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CN101421306B - 用于治疗和预防子宫颈癌的包含hpv多肽和免疫增强肽的组合物 - Google Patents

用于治疗和预防子宫颈癌的包含hpv多肽和免疫增强肽的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于受试者的包括人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽、用于使多肽分泌到细胞外面的信号肽和免疫增强肽的融合蛋白；编码所述融合蛋白的多核苷酸；以及包含所述多核苷酸的载体。本发明还涉及包含所述融合蛋白或载体的药物组合物；以及使用所述药物组合物治疗由人乳头瘤病毒引起的疾病的方法。

Description

用于治疗和预防子宫颈癌的包含HPV多肽和免疫增强肽的组合物
技术领域
本发明涉及：一种用于受试者的包括人乳头瘤病毒(HPV)E6和E7融合多肽、用于使多肽分泌到细胞外面的信号肽和免疫增强肽的融合蛋白；编码所述融合蛋白的多核苷酸；包含所述多核苷酸的载体；包含所述融合蛋白或载体的药物组合物；以及使用所述药物组合物治疗由人乳头瘤病毒引起的疾病的方法。
背景技术
子宫颈癌已成为第二最主要的癌症死亡的原因，全世界每年引起250,000人死亡。已知子宫颈癌主要由人乳头瘤病毒(HPV)感染引起(zurHausen，H et al.Biochem Biophys Acta1996，1288；F55-F78)。在数百种类型的HPV中，HPV16被认为是子宫颈癌的首要原因(Mark H et al.J NatlCancer Inst1993，85；958-964)。在HPV蛋白中，E6和E7蛋白在因致癌基因引起的子宫颈癌的出现中起关键作用，并且已报导它们是在约99％的由HPV引起的肿瘤中表达的主要蛋白。结果，E6和E7蛋白已成为在治疗和预防子宫颈癌的疫苗的制备中的主要靶抗原(von Knebel Doeberitz et al.Int.J.Cancer1992，51；831-834)。E6通过诱导肿瘤抑制蛋白p53的分解而阻止细胞凋亡，而E7与作为细胞肿瘤抑制因子的成视网膜细胞瘤蛋白(Rb)结合以使该蛋白失活，然后诱导细胞进入细胞周期的S期(Cobrinik et al.，Trends Biochem Sci1992，17：312-5)。
为了治疗子宫颈癌，使用表达核酸碱基序列(同时表达HPV16E6和E7蛋白)的组合物进行临床试验，但其疗效并不显著(Garcia F et al.ObstetGynecol2004，103；317-326)。此外，国际专利公开WO2004/030636披露了一种包括E6和E7的融合多肽(其中E6位于氨基末端或羧基末端)，以及编码该融合多肽的多核苷酸。然而，该文献中公开的多肽在治疗由HPV引起的子宫颈癌方面仍具有限制。
因此，本发明人已经发现包括与分泌肽和免疫增强肽结合的HPVE6/E7融合多肽的融合蛋白促进免疫应答，并有效治疗和预防由HPV引起的肿瘤，从而完成本发明。
发明内容
技术方案
本发明的一个目的是提供一种非常有效地治疗和预防由HPV引起的疾病的融合蛋白。
本发明的另一目的是提供编码所述融合蛋白的多核苷酸。
本发明的再一目的是提供包含所述多核苷酸的重组载体。
本发明的还一目的是提供包含所述融合蛋白和重组载体的药物组合物。
本发明的还一目的是提供在受试者中使用所述药物组合物治疗或预防由HPV引起的疾病的方法。
附图说明
图1为显示通过在C57BL/6小鼠模型中接种表达Mock、E6Co、E7Co、E67和E67Co、tE67Co、tFCoE67Co和tE67CoLCo的质粒DNA产生的E7特异性CD8+T细胞应答的比较结果的图。
图2为显示通过在C57BL/6小鼠模型中接种Mock、E6Co、E7Co、E67和E67Co、tE67Co、tFCoE67Co和tE67CoLCo产生的E6特异性CD8+T细胞应答的比较结果的图。
图3为显示在用Mock、E6Co、E7Co、E67和E67Co、tE67Co、tFCoE67Co和tE67CoLCo接种的C57BL/6小鼠中对皮下注射TC-1肿瘤细胞的预防性抗肿瘤作用的比较结果的图，，该作用通过肿块体积的增加来指示。
