DE69129989T2

DE69129989T2 - Arzneimittelzusammensetzung zur behandlung oder vorbeugung maligner tumore

Info

Publication number: DE69129989T2
Application number: DE69129989T
Authority: DE
Inventors: Pierre F-67113 Blaesheim Chambon; Mara 47 279 Ramat-Ha-Sharon Hareuveni; Marie-Paule F-67000 Strasbourg Kieny; Richard Leeds Ls8 Lathe
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1990-10-23
Filing date: 1991-10-23
Publication date: 1999-04-08
Anticipated expiration: 2011-10-24
Also published as: JPH06502399A; EP0554344B1; JP3195958B2; HK1012841A1; CA2094705A1; US5861381A; FR2668064B1; US6328956B1; SG96535A1; US6203795B1; ES2121791T3; EP0554344A1; DE69129989D1; WO1992007000A1; ATE169640T1; FR2668064A1; CA2094705C; DK0554344T3

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zur kurativen Behandlung oder zur Prävention eines malignen Tumors bestimmt ist, genauer gesagt eines Karzinoms, ganz genau von Brustkrebs.
Die meisten Tumorzellen exprimieren an ihrer Oberfläche Antigene, die sich enteder qualitativ oder quantitativ von Antigenen unterscheiden, die an der Oberfläche entsprechender normaler Zellen vorhanden sind. Diese Antigene sind spezifisch, wenn sie ausschließlich durch die Tumorzellen exprimiert werden. Wenn sie gleichzeitig auf normalen und Tumorzellen vorhanden sind, werden diese Antigene als mit dem Tumor assoziiert bezeichnet; in diesem Fall sind sie entweder in größerer Menge oder in verschiedener Form in den Tumorzellen anwesend.
Die große Mehrheit der Tumor-Antigene, die bisher beim Menschen charakterisiert wurden, sind mit einem Tumor assoziierte menschliche Antigene (im folgenden assoziierte Antigene genannt). Unter diesen unterscheidet man:
- die onkofetalen Antigene, wie das karzino-embryonale Antigen, die in fetalen Geweben vorhanden sind und in entsprechenden adulten Geweben abwesend oder nur in Spuren vorhanden sind ihre Expression wird neuerlich in entarteter Form während der Entwicklung eines Tumors induziert;
- die Differenzierungs-Antigene, die normalerweise nicht exprimiert werden, außer während bestimmter Etappen der Reifung eines bestimmten Zelltyps; die Tumorzellen, die ein solches Antigen exprimieren, weisen als Ursprung eine in ihrer Differenzierung blockierte Zelle auf;
- die Produkte der Onkogene, deren Identifikation beginnt.
Die Spezifität eines mit einem Tumor assoziierten Antigens ist daher eher quanitativ als qualitativ, da der Tumor bei einem normalen Individuum in lokalisierter oder intermittierender Weise (feto-embryonale Periode) oder in Spuren vorhanden sein kann und nicht hyperexprimiert werden muß (um einen Faktor 10 bis 1000 erhöhte Expression), außer während des Prozesses der Tumorgenese. Während das Antigen normal exprimiert wird, wird es durch das Immunsystem als Partie des "Selbst" erkannt, während seine Hyperexpression oder seine entartete Expression eine humorale oder zelluläre Immunantwort auslösen kann.
In allgemeiner Weise existieren zwei große Typen der Immunantwort; die Antwort vom humoralen Typ, die durch die Produktion von Antikörpern durch die B-Lymphozyten charakterisiert ist, und die zellulär vermittelte Immunantwort, die die Effektorzellen ins Spiel bringt, d. h. im wesentlichen die Makrophagen und die cytotoxischen T-Lymphocyten genauso wie die die Immunantwort regulierenden Zellen, d. h. die Helfer-T- Lymphocyten und Supressoren.
Eine zellvermittelte Immunantwort erfordert die Kooperation von Helfer-T-Lymphocyten und Effektorzellen. Diese Kooperation findet insbesondere dank Interleukin-2 und weiteren verschiedenen Lymphokinen statt, die von aktivierten Helfer-T- Lymphocyten sezerniert werden. Anschließend induziert Interleukin-2 die Wirkung der cytotoxischen T-Lymphocyten, und die Lymphokine lösen die Antwort der Phagocytose der Makrophargen aus. Parallel existiert genauso ein zellvermittelter Suppressor-Mechanismus der Immunantwort, der die Suppressor-T-Lymphocyten aktiviert.
Es ist mittlerweile gut bekannt, daß von Krebs befallene Patienten eine humorale und zellvermittelte Immunantwort entwickeln können. Dies wurde insbesondere dadurch bewiesen, daß gezeigt wurde, daß das Serum bestimmter Patienten Anti-Antigen- Tumor-Antikörper enthielt und daß ihr Serum zur Inhibierung des Wachstums von Krebszellen in vitro in der Lage war. Dennoch scheint in dem Maße, wie die spontanen Tumorregressionen extrem selten sind, daß die Immunantwort, die man in vitro beobachtet, in vivo unwirksam bleibt. Im selben Ideenrahmen ist es auch bekannt, daß Tumorimplantate nicht häufig abgestoßen werden, sogar bei immunen Tieren, während die Allo-Implantate stets abgestoßen werden.
Obwohl sich eine Immunantwort bei der Entstehung eines Tumors entwickeln kann, ist es zweifelhaft, ob dies einen tatsächlichen Vorteil für den Kranken bedeutet. Alles scheint darauf hinzuweisen, daß ein Tumor dem immunitären Überwachungsmechanismus des Organismus entkommt. Es wurden verschiedene Modelle zur Erklärung dieses Phänomens vorgeschlagen; für einen vollständigen und detaillierten Überblick siehe Scientific American, Medizin, Kapitel 6, VIII Tumor Immunology, 1990. Im Prinzip spielen die Tumor-Antigene eine nicht vernachlässigbare Rolle bei der Modifikation oder Abänderung der Immunantwort zugunsten des Tumors viel eher als zugunsten des Individuums.
Unter Berücksichtigung der Komplexität der Immunantwort beim Auftreten von Tumoren und der mittelmäßigen aktuellen Kenntnisse auf diesem Gebiet ist die Entwicklung eines Anti- Krebs-Impfstoffes in keiner Weise offensichtlich. Studien bei Tieren haben gezeigt, daß die Immunisierung mit Hilfe von lebenden oder toten Krebszellen zu einer nachträglichen Abstoßung eines Tumorimplantats führen könnten. Versuche zur Immunisierung mit Hilfe von azellulären Produkten waren im allgemeinen weniger erfolgreich.
