DE19925199A1 - Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie - Google Patents
Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und TherapieInfo
- Publication number
- DE19925199A1 DE19925199A1 DE19925199A DE19925199A DE19925199A1 DE 19925199 A1 DE19925199 A1 DE 19925199A1 DE 19925199 A DE19925199 A DE 19925199A DE 19925199 A DE19925199 A DE 19925199A DE 19925199 A1 DE19925199 A1 DE 19925199A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cell
- cells
- cell epitope
- compound
- complex
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 title claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 48
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 title claims description 20
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title abstract description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 133
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 155
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 56
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 49
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 37
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 19
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 15
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 8
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 claims description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 5
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 5
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 5
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 claims description 4
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 claims description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000000763 radioactive isotope labeling Methods 0.000 claims description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 18
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 9
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 101100209954 Human papillomavirus type 16 L1 gene Proteins 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 6
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 6
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 4
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- -1 E2F Proteins 0.000 description 3
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 3
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 3
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 3
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 3
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100166600 Homo sapiens CD28 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 102000008937 Zona Pellucida Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010074006 Zona Pellucida Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101150012716 CDK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000002554 Cyclin A Human genes 0.000 description 1
- 108010068192 Cyclin A Proteins 0.000 description 1
- 102000003909 Cyclin E Human genes 0.000 description 1
- 108090000257 Cyclin E Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 101150013359 E7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100059559 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) nimX gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 241000701828 Human papillomavirus type 11 Species 0.000 description 1
- 101000767631 Human papillomavirus type 16 Protein E7 Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 101150075239 L1 gene Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100034670 Myb-related protein B Human genes 0.000 description 1
- 101710115153 Myb-related protein B Proteins 0.000 description 1
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 1
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010057576 Papillomavirus E7 Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 description 1
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 1
- 101100273808 Xenopus laevis cdk1-b gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 208000007951 cervical intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000002178 crystalline material Substances 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N fluorescamine Chemical compound C12=CC=CC=C2C(=O)OC1(C1=O)OC=C1C1=CC=CC=C1 ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 108010061181 influenza matrix peptide (58-66) Proteins 0.000 description 1
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 208000022766 lymph node neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004987 nonapoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 208000005963 oophoritis Diseases 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 1
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 206010043778 thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 208000024719 uterine cervix neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Papillomavirus T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz ILVPKVSGLK, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, und/oder eine funktionell aktive Variante davon, sowie ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Papillomavirus T-Zell-Epitop mit einer
Aminosäuresequenz ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV,
TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI,
YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, und/oder eine funktionell aktive Variante
davon, sowie ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie.
Die Papillomviren, auch Warzenviren genannt, sind doppelsträngige DNA-Viren mit einer
Genomgröße von etwa 8000 Basenpaaren und einem Ikosaeder-förmigen Kapsid mit einem
Durchmesser von ca. 55 nm. Bis heute sind mehr als 100 verschiedene humanpathogene
Papillomavirustypen (HPV) bekannt, von denen einige, z. B. HPV-16, HPV-18, HPV-31,
HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 oder HPV-58, bösartige Tumore und andere, z. B. HPV-6,
HPV-11 oder HPV-42 gutartige Tumore verursachen können.
Das Genom der Papillomaviren läßt sich in drei Bereiche unterteilen: Der erste Bereich
betrifft eine nicht-kodierende Region, die Regulationselemente für die Transkription und
Replikation des Virus enthält. Die zweite Region, sogenannte E-(Early)Region enthält
verschiedene Protein-kodierende Abschnitte E1-E7, von denen z. B. das E6- und das E7-
Protein für die Transformation von Epithelzellen verantwortlich sind und das E1-Protein die
DNA-Kopienzahl kontrolliert. Bei der E6- und E7-Region handelt es sich um sogenannte
Onkogene, die auch in bösartig entarteten Zellen exprimiert werden. Die dritte Region, auch
L-(Late)Region genannt, enthält zwei Protein-kodierende Abschnitte L1 und L2, die für
Strukturkomponenten des Viruskapsids kodieren. Das L1-Protein ist zu über 90% im viralen
Kapsid vorhanden, wobei das Verhältnis von L1 : L2 im allgemeinen 30 : 1 ist. Unter dem
Begriff L1-Protein versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung das Hauptkapsid
Protein der Papillomaviren (Baker T. et al. (1991) Biophys. J. 60, 1445).
In über 50% der Fälle wird HPV-16 mit Gebärmutterhalskrebs (Cervixcarcinom) in
Verbindung gebracht. HPV-16 ist der Hauptrisikofaktor für die Ausbildung von cervicalen
Neoplasien. Das Immunsystem spielt eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Krankheit.
So sind vermutlich zelluläre Immunantworten und insbesondere Antigen-spezifische T-
Lymphozyten wichtig für den Abwehrmechanismus. Es wurde weiterhin gefunden, daß in
hochgradig malignen cervicalen intraepithelialen Neoplasien (CIN II/III) und cervicalen
Tumoren das E7-Gen konstitutiv in allen Schichten des infizierten Epithels exprimiert wird.
Daher wird vor allem das E7-Protein als potentielles Tumorantigen und als Zielmolekül für
aktivierte T-Zellen betrachtet (siehe z. B. WO 93/20844). Die E7-induzierte zelluläre
Immunantwort im Patienten ist aber anscheinend nicht stark genug, um den Krankheitsverlauf
zu beeinflussen. Die Immunantwort kann eventuell durch geeignete Impfstoffe verstärkt
werden.
Es konnte gezeigt werden, daß die Expression des L1-Gens bzw. die Coexpression des L1-
und L2-Gens zur Bildung von Capsomeren, stabilen Capsomeren, Capsiden oder Virus-
ähnliche Partikel (VLPs für virus-like particle) führen kann (siehe z. B. WO 93/02184, WO 94/20137
oder WO 94/05792). Unter Capsomeren versteht man eine oligomere
Konfiguration, die aus fünf L1-Proteinen aufgebaut ist. Das Capsomer ist der Grundbaustein,
aus denen virale Capside aufgebaut sind. Unter stabilen Capsomeren versteht man
Capsomere, die nicht dazu in der Lage sind sich zu Capsiden zusammenzusetzen. Unter
Capsiden versteht man die Hülle des Papillomavirus, die beispielsweise aus 72 Capsomeren
zusammengesetzt ist (Baker T. et al. (1991) Biophys. J. 60, 1445). Unter VLP versteht man
ein Capsid, das morphologisch und in seiner Antigenität einem intakten Virus gleicht. Die
VLPs konnten zur Auslösung einer humoralen Immunantwort, die durch Bildung von
neutralisierenden Antikörpern charakterisiert ist, in verschiedenen tierischen Systemen
verwendet werden. Die Bildung von virus-neutralisierenden Antikörpern gegen L1- und/oder
L2-Protein ist jedoch von geringerer klinischer Bedeutung, wenn die Virusinfektion bereits
stattgefunden hat, da für die Eliminierung virus-infizierter Zellen keine Antikörper, sondern
eine virus-spezifische zytotoxische T-Zell-(CTL)-Antwort notwendig zu sein scheint. Und
obwohl VLPs in der Lage sind eine zytotoxische T-Zell-Antwort auszulösen, scheint eine
ausschließlich gegen die Kapsidproteine L1 und/oder L2 gerichtete Immunantwort nicht zur
Bekämpfung eines durch Papillomaviren bedingten Tumors geeignet.
Es wurden daher sogenannte chimäre Papillomavirus-ähnliche Partikel (CVLPs für chimeric
virus-like particle) entwickelt, die aus einem Fusionsprotein des Kapsidproteins L1 und des
potentiellen Tumorantigen E7 bestehen (WO 96/11272 und Müller, M. et al. (1997) Virology,
234, 93). Die CVLPs lösten nur im geringen Maße eine gegen das E7-Protein gerichtete
humorale Immunantwort aus (Müller, M. et al. (1997), supra). Einige der getesteten CVLPs
induzieren jedoch tatsächlich die erwünschte E7-spezifische zytotoxische T-Zellantwort in
Mäusen (siehe auch Peng S. et al. (1998) Virology 240, 147-57). CVLPs sind deshalb sowohl
für die Entwicklung eines Impfstoffes als auch für die Behandlung bereits bestehender
Infektionen und daraus resultierender Tumore interessant, da die über MHC-Moleküle der
Klasse I-präsentierten E7-Peptide von Tumorzellen Zielmoleküle von zytotoxischen T-Zellen
darstellen würden.
Einem Impfstoff bestehend aus CVLPs liegt das Prinzip der Pseudoinfektion der Zellen durch
die CVLPs zugrunde. Dies bedeutet, daß die CVLPs wie Viren in die Zelle gelangen, dort zu
Peptiden prozessiert werden, die Peptide dann auf MHC-Klasse I und II-Moleküle geladen
werden und letztendlich CD8- bzw. CD4-positiven T-Zellen präsentiert werden. CD8-Zellen
können als Folge dieser Stimulation zu zytotoxischen T-Zellen differenzieren und dann eine
zelluläre Immunantwort bewirken, CD4-Zellen hingegen entwickeln sich zu T-Helferzellen
und stimulieren B-Zellen zu einer humoralen oder CD8-positive T-Zellen zu einer
zytotoxischen Immunantwort und können selbst die Lyse von infizierten Zellen induzieren.
Kleine Peptide können bereits auf der Zelloberfläche an MHC-Klasse I-Moleküle binden und
dann ohne weitere Prozessierung CD8- oder CD4-positive Zellen zu einer zellulären
Immunantwort stimulieren. Ein bestimmtes Peptid kann jedoch nur durch bestimmte MHC-
Moleküle gebunden werden. Durch den großen Polymorphismus der MHC-Moleküle in
natürlichen Populationen kann deshalb ein bestimmtes Peptid lediglich durch einen kleinen
Teil einer Population gebunden und präsentiert werden. Unter Präsentation im Sinne der
vorliegenden Erfindung wird verstanden, wenn ein Peptid oder Proteinfragment an ein MHC-
Molekül bindet, wobei diese Bindung beispielsweise im endoplasmatischen Retikulum, im
extrazellulären Raum, den Endosomen, Proendosomen, Lysosomen oder Protysosomen,
stattfinden kann, und wenn dann dieser MHC-Molekül-Peptid-Komplex auf der
extrazellulären Seite der Zellmembran gebunden ist, so daß er durch Immunzellen spezifisch
erkannt werden kann.
