DE60126737T2

DE60126737T2 - Modifizierte HPV E6- und E7-Gene und -Proteine als Impfstoff

Info

Publication number: DE60126737T2
Application number: DE2001626737
Authority: DE
Inventors: Angel Dr. Cid-Arregui; Harald Prof. Dr. Zur Hausen
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2001-03-23
Filing date: 2001-03-23
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2021-03-24
Also published as: AU2002312774A1; DE60126737D1; MXPA03008559A; US7700114B2; WO2002081709A2; JP2004531253A; US20070190074A1; EP1243655B1; ES2284559T3; EP1243655A1; US20040171806A1; ATE354662T1; WO2002081709A3; US7201908B2; US20070196339A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA Sequenzen, die ein E6 oder E7 Fusionsprotein von HPV kodieren, wobei die DNA Sequenzen durch eine Kombination der folgenden Merkmale gekennzeichnet sind: mindestens 20 % der ursprünglichen Kodons werden durch Kodons ersetzt, die in einer Säugetierzelle zu einer erhöhten Translation führen; sie enthalten eine Mutation, die zur Erzeugung eines verkürzten, nicht funktionellen Proteins führt, und sie kodieren einen Fusionspartner, bei dem es sich um ein stark immunogenes Polypeptid handelt, das die Immunogenität des E6 oder E7 Proteins im Säugetierwirt erhöhen kann. Weiterhin betrifft die Erfindung das modifizierte E6 oder E7 Fusionsprotein, das durch die DNA Sequenzen kodiert wird, sowie Expressionsvektoren, die die DNA Sequenzen enthalten. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung mehrere Verwendungen der obigen Verbindungen, insbesondere als wirksame Impfstoffe, die zur Behandlung oder Verhinderung einer HPV Infektion oder eines Neoplasmas in Verbindung mit einer HPV Infektion nützlich sind.
Ein Karzinom des Gebärmutterhalses (Gebärmutterhalskrebs, CC) ist bei Frauen der zweithäufigste Krebs weltweit und der häufigste in Entwicklungsländern. CC entwickelt sich aus vormalignen Zwischenstufen von zunehmender Schwere, die als zervikale intraepitheliale Neoplasie (CIN) der Stufen 1–3 bekannt sind, wobei letztere in etwa 50 % der Fälle über einen Zeitraum von 1–2 Jahrzehnten zur Entwicklung eines invasiven Krebs führt. Über 11 % der weltweiten Krebsfälle bei Frauen rühren von Infektionen mit menschlichen Papillomaviren (HPV) her. Eine Infektion mit HPV des Typs 16 und 18 ist mit der Entwicklung von CIN und CC in Verbindung gebracht worden, wobei HPV Genotyp 16 der am meisten verbreitete Virus-Typ ist, der eine Infektion der Zervix verursacht. Die E6 und E7 Proteine, die von diesen HPV Typen kodiert werden, sollen durch Induzieren einer abnormalen Zellproliferation an der Pathogenese von CC beteiligt sein. Eine Expression von E6 und E7 wird durchwegs in Gewebe- und Tumorzellen von HPV-assoziierten CCs festgestellt. Weiterhin reichen die E6 und E7 Gene von HPV Typ 16 und 18 zur Transformation von Epithelzellen in der Kultur aus (zur Hausen, Biochim. Biophys. Acta 1288(2) (1996); F55–78).
Es gibt immer mehr Beweise, dass die E6 und E7 Proteine, die durch HPV Typ 16 und 18 kodiert werden, wirksame immunologische Ziele für eine Tumorabstoßung durch den Wirt sein können. Es werden Anstrengungen unternommen, um wirksame vorbeugende und therapeutische Impfstoffe zu entwickeln, die zur Behandlung und Vorbeugung eines mit HPV in Verbindung stehenden Neoplasmas nützlich sind. Die unterschiedlichen Strategien, die bisher zur Induzierung von Immunreaktionen auf HPV Proteine des Typs 16 und 18 verwendet werden, sind: (a) Verwendung von synthetischen antigenen Peptiden, (b) Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen (rekombinantes Bacillus Calmette-Guerin; BCG), (c) Verwendung von DNA Impfstoffen mittels viralen Wild-Typ Genen und (d) Verwendung von virusartigen Partikeln (VLPs).
Allerdings zeigen die obigen Strategien unglücklicherweise eine Anzahl von Nachteilen, die bisher die Entwicklung eines sicheren und wirksamen Impfstoffs behindert haben. Im Hinblick auf die Verwendung von synthetischen antigenen Peptiden ist hervorzuheben, dass die Identifikation von HPV-spezifischen immunreaktiven Peptiden sehr kompliziert ist. Sie erfordert eine große Zahl und Menge an Peptiden, damit Impfstoffe wirksam sind, und an einem breiten Spektrum.
Außerdem enthalten synthetische Peptide keine posttranslationalen Modifikationen (z.B. Glycosylierung, Sulfatierung, Phosphorylierung), die normalerweise in nativen Proteinen gefunden werden, und sind daher als Impfstoffe nicht ausreichend wirksam. Die auf BCG beruhenden Impfstoffabgabesysteme, die das L1 late Protein von HPV 6b oder das E7 early Protein von HPV 16 exprimieren, werden als Immunogene verwendet. Allerdings waren die Immunreaktionen, die mit diesen Systemen erhalten wurde, noch geringer als die durch Protein/Adjuvant-Impfstoffe ausgelösten und daher wird es als unwahrscheinlich angesehen, dass dieses System als eine Impfstoffstrategie auf Grundlage einer einzelnen Komponente nützlich sein kann. Im Hinblick auf DNA Impfstoffe ist beobachtet worden, dass die Expression von Wild-Typ HPV Genen ziemlich niedrig ist, selbst wenn sie von starken Promotoren exprimiert sind, wie beispielsweise dem Cytomegalovirus (CMV). Was die Verwendung der virusartigen Partikel (VLPs) anbetrifft, ist zu erwähnen, dass echte VLPs aus dem L1 (Kapsid)-Protein eines speziellen HPV Typs erzeugt werden. Sie können daher nur als prophylaktische und nicht als therapeutische Impfstoffe von Nutzen sein, wenn überhaupt. Pseudotypisierte VLPs, die zum Beispiel Epitope von HPV-16 E7 enthalten, sind auch beschrieben worden und können als prophylaktische und therapeutische Impfstoffe nützlich sein. Allerdings besteht eine wichtige Begrenzung darin, dass VLPs in Insektenzellen oder in Hefe erzeugt werden. Bisher gibt es keine Erzeugungssysteme in Säugetierzellen. Deshalb sind kritische Epitope, die von den posttranslationalen, in menschlichen Zellen stattfindenden Modifikationen abhängen, in diesen Systemen verloren.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen sicheren und wirksamen Impfstoff, vorzugsweise einen genetischen Impfstoff, zur Behandlung oder Verhinderung einer HPV Infektion oder eines mit HPV in Verbindung stehenden Neoplasmas zur Verfügung zu stellen.