Bis heute ist die Möglichkeit zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Krebs unter Verwendung eines mit diesem Krebs assoziierten Antigens umstritten. Eine hauptsächliche theoretische Beanstandung dieses Behandlungsmodes liegt darin, daß die Immunantwort nicht ausreichend sei, um einen Tumor zu verhindern oder zu heilen, und daß es sehr zweifelhaft ist, ob ein Impfstoff eine Schutzwirkung haben könne, d. h. zur Verhinderung oder Verlangsamung der Entwicklung eines Tumors fähig wäre.
Dennoch wurde jetzt gefunden, daß ein assoziiertes Tumor- Antigen, unter anderem bei Brustkrebs, imn Impfstoff- oder therapeutischer Form eine Immunantwort induzieren kann, die gegen eine nachträgliche Tumorattacke oder eine solche im Verlauf der Entwicklung schützt. Es handelt sich genauer gesagt um das Antigen, das vom monoklonalen Antikörper H23 erkannt wird, der aus dem Hybridom ATCC Nr. HB 8630 stammt, das bezüglich der Patentanmeldung EPA 174 534 hinterlegt wurde und für experimentelle Forschungsarbeiten öffentlich verfügbar ist. Der Antikörper H²³ ist andererseits kommerziell erhältlich bei Teva Pharmaceutical Industries Ltd., 5 Basel Street, Petah Tiqva, Postfach 1424, Tel-Aviv, Israel.
Der Antikörper H²³ wurde gegen partikelförmiges Material erzeugt, das in Überstand in vitro-Kulturen der Tumor-Mammazell- Linie T47Dvorhanden ist. In der Folge wurde gezeigt, daß der Antikörper H23 glatt mit einer großen Mehrheit von Biopsien von Mamma-Tumoren genauso wie mit dem Serum und weiteren physiologischen Flüssigkeiten von Patienten reagierte, die Brustkrebs aufwiesen. Im Gegensatz dazu weist der Antikörper H23 das Antigen nicht oder nur in Spuren im Fall von gesunden Individuen nach.
Das vom Antikörper H23 erkannte Tumor-Antigen wird daher in entarteter Weise durch Epithelial-Zellen des Krebs-Mamma-Gewebes in ungefähr 90% der Brustkrebsfälle exprimiert, während beim normalen Individuum seine Expression sehr schwach, wenn nicht 0 ist. Seine Anwesenheit in signifikanter Menge wurde auch in Tumor-Epithel-Geweben von anderen als Mamma-Epithel-Geweben nachgewiesen.
Polypeptide, die vom Antikörper H&sub2;&sub3; erkannt werden können, wurden bereits im Stand der Technik beschrieben.
In der Tat beschreibt WO-A-8805054 ein Polypeptid, das von einem Antikörper erkannt wird, welcher gegen den zentralen Teil eines Mucins gerichtet ist, das von menschlichen Mamma-Epithel- Zellen synthetisiert wird, EP-A-0 369 8I6 beschreibt ein Peptid, das von Antikörpern erkannt wird, die gegen ein humanes Mucin gerichtet sind, und WO-A-9005142 beschreibt Polypeptide, die die Sequenz Pro-Asp-Thr-Arg-Pro umfassen, und direkt einem Menschen oder einem Tier zum Zweck der Immunisierung gegen die zentrale Partie eines Mucins geimpft werden können.
Die zuvor beschriebenen Sequenzen unterscheiden sich jedoch alle von der des Polypeptids, das in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird.
In der Tat existiert bei demselben Patienten das vom Antikörper H23 erkannte Tumor-Antigen in zwei Formen: einer transmembranären Form und einer sezernierten Form, deren Aminosäure-Sequenzen jeweils in den Sequenzprotokollen (IS) Nr. 1 und 2 dargestellt sind. Die transmembranäre Form und die sezernierte Form zeigen beide einen hohen Grad an Polymorphismus. Tatsächlich umfaßt die Sequenz der beiden Formen des Antigens eine bestimmte Untereinheit von 20 Aminosäuren, die in jedem IS vorhanden zu sein scheint und die als Tandem mehrere Male wiederholt werden kann. Die Sequenz dieser Untereinheit hat die Formel (1): Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-X-Ala-His-Gly-Val-Thr- Ser-Ala-Pro-Asp-Y-Arg-Pro-X, wobei X Pro oder Ala ist und Y Thr oder Asn ist. Von einem Individuum zum anderen kann die Anzahl der Tandem-Wiederholungen von ungefähr 25 bis 80 variieren und charakterisiert unter anderem den polymorphen Typ. Schließlich kann von einer Wiederholung zur anderen ein Minimum von Aminosäuren (am häufigsten 1, 2 oder 3 Aminosäuren) modifiziert sein.
Andererseits wurde festgestellt, daß die Untereinheit der zuvor beschriebenen 20 Aminosäuren spezifisch ist für das Tumor- Antigen, das mit dem Antikörper H23 reagiert, da diese Untereinheit das von diesem Antikörper erkannte Epitop umfaßt. Als Konsequenz schlägt die Erfindung eine zur kurativen Behandlung oder zur Prävention eines malignen Tumors bestimmte pharmazeutische Zusammensetzung vor, die als therapeutisches Mittel ein vom Antikörper H23 erkanntes Polypeptid in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünner oder Träger umfaßt, wobei das vom Antikörper H23 erkannte Polypeptid eine nmal wiederholte Sequenz der Formel (I) umfaßt: Pro-Gly-Ser-Thr- Ala-Pro-X&sub1;-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Y-Arg-Pro-X&sub2;, wobei X&sub1; und X&sub2; unabhängig voneinander Pro oder Ala sind und Y Thr oder Asn ist, mit Ausnahme der Sequenz, in der X&sub1;, X&sub2; und Y jeweils Pro, Ala und Thr darstellen, wobei das Polypeptid eine vollständige Sequenz aufweist, die einen Grad an Homologie von mindestens 80% mit (i) der in IS Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Leucin-Rest in Position 414 + (20 · n) endet oder (ii) der in IS Nr. 2 dargestellten Sequenz, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Prolin-Rest in Position 246 + (20 · n) endet; die Zahl n unter Bezug auf die Sequenz der Formel (1) des Polypeptids einerseits und unter Bezug auf die in IS Nr. 1 oder 2 andererseits gezeigte Sequenz ist in abhängiger Weise eine Zahl von 1 bis 20, bevorzugt ist n 2, 3 oder 4.
Ein bevorzugtes vom Antikörper H23 erkanntes Polypeptid hat eine vollständige Sequenz, die einen Grad an Homologle von mindestens 90%, besonders bevorzugt 95 bis 100% einschließlich mit (i) der in IS Nr. 1 dargestellten Sequenz oder (ii) der in IS Nr. 2 dargestellten Sequenz aufweist, wobei diese Sequenzen vorstehend definiert sind.
Genauso hat die Erfindung ebenfalls zum Gegenstand:
- die Verwendung (i) eines vom Antikörper H23 erkannten Polypeptids oder in alternativer Weise die Verwendung (ii) eines Virus, in dessen Genom ein DNA-Fragment insertiert ist, das für ein Polypeptid kodiert, welches vom Antikörper H23 erkannt wird, zur Behandlung oder Prävention eines malignen Tumors;