Da CVLPs sowohl eine zelluläre als auch humorale Immunantwort auslösen und nicht MHC-
restringiert sind, eignet sich diese Technologie generell zur Entwicklung von Impfstoffen,
indem die Fähigkeit zur Partikelbildung durch einen L1-Anteil zur Verfügung gestellt wird
und ein zusätzlicher Antigenanteil an diesen L1-Anteil fusioniert wird.
Bei der Entwicklung derartiger CVLPs ist es unbedingt notwendig, ein funktionelles
Testsystem zur Verfügung zu haben, mit dem man direkt die Immunogenität von CVLPs
untersuchen kann. Ein derartiges Testsystem sollte die Eigenschaft besitzen, daß CVLPs mit
unterschiedlichen Antigenanteilen mit demselben Testsystem untersucht werden können. Da
für immunologische Therapieverfahren von Tumoren oder Viruserkrankungen die zelluläre
Immunantwort von entscheidender Bedeutung ist, stellte sich die Aufgabe, die durch CVLPs
hervorgerufene zelluläre Immunantwort meßbar zu machen.
Die Lösung dieser Aufgabe gelang durch die Identifikation von T-Zell-Epitopen, die in
Verbindung mit MHC-Molekülen, in einer besonderen Ausführungsform mit HLA A2.01
MHC-Molekülen in vivo und in vitro beispielsweise eine zytotoxische T-Zellantwort
auslösen. Diese Peptide haben vorzugsweise die Sequenz ILVPKVSGL, RLVWACVGV,
HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL,
NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV. Diese
Sequenzen sind Bestandteil des L1-Peptid des HPV 16. Sie umfassen die Aminosäurebereiche
86-94 (5104), 123-131 (5106), 285-293 (5107), 275-283 (5108), 238-246 (5109), 426-434
(5112), 28-39 (2016), 311-320 (2017), 408-417 (2018), 38-47 (2019), 396-404 (2020), 349-357
( 2022) die Namen der jeweiligen Epitope ist in Klammern angegeben.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz
ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV,
ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV,
YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, und/oder eine funktionell aktive Variante davon.
Unter einer funktionell aktiven Variante von ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV,
YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT,
TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL oder ICWGNQLFV versteht man ein T-
Zell-Epitop, das in einem T-Zell-Zytotoxizitäts-Testsystem (siehe beispielsweise Beispiele 2-5
der vorliegenden Erfindung) eine, an der Zytotoxizität von ILVPKVSGL, RLVWACVGV,
HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL,
NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL oder ICWGNQLFV
gemessene Zytotoxizität besitzt, die mindestens der Summe aus dem Mittelwert der
Negativkontrollen und der dreifachen Standardabweichung entspricht, vorzugsweise von
mindestens ca. 30%, insbesondere mindestens ca. 50% und in besonders bevorzugter Weise
von mindestens ca. 80%.
Eine bevorzugte Variante ist beispielsweise ein T-Zell-Epitop mit einer Sequenzhomologie zu
ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV,
ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV,
YDLQFIFQL oder ICWGNQLFV von mindestens ca. 65%, vorzugsweise mindestens ca.
75% und insbesondere mindestens ca. 85% auf Aminosäureebene. Andere bevorzugte
Varianten sind auch T-Zell-Epitope, die eine strukturelle Homologie zu ILVPKVSGL,
RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL,
SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL oder
ICWGNQLFV haben. Solche Epitope können aufgefunden werden, indem man gegen die T-
Zell-Epitope ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV,
TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI,
YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL oder ICWGNQLFV spezifische T-Zellen generiert (DeBruijn
M. L. et al. (1991) Eur. J. Immunol. 21, 2963-70; und DeBruijn M. L. (1992) Eur. J. Immunol.
22, 3013-20) und beispielsweise synthetisch hergestellte Peptide nach Wahl auf Erkennung
durch die peptidspezifischen T-Zellen getestet werden (siehe Beispiele). Insbesondere werden
unter T-Zellepitopen zytotoxische T-Zellepitope verstanden. Es sind jedoch auch nicht
zytotoxische T-Zellen bekannt, die ebenfalls MHC I-Moleküle erkennen können, so daß auch
nicht-zytotoxische T-Zellepitope als Variante von der vorliegenden Erfindung umfaßt sind.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein T-Zell-Epitop, das Teil
einer Verbindung ist, wobei die Verbindung kein natürlich vorkommendes L1 Protein eines
Papillomavirus und keine ausschließlich N-terminale oder ausschließlich C-terminale
Deletionsmutante eines natürlich vorkommenden L1 Proteins eines Papillomavirus ist.
In einer besonderen Ausführungsform kann ein T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz
ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV,
ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV,
YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, und/oder eine funktionell aktive Variante in einem L1-Protein
eines anderen Papillomavirus oder in einem chimären L1-Protein, beispielsweise einem
HPV18L1E7-Fusionsprotein, enthalten sein. Eine solche erfindungsgemäβe Verbindung kann
die Fähigkeit zur Bildung von CVLPs besitzen.
Vorzugsweise kann das genannte T-Zell-Epitop als Teil einer Verbindung ein Polypeptid, das
in bevorzugter Weise weitere Aminosäuresequenzen enthält, insbesondere ein Fusionsprotein
sein. Insbesondere kann die Verbindung ein Polypeptid von mindestens ca. 50 Aminosäuren,
vorzugsweise von mindestens ca. 35 Aminosäuren, insbesondere von mindestens ca. 20
Aminosäuren und in besonders bevorzugter Weise von mindestens ca. 9-12 Aminosäuren
Länge sein.
Um die Verbindung zu detektieren oder in ihrer Aktivität der Bindung an T-Zellen zu
modifizieren, kann sie eine chemische, radioaktive Isotopen-, nicht radioaktive Isotopen-,
und/oder Fluoreszensmarkierung des T-Zell-Epitops und/oder des genannten Fusionsproteins
enthalten.
Beispiele von dem Fachmann bekannten chemischen Substanzen, die sich für eine
erfindungsgemäße chemische Markierung eignen, sind: Biotin, FITC (Fluorescein
isothiocyanat) oder Streptavidin.
Eine mögliche Ausführungsform ist, daß ein Peptid derart modifiziert wird, daß es mindestens
ein Lysin enthält. An dieses Lysin wird in der dem Fachmann bekannter Weise Biotin oder
FITC (Fluoresceinisothiocyanat) gekoppelt. Ein derartig modifiziertes Peptid wird an ein
entsprechendes MHC-Molekül oder an eine Zelle mit entsprechenden MHC-Molekülen
gebunden. Daraufhin kann das Peptid über markiertes Avidin oder Streptavidin bzw. direkt
über die Fluoreszenz des FITC nachgewiesen werden.
Beispiele von dem Fachmann bekannten Isotopen, die sich für eine erfindungsgemäße
radioaktive Isotopenmarkierung eignen, sind: 3H, 125I, 131I, 32P, 33P oder 14C.
Beispiele von dem Fachmann bekannten Isotopen, die sich für eine erfindungsgemäße nicht
radioaktive Isotopenmarkierung eignen, sind: 2H oder 13C.
Beispiele von dem Fachmann bekannten fluoreszierenden Substanzen, die sich für eine
erfindungsgemäße Fluoreszensmarkierung eignen, sind: 152Eu, Fluoresceinisothiocyanat,
Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phtaldehyd oder Fluorescamin.
Dem Fachmann sind weitere hier nicht aufgeführte Markierung bekannt, die auch im Sinne
dieser Erfindung zur Markierung eingesetzt werden können.
Beispiele von dem Fachmann bekannten erfindungsgemäßen chemischen Modifikationen sind
die Übertragung von Acetyl-, Phosphat-, und/oder Monosacharidgruppen.
Erfindungsgemäße Polypeptide mit einer Aminosäurelänge von ca. 50 können beispielsweise
durch eine chemische Peptidsynthese hergestellt werden. Längere Polypetide werden
vorzugsweise gentechnisch erzeugt. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist
daher ein Nukleinsäurekonstrukt zur Expression des genannten T-Zell-Epitops oder der
Verbindungen, das folgende Komponenten enthält: (a) mindestens ein regulatorisches
Element und (b) mindestens eine Nukleinsäure, die für eine Aminosäuresequenz der
erfindungsgemäßen Verbindung kodiert. Das genannte Nukleinsäurekonstrukt ist
vorzugsweise aus DNA oder RNA. Geeignete regulatorische Elemente erlauben
beispielsweise die konstitutive, regulierbare, gewebsspezifische, zellzyklusspezifische oder
metabolischspezifische Expression in eukaryotischen Zellen oder die konstitutive,
metabolischspezifische oder regulierbare Expression in prokaryotischen Zellen. Regulierbare
Elemente gemäß der vorliegenden Erfindung sind Promotoren, Aktivatorsequenzen,
Enhancer, Silencer, und/oder Repressorsequenzen.
Beispiele für geeignete regulierbare Elemente, die konstitutive Expression in Eukaryoten
ermöglichen sind Promotoren die von der RNA Polymerase III erkannt werden oder virale
Promotoren, wie CMV-Enhancer, CMV-Promotor, SV40 Promotor und virale Promotor- und
Aktivatorsequenzen, abgeleitet aus beispielsweise HBV, HCV, HSV, HPV, EBV HTLV oder
HIV.