Gemäß der Erfindung wird dies durch die in den Ansprüchen angegebenen Gegenstände erreicht. Die vorliegende Erfindung stellt DNA Sequenzen zur Induzierung einer Immunreaktion auf die E6 und/oder E7 Protein von onkogenem HPV in einem Wirtstier zur Verfügung, und zwar vorzugsweise durch Verabreichung von Vektoren, die die DNA Sequenzen enthalten, z.B. Plasmidvektoren, Herpes simplex Virus Typ 1 Amplikon oder rekombinante Semliki Forest Virusvektoren. Die DNA Sequenzen kodieren die HPV Proteine als Fusionsproteine, die immunogen aber nicht in der Lage sind, die Zelltransformation zu induzieren. Die DNA Sequenzen der Erfindung sind durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet:

(a) Die DNA Sequenzen der HPV E6/E7 Gene sind dahingehend modifiziert worden, dass ihre Kodon-Verwendung enger an die von humanen Genen angepasst wird, d.h. mindestens 20 % der ursprünglichen Kodons werden durch Kodons ersetzt, die in einer Säugetierzelle zu einer erhöhten Translation führen, (b) die Gene sind durch Mutation modifiziert worden, um sie nicht funktional zu machen, wodurch ihre onkogene Fähigkeit inaktiviert wird (Deletionen sind vorzugsweise Punktmutationen, weil diese zu einem Verlust von potentiell wichtigen Epitopen führen), (c) die HPV Gene werden mit stark immunogenen Proteinen fusioniert, um ihre Immunogenität im Wirt zu erhöhen (es wird nicht davon ausgegangen, dass diese Fusionen zu einer Maskieung der HPV Proteinepitope führen, da die fusionierten Fragmente eine ausreichende Länge besitzen, um dieses Problem zu vermeiden) und vorzugsweise wird die Expression der HPV Gene durch rekombinantes, replikationsdefizientes HSV, SFV oder Plasmidvektoren mit hoher Kopienzahl oder Kombinationen davon vorgesehen.

Dieser Ansatz bietet eine Auswahl von Vorteilen, nämlich:

(a) Es werden höhere Expressionsniveaus des HPV Proteins als Ergebnis der stillen Mutationen erhalten, die in die HPV Gene eingeführt werden, um ihre Kodonverwendung enger an die menschliche anzupassen. Dies führt im Vergleich zur Verwendung der Wild-Typ HPV Gene zu einer wirksameren Wirtsreaktion bei Immunisierungsversuchen.
(b) Die HPV Gene und Proteine, die durch die vorliegende Erfindung erzeugt werden, werden in menschlichen Zellen exprimiert und anders als Proteine, die in anderen Systemen, wie beispielsweise Bakterien, Hefe oder Insektenzellen, exprimiert werden, enthalten sie posttranslationale Modifikationen, die normalerweise in den in menschlichen Zellen exprimierten Proteinen gefunden werden. Dies ist für eine angemessene Erkennung der HPV Proteine durch das Wirtsimmunsystem wichtig.
(c) Da die HPV Proteine fusioniert an Proteine, die bekanntermaßen stark immunogen sind, exprimiert werden, lösen sie stärkere Immunreaktionen beim Wirtstier aus.
(d) Die HPV Proteine sind nicht zellbildend, weder in vitro noch im Wirtstier, weil sie in keinem Fall als Polypeptide voller Länge exprimiert sind. Die HPV Fusionsgene exprimieren unvollständige Proteine, deren Funktionen beeinträchtigt sind. Darüber hinaus werden die HPV Proteine als Fusionen für zytoplasmatische Proteine exprimiert und daher können sie den Nukleus, wo sie ihre Funktionen ausüben, nicht erreichen.
(e) Die HPV Proteine sind vorzugsweise mit einer spezifischen Sequenz markiert exprimiert, was leicht in Western Blots und durch Immunfluoreszenz mit Hilfe von im Handel erhältlichen Antikörpern festgestellt werden kann.
(f) Die Kombination von verschiedenen Virusvektoren und von diesen mit Plasmidvektoren stellt eine wirksamere Immunisierung sicher, da sie eine Neutralisation des Vektors durch eine in einem vorherigen Boost ausgelöste Immunreaktion verhindert.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA Sequenz, die ein E6 oder E7 Fusionsprotein von HPV kodiert, wobei die DNA Sequenz durch eine Kombination der folgenden Merkmale gekennzeichnet ist:

(a) mindestens 20 % der ursprünglichen Kodons werden durch Kodons ausgewechselt, die in einer Säugetierzelle zu einer erhöhten Translation führen;
(b) sie enthält eine Mutation, die zur Erzeugung eines verkürzten, nicht funktionellen Proteins führt; und
(c) sie kodiert einen Fusionspartner, bei dem es sich um ein stark immunogenes Polypeptid handelt, das die Immunogenität des E6 oder E7 Proteins im Säugetierwirt erhöhen kann.

Der Ausdruck „ursprüngliche Kodons" betrifft die Kodons, die in der entsprechenden Wildtyp-Version von HPV gefunden werden.
Der Ausdruck „erhöhte Translation in einer Säugetierzelle" betrifft die Gene, die aus der Einführung von stillen Mutationen in die HPV Sequenzen resultieren, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, die offene Leseraster erzeugen, die vollständig aus bevorzugten menschlichen Kodons bestehen und daher zu einer erhöhten Expression der Proteine führen, die sie in Säugetierzellen kodieren.