- eine Methode zur kurativen Behandlung oder Prävention eines malignen Tumors, die die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge (i) eines vom Antikörper H23 erkannten Polypeptids oder in alternativer Weise (ii) eines Virus umfaßt, in dessen Genom ein DNA-Fragment insertiert ist, das für das vom Antikörper H23 erkannte Polypeptid kodiert, an ein Subjekt, das eine solche Behandlung benötigt (unter "therapeutisch wirksamer Menge" wird eine ausreichende Menge zur Durchführung einer wirksamen Therapie verstanden).
Ein bevorzugtes vom Antikörper H23 erkanntes Polypeptid ist ein vom Antikörper H23 erkanntes Polypeptid, dessen Sequenz wie in IS Nr. 1 dargestellt ist, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Leucin-Rest in Position 414 + (20 · n) endet oder (ii) die Sequenz wie in IS Nr. 2 dargestellt, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Prolin-Rest in Position 246 + (20 · n) endet; wobei n eine Zahl von 1 bis 80 ist, bevorzugt 2, 3 oder 4.
Genauer gesagt weisen die transmembranären und sezernierten Formen von H23 - ETA gemeinsam eine N-terminale Region von 106 Aminosäuren auf (im folgenden als N-terminale Region bezeichnet) und eine mittlere Region, die der Gesamtheit der wiederholten Untereinheiten entspricht; im Gegensatz dazu unterscheiden sich ihre C-terminalen Enden deutlich. Die Aminosäuren von Position 107 + (20 · n) bis Position 149 + (20 · n) sind für die beiden Formen identisch und unterscheiden sich ausgehend von Position 150 + (20 · n).
Ein bevorzugtes vom Antikörper H23 erkanntes Polypeptid, dessen Sequenz nicht identisch ist mit den in IS Nr. 1 und 2 beschriebenen, ist charakterisiert durch mindestens eine Mutation einer Aminosäure (Punktmutation), die nach dem Zufallsprinzip in den N- oder C-terminalen Regionen verteilt ist. Die Anzahl der gesamten Mutationen muß selbstverständlich das zuvor dargestellte Kriterium des Homologiegrades erfüllen. Unter "Punktmutation" versteht man die Deletion oder Substitution einer Aminosäure der in IS Nr. 1 oder 2 beschriebenen N- oder C-terminalen Region genauso wie die Hinzufügung einer Aminosäure in der in IS Nr. 1 oder 2 beschriebenen N- oder C-terminalen Region.
Tn allgemeiner Weise kann ein vom Antikörper H23 erkanntes Polypeptid durch übliche Methoden der chemischen Synthese hergestellt werden oder, wenn die Aminosäure-Sequenz eine große Anzahl Reste umfaßt, durch DNA-Rekombinations-Techniken. Genauer gesagt umfaßt ein Herstellungsverfahren die Kultivierung eines Wirts-Mikroorganismus, der durch ein DNA-Fragment transformiert wurde, welches für ein vom Antikörper H23 erkanntes Polypeptid kodiert, und die Isolierung des Polypeptids aus der Kultur. Der Wirts-Organismus kann jeder beliebige Mikroorganismus sein, der transformiert werden kann, beispielsweise und ohne Beschränkung ein Bakterium, eine Hefe oder eine Säugerzelle, in dem Maß, indem das betrachtete DNA-Fragment entweder in das Genom des Wirts-Organismus integriert wird oder in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert wird, d. h., der sich im Wirts- Organismus replizieren kann. Selbstverständlich befindet sich das für das vom Antikörper H23 erkannte Polypeptid kodierende DNA-Fragment unter Kontrolle von Regionen, die geeignete Transkriptions- und Translations-Signale umfassen.
Expressionsvektoren und Kontrollregionen sind dem Fachmann bekannt.
Im letzten Jahrzehnt wurde die Verwendung von rekombinanten Viren vorgeschlagen als Mittel, die eine Immunantwort bei der Begegnung mit verschiedenen pathogenen Organismen auslösen sollen. Zu diesem Zweck sind die Adenoviren oder die Pockenviren besonders geeignet. Für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind die Vogel-Pockenviren, der Kanarien-Pockenvirus oder der Impfstoff-Virus geeignet. Der Impfstoff-Virus zeigt eine Kreuz-Immunreaktion mit dem Pockenvirus und wurde auf Grund dieser Tatsache als Anti-Pocken-Impfstoff seit dem 19ten Jahrhundert verwendet. Zu Beginn der 80er Jahre betrachtete die Weltgesundheits-Organisation die Pocken als von der Erdoberfläche ausradiert und sah es daher als bevorzugt an, die Impfung gegen die Pocken einzustellen. Der Impfstoffvirus ist daher heute zur Herstellung von Impfstoffen verfügbar, die einen Impfstoffvirus umfassen, dessen Genom so modifiziert wurde, daß er heterologe Gene exprimiert, die für spezifische antigenische Determinanten eines Vektororganismus einer anderen Krankheit als Pocken kodieren.
Aus diesem Grund kann das therapeutische Mittel einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in alternativer Weise ein Virus sein, in dessen Genom ein DNA- Fragment insertiert ist, das für ein vom Antikörper H23 erkanntes Polypeptid kodiert.
In diesem Fall umfaßt das Polypeptid in bevorzugter Weise eine n-fach wiederholte Sequenz, wobei n eine Zahl von 1 bis 80 ist; der Formel (I): Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-X&sub1;-Ala-His-Gly-Val- Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Y-Arg-Pro-X&sub2;, wobei X&sub1; und X&sub2; unabhängig voneinander Pro oder Ala sind und Y Thr oder Asn ist.
Noch weiter bevorzugt umfaßt dieses Polypeptid die n-fach wiederholte Sequenz der Formel (I), deren vollständige Sequenz einen Grad an Homologie von mindestens 80% mit (i) der in IS Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Leucin-Rest in Position 414 + (20 · n) endet oder (ii) mit der in IS Nr. 2 dargestellten Sequenz, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Prolin-Rest in Position 246 + (20 · n) endet; wobei die Zahl n unter Bezug auf die Sequenz der Formel (I) des Polypeptids einerseits und relativ zur in IS Nr. 1 oder 2 andererseits gezeigten Sequenz ist in abhängiger Weise eine Zahl von 1 bis 80, bevorzugt ist n 2, 3 oder 4 ist.