图4为显示通过在患TC-1肿瘤的C57BL/6小鼠中用mock、tE67Co、tFCoE67Co和tE67CoLCo治疗产生的E7特异性CD8+T细胞应答的比较结果的图。
图5为显示通过在患TC-1肿瘤的C57BL/6小鼠中用mock、tE67Co、tFCoE67Co和tE67CoLCo治疗产生的E6特异性CD8+T细胞应答的比较结果的图。
图6为显示通过在作为治疗模型的患TC-1肿瘤的C57BL/6小鼠中用mock、tE67Co、tFCoE67Co和tE67CoLCo治疗产生的治疗性抗肿瘤作用的比较结果的图。
具体实施方式
根据本发明的一个技术方案，提供了一种用于受试者的融合蛋白，该融合蛋白包括人乳头瘤病毒(HPV)的E6和E7融合多肽、用于将多肽分泌到细胞外的信号肽和免疫增强肽。
构成本发明的融合多肽的E6和E7是源于16型、18型、31型、33型、45型和51型人乳头瘤病毒(HPV)的抗原蛋白，并且它们优选为源于16型(HPV16)或18型(HPV18)人乳头瘤病毒的E6和E7抗原蛋白。
在本发明中，“人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽”这种表述指其中E6和E7各为天然氨基酸序列或者E6和E7中任一为天然氨基酸序列的氨基酸突变型的多肽的融合蛋白。本文中所用术语“突变型”指一种多肽，该多肽通过使至少一个氨基酸残基经过缺失、插入、保守性置换或这些的组合而使其具有与天然氨基酸序列不同的氨基酸序列，但其具有与天然E6和E7多肽基本相同的免疫原性，并且能够天然或人造产生。在一个实施方式中，例如，突变型为SEQ ID NO：4，其中在编码16型人乳头瘤病毒(HPV16)的E6多肽的氨基酸序列中，第63位和106位的半胱氨酸被甘氨酸替换；SEQ ID NO：6，其中在编码HPV16的E7多肽的氨基酸序列中，第24位的半胱氨酸和第26位的谷氨酸被甘氨酸替换；SEQ ID NO：10，其中在编码HPV18的E6多肽的氨基酸序列中，第65位和第108位的半胱氨酸被甘氨酸替换；或者SEQ ID NO：12，其中在编码HPV18的E7多肽的氨基酸序列中，第27位的半胱氨酸和第29位的谷氨酸被甘氨酸替换。
本发明的人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽可以是E6/E7融合多肽的形式，其中相对于E7，E6位于氨基末端，就是说，E7接着E6(E6/E7融合多肽)；或者其中相对于E7，E6位于羧基末端，就是说，E6接着E7(E7/E6融合多肽)。在具体实施方式中，例如，融合多肽可为SEQ ID NO：8的HPV16E6/E7融合多肽或者SEQ ID NO：14的HPV18E6/E7融合多肽。
本发明中，术语“信号肽”指由约20～30个氨基酸组成的肽，该肽将在细胞内表达的蛋白，尤其是包含E6/E7融合多肽的蛋白分泌到细胞外面。用于使多肽分泌到细胞外面的信号肽及编码该肽的核酸序列被称为“分泌信号序列”。本发明的E6和E7抗原是在已被病毒感染并因此具有弱免疫性的细胞的核内表达的蛋白(核蛋白)。因此，由分泌信号序列表达的信号肽能够诱导E6和E7抗原分泌到细胞外面，以增强抗原特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。因此，就本发明的信号肽而言，可以使用tPA、HSV gDs及生长激素等的分泌信号序列，但不限于此。优选地，可使用在包括哺乳动物的高等真核细胞中所用的信号肽，更优选tPA(组织型纤溶酶原激活物)。
本文中所用术语“免疫增强肽”指激活参与免疫应答的细胞(例如树突状细胞等)以增强免疫应答的肽。免疫增强肽的实例包括CD40配体、Flt3配体、鞭毛蛋白和OX40。本发明中，至少一种免疫增强肽可选择使用以上所列的肽，并且优选该肽可选择单独使用。在本发明的具体实施方式中，CD40配体和Flt3配体单独或组合使用。本发明的“Flt3配体”是一种因子，该因子诱导树突状细胞(DC)的增殖与成熟，经抗原增强免疫应答，以及在与肿瘤抗原融合时非常有效地使肿瘤减小。本文中所用术语“CD40配体”是与存在于如树突状细胞的抗原递呈细胞(APC)表面上的CD40相互作用以激活树突状细胞等的配体。
本文中所用“受试者”包括如人、猴、鼠、猪、母牛和兔的哺乳动物，但不限于此。
