschiedenen rekombinanten Vaccinia Viren, wobei jedes ein nur einmal vorhandenes HIV-1-Hüllprotein exprimiert. Für Verweiszwecke wird jedes einzelne Virus als VVenv bezeichnet und die endgültige Virusmischung wird als Poly-Env bezeichnet.
Die Herstellung von jedem VVenv verwendet das mit pVenv4 bezeichnete Plasmid und ein mit NYCDH bezeichnetes Vaccinia Virus, wie nachstehend beschrieben ist. Siehe Ryan et al., „Preparation and Use of Vaccinia Virus Vectors for HIV Protein Expression and Immunization," in Immunology Methods Manual, Lefkovits, Hrsg. Academic Press (1996) für zusätzliche Einzelheiten.
Vektoren und Wirtszellen. Der früher beschriebene pSC11-Vektor [Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3403–3409 (1985)] kann für die Rekombination multipler HIV-Gene in das VV-Genom verwendet werden. Elemente des pSC11-Plasmids umfassen das lacZ-Gen (ein Reportergen, durch das transformierte Bakterien und VV-Rekombinationen leicht als solche mit β-Galactosidaseaktivität identifiziert werden können), einen Teil des Thymidinkinase (TK)-kodierenden Gens und ein Ampicillin-Resistenzgen (amp). In pSC11 klonierte Gene werden in das VV-Genom durch homologe Rekombination zwischen dem TK-Gen des Wildtyp-Virus und den Teilen des TK-Gens, das in pSC11 enthalten ist, eingeschoben. Ein Einschub von Plasmid-DNA in den viralen TK-Locus inaktiviert das virale Gen, so dass rekombinante Viren leicht von dem Hintergrund des TK⁺-Virus durch Vermehrung in Bromodesoxyuridin (BUdR) ausgewählt werden können. Damit das rekombinante TK^–-Virus diese Auswahl überlebt, müssen sie in Zellen vermehrt werden, die kein aktives TK-Enzym liefern, wie zum Beispiel eine TK^–143-Zelllinie, die ein TK-Mangelderivat der menschlichen Zelllinie R970-5 ist, eine Osteosarkomzelllinie (Rhim, J. S. et al., Int. J. Cancer 15: 23–29 (1975)], die das Wachstum von VV unterstützt [Weir et al., s. u. (1982)]. Die Erzeugung der HIV-Gensegmentexpression kann durch Einschub eines vollständigen Gens in die SmaI-Stelle des PSC11-Vektors erfolgen. Gene mit vollständiger Länge können unter der Kontrolle des P7.5K-Promotors exprimiert werden.
Als Alternative zu dem Klonieren vollständiger HIV-Gene können teilweise Gensequenzen für HIV-Gene, die schon in pSC11 kloniert worden sind, substituiert werden. Zum Beispiel wurde von pSC11 ein mit pVenv1 bezeichnetes Konstrukt hergestellt und es exprimiert das BH10-HIV-Hüllprotein (Env)-Gen [Hallenberger et al., s. u. (1993); Kilpatrick et al., J. Biol. Chem. 262: 116–121 (1987)]. Das Konstrukt kann als Ausgangsvektor verwendet werden, um variable Hüllproteinregionen von Feld-HIV-Isolaten zu substituierten und zu exprimieren. Ähnlich wurde ein mit pVenv4 bezeichneter Vektor von pSC11 konstruiert, um ein BH10-Env-Protein zu exprimieren, abgeschnitten, um die Transmembran- und gp41 Sequenzen kodierende zytoplasmatische Schwanzdomäne auszuschließen, während die Oligomerisierungsdomäne beibehalten wird [Hallenberger et al. (1993), s. u.]. Wie es für den Fachmann klar ist, wird der Begriff „Oligomerisierungsdomäne" funktionell verwendet, um auf einen Teil von gp41 zu verweisen, der eine Oligomerisierung von Env-Proteinen erlaubt, das heißt, es ist eine für eine Oligomerisierung ausreichende Struktur vorhanden. Der pVenv4-Vektor kodiert ein abgeschnittenes pg160 (ebenfalls: gp160t, gp140), von dem entdeckt wurde, dass es eine tertiäre Struktur bildet, die zu derjenigen des verarbeiteten pg41/pg120-Oligomers (Dimer, Trimer oder Tetramer), wie es auf der Zelloberfläche von HIV-infizierten Zellen vorhanden ist, ähnlich ist. Diese tertiäre Struktur wird sowohl in sezernierter als auch Membran-assoziierter Form beibehalten [Halleneberger et al. (1993)]. Dieser Vektor wird vorzugsweise als Ausgangsvektor zur Substitution alternativer isolierter Env-Sequenzen verwendet.
In diesem Beispiel betrifft die Herstellung eines jeden VVenv-Kosntrukts die Verwendung eines pVenv4 und eines Wildtyp-Vaccinia Virus NYCDH und geeignete Wirtszellen, wie es nachstehend ausführlich beschrieben ist.
pVenv4: Der pVenv4-Vektor wurde früher durch den Einschub einer HIV-1-Hüllekodierenden Sequenz in den pSC11-Vaccinia Virus-Rekombinationsvektor hergestellt [Hallenberger, et al., Virology 193: 510–514 (1993); Chakrabarti et al., Mol. Cell Biology 5: 3403–3409 (1985)]. Die HIV-1-Sequenz wurde aus einem Laborstamm eines Lebendvirus abgeleitet. Die Sequenz wurde mit „BH10" bezeichnet [Ratner et al., Nature 313: 277–284 (1985)]. Mit PCR-Techniken können einmalig vorhandene Hüllsequenzen von HIV-1-infizierten Patienten amplifiziert und in die BH10-Env-Sequenz unter Erzeugung neuer Vektoren substituiert werden. Für eine PCR können zum Beispiel die folgenden Primer verwendet werden.

(A) Sense, Position 5785 (SEQ ID Nr.: 1): AGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGA.
(B) Antisense, Position 7694 (SEQ ID Nr.: 2): CCACTCCATCCAGGTCATGTTATTCCAAAT.
(C) KpnI-Sense, Position 5903 (SEQ ID Nr.: 3): GTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGT.
(D) BsmI-Antisense, Position 7659 (SEQ ID Nr.: 4): CCAGAGATTTATTACTCCAACTAGCATTCCAAGG.
(E) (optional) DraIII-Sense, Position 6153 (SEQ ID Nr.: 5): CCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTG.
(F) (optional) Bsu36I-Antisense-Position 6917 (SEQ ID Nr.: 6): TACAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG.

Diese Primer werden von 5 nach 3 geschrieben. Restriktionsstellen sind unterstrichen (nummerierte Positionen basieren auf der BH10-Sequenz [Ratner et al., Nature 313: 277–284 (1985)].