Dieses Polypeptid kann auch als Sequenz (i) die in IS Nr. 1 dargestellte Sequenz aufweisen, die mit dem Threonin-Rest in Position beginnt und mit dem Leucin-Rest in Position 414 + (20 · n) endet oder (ii) die in IS Nr. 2 dargestellte Sequenz, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Prolin-Rest in Position 246 + (20 · n) endet; wobei die Zahl n eine Zahl von 1 bis 80 ist und wobei n bevorzugt 2, 3 oder 4 ist.
Diese Typ pharmazeutische Zusammensetzung bietet den Vorteil einer preisgünstigen Herstellung und einer großen Stabilität unter verschiedenen Umweltbedingungen. Insbesondere sind die Konservierungsbedingungen nicht verpflichtend.
Die allgemeinen Bedingungen zur Herstellung eines Virus des Impfstoffs, der zur Exprimierung eines Expressionsblocks eines heterologen Proteins fähig ist, sind im europäischen Patent EP 83 286 beschrieben, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Die Bedingungen sind auf andere als Vektoren geeignete Viren anwendbar in dem Maße, wo sie mindestens eine nicht essentielle genomische Region besitzen, in die ein Expressionsblock insertiert werden kann.
Ein Impfstoffvirus, in dessen Genom ein DNA-Fragment insertiert ist, das für ein vom Antikörper H23 erkanntes Polypeptid kodiert, kann auch als besonderer Expressionsvektor im Hinblick auf die Produktion des Polypeptids in Säugerzell- Kulturen verwendet werden, wie vorstehend angegeben.
Ein vom Antikörper H23 erkanntes Polypeptid oder ein Virus, in dessen Genom ein DNA-Fragment insertiert ist, das für dieses Polypeptid kodiert, zeigt eine Anti-Tumor-Aktivität in vivo im folgenden Test: man behandelt zweimal, mit 10 Tagen Abstand zwischen den beiden Behandlungen, Mäuse der Linie C3H oder Ratten der Linie Fisher im Alter von 4 bis 5 Wochen entweder mit 10 bis 500 mg eines vom Antikörper H&sub2;&sub3; erkannten Polypeptids oder zwischen 10&sup7; und 10&sup8; pfu (Plaquebildenden Einheiten) eines Virus, in dessen Genom ein DNA-Fragment insertiert ist, das für dieses Polypeptid kodiert. Wenn man ein Polypeptid verwendet, erfolgt die Behandlung bevorzugt durch subkutane Injektion. Ein Einritzen des Schwanzes ist im Fall eines Virus bevorzugt. 15 Tage nach der letzten Behandlung injiziiert man subkutan ungefähr 10&sup4; bis 10&sup7; syngenische Tumor-Zellen, die H23-ETA exprimieren, die in vitro kultiviert, mit Trypsin behandelt, gewaschen und in PBS-Puffer (Phosphatgepufferter Kochsalzlösung) in einem Volumen von ungefähr 100 ml resuspendiert wurden. Parallel dazu unterzieht man nicht behandelte Tiere einer identischen Tumor-Attacke. Ungefähr 20 Tage nach der Injektion der Zellen ist die Größe der subkutanen Tumoren bei den mit einem Polypeptid oder einem Virus behandelten Tieren kleiner als bei den nicht behandelten Tieren.
Ein vom Antikörper H23 erkanntes Polypeptid oder ein Virus, in dessen Genom ein DNA-Fragment insertiert ist, das für das Polypeptid kodiert, ist in der Tat nützlich für die Behandlung oder Prävention von Krebs-Zuständen, genauer gesagt eines Tumors vom Karzinom-Typ (von Epithel-Zellen entwickelter Tumor), beispielsweise eines Mamma-Tumors.
Für diese Behandlungen variiert die geeignete Dosis als Funktion von beispielsweise dem verwendeten Polypeptid oder Virus, dem behandelten Individuum, der Verabreichungsart, der Verwendung als Impfstoff oder als Behandlung, der Art und der Schwere des behandelten Tumorzustands. Im allgemeinen werden dagegen Impfresultate, die bei Säugern zufriedenstellen sind, beispielsweise bei Menschen, so angegeben, daß sie mit einem Virus erzielt werden können, in dessen Genom ein DNA-Fragment insertiert ist, das für das Polypeptid kodiert, bei einer einfachen oder ein- oder zweimal wiederholten Dosierung mit ungefähr 1 bis 3 Wochen Abstand von ungefähr 10&sup4; pfu/kg bis ungefähr 10&sup8; pfu/kg des Körpergewichts des Säugers.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann durch jeden üblichen Weg verabreicht werden, insbesondere auf subkutanem Weg, beispielsweise in Form einer Lösung oder injizierbaren Suspension. Als Impfstoff kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung auf die üblicherweise für bereits bekannte Impfstoffe durchgeführten Arten verabreicht werden, beispielsweise als einmalige oder ein- oder mehrfach wiederholte Dosierungen nach einem bestimmten Abstand. Wenn eine erfindungsgemäße Zusammensetzung bei der kurativen Behandlung von Krebs verwendet wird, kann sie häufig während einer Zeitdauer gegeben werden, die zur effizienten Behandlung ausreichend ist. Eine solche Zusammensetzung kann vorteilhafterweise intra-tumoral injiziert werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann nach den üblichen Techniken hergestellt werden. Wenn das therapeutische Mittel ein Impfstoffvirus ist, liegt dieses Virus bevorzugt in abgeschwächter lebender Form vor. Abgeschwächte Virusstämme sind heute verfügbar; beispielsweise der Thymidinkinase-negative Stamm Copenhagen. Zur Herstellung von rekombinanten Viren, die zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung notwendig sind, reicht es aus, einen solchen Stamm zu verwenden. Schließlich kann ein rekombinanter Virus durch geeignete den Fachleuten bekannte chemische Behandlung erhalten werden.
Die Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf Fig. 1 dargestellt.
Fig. 1 stellt in schematischer Art ein genomisches DNA- Fragment dar, das für die sezernierte Form von H23-ETA (®1) oder für die transmembranäre Form von H23-ETA (®2) kodiert. Die Blöcke und die Leerstellen symbolisieren jeweils Exons und Introns. Der schwarze Untergrund entspricht der Signalsequenz, und der gestrichelte Hintergrund bedeutet die wiederholten Sequenzen (in der Anzahl 4: a, b, c und d). Die DNA-Fragmente Nr. 1 und 2 werden für die Konstruktion eines vollständigen Fragments verwendet, das für die sezernierte Form H23-ETA kodiert, während die Fragmente Nr. 3 bis 5 zur Konstruktion eines vollständigen Fragments verwendet werden, das für die transmembranäre Form von H23-ETA kodiert. Die in dieser Figur angegebenen Restriktionsstellen finden sich genauso in IS Nr. 1 und 2.