Der Begriff „Mutation, die zur Erzeugung eines verkürzten, nicht funktionellen Proteins führt" betrifft jede Mutation, die zur Erzeugung einer nicht funktionellen Version des Proteins führt. Vorzugsweise führt eine solche Mutation zu einer verkürzten Version des Proteins. Beispiele für passende Mutationen umfassen eine Mutation, bei der mindestens ein Kodon deletiert wurde, oder eine Mutation, die zu einer vorzeitigen Beendigung der Translation führt. Eine solche Mutation ist z.B. der Austausch eines eine bestimmte Aminosäure kodierenden Kodons durch ein Stoppkodon, eine Insertion oder Deletion von einem oder zwei Nukleotiden, die zu einer Leserastermutation usw. führt. Der Begriff „nicht funktionelles Protein oder Gen" bedeutet, dass die mutanten HPV Gene und Proteine der vorliegenden Erfindung „weder in vitro noch in vivo nicht transformierend" sind, was bedeutet, dass die Fähigkeit der E6 oder E7 Gene und Proteine zur Transformation von Zellen zu einem tumorigenen Phänotyp ausgeschaltet wurde, wie durch Standardtests gezeigt. Der Fachmann kann leicht bestimmen, ob eine bestimmte Mutation zu einem E6 oder E7 Gen oder Protein mit den gewünschten Merkmalen führt, d.h. es ist „nicht transformierend" gemäß den Standardverfahren. Diese umfassen:

1) In vitro: Transformationsassays von NIH 3T3 Zellen und primären humanen Keratinozyten. Transformationsgene (Onkogene) werden routinemäßig mittels Assays identifiziert, bei denen die transformierten Fokusse aus der Transfektion des Tumors oder rekombinanten DNA in die NIH 3T3 Zellen resultieren (Todaro u.a., PNAS USA 51: 66–73, 1964; Jainchill u.a., J. Virol. 4: 549–553, 1969; Andersson u.a., Cell 16: 63–75, 1979). Diese Zellen sind Mausfibroblasten, die als kontaktgehemmte, nicht tumorigene Zelllinien erhalten werden. Die Übertragung von DNA, die ein aktiviertes Onkogen enthält, führt gelegentlich zu Fokussen von morphologisch veränderten Zellen, die tumorigene Eigenschaften aufweisen.
2) In vivo: Tumorigenitätstests werden routinemäßig in immundefizienten Mäusen durch Inokulation mit transformierten Maus- oder humanen transformieren Zellen durchgeführt. Zellen die zur Expression von HPV E6 und E7 Genen transfiziert wurden, und Zelllinien, die von durch HPV infizierten Gebärmutterhalskarzinomen stammen, wie beispielsweise HeLa Zellen, haben sich als tumorigen herausgestellt (Lichy u.a., Cell Growth Differ. 3: 541–548, 1992; Stanbridge, Nature 260: 17–20, 1976).

In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die DNA Sequenz der vorliegenden Erfindung das HPV E7 Protein mit den oben beschriebenen Merkmalen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden mindestens 50 % der ursprünglichen Kodons der DNA Sequenz der vorliegenden Erfindung durch Kodons ersetzt, die zu einer erhöhten Translation in Säugetierzellen führt; Beispiele für einen geeigneten Austausch sind beispielsweise in den 1 und 2 gezeigt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die DNA Sequenz der vorliegenden Erfindung eine Leseraster-Punktmutation, die zu einem vorzeitigen Translationsstopp führt.
Der Fachmann kennt Polypeptide oder Teile davon, die als Fusionspartner für das E6 oder E7 Protein geeignet sind und die bei Säugetieren, insbesondere Menschen, stark immunogen sind. Beispiele für geeignete Polypeptide umfassen:

1) kleines Hepatitis B Virus Hüllprotein (HBsAg-S). Dieses Protein besitzt die Fähigkeit, sich mit vom Wirt stammenden Membranen selbst zusammenzusetzen, um leere subvirale Partikel zu bilden, die in das Lumen eines Prä-Golgi-Kompartment freigesetzt und anschließend sekretiert werden (Ganem, „Hepadnaviridae and their replication" p2703-37, in Fields, Knipe und Howley (Hrsg.); Fields Virology, 3. Ausg., 1996, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia). E6 oder E7 kann an den C-Terminus des Proteins fusioniert sein, der an der Oberfläche der subviralen Partikel freiliegend bleibt.
2) E2 Glycoprotein von Semliki Forest Virus (SFV). E2 ist eine Ährenkomponente des SFV Virions und ein Hauptantigen zur Neutralisierung von Antikörpern (Schlesinger und Schlesinger, „Togaviridae: the viruses and their replication" in Fields, Knipe und Howley (Hrsg.), Fields Virology, 3. Ausg., 1996, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia). E6 oder E7 können an den N-Terminus des E2 Proteins fusioniert sein, das an der Oberfläche der Virushülle oder der Plasmamembran von E2 exprimierenden Zellen freiliegt.
3) Humaner Amyloid β-Proteinvorläufer (APP). APP ist ein Transmembranprotein mit einer großen extrazellulären Region und einem kleinen zytoplasmatischen Schwanz. Es wird normalerweise durch Protease zu einem 40 Aminosäuren umfassenden β-Peptid (Amyloid) gespalten, das in der Plaque von Patienten mit Alzheimer gefunden wird, oder zu einem kleineren Fragment namens p3, das sich mit der extrazellulären Matrix verbinden kann („Principles of neural Science", Kandel, Schwartz und Jessell (Hrsg.), 3. Ausg., 1991, Elsevier, New York). E6 und E7 können in den extrazellulären Teil von APP eingeführt werden und sollen zusammen mit dem β-Peptid oder dem p3 Fragment freigesetzt werden.
4) Humanes Chromagranin B (hCgB). Obwohl hCgB ein Protein ist, das am regulierten sekretorischen Weg beteiligt ist, wird es, wie sich gezeigt hat, konstitutiv in Zellen ohne einen regulierten Weg sekretiert, wie beispielsweise HeLa Zellen, und zwar nach der Transfektion (Kaether und Gerdes, FEBS Letters 369: 267–271, 1995). E6 oder E7 kann an den C-Terminus von hCgB fusioniert sein.