Beispiele für regulierbare Elemente, die regulierbare Expression in Eukaryoten ermöglichen,
sind der Tetrazyklinoperator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor (Gossen
M. et al (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).
Beispiele für regulierbare Elemente, die gewebsspezifische Expression in Eukaryoten
ermöglichen, sind Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern von
solchen Genen, die für Proteine kodieren, die nur in bestimmten Zelltypen exprimiert werden.
Beispiele für regulierbare Elemente, die zellzyklusspezifische Expression in Eukaryoten
ermöglichen, sind die Promotoren der folgenden Gene: cdc25C, Cyclin A, Cyclin E, cdc2,
E2F, B-myb oder DHFR (Zwicker J. und Müller R. (1997) Trends Genet. 13, 3-6).
Beispiele für regulierbare Elemente, die metabolisch spezifische Expression in Eukaryoten
ermöglichen, sind Promotoren, die durch Hypoxie, durch Glucosemangel, durch
Phosphatkonzentration oder durch Hitzeschock reguliert werden.
Um die Einführung der genannten Nukleinsäure und damit die Expression des Polypeptids in
einer eu- oder prokaryotischen Zelle durch Transfektion, Transformation oder Infektion zu
ermöglichen, kann die Nukleinsäure als Plasmid, als Teil eines viralen, oder nicht viralen
Vektors vorliegen. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb ein
Vektor, insbesondere ein Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure codierend für ein
erfindungsgemäßes Polypeptid enthält. Als virale Vektoren eignen sich hierbei besonders:
Baculoviren, Vakziniaviren, Adenoviren, adenoassozüerte Viren und Herpesviren. Als nicht
virale Vektoren eignen sich hierbei besonders: Virosomen, Liposomen, kationische Lipide,
oder Poly-Lysin konjugierte DNA.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mindestens ein T-Zell-
Epitop enthält, vorzugsweise präsentiert. In einer besonderen Ausführungsform wird die Zelle
durch einen der genannten Vektoren transfiziert, transformiert oder infiziert. Diese Zelle
exprimiert unter dem Fachmann bekannten Bedingungen, die zur Aktivierung der jeweils
verwendeten regulierbaren Elemente führen, das erfindungsgemäße Polypeptid. Das
Polypeptid kann dann aus dieser Zelle isoliert und z. B. unter Verwendung einer der oben
genannten Markierungen aufgereinigt werden. Zur gentechnischen Herstellung und
anschließenden Aufreinigung der exprimierten, erfindungsgemäßen Verbindungen eignen
sich prokaryotische und eukaryotische Zellen, insbesondere Bakterienzellen wie
beispielsweise E. coli, Hefezellen wie beispielsweise S. cerevisiae, Insekten Zellen wie
beispielsweise Spodoptera frugiperda Zellen (Sf-9) oder Trichoplusia ni Zellen oder
Säugerzellen wie beispielsweise COS-Zellen oder HeLa-Zellen.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist es, die Zelle, die das erfindungsgemäße Polypeptid
exprimiert, selbst zu verwenden, wobei in einer besonders bevorzugten Ausführungsfarm die
Zelle Teile das erfindungsgemäßen Polypeptids über MHC-1 Moleküle auf der Zelloberfläche
präsentiert. Für die Herstellung einer erfindungsgemäßen Zelle sind Antigen-präsentierende
Zellen wie beispielsweise B-Zellen, Makrophagen, dendritische Zellen, Fibroblasten oder
anderen HLA A2.01 positive Zellen, in einer bevorzugten Ausführungsform JY-, T2, CaSki-
Zellen oder EBV-transformierte B-Zellinien, geeignet. Die erfindungsgemäßen Zellen, die ein
Polypeptid enthaltend ein T-Zell-Epitop, präsentieren, können als Zielzellen zur
Restimulation von Immunzellen, insbesondere T-Zellen und/oder zur Messung der
Aktivierung von T-Zellen eingesetzt werden. Unter Zielzelle im Sinne der vorliegenden
Erfindung ist eine Zelle zu verstehen, die über MHC-Moleküle ein T-Zell-Epitope präsentiert
und damit spezifisch eine T-Zell-Aktivierung hervorruft, insbesondere eine zytotoxische T-
Zell-Reaktion gegen die Zelle.
Ferner kann die ein T-Zell-Epitop enthaltene Verbindung, Teil eines Komplexes sein, der
dadurch charakterisiert ist, daß die Verbindung kovalent oder über hydrophobe
Wechselwirkungen, Ionenbindung oder Wasserstoffbrückenbindungen mit mindestens einer
weiteren Spezies wie Peptide, Proteine, Peptoide, lineare oder verzweigte Oligo- oder
Polysacharide und Nukleinsäuren verbunden ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop
oder eine Verbindung und mindestens eine weitere Verbindung. Eine bevorzugte
Ausführungsform ist, daß das Polypeptid in Verbindung mit MHC Klasse I-Molekülen,
vorzugsweise als HLA A2.01 Tetramer vorliegt. Besonders bevorzugt sind humane MHC-
Klasse I Moleküle. Durch die Technik von Altman J. D. et al. (1996, Science 274, 94-6) lassen
sich beispielsweise HLA A2.01-Tetramere mit den entsprechenden gebundenen Peptiden
herstellen, die in der Lage sind, an die T-Zellrezeptoren von peptidspezifischen zytotoxischen
T-Zellen zu binden.
Eine weitere Ausführungsform ist die Immobilisierung der erfindungsgemäßen Verbindung
oder des genannten Komplexes an Trägermaterialien. Als Trägermaterialien eignen sich
beispielsweise Keramik, Metall, insbesondere Edelmetall, Gläser, Kunststoffe, kristalline
Materialien bzw. dünne Schichten des Trägers, insbesondere der genannten Materialien, oder
(bio)molekulare Filamente wie Cellulose oder Gerüstproteine.
Zur Aufreinigung des erfindungsgemäßen Komplexes kann eine Komponente des Komplexes
zusätzlich noch ein Protein-Tag enthalten. Erfindungsgemäße Protein-Tags erlauben
beispielsweise die hochaffine Absorption an eine Matrix, stringentes Waschen mit geeigneten
Puffern ohne den Komplex im nennenswerten Maße zu eluieren und anschließende gezielte
Elution des absorbierten Komplexes. Beispiele von dem Fachmann bekannten Protein-Tags,
sind ein (HIS)6-Tag, ein Myc-Tag, ein FLAG-Tag, ein Hämaglutenin-Tag, Glutathion-
Transferase (GST)-Tag, Intein mit einem Affinitäts-Chitin-binding Tag oder Maltose binding
protein (MBP)-Tag. Die erfindungsgemäßen Protein-Tags können sich N-, C-terminal,
und/oder intern befinden.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum in vitro Nachweis
der Aktivierung von T-Zellen durch mindestens eine Verbindung, enthaltend ein T-Zell-
Epitop. Ein derartiges Verfahren besteht vorzugsweise aus drei Schritten:
- a) In einem ersten Schritt werden Zellen mit mindestens einer Verbindungen enthaltend ein T-Zell-Epitop stimuliert. Diese Verbindung kann mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einen erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein VLP, mindestens ein CVLP, und/oder mindestens ein Virus bedeuten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Immunzellen durch die Inkubation mit CVLPs stimuliert. Diese Stimulation kann beispielsweise in Form einer Impfung erfolgen, oder durch Inkubation von Immunzellen mit CVLPs in vitro. Derartig stimulierte Immunzellen werden beispielsweise nach einer Impfung oder bei einem Tumorpatienten aus dem Blut, aus Tumoren oder aus Lymphknoten gewonnen, und/oder werden kultiviert.
- b) In einem zweiten Schritt werden Zellen mit mindestens einem erfindungsgemäßen T- Zell-Epitop, mindestens einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell- Epitop, mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert und/oder mit mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex inkubiert.
- c) In einem dritten Schritt erfolgt die Bestimmung der Aktivierung von T-Zellen. Hierfür geeignete Verfahren sind beispielsweise der Nachweis der Produktion oder Sekretion von Cytokinen durch die T-Zellen, der Expression von Oberflächenmolekülen auf T- Zellen, der Lyse von Zielzellen oder der Proliferation von Zellen. Hierfür geeignete Methoden sind beispielsweise ein Cytokinassay (Chapter 6.2 bis 6.24 in Current Protocols in Immunology (1999), edited by Coligan J. E., Kruisbeek A. M., Margulies D. H., Shevach E. M. and Strober W., John Wiley & Sons), ELISPOT (Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra), ein 51Cr-Freisetzungstest (Chapter 3.11 in Current Protocols in Immunology, supra) oder der Nachweis der Proliferation (Chapter 3.12 in Current Protocols in Immunology, supra). Je nach verwendeter Methode kann dabei auch zwischen den Immunzellen wie zytotoxischen T-Zellen, T- Helferzellen, B-Zellen, NK-Zellen und anderen Zellen unterschieden werden. Die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen, Komplexen, und/oder Zellen, die erfindungsgemäße Markierungen enthalten, erlaubt die Detektion von T-Zellen, die das T-Zell-Epitop erkennen über den Nachweis der Bindung markierter Verbindungen, Komplexe, und/oder Zellen an die T-Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bindung erfindungsgemäßer MHC-Polypeptid-Komplexe an die Oberfläche der T-Zellen nachgewiesen. Dies kann derart durchgeführt werden, daß die MHC- Komplexe selbst markiert, beispielsweise fluoreszenzmarkiert sind, oder daß man in einem weiteren Schritt einen MHC-spezifischen, markierten, beispielsweise fluoreszenzmarkierten Antikörper verwendet, um wiederum die MHC-Komplexe nachzuweisen. Die Fluoreszenzmarkierung der T-Zellen läßt sich dann beispielsweise in einem "Fluorescens Activated Cell Sorter" (FACS) messen und auswerten. Eine andere Möglichkeit zum Nachweis der Bindung von den Komplexen an die T-Zellen ist erneut die Messung der Aktivierung von T-Zellen (Cytokinassay, Elispot, 51Cr- Freisetzungstest, Proliferation, siehe oben). Allerdings benötigt man hierfür die gleichzeitige Stimulation von Korezeptoren (z. B. CD28), beispielsweise durch Korezeptor-spezifische Antikörper (Anti-CD28) und/oder andere unspezifische Aktivatoren (IL-2).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren, das einen zusätzlichen Schritt
a') enthält, der nach Schritt a) eingeführt wird.