PCR-Strategie: Zur Herstellung neuer HIV-1-Env-Konstrukte wird die Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Amplifikation von 1800 Basenpaaren (bp) des Hüllgens von vierzig verschiedenen HIV-1-Patientenproben verwendet. Die PCR-Primer stellen gut konservierte HIV-1-Sequenzen dar und daher erfolgreich amplifizierte Env-Gene von vielen verschiedenen HIV-1-Patientenproben. Die amplifizierte DNA umfasst das gesamte gp120-Protein mit Ausnahme von näherungsweise 10 hochkonservierten Aminosäuren am Aminoende des Proteins. Alle variablen Hüllregionen (V1–V5) sind in den PCR-Produkten enthalten. Zusätzlich kodieren amplifizierte Sequenzen näherungsweise 100 Aminsäuren außerhalb der Spaltungsstelle für gp120/gp41.
Die die Restriktionsenzymstellen für KpnI und BsmI tragenden Primer, die die BH10-Hüllgensequenz in pVenv4 flankieren, werden in die amplifizierten DNA-Produkte eingebaut.
Erste PCR-Runde: Mische in einem 500 μl Mikrozentrifugenröhrchen:

– 1 μl Primer A (SEQ ID Nr.: 1), 300 ng/μl;
– 1 μl Primer B (SEQ ID Nr.: 2), 300 ng/μl;
– je 2,5 μl 10 mM der 4 dNTPs;
– 1 μg DNA;
– 10 μl 10X PCR-Puffer und
– HPLC H20 bis 99 μl

Verwirble die taq-Stammlösung und dispensiere 1 μl zu der PCR-Reaktion. Mische gut. Überschichte mit Mineralöl.
Betreibe einen Thermocycler folgendermaßen:

– Inkubiere bei 95°C, 3 Minuten zum Schmelzen der DNA.
– Führe 40 Zyklen durch: 95°C, 1 Minute; 45°C, 2 Minuten; 72°C, 3,5 Minuten.

Zweite PCR-Runde: Stelle eine PCR-Reaktionslösung wie vorstehend her, jedoch mit den Primern C und D (SEQ ID Nr.: 3 beziehungsweise 4) und ohne die DNA. Bringe die Endlösung auf 95 μl. Überschichte mit Mineralöl. Entferne 5 μl aus der ersten PCR-Reaktionslösung (unterhalb des Öls) mit einer Pumpspitze mit Stopfen. Mische die Probe in die zweite Reaktionslösung unterhalb der Ölschicht und beginne mit den Zyklen wie vorher. Normalerweise sind dreißig Zyklen geeignet. Es kann erwünscht sein, das Produkt zu überwachen, indem 2 μl für eine Gelanalyse nach jeweils 10 Zyklen entfernt werden, bis eine klare Bande mit näherungsweise 1800 bp identifiziert wird.
Unter Verwendung gut bekannter Substitutionsklonierungstechniken wurden pVenv4-Derivate, die eine Env-Sequenz von einem der 40 Patienten exprimieren, anstelle der BH10-Hüllsequenz erzeugt. Kurz gesagt, das pVenv4-Plasmid und die PCR-Produkte werden als nächstes mit KpnI und BsmI abgeschnitten und man ließ das abgeschnittene pVenv4 auf einem Agarosegel laufen und das größte Fragment wurde isoliert. Das kleine Fragment (1800 bp Fragment) von BH10-Env wurde verworfen. Das abgeschnittene PCR-Produkt wurde ebenfalls isoliert und an das große pVenv4-Fragment zur Erzeugung einer chimären Hüllsequenz ligiert, die nun 1800 bp des varianten Env von der DNA des Patienten enthält. Nach der Ligation des PCR-Produkts und der pVenv-Produkte wurden bakterielle Wirtszellen mit der Ligationsmischung über ein beliebiges aus einer Anzahl von Verfahren, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, einschließlich zum Beispiel Elektroporation, transformiert und rekombinante Kolonien wurden ausgesucht und durch Sequenzierung untersucht.
Das Plasmid pVenv4 oder mit pVenv4 hergestellte Rekombinanten erleichtern den Einschub von Genen in das Vaccinia Virus-Genom durch homologe Rekombination zwischen dem Thymidinkinase (Tk)-Gen des Wildtyp-Virus und den Tk-Sequenzen innerhalb des Plasmids. Ein Einschub der pVenv4-DNA in den viralen Tk-Locus ergibt einen Vaccinia Virus, wobei das HIV-1-Hüllgen unter der Kontrolle des frühen/späten P7.5K-Promotors exprimiert wird. Das Virus wird in seiner Wachstumsaktivität aufgrund der Unterbrechung des Tk-Locus geschwächt. Ein zusätzliches Element von pVenv4 ist das lacZ-Gen, das die β-Galactosidaseaktivität kodiert. Die lacZ-Aktivität kann zur Auswahl von Vaccinia Virus-Rekombinanten verwendet werden (siehe unten).
Das von pVenv4 exprimierte Hüllgen wird zum Ausschluss der Transmembran/C-endständigen gp41-Sequenz abgeschnitten. Der Vektor wird als oligomere Struktur, die innerhalb von Zellen und in sezernierter Form vorgefunden wird, exprimiert.
Vaccinia Virus-NYCDH. Jedes neue substituierte Plasmid wird individuell mit dem Wildtyp-Vaccinia Virus NYCDH kombiniert. Dieses Virus wurde von der A. T. C. C. (Zugangsnr. VR-325) erhalten und wurde vor Verwendung von Plaque gereinigt (Buck, C., und Paulino, M. S., Hrsg., American Type Culture Collection Catalogue of Animal Viruses and Antisera, Chlamydiae and Rickettsiae, 6. Auflage, American Type Culture Collection, Rockville, MD (1990), S. 138).
Bakterielle Wirtszellen. Das Plasmid kann auf jedem geeigneten Wirt, wie aus dem Stand der Technik bekannt ist, vermehrt werden [siehe zum Beispiel Ausubel, s. u. (1995 Rev), §§ 16.15–16.19]. Ein nicht einschränkendes Beispiel sind DH5α-Zellen.
Zellen mit TK-Mangel. Die Transformation und Vaccinia Virus-Substitution wird auf der menschlichen TK143B-Zelllinie durchgeführt, die ein TK-Mangelderivat der menschlichen Zelllinie R970-5, eine Osteosarkomzelllinie ist [Rhim et al. (1975), s. u.], die das Wachstum von VV [Weir et al. (1982), s. u.] unterstützt. Jede Vaccinia VirusRekombinante, die eine einmalig vorhandene HIV-Env-Gensequenz enthält, wird basierend auf der Expression des lacZ-Gens ausgewählt (Virusplaques werden mit Bluo-gal überschichtet und bezüglich der β-Galactosidaseaktivität, entsprechend der Beurteilung durch die Entwicklung einer blauen Farbe, ausgewählt). Es können zwei PCR-Runden durchgeführt werden.
BEISPIEL 2: Herstellung eines Poly-Env-Impfstoffs
Vero-Zellen. Der letzte Herstellungsschritt ist die Vermehrung von n VVenv-Konstrukten auf Vero-Zellen, die neu von der A. T. C. C. (Zugangsnr. CCL81 oder X38) bezogen und kloniert wurden und für eine Virusvermehrung expandiert wurden. Die Vero-Zelllinie wurde von der Weltgesundheitsorganisation für Impfstoffentwicklung genehmigt [Hay, R., et al., Hrsg., American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 7. Auflage, American Type Culture Collection, Rockville, MD (1992), Seite 48].
Vero-Zellen werden mit Dulbeccos modifiziertem Eagles-Medium (Bio-Whittaker), einer Glutaminergänzung (Bio-Whittaker) und durch Wärme inaktiviertem fetalen Kälberserum (Hyclone, Inc.) vermehrt. Alternativ dazu können Serum-freie Medien verwendet werden. Jedes VVenv-Konstrukt wird auf eine getrennte konfluente Schicht von Vero-Zellen geimpft und geerntet, wenn die Zellen zellschädigende Wirkungen aufgrund der Virusinfektion zeigen. Zellextrakte werden nach der Ernte und vor dem Einfrieren gründlich mit PBS (Bio-Whittaker) gewaschen. Dann werden die Zellen durch Gefrier-Tauen, Beschallung oder Zentrifugieren bei geringer Geschwindigkeit in einer Zentrifuge (optional) aufgebrochen. Aliquoten des Überstands werden dann bei –70°C gelagert. Das Hüllprotein ist in dem Lysat in ausreichenden Konzentrationen vorhanden, um einen HIV-Hüllprotein-spezifischen Antikörper (wie durch ELISA nachweisbar ist) in Säugetiermodellen hervorzurufen, selbst wenn VV, zum Beispiel wird das Präparat auf 60°C, 1 Stunde erhitzt, abgeschwächt ist.
Das Impfstoffprodukt. Jeder Virus (VVenv-Konstrukt)stamm von Vero-Zellen wird einzeln eingefroren und nachfolgend wird der Titer bestimmt und die Sicherheit getestet. Nach Beendigung der Tests werden Aliquoten von jedem Virus gemischt, um einen Stammimpfstoff mit 10⁸ an gesamten pfu/ml („pfu" bedeutet Plaque-bildenden Einheiten) zu ergeben. Werden 40 VVenv-Konstrukte verwendet, wird jedes VVenv vorzugsweise gleichwertig repräsentiert, jedes VVenv wird mit einem Titer von 2,5 × 10⁶ pfu/ml in dem Impfstoffprodukt verwendet. Dieses sollte 1 × 10⁸ gesamte pfu ergeben.
Bewertung des Poly-Env-Impfstoffs
Mäuse. Mäuse können mit einer intraperitonealen Injektion mit 1 × 10⁷ pfu an Env-exprimierendem VV infiziert werden. Antikörper können durch HIV-ELISA oder Neutralisations-Assays, wie vorstehend beschrieben ist, drei Wochen nach der VV-Injektion identifiziert werden.
Vor der Herstellung des Poly-Env-Impfstoffs zur Verwendung beim Menschen wurde eine ähnliche Gruppe von Viren für den Zweck, den Impfstoff in Mäusen zu testen, hergestellt. Die Viren wurden Mäusen entweder über den intraperionealen oder subkutanen Weg verabreicht. Dann testeten wir ein gegen ein HIV-1-Serum spezifisches Antikörperserum bezüglich der Aktivität in einem Enzym-gebundenen Immunosorbensassay (ELISA). Der Assay betraf das Ausstreichen des gesamten gespaltenen HIV-1 (HTLV_ms) auf ELISA-Platten und das Blockieren der Platten mit Rinderserumalbumin. Dann wurden Serumproben in Verdünnungen von 1 : 100, 1 : 1.000 und 1 : 10.000 in Phosphat-gepufferter Salzlösung zugegeben. Der Assay wurde mit einem Alkaline-Phosphatase-konjugiertem Ziege-Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper und p-Nitrophenylphosphatase entwickelt. Die Farbreaktion wurde mit einer Natriumhydroxidlösung beendet und die optische Dichte wurde auf einem ELISA-Plattenleser bei 405 nm abgelesen.
Wie in 2 gezeigt ist, rief eine einzelne Impfung mit einem Zelllysatpräparat mit 10⁶–10⁷ pfu Vaccinia Virus (das eine einzelne HIV-1/Hüllprotein-kodierende Sequenz und ein Membran-gebundenes exprimiertes Hüllprotein enthielt) eine starke Antikörperantwort gegen HIV-1 hervor, die über den experimentellen Zeitverlauf von sechs Monaten hinweg aufrechterhalten wurde. Eine derartige Antikörperantwort war signifikant höher als im Vergleich zu früheren Berichten mit anderen Immunisierungen. Diese hohe Antikörperantwort kann auf das Vorhandensein von Membran-gebundenem Hüllprotein in einem Impfstoffpräparat zurückzuführen sein. Wie in 3 gezeigt ist, waren diese Antworten dosisabhängig. Im Vergleich zu Säugetie ren, denen eine Dosis von 10⁷ pfu gegeben wurde wurden geringere Antworten wurden in Säugetieren gesehen, denen einen Dosis von 10⁶ pfu gegeben wurde.
Es wurden ebenfalls Mischungen von Vaccinia Viren, die unterschiedliche HIV-1-Hüllproteine exprimieren, hergestellt. Erhielten Mäuse 10⁷ pfu einer Mischung aus fünf Viren, waren ihre Antworten im Vergleich zu Antworten, die gegen 10⁷ pfu einer einzelnen Vaccinia Virusrekombinanten erzeugt wurden, in der Größenordnung im wesentlichen identisch (4). Das Mischen von zahlreichen Env-exprimierenden Vaccinia Viren in hohen Zahlen ist nicht berichtet worden und es wird erwartet, dass dies ein breites Spektrum an neutralisierenden Antikörpern bereitstellt.
Menschen. Tests bezüglich des gemischten Virusstamms werden vor klinischen Erprobungen ausgeführt, wobei die erste davon zum Zwecke der Dosissteigerung und für das Testen der Sicherheit ist.
Die klinischen Erprobungen werden eine Untersuchung der Dosissteigerung sein, die eine Zusammensetzung von vier Gruppen aus Freiwilligen betrifft. Jede Gruppe bekommt eine der folgenden Impfstoffdosen:

(1) 2 × 10⁴ pfu
(2) 2 × 10⁵ pfu
(3) 2 × 10⁶ pfu
(4) 2 × 10⁷ pfu

Jeder Freiwillige erhält den gemischten Virusimpfstoff in eine 0,5 ml Salzlösung, der durch subkutane Injektion verabreicht wird.