5) Die bakterielle β-Galactosidase, die bekanntermaßen stark immunogen ist (Fijikawa u.a., Virology 204: 789–793, 1994). E6 oder E7 können an den N- oder den C-Terminus des Proteins fusioniert sein. Als Fusionsprodukt dient ein lösliches Nicht-Membranprotein, das in den Nukleus diffundieren kann, E6 oder E7 ist eine (inaktive) Deletionsmutante. Alternativ wird ein Signalpeptid der Fusion zugegeben, die das Produkt auf die Zelloberfläche richtet.
6) Die Fusion der N- oder C-Terminushälften von E6 oder E7 zusammen und das resultierende chimäre Polypeptid, das an jedes der obigen Proteine fusioniert ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere, aber nicht ausschließlich, die E6 und E7 Gene und Proteine der HPV-16 und HPV-18 Genotypen. Es wird aber davon ausgegangen, dass sich die Erfindung auf Varianten von solchen HPV Genotypen und andere HPV Genotypen erstreckt, die ein onkogenes oder anderes pathologisches Potential aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung chimäre Gene, die ein Polyprotein kodieren, das E6 und E7 von HPV-16 und E6 und E7 von HPV-18 entweder vollständig oder als Deletionsfragmente enthält, die N- oder C-terminale Hälften von solchen Proteinen umfassen, die miteinander fusioniert sind, sowie die Polypeptide oder Teile davon, wie oben erwähnt. Dies ermöglicht eine Immunisierung gegenüber HPV16 und HPV18 mittels eines einzelnen Produkts als Immunogen.
Der Fachmann geht davon aus, dass die Fusion von E6 und/oder E7 an die Proteine 1–4 der obigen Liste die Translokation der ersteren zum Nukleus abschafft und so die Funktion stört. Weiter soll eine Sekretion oder ein Anordnen der Fusionsproteine an der Oberfläche ihr Erkennen durch das Immunsystem erleichtern.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA Sequenz, wobei die Teile (a) und (b) die Kodierungsregion der DNA Sequenz umfassen, wie in der 1, 2, 3 oder 4 gezeigt, einschließlich Flag-tag oder nicht. Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform der DNA Sequenzen der vorliegenden Erfindung, die die Kodierungsregion der DNA Sequenz umfasst, wie in der 5 gezeigt, einschließlich Flag-tag oder nicht.
Vorzugsweise sind die die mutanten HPV E6 und E7 Fusionsproteine kodierenden DNA Sequenzen in einem Vektor oder einem Expressionsvektor vorhanden. Dem Fachmann sind Beispiele davon bekannt. Im Fall eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z.B. pGE-MEX, pUC Derivate, pGEX-2T, pET3b, Expressionsvektoren auf T7 Basis und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind zB. pY100 und Ycpad1 zu erwähnen, während für die Expression in Tierzellen z.B. pKCR, pEF-BOS, cDM8, pMSCND und pCEV4 anzugeben sind. Der Baculovirus Expressionsvektor pAcSGHisNT-A ist besonders geeignet für die Expression in Insektenzellen. Die DNA Sequenzen der vorliegenden Erfindung können auch in einem rekombinanten Virus enthalten sein, der geeignete Expressionskassetten aufweist. Geeignete Viren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Baculovirus, Vaccinia, Sindbis-Virus, SV40, Sendai-Virus, Adenovirus ein AAV Virus oder ein Parvovirus, wie beispielsweise MVM oder H-1. Der Vektor kann auch ein Retrovirus, wie beispielsweise MoMULV, MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV sein. Besonders bevorzugte Plasmide und rekombinante Viren sind piRES-Neo2 (Clontech, Heidelberg, Deutschland), pTet-On (Clontech, pHSVPUC (Geller u.a., PNAS USA 87 (1990), 8950–8954), HSV Amplikone und rekombinante SFV Vektoren. Für die Expression in Säugetieren sind die DNA Sequenzen der Erfindung funk tionsfähig mit einem geeigneten Promotor, z.B. einem humanen Cytomegalovirus „Immediate Early Promotor" (pCMV), SV Enhancer und Early Promotor, SCα Promotor (Takebe u.a., Mol. Cell. Biol. 8: 466–472, 1988), Tet-On/Tet-Off Genexpressionssysteme, immediate early E4/5 Promotor von HSV-1 (Geller u.a., PNAS USA 87: 8950–8954, 1990), verbunden.
Zum Erzeugen von E6 und E7 Fusionsprotein kodierenden DNA Sequenzen, die die oben diskutierten Modifikationen aufweisen, und zum Konstruieren der Expressionsvektoren, die die DNA Sequenzen gemäß der Erfindung enthalten, ist es möglich, allgemeine auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren zu verwenden. Diese Verfahren umfassen z.B. in vitro Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren und in vivo Rekombinationsverfahren, wie zum Beispiel in Sambrook u.a., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die die oben beschriebenen DNA Sequenzen oder Vektoren enthalten. Diese Wirtszellen umfassen Bakterien, Hefe, Insekten und Tierzellen, vorzugsweise Säugetierzellen. Die E. coli Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21, XL1Blue und SG 13009, den Hefestamm Saccharomyces cerevisiae, die Insektenzellen sf9 und die Tierzellen L, A9, 3T3, FM3A, BHK, humanes SW13, CHO, COS, Vero und HeLa sind bevorzugt. Verfahren zum Transformieren dieser Wirtszellen, zum phänotypischen Auswählen von Transformanenten und zum Exprimieren der DNA gemäß der Erfindung mittels der oben beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein HPV E6 oder E7 Fusionsprotein, das durch die oben beschriebenen DNA Sequenzen kodiert wird. Das HPV E6 oder E7 Fusionsprotein ist als isoliertes, gerei nigtes Material vorgesehen und daher frei von anderen Proteinen. Solche HPV Fusionsproteine werden vorzugsweise in humanen Zellen exprimiert und anders als Proteine, die in anderen Systemen, wie beispielsweise Bakterien, Hefe oder Insektenzellen, exprimiert werden, enthalten sie die posttranslationalen Modifikationen, die normalerweise in den in humanen Zellen exprimierten Proteinen gefunden werden: Dies kann von entscheidender Bedeutung für ein angemessenes Erkennen der HPV Proteine durch das Wirtsimmunsystem sein.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung des obigen E6 oder E7 Fusionsproteins, wonach z.B. eine Wirtszelle der Erfindung unter Bedingungen kultiviert wird, die die Synthese des Proteins ermöglichen, und das Protein anschließend aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert wird.