- 1. a') In diesem zusätzlichen dem Schritt a) nachfolgenden Schritt a') werden die isolierten
oder kultivierten Zellen mit mindestens einer Zielzelle beladen mit einer
erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einem
erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einem
Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens
einem CVLP und/oder mindestens einem Virus, mit mindestens einem
erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, und/oder mindestens einer
Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert, für mindestens ca. 8 Wochen, insbesondere
für mindestens ca. 1 Woche cokultiviert, bevor sich Schritt b) anschließt.
Unter Cokultivierung ist das Wachstum der Zellen:- a) in Gegenwart von mindestens einer Zielzelle beladen mit einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP, und/oder mindestens einem Virus,
- b) in Gegenwart mindestens eines erfindungsgemäßen Komplexes enthaltend ein T-Zell-Epitop,
- c) in Gegenwart mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert,
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer
T-Zell-Epitop präsentierenden Zielzelle. Hierbei ist es möglich, die Zielzelle mit
Kombinationen von unterschiedlichen T-Zell-Epitopen zu beladen. In einer bevorzugten
Ausführungsform wird die Zielzelle mit mindestens einer Verbindung enthaltend ein T-Zell-
Epitop und/oder mindestens einem Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop inkubiert. In einer
besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Zielzelle in Wachstumsmedium, das
erfindungsgemäße Polypeptide enthält, oder mit MHC Klasse I-Komplexen mit gebundenen
erfindungsgemäßen Polypeptiden inkubiert. Die MHC Klasse I-Komplexe können
beispielsweise als HLA A2.01-Tetramere vorliegen. Ein Tetramer bindet dabei in der Regel
vier Peptide. Diese können sowohl identisch sein oder aber unterschiedliche Spezies von
Peptiden repräsentieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Zielzelle
mit einer Nukleinsäure und/oder einem Vektor transfiziert, transformiert und/oder infiziert. In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Zielzelle mit einem
Vakziniavirusvektor infiziert. Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit Antigen-
präsentierenden Zellen beispielsweise mit B-Zellen, Makrophagen, dendritischen Zellen,
embryonalen Zellen oder Fibroblasten oder anderen HLA A2.01 positiven Zellen, in einer
bevorzugten Ausführungsform mit JY-, T2-, CaSki- Zellen oder EBV-transformierten B-
Zellinien durchgeführt.
Die verwendeten CVLPs enthalten ein Papillomavirus L1-Protein oder Varianten davon,
insbesondere HPV16 L1-Protein und, jedoch nicht notwendigerweise, ein zu L1 heterologes
Protein oder Varianten davon. Die zwei Proteine können direkt oder indirekt gebunden
vorliegen. Direkt gebunden meint im Sinne der Erfindung, daß eine kovalente Bindung
zwischen den beiden Proteinen vorliegt, beispielsweise eine Peptidbindung oder eine
Disulfidbindung. Indirekt gebunden bedeutet, daß die Proteine über nicht-kovalente
Bindungen gebunden sind, beispielsweise hydrophobe Wechselwirkungen, Ionenbindungen
oder Wasserstoffbrücken. In einer weiteren Ausführungsform enthalten die CVLPs zusätzlich
zu L1-Protein oder Varianten davon ein Papillomavirus L2-Protein.
Eine bevorzugte Ausführung des L1-Proteins der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise
L1-Proteine mit einer oder mehreren Deletionen, insbesondere einer C-terminalen Deletion.
Eine C-terminale Deletion hat den Vorteil, daß die Effizienz der Bildung virus-ähnlicher
Partikel gesteigert werden kann, da das am C-Terminus lokalisierte nukleäre
Lokalisationssignal deletiert wird. Die C-terminale Deletion beträgt daher vorzugsweise bis
zu ca. 35 Aminosäuren, insbesondere ca. 25 bis ca. 35 Aminosäuren, vor allem ca. 32 bis ca.
34 Aminosäuren. Beispielsweise ist eine 32 Aminosäuren lange C-terminale Deletion des
HPV16 L1-Proteins ausreichend, um die Bildung von virus-ähnlichen Partikeln um das
mindestens ca. zehnfache steigern zu können. Des weiteren kann das L1-Protein eine oder
mehrere Mutationen tragen oder der L1-Anteil aus L1-Proteinen verschiedener Papilloma
viren zusammengesetzt sein. Gemeinsames Kennzeichen der erfindungsgemäßen L1-Proteine
ist, daß sie die Bildung von VLPs bzw. CVLPs zulassen und daß sie mindestens ein
erfindungsgemäßes T-Zell-Epitop enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das L1-Protein oder Varianten davon und das zu L1
heterologe Protein ein Fusionsprotein. Beinhaltet sind auch heterologe Proteine, die aus
mehreren verschiedenen Proteinen oder Teilen davon zusammengesetzt sind. Dies können
beispielsweise auch Epitope, insbesondere zytotoxische T-Zellepitope von Proteinen sein.
Epitope im Sinne der Erfindung können dabei auch Teil eines synthetischen Polypeptids mit
einer Länge von ca. 50 Aminosäuren, vorzugsweise von mindestens ca. 35 Aminosäuren,
insbesondere von mindestens ca. 20 Aminosäuren und in besonders bevorzugter Weise von
mindestens ca. 9 Aminosäuren sein.
Bevorzugt sind zu L1 heterologe Proteine, die von einem viralen Protein abgeleitet sind,
beispielsweise abgeleitet von HIV, HBV oder HCV, vorzugsweise von Papillomaviren,
insbesondere von humanen Papillomaviren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist dies ein E-Protein eines Papillomavirus,
vorzugsweise ein E6- und/oder E7-Protein. Insbesondere ist bevorzugt, wenn das E-Protein
ein deletiertes E-Protein ist, vorzugsweise ein C-terminal deletiertes, insbesondere ein C-
terminal deletiertes E7-Protein, da diese Konstrukte in Verbindung mit deletiertem L1-Protein
bevorzugt virus-ähnliche Partikel ausbilden können. Insbesondere bevorzugt sind Deletionen
bis zu 55 Aminosäuren, vorzugsweise ca. 5 bis ca. 55 Aminosäuren, insbesondere ca. 38 bis
ca. 55 Aminosäuren.
In einer weiteren Ausführung kann das zu L1 heterologe Protein von Antigenen nicht viraler
Erreger abstammen. Ebenso können sie von Autoimmunantigenen wie z. B. Thyroglobulin,
Myelin basic protein oder Zona Pellucida Glycoprotein 3 (ZP3), die mit bestimmten
Autoimmunkrankheiten wie z. B. Thyroiditis, Multiple Sklerose, Oophoritis oder
rheumatoider Arthritis assoziiert sind, abgeleitet sein. In einer bevorzugten Ausführung
stammt das zu L1 heterologe Protein von Tumorantigenen ab, vorzugsweise Melanomaanti
genen wie MART, Ovarialcarcinomantigenen wie Her2 neu (c-erbB2), BCRA-1 oder CA125,
Coloncarcinomantigenen wie CA125 oder Mammacarcinomantigenen wie Her2 neu (c-erb82),
BCRA-1, BCRA-2.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Verfahren zum in vitro Nachweis der
Aktivierung von T-Zellen, die durch Präparation aus Proben gewonnen werden. Dieses
Verfahren erlaubt es zu bestimmen, ob in einer Probe, beispielsweise einer Blutprobe eines
Patienten oder in Tumoren oder Lymphknoten eines Tumorpatienten, Papillomavirus L1-
Protein-spezifische zytotoxische T-Zellen vorhanden sind. Ein derartiges Nachweisverfahren
enthält die folgenden Schritte:
- 1. In einem ersten Schritt werden Zellen gewonnen, beispielsweise durch Blutabnahme von einem Patienten oder durch die Präparation zum Beispiel von Tumoren oder Lymphknoten. Anschließend werden die Zellen in Wachstumsmedium aufgenommen und kultiviert.
- 2. In einem zweiten Schritt werden Zellen mit mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell- Epitop präsentiert oder mit mindestens einem Komplex, der als eine Komponente eine Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitope umfaßt, inkubiert.
- 3. In einem dritten Schritt erfolgt die Bestimmung der Aktivierung von T-Zellen. Hierfür geeignete Verfahren sind beispielsweise der Nachweis der Produktion oder Sekretion von Cytokinen durch die T-Zellen, der Expression von Oberflächenmolekülen auf T- Zellen, der Lyse von Zielzellen oder der Proliferation von Zellen. Hierfür geeignete Methoden sind beispielsweise ein Cytokinassay (Chapter 6.2 bis 6.24 in Current Protocols in Immunology (1999), edited by Coligan J. E., Kruisbeek A. M., Margulies D. H., Shevach E. M. and Strober W., John Wiley & Sons), ELISPOT (Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra), ein 51Cr-Freisetzungstest (Chapter 3.11 in Current Protocols in Immunology, supra) oder der Nachweis der Proliferation (Chapter 3.12 in Current Protocols in Immunology, supra). Je nach verwendeter Methode kann dabei auch zwischen den Immunzellen wie zytotoxischen T-Zellen, T-Helferzellen, B- Zellen, NK-Zellen und anderen Zellen unterschieden werden. Die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen, Komplexen, und/oder Zellen die erfindungsgemäße Markierungen enthalten erlaubt die Detektion von T-Zellen, die das T-Zell-Epitop erkennen über den Nachweis der Bindung markierter Verbindungen, Komplexe, und/oder Zellen an die T-Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bindung erfindungsgemäßer MHC-Polypeptid-Komplexe an die Oberfläche der T- Zellen nachgewiesen. Dies kann derart durchgeführt werden, daß die MHC-Komplexe selbst markiert, beispielsweise fluoreszenzmarkiert sind, oder daß man in einem weiteren Schritt einen MHC-spezifischen, markierten, beispielsweise fluoreszenzmarkierten Antikörper verwendet, um wiederum die MHC-Komplexe nachzuweisen. Die Fluoreszenzmarkierung der T-Zellen läßt sich dann beispielsweise in einem "Fluorescens Activated Cell Sorter" (FACS) messen und auswerten. Eine andere Möglichkeit zum Nachweis der Bindung von den Komplexen an die T-Zellen ist erneut die Messung der Aktivierung von T-Zellen (Cytokinassay, Elispot, 51Cr- Freisetzungstest, Proliferation, siehe oben). Allerdings benötigt man hierfür die gleichzeitige Stimulation von Korezeptoren (z. B. CD28), beispielsweise durch Korezeptor-spezifische Antikörper (Anti-CD28) und/oder andere unspezifische Aktivatoren (IL-2).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren, das einen zusätzlichen Schritt
a') enthält, der nach Schritt a") eingeführt wird.