BEISPIEL 3: Induktion einer ein primäres Isolat neutralisierenden Immunität mit einem auf einem Mehrfachhüllen-Vaccinia Virus basierenden HIV-1-Impfstoff in Schimpansen
Die Population von HIV-1-Isolaten wird mit einer ausgeklügelten Gruppierung von Hüllproteinen versehen. Env-Proteine sind die einzigen viral kodierten äußeren Proteine und Ziele für eine neutralisierende Antikörperaktivität, aber Antikörper, die gegen ein Isolat hervorgerufen werden, werden nicht notwendigerweise ein anderes neutralisieren. Aus diesem Grund stellten wir einen HIV-1-Impfstoffcocktail, zahlrei che Poly-Env-exprimierende Env-Proteine her. Die Impfstoffherstellung begann mit der Herstellung von dreißig verschiedenen VV-Rekombinanten, wobei jede ein verschiedenes Env-Protein exprimiert. Dann wurden VVEnv einzeln und in Kombination (Poly-Env) in einem Schimpansenmodell getestet. Vier Schimpansen wurden subkutan mit drei Injektionen eines einzelnen VVenv (Schimpansen 1 und 2) oder Poly-Env (Schimpansen 4 und 4) mit einer anschließenden intramuskulären Injektion mit rekombinantem gp120/gp41-Protein in Alaun immunisiert. In allen vier Tieren wurde die Sicherheit gezeigt, nur zwei davon zeigten Zeichen einer Geschwürbildung an der Injektionsstelle. Die Serumproben wurden durch zahlreiche Tests bezüglich der HIV-Bindung und Neutralisation überwacht. Die Antikörper der Schimpansen 3 und 4 zeigten die höchste Qualität der Antikörperaktivität. Eine Neutralisierungsfunktion wurde sowohl gegen ein Laborisolat als auch gegen ein primäres Isolat von HIV-1 gezeigt, wobei keines davon spezifisch in dem Impfstoff repräsentiert war. Somit stellt das Initiieren von Lymphozyten mit gemischten Env-Proteinen daher ein viel versprechendes Verfahren bereit, durch das hochqualitative Antikörper gegen verschiedene HIV-1 hervorgerufen werden können.
Materialien und Verfahren
pVenv4, ein VV-Rekombinationsvektor. pVenv4 wurde früher durch die Einführung eines Stopcodons in die BH10-Env-Sequenz und den Einschub des modifizierten BH10-Hüllgens (Env) in pSC11 hergestellt. pVenv4 exprimierte ein Env-Proteinprodukt, das bei der Aminosäure 640 abgeschnitten wurde und das sowohl zur Sekretion als auch zur Oligomerisierung befähigt war. Die Herstellung eines rekombinanten VV, Venv4, das dieses abgeschnittene BH10-Env-Protein exprimierte ist früher beschrieben worden [Hallenberger et al., Virology 193: 510–514 (1993)].
PCR für die Amplifikation von Env-Sequenzen von HIV-1-infizierten Individuen. Zur Amplifikation von HIV-Env-Sequenzen wurde eine PCR verwendet. Im Allgemeinen stammten die Proben aus dem Blut von HIV-1-infizierten Individuen, die bei einer ersten Diagnose von HIV genommen wurden. Andere Proben wurden von Individuen mit klinischen AIDS-Symptomen oder von Produkten die von der AIDS-Forschung zur Verfügung gestellt wurden und von einem Referenzreagenzdepot genommen. Für die Blutproben wurde DNA zuerst durch die tropfweise Zugabe von Blut oder infi zierten Zellen in einen auf SDS-basierenden Zelllysepuffer und Inkubation bei 65°C während 30 min hergestellt. Mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml wurde Pronase zugegeben und das Lysat wurde weiterhin bei 45°C über Nacht inkubiert. Nach zwei Phenolextraktionen folgte eine Ethanolfällung und die Resuspension von DNA in Wasser.
Mit allen DNA-Proben wurden zwei PCR-Runden nach Standardverfahren durchgeführt. Primersequenzen wurden, basierend auf der veröffentlichten BH10-Sequenz [Ratner et al., Nature 313: 277–284 (1985)], ausgewählt. Zum Erhalten von Fragmenten, die Sequenzen von allen variablen Regionen und einen Teil von gp41 enthalten, wurden PCR-Primer, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, verwendet. Anschließend wurden PCR-Produkte durch Substitution in den pVenv4-Vektor unter Verwendung von Standardverfahren kloniert. Eine Sequenzierung wurde mit den neuen Plasmiden durch Verwendung des Sanger-Verfahrens und des Primers ccatgtgtaaaattaaccccactctgtg (SEQ ID Nr.: 5) durchgeführt.
Herstellung von VVenv. Neue VV-Rekombinanten (VVenv) wurden durch Transfektion von VV (NYCDH, ATCC)-infizierten Zellen mit kürzlich substituierten Rekombinationsplasmiden (siehe oben) hergestellt. Nach den Empfehlungen des Herstellers wurden Transfectam (Promega) und Lipofectamine (Gibco, BRL) zur Erleichterung der Transfektion verwendet. Dann wurde VV von Plaque gereinigt.
Immunisierungen. VVenv-infizierte Zelllysate wurden Schimpansen mit subkutanen Injektionen verabreicht. VVenv wurde entweder allein oder in Kombination verwendet. Die Gesamtmengen von VV in pfu waren in jeder Injektion pro Tier ähnlich (näherungsweise 10⁷ pfu). Intramuskuläre Injektionen wurden mit einer Mischung von näherungsweise 40 Mikrogramm gp120 (Kat.# 12101, Intracel, Cambridge, MA), 20 Mikrogramm gp41 (Kat.# 036001, Intracel) und 500 Mikrogramm Alaun (Rehsorptar Aluminiumhydroxid-Adsorptionsgel, Intergen Co., Purchase, N. Y.) pro Impfung durchgeführt.
ELISAs. Fünf ELISAs wurden folgendermaßen durchgeführt: ELISA #1 der klinische ELISA von Abbott, wurde von Abbott Laboratories bezogen und entsprechend den Empfehlungen der Hersteller durchgeführt (HIVAB HIV-1/HIV-2 (rDNA) EIA, Abbott Laboratories, Abbott Park, I. L.). ELISA # 2: ELISAs wurden durch Ausstreichen von rekombinantem Mn-gp160 (Quality Biological, Inc. Gaithersburg, MD) mit einem Mikrogramm/ml durchgeführt. Die Platten wurden blockiert und Tests wurden mit einer Reihe von dreifach aufeinanderfolgenden Verdünnungen der Seren durchgeführt. Dann wurden die Platten gewaschen und mit einem Alkaline-Phosphatasekonjugierten Anti-Mensch IgG bewertet. ELISA #3 ELISA-Platten wurden mit einem Mikrogramm/ml LAI-gp120 (CHO-abgeleitetes Protein, Intracel) beschichtet. Die Serumproben wurden nach einer Verdünnung von 1 : 100 ausgestrichen und mit alkalischer Phosphatase-konjugiertem Anti-Mensch IgG1 (Maus-Anti-Mensch-IgG1-AP, Kat. #9050-04, Southern Biological Associates, Inc. Birmingham, A. L.) und p-Nitrophenylphosphat bewertet. Messdaten der O. D. wurden bei 405 nm aufgenommen. ELISA #4: Der ELISA wurde wie in Assay #3 durchgeführt, mit Ausnahme davon, dass die Platten mit einem Mikrogramm/ml IIIB-gp120 (vom Baculovirus abgeleitetes Protein, Intracel, Kat. #12001, Cambridge, MA) beschichtet wurden. ELISA #5: Der ELISA wurde wie in Assay #3 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Platten mit einem Mikrogramm/ml IIIB-Viruslysat (Organon Teknika Co., Durham, N. A.) beschichtet wurden.