Beispiel 1

Komplementäre und genomische DNA-Fragmente, die für Teile von H23 kodieren, werden nach dem in Wreschner et al., Eur. J. Biochem. (1990) 189. 463 beschriebenen Verfahren isoliert. Diese Fragmente werden im folgenden zur Wiederherstellung eines DNA-Fragments verwendet, das für das vollständige Antigen H23- ETA in sezernierter oder transmembranärer Form kodiert.
Die plasmidischen Konstruktionen sind im folgenden unter Bezug auf Fig. 1 beschrieben.
A. Herstellung eines Impfstoffvirus, der zur Förderung der Synthese der sezernierten Form von H23-ETA fähig ist.
Ein komplementäres DNA-Fragment EcoRI-PvuII (Nr. 1) wird in die EcoRI- und PvuII-Stellen der multiplen Insertionsregion des in Lathe et al., Gene (1987) 57. 193 beschriebenen Vektors pPolyII insertiert und ergibt das Plasmid pETA-5'. Ein genomisches DNA-Fragment PvuII (Nr. 2), umfassend 4 sich wiederholende Einheiten, wird in die PvuII-Stelle der multiplen Insertionsregion von pETA-5' stromabwärts vom Fragment Nr. 1 und in geeigneter Orientierung eingeführt. In den sich wiederholenden Einheiten a, b, c und d sind die Kodons xxx&sub1; und xxx&sub2; jeweils CCA (Pro) und CCC (Pro), CCA und CCC, GCA (Ala) und GCC, CCA und GCC. Genauso ist das Kodon yyy ACC (Thr) in den sich wiederholenden Einheiten a, b und c; das Kodon yyy ist AAC (Asn) in der Einheit d.
Eine für die vollständige sezernierte Form von H23-ETA kodierendes BamHI-SalI-Fragment wird aus dem zuletzt erhaltenen Plasmid ausgeschnitten. Anschließend wird dieses Fragment zwischen die BamHI und SalI-Stellen des Transfer-Vektors ptg194- poly insertiert, der in Kieny et al., Bio/Technology, (1986) 4. 790 beschrieben ist, stromabwärts vom Promotor des Virus des Impfstoffs E7,5k und im Inneren des Gens des Impfstoffvirus, das für Thymidinkinase kodiert.
Der im vorstehenden Absatz erhaltene Transfer-Vektor wird anschließend zur Übertragung des Expressionsblocks der sezernierten Form von H23-ETA in das Genom des Impfstoffvirus, Stamm Copenhagen, nach der in Kieny et al., Nature (1984) 312. 163 beschriebenen Methode verwendet. Man erhält so das Impfstoffvirus VV-ETA-S.
B. Herstellung eines Impfstoffvirus, das zur Förderung der Synthese der transmembranären Form von H23-ETA fähig ist.
Ein genomisches DNA-Fragment PvuII-Pstl (Nr. 3), umfassend 4 sich wiederholende Einheiten, wird zwischen die Stellen PvuII und PstI der multiplen Insertionsregion von pETA-5' stromabwärts vom Fragment Nr. 1 und in geeigneter Orientierung eingeführt. In den sich wiederholenden Einheiten a, b, c und d sind die Kodons xxx1 und xxx2 jeweils CCA (Pro) und CCC (Pro), CCA und CCC, GCA (Ala) und GCC, CCA und GCC. Genauso ist das Kodon yyy ACC (Thr) in den sich wiederholenden Einheiten a, b und c; das Kodon yyy ist AAC (Asn) in der Einheit d.
Ein den klonierten Fragmenten entsprechendes Fragment EcoRI-PstI wird aus dem letzten erhaltenen Plasmid ausgeschnitten. Das klebrige Ende EcoRI wird durch Behandlung mit der Klenow-Polymerase in ein stumpfes Ende umgewandelt. Anschließend wird dieses Fragment zwischen die zuvor mit der Klenow-Polymerase behandelten Stelle XhoI und die Stelle PstI der multiplen Insertionsregion des Vektors pPolyII-Sfi/Not-14 eingeführt wird, der in Lathe et al., supra beschrieben wird, und ergibt das Plasmid pETA-T-5'.
Ein komplementäres DNA-Fragment PstI-BalI (Nr. 4) wird zwischen den Stellen PstI und BalI von pETA-T-5' eingeführt. Anschließend wird ein komplementäres DNA-Fragment Ball-Ball (Nr. 5) in die Stelle BalI des zuletzt erhaltenen Plasmids insertiert.
Ein für die vollständige transmembranäre Form von H&sub2;&sub3;-ETA kodierendes Fragment BglII-SstI wird aus dem im vorstehenden Abschnitt erhaltenen Plasmid ausgeschnitten; anschließend wird es zwischen die Stämme BamHI und SstI des in Kieny et al., (1986) supra beschriebenen Transfer-Vektors ptg186-poly eingeführt, stromabwärts vom Promotor des Impfstoffvirus E7,5k und im Inneren des Gens des Impfstoffvirus, das für Thymidinkinase kodiert.
Der im vorstehenden Absatz erhaltene Transfer-Vektor wird anschließend zur Übertragung des Expressionsblocks der transmembranären Form von H23-ETA in das Genom des Impfstoffvirus, Stamm Copenhagen (VV-O) nach der in Kieny et al., 1984, supra beschriebenen Methode verwendet. Man erhält so das Virus des Impfstoffs VV-ETA-T.