- 1. In diesem zusätzlichen dem Schritt a") nachfolgenden Schritt a') werden die isolierten
oder kultivierten Zellen mit mindestens einer Zielzelle beladen mit einer
erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einem
erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einem
Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens
einem CVLP und/oder mindestens einem Virus, mit mindestens einem
erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, und/oder mindestens einer
Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert, für mindestens ca. 8 Wochen, insbesondere
für mindestens ca. 1 Woche cokultiviert, bevor sich Schritt b) anschließt.
Unter Cokultivierung ist das Wachstum der Zellen:- a) in Gegenwart von mindestens einer Zielzelle beladen mit einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP, und/oder mindestens einem Virus,
- b) in Gegenwart mindestens eines erfindungsgemäßen Komplexes enthaltend ein T-Zell-Epitop,
- c) in Gegenwart mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert,
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testsystem (Kit) zum in vitro Nachweis der
Aktivierung von T-Zellen enthaltend:
- a) mindestens ein erfindungsgemäßes T-Zell-Epitop, mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor, mindestens eine erfindungsgemäße Zelle, und/oder mindestens einen erfindungsgemäßen Komplex, und
- b) Effektorzellen des Immunsystems, vorzugsweise T-Zellen, insbesondere zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen.
Das Testsystem wird in einer besonderen Ausführungsform zur Bestimmung der,
beispielsweise in einer Blutprobe eines Patienten oder in Tumoren oder Lymphknoten eines
Tumorpatienten vorhandenen L1-Protein-spezifischen zytotoxischen T-Zellen verwendet. In
diesem Fall sind die in b) beschriebenen Zellen im Testsystem enthaltene Kontrollzellen,
deren Aktivierung durch die erste Kitkomponente, die unter a) genannten Substanzen, als
Standard dient. Die in dieser Reaktion beobachteten Aktivierung wird mit die T-Zell-
Aktivierung von aus Patienten isolierten Zellen durch die Kitkomponente a) verglichen.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform wird das Testsystem beispielsweise zur
Bestimmung der L1-Protein-spezifischen Antigenität einer Verbindung enthaltend ein T-Zell-
Epitop, eines Komplexes enthaltend ein T-Zell-Epitop, eines Capsomers, eines stabilen
Capsomers, eines VLPs, eines CVLPs, und/oder eines Virus verwendet. In diesem Fall sind
die in a) beschriebenen Substanzen Kontrollsubstanzen deren aktivierende Wirkung auf die
zweite Kitkomponente, die unter b) genannten Zellen, als Standard dient. Die in dieser
Reaktion beobachteten Aktivierung wird mit der aktivierenden Wirkung einer Verbindung
enthaltend ein T-Zell-Epitop, einem Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, einem Capsomer,
einem stabilen Capsomer, einem VLP, ein CVLP, und/oder einem Virus auf die
Kitkomponente b) verglichen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von mindestens einem T-Zell-
Epitop, mindestens einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop,
mindestens einem erfindungsgemäßen Vektor enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für
eine ein T-Zell-Epitop enthaltende Verbindung, mindestens einer erfindungsgemäßen Zelle
enthaltend ein T-Zell-Epitop zur, und/oder mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex
enthaltend ein T-Zell-Epitop zur Auslösung oder zum Nachweis einer Immunantwort.
Zur Stimulation von Immunzellen in vitro wie in vivo eignen sich insbesondere Zellen, die
mindestens eines der erfindungsgemäßen Moleküle über ihre MHC-Klasse I-Moleküle
präsentieren. Zur Antigen-Präsentation geeignete Zellen sind z. B. B-Zellen, dendritische
Zellen, Macrophagen, Fibroblasten oder andere HLA A2.01 positive Zellen, die durch eine
gemeinsame Kultivierung mit Immunzellen eine Stimulation von spezifischen T-Zellen
erreichen können.
In einer besonderen Ausführungsform kann eine erfindungsgemäße Verbindung
beispielsweise ein HPV18 L1E7-Fusionsprotein, das zusätzlich ein erfindungsgemäßes T-
Zell-Epitop enthält, zur Detektion einer Immunantwort eingesetzt werden. Eine solche
erfindungsgemäße Verbindung kann die Fähigkeit zur Bildung von CVLPs besitzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel oder Diagnostikum enthaltend
mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens
einen Vektor enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für eine ein T-Zell-Epitop enthaltende
Verbindung, mindestens eine erfindungsgemäße Zelle enthaltend ein T-Zell-Epitop, und/oder
mindestens einen erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop und
gegebenenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Beispiele von dem Fachmann bekannten Trägern sind Glas, Polystyren, Polypropylen,
Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylase, natürliche oder modifizierte Zellulose,
Polyacrylamide, Agarose, Aluminiumhydroxid oder Magnitid.
Ein erfindungsgemäßes Arzneimittel oder Diagnostikum kann in Lösung vorliegen, an eine
feste Matrix gebunden sein, und/oder mit einem Adjuvans versetzt sein.
Das Arzneimittel oder Diagnostikum kann auf verschiedene Weisen verabreicht werden.
Beispiele von dem Fachmann bekannten Verabreichungsformen sind parenterale, lokale
und/oder systemische Applikation durch z. B. orale, intranasale, intravenöse, intramuskuläre,
und/oder topische Applikation. Die bevorzugte Applikationsform wird beispielsweise durch
den natürlichen Infektionsweg der jeweiligen Papillomavirusinfektion beeinflußt. Die
verabreichte Menge richtet sich nach Alter, Gewicht, allgemeinem Gesundheitszustand des
Patienten und dem Typ der Papillomavirusinfektion. Das Arzneimittel oder Diagnostikum
kann in Form von Kapseln, Lösung, Suspension, Elixier (für orale Applikation) oder sterile
Lösungen bzw. Suspensionen (für parenterale oder intranasale Applikation) verabreicht
werden. Als inerter und immunologisch akzeptabler Träger kann beispielsweise Salzlösung
oder phosphatgepufferte Salzlösung verwendet werden. Das Arzneimittel wird in
therapeutisch effektiven Mengen verabreicht. Das bedeutet Mengen, die ausreichend sind, um
eine schützende immunologische Antwort hervorzurufen.
In einer besonderen Ausführungsform kann eine erfindungsgemäße Verbindung
beispielsweise ein HPV18 LIE7-Fusionsprotein, das zusätzlich ein erfindungsgemäßes T-
Zell-Epitop enthält, als Arzneimittel oder Diagnostikum eingesetzt werden. Eine solche
erfindungsgemäße Verbindung kann die Fähigkeit zur Bildung von CVLPs besitzen.
Die Figuren und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu
beschränken.
Fig. 1 zeigt die graphische Auswertung der MTT-Färbung von WEHI-Zellysaten, gemessen
als Absorption bei 595 nm, die mit Überständen von T-Zellen inkubiert worden waren, die
wiederum durch unterschiedliche Antigen-präsentierende periphere Blutlymphozyten (PBL)
stimuliert worden waren. Durch spezifische Antigen-präsentierende PBL stimulierte T-Zellen
sekretieren TNFα. Dieses induziert bei WEHI-Zellen Apoptose, so daß diese Zellen MTT
nicht mehr zu einem bräunlichen Farbstoff prozessieren können. Niedrige Absorption
bedeutet geringe Farbstoffproduktion und somit viele apoptotische Zellen, die somit viel
TNFα ausgesetzt waren, so daß die zugehörigen T-Zellen stimuliert worden waren. Somit ist
die Stimulation der T-Zellen umso besser, je niedriger die Absorption für ein bestimmtes
Antigen bei 595 nm ist.
Fig. 2 zeigt die graphische Auswertung der Fluoreszenz von T2-Zellen - gemessen in einer
FACS-Analyse -, deren auf der Zelloberfläche befindliche MHC-1 Moleküle durch einen
FITC-markierten Antikörper markiert worden waren. Zellen, deren MHC-1 Moleküle
spezifisch die auf der X-Achse aufgetragenen Peptide binden können, haben vermehrt MHC-1
Moleküle, da die spezifische Bindung die MHC-Komplexe stabilisiert, so daß sie sich auf der
Zelloberfläche anreichern können.
Fig. 3 zeigt die Auswertung von drei FACScan-Experimenten nach Restimulation CVLP
spezifischer humaner T-Zellen mit peripheren Blutmononukleären Zellen (PBMC), die
unterschiedliche Antigene präsentieren. Von links nach rechts ist jeweils der Gehalt an CD3
aufgetragen, das für T-Zellen spezifisch ist, und von unten nach oben der Gehalt an humanem
Interferon γ, das für aktivierte Zellen spezifisch ist.
- - Die Herstellung von HPV16 L1Δ C*E71-55 CVLPs erfolgte gemäß der deutschen Patent anmeldung DE 198 12 941, siehe auch Müller M. et al. ( 1997) Virology 234, 93-111.