Die Isolation und Reinigung der rekombinant erzeugten Proteine kann mit herkömmlichen Mitteln durchgeführt werden, die die präparative Chromatographie und Affinität und immunologischen Trennungen, einschließlich Affinitätschromatographie mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine DNA Sequenz oder einen Expressionsvektor der Erfindung oder alternativ das HPV E6 oder E7 Fusionsprotein, das durch die DNA Sequenz in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger kodiert wird.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung verschiedene Verwendungen der DNA Sequenzen der Erfindung, der Expressionsvektoren oder der HPV E6 oder E7 Fusionsproteine. Bevorzugte Verwendungen sind:

(a) Herstellung eines Impfstoffs zum Verhindern oder Behandeln einer HPV Infektion oder eines Neoplasmas, das mit einer HPV Infektion in Verbindung steht. Vorzugsweise ist der Impfstoff ein genetischer Impfstoff, der auf DNA Sequenzen der Erfindung beruht, die in einen geeigneten Vektor unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors, z.B. eines Vektors oder Promotors, wie oben beschrieben, eingeführt wird. Ein solcher Impfstoff kann dazu verwendet werden, die humorale und/oder zelluläre Immunreaktion bei Personen zu stimulieren, die von solchen Reaktionen durch Schutz vor oder Behandlung von möglichen Infektionen mittels HPV oder durch Zellabstoßung von Tumoren oder Verletzungen, die mit HPV infiziert sind und virale Proteine exprimieren, profitieren können.
(b) Erzeugung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die als therapeutische Mittel von Nutzen sein können. Solche Antikörper können gemäß bekannten Verfahren erzeugt werden.
(c) Detektion von spezifischen Antikörpern oder zytotoxischen T-Lymphozyten bei mit HPV infizierten Personen, d.h. Verwendung in einem diagnostischen Assay. Geeignete Assayformate (RIA, ELISA etc.) sind dem Fachmann bekannt.
(d) Erzeugung einer transgenen Mauslinie z.B. mittels der DNA Sequenzen der Erfindung unter der Kontrolle eines mit Tetracyclin induzierbaren Promotors. Eine solche Mauslinie kann nützlich sein, um Impfstoffe gegen HPV zu testen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: HPV16 EE7T Sequenz
Es wird die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz (Einbuchstabenkode) des mutagenisierten E7 Gens von HPV-16 (EE7T) gezeigt. Stille Mutationen, die zum Erzeugen eines offenen Leserahmens von bevorzugten humanen Kodons eingeführt wurden, sind fettgedruckt. Die die hexa-His-tags und Flag-tags kodierenden Sequenzen sind unterstrichen. Das Stoppkodon ist mit einem Stern gekennzeichnet.
2: HPV16 EE6T Sequenz
Es wird die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz (Einbuchstabenkode) des mutagenisierten E6 Gens von HPV-16 (EE6T) gezeigt. Stille Mutationen, die zum Erzeugen des offenen Leserahmens von bevorzugten humanen Kodons eingeführt wurden, sind fettgedruckt. Die die hexa-His-tags und Flag-tags kodierenden Sequenzen sind unterstrichen. Das Stoppkodon ist mit einem Stern gekennzeichnet.
3: HPV18 EE7T Sequenz
Es wird die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz (Einbuchstabenkode) des mutagenisierten E7 Gens von HPV-18 (EE7T) gezeigt. Stille Mutationen, die zur Erzeugung des offenen Leserahmens von bevorzugten humanen Kodons eingeführt wurden, sind fettgedruckt. Die die hexa-His-tags und Flag-tags kodierenden Sequenzen sind unterstrichen. Das Stoppkodon ist mit einem Stern gekennzeichnet.
4: HPV18 EE6T Sequenz
Es wird die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz (Einbuchstabenkode) des mutagenisierten E6 Gens von HPV-18 (EE6T) gezeigt. Stille Mutationen, die zur Erzeugung des offenen Leserahmens von bevorzugten humanen Kodons eingeführt wurden, sind fettgedruckt. Die die hexa-His-tags und Flag-tags kodierenden Sequenzen sind unterstrichen. Das Stoppkodon ist mit einem Stern gekennzeichnet.
5: HbsAg-EE7T Fusionsgen
Es wird die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz (Einbuchstabenkode) des Hbs-Ag-EE7T Fusiongens gezeigt. Die fusionierten Fragmente sind durch drei Punkte getrennt. Stille Mutationen, die in das E7 Gen von HPV-16 (EE7T) zur Umwandlung des offenen Leserahmens von bevorzugten humanen Kodons eingeführt wurden, sind fettgedruckt. Die das Flag-tag kodierende Sequenz ist unterstrichen. Das Stoppkodon ist mit einem Stern gekennzeichnet.
6: Konfokale Bildanalyse der Expression der HPV-16 E7 Fusionsproteine, die durch die mutanten Gene EE7T und E7T kodiert sind
Vero Zellen, die auf den Deckgläschen wachsen, wurden entweder mit Plasmid pIRES-Neo2/EE7T oder pIRES-Neo2/E7T mittels des „FeGene" Transfektionsreagens (Roche, Basel Schweiz) transfiziert. Die Zellen wurden 48 h lang inkubiert, mit 2 % Paraformaldehyd fixiert, mit 0,2 % Triton X-100 permeabilisiert und durch anschließende Inkubationen mit anti-Flag M2 monoklonalen Antikörpern (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) und Ziegen anti-Maus Antikörpern, konjugiert an cy2 (Dianova, Hamburg, Deutschland) gefärbt.
7: Western Blot Analyse der HVP-16 E7 Fusionsproteine, die durch die EE7T und E7T Gene kodiert werden
HeLa Zellen wurden wie in der 6 beschrieben transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen in SDS Puffer lysiert, Proteine mittels PAGE (15 % Polyacrylamid) getrennt, auf PVDF Membranen übertragen (Immobilion-P, Millipore, Eschborn, Deutschland) und mit anti-Flag M2 monoklonalen Antikörpern, konjugiert mit Meerrettich Peroxidase, hybridisiert, wobei eine Aktivität mittels ECL Assay festgestellt wurde.
Die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele erläutert.
Beispiel 1: Mutagenese und Expression des E7 Gens vom HPV Typ 16
Das HPV-16 E7 Gen wurde in vitro mutagenisiert, um 64 stille Mutationen einzuführen, die einen offenen Leserahmen erzeugen, der aus bevorzugten humanen Kodons besteht. Außerdem wurden die mutanten E7 Gene zu einem Hexa-histidin-tag und einem Flag-tag fusioniert.
Die mutanten E7 Gene wurden synthetisch durch aufeinander folgende Schritte der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) mittels der folgenden Primer erzeugt:
Im ersten PCR Schritt wurden die Primer (b) und (e) (PCR1) und die Primer (c) und (f) (PCR2) zur Erzeugung der jeweiligen Fragmente mittels Kettenerweiterung ohne Matrize verwendet. In einem zweiten Schritt wurden die Produkte von PCR1 und PCR2 verwendet, um ein einzelnes Fragment ohne Primer (PCR3) zu amplifizieren. In einem dritten Schritt, wurde das Produkt von PCR3 als Matrize verwendet, um ein vollständiges E7 Gen mit Primern (a) und (d) zu amplifizieren (PCR4).
In einem abschließenden PCR Schritt wurde das Produkt von PCR4 (EE7) als Matrize zur folgenden Amplifikation verwendet: (1) unter Verwendung der Primer (g) und (i) wurde eine vollständige E7 Sequenz, die an Sequenzen fusioniert war, die ein hexa-His-tag (HHHHHH Epitop) am N-Terminus kodieren, und ein Flag-tag (DYKDDDDK-Epitop) an den C-Terminus synthetisiert (verstärktes E7 mit Tags: EE7T); (2) mittels der Primer (h) und (i) wurde ein verkürztes E7 (EE7TΔ1) ohne die ersten 35 Reste, das His- und Flag-tags enthält, wie oben beschrieben, synthetisiert.
Die mutierten mit Tags versehenen E7 Gene wurden aus den PCR Reaktionsgemischen mittels Agarosegelelektrophorese isoliert, doppelt mit NheI und EcoRI verdaut und in die Mehrfachklonierungsstelle des Plasmids pIRES-Neo2 (Clontech, Heidelberg, Deutschland) kloniert, das zuvor mit denselben Restriktionsenzymen verdaut worden war. Nach der Transformation von DH5α Bakterien, wurden einzelne Klone identifiziert und sequenziert. Die Klone mit der korrekten Sequenz wurden ausgedehnt und verwendet, um die entsprechenden Plasmide zu reinigen. Als Kontrolle wurde ein Wild-Typ E7 Gen und eine verkürzte Mutante, der die ersten 35 Reste fehlten, die beide auf dieselbe Weise wie die oben beschriebenen EE7T Mutanten mit Tags versehen waren, durch PCR (E7T und E7TΔ1 Gene) kloniert, und an schließend in die NheI und EcoRI Stellen des pIRES-Neo2 Plasmids eingeführt.
Das EE7 Produkt aus PCR4 wurde auch in den pBluescript Vektor (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) kloniert und zur Mutagenese verwendet, was zu einer doppelten Deletionsmutante führte, der die Reste 26–32 und 70–74 fehlten. Das EE7 Produkt aus PCR4 wurde als Matrize für die Amplifikation wie folgt verwendet: (1) mittels der Primer (g) und (i) wurde eine EE7T Deletionsmutante, der die Reste 26–32 und 70–74 (EE7TΔ2,3) fehlten, mit His- und Flag-tags, wie oben, erzeugt, (2) mittels der Primer (h) und (i) wurde ein verkürztes EE7T, dem die ersten 35 Reste sowie die Reste 70–74 (EE7TΔ1,3) fehlten, mit His und Flag-tags wie oben erzeugt.
Beispiel 2: Expression der EE7T Fusionsgene in Säugetierzellen
Die Expression der im Beispiel 1 oben beschriebenen EE7T Fusionsgene wurde in vitro durch Immunfluoreszenz und Western Blot Analyse verglichen mit der der E7T Kontrollen getestet. Die obigen Plasmide wurden auf transiente Transfektion mittels eukaryontischen Zelllinien mit Ursprung von Maus (C-26), Affe (Vero 2-2) und Mensch (HeLa) verwendet. Die Zelllinie Vero 2-2 enthält HSV-1 IE2 (ICP27) Gen und Promotor. Diese Linie wurde ursprünglich durch R.M. Sandri-Goldin u.a. eingerichtet (Smith u.a., Virology 186 (1992), 74–86). Zu unterschiedlichen Expressionszeiten wurden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert und zur Immundetektion bearbeitet oder in SDS Beladungspuffer lysiert und mittels Western, Blot analysiert. In beiden Fällen wurden die E7 Fusionsproteine mit Maus monoklonalen Antikörpern erfasst, die für die hexa-His (anti-His-tag Ab-1, Calbiochem-Novabiochem, Bad Soden, Deutschland) oder die Flag Epitope (anti-Flag M2, Sigma-Alderich, Steinheim, Deutschland) spezifisch sind.
Die Bildanalyse von Immunfluoreszenzpräparaten zeigte die Expression der mutanten Proteine im Nukleus der transfizierten Zellen (6). Western Blots, die mit monoklonalen, gegen das Flag Epitop gerichteten Antikörpern untersucht wurden, zeigten, dass die Expression von mutagenisierten E7 Genen (EE7 und seine oben beschriebenen Deletionsmutanten) mindestens zwei Größenordnungen größer als die der äquivalenten E7 Gene war, die aus Wild-Typ Kodons bestanden (VE7 und seine Deletionsmutanten) (7).
BEISPIEL 3: Klonierung und Expression von E7/HBsAg Fusionsgenen
Um das antigene Potential von E7 zu erhöhen, wurden Fusionsproteine zwischen mit Tags versehenen EE7 offenen Leserahmen und einem Gen erzeugt, das das Oberflächenantigen des Hepatitis B Virus kodiert (HbsAg). Das Fusionsgen wurde durch PCR Klonierung der HbsAg und EE7 Gene erzeugt. Das Plasmid pRc/CMV-HBs(S) (Aldevron, Fargo, USA) diente als Matrize, um das HbsAg Gen mittels der Primer 5'-CTC GAG GAT TGG GGA-3' und 5'-GAT ATC AAT GTA TAC CCA AAG A-3' zu amplifizieren. Das sich ergebende Fragment enthielt die vollständige Sequenz des HbsAg offenen Leserahmens mit Ausnahme des Terminierungskodons, das durch eine EcoRV Stelle ersetzt war. Die mutanten EE7T Gene wurden als Matrize mittels des EE7 Gens voller Länge, das im Beispiel 1 beschrieben ist, amplifiziert sowie als Primer für das 5'-Ende mittels der Olignucleotide 5'-GAT ATC GAG GAG GAC GAG ATC GA-3' oder 5'-GAT ATC ATG CAC GGC GAC A-3' und für das 3'-Ende mittels des Oligonukleotids (i), das im Beispiel 1 beschrieben ist. Die auf diese Weise amplifizierten EE7T Gene wurden mit EcoRV geschnitten und an das 3'-Ende des oben erzeugten HbsAg ligiert, um HbsAg-EE7T Fusionsgene zu erzeugen, die entweder das vollständige EE7 Gen oder EE7TΔ1 oder Δ Deletionsmutanten exprimieren.
Die HbsAg-EE7T Fusionsgene wurden in den Polylinker des Plasmids pIRESNeo2 kloniert und zur transienten Transfektion mittels eukaryontischen Zelllinien mit Ursprung von Maus (C-26; Tumorbibliothek, DKFZ, Heidelberg, Deutschland), Affe (Vero 2-2), und Mensch (HeLa) verwendet.
Beispiel 4:
1. Transformationsstudien der erhöhten HPV Gene.
Die angesammelten Versuchsbeweise zeigen, dass E6 und E7 von HPV16 und HPV18 ein Transformierungspotential aufweisen. Bei Expression unter der Kontrolle der starken heterologen Promotoren ist gezeigt worden, dass diese Gene etablierte Mauszellen transformieren (Kanda u.a., J. viol. 62: 610–613, 1988; Vousden u.a., Oncogene Res. 3: 167–175, 1989) und primäre Maus und humane Vorhautkeratinozyten immortalisieren (Halbert u.a., J. Virol. 65: 473–478, 1991; Hudson u.a., J. Virol. 64: 519–526, 1990; Sedman u.a., J. Virol. 65: 4860–4866).
Das Transformierungspotential der erhöhten Gene der vorliegenden Erfindung und ihrer Derivate (Fusionsproteine wie die der 5 und andere, bei denen das HPV Gen eine Deletion von mindestens 50 % aufweist) wurden durch Standardverfahren mittels Maus NIH 3T3 Zellen und primären humanen Keratinozyten getestet. Ihre Wild-Typ Entsprechungen und der leere Plasmidvektor wurden als positive bzw. negative Kontrolle verwendet.
Die HPV erhöhten Gene und ihre DNA Fusionskonstrukte wurden in die Mehrfachklonierungsstelle des Plasmids pIRESNeo2 subkloniert (Clontech, Heidelberg, Deutschland). Die sich ergebenden Plasmi de wurden in E. coli amplifiziert und auf Harz gereinigt (Quiagen, Hilden, Deutschland), eluiert, mit Ethanol präzipitiert und in sterilem, entionisiertem Wasser resuspendiert. Die DNA Menge und Reinheit wurde durch spektrophotometrische Absorptionsmessungen bei 260 und 280 nm und durch Agarosegelelektrophorese bestimmt. NIH 3T3 Zellen (ATCC, Manassas) wurden auf Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium ergänzt mit L-Glutamin und 10 % fötalem Kälberserum erhalten.
Die Transfektion von NIH 3T3 Zellen mit Plasmid DNA wurde mittels FuGene^TM 6 Transfektionsreagens (Roche, Mannheim, Deutschland) durchgeführt, und zwar im Wesentlichen wie vom Hersteller beschrieben. Die mit 3 × 10 in einer 100 mm Schale ausgesäten Zellen wurden am nächsten Tag mit 3 μg Testplasmid transfiziert. Jede Transfektion wurde dreifach durchgeführt. Nach 48 h Inkubation bei 37°C wurden die transfizierten Zellen durch Trypsinierung entfernt und auf Koloniebildung in Weichagar untersucht oder in drei 100 mm Schalen subkultiviert und für weitere 24 h bei 37°C inkubiert, bevor eine Selektion in einem Geneticin (Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland) enthaltenden Medium durchgeführt wurde, und zwar in einer Konzentration von 500 μg/ml. Für die Koloniebildungsassays in Weichagar wurden die trypsinierten Zellen in 0,4 % Agar in Wachstumsmedium bei 10⁵ Zellen pro 60 mm Schale gesät und bei 37°C inkubiert. Doppelte Schalen wurden nach zwei Wochen auf Koloniebildung bewertet. Neomycinresistente Kolonien wurden durch Zugabe von Geneticin auf subkonfluente Zellmonoschichten ausgewählt, die Zellen wurden trypsiniert und auf Koloniebildung in Weichagar wie oben beschrieben untersucht.
Eine Transfektion der primären humanen Keratinozyten mit Plasmid DNA wurde mittels FuGene^TM 6 Transfektionsreagens wie oben durchgeführt. Die Keratinozyten wurden in KGM Medium (KMK2 Kit, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) in 30 mm Schalen wachsen gelassen. Die Zellen wurden bei der Passage 5 mit 5 μg DNA transfiziert. Nach annähernder Konfluenz wurden die Kulturen in einem Verhältnis von 1:2 und einer Auswahl mit 100 μg von Geneticin pro ml ausgeführt.
Alle getesteten HPV erhöhten Fusionsgene erzeugten keine Fokusse der NIH 3T3 Zellen in Weichagar und immortalisierten keine primären humanen Keratinozyten.
2. Immunogenitätsstudien der erhöhten HPV Gene.
Die erhöhten HPV Gene wurden in das Plasmid pHSVPUC (Geller u.a., PNAS USA 87: 8950–8954, 1990) und die sich ergebenden rekombinanten Konstrukte subkloniert, die zur Erzeugung von Amplikon HSV-1 Vektoren wie anderswo beschrieben verwendet wurden (Cid-Arregui und Lim in Cid-Arregui und Garcia (Hrsg.), „Viral Vectors: Basic Science and Gene Therapy", BioTechniques Books, Eaton Publishing, Natrick) und diese wurden für die Immunisierungsstudien bei BALB/c Mäusen verwendet. Gruppen von fünf Mäusen (8 Wochen alt, weiblich) wurden für jedes Immunisierungsexperiment verwendet. Am Tag 0 wurden 10³–10⁴ Viruspartikel in einer 50 μl Suspension in salzhaltiges Serum subkutan inokuliert. Am Tag 14 wurde eine zweite Formulierungsdosis auf dieselbe Weise verabreicht. Am Tag 28 wurden die Mäuse ausbluten gelassen.
Die Serumantikörperreaktionen auf E6 und E7 wurden mittels Platten, die mit rekombinantem E65 oder E7 Protein überzogen waren, mittels Standardverfahren gemessen. Die Seren wurden in PB5, pH 7,2, enthaltend 1 mg/ml Casein, 0,5 % Tween 20, 0,002 % Alphazurin A verdünnt.
Nach dem Waschen der Platten wurde 0,1 mg/Vertiefung Testserum in einer geeigneten Verdünnung zugesetzt und die Platten wurde 1 h lang bei 38°C inkubiert. Um den gebundenen Antikörper festzustellen, wurde 0,1 ml 0,1 μg/ml Meerrettich Peroxidase markiertes Ziegen anti-Maus IgG + IgM (H- und L-kettenspezifisch) in PBS, pH 7,2, wie oben ergänzt, zugesetzt. Die Platten wurden 1 h bei 20°C inkubiert und 6-mal mit PBS, pH 7,2, mit 0,5 % Tween 20 gewaschen. Danach wurde 0,1 ml Substrat TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) zugegeben. Nach 10-minütiger Inkubation bei 20°C, wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 0,5 M H₂SO₄ angehalten. Kolorimetrische Messungen wurden in einem Spektrophotometer mit vertikalem Strahlengang bei 450 nm durchgeführt.
Alle Mäuse, die mit Vektoren immunisiert waren, die erhöhte HPV E6 und E7 Gene getrennt oder als Fusionsgene, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, exprimierten, erzeugten eine signifikante Reaktion im Anschluss an die Immunisierung, die deutlich über der lag, die durch nicht erhöhte Kontrollen ausgelöst wurde.
SEQUENZPROTOKOL1

Claims

DNA Sequenz, die ein E6 oder E7 Fusionsprotein von HPV kodiert, wobei die DNA Sequenz durch eine Kombination der folgenden Merkmale gekennzeichnet ist: (a) mindestens 20 % der ursprünglichen Kodons werden durch Kodons ausgewechselt, die in einer Säugetierzelle zu einer erhöhten Translation führen; (b) sie enthält eine Mutation, die zur Erzeugung eines verkürzten, nicht funktionellen Proteins führt; und (c) sie kodiert einen Fusionspartner, bei dem es sich um ein stark immunogenes Polypeptid handelt, das die Immunogenität des E6 oder E7 Proteins im Säugetierwirt erhöhen kann.
DNA Sequenz nach Anspruch 1, wobei das HPV Protein ein E7 Protein ist.
DNA Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens 50 % der ursprünglichen Kodons durch Kodons ersetzt werden, die zu einer erhöhten Translation in einer Säugetierzelle führen.
DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Mutation eine Leseraster-Punktmutation ist, die zu einem vorzeitigen Translationsstopp führt.
DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der stark immunogene Fusionspartner HbsAg oder ein immunogener Teil davon ist.
DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei HPV HPV-16 oder HPV-18 ist.
DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei die Teile (a) und (b) die Kodierungsregion der DNA Sequenz umfassen, wie in der 1, 2, 3 oder 4 angegeben, einschließlich gegebenenfalls das Flag-tag.
DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 7, umfassend die Kodierungsregion der DNA Sequenz, wie in der 5 angegeben, einschließlich gegebenenfalls das Flag-tag.
Expressionsvektor, enthaltend eine DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Expressionsvektor nach Anspruch 9, bei dem es sich um ein Plasmid oder ein rekombinantes Virus handelt.
Expressionsvektor nach Anspruch 10, wobei das Plasmid oder das rekombinante Virus pIRES-Neo2, pTet-On, pHSVPUC, ein HSV Amplikon oder ein SFV Vektor ist.
Wirtszelle, enthaltend die DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder den Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 9 bis 11.
E6 oder E7 Fusionsprotein, das durch die DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert ist.
Verfahren zur Erzeugung eines E6 oder E7 Fusionsproteins nach Anspruch 13, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 12 unter geeigneten Bedingungen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, einen Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 9 bis 11, das E6 oder E7 Fusionsprotein nach Anspruch 13 oder das E6 oder E7 Fusionsprotein, hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 14, in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Verwendung einer DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, eines Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 9 bis 11, des E6 oder E7 Fusionsproteins nach Anspruch 13 oder des E6 oder E7 Fusionsproteins, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 14, zur Herstellung eines Impfstoffs zum Verhindern oder Behandeln einer HPV Infektion oder eines mit einer HPV Infektion verbundenen Neoplasmas.
Verwendung eines E6 oder E7 Fusionsproteins nach Anspruch 13 oder hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 14 zur in vitro Erzeugung eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers.
Verwendung eines E6 oder E7 Fusionsproteins nach Anspruch 13 oder hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 14 in einem in vitro Assay zum Feststellen von spezifischen Antikörpern oder zytotoxischen T Lymphozyten in einer Probe, die von einem mit HPV infizierten Subjekt erhalten wird.
Verwendung einer transgenen Mauslinie, transformiert mit einer DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 9 bis 11 zum Testen von Impfstoffen gegen HPV in vitro.