本发明的融合蛋白对抗原特异性免疫应答以及抑制肿瘤的发生和生长非常有效。确实，人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽诱导E6和E7特异性CD8+T细胞应答并显示出比E6或E7更强的抗肿瘤作用。另外，发现一种融合蛋白导致非常有效的抗原特异性免疫应答并且抑制肿瘤的发生和生长，在该融合蛋白中，人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽与信号肽和免疫增强肽结合。在具体实施方式中，发现一种融合蛋白与人乳头瘤病毒的E6和E7各自相比对抗原特异性免疫应答、抑制肿瘤的发生和生长以及抑制肿瘤大小非常有效，在该融合蛋白中，人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽与作为信号肽的tPa和作为免疫增强物的Flt3配体和/或CD40配体结合。因此，本发明的融合蛋白可用于肿瘤的治疗和预防。
本发明的另一实施方式涉及编码所述融合蛋白的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可通过化学合成方法或遗传工程技术而制备。化学合成方法为本领域技术人员已知的，并且可使用任何方法。此外，其可以从商用合成者或制造商购买。在通过遗传工程技术制备的情况下，例如通过分别编码已知商用的E6和E7融合多肽、信号肽和免疫增强肽的核酸片段以及连接这些片段以符合读框而制备。制得核酸片段的方法为本领域已知的，并且本领域技术人员可以将其通过适当的限制酶连接。在本发明的具体实施方式中，公开了通过化学合成法制备多核苷酸的方法。
本发明的还一实施方式涉及包含所述多核苷酸的重组载体。
本文中所用术语“载体”指包括外源DNA的遗传结构，所述外源DNA已被插入到编码多肽的基因组中。本文中所用术语“表达载体”指一种载体，在该载体中将编码分泌信号序列的核酸序列、编码人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽的核酸序列以及编码免疫增强肽的核酸序列等插入到基因组中，并且其实例包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体、酵母载体和病毒载体(如腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺伴随病毒载体)。
本文中所用术语“分泌信号序列”指编码将在细胞内表达的肿瘤抗原分泌到细胞外面并使其被免疫细胞识别的肽的核酸序列，并且其实例包括如tPA、HSV gDs和生长激素的分泌信号序列。优选地，可以使用哺乳动物的高等真核细胞中所用的分泌信号序列，更优选tPA(组织型纤溶酶原激活物)。此外，本发明的分泌信号序列可在用在宿主细胞中具有高表达频率的密码子替换之后使用。
本文中所用表述“编码免疫增强肽的核酸序列”指编码通过激活参与免疫应答的细胞(例如树突状细胞等)而增强免疫应答的肽的核酸序列。免疫增强肽的实例包括CD40配体、Flt3配体、鞭毛蛋白和OX40。本发明中，可选择使用至少一种这些免疫增强肽，并且优选可选择使用每个肽。在本发明的具体实施方式中，CD40配体和Flt3配体单独或者组合使用。编码免疫增强肽的核酸序列可在用在宿主细胞中具有高表达频率的密码子替换之后使用。
本发明的重组载体中包含的多核苷酸可用在宿主细胞中具有高表达频率的密码子替换。本文中所用表述“用在宿主细胞中具有高表达频率的密码子替换”或“密码子最优化”指当宿主细胞中DNA转录和翻译成蛋白时在指示氨基酸的密码子中用具有更高偏爱性的密码子替换在一些宿主中具有高偏爱性的密码子，从而增强由核酸编码的氨基酸或蛋白的表达效率。本文中，术语“宿主细胞”包括原核细胞或真核细胞，并且真核细胞包括如真菌和酵母的低等真核细胞以及如哺乳动物的高等真核细胞。
除了密码子最优化之外，本发明的重组载体中包含的编码人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽的多核苷酸可用一些编码E6和E7的核酸序列替换以避免产生致癌性。