- - Die Herstellung von L1 VLP's erfolgte gemäß Müller M. et al. (1997) Virology 234, 93-111 .
- - T2 Zellen, die unter der ATCC Nummer: CRL-1992 zu beziehen sind, weisen einen Defekt im Antigenprozessierungs-assoziierten Transport auf, der zur Unterbindung der Beladung von MHC-1 Molekülen im endoplasmatischen Retikulum führt. Die dennoch auf der Zelloberfläche vorhandenen unbeladenen MHC-1 Moleküle können beispielsweise durch Inkubation der Zellen in Peptid-haltigen Medien beladen werden, so daß sich diese Zellen sehr gut zur Präsentation eines Antigens eignen.
- - WEHI Zellen sind unter der ATCC Nummer CRL-2148 zu beziehen.
- - PMBC bedeutet periphere Blutmononukleäre Zellen, deren Isolierung wird beispielsweise in Rudolf M. P. et al. ( 1999), Biol. Chem. 380, 335-40 beschrieben.
- - BB7.2 bedeute ein α-HLA A2.01-spezifischer monoklonaler Maus Antikörper (ATCC HB-82).
- - α-hum CD28 bedeutet ein monoklonaler Maus-Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil von humanem CD28 gerichtet ist.
- - α-hum CD3/PE bedeutet ein monoklonaler Maus Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil von humanem CD3 (ε) gerichtet ist und den Fluoreszensmarker Phycoerithrin enthält (Medac, Hamburg, Deutschland).
- - α-hum CD4/Cychrome bedeutet ein monoklonaler Maus-Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil von humanen CD4 gerichtet ist und den Fluoreszensmarker Cychrome enthält (DAKO; Glostrup, Dänemark).
- - α-hum Interferon γ/FITC bedeutet einen monoklonaler Ratten-Antikörper, der gegen humanes Interferon γ gerichtet ist und den Fluoreszensmarker FITC enthält (Medac, Hamburg, Deutschland).
- - InfluenzaMP bedeutet Aminosäuren 58-66 GILGFVFTL des Influenza Matrix Protein (siehe Dunbar P. R. et al. (1998) Curr. Biol. 26, 413-6).
- - HPV16E7-Peptid bedeutet Aminosäuren 11-20 YMLDLQPETT des humanen Papillomavirus E7-Proteins.
- - Die verwendeten Peptide, die in den nachfolgenden Beispielen verwendet wurden, sind
von der HPV16 L1-Sequenz abgeleitet, die Aminosäurepositionen des jeweiligen
Fragments ist relativ zum Met (+1), der unter Genbank Zugangsnummer: g333037
hinterlegten Sequenz, angegebenen:
- - Golgi Plug ist durch Pharmingen (Hamburg, Deutschland) erhältlich.
- - IL-2 wurde von Becton Dickinson (Hamburg, Deutschland) bezogen.
- - MTT-Lösung in PBS bedeutet 2,5 mg/ml 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazoliumbromid in PBS (Sigma, Deisenhofen, Deutschland).
- - PBS bedeutet "phosphosphate buferered sahne" und besteht aus 16,6 mM Na2HPO4 8,4 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl pH 7,4.
- - Zellen wurden jeweils bei 37°C und 5% CO2 in RPMI-Medium (Gibco BRL, Eggenstein; Deutschland) mit 10% fötalem Kälberserum, Kanamycin und Ampicillin kultiviert.
- - FACScan calibur bedeutet "fluorescens activated cell sorter" die Apparatur wurde von Becton Dickenson (Hamburg, Deutschland) bezogen.
- - Cellquest Software wurde von Becton Dickinson (Hamburg, Deutschland) bezogen.
- a) Herstellung CVLP-spezifischer T-Zellen
Humane T-Zellen (4 × 105) wurden für 8 Wochen mit HPV16 L1Δ C*E71-55 CVLPs bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 µg/ml CVLPs, 105 bestrahlten periphere Blutmononukleäre Zellen (PMBC) und 10 IU/ml IL-2 stimuliert und geerntet. - b) Stimulation mit Antigenen
Die Zellen wurden über Nacht in 100 µl Medium bei 37°C mit unterschiedlichen Antigenen (PMBC + E7-Peptid; PMBC + HPV16 L1Δ C*E71-55 (CVLP); PMBC + 5104, 5105, 5106, 5107, 5108, 5109, 5112, 5113 je 10 µg/ml) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL-2 stimuliert. Während dieser Zeit produzieren stimulierte Zellen TNFα. - c) TNFα-Nachweis
Am nächsten Tag wurden 50 µl Überstand entnommen, eingefroren, wieder aufgetaut (um evtl. mitgenommene Zellen abzutöten) und zu 50 µl einer Zellsuspension gegeben, die 0,9 × 106 WEHI-Zellen, 2 µg/ml Actinomycin D und 400 mM LiCl enthielt. Die Zellen wurden für 24 h bei 37°C inkubiert. Während dieser Zeit leitet TNFα (sofern im Überstand enthalten) Apoptose der WEHI-Zellen ein. Durch Zugabe von 50 µl einer 2,5 mg/ml MTT-Lösung in PBS wurden innerhalb von 3 Stunden nicht apoptotische Zellen braun angefärbt, apoptotische Zellen hingegen blieben gelb. Sämtliche Zellen wurden durch Zugabe von 100 µl Lysis-Puffer (34% N,N dimethylformamide, 20% sodium dodecyl sulfate) und eine Inkubation für mindestens 6 Stunden bei 37° lysiert, so daß die Farbstoffe freigesetzt wurden. Abschließend wurde die Absorption der Lösung bei 595 nm gemessen.
Fig. 1 zeigt die unterschiedlichen Antigene aufgetragen gegen die gemessene Absorption bei
595 nm. Niedrige Absorption bedeutet geringe Farbstoffproduktion und somit viele
apoptotische Zellen, die somit viel TNFα ausgesetzt waren, so daß die zugehörigen T-Zellen
stimuliert worden waren. Somit war die Stimulation der T-Zellen umso besser, je niedriger
die Absorption bei 595 nm ist.
Ergebnis: Die Peptide 5104, 5106, S 107, 5108, 5109 und 5112 waren in der Lage, CVLP- spezifische T-Zellen zu stimulieren.
Ergebnis: Die Peptide 5104, 5106, S 107, 5108, 5109 und 5112 waren in der Lage, CVLP- spezifische T-Zellen zu stimulieren.
- a) Beladung der T2-Zellen
2,5 × 106 T2-Zellen wurden in Medium enthaltend 2% humanes Serum über Nacht in Anwesenheit von 0, 10 oder 100 µg/ml 5105, 5106, 5107, 5109, 5112, 5113, InfluenzaMP, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020, 2021, 2022, 2023, 2024, 2025 Peptid bei 37°C inkubiert. Während dieser Zeit können passende Peptide an die unphysiologisch leeren MHC-1 Moleküle binden und diese somit stabilisieren, wohingegen MHC-1 Moleküle ohne passende Peptide relativ schnell wieder in die Zelle aufgenommen werden. Somit erhöhen spezifisch bindende Peptide die Anzahl der MHC-1 Moleküle auf der Zelloberfläche. - b) Nachweis der Peptidbindung an MHC-1 Komplexe der T2-Zellen
Am nächsten Morgen wurden die Zellen geerntet, mit PBS enthaltend 0,5% bovines Serumalbumin (BSA) gewaschen und die MHC-1 Moleküle nachgewiesen. Dies erfolgt durch die Inkubation für 30 min auf Eis mit dem Antikörper BB7.2, Waschen und Färbung mit einem α-Maus FITC-Antikörper für weitere 30 min auf Eis. Die Zellen wurden erneut gewaschen, in einem FACScan calibur gemessen und mit Cellquest Software analysiert.
Fig. 2 zeigt die verschiedenen Peptide aufgetragen gegen die gemessene Fluoreszenz.
Ergebnis: T2-Zellen nach Inkubation mit den L1-Peptiden 5106, 5107, 5109, 5112, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020 und 2022 zeigen wie nach Inkubation mit dem bekannten Influenza- Peptid MP deutlich mehr MHC-Moleküle auf der Zelloberfläche, was auf eine Bindung der entsprechenden Peptide an die MHC-Moleküle hindeutet.
Ergebnis: T2-Zellen nach Inkubation mit den L1-Peptiden 5106, 5107, 5109, 5112, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020 und 2022 zeigen wie nach Inkubation mit dem bekannten Influenza- Peptid MP deutlich mehr MHC-Moleküle auf der Zelloberfläche, was auf eine Bindung der entsprechenden Peptide an die MHC-Moleküle hindeutet.
Humane T-Zellen (4 × 105) wurden für 8 Wochen mit HPV16 L1 Δ C*E71-55 CVLPs bei 37°C
unter wöchentlicher Zugabe von 1 µg/ml CVLPs sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen
(bestrahlte PMBC) stimuliert und geerntet. Anschließend wurden die Zellen in 100 µl
Medium bei 37°C mit 10 µg/ml verschiedener Antigene in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2
und 0,5 µg/ml α-human CD28 restimuliert:
- a) über Nacht mit CVLP-inkubierten PBMC
- b) über Nacht mit L1 2022-Peptid inkubierten PBMC
- c) über Nacht mit L1 2025-Peptid (Kontroll-Peptid) inkubierten PBMC
Nach einer Stunde wurde 1 µl Golgi Plug zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5
Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit
α-hum CD3/PE, mit α-hum CD4/Cychrome und mit α-hum Interferon γ/FITC gefärbt. Die
Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die
Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 3 zeigt, daß die CVLP-inkubierten PBMC wie auch die mit dem L1-Peptid 2022-inkubierten PBMC eine Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen bewirkten, nicht aber die mit dem Kontroll-Peptid inkubierten PBMC.