Beispiel 2: Herstellung von Virusvorräten.

Die gereinigten Virusvorräte werden aus Zellen BHK-21 hergestellt. Die Zellen BHK-21 werden während 48 Stunden durch die rekombinanten Viren VV-ETA-S und VV-ETA-T (0,1 pfu/Zelle) infiziert. Nach dieser Zeit werden die Kulturen bei -20ºC eingefroren, anschließend auf Raumtemperatur aufgetaut. Nach Zerstörung der Zellwand durch 3 aufeinanderfolgende Behandlungen im "Potter" in einem hypotonen Puffer werden die löslichen Proteine des Überstands auf ein Saccharosekissen 36% (m/v) gegeben und zentrifugiert (SW 28 Beckman, 1 Stunde, 14 K). Der das Virus enthaltende Niederschlag wird in Tris/HCl, 10 mM pH 8 gelöst und auf einen linearen Gradienten (20 bis 40%) von Saccharose gegeben. Nach Zentrifugation (SW 28, 40 Minuten, 14 K) wird die den Virus enthaltende opalisierende Bande mit Hilfe einer Spritze aufgenommen und durch Zentrifugation konzentriert (SW 28, 20 K, 1 Stunde). Der Virus wird schließlich in einem kleinen Volumen Tris/HCl 10 mM pH 8 aufgenommen, so daß ein Virusvorrat mit einem Titer von ungefähr 10¹&sup0; pfu/ml erhalten wurde.
Beispiel 3: H23-ETA exprimierende Tumor-Zellinien
A. Konstruktion von eukaryotischen Plasmiden, die die Expression von H23-ETA fördern können.
Ein DNA-Fragment BamHI-SalI, das für die sezernierte Form von H23-ETA kodiert, wird aus dem in Beispiel 1A, erster Abschnitt, erhaltenen Plasmid ausgeschnitten. Anschließend wird es zwischen die Stellen BamHl und Sall der multiplen Insertionsregion des Plasmids pHMG wieder eingeführt, das in Gautier et al., Nucl. Acid Res., (1989) 17 (20). 83 beschrieben ist, so daß es sich unter der Kontrolle des Promoters des Gens von 3-Hydroxy-3-methyl-glutaryl-Coenzym-A-Reduktase 8HMGCR) befindet, stromabwärts von der Signal-Sequenz von SV40 polyA. Man erhält so das Plasmid pHMG-ETA-S.
Genauso wird das Plasmid pHMG-ETA-T auf gleiche Weise konstruiert, durch Insertion eines DNA-Fragments BamHI-EcoRV, das aus dem in Beispiel 1B, Abschnitt 2 erhaltenen Plasmid erhalten wird.

B. Herstellung von Zellinien.

Zellen der Tumor-Zellinie FR3T3-ras-1, erhalten aus Fibroblasten aus Fisher-Ratten von Matriceau et al. EMBO J. (1985) 4. 1435 und Zellen der Mamma-Karzinom-Linie von Mäusen MM5t, erhalten aus Mäusen C3H, werden cotransfiziert (i) durch pHMG-ETA-S und das Plasmid pAG60, beschrieben in Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. (1981) 150. 1, das ein Genetizin- Resistenzgen umfaßt (G418) oder (ii) durch pHMG-ETA-T und pAG60. Um die Transfektion durchzuführen, verwendet man die Calciumphosphat-Präzipitationsmethode von Graham et al., Virology (1973) 52. 456, modifiziert von Wigler et al., Cell (1978) 14. 725.
Die transfizierten Klone werden in Gegenwart von 500 ml/ml G418 selektiert und anschließend kultiviert. Die Selektion der H23-ETA exprimierenden Klone erfolgt durch Markierung der Zellen mit Peroxidase nach Reaktion mit dem Antikörper H23. Zellinien in reinem Zustand werden durch die Grenzverdünnungs-Methode erhalten, und die Expression von H23-ETA wird kontrolliert. Die Zellinien werden wie folgt benannt:
FR3T3-ras-1 (pAG60/pHMG-ETA-S): F-S
FR3T3-ras-1 (pAG60/pHMG-ETA-T): F-T
FR3T3-ras-1 (pAG60/pHMG): F-C
MM5tC3H (pAG60/pHMG-ETA-S): M-S
MM5tC3H (pAG60/pHMG-ETA-S): M-T
MM5tC3H (pAGbO/pHMG-ETA-S): M-C