Neutralisationsassays. Neutralisationsassays wurden mit Labor- oder primären Isolaten durchgeführt [Montefiori et al., J. Clin. Microbiol. 26: 231–237 (1988); Montefiori et al., Journal of Infectious diseases 173: 60–67 (1996)]. Laborisolate: das Virus wurde mit jeder Serumprobe in einer Verdünnung von 1 : 20 gemischt und auf MT-2 oder CEM-x174-Zellen ausgestrichen. Zur Bewertung der Lebensfähigkeit der Zellen wurde Neutralrotfarbstoff verwendet. Eine Verringerung um 35–40% des Zelltods im Vergleich zu Kontrollkulturen wurde als positive Abweichung definiert. Primäre Isolate: das Virus wurde mit jeder Serumprobe in einer Verdünnung von 1 : 4 gemischt und auf PHA-stimuliertem PBMC ausgestrichen. Die Assays wurden bezüglich p24 bewertet. Eine Verringerung der Infektiosität von mindestens 75% im Vergleich zu Kontrollkulturen war für eine positive Bewertung erforderlich.
Ergebnisse
Herstellung neuer VVenv-rekombinante Vaccinia Viren. Zur Herstellung neuer VV-Rekombinanten (VVenv), die jeweils ein einmalig vorhandenes HIV-1-Env-Protein exprimieren, wurde die DNA zuerst aus HIV-1-Proben isoliert. Die meisten DNAs stammten aus dem Blut von Individuen, die keine äußeren Zeichen einer Krankheit zeigten und für die eine erste Diagnose einer HIV-1-Infektion wahrscheinlich war. Zusätzliche DNAs stammten aus AIDS-Patienten oder von Viren, die von der AIDS-Forschung und dem Referenzreagenzdepot zur Verfügung gestellt wurden. Eine PCR wurde mit Primerpaaren durchgeführt, die KpnI- und BsmI-Restriktionsstellen umfassten. Dann wurden Fragmente in den pVenv4-Vektor, der in 5 dargestellt ist, an den KpnI- und BsmI-Restriktionsstellen substituiert (pVenv4 exprimierte ursprünglich ein abgeschnittenes HIV-1-Protein, BH10). Auf diese Art wurden gp120 (V1–V5)- und gp41-Sequenzen von BH10 durch die entsprechenden Sequenzen in den PCR-Produkten ersetzt. Mit jedem substituierten Plasmid wurde ein neues VV-rekombinantes Virus (VVenv) hergestellt.
Dieses Verfahren stellt ein einfaches Mittel zur Verfügung, durch das eine große Verschiedenartigkeit von Env-Sequenzen in einmalig vorhandene VV-Rekombinante (VVenv) eingebaut werden könnten. Interessanterweise war die Mehrheit der Sequenzen leistungsfähig, was darauf schließen lässt, dass Env-Sequenzen in proviralen Genomen (von denen die meisten PCR-Produkte stammen) kaum schadhaft waren. Unter den in der Impfstoffmischung verwendeten VVenv besteht eine enorme Verschiedenartigkeit.
Immunisierung von Schimpansen mit einzelnem oder gemischtem VVenv. Zum Testen von einzelnen oder gemischten VV-rekombinanten Impfstoffen wurden vier Schimpansen verwendet. Das Programm für die Immunisierungen ist in Tabelle 2 gezeigt. Die ersten drei Injektionen enthielten VV, während die letzte Injektion eine Kombination aus gp120, gp41 und Alaun enthielt, die intramuskulär verabreicht wurden. Die Schimpansen 1 und 2 erhielten nur ein Impfstoffvirus und entsprechendes Hüllprotein, die in jeder der ersten drei Injektionen verabreicht wurden. Die Schimpansen 3 und 4 erhielten eine Mischung aus 10 rekombinanten VV (und entsprechendes Env in der ersten Injektion), zehn zusätzliche Env in der zweiten Injektion und 10 zusätzliche einmalig vorhandene Env in der letzten Immunisierung, was insgesamt 30 verschiedene Vektoren vor der Proteinverstärkung ergab. Alle Schimpansen erhielten ähnliche Mengen an gesamtem Vaccinia Virus in Plaque-bildenden Einheiten und ähnliche Mengen an gesamten rekombinanten Proteinen.
TABELLE 2 Immunisierungsprogramm für Schimpansen mit gemischten VV- Rekombinanten
Rekombinantes VVenv kann ohne Hervortreten einer Wunde verabreicht werden. Alle vier Schimpansen wurden bezüglich Zeichen einer systemischen Krankheit und Wundbildung an der Stelle der Infektion überwacht.
Die Tiere wurden auf Tagesbasis bezüglich Durchfall, Nasenausfluss, Husten, Niesen, schneller Atmung, Lethargie, eingeschränkter Bewegung und Appetitverlust analysiert. Zu keiner Zeit war in einem Tier eines dieser Zeichen offensichtlich. Photographien, die von der Injektionsstelle in regelmäßigen Intervallen nach der ersten VV-Immunisierung stammten, zeigten eine in allen vier Tieren offensichtliche Schwellung. Geringe Wunden erschienen an den Injektionsstellen bei den Schimpansen 1 und 3, die typisch für eine Pockenimpfung sind, während bei den Schimpansen 2 und 4 keine Wunden offensichtlich waren. Bei keinem Tier waren Krankheitssymptome, Schwellung oder Wunden bei den zweiten, dritten oder vierten Injektionen offensicht lich, was zeigte, dass durch die erste Impfung eine VV-spezifische Immunität hervorgerufen worden war.
Injektionen von VVenv mit anschließenden Proteinimmunisierungen zur Verstärkung ergaben einen ELISA positiven Antikörper. HIV-spezifische Antikörper wurden während des Immunisierungsschemas anhand fünf verschiedener ELISAs überwacht. Die ELISAs wurden eher zum Messen der relativen Qualität als der absoluten Menge von Antikörpern in jedem Tier verwendet. In den meisten Fällen wurden die Tests mit Virusfragmenten, denen die für natives Env typische dreidimensionale und oligomere Struktur fehlte, durchgeführt. In diesen Fällen wäre zu erwarten, dass ELISAs nur an einen Untersatz von HIV-spezifischen Antikörpern binden. Die mit dem Abbott-ELISA erhaltenen Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Der Schimpanse 3 überschritt den Grenzwert für eine positive Bewertung nach der ersten VV-Immunisierung, während der Schimpanse 4 den Grenzwert nach der zweiten VVenv-Immunisierung überschritt. Die Antworten der Schimpansen 3 und 4 am Ende des Immunisierungsschemas überschritten bei weitem diejenigen der Schimpansen 1 und 2. In dem ELISA #2 mit MN gp160 zeigte der Schimpanse 3 als einziger eine hohe Antwort. Diese Antwort trat vor der Proteinverstärkung auf und wurde nicht durch die Injektion zur Verstärkung gestört. Die Antwort gegen CHO-LAI, das an eine ELISA (ELISA #3)-Platte unter Verwendung desselben Antigens, wie dasjenige, dass für die Verstärkung mit gereinigtem Protein verwendet wurde, gebunden wurde, zeigte nur beim Schimpansen 3 eine starke Antwort. In dem ELISA #4 mit dem an die Platte gebundenem IIIB-gp120 zeigte der Schimpanse 2 einen hohen Hintergrund und, vielleicht aufgrund des hohen Hintergrunds, den höchsten Antwortwert von allen Tieren. Die Antworten in dem fünften ELISA; Organon Technika IIIB-Viruslysat, waren mit den Seren von allen vier Tieren positiv.
Neutralisationsantworten gegen primäre und Laborisolate. Neutralisationsassay wurden mit Seren von jedem Tier gegen Labor- und primäre Isolate durchgeführt. Der erste Assay wurde auf einer T-Zelllinie durchgeführt, während der letzte Assay auf seronegativem PHA-stimulierten PBMC durchgeführt wurde. In allen Fällen stimmten die Isolate nicht mit denjenigen überein, die in den HIV-1-Impfstoffen repräsentiert waren.
Wie in Tabelle 3 gezeigt wurde, ergaben die Proben von Schimpanse 2, Schimpanse 3 und Schimpanse 4 eine positive Abweichung (Hemmung der Virusvermehrung um 35–40%) gegen das MN-Laborisolat in T-Zellen. Assays mit zwei anderen Laborviren (ein IIIB [Lockey et al., Aids Res. Hum. Retroviruses 12: 1297–1299 (1996)] und ein SF2-Stamm) ergaben mit keiner Probe eine positive Bewertung. Die Ergebnisse von Neutralisationsassays [Montefiori et al., 1988, s. u.; Montefiori et al., 1996, s. u.] mit vier primären Isolaten, die auf PHA-stimuliertem PBMC getestet wurden, werden gezeigt. Es wird angenommen, dass das Virus in diesen Assays nur schwer zu neutralisieren ist, da Patientenseren häufig negative Ergebnisse ergeben, selbst wenn Verdünnungen mit 1 : 2 verwendet werden [Fenyo et al., AIDS 10: S97–S106 (1996); Moore und Ho, AIDS 9: S117–S136 (1995); Montefiori et al., 1996, s. u.]. Interessanterweise war eine Verdünnung des Serums von 1 : 4 des Schimpansen 4 in der Lage, eines der primären Testisolate zu neutralisieren. Die Situation unterschied sich von den Erfahrungen von anderen mit Env-Impfstoffen, da in den meisten früheren Fällen Seren von Env-immunisierten Individuen in primären Neutralisationsassays negative Ergebnisse ergaben [Steele, Journal of NIH research 6: 40–42 (1994); Moore, Nature 376: 115 (1995)].
TABELLE 3 Neutralisation von Viren, die nicht in dem Impfstoff spezifisch repräsentiert sind, durch Schimpansenantiseren
Gemischtes VVenv ruft HIV-1-spezifische Antikörper von höherer Qualität hervor als einzelnes VVenv. Die Ergebnisse der ELISA- und Neutralisationsassay sind in Tabel le 4 zusammengefasst, die diejenigen Schimpansen auflistet, deren Seren die höheren Antworten in den vorstehend beschriebenen sieben Tests ergaben. Wie aus der Tabelle 4 bemerkt werden kann, ergaben die Schimpansen 3 und 4 in einer Zusammensetzung von fünf von sieben Tests eine positive Bewertung, während die Schimpansen 1 und 2 in nur drei von sieben Tests eine positive Bewertung ergaben. Dieses Ergebnis kann im Vergleich zu Impfstoffen mit einzelnem Env eine höhere Qualität der Antikörper spiegeln, die durch Poly-Env hervorgerufen werden.
TABELLE 4 Zusammenfassung von ELISA- und Neutralisationsassay
Diskussion
Die in diesem Beispiel beschriebenen Experimente wurden entworfen, um die Sicherheit eines auf dem Vaccinia Virus basierenden HIV-1-Impfstoffs zu testen und um dessen Wirksamkeit bei der Initiierung mit Hüllcocktails und einzelnen Hüllimpfstoffen zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten zuerst, dass der Vaccinia Virus als Immunogen verwendet werden könnte, ohne eine offene Wunde zu induzieren, und zweitens, dass mit dem Hüllcocktail eine große Breite an HIV-1-spezifischer Aktivität hervorgerufen werden könnte.
Das Schimpansenmodell gestattete uns, die Sicherheit von Poly-Env in Primaten zu untersuchen. Wir waren besonders an der Bestimmung des Ausmaßes einer offenen Wundbildung interessiert, da VV-Impfungen für nicht immunisierte Individuen eine Bedrohung durch den Lebendvirustransfers darstellen könnten. Im Falle von HIV ist dies dahingehend eine ernste Angelegenheit, weil ein AIDS Patient nicht in der Lage sein könnte, die VV-Infektion zu blockieren. Um auf dieses Problem einzugehen, testeten wir die Verwendung subkutaner Impfungen in Schimpansen, wobei wir uns fragten, ob eine offene Wunde vermieden werden könnte. Tatsächlich zeigten nur zwei der vier Schimpansen offene Wunden. Ähnliche Ergebnisse wurde beobachtet, wenn subkutane Impfungen des NYCDH-Vaccinia Virusstamms in klinischen Erprobungen des Pockenimpfstoffs verwendet wurden [Connor et al., Journal of Infectious diseases 135: 167–175 (1977); Benenson et al., Journal of Infectious diseases 135: 135–144 (1977)].
Es ist wahrscheinlich, dass mit zusätzlicher Aufmerksamkeit bei dem Injektionsverfahren und dem sorgfältigen Nachbehandeln der Injektionsstelle in allen Fällen offene Wunden vermieden werden könnten. Diese Ergebnisse zeigen, dass Sicherheitsaspekte nicht die Verwendung von Vaccinia Virus als ein HIV-1-Impfstoffvektor ausschießen.
Die Hüllcocktails sind in Mäuse- (Beispiel 2) und Kaninchenexperimenten getestet worden. Bei den Mäuseexperimenten wurden Anit-HIV-Antikörper nach einer einzelnen Injektion von VVenv überwacht, während in Kaninchen VVenv zur Verstärkung der Antworten verwendet wurden, die basierend auf DNA hervorgerufen wurden. Experimente wiesen darauf hin, dass HIV-1-spezifische Antikörper mit VVenv hervorgerufen und verstärkt werden konnten, und, dass primäre Isolate durch die Antikörperantwort neutralisiert werden konnten. Zur Untersuchung des Potentials von gemischtem VVenv (Poly-Env) wurden Schimpansen in zwei Gruppen eingeteilt. Die ersten zwei Schimpansen erhielten nur ein VVenv, während die Schimpansen 3 und 4 Cocktails erhielten, die aus insgesamt dreißig verschiedenen VVenv zusammengesetzt waren.
Nach dem Erhalten der Vaccinia Virus-Immunisierungen wurde allen vier Schimpansen eine Verstärkung mit einer einzelnen gp120/gp41-Proteinmischung in Alaun verabreicht. Die Seren von jedem der vier Schimpansen wurden in fünf unterschiedlichen ELISAs getestet, wobei jeder ein unterschiedliches Env-Fragment und/oder Env-Konfiguration verwendete. Interessanterweise wies das von den Schimpansen 1 und 2 gemischte Serum eine starke Antwort in nur einem dieser ELISAs auf, wohingegen das von den Schimpansen 3 und 4 gemischte Serum in 4 derartigen Assays eine starke Antwort aufwies. Da jeder Assay nur eine Fraktion des HIV-1-spezifischen Antikörpers in jedem Tier maß, reflektieren die Ergebnisse wahrscheinlich die hervorragende Breite an Antikörperbindungsaktivitäten, die durch den gemischten Impfstoff hervorgerufen wurden.
Neutralisationsassays wurden ebenfalls sowohl gegen Labor- als auch primäre Isolate durchgeführt. Interessanterweise wurde eine positive Reaktion gegen ein primäres Isolat beim Schimpansen 4 bemerkt, selbst, wenn das primäre Isolat nicht spezifisch in der Impfstoffmischung repräsentiert gewesen ist. Wiederum zeigten diese Ergebnisse eine große Breite an Antikörpern, die durch den Poly-Env-Impfstoffcocktail hervorgerufen wurden. Es kann erwartet werden, dass eine Zunahme in der Komplexität des Antigens eines Impfstoffs zu einer erhöhten Verschiedenartigkeit von Lymphozyt- und entsprechenden Antikörperantworten führt.
Der Nachweis, dass neutralisierende Antikörper gegen ein primäres Isolat, das in dem Impfstoff nicht repräsentiert ist, hervorgerufen werden können, zeigt, dass linear verschiedene Proteine Konformationsstrukturen gemeinsam haben. Diese Idee wird ebenfalls durch die Immunantworten der HIV-1-infizierten Patienten darin gezeigt, dass beliebige zwei Individuen, die einer Unzahl von sich gegenseitig ausschließenden Viren ausgesetzt sind, im allgemeinen vor einer Superinfektion bei auftretender kreuzweiser Aussetzung geschützt sind. Die Verwendung von Poly-Env stellt einen ersten Versuch dar, in einem Schimpansensystem die Situation in HIV-1-Patienten nachzuahmen. Das heißt, neutralisierende Antikörper werden vielmehr mit einem großen Bereich als einem einzelnen Env-Protein hervorgerufen.
Zusammengefasst haben wir einen auf VV basierenden HIV-1-Impfstoffcocktail, der Poly-Env genannt wurde, in einem Schimpansenmodell getestet. Dieses Beispiel zeigte:

1) VV konnte als ein Impfstoff verwendet werden, ohne eine offene Hautwunde auszulösen;
2) eine große Breite an HIV-1-spezifischen Antikörperaktivitäten konnte mit diesem Impfstoff hervorgerufen werden und
3) ein Cocktail an Env-Konstrukten (Poly-Env) ergab HIV-spezifische Antikörper, deren Qualität im Vergleich zu einem einzelnen Env-Konstrukt überlegen war.

Von dem Vaccinia Virus ist schon lange bekannt, dass er sowohl in Wildtypform als auch in rekombinanter Form ein wirksamer Impfstoff ist. Die Stärke von VV liegt in dessen Vermögen, sowohl die B- als auch die zytotoxischen T-Lymphozytenkompartimente der Immunantwort zu rekrutieren. VV umfasste den einzigen Impfstoff, der in der Lage ist, eine Krankheit (Pocken) aus der menschlichen Bevölkerung auszurotten. Die Daten in diesem Beispiel weisen darauf hin, dass rekombinante VV-Vektoren zu der zukünftigen Kontrolle von HIV-1 beitragen werden.
BEISPIEL 4: Herstellung eines bifunktionellen Plasmids
Es wurde gezeigt, dass DNA-Impfstoffe starke Antikörper- und CTL-Antworten in mehreren unterschiedlichen Systemen (Influenza, HIV-1, usw.) hervorrufen. Auf DNA basierende Influenza- und HIV-1-Impfstoffe sind schon in klinischen Erprobungen mit gesunden freiwilligen Erwachsenen. Das Vaccinia Virus dient ebenfalls als starke Ausgangsbasis für Impfungsprogramme. Tatsächlich war das Vaccinia Virus der einzige Impfstoff, der in der Lage ist, eine Krankheit (Pocken) aus der menschlichen Bevölkerung auszurotten. Zahlreiche rekombinante Vaccinia Viren haben schützende Immunantworten hervorgerufen, wie in Tieruntersuchungen gezeigt wurde. Die vorstehend gezeigten Daten zeigen die Wirksamkeit eines Poly-Env-Impfstoffs und des Kombinierens von Impfungsstrategien, zum Beispiel von DNA-Impfstoffen und viralen Impfstoffen.
Ein bifunktionelles Plasmid, das sowohl als ein DNA-Impfstoff als auch ein VV-rekombinanter Vektor wirken kann, wird konstruiert. 7 zeigt eine Karte dieses Plasmids, das einen CMV-Promotor zur Expression in Säugetierzellen und frühe und späte Vaccinia-Promotoren zur Herstellung von rekombinantem Vaccinia umfasst. Die direkte Injektion der gereinigten Plasmid-DNA würde zum Hervorrufen von Immunantworten gegen ein HIV-Env-Protein in Versuchspersonen verwendet werden. Das Plasmid würde ebenfalls zur Herstellung und zum Testen von lebenden rekombinanten Vaccinia Viren, wie HIV-Env-Protein-Immunisierungsvehikel verwendet werden.
Versuchspersonen könnten möglicherweise mit einer vielschichtigen Therapie geimpft werden, die sowohl aus DNA-Impfungen als auch aus rekombinanter Vaccinia Virus-Immunisierung(en) besteht, die in beliebiger Reihenfolge, in einzelnen oder mehrfachen Injektionen und/oder in Verbindung mit zusätzlichen Impfstoffvehikeln verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung ist im Umfang nicht durch die hierein beschriebenen spezifischen Ausführungsformen beschränkt. Tatsächlich werden dem Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung und den begleitenden Figuren verschiedene Modifikationen der Erfindung, zusätzlich zu den hierin beschriebenen, ersichtlich. Derartige Modifikationen sollen innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche fallen. Weiterhin versteht es sich von selbst, dass alle Basengrößen oder Aminosäuregrößen und alle Molekulargewichtswerte oder Molekülmassenwerte, die für Nukleinsäuren oder Polypeptide angegeben sind, Näherungen sind und, dass sie für eine Beschreibung bereitgestellt worden sind.
Hierin sind verschiedene Veröffentlichungen zitiert, auf deren Offenbarungsgehalte vollumfänglich Bezug genommen wird.
Verweisliste

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Poly-Env-Impfstoff, der mindestens 4 bis etwa 10.000 verschiedene rekombinante Viren umfaßt, wobei jedes eine Env-Variante (EV)-Nukleinsäure umfaßt, die eine unterschiedliche Hüllprotein-Variante des Hüllproteins des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) kodiert, wobei a) die EV-Nukleinsäure sowohl variable als auch konstante Regionen der Hüllprotein-Variante kodiert, b) der Poly-Env-Impfstoff befähigt ist, mindestens eine der zellulären und humoralen Immunantwort in einem Säuger gegen einen HIV-Stamm hervorzurufen, und c) der Poly-Env-Impfstoff befähigt ist, eine Immunantwort gegen einen HIV-Stamm, für welchen nicht Hüllproteine in dem Poly-Env-Impfstoff enthalten sind, hervorzurufen.
Poly-Env-Impfstoff nach Anspruch 1, der 10 bis 100, verschiedene Env-Varianten von HIV umfassende rekombinante Viren umfaßt.
Poly-Env-Impfstoff nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die rekombinanten Viren Vaccinia, Kanarienpockenvirus, Adenovirus oder Adenoassoziiertes Virus (AAV) sind.
Poly-Env-Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Hüllprotein-Variante gp 120 und einen Teil von gp 41, der zum Ermöglichen einer Oligomerisierung der Env-Proteine ausreicht, umfaßt.
Poly-Env-Impfstoff nach Anspruch 4, wobei die EV-Nukleinsäure ein KpnI-BsmI-Restriktionsfragment einer Nukleotidsequenz, die ein HIV-Hüllprotein kodiert, umfaßt.
Poly-Env-Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die EV-Nukleinsäure von Patienten, die mit einem HIV-Virus aus einem geographisch begrenzten Gebiet infiziert sind, oder von Patienten, die mit einem HIV-Virus aus verschiedenen Kladen infiziert sind, isoliert wurde.
Poly-Env-Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Poly-Env-Impfstoff Hüllprotein-Varianten, die von dem rekombinanten Virus exprimiert werden, umfaßt.
Poly-Env-Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Poly-Env-Impfstoff weiter mindestens eines aus einem pharmazeutisch verträglichen Träger, einem Hilfsmittel oder einer antiviralen chemotherapeutischen Verbindung umfaßt.
Poly-Env-Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung für das Hervorrufen einer humoralen oder zellulären Immunantwort oder beidem gegen ein humanes Immundefizienz-Virus.
Poly-Env-Impfstoff nach Anspruch 8, wobei das rekombinante Virus ein Vaccinia Virus ist und wobei der Poly-Env-Impfstoff für eine subkutane Verabreichung geeignet ist.
Verfahren zum Herstellen eines in einem der Ansprüche 1 bis 8 definierten Poly-Env-Impfstoffs, welches das Kombinieren von mindestens 4 bis etwa 10.000 verschiedenen rekombinanten Viren in einer Beimengung zum Erhalten des Poly-Env-Impfstoffs und gegebenenfalls das Hinzufügen von mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger, einem Hilfsmittel oder einer antiviralen chemotherapeutischen Verbindung umfaßt.
Ein erster Poly-Env-Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und ein weiterer Poly-Env-Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die rekombinanten Viren des weiteren Poly-Env-Impfstoffs einer anderen Art angehören als die rekombinanten Viren des ersten Poly-Env-Impfstoffs, und wobei der erste und der weitere Poly-Env-Impfstoff für die Verabreichung an einen Säuger geeignet sind.
Poly-Env-Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 8, welcher weiter (a) mindestens ein rekombinantes HIV Env-Protein oder (b) eine wirksame Menge von mindestens einem DNA-Vektor, der ein rekombinantes HIV Env-Protein nach der Expression kodiert, oder (c) sowohl mindestens ein rekombinantes HIV Env-Protein als auch eine wirksame Menge von mindestens einem DNA-Vektor, der ein rekombinantes HIV Env-Protein nach der Expression kodiert, für das Erzeugen, Initiieren oder Verstärken einer humoralen oder zellulären Immunantwort oder beidem umfaßt, wobei der Poly-Env-Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das rekombinante HIV Env-Protein und/oder der DNA-Vektor, der ein rekombinantes HIV Env-Protein nach der Expression kodiert, in jeder Reihenfolge verabreicht werden können.
Poly-Env-Impfstoff nach Anspruch 13, wobei der DNA-Vektor für das Verabreichen durch eine Genkanone angepaßt ist.
Poly-Env-Impfstoff nach Anspruch 13, wobei das rekombinante HIV Env-Protein in einer Beimengung mit einem Hilfsmittel vorliegt oder an eine intramuskuläre Verabreichung angepaßt ist oder beides.
Poly-Env-Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die rekombinanten Viren bifunktionelle Plasmide sind, die als ein DNA-Impfstoff und als ein rekombinanter Virus-Vektor dienen, wobei sie sowohl eine Expressionskontrollsequenz vom Tier als auch eine virale Expressionskontrollsequenz umfassen.
Poly-Env-Impfstoff nach Anspruch 16, wobei die Expressionskontrollsequenz vom Tier ein unmittelbar früher Cytomegalovirus (CMV)-Promotor und die virale Expressionskontrollsequenz ein früher Vaccinia Virus-Promotor oder ein später Vaccinia Virus-Promotor oder beides ist.
Poly-Env-Impfstoff nach Anspruch 16, der ein heterologes Gen umfaßt, wobei das heterologe Gen eine Env-Variante (EV)-Nukleinsäure ist, die sowohl variable als auch konstante Bereiche einer Hüllprotein-Variante eines HIV-Hüllproteins kodiert.