Ergebnis: Fig. 3 zeigt, daß die CVLP-inkubierten PBMC wie auch die mit dem L1-Peptid 2022-inkubierten PBMC eine Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen bewirkten, nicht aber die mit dem Kontroll-Peptid inkubierten PBMC.
Claims (27)
1. T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz ILVPKVSGL, RLVWACVGV,
HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL,
NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV,
und/oder eine funktionell aktive Variante davon.
2. T-Zell-Epitop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Variante
eine Sequenzhomologie zu ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV,
YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT,
TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL oder ICWGNQLFV von mindestens
ca. 65%, vorzugsweise mindestens ca. 75% und insbesondere mindestens ca. 85% auf
Aminosäureebene besitzt.
3. T-Zell-Epitop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Variante
eine strukturelle Homologie zu ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV,
YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT,
TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL oder ICWGNQLFV hat.
4. T-Zell-Epitop nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das T-
Zell-Epitop ein zytotoxisches T-Zell-Epitop ist.
5. Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die
Verbindung kein natürlich vorkommendes L1 Protein eines Papillomavirus und keine
ausschließlich N-terminale oder ausschließlich C-terminale Deletionsmutante eines
natürlich vorkommenden L1 Proteins eines Papillomavirus ist.
6. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ein
Polypeptid, insbesondere ein Fusionsprotein ist.
7. Verbindung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ein
Polypeptid von mindestens ca. 50 Aminosäuren, vorzugsweise von mindestens ca. 35
Aminosäuren, insbesondere von mindestens ca. 20 Aminosäuren und in besonders
bevorzugter Weise von mindestens ca. 9-13 Aminosäuren Länge ist.
8. Verbindung nach einem der Ansprüche 5-7, dadurch gekennzeichnet, daß die
Verbindung eine chemische, radioaktive, nicht radioaktive Isotopen und/oder
Fluoreszenzmarkierung des T-Zell-Epitops und/oder des genannten Fusionsproteins,
und/oder eine chemische Modifikation des T-Zell-Epitops und/oder Fusionsproteins
enthält.
9. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein T-Zell-Epitop oder eine
Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 5-8 kodiert.
10. Vektor, insbesondere ein Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine
Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 enthält.
11. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein T-Zell-Epitop gemäß einem der
Ansprüche 5-8 enthält, vorzugsweise präsentiert.
12. Zelle nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle mit einer
Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 und/oder einem Vektor gemäß Anspruch 10
transfiziert, transformiert, und/oder infiziert ist.
13. Zelle nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle mit mindestens einer
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8 und/oder mindestens einem Komplex
gemäß einem der Ansprüche 15-17 enthaltend ein T-Zell-Epitop gemäß einem der
Ansprüche 5-8, inkubiert wurde.
14. Zelle nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine B-Zelle,
ein Makrophage, eine dendritische Zelle, ein Fibroblast, insbesondere eine JY-, T2-,
CaSki-Zelle oder EBV-transformierte Zelle ist.
15. Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4 oder eine
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8 und mindestens eine weitere
Verbindung.
16. Komplex nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex mindestens
ein MHC-Klasse I-Molekül, vorzugsweise als HLA A2.01 Tetramer enthält.
17. Komplex nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte MHC-Klasse-
I-Molekül ein humanes MHC-Klasse-I-Molekül, insbesondere ein HLA A2.01 Molekül
ist.
18. Verfahren zum in vitro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen durch mindestens eine
Verbindung, enthaltend ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4, das
folgende Schritte enthält:
- a) Stimulation von Zellen mit mindestens einer genannten Verbindung;
- b) Zugabe von mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4 präsentiert oder eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 15-17, und
- c) Bestimmung der Aktivierung von T-Zellen.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Schritt a)
folgenden zusätzlichen Schritt a') enthält:
- 1. Cokultivierung der Zellen für mindestens ca. 1 Woche, insbesondere mindestens
ca. 8 Wochen mit:
- a) mindestens einer Zielzelle beladen mit einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens einem Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP, und/oder mindestens einem Virus,
- b) mindestens einem Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17,
- c) und/oder mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4 präsentiert,
20. Verfahren zur Herstellung einer Zielzelle nach einem der Ansprüche 11, 13, 14, 18
oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzelle mit mindestens einer Verbindung
gemäß einem der Ansprüche 5-8 und/oder mindestens einem Komplex gemäß einem
der Ansprüche 15-17 enthaltend ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 5-8,
inkubiert wird.
21. Verfahren zur Herstellung einer Zielzelle nach einem der Ansprüche 11, 12, 14, 18
oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzellen mit einer Nukleinsäure gemäß
Anspruch 9 und/oder einem Vektor gemäß Anspruch 10 transfiziert, transformiert
und/oder infiziert wird.
22. Verfahren zur Herstellung einer Zielzelle nach Anspruch 20 oder 21, dadurch
gekennzeichnet, daß die Zielzelle eine B-Zelle, ein Makrophage, eine dendritische
Zelle, ein Fibroblast, insbesondere eine JY-, T2-, CaSki-Zelle oder EBV-
transformierte Zelle ist.
23. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle von
Schritt a) folgender Schritt a") durchgeführt wird:
- 1. Gewinnung und Präparation von Proben enthaltend T-Zellen und anschließende Kultivierung.
24. Testsystem zum in vitro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen enthaltend:
- a) mindestens ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4, mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 10, mindestens eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 11-14, und/oder mindestens einen Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17, und
- b) Effektorzellen des Immunsystems, vorzugsweise T-Zellen, insbesondere zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen.
25. Verwendung mindestes eines T-Zell-Epitops gemäß einem der Ansprüche 1-4,
mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens eines
Vektors gemäß Anspruch 10, mindestens einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 11-14,
und/oder mindestens eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 15-17 zur
Auslösung oder zum Nachweis einer Immunantwort.
26. Arzneimittel oder Diagnostikum enthaltend mindestens eine Verbindung gemäß einem
der Ansprüche 5-8, mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 10, mindestens eine
Zelle gemäß einem der Ansprüche 11-14, und/oder mindestens einen Komplex gemäß
einem der Ansprüche 15-17 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen
Träger.
27. Arzneimittel oder Diagnostikum nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß
mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens ein Vektor
gemäß Anspruch 10, mindestens eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 11-14,
und/oder mindestens ein Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17 in Lösung
vorliegt, an eine feste Matrix gebunden ist, und/oder mit einem Adjuvans versetzt ist.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19925199A DE19925199A1 (de) | 1999-06-01 | 1999-06-01 | Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie |
| JP2001500659A JP2003502027A (ja) | 1999-06-01 | 2000-05-31 | パピローマウイルスｌ１タンパク質の細胞傷害性ｔ細胞エピトープ、並びに診断法および療法におけるその使用 |
| CA002375802A CA2375802A1 (en) | 1999-06-01 | 2000-05-31 | Cytotoxic t-cell epitopes of the papilloma virus l1-protein and use thereof in diagnosis and therapy |
| AU55275/00A AU5527500A (en) | 1999-06-01 | 2000-05-31 | Cytotoxic t-cell epitopes of the papilloma virus l1-protein and use thereof in diagnosis and therapy |
| PCT/EP2000/005006 WO2000073335A1 (de) | 1999-06-01 | 2000-05-31 | Zytotoxische t-zellepitope des papillomavirus l1-proteins und ihre verwendung in diagnostik und therapie |
| US09/980,177 US6838084B1 (en) | 1999-06-01 | 2000-05-31 | Cytotoxic T-cell epitopes of the papilloma virus l1-protein and use thereof in diagnosis and therapy |
| EP00940295A EP1181312A1 (de) | 1999-06-01 | 2000-05-31 | Zytotoxische t-zellepitope des papillomavirus l1-proteins und ihre verwendung in diagnostik und therapie |
| US10/890,526 US20040258708A1 (en) | 1999-06-01 | 2004-07-13 | Cytotoxic T-cell epitopes of papillomavirus L1 protein and their use in diagnostics and therapy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19925199A DE19925199A1 (de) | 1999-06-01 | 1999-06-01 | Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19925199A1 true DE19925199A1 (de) | 2000-12-07 |
Family
ID=7909963
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19925199A Withdrawn DE19925199A1 (de) | 1999-06-01 | 1999-06-01 | Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6838084B1 (de) |
| EP (1) | EP1181312A1 (de) |
| JP (1) | JP2003502027A (de) |
| AU (1) | AU5527500A (de) |
| CA (1) | CA2375802A1 (de) |
| DE (1) | DE19925199A1 (de) |
| WO (1) | WO2000073335A1 (de) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002004007A2 (en) * | 2000-07-06 | 2002-01-17 | Georgetown University | Stable (fixed) forms of viral capsid proteins, fusion proteins and uses thereof |