就本发明的人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽而言，与使用单独表达的E6和E7作为免疫原相比，使用以融合多肽表达的E6和E7作为免疫原更加有效地诱导抗肿瘤作用。此外，用在宿主细胞中具有高表达频率的密码子替换的编码E6和E7融合多肽的核酸序列与未经替换的相比更加有效地诱导抗原特异性免疫应答。此外，即使出现了使E6和E7的一些核酸序列缺失以避免致癌性的突变，也可有效诱导免疫应答。在具体实施方式中，在SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：13中，描述了最优化和突变密码子的HPV16E6和E7或者HPV18E6和E7融合的E6/E7融合多肽的核酸序列。此外，与E6/E7融合多肽单独表达相比，E6/E7融合多肽与由分泌信号序列产生的信号肽以及免疫增强肽的共表达提高抗原特异性免疫应答的效率，并且抑制肿瘤的大小和发生。
以在宿主细胞中适于表达编码本发明的融合蛋白的核酸的形式，本发明的重组载体可包含编码融合蛋白的核酸。就是说，本发明的重组载体包括至少一个基于宿主细胞选择的用于表达的调控序列，并且将调控序列与要表达的核酸序列有效连接。表述“有效连接”指将核苷酸序列与调控序列连接以表达(例如，在体外转录/翻译系统中或者在宿主细胞中)。术语“调控序列”包括启动子、增强子及其他调控元件(例如多腺苷酸化信号)。调控序列包括在许多宿主细胞中定向组成型表达目的核酸的调控序列和仅在特异性宿主细胞中定向表达目的核酸的调控序列(例如组织特异性调控序列)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可根据如要转化的宿主细胞的选择和目的蛋白的表达水平的因素而改变。本发明的表达载体可引入宿主细胞中以表达融合蛋白。
例如，本发明的载体可通过标准重组DNA技术制备，并且标准重组DNA技术包括，例如，平端和粘端连接，用限制酶处理以提供适当的末端，通过用碱性磷酸酶处理除去磷酸基以避免非特异性结合，以及通过T4DNA连接酶酶连接。通过化学合成方法或遗传工程技术制得的编码信号肽、人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽和免疫增强肽的各DNA可与包含适合调控序列的载体重组以提供本发明的载体。包含调控序列的载体可商购或制备，并且在本发明中，其使用pGX10而制备，该载体为在第2003-47667号韩国专利申请公开中披露的用于制备疫苗的载体。
本发明的还一实施方式涉及包含所述核酸序列的重组载体，所述核酸序列编码SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：13的E6/E7多核苷酸，其具有密码子最优化和编码一些氨基酸的核酸的替换。
包含本发明的SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：13的核酸序列的重组载体可进一步包含分泌信号序列和编码免疫增强肽的氨基酸序列。分泌信号序列的实例包括tPA、HSV、gDs和生长激素的分泌信号序列，优选在如哺乳动物的高等真核生物中所用的分泌信号序列，并且更优选tPa(组织型纤溶酶原激活物)。编码免疫增强肽的上述序列的实例包括编码CD40配体、Flt3配体、鞭毛蛋白和OX40的氨基酸序列。至少一种免疫增强肽可使用选自上述所列的肽，且优选可选择单独使用所述肽。在本发明的具体实施方式中，CD40配体和Flt3配体单独或组合使用。此外，分泌信号序列和编码免疫增强肽的核酸序列优选用在宿主细胞中具有高表达频率的密码子替换。在具体实施方式中，tPa包含SEQ ID NO：1的核酸序列，Flt3配体包含SEQ ID NO：15的核酸序列，以及CD40配体包含SEQ ID NO：17的核酸序列。
另一实施方式中，本发明的重组载体可用于制备本发明的融合蛋白，作为基因治疗的基因转移的载体，或者作为向受试者施用的药物活性成分。
本发明的还一实施方式涉及在受试者中用于治疗和预防由人乳头瘤病毒引起的疾病的药物组合物，该药物组合物包含本发明的融合蛋白和可药用载体。本发明中，受试者的实例包括如人、猴和鼠的哺乳动物，但不限于此。由病毒引起的疾病的实例包括子宫颈癌、尖锐湿疣和瘰粒。
本发明的组合物中所用的可药用载体的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。该组合物可额外包含润滑剂、湿润剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。
本发明的组合物可通过包括静脉内、肌内、经口、经皮、经皮肤、鼻内、气管内和皮下施用的任何各种途径向受试者施用，但不限于此。本发明的组合物可通过施用组合物至体外培养细胞中然后施用该培养细胞至受试者体内而间接向受试者施用。本发明的组合物可系统地或局部地施用。
本发明的组合物可制成包括但不限于粒剂、粉剂、溶液、片剂、胶囊、干糖浆剂等的口服给药剂型，或者包括血管注射剂的非肠道给药剂型。本发明的组合物优选以溶液或血管注射剂的给药剂型。
本发明的融合蛋白作为活性成分的有效量可在约0.05～500mg/kg体重，优选0.5～50mg/kg体重的范围内，并且可以单次剂量或分份剂量施用。然而，应当理解，施用活性成分的量应根据包括治疗条件、患者的年龄和体重以及患者症状的严重程度的各种相关因素确定；并因此以上剂量不应以任何方式用来限制本发明的范围。
本发明的还一实施方式涉及在受试者中用于治疗和预防由人乳头瘤病毒引起的疾病的药物组合物，该药物组合物包含本发明的重组载体和可药用载体。本发明中，受试者的实例包括如人、猴和鼠的哺乳动物，但不限于此。由病毒引起的疾病的实例包括子宫颈癌、尖锐湿疣和瘰粒。
本发明的组合物中所用的可药用载体的实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。该组合物可额外包含润滑剂、湿润剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。
本发明的组合物可通过包括静脉内、肌内、经口、经皮、经皮肤、鼻内、气管内和皮下施用的任何各种途径向受试者施用，但不限于此。本发明的组合物可通过施用组合物至体外培养细胞中然后施用该培养细胞至受试者体内而间接向受试者施用。本发明的组合物可系统地或局部地施用。
本发明的组合物可制成包括但不限于粒剂、粉剂、溶液、片剂、胶囊、干糖浆剂等的口服给药剂型，或者包括血管注射剂的非肠道给药剂型。本发明的组合物优选以溶液或血管注射剂的给药剂型。
本发明的融合蛋白作为活性成分的有效量可在约0.05～500mg/kg体重，优选0.5～50mg/kg体重的范围内，并且可以单次剂量或分份剂量施用。然而，应当理解，施用活性成分的量应根据包括治疗条件、患者的年龄和体重以及患者症状的严重程度的各种相关因素确定；并因此以上剂量不应以任何方式用来限制本发明的范围。
本发明的还一实施方式涉及用于在受试者中治疗由人乳头瘤病毒引起的疾病的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物的步骤。
本发明的药物组合物、该组合物的功效、施用方式和施用量如上所述。本发明的方法中，受试者的实例包括如人、猴、鼠、猪、母牛和兔的哺乳动物，但不限于此。
在下文，将参照实施例描述本发明。但是，提供的实施例仅用来说明本发明，并且本发明的范围并不限于实施例。
实施例
实施例1：pGX10/tE67CoDNA的构建
本发明的实施例中所用缩写的定义如下：
“Co”表示最优化密码子的核酸序列；“tPa”或“t”表示组织型纤溶酶原激活物的分泌信号序列；“F”表示Flt3配体；以及“L”表示CD40配体。
化学合成包含SEQ ID NO：1的核酸序列的最优化密码子的tPa分泌信号序列。向末端加入EcoRI-KpnI(5′)和Eco47III-NheI(3′)位点。化学合成包含SEQ ID NO：7的核酸序列的最优化密码子的HPV16E6E7，向末端加入Eco47III-NheI(5′)和AscI-XhoI(3′)位点以便于插入到载体中。此外，向E6和E7的接头加入BamHI位点。为了排除由致癌性引起的性质，在E6中，用甘氨酸替换第63位密码子(半胱氨酸)；并且用指示甘氨酸的密码子替换第106位密码子(半胱氨酸)(SEQ ID NO：3)。在E7中，用甘氨酸替换第24位密码子(半胱氨酸)；并且用指示甘氨酸的密码子替换第26位密码子(谷氨酰胺)(SEQ ID NO：5)。用EcoRI与NheI酶处理用于制备DNA疫苗的载体，pGX10(第2003-0047667号韩国专利申请公开)，从而使用连接酶连接合成的分泌信号序列tPa。使用NheI与XhoI酶酶切生成物以使用连接酶连接HPV16E6E7，从而制备pGX10/tE67Co。
实施例2：pGX10/tFCoE67CoDNA的构建
以连接的形式化学合成包含SEQ ID NO：1的核酸序列的最优化密码子的tPa分泌信号序列和包含SEQ ID NO：15的核酸序列的最优化密码子的Flt3L。向末端加入KpnI(5′)与EcoRV(3′)位点以便于插入到载体中。用KpnI与Eco47III酶处理实施例1中制备的pGX10/tE67Co，并且仅除去分泌信号序列tPa。然后，使用连接酶连接tFCo以制备pGX10/tFCoE67Co。
实施例3：pGX10/tE67CoLCoDNA的构建
化学合成包含SEQ ID NO：17的核酸序列的最优化密码子的CD40L。向末端加入AscI(5′)和XhoI(3′)位点以便于插入到载体中。用AscI与XhoI酶处理实施例1中制备的pGX10/tE67Co，并且使用连接酶连接CD40LCo以制备pGX10/tE67CoLCo。
实施例4：pGX10/tE67Co.pGX10/tFCoE67Co和pGX10/tE67CoLCo预防子宫颈癌的作用的证实
为了证实pGX10/tE67Co.pGX10/tFCoE67Co和pGX10/tE67CoLCo预防子宫颈癌的作用，将其每隔三周两次以50μg的量分别肌内注射至C57BL/6小鼠中，以及在同样的间隔以相同的量将pGX10、pGX10/E6Co、pGX10/E7Co、pGX10/E67Co和pGX10/E67肌内注射作为对照组。在最初肌内注射之后的6.5周取出小鼠的脾，并且将1x106个细胞与IL-2及E6或E7CD8T细胞表位(E648-57；EVYDFAFRDL，E749-57；RAHYNIVTF，Peptron，Korea)一起置于已用50μL的3μg/ml的抗鼠IFN-γ抗体(BD Pharmingen，Sandiego，CA)包被的平板。在37℃和5％CO2的培养箱(Forma，Minnesota，CA)中培养24小时。用PBST洗涤该平板，然后向其中加入50μL含有2μg/mL悬垂生物素的IFN-γ检测抗体(BD Pharmingen，Sandiego，CA)，并且将其在环境温度下培养约3小时。其后，将其用PBST洗涤，并且将50μL已稀释至1:2000的链霉抗生物素蛋白-AKP(碱性磷酸酶)加入其中，并且在环境温度下培养该生成物1小时。将其用PBST洗涤，然后向该生成物中加入50μL的在10mL碱性磷酸盐缓冲液中的66μLNBT(Promega，Madison，WT)与33μLBCIP(Promega，Madison，WT)的混合物以使其相互反应。为了通过反应得到清楚颜色的呈现，将产物置于37℃的培养箱中大约30分钟，且用蒸馏水(D.W)洗涤，并且通过计数器对产生的斑点计数(见图1和2)。
利用ELISPOT使用E6CD8T细胞表位和E7CD8T细胞表位测量E6/E7-特异性T细胞免疫应答，结果是，发现pGX10/E67Co比pGX10/E67诱导更高程度的抗原特异性免疫应答，这说明密码子最优化对增强抗原特异性免疫应答更加有效。进一步，发现pGX10/tE67Co比pGX10/E67Co诱导更高程度的CD8T细胞免疫应答，这说明分泌信号序列，tPa，对改进抗原特异性免疫应答也是有效的。进一步，发现pGX10/tE67CoLCo比pGX10/tE67Co诱导较低程度的E6特异性免疫应答，但与其他对照组相比，诱导基本相同程度的E7特异性应答，这说明其对增强免疫应答是有效的。已证实，pGX10/tFE67Co对E6和E7特异性免疫应答的诱导是最有效的。
在最初注射之后的6.5周，将表达HPV16E6和E7的肿瘤细胞TC-1以5x105个细胞皮下注射至受试者中，并且测量肿瘤细胞体积的增加(见图3)。特别是，在E6和E7特异性免疫应答中，与E6Co和E7Co各自相比，融合产物，E67Co诱导较低程度的免疫应答(见图1和2)，但对注射的TC-1肿瘤细胞呈现出较高的抗癌作用。这说明，因为E67融合产物能够针对两种肿瘤抗原E6和E7同时诱导免疫应答，而不是单独针对其一(即使该应答很强)诱导免疫应答，所以其具有较好的抗癌作用。已观察到注射肿瘤细胞后直到24天为止在已被注射了pGX10/tE67Co、pGX10/tFCoE67Co和pGX10/tE67CoLCo的小鼠中未出现肿瘤，但在其他对照组中，注射肿瘤细胞后从第9天的时间点肿瘤体积急剧增加。因此，可以证实，pGX10/tE67Co、pGX10/tFCoE67Co和pGX10/tE67CoLCo具有较高的预防子宫颈癌的能力。
实施例5：pGX10/tE67Co、pGX10/tFCoE67Co、pGX10/tE67CoLCo的子宫颈癌的治疗作用的证实
为了证实pGX10/tE67Co.pGX10/tFCoE67Co和pGX10/tE67CoLCo的子宫颈癌的治疗作用，将TC-1肿瘤细胞以5x105个细胞分别皮下注射至C57BL/6小鼠中，并且进一步在最初注射TC-1肿瘤细胞之后的第3天和第8天以50μg的量肌肉注射。从注射肿瘤细胞的当天(第0天)起，到第21天观察肿块体积的改变，并且在第22天取出小鼠的脾，并且以与实施例4中所述的相同方式(ELISPOT)测量CD8T细胞免疫应答(对E6和E7抗原特异)的诱导程度。与作为对照组的pGX10相比，在用pGX10/tE67Co、pGX10/tFCoE67Co和pGX10/tE67CoLCo处理的小鼠中诱导较高程度的抗原特异性免疫应答，特别是，在用pGX10/tFCoE67Co处理的小鼠中测量出最高程度的免疫应答，这说明pGX10/tFCoE67Co对诱导抗癌免疫应答具有高功效(见图4和5)。
已发现，与作为对照组的用pGX10处理的小鼠相比，已用针对TC-1肿瘤细胞的pGX10/tE67Co、pGX10/tFCoE67Co和pGX10/tE67CoLCo免疫处理过的小鼠的肿瘤体积显示了明显减小。此外，还发现，直到在注射肿瘤细胞后的第12天肿瘤体积不断增大，然后该体积开始减小，特别是，发现在已用pGX10/tFCoE67Co和pGX10/tE67CoLCo免疫处理的小鼠中，肿瘤体积在第21天基本为零，这说明其具有子宫颈癌的治疗作用(见图6)。
Figure IDA00002896628200011
Figure IDA00002896628200021
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Claims (40)

1.一种用于受试者的融合蛋白，该融合蛋白由人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽、用于使多肽分泌到细胞外面的信号肽tPa和免疫增强肽CD40配体或Flt3配体组成，其中，所述E6和E7融合多肽的氨基酸序列如SEQID NO:8所示，所述信号肽tPa的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，以及所述免疫增强肽CD40配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述免疫增强肽Flt3配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述E6和E7融合多肽源于16型人乳头瘤病毒(HPV16)。
3.编码权利要求1的融合蛋白的多核苷酸。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中，编码E6和E7融合多肽的序列源于16型人乳头瘤病毒(HPV16)。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中，用哺乳动物的最优化密码子修饰所述编码E6和E7融合多肽的序列，以提高基因表达率。
6.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中，用哺乳动物的最优化密码子修饰编码所述信号肽tPa的序列，以提高基因表达率。
7.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中，用哺乳动物的最优化密码子修饰编码所述免疫增强肽CD40配体或Flt3配体的序列，以提高基因表达率。
8.包含根据权利要求3所述的多核苷酸的重组载体。
9.根据权利要求8所述的重组载体，其中，编码所述E6和E7融合多肽的序列源于16型人乳头瘤病毒(HPV16)。
10.根据权利要求9所述的重组载体，其中，用哺乳动物的最优化密码子修饰所述编码E6和E7融合多肽的序列，以提高基因表达率。
11.根据权利要求10所述的重组载体，其中，所述编码E6和E7融合多肽的核酸序列如SEQ ID NO:7所示。
12.根据权利要求8所述的载体，其中，编码所述信号肽tPa的分泌信号序列是密码子最优化的。
13.根据权利要求12所述的载体，其中，编码所述tPa的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
14.根据权利要求8所述的载体，其中，编码所述免疫增强肽CD40配体或Flt3配体的核酸序列是密码子最优化的。
15.根据权利要求14所述的载体，其中，编码所述Flt3配体的核酸序列如SEQ ID NO:15所示。
16.根据权利要求14所述的载体，其中，编码所述CD40配体的核酸序列如SEQ ID NO:17所示。
17.根据权利要求8所述的载体，其中，所述载体是质粒载体。
18.一种在受试者中用于治疗和预防由人乳头瘤病毒引起的疾病的药物组合物，该药物组合物包含权利要求1的融合蛋白和可药用载体。
19.一种在受试者中用于治疗和预防由人乳头瘤病毒引起的疾病的药物组合物，该药物组合物包含权利要求8的载体和可药用载体。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述疾病为子宫颈癌。
21.根据权利要求19所述的组合物，其中，载体中编码所述E6和E7融合多肽的序列源于16型人乳头瘤病毒(HPV16)。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中，用哺乳动物的最优化密码子修饰所述编码E6和E7融合多肽的序列，以提高基因表达率。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中，所述编码E6和E7融合多肽的核酸序列如SEQ ID NO:7所示。
24.根据权利要求19所述的组合物，其中，在所述载体中编码所述信号肽tPa的分泌信号序列是密码子最优化的。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中，编码所述tPa的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
26.根据权利要求19所述的组合物，其中，编码所述免疫增强肽CD40配体或Flt3配体的核酸序列是密码子最优化的。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中，编码所述Flt3配体的核酸序列如SEQ ID NO:15所示。
28.根据权利要求26所述的组合物，其中，编码所述CD40配体的核酸序列如SEQ ID NO:17所示。
29.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述载体是质粒载体。
30.根据权利要求8所述的载体在制备治疗或预防由人乳头瘤病毒引起的疾病的药物中的用途。
31.根据权利要求30所述的用途，其中，所述疾病为子宫颈癌。
32.根据权利要求30所述的用途，其中，在所述载体中编码E6和E7融合多肽的序列源于16型人乳头瘤病毒(HPV16)。
33.根据权利要求32所述的用途，其中，用哺乳动物的最优化密码子修饰所述编码E6和E7融合多肽的序列，以提高基因表达率。
34.根据权利要求33所述的用途，其中，所述编码E6和E7融合多肽的核酸序列如SEQ ID NO:7所示。
35.根据权利要求30所述的用途，其中，在所述载体中编码所述信号肽tPa的分泌信号序列是密码子最优化的。
36.根据权利要求35所述的用途，其中，编码所述tPa的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
37.根据权利要求30所述的用途，其中，编码所述免疫增强肽CD40配体或Flt3配体的核酸序列是密码子最优化的。
38.根据权利要求37所述的用途，其中，编码所述Flt3配体的核酸序列如SEQ ID NO:15所示。
39.根据权利要求37所述的用途，其中，编码所述CD40配体的核酸序列如SEQ ID NO:17所示。
40.根据权利要求30所述的用途，其中，所述载体是质粒载体。
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