Beispiel 4: Nachweis des Impf-Effekts von H23-ETA

Männliche und weibliche Ratten der Linie IOFS Fisher und weibliche Mäuse der Linie C3H im Alter von 4 bis 5 Wochen werden auf folgende Weise immunisiert: ein gereinigtes Viruspräparat von W-ETA-S. W-ETA-T oder W-0 wird durch Einritzen des Schwanzes in einem Volumen von 10 ml entsprechend ungefähr 2 10&sup7; pfu gegeben. Diese Behandlung wird 10 Tage später wiederholt.
Die Tumor-Linien F-S, F-T, F-C, M-S, M-T und M-C werden in modifiziertem Dulbecco-Medium (Gibco), versetzt mit 10% fetalem Kälberserum, 100 Einheiten Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin, kultiviert. Die Kulturen werden anschließend mit Trypsin behandelt, gewaschen und in PBS-Puffer (Phosphatgepufferter Kochsalzlösung) suspendiert.
14 Tage nach dem ersten Immunisierungsschritt werden einem Tier 2 · 10&sup4; Zellen F-C, 4 · 10&sup4; Zellen F-S. 1,5 · 10&sup5; Zellen F-T oder 2 · 10&sup6; Zellen M-C, M-S oder M-T subkutan in einem Volumen von 100 ml injiziert.
Das Auftreten subkutaner Tumoren wird täglich kontrolliert. Der Durchmesser der Tumoren wird in zwei Dimensionen gemessen. Die vollständigen Daten des Experiments und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I dargestellt. Tabelle I
Tabelle I zeigt, daß, wenn Tiere einer Infektion mit F-S oder F- T unterworfen werden, die Häufigkeit des Auftretens von Tumoren in der Gruppe der zuvor mit dem Impfstoffvirus VV-ETA-S oder VV- ETA-T behandelten Tiere weniger hoch ist als in der Gruppe der nicht behandelten Tiere oder der mit dem Impfstoffvirus VV-0 behandelten Tiere. Andererseits ist die Größe der Tumor- Knötchen, die bei den zuvor mit VV-ETA-S oder VV-ETA-T behandelten Tiere erschienen sehr viel kleiner als die der Tumor-Knötchen, die bei den nicht behandelten oder mit VV-0 behandelten Tieren beobachtet wurde.
Die Immunisierung mit Hilfe von VV-ETA-S oder VV-ETA-T ist nur wirksam im Fall von durch Zellen induzierten Tumoren, die die sezernierte transmembranäre Form von H23-ETA exprimieren. Der Impf-Effekt der Viren ist daher sehr spezifisch.
Schließlich scheint es, daß der Impf-Effekt von VV-ETA-T dem von VV-ETA-S überlegen ist, was auch die Form der H23-ETA ist, das von den die Tumoren induzierenden Zellen exprimiert wird.

Beispiel 5: Nachweis des kurativen Effekts von H23-ETA

Ratten der Linie Fisher werden mit Tumorzellen infiziert wie in Beispiel 4 beschrieben. Ab dem Auftreten von Tumoren (10 bis 15 Tage später) behandelt man mit Hilfe von viralen Präparaten wie in Beispiel 4 beschrieben.
Die Daten und Ergebnisse des Experiments sind in der folgenden Tabelle II angegeben. Tabelle II
Die Tabelle II zeigt, daß die Behandlung einer Infektion durch VV-ETA-S oder VV-ETA-T einen günstigen Einfluß auf die Häufigkeit des Auftretens und die Größe von Tumoren bezogen auf den Kontrolltest zeigt. Andererseits scheint es, daß VV-ETA-T wirksamer ist als VV-ETA-S.

Sequenz-Protokoll Nr. 1

Gegenstand: Transmembranäre Form des Antigens H23-ETA
Sequenztyp: Sequenz eines DNA-Fragments und entsprechende Aminosäuresequenz
Molekültyp: Komplementäre DNA
Ursprung: Mammakarzinomlinie T47D
Eigenschaften des vollständigen DNA-Fragments:
Fragment EcoRI-BalI
Kodierende Sequenz: von Nukleotid 58 bis Nukleotid 1362 + (60 · n)
Eigenschaften der Aminosäuresequenz:
Peptidsignal: von Aminosäure -21 bis Aminosäure -1 Reife Form von Aminosäure 1 bis Aminosäure 414*, * bedeutet [+ (20 · n)], wobei n eine Zahl von 1 bis 80 ist
Sich wiederholende Sequenz:
wie im folgenden eingerahmt gezeigt, wobei X&sub1; und X&sub2; unabhängig Pro oder Ala sind und Y Thr oder Asn ist.

Sequenz-Protokoll Nr. 2

Gegenstand: Lösliche Form des Antigens H23-ETA
Sequenztyp: Sequenz eines DNA-Fragments und entsprechende Aminosäuresequenz
Molekültyp: Komplementäre DNA
Ursprung: Mammakarzinomlinie T47D
Eigenschaften des vollständigen DNA-Fragments:
Fragment EcoRI-PvuII
Kodierende Sequenz: von Nukleotid 58 bis Nukleotid 858 + (60 · n)
Eigenschaften der Aminosäuresequenz:
Peptidsignal: von Aminosäure -21 bis Aminosäure -1
Reife Form: von Aminosäure 1 bis Aminosäure 264*, * bedeutet [+ (20 · n)], wobei n eine Zahl von 1 bis 80 ist
Sich wiederholende Sequenz:
wie im folgenden eingerahmt dargestellt wobei X&sub1; und X&sub2; unabhängig Pro oder Ala sind und Y Thr oder Asn ist.

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Prävention eines malignen Tumors, die als therapeutisches Mittel ein durch den Antikörper H&sub2;&sub3; erkanntes Polypeptid in Verbindung mit einem unter pharmazeutischem Gesichtspunkt verträglichen Verdünner oder Träger umfaßt, wobei das durch den Antikörper H&sub2;&sub3; erkannte Polypeptid eine n-mal wiederholte Sequenz der Formel (I) umfaßt: Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-X&sub1;-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro- Asp-Y-Arg-Pro-X&sub2;, wobei X&sub1; und X&sub2; unabhängig voneinander Pro oder Ala sind und Y Thr oder Asn ist, mit Ausnahme der Sequenz, in der X&sub1;, X&sub2; und Y jeweils Pro, Ala und Thr darstellen, wobei das Polypeptid eine vollständige Sequenz aufweist, die ein Grad an Homologie von mindestens 80% mit (i) der in IS Nr. 1 dargestellten Sequenz aufweist, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Leucin-Rest in Position 414 + (20 · n) endet oder (ii) der in IS Nr. 2 dargestellten Sequenz, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Prolin-Rest in Position 246 + (20 · n) endet; wobei die Zahl n unter Bezug auf die Sequenz der Formei (I) des Polypeptids einerseits und unter Bezug auf die in IS Nr. 1 oder 2 dargestellte Sequenz andererseits in abhängiger Weise eine Zahl von 1 bis 80 bedeutet.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das vom Antikörper H23 erkannte Polypeptid ein Polypeptid ist, das die n-fach wiederholte Sequenz der Formel (I) umfaßt, deren vollständige Sequenz einen Grad an Homologie von mindestens 80% mit (i) der in IS Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist, die mit dem Threonin- Rest in Position 1 beginnt und mit dem Leucin-Rest in Position 414 + (20 · n) endet oder (ii) der in IS Nr. 2 dargestellten Sequenz, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Prolin-Rest in Position 246 + (20 · n) endet; wobei die Zahl n unter Bezug auf die Sequenz der Formel (1) des Polypeptids einerseits und unter Bezug auf die in IS Nr. 1 oder 2 dargestellte Sequenz andererseits in abhängiger Weise 2, 3 oder 4 bedeutet.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der vom Antikörper H23 erkannte Polypeptid als Sequenz (i) die Sequenz aufweist wie in IS Nr. 1 dargestellt, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Leucin-Rest in Position 414 + (20 · n) endet oder (ii) die Sequenz wie in IS Nr. 2 dargestellt, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Prolin-Rest in Position 246 + (20 · n) endet; wobei n eine Zahl von 1 bis 80 ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, bei der das vom Antikörper H&sub2;&sub3; erkannte Polypeptid als Sequenz (i) die Sequenz aufweist wie in IS Nr. 1 dargestellt, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Leucin-Rest in Position 414 + (20 · n) endet oder (ii) die Sequenz wie in IS Nr. 2 dargestellt, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Prolin-Rest in Position 246 + (20 · n) endet; wobei n 2, 3 oder 4 ist.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Prävention eines malignen Tumors, welche als therapeutischen Wirkstoff ein Virus umfaßt, in dessen Genom ein DNA-Fragment insertiert ist, das für ein vom Antikörper H&sub2;&sub3; erkanntes Polypeptid kodiert, wobei das Polypeptid eine n-mal wiederholte Sequenz der Formel (1) umfaßt: Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-X&sub1; -AIa-His-Gty-Val-Thr- Ser-Ala-Pro-Asp-Y-Arg-Pro-X&sub2;, wobei X&sub1; und X&sub2; unabhängig voneinander Pro oder Ala sind und Y Thr oder Asn ist, und dessen vollständige Sequenz einen Grad an Homologie von mindestens 80% mit (i) der in IS Nr. 1 dargestellten Sequenz aufweist, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Leucin-Rest in Position 414 + (20 · n) endet oder (ii) der in IS Nr. 2 dargestellten Sequenz, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Prolin- Rest in Position 246 + (20 · n) endet; wobei die Zahl n unter Bezug auf die Sequenz der Formel (I) des Polypeptids einerseits und unter Bezug auf die in IS Nr. 1 oder 2 dargestellte Sequenz andererseits in abhängiger Weise eine Zahl von 1 bis 80 ist, wobei das DNA-Fragment unter der Kontrolle von geeigneten Transkriptions- und Translations-Signalen (signeaux de transcription et de traduction) steht.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, die ein Virus umfaßt, in dessen Genom ein DNA-Fragment insertiert ist, welches für ein vom Antikörper H&sub2;&sub3; erkanntes Polypeptid kodiert, umfassend die n-fach wiederholte Sequenz der Formel (I) umfaßt, dessen vollständige Sequenz einen Grad an Homologie von mindestens 80% mit (i) der in IS Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist, die mit dem Threonin- Rest in Position 1 beginnt und mit dem Leucin-Rest in Position 414 + (20 · n) endet oder (ii) der in IS Nr. 2 dargestellten Sequenz, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Prolin-Rest in Position 246 + (20 · n) endet; wobei die Zahl n unter Bezug auf die Sequenz der Formel (1) des Polypeptids einerseits und unter Bezug auf die in IS Nr. 1 oder 2 dargestellte Sequenz andererseits in abhängiger Weise 2, 3 oder 4 bedeutet.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 5, die ein Virus umfaßt, in dessen Genom ein DNA-Fragment insertiert ist, welches für ein vom Antikörper H23 erkanntes Polypeptid kodiert und als Sequenz (i) die in IS Nr. 1 gezeigte Sequenz aufweist, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Leucin- Rest in Position 414 + (20 · n) endet oder (ii) die in IS Nr. 2 dargestellte Sequenz, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Prolin- Rest in Position 246 + (20 · n) endet; wobei die Zahl n eine Zahl von 1 bis 80 bedeutet.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, die ein Virus umfaßt, in dessen Genom ein DNA-Fragment insertiert ist, welches für ein vom Antikörper H23 erkanntes Polypeptid kodiert und als Sequenz (i) die in IS Nr. 1 gezeigte Sequenz aufweist, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Leucin- Rest in Position 414 + (20 · n) endet oder (ii) die in IS Nr. 2 dargestellte Sequenz, die mit dem Threonin-Rest in Position 1 beginnt und mit dem Prolin- Rest in Position 246 + (20 · n) endet; wobei die Zahl n 2, 3 oder 4 bedeutet.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, bei der das Virus, in dessen Genom ein DNA-Fragment insertiert ist, welches für ein vom Antikörper H23 erkanntes Polypeptid kodiert, ein Pockenvirus ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Pockenvirus, in dessen Genom ein DNA-Fragment insertiert ist, welches für ein vom Antikörper H23 erkanntes Polypeptid kodiert, das Virus des Impfstoffs ist.

11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, in der das Virus, in dessen Genom ein DNA-Fragment insertiert ist, welches für ein vom Antikörper H23 erkanntes Polypeptid kodiert, ein Adenovirus ist.