| DE10059631A1 (de) * | 2000-12-01 | 2002-07-18 | Medigene Ag | T-Zellepitope des Papillomavirus L1-und E7-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie |
| DE10137102A1 (de) * | 2001-07-30 | 2003-02-27 | Deutsches Krebsforsch | Polyvalente Vakzine gegen durch Papillomaviren verursachte Erkrankungen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL105554A (en) * | 1992-05-05 | 1999-08-17 | Univ Leiden | Peptides of human papillomavirus for use in preparations elicit a human T cell response |
| FR2828934B1 (fr) * | 2001-08-27 | 2004-08-13 | Inst Nat Sante Rech Med | Test de l'immunite cellulaire par des peptides fixes sur support solide |
| KR101278077B1 (ko) * | 2004-05-11 | 2013-07-09 | 압제노믹스 코오페라티에프 유.에이. | Ｔ 세포 사멸 유도성 에피토프 |
| CN1328287C (zh) * | 2005-12-29 | 2007-07-25 | 西安交通大学 | Hpv16 l1蛋白模拟肽及其用于制备hpv16诊断试剂和疫苗的用途 |
| EP2012122A1 (de) | 2007-07-06 | 2009-01-07 | Medigene AG | Strukturproteine von mutierten Parvoviren als Impfstoffe |
| AR082925A1 (es) | 2010-09-08 | 2013-01-16 | Medigene Ag | Proteinas estructurales mutadas por parvovirus con epitopo de celulas b de proteccion cruzada, producto y metodos relacionados |
| CN104274827B (zh) * | 2013-07-01 | 2020-07-14 | 上海贺普药业股份有限公司 | 贺普拉肽的制剂 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0375555A1 (de) * | 1988-12-23 | 1990-06-27 | Medgenix Group, S.A. | Peptide, Antikörper gegen diese Peptide, und Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung des Papillom-Virus VP 16 |
| EP0451550A2 (de) * | 1990-03-20 | 1991-10-16 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Seroreaktive Epitope von den Proteinen 16 des menschlichen Papillomavirus (HPV) |
| WO1993002184A1 (en) * | 1991-07-19 | 1993-02-04 | The University Of Queensland | Papilloma virus vaccine |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4777239A (en) | 1986-07-10 | 1988-10-11 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Diagnostic peptides of human papilloma virus |
| SE8803870D0 (sv) * | 1988-10-28 | 1988-10-28 | Medscand Ab | Method for detection of human papillomavirus (hpv) for diagnostic purposes |
| DE3907721A1 (de) | 1989-03-10 | 1990-09-20 | Behringwerke Ag | Immunogene regionen auf dem e7-protein des humanen papillomvierus typ 16 |
| SE9001705D0 (sv) | 1990-05-11 | 1990-05-11 | Medscand Ab | Saett foer diagnostik av virusbaerande tumoerer genom immunoassay |
| CN1067382A (zh) | 1990-09-26 | 1992-12-30 | 布里斯托尔-迈尔斯斯奎尔公司 | 人类乳头状瘤病毒肽的表达以及在致免疫组合物中的应用 |
| DE69131992T2 (de) * | 1990-12-12 | 2000-06-29 | Csl Ltd., Parkville | Papillomavirusuntereinheit-impfstoff |
| DE4143467C2 (de) | 1991-05-17 | 1995-02-09 | Max Planck Gesellschaft | Peptidmotiv und dessen Verwendung |
| ATE234860T1 (de) | 1991-07-13 | 2003-04-15 | Dade Behring Marburg Gmbh | Verwendung von hpv-16 e6 und e7-gen gewonnen peptiden für den diagnostischen zweck |
| GB9207701D0 (en) | 1992-04-08 | 1992-05-27 | Cancer Res Campaign Tech | Papillomavirus e7 protein |
| IL105554A (en) | 1992-05-05 | 1999-08-17 | Univ Leiden | Peptides of human papillomavirus for use in preparations elicit a human T cell response |
| US5662907A (en) | 1992-08-07 | 1997-09-02 | Cytel Corporation | Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in humans using synthetic peptide epitopes |
| US5437951A (en) | 1992-09-03 | 1995-08-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins |
| DE69434383T2 (de) | 1993-03-09 | 2005-11-24 | The University Of Rochester | Herstellung von menschlichem papillomavirus hüllprotein und virus-ähnlichen teilchen |
| GB2279651A (en) | 1993-07-01 | 1995-01-11 | British Tech Group | Synthetic peptides of human papillomavirus |
| GB9313556D0 (en) | 1993-07-01 | 1993-08-18 | British Tech Group | Synthetic peptides of human papillomavirus |
| CN1112933A (zh) | 1994-01-20 | 1995-12-06 | 伯伦格·曼海姆有限公司 | 抗原特异性活化t淋巴细胞，其检测和用途 |
| DE4415743C2 (de) | 1994-05-04 | 1996-10-10 | Deutsches Krebsforsch | Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen |
| DE122007000092I1 (de) | 1994-10-07 | 2008-03-27 | Univ Loyola Chicago | Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung |
| SE9501512D0 (sv) * | 1995-04-24 | 1995-04-24 | Euro Diagnostica Ab | Synthetic peptide-defined eptopes useful for vaccination against papillomavirus |
| DE19631357A1 (de) * | 1996-08-02 | 1998-02-05 | Deutsches Krebsforsch | Vektor zur Aktivierung des Immunsystems gegen mit Papillomviren bzw. Sequenzen davon assoziierten Zellen |
| DE19648962C1 (de) | 1996-11-26 | 1998-02-26 | Deutsches Krebsforsch | Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen |
| FR2766091A1 (fr) | 1997-07-18 | 1999-01-22 | Transgene Sa | Composition antitumorale a base de polypeptide immunogene de localisation cellulaire modifiee |
| US6228368B1 (en) * | 1997-10-06 | 2001-05-08 | Loyola University Of Chicago | Papilloma virus capsomere formulations and method of use |
| US6183746B1 (en) | 1997-10-09 | 2001-02-06 | Zycos Inc. | Immunogenic peptides from the HPV E7 protein |
| CA2330824A1 (en) | 1998-06-17 | 1999-12-23 | Epimmune Inc. | Hla binding peptides and their uses |
-
1999
- 1999-06-01 DE DE19925199A patent/DE19925199A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-05-31 AU AU55275/00A patent/AU5527500A/en not_active Abandoned
- 2000-05-31 US US09/980,177 patent/US6838084B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-31 WO PCT/EP2000/005006 patent/WO2000073335A1/de not_active Application Discontinuation
- 2000-05-31 JP JP2001500659A patent/JP2003502027A/ja active Pending
- 2000-05-31 CA CA002375802A patent/CA2375802A1/en not_active Abandoned
- 2000-05-31 EP EP00940295A patent/EP1181312A1/de not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-07-13 US US10/890,526 patent/US20040258708A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0375555A1 (de) * | 1988-12-23 | 1990-06-27 | Medgenix Group, S.A. | Peptide, Antikörper gegen diese Peptide, und Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung des Papillom-Virus VP 16 |
| EP0451550A2 (de) * | 1990-03-20 | 1991-10-16 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Seroreaktive Epitope von den Proteinen 16 des menschlichen Papillomavirus (HPV) |
| WO1993002184A1 (en) * | 1991-07-19 | 1993-02-04 | The University Of Queensland | Papilloma virus vaccine |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002004007A2 (en) * | 2000-07-06 | 2002-01-17 | Georgetown University | Stable (fixed) forms of viral capsid proteins, fusion proteins and uses thereof |
| WO2002004007A3 (en) * | 2000-07-06 | 2002-04-18 | Univ Georgetown | Stable (fixed) forms of viral capsid proteins, fusion proteins and uses thereof |
| DE10059631A1 (de) * | 2000-12-01 | 2002-07-18 | Medigene Ag | T-Zellepitope des Papillomavirus L1-und E7-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie |
| DE10137102A1 (de) * | 2001-07-30 | 2003-02-27 | Deutsches Krebsforsch | Polyvalente Vakzine gegen durch Papillomaviren verursachte Erkrankungen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
| US7320861B2 (en) | 2001-07-30 | 2008-01-22 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Oeffentlichen Rechts | Polyvalent vaccine against diseases caused by papilloma viruses, method for the production and the use thereof |
| US7354714B2 (en) | 2001-07-30 | 2008-04-08 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Production and applications for polyvalent vaccines against diseases caused by papilloma viruses |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000073335A1 (de) | 2000-12-07 |
| AU5527500A (en) | 2000-12-18 |
| CA2375802A1 (en) | 2000-12-07 |
| JP2003502027A (ja) | 2003-01-21 |
| EP1181312A1 (de) | 2002-02-27 |
| US6838084B1 (en) | 2005-01-04 |
| US20040258708A1 (en) | 2004-12-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69532532T2 (de) | Chimerische papillomavirus-ahnliche partikel | |
| DE69534995T2 (de) | Varianten von antigenen des menschlichen papillomvirus | |
| DE60124918T2 (de) | Kodon-optimierte papillomavirussequenzen | |
| DE69129989T2 (de) | Arzneimittelzusammensetzung zur behandlung oder vorbeugung maligner tumore | |
| DE69929232T2 (de) | Virusähnliche partikel zur induktion von autoantikörpern | |
| DE60132770T2 (de) | Chimäre humane papillomavirus (hpv) l1 moleküle und deren verwendungen | |
| DE69333859T2 (de) | Sich selbst-zusammenbauende rekombinante hpv16 papillomavirus hüllproteine | |
| DE69529748T2 (de) | Polynukleotide vakzine gegen den papilloma virus | |
| DE69834022T2 (de) | Fusionproteine für intra- und interzelluläre transport und deren verwendungen | |
| US7097843B2 (en) | Immunogenic peptides from the HPV E7 protein | |
| JP4472724B2 (ja) | パピロマウイルス偽ウイルス及びその調製方法 | |
| DE69521331T2 (de) | Nukleinsäure-einbringungssystem | |
| EP0809700A1 (de) | Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung | |
| DE60304835T2 (de) | Ein herpes simplex virus komplex | |
| DE60126737T2 (de) | Modifizierte HPV E6- und E7-Gene und -Proteine als Impfstoff | |
| DE69131992T2 (de) | Papillomavirusuntereinheit-impfstoff | |
| DE19925199A1 (de) | Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie | |
| DE60129358T2 (de) | Genetische immunisierung gegen zervixkarzinom | |
| DE10059631A1 (de) | T-Zellepitope des Papillomavirus L1-und E7-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie | |
| DE69933875T2 (de) | Protein-verabreichungssystem, das dem menschlichen papillomavirus ähnliche partikel benützt. | |
| WO2002043757A2 (de) | Arzneimittel zur vermeidung oder behandlung von durch humanen papillomavirus-typ 18-hervorgerufenem tumor | |
| DE4447664C2 (de) | Fusionsproteine, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Anwendung | |
| DE60033690T2 (de) | Dns impfung | |
| DE69428984T2 (de) | Stimulierung der immunantwort durch virales protein | |
| EP1183367B1 (de) | Zytotoxisches t-zellepitop des papillomavirus l1-proteins und seine verwendung in diagnostik und therapie |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |