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Diese
Erfindung betrifft rekombinante virale HPV16-Proteine. Sie betrifft
insbesondere rekombinante virale HPV16-Proteine, welche zur Verwendung
in der Diagnose, Prophylaxe und Therapie von viralen HPV16-Infektionen
geeignet sind.
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Hintergrund
der Erfindung
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Papillomaviren
infizieren die Epithelien einer großen Vielzahl von Tierarten,
einschließlich
Menschen, wobei im Allgemeinen gutartige epitheliale und fibro-epitheliale
Tumoren oder Warzen an der Infektionsstelle hervorgerufen werden.
Jede Wirbeltierart wird von einer anderen Gruppe von Papillomaviren
infiziert, wobei jede Papillomavirusgruppe mehrere Papillomavirustypen
umfasst. Zum Beispiel sind mehr als 60 verschiedene humane Papillomavirus(HPV)-Genotypen
isoliert worden. Papillomaviren sind in hohem Maße speziesspezifische infektiöse Agenzien;
beispielsweise kann ein Rinder-Papillomavirus keine Papillome in
heterologen Spezies, wie Menschen herbeiführen. Papillomavirus-Typen
scheinen ebenfalls in hohem Maße
spezifisch als Immunogene zu sein, dahingehend, dass eine neutralisierende
Immunität
gegen Infektion gegen einen Papillomavirus-Typ üblicherweise keine Immunität gegen
einen anderen Typ vermittelt, sogar wenn die Typen eine homologe
Spezies infizieren.
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In
Menschen repräsentieren
genitale Warzen, welche von humanen Papillomaviren verursacht werden,
eine sexuell übertragene
Krankheit. Genitale Warzen sind sehr häufig und eine subklinische
oder nicht-offenkundige HPV-Infektion ist sogar häufiger als
eine klinische Infektion. Manche gutartigen Schäden in Menschen, insbesondere
diejenigen, welche durch bestimmte Papillomavirus-Typen entstehen,
durchlaufen eine maligne Progression. Aus diesem Grunde ist die
Infektion durch einen der mit Malignität assoziierten Papillomavirus-Typen
angenommenermaßen
einer der signifikantesten Risikofaktoren in der Entwicklung von
Gebärmutterhalskrebs,
dem zweithäufigsten
Krebs von Frauen weltweit (zur Hausen, H., 1991; Schiffman, M.,
1992). Es sind mehrere unterschiedliche HPV-Genotypen bei Gebärmutterhalskrebs
gefunden worden, wobei HPV16 der häufigste Typ ist, welcher aus
50% der Gebärmutterhalskrebs-Fälle isoliert
wird.
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Immunologische
Untersuchungen, welche die Produktion neutralisierender Antikörper gegen
Papillomavirus-Antigene nachweisen, weisen darauf hin, dass Papillomavirus-Infektionen
und mit diesen Infektionen assoziierte Malignitäten in Wirbeltieren durch Impfung
verhindert werden könnten;
allerdings ist die Entwicklung von wirksamen Papillomavirus-Impfstoffen
durch eine Reihe von Schwierigkeiten behindert worden.
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Zum
Ersten ist es nicht möglich
gewesen, die zur Bestimmung der strukturellen und immunogenen Merkmale
von Papillomavirus, welche fundamental für die Entwicklung von wirksamen
Impfstoffen sind, erforderlichen großen Vorräte an infektiösem Virus
in vitro zu erzeugen. Kultivierte Zellen exprimieren Papillomavirus-Onkoproteine
und andere nicht-strukturelle
Proteine, und diese sind in vitro umfassend untersucht worden; jedoch
findet die Expression der viralen Strukturproteine L1 und L2 (und
der anschließende
Zusammenbau des infektiösen
Virus) nur in terminal-differenzierten Schichten von infizierten
Epithelgeweben statt. Deshalb ist die Charakterisierung von viralen
Genen, Proteinen und der Struktur notwendigerweise aus Untersuchungen
von aus Papillomen geerntetem Virus zusammengefügt worden. Insbesondere wurden
die Papillomavirus-Struktur und damit zusammenhängende Immunität im Rinder-Papillomavirus-System
untersucht bzw. ausgeführt,
weil große
Mengen an infektiösen
Viruspartikeln aus Rinder-Papillomavirus (BPV)-Warzen isoliert werden
können.
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Die
bislang aus Untersuchungen der Papillomavirus-Struktur abgeleiteten
Informationen weisen darauf hin, dass alle Papillomaviren nicht-eingehüllte 50–60 nm große ikosaedrische
Strukturen sind (Crawford, L., et al., 1963), welche aus dem konservierten
Haupt-Kapsidprotein L1 und dem weniger stark konservierten Neben-Kapsidprotein
L2 aufgebaut sind (Baker, C., 1987). Es gibt keine Sequenz-Verwandtschaft
zwischen den zwei Proteinen. Die Funktion und Lokalisierung von
L2 in dem Kapsid ist unklar; allerdings legen immunologische Daten
nahe, dass der Großteil
von L2 intern zu L1 vorkommt.
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Vor
kurzem hat die Hochauflösungs-Kryoelektronenmikroskopie-Analyse
von BPV1- und HPV1-Virionen festgestellt, dass die zwei Viren eine
sehr ähnliche
Struktur, mit 72 pentameren Kapsomeren, aufweisen, wobei jedes Kapsomer
vermutlich aus fünf
L1-Molekülen
unter Bildung einer Virionhülle
mit einer Symmetrie T = 7 aufgebaut ist (Baker, T., 1991). Die Lokalisierung
des Neben-Kapsidproteins L2 in dem Virion ist nicht ermittelt worden,
und es ist nicht sicher, ob L2 oder andere virale Proteine für den Kapsid-Zusammenbau
benötigt
werden. Oberflächlich ähnelt die
Papillomavirusstruktur derjenigen des Polyoma-45-nm-Virions, welches die
gleiche Symmetrie und Kapsomeranzahl aufweist (Liddington, R., et
al., 1991); allerdings sind die Systeme des Intrakapsomer-Kontaktes
für Polyomavirus-
und Papillomavi rus-Arten unterschiedlich, und die Haupt- und Neben-Kapsidproteine
von Polyomavirus sind genetisch nicht mit L1 und L2 verwandt.
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Untersuchungen
an Rinder-Papillomavirus werden durch einen für BPV entwickelten quantitativen
focalen Transformations-Infektionsvermögens-Assay, welcher nicht für HPV verfügbar ist
(Dvoretzky, I., et al., 1980), und ein Verständnis der Immunität gegen
Papillomavirus ist deshalb aus dem Rinder-Papillomavirussystem entwickelt
worden. Beschränkte
Untersuchungen unter Verwendung von intaktem Rinder-Papillomavirus
zeigten, dass die nicht-kutane
Inokulation von infektiösem
oder Formalin-inaktiviertem BPV-Virus als ein Impfstoff zur Verhinderung
einer experimentellen BPV-Infektion in Kälbern wirksam war (Olson, C.,
et al., 1960; Jarrett, W., et al., 1990). Unglücklicherweise können BPV-Virionen
weder verwendet werden, um Impfstoffe gegen Papillomavirus, welches
andere Spezies infiziert, noch Impfstoffe gegen andere Rinder-Typen
herzustellen, und zwar aufgrund der großen Spezifität dieser
Viren sowie Bedenken hinsichtlich des onkogenen Potenzials von intakten
viralen Partikeln.
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Eine
signifikante Folgerung aus Untersuchungen der Papillomavirus-Immunität ist, dass
das Vermögen
von Antikörpern,
Papillomavirus zu neutralisieren, mit ihrer Fähigkeit zusammenhängen zu
scheint, mit typspezifischen, konformationsabhängigen Epitopen auf der Virionen-Oberfläche zu reagieren.
Zum Beispiel inhibieren gegen infektiöse BPV1-Virionen herangezogene
Kaninchen-Antiseren eine focale Transformation von C127-Zellen (Doretzky,
I., et al., 1980) sowie die Transformation von fötalen Rinderhauttransplantaten; während gegen
denaturierte Virionen erzeugte Antiseren dies nicht tun (Ghim, S.,
et al., 1991).
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Im
Gegensatz dazu wiesen neutralisierende Seren, welche gegen bakteriell
abgeleitetes BPV-L1
und -L2 (Pilacinski, W., et al., 1984; Jin, X., et al., 1989) und
gegen in vitro synthetisiertes Baumwollschwanzkaninchen-Papillomavirus(CRPV)-L1
und -L2 (Christensen, N., et al., 1991; Lin, Y-L., et al., 1992),
von denen keines die strukturellen Merkmale nativer Virionen aufweist,
erzeugt wurden, niedrige Titer auf, und die Verwendung von in E.
coli exprimierten rekombinanten HPV-L1-Fusionspeptiden zum Nachweis
einer zellulären
Immunreaktivität
hatte nur begrenzten Erfolg (Höpfl,
R., et al., 1991). Die Ergebnisse in dem BPV-System sind konsistent
mit denjenigen des HPV-Systems, in welchem monoklonale Antikörper, welche
eine HPV11-Infektion in einem Maus-Xenotransplantat-Assay neutralisierten,
native aber nicht denaturierte HPV11-Virionen erkannten (Christensen,
N., et al., 1990).
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Es
hat vereinzelte Versuche gegeben, Papillomavirus-Kapside in vitro
herzustellen. Zhou, J., et al. (1991) und (1992) erzeugten virusartige
Teilchen durch Klonieren von HPV-L1- und -L2-Genen und HPV-L1- und
-L2-Genen in Kombination mit HPV-E3/E4-Genen in einen Vaccinia-Virus-Vektor
und Infizieren von CV-1-Säugerzellen
mit dem rekombinanten Vacciniavirus. Diese Untersuchungen wurden
von Zhou interpretiert, um zu untermauern, dass die Expression von
HPV16-L1- und -L2-Proteinen in Epithelzellen notwendig und hinreichend
ist, um die Montage von Partikeln vom Viriontyp zu gestatten. Mit
doppelt-rekombinantem Vacciniavirus, welches L1- und L2-Proteine
exprimierte, infizierte Zellen zeigten kleine (40 nm) virusartige
Partikel im Zellkern, welche unvollständig zusammengebaute Ansammlungen
von HPV-Kapsomeren zu sein schienen. Bei Exprimieren von L1-Protein
allein, oder als L2-Protein
allein exprimiert wurde, wurden keine virusartigen Partikel erzeugt;
Zellen, welche mit einzeln-rekombinantem Vacciniavirus, enthaltend
L1- und L2-Gene, doppelt infiziert worden waren, stellten ebenfalls
keine Partikel her. Es wurde keine neutralisierende Aktivität berichtet.
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Ghim
et al., (1992) berichteten, dass, wenn L1 aus HPV1, einem nicht-genitalen
Virustyp, welcher hauptsächlich
mit Warzen auf Händen
und Füßen assoziiert
ist, in Säugerzellen
exprimiert wurde, das L1-Protein konformationelle Epitope enthielt,
welche auf intakten Virionen zu finden sind. Ghim bestimmte nicht,
ob Partikel hergestellt wurden, noch wurde es untersucht, ob das
L1-Protein neutralisierende Antikörper induzieren könnte. Noch
kürzlicher
berichteten Hagansee et al. (1993), dass, wenn L1 aus HPV1 in humanen
Zellen exprimiert wurde, dieses eine Selbstmontage zu virusartigen
Partikeln zeigte. Es wurden keine Untersuchungen hinsichtlich neutralisierender
Antikörper
durchgeführt.
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Untersuchungen
in anderen Virussystemen, zum Beispiel Parvovirus, weisen darauf
hin, dass der Kapsid-Zusammenbau allein keine Immunogenität verleihen
kann. Parvovirus VP2 war bei Expression in Insektenzellen von sich
aus zur Selbstmontage in der Lage, aber nur Partikel, welche sowohl
VP1 als auch VP2 enthielten, waren in der Lage, neutralisierende
Antikörper
zu induzieren (Kajigaya, S., et al., 1991).
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Es
wäre vorteilhaft,
Verfahren zur Herstellung von erneuerbaren Papillomavirus-Reagenzien
von jedweder gewählten
Spezies und Typ in Zellkultur zu entwickeln. Es wäre ebenfalls
nutzbringend, derartige Papillomavirus-Reagenzien mit den Immunitäts-vermittelnden
Eigenschaften der konformationstragenden bzw. konformierten nativen
Viruspartikel herzustellen, welche als ein Untereinheit-Impfstoff
verwendet werden könnten.
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Es
ist deshalb das Ziel der Erfindung, diese rekombinanten konformationstragenden
Papillomavirus-Proteine sowie Verfahren für ihre Herstellung und Anwendung
vorzusehen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Erfindung richtet sich auf Diagnose und Prävention von HPV16-Infektionen
und ihren gutartigen und bösartigen
Folgeerscheinungen durch Vorsehen von rekombinanten HPV16-Kapsidproteinen,
welche sich unter Bildung von Kapsomerstrukturen, umfassend konformationelle
Epitope, welche in hohem Maße
spezifisch und hochimmunogen sind, selbst zusammenbauen. Deshalb
wird gemäß der Erfindung
eine isolierte HPV16-Kapsomerstruktur, umfassend L1-Kapsidprotein,
vorgesehen, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapsomerstruktur in
der Lage ist, HPV16 neutralisierende Antikörper mit einem Titer von mindestens
103 zu induzieren, und dass die Selbstmontage
einer Kapsomerstruktur, bestehend aus L1 allein, mindestens 100-mal
effizienter ist als die Selbstmontage einer Kapsomerstruktur, bestehend
aus L2 und dem L1-Protein mit His in der Position 202. Die Kapsomerstruktur
kann weiterhin ein L2-Kapsidprotein umfassen. In einer bevorzugten Kapsomerstruktur
hat das L1-Kapsidprotein die Aminosäuresequenz von SEQ ID No: 2.
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Folglich
sieht die Erfindung einen Impfstoff vor, umfassend eine Kapsomerstruktur,
wie hierin obenstehend beschrieben.
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In
einem anderen Aspekt sieht die Erfindung eine Kapsomerstruktur,
wie hierin zuvor beschrieben, zur Verwendung als HPV16-Impfstoff
vor.
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Die
Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung einer Kapsomerstruktur,
wie hierin zuvor beschrieben, zur Herstellung eines Medikaments
zum Verhindern oder Behandeln einer HPV16-Infektion vor.
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Gemäß eines
anderen Aspekts sieht die Erfindung eine Nukleinsäure vor,
umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein HPV16-L1-Kapsidprotein
kodiert, das in der Lage ist, eine HPV16-Kapsomerstruktur zu bilden,
dadurch gekennzeichnet, dass die Kapsomerstruktur in der Lage ist,
HPV16 neutralisierende Antikörper
mit einem Titer von mindestens 103 zu induzieren,
und dass die Selbstmontage einer Kapsomerstruktur, bestehend aus
L1 allein, mindestens 100-mal wirksamer ist als die Selbstmontage
einer Kapsomerstruktur, bestehend aus L2 und dem L1-Protein mit
His an der Position 202.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Nukleotidsequenz SEQ ID No: 2.
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Die
Erfindung sieht ebenfalls einen Baculovirusvektor vor, umfassend
eine Nukleinsäure,
wie hierin zuvor beschrieben, unter der wirksamen Kontrolle eines
Promotors des Vektors. Der Vektor kann weiter eine für HPV16-L2
kodierende Sequenz unter der wirksamen Kontrolle eines Promotors
des Vektors umfassen.
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Die
Erfindung sieht ferner eine Insektenzelle vor, die mit dem Baculovirusvektor,
wie hierin zuvor beschrieben, transfiziert ist.
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In
einem anderen Aspekt sieht die Erfindung ein Genkonstrukt vor, umfassend
die Nukleinsäure,
wie hierin zuvor beschrieben, unter der wirksamen Kontrolle eines
Promotors, zur Verwendung als Impfstoff.
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Die
Erfindung schließt
deshalb die Verwendung eines Genkonstrukts, umfassend eine Nukleinsäure, wie
hierin zuvor beschrieben, unter der wirksamen Kontrolle eines Promotors
zur Herstellung eines Impfstoffs zum Verhindern oder Behandeln einer
HPV16-Infektion ein.
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In
einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zum Feststellen
einer humoralen Immunität gegen
eine Papillomavirus-Infektion bei einer Person vor, umfassend:
- (a) Bereitstellen einer wirksamen, Antikörper erfassenden
Menge an einer HPVI6-Kapsomerstruktur,
wie hierin obenstehend beschrieben;
- (b) Kontaktieren der Kapsomerstruktur mit einer Probe einer
Körperflüssigkeit
von einer auf eine Papillomavirus-Infektion zu untersuchenden Person
und Ermöglichen,
dass Papillomavirus-Antikörper,
die in der Probe enthalten sind, daran binden, um so Antigen-Antikörper-Komplexe
zu bilden;
- (c) Trennen der Komplexe von ungebundenen Substanzen;
- (d) Kontaktieren der Komplexe von (c) mit einem feststellbar
markierten, immunoglobulinbindenden Agens, das an die Komplexe bindet;
und
- (e) Feststellen des Vorhandenseins der Papillomavirus-Antikörper in
der Probe mittels des markierten immunoglobulinbindenden Agens,
das an die Komplexe bindet.
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Die
Erfindung schließt
ferner ein Verfahren zum Feststellen eines Papillomavirus in einer
Probe von einer Person ein, die vermutlich mit dem Virus infiziert
ist, umfassend:
- (a) Kontaktieren der Probe
mit für
Papillomavirus spezifischen Antikörpern, welche erzeugt wurden
gegen eine HPV16-Kapsomerstruktur, wie hierin zuvor beschrieben,
wobei die Antikörper
eine feststellbare, signalerzeugende Markierung aufweisen oder an
einem feststellbar markierten Reagens angebracht sind;
- (b) Ermöglichen,
dass in der Probe enthaltenes Papillomavirus daran bindet, um so
Antigen-Antikörper-Komplexe
zu bilden; und
- (c) Bestimmen des Vorhandenseins des Papillomavirus in der Probe
mittels der feststellbaren Markierung.
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Die
Erfindung sieht auch ein Diagnosekit zum Feststellen einer Papillomavirus-Infektion,
umfassend HPV16-Kapsomerstrukturen, wie hierin zuvor beschrieben,
einzeln oder in Kombination, zusammen mit Materialien zum Durchführen eines
Assays auf humorale Immunität
gegen Papillomavirus, oder Papillomavirus als solches, in einem
Einzelpackungsbehälter
vor.
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In
einem anderen Aspekt schließt
die Erfindung die Verwendung einer HPV16-Kapsomerstruktur, wie hierin
zuvor beschrieben, als in-vitro-Diagnosereagens in einem Bindungsassay,
wahlweise in einem Diagnosekit, zum Feststellen von Immunität verleihenden
neutralisierenden Antikörpern
gegen Papillomavirus ein.
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Die
Erfindung schließt
auch die Verwendung von für
Papillomavirus spezifischen Antikörpern, erzeugt gegen eine HPV16-Kapsomerstruktur,
wie hierin zuvor beschrieben, als in-vitro-Diagnosereagens in einem Bindungsassay,
wahlweise in einem Diagnosekit, zum Feststellen von Papillomavirus-Kapsidproteinen
ein.
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Gemäß der Erfindung
wird ein Genkonstrukt vorgesehen, umfassend eine HPV16-L1 konformationell kodierende
Sequenz, welche in einen Baculovirus-Transfervektor inseriert ist
und wirksam von einem Promotor dieses Vektors exprimiert wird. Die
Papillomavirus-L1 konformationell kodierende Sequenz kann aus einem Wildtyp-HPV16-Gen
isoliert sein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die HPV16-L1 konformationell kodierende Sequenz SEQ ID No: 2.
Das Genkonstrukt kann ferner eine Papillomavirus-L2 kodierende Sequenz
umfassen.
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Hierin
wird ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten HPV16-Kapsidproteins
vorgeschlagen, welches zu einer Kapsomerstruktur oder einem Teil
davon zusammengebaut ist, umfassend die Schritte des (1) Klonierens
eines HPV16-Gens, welches für
ein konformationelles L1-Kapsidprotein kodiert, in einen Transfervektor,
wobei das offene Leseraster des Gens unter der Kontrolle des Promotors
des Vektors steht; (2) Überführens des
rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle, worin das klonierte Papillomavirus-Gen
das Papillomavirus-Kapsidprotein
exprimiert; und (3) Isolierens von Kapsomerstrukturen, die das Papillomavirus-Kapsidprotein umfassen,
aus der Wirtszelle. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das klonierte
Papillomavirus-Gen im Wesentlichen aus der konformationelles L1
kodierenden Sequenz, und das exprimierte Protein montiert sich zu
Kapsomerstrukturen, welche im Wesentlichen aus L1-Kapsidprotein
bestehen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst der Klonierungsschritt
des Verfahrens ferner das Klonieren eines Papillomavirus- Gens, welches für L2-Kapsidprotein
kodiert, wodurch die L1- und L2-Proteine in der Wirtszelle koexprimiert
werden, und wobei die isolierte Kapsomerstruktur L1- und L2-Kapsidproteine umfasst;
mit der Maßgabe,
dass der Transfervektor kein Vacciniavirus ist, wenn die Wirtszelle
eine Säugerzelle
ist. Die konformationelles L1 kodierende Sequenz kann aus einem
Wildtyp-HPV16-Papillomavirus kloniert werden. In einer besonders
bevorzugten Ausführungsform
ist die konformationelles L1 kodierende Sequenz SEQ ID No: 2. Des Weiteren
ist, in einer bevorzugten Ausführungsform,
die Wirtszelle, in welche das Genkonstrukt transfiziert wird, eine
Insektenzelle. Ebenfalls bevorzugt sind Ausführungsformen, worin der Transfervektor
ein Transfervektor auf Baculovirus-Basis ist, und das Papillomavirus-Gen
unter der Kontrolle eines Promotors steht, welcher in Insektenzellen
aktiv ist. Folglich wird in dieser Ausführungsform die rekombinante
Baculovirus-DNA in Sf-9-Insektenzellen transfiziert, vorzugsweise
mit Wildtyp-Baculovirus-DNA in Sf-9-Insektenzellen co-transfiziert.
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In
einer alternativen Ausführungsform
des vorgeschlagenen Verfahrens ist der Transfervektor ein Hefe-Transfervektor,
und der rekombinante Vektor wird in Hefezellen transfiziert.
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Eine
Viruskapsomerstruktur, oder ein Teil davon, bestehend im Wesentlichen
aus HPV16-L1-Kapsidprotein,
kann durch das vorgeschlagene Verfahren hergestellt werden. Alternativ
dazu kann die Viruskapsomerstruktur im Wesentlichen aus Papillomavirus-Kapsidproteinen
L1 und L2 bestehen, hergestellt durch das vorgeschlagene Verfahren.
Die Viruskapsomerstruktur umfasst Papillomavirus-Kapsidprotein L1,
welches das Expressionsprodukt einer HPV16-L1-DNA ist, welche aus einem Wildtypvirus
kloniert wurde.
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Die
Viruskapside oder -Kapsomerstrukturen der Erfindung oder Teile oder
Fragmente davon können im
Wesentlichen aus HPV16-Kapsidprotein L1 bestehen. Diese Kapside
oder Kapsomerstrukturen oder ihre Fragmente können im Wesentlichen aus Wildtyp-HPV16-Papillomavirus-Kapsidprotein
L1 bestehen.
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Die
Viruskapsidstrukturen gemäß irgendeines
der hierin beschriebenen Verfahren umfassen Kapsidproteine mit immunogenen
konformationellen Epitopen, die in der Lage sind, neutralisierende
Antikörper
gegen natives Papillomavirus zu induzieren. Das Papillomavirus-Kapsidprotein L1
kann das Expressionsprodukt eines Wildtyp-HPV16-L1-Gens sein. In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
umfasst das HPV16-L1-Gen die Sequenz von SEQ ID No: 2.
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Gemäß noch eines
anderen Aspekts der Erfindung wird eine Einzeldosis eines Impfstoffs
vorgesehen, umfassend ein Peptid mit Konformationsepitopen eines
HPV16-L1-Kapsidproteins, oder L1-Protein und L2-Kapsidproteine,
in einer wirksamen immunogenen Konzentration, die ausreichend ist,
um einen Papillomavirus neutralisierenden Antikörpertiter von mindestens etwa
103 zu induzieren, wenn eine Verabreichung
gemäß eines
Immunisierungs-Dosierschemas erfolgt. Der Impfstoff kann ein L1-Kapsidprotein
umfassen, welches ein Wildtyp-HPV16-L1-Protein
ist.
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Die
Verwendung des offenen Leserasters (ORF) für L1 aus einem Wildtyp-HPV16-Papillomavirus-Genom
gemäß der Verfahren
der Erfindung erleichtert insbesondere die Herstellung von präparativen
Mengen an virusartigen Partikeln in einem zur Impfstoffverwendung
geeigneten Maßstab.
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Gemäß noch eines
anderen Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren zum Verhindern
oder Behandeln einer Papillomavirus-Infektion in einer Person vorgesehen,
umfassend die Verabreichung einer Papillomavirus-Kapsomerstruktur
oder eines Fragments davon gemäß der Erfindung
an eine Person gemäß eines
Immunität
hervorrufenden Schemas. Die Papillomavirus-Kapsomerstruktur umfasst Wildtyp-HPV16-L1-Kapsidprotein.
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Die
Erfindung sieht ferner ein Verfahren zum Verhindern oder Behandeln
einer Papillomavirus-Infektion in einer Person vor, umfassend die
Verabreichung der Papillomavirus-Kapsomerstruktur
der Erfindung, oder eines die Kapsomerstruktur umfassenden Impfstoffprodukts,
an eine Person gemäß eines
Immunität
hervorrufenden Schemas. Der Papillomavirus-Impfstoff umfasst Wildtyp-HPV16-L1-Kapsidprotein.
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Ebenfalls
innerhalb des Umfangs der Erfindung liegt ein Verfahren zum Immunisieren
einer Person gegen eine Papillomavirus-Infektion, umfassend das
Verabreichen eines rekombinanten Genkonstrukts der Erfindung an
die Person, umfassend eine konformationelles Papillomavirus-L1 kodierende
Sequenz, und das Ermöglichen,
dass die kodierende Sequenz in den Zellen oder Geweben der Person
exprimiert wird, wodurch eine wirksame neutralisierende Immunantwort
gegen Papillomavirus induziert wird. Die konformationelles Papillomavirus-L1
kodierende Sequenz ist aus humanem Papillomavirus HPV16 abgeleitet.
Das humane Papillomavirus HPV16 ist ein Wildtyp-Papillomavirus.
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Gemäß eines
noch anderen Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren zum Feststellen
einer humoralen Immunität
gegen eine Papillomavirus-Infektion bei einer Person vorgesehen,
umfassend die Schritte des: (a) Bereitstellens einer wirksamen,
Antikörper
erfassenden Menge an einem Papillomavirus-Kapsidpeptid mit mindestens
einem Konformationsepitop einer Papillomavirus-Kapsomerstruktur;
(b) Kontaktierens des Peptids von Schritt (a) mit einer Probe einer
Körperflüssigkeit
aus einer Person, welche hinsichtlich Papillomavirus-Infektion zu
untersuchen ist, und Ermöglichens,
dass in der Probe enthaltene Papillomavirus-Antikörper dar an binden,
um so Antigen-Antikörper-Komplexe
zu bilden; (c) Trennens der Komplexe von ungebundenen Substanzen;
(d) Kontaktierens der Komplexe von Schritt (c) mit einem feststellbar
markierten immunoglobulinbindenden Agens; und (e) Feststellens von
Anti-Papillomavirus-Antikörpern in
der Probe mittels des markierten immunoglobulinbindenden Agens,
das an die Komplexe bindet. Das Peptid besteht im Wesentlichen aus
dem Expressionsprodukt eines humanen Papillomavirus HPV16. Das Peptid
kann im Wesentlichen aus dem Expressionsprodukt eines humanen Wildtyp-Papillomavirus-HPV16-Gens
bestehen. Zum Beispiel kann das Peptid im Wesentlichen aus dem Expressionsprodukt
von SEQ ID No: 2 bestehen.
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Gemäß noch eines
anderen Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweisen
von HPV16 in einer Probe aus einer Person, die vermutlich mit dem
Virus infiziert ist, vorgesehen, umfassend das Kontaktieren der
Probe mit Antikörpern
mit einer Spezifität
gegen ein oder mehrere Konformationsepitope des Kapsids des Papillomavirus,
wobei die Antikörper
eine feststellbare signalerzeugende Markierung aufweisen oder an einem
feststellbar markierten Reagens angebracht sind; Ermöglichen,
dass die Antikörper
an das Papillomavirus binden; und Bestimmen des Vorhandenseins von
Papillomavirus, welches in der Probe vorhanden ist, mittels der
feststellbaren Markierung.
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Gemäß noch eines
anderen Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung
einer zellulären Immunantwort
gegen HPV16 in einer Person, die vermutlich mit dem Virus infiziert
ist, vorgesehen, umfassend das Kontaktieren von immunkompetenten
Zellen der Person mit einem rekombinanten Wildtyp-HPV16-L1-Kapsidprotein
oder kombinierten rekombinanten L1- und L2-Kapsidproteinen gemäß der Erfindung;
und des Feststellens von zellulärer
Immunität
gegen Papillomavirus mittels der proliferativen Antwort der Zellen
auf das Kapsidprotein. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der
Erfindung wird das rekombinante Papillomavirus-Protein in die Haut
der Person eingebracht.
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Gemäß eines
noch weiteren Aspekts der Erfindung wird ein HPV16-Infektions-Diagnosekit
vorgesehen, umfassend Kapsomerstrukturen, bestehend im Wesentlichen
aus HPV16-L1-Kapsidprotein,
oder Kapsomerstrukturen, umfassend Papillomavirus-L1-Protein und
-L2-Kapsidproteine,
oder Antikörper
gegen eine dieser Kapsomerstrukturen, einzeln oder in Kombination,
zusammen mit Materialien zum Durchführen eines Assays auf humorale
oder zelluläre
Immunität
gegen Papillomavirus, in einem Einzelpackungsbehälter.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Wir
haben festgestellt, dass das Gen, welches für das Haupt-Kapsidprotein L1
von BPV oder HPV16 kodiert, im Anschluss an die Einbringung in Wirtszellen
mittels eines passenden Transfervektors, L1 bei hohen Spiegeln exprimieren
kann, und dass das rekombinante L1 die innewohnende Fähigkeit
zur Selbstmontage zu leeren Kapsomerstrukturen besitzt, welche denjenigen
eines intakten Virions sehr ähnlich
sind.
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Ferner
besitzt das selbst-montierte rekombinante L1-Kapsidprotein der Erfindung,
im Gegensatz zu aus rekombinanten Bakterien oder denaturierten Virionen
extrahiertem L1-Protein, die Wirksamkeit von intakten Papillomavirus-Partikeln
hinsichtlich der Fähigkeit,
hohe Spiegel an neutralisiertem Antiserum zu induzieren, welche
gegen eine Papillomavirus-Infektion schützen können. Der hohe Spiegel an Immunogenität der Kapsidproteine
der Erfindung deutet auf starke Antikörper-Bindungseigenschaften
hin, welche sie zu empfindlichen Agentien in serologischen Screening-Tests
zum Nachweisen und Messen von Antikörpern gegen konformationelle
Virion-Epitope machen. Ihre Immunogenität weist ebenfalls darauf hin,
dass die Kapsidproteine der Erfindung ebenfalls als hochwirksame
Impfstoffe oder Immunogene verwendet werden können, um neutralisierende Antikörper hervorzurufen,
um ein Wirtstier gegen eine Infektion durch Papillomaviren zu schützen. Diese
Beobachtungen wurden kürzlich
in Kirnbauer et al., (1992), veröffentlicht.
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Wir
haben nun festgestellt, dass das Kapsidprotein L1, welches von aus
benignen Papillomavirus-Schäden
isolierten Wildtyp-HPV16-Genomen exprimiert wird, sich bei Expression
in dem beschriebenen Baculovirussystem mit einer Effizienz selbst-montieren
wird, welche bislang unbekannt war und mit derjenigen von Rinder-Papillovirus-L1-Kapsidprotein
vergleichbar ist.
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Die HPV16-L1-Gensequenz
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Die
Quelle für
HPV16-L1-DNA, wie offenbart in veröffentlichten Untersuchungen,
zum Beispiel von Zhou et al. (1991), war der Prototypklon, GenBank-Zugangs-Nr.
K02718, welcher aus einem Gebärmutterhalskarzinom
isoliert worden war (Seedorf et al., 1985). Wir haben festgestellt,
dass L1 aus Wildtyp-HPV16-Genom, welches sich von dem Prototypgenom
durch eine einzelne Punktmutation unterscheidet, sich zu virusartigen
Partikeln mit einer ähnlichen
Effizienz selbst-montieren wird, wie derjenigen, welche mit BPV-L1
oder BPV-L1/L2 beobachtet wird. Verglichen mit der Selbstmontage,
welche beobachtet wird, wenn L1 aus dem Prototyp-HPV-Genom mit L2
verwendet wird, zeigt L1 aus einem Wildtyp-Genom eine mindestens
100-mal wirksamere Selbstmontage.
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Um
eine genetische Einsicht in die Selbstmontage-Effizienz von unterschiedlichen
HPV16-L1-Expressionsprodukten
vorzusehen, wurden die offenen Leseraster von HPV16-L1-Genen, welche
sowohl aus gutartigen Schädigungen
wie auch aus mit Dysplasie oder Karzinom assoziierten Schädigungen
isoliert worden waren, sequenziert.
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Die
Analyse wies zwei Fehler in der veröffentlichten Sequenz der veröffentlichen
L1-Sequenz des Prototypstammes wie folgend nach:
- (1)
Es sollte eine Insertion von drei Nukleotiden (ATC) zwischen nt
6901 und 6902 vorhanden sein, welche zur Insertion eines Serins
in dem L1-Protein führt;
und
- (2) es sollte eine Deletion in der veröffentlichten Prototypsequenz
von drei Nukleotiden (GAT) vorliegen, bestehend aus nt 6951–6953, welche
ein Aspartat aus der L1-Proteinsequenz
deletiert. Die korrigierte Nukleotidsequenz des Prototyp-HPV16-L1-Genoms, bestehend
aus nt 5637–7153,
ist diejenige der hierin aufgeführten
SEQ ID No: 1.
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Die
Nummerierung der Nukleotidbasen in Sequenz ID No. 1 und 2 ist auf
1 indexiert, und die Nummerierung von Nukleotidbasen der veröffentlichten
HPV-Sequenz, das heißt
von nt 5637–7153,
entspricht denjenigen der Sequenz, welche von 1–1517 aufgelistet sind. Die
in der Originalsequenz bezeichneten Stellen können somit vom Fachmann auf
dem Gebiet ohne weiteres identifiziert werden.
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Drei
andere HPV16-L1-Genome, Klon 16PAT; und die Klone 114/16/2 und 114/16/11,
wurden sequenziert, und diese Sequenzen wurden mit derjenigen des
korrigierten Prototyps verglichen.
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Der
Klon 16PAT, welcher freundlicherweise von Dennis McCance an der
University of Rochester School of Medicine zur Verfügung gestellt
wurde, und aus einer dysplastischen (prämalignen) Schädigung des Gebärmutterhalses
kloniert wurde, exprimiert ein L1, welches sich nicht effizient
selbst-montiert.
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Die
Klone 114/16/2 und 114/16/11, welche freundlicherweise von Matthias
Dürst vom "German Cancer Research
Center" in Heidelberg
zur Verfügung
gestellt wurden, wurden beide aus nicht-malignen Schädigungen
kloniert, und exprimierten beide L1-Protein, welches sich effizient
selbst-montierte.
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Vergleich der genetischen
Merkmale von HPV16-L1, welches mit Dysplasie, maligner Progression
und gutartigen Schädigungen
assoziiert war
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Der
Klon 16PAT, der aus mit Papillomavirus infizierten dystplastischen
Schädigungen
isoliert wurde, und das Prototyp-HPV16, das aus malignem Gebärmutterhalskarzinom
isoliert war, kodieren beide Histidin an nt 6240–6242, wohingegen die Klone
2 und 11, die aus gutartigen Papillomavirus-infizierten Schädigungen (wie
Isolate aus vielen anderen Papillomaviren) isoliert worden waren,
an dieser Stelle Aspartat kodieren.
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Es
scheint, dass dieser einzelne Aminosäureunterschied zwischen der
Malignität-assoziierten
Prototyp-HPV16-Spezies und der HPV16-Spezies aus gutartigen Schädigungen
für den
Unterschied der Selbstmontage-Wirksamkeit verantwortlich ist. Es
ist wahrscheinlich, dass unter nahen verwandten HPV-Typen Aspartat
an diesem Ort für
eine effiziente Selbstmontage notwendig sein kann, und dass die
Substitution von Histidin für
Aspartat dieses Vermögen
in dem Kapsidprotein beeinträchtigt.
Die Beeinträchtigung
der Kapsid-Montage in mit Malignität assoziierten Viren, assoziiert
mit dem Verlust der Konformationsepitope, welche für die Herstellung
von neutralisierenden Antikörpern
erforderlich sind, kann auch mit einer verringerten Immunogenität verbunden
sein, welche dem Papillomavirus erlauben würde, der Immun-Kontrolle zu
entkommen.
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Folglich
können
HPV16-L1-Gene, welche Kapsidprotein exprimieren, welches sich effizient
selbst montiert, erhalten werden durch
- (1)
Isolieren des offenen Leserasters von Wildtyp-HPV16-L1 aus gutartigen
Schäden
einer Papillomavirus-Infektion; oder
- (2) Ausführen
einer ortsspezifischen Mutation in der Prototypsequenz an nt 6240–6242, um
Aspartat zu kodieren
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Rekombinantes Kapsidprotein
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Das
Verfahren der Erfindung sieht eine Methode zur Herstellung von rekombinanten
Kapsidpartikeln für
HPV16 vor. Partikel, welche entweder aus L1- oder L2-Kapsidprotein
allein bestehen, oder sowohl aus L1- als auch L2-Kapsidproteinen
gemeinsam bestehen, können
hergestellt werden. L1/L2-Kapsidproteinpartikel sind näher zu der
Zusammensetzung von nativen Papillomavirus-Virionen verwandt, aber
L2 scheint nicht so bedeutsam wie L1 bei der Vermittlung von Immunität zu sein,
wahrscheinlich weil der Großteil
von L2 intern hinsichtlich L1 in der Kapsidstruktur liegt. Obwohl
L1 sich, in Abwesenheit von L2, von sich aus selbst montieren kann,
sind selbst-montierte L1/L2-Kapsidprotein-Partikel der Zusammensetzung
von nativen Papillomavirus-Virionen näher verwandt. Folglich sind
L1 allein umfassende Partikel einfacher, während diejenigen, welche L1/L2
umfassen, eine noch authentischere Struktur besitzen können. Sowohl
selbst-montierte L1- als auch L1/L2-Partikel induzieren hohe Titer
an neutralisierenden Antikörpern
und können
deshalb für
die Impfstoffherstellung geeignet sein. Partikel, welche L1-Kapsidprotein,
exprimiert durch ein Wildtyp-HPV16-Genom, entweder als L1 allein oder L1/L2
gemeinsam, umfassen, werden besonders bevorzugt.
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Die
Herstellung der rekombinanten L1- oder kombinierten L1/L2-Kapsidpartikel
wird durch Klonieren des/der L1-(oder L1- und L2-)Gen(e) in einen
geeigneten Vektor und Exprimieren der entsprechenden konformationell
kodierenden Sequenzen für
diese Proteine in einer mit dem Vektor transformierten eukaryotischen Zelle
durchgeführt.
Es wird angenommen, dass das Vermögen, eine kapsidartige Struktur
zu bilden, eng mit der Fähigkeit
des Kapsidproteins zusammenhängt,
hohe Titer an neutralisierendem Antikörper zu erzeugen, und dass,
um ein Kapsidprotein herzustellen, welches zur Selbstmontage zu
Kapsidstrukturen mit Konformationsepitopen in der Lage ist, im Wesentlichen
die gesamte Kapsidprotein-kodierende Sequenz exprimiert werden muss.
Folglich wird im Wesentlichen die Gesamtheit der Kapsidproteinkodierenden
Sequenz kloniert. Das Gen wird vorzugsweise in einem eukaryotischen
Zellsystem exprimiert. Insektenzellen sind bevorzugte Wirtszellen;
jedoch sind auch Hefezellen als Wirtszellen geeignet, wenn passende
Hefeexpressionsvektoren verwendet werden. In ähnlicher Weise unter Verwendung
von passenden Säuger-Expressionsvektoren
transfizierte Säugerzellen
können
ebenfalls eingesetzt werden, um montiertes Kapsidprotein herzustellen.
Allerdings sind kultivierte Säugerzellen
weniger vorteilhaft, weil es bei ihnen wahrscheinlicher als bei
Nicht-Säuger-Zellen ist,
dass sie versteckte Viren beinhalten, welche für Säuger infektiös sein könnten.
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Gemäß eines
bevorzugten Protokolls wird ein Baculovirus-System verwendet. Das
zu klonierende Gen, im Wesentlichen die gesamte kodierende Sequenz
für L1-Kapsidprotein
von Rinder-Papillomavirus (BPV1) oder humanem Papillomavirus (HPV16),
oder L1 und L2 von humanem Papillomavirus HPV16, wird in einen Baculovirus-Transfervektor
inseriert, welcher flankierende Baculovirus-Sequenzen enthält, um ein
Genkonstrukt zu bilden, und die rekombinante DNA wird mit Wildtyp-Baculovirus-DNA
in Sf-9-Insektenzellen co-transfiziert, wie beschrieben in Beispiel
1, um das rekombinante Virus zu erzeugen, welches, bei einer Infektion,
das inserierte Gen bei hohen Spiegeln exprimieren kann. Die tatsächliche
Produktion von Protein wird durch Infizieren frischer Insektenzellen
mit dem rekombinanten Baculovirus durchgeführt; folglich werden das L1-Kapsidprotein
und die L1- und L2-Kapsidproteine in Insektenzellen exprimiert,
welche mit rekombinantem Baculovirus wie beschrieben in Beispiel
2, infiziert worden sind.
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In
der Vorgehensweise von Beispiel 1 wurde das vollständige L1-Gen
von BPV1 durch Polymerasekettenreaktion (PCR; Saiki, R., et al.,
1987) amplifiziert und in den auf AcMNPV (Autographa californica-Nuclear-Polyhedrosis-Virus)
basierenden Baculovirusvektor (Sommers, M., et al., 1987) kloniert.
Das offene Leseraster für
L1 wurde unter die Kontrolle des Baculovirus-Polyhedrin-Promotors
gestellt. Nach Co-Transfektion des L1-Klons mit der Wildtyp(wt)-Baculovirus-DNA
in Sf-9-Insektenzellen (ATCC-Zugangs-Nr. CRL 1711) und Plaque-Reinigung
von rekombinanten Klonen wurde ein hoher Titer an rekombinantem
Virus erzeugt. Extrakte aus mit wt-AcMNPV- oder rekombinanten BPV1-L1-Viren
(AcBPV-L1) infizierten Zellen (Beispiel 2) wurden durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese
analysiert. Nach Coomassie-Blau-Färbung wurde ein einmaliges
Protein der vorhergesagten Größe, 55 Kilodalton,
in Extrakten aus Kulturen nachgewiesen, welche mit dem AcBPV1-L1-Virus
infiziert waren. Die Identität
dieses Proteins als BPV-L1 wurde durch Immunoblotting unter Verwendung
eines BPV-L1-spezifischen monoklonalen Antikörpers (Nakai, Y., et al., 1986)
verifiziert. Somit wurde die Expression von BPV-L1 mittels rekombinantem
Virus durch SDS-PAGE-Analyse von Lysaten aus infizierten Insektenzellen
aufgezeigt.
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Um
die Hypothese zu testen, dass Papillomavirus-L1 das Vermögen zur
Selbstmontage zu virusartigen Partikeln bei Überexpression in heterologen
Zellen besitzt, wurden elektronenmikroskopische Aufnahmen von Dünnschnitten
aus AcBPV-L1-infizierten Zellen hinsichtlich des Vorhandenseins
von Papillomavirus-artigen Strukturen untersucht. Zellen, welche
mit dem rekombinanten BPV-Virus infiziert waren, enthielten viele zirkuläre Strukturen
von ungefähr
50 nm, welche präferenziell
im Zellkern lokalisiert waren; diese Strukturen waren bei Wildtyp-Baculovirus-infizierten
Zellen abwesend. Diese Ergebnisse legten nahe, dass eine Selbstmontage
von L1 zu virusartigen Partikeln stattgefunden hatte, da in vivo
die Papillomavirus-Virion-Montage im Zellkern stattfindet und der
Durchmesser der Virionen als 55 nm berichtet worden ist.
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Im
Anschluss an die Expression des konformierten Kapsidproteins in
der Wirtszelle werden Viruspartikel aus Lysaten von infizierten
Zellen, wie beschrieben in Beispiel 4, gereinigt. Um weitere Beweise
zu erhalten, dass sich das L1-Protein selbst-montiert hatte, wurden
virusartige Partikel aus den infizierten Insektenzellen mittels
Gradientenzentrifugation isoliert. Wir zeigten die Konformation
von gereinigten rekombinanten BPV-L1 und HPV16-L1-Kapsidproteinen
durch Elektronenmikroskopie im Vergleich zu authentischen BPV-Virionen.
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Strukturen
mit hoher molekularer Masse wurden aus Lysaten von mit L1-Rekombinante
oder Wildtyp infizierten Zellen durch Zentrifugation durch ein 40%iges
Saccharosekissen getrennt, und das pelletierte Material wurde einer
CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugation unterzogen. Fraktionen wurden
aufgefangen und auf Reaktivität
gegen den monoklonalen BPV-L1-spezifischen
Antikörper
mittels Immunoblotting getestet.
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L1-positive
Fraktionen aus dem Gradienten wurden auf Kohlenstoff-Foliengitter
adsorbiert, mit 1% Uranylacetat gefärbt und durch Transmissions-Elektronenmikroskopie
untersucht. In der Elektronenmikroskopie enthielten die positiven
Fraktionen zahlreiche zirkuläre
Strukturen, welche eine regelmäßige Anordnung von
Kapsomeren aufzeigten. Konsistent mit früheren Berichten über die
Dichte von leeren BPV-Virionen (Larsen, P., et al., 1987) belief
sich die Dichte der CsCl-Fraktion, enthaltend den Peak der virusartigen
Partikel, auf ungefähr
1,30 g/ml. Die meisten hatten einen Durchmesser von ungefähr 50 nm,
obwohl auch kleinere Zirkel und partiell zusammengebaute Strukturen
zu beobachten waren. In der Elektronenmikroskopie waren die größeren Partikel
von sehr ähnlicher
Größe und Untereinheitstruktur
zu infektiösen
BPV-Virionen, welche gleichzeitig gefärbt und photografiert worden
waren. Diese Partikel wurden nicht in Präparationen aus scheininfizierten
oder wt-AcMNPV-infizierten Zellen beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen,
dass BPV-L1 die intrinsische Fähigkeit
besitzt, sich in der Abwesenheit von L2 oder anderen Papillomavirus-Proteinen
zu virusartigen Partikeln zu montieren. Darüber hinaus sind spezifische
Faktoren, welche auf sich differenzierende Epithel- oder Säugerzellen
beschränkt
sind, für
die Papillomavirus-Kapsid-Montage nicht erforderlich.
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Um
zu bestimmen, ob die Fähigkeit
zur Selbstmontage in Insektenzellen ein allgemeines Merkmal von Papillomavirus-L1
ist, exprimierten wir auch das L1 von HPV16, dem am häufigsten
in humanen Genitalkrebsarten festgestellten HPV-Typ, durch ein analoges
rekombinantes Baculovirus. Ein Protein mit der erwarteten Größe von 58
kd wurde bei hohen Spiegeln in den Insektenzellen exprimiert, welche
mit dem HPV16-L1-Rekominanten-Virus infiziert waren, wie durch SDS-PAGE
gezeigt wurde. Dieses Protein reagierte stark mit einem monoklonalen
HPV16-L1-Antikörper
beim Immunoblotting. Der monoklonale Antikörper färbte auch fünf andere Banden geringfügig, welche
hinsichtlich des scheinbaren Molekulargewichts im Bereich von ungefähr 28 kd
bis ungefähr
48 kd lagen. Der Antikörper
reagierte auch schwach mit BPV-L1, weswegen dieser Antikörper das
55-kd-Protein von BPV-L1 auf demselben Immunblot leicht anfärbte. Nach
CsCl-Gradientenreinigung wurden immunreaktive Fraktionen durch Elektronenmikroskopie
untersucht, und von ihnen wurde festgestellt, bei der Elektronenmikroskopie
50 nm große
Papillomavirus-artige Partikel zu enthalten. Obwohl in dem humanen
System etwas weniger vollständig
montierte Partikel im Vergleich zu den BPV-L1-Präparationen beobachtet wurden,
möglicherweise
aufgrund der niedrigeren Expres sionsspiegel oder des größeren Ausmaßes an HPV16-L1-Abbau,
welche in der SDS-PAGE zu sehen waren, weisen die Ergebnisse eindeutig
darauf hin, dass das L1 des HPV16 und vermutlich die L1-Proteine
von anderen Typen die intrinsische Fähigkeit zur Montage zu Strukturen
vom Virion-Typ besitzen. Präparationen
von rekombinanten Papillomavirus-Kapsidpartikeln für Rhesusaffen-PV
sind ebenfalls durchgeführt
worden, wie in den Beispielen beschrieben wird.
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Rekombinante
konformationstragende Kapsidproteine als Immunogene
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Untereinheit-Impfstoffe,
welche auf selbst-montierten Haupt-Kapsidproteinen basierten, die
in heterologen Zellen synthetisiert worden waren, haben sich als
wirksam zur Verhinderung von Infektionen durch mehrere pathogene
Viren, einschließlich
humanem Hepatitis B (Stevens, C., et al., 1987), erwiesen.
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Untersuchungen,
welche demonstrieren, dass infektiöses oder mit Formalin inaktiviertes
BPV wirksam als ein Impfstoff ist, wohingegen BPV-transformierte
Zellen unwirksam sind, legen nahe, dass eher virale Kapsidproteine
als frühe
Genprodukte die Immunantwort hervorrufen. Andere Daten in der wissenschaftlichen
Literatur weisen darauf hin, dass aus Bakterien extrahiertes L1-Protein
bei der Hervorrufung einer Immunantwort, trotz der niedrigen Titer
an neutralisierenden Antikörpern,
teilweise erfolgreich war. Folglich wurde das BPV-L1, welches in
Insektenzellen eprimiert und zu virusartigen Partikeln montiert
wurde, hinsichtlich seines Vermögens,
neutralisierende Antiseren in Kaninchen zu induzieren, untersucht.
Es wurden zwei Typen von Präparationen
getestet: Ganzzellextrakte von mit L1-Rekombinante oder Wildtyp
infizierten Sf-9-Zellen sowie teilweise gereinigte Partikel, welche
mittels Differenzialzentrifugation und Ammoniumsulfatfällung isoliert
worden waren. Im Anschluss an eine primäre Inokulation erheilten die
Kaninchen zwei zweiwöchentlichen
(biweekly) Booster-Inokulationen.
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Die
Kaninchenseren wurden auf die Fähigkeit
getestet, die BPV-Infektion von Maus-C127-Zellen zu inhibieren, wie durch eine
Reduktion der Anzahl von durch eine Standardmenge an BPV-Virus induzierten
Foci gemessen wird. Ein repräsentativer
Assay wurde durchgeführt,
in welchem die Titer an neutralisierenden Antiseren, die in mit
rekombinanten BPV-L1 inokulierten Tieren induziert wurden, mit Antiseren
gegen intakte und denaturierte BPV-Virionen verglichen wurden. Die
durch Inokulation mit Baculovirus-abgeleitetem L1 erzeugten Immunseren
waren in der Lage, das Infektionsvermögen des BPV-Virus um 50% bei
einer Verdünnung
von mindestens 1:11 000 (einem Titer von 11 000; Tabelle 1) zu reduzieren,
wohingegen die Präimmunseren
aus den gleichen Kaninchen eine focale Transformation bei einer
Verdünnung
von 1:20, der niedrigsten getesteten Verdünnung, nicht inhibierten. Sowohl
die Roh-Präparationen
als auch teilweise gereinigte Partikel waren wirksam zur Induzierung
eines hohen Titers an neutralisierenden Antiseren, wobei 290 000
der höchste
gemessene Titer war. Dieser war gleich zum neutralisierenden Titer
des Positivkontroll-Antiserums, welches gegen infektiöse BPV-Virionen
gewonnen worden war. Im Vergleich dazu belief sich der höchste Titer,
welcher in einer früheren
Untersuchung unter Verwendung von bakteriell abgeleitetem L1 erzeugt
worden war, auf 36 (Pilancinski, W., et al., 1984). Das Serum aus
dem Kaninchen, welches mit dem Extrakt aus den Wildtyp-Baculovirus-infizierten
Zellen inokuliert worden war, war nicht in der Lage, das Infektionsvermögen bei
einer Verdünnung
von 1:20 zu inhibieren, was zeigt, dass die neutralisierende Aktivität L1-spezifisch
war. Das Zerstören
der teilweise gereinigten L1-Partikel durch Kochen in 1% SDS eliminierte
die Fähigkeit
der Präparation,
neutralisierende Antikörper
zu induzieren (Tabelle 1). Die Demonstration, dass L1 sich zu Virion-artigen
Partikeln selbstmontieren kann, welche um mindestens 3 Größenordnungen
höhere
neutralisierende Antiserumtiter als frühere in vitro hergestellte
Antigene hervorrufen, legt nahe, dass die rekombinanten L1-Kapsidproteine
das Potenzial aufweisen, einen wirksamen Langzeit-Schutz gegen natürlich übertragenes
Papillomavirus zu induzieren. Angesichts dieser Ergebnisse scheint
es, dass die in Insektenzellen montierten L1-Partikel infektiöses Virus
hinsichtlich der Präsentation
von konformationsabhängigen
immunodominanten Epitopen nachahmen. Diese Ergebnisse belegen auch,
dass L2 nicht für
die Erzeugung eines hohen Titers an neutralisierenden Antikörpern benötigt wird.
Die berichtete schwache neutralisierende Immunogenität von bakteriell
abgeleitetem L1 kann auftreten, weil es keine angemessene Konformation
einnimmt oder nicht zu Virion-artigen Strukturen montiert worden
ist. Des Weiteren sind mehrere elektrophoretische Varianten von
L1 in Virionen nachgewiesen worden (Larsen, P., et al., 1987). Einige
dieser modifizierten Spezies, welche wahrscheinlich in dem bakteriell abgeleiteten
L1 abwesend sind, können
die Erzeugung von neutralisierenden Antikörpern erleichtern.
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Die
Fähigkeit
von rekombinanten L1-(oder L2-)Papillomavirus-Kapsidproteinen, wie
denjenigen, welche hierin offenbart werden, einen hohen Titer an
neutralisierendem Antiserum zu induzieren, macht sie geeignet zur
Verwendung als Impfstoffe für
die Prophylaxe gegen übertragbare
Papillomatose. Beispiele gefährdeter
Populationen, welche von einer Impfung profitieren könnten, sind
Rinderherden, welche anfällig
gegen Papillomawarzen sind; alle Menschen für nicht-genitale Typen der
HPV-Infektion; und sexuell aktive Menschen für genitale HPV-Typen der Infektion.
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Eine
therapeutische Impfung kann nützlich
bei produktiven Papillomavirus-Schädigungen sein, welche gewöhnlicherweise
die Kapsidproteine L1 (und L2) exprimieren. Solche Schädigungen
treten am wahrscheinlichsten in gutartigen Infektionen, wie Warzen
oder laryngealer Papillomatose auf. Eine laryngeale Papillomatose
bei Neugeborenen wird von dem Kleinkind üblicherweise während des
Durchtritts durch den Geburtskanal erworben, wo infektiöses Papillomavirus
in vaginalen Sekretionen vorhanden ist. Eine therapeutische Impfung von
infizierten schwangeren Frauen gegen das Papillomavirus kann neutraliserenden
IgG-Antikörper
induzieren, der zum Übertreten
durch die plazentale Barriere und in den Kreislauf des Fötus in der
Lage ist, um eine prophylaktische passive Immunität in dem
Kind gegen diesen Typ von Papillomavirus-Infektion bereitzustellen. Zusätzliche
kinderschützende
Mechanismen werden durch maternales IgA vorgesehen, welches in das
Vaginalfluid und in die Brustmilch sezerniert wird. Jarrett (1991)
zeigt eine gewisse therapeutische Wirksamkeit für L2 bei der Behandlung von
BPV-induzierten Warzen. Bösartige
Tumoren exprimieren typischerweise weder L1 noch L2, und die Wirksamkeit
einer Impfung mit rekombinantem L1 oder L2 bei Leiden, wie Gebärmutterhalskrebs,
ist ungewiss.
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Eine
schützende
Immunität
sowohl gegen gutartige als auch bösartige Papillomavirus-Krankheit
kann durch Verabreichen einer wirksamen Menge an rekombinantem L1-Kapsidprotein
an eine Person, welche in der Gefahr für eine Papillomavirus-Infektion
steht, induziert werden. Ein das Kapsidprotein umfassender Impfstoff
kann, entweder parenteral oder lokal, gemäß herkömmlichen Immunisierungsprotokollen
direkt verabreicht werden. In einer alternativen Ausführungsform
kann die konformationell kodierende Sequenz von L1 in einen Transfervektor
kloniert werden, beispielsweise einen Semliki-Forest-Virusvektor
(welcher eine milde vorübergehende
Infektion erzeugt), und das rekombinante Virus kann in die Zellen
oder Gewebe des Empfängers eingeführt werden,
wo das immunisierende Kapsidprotein dann exprimiert wird. Auch das
Vaccinia-Virus kann als Vehikel für das Gen verwendet werden.
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Rekombinante
konformationstragende Kapsidproteine als serologische Screening-Mittel
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Veröffentlichte
serologische Untersuchungen der menschlichen Immunantwort gegen
Papillomavirus-Virionproteine haben grundsätzlich bakteriell abgeleitete
L1- und L2-Kapsidproteine verwendet, und die Ergebnisse standen
nicht in guter Korrelation mit anderen Messungen der HPV-Infektion
(Jenison, S. et al., 1990). Die obenstehend beschriebenen BPV-Papillomavirus-Immunitätsuntersuchungen
weisen darauf hin, dass aus Bakterien extrahierte Papillomavirus-Virionproteine
die konformationell abhängigen
Epitope nicht präsentieren,
welche typspezifisch zu sein und von den meisten neutralisierenden
Antikörpern
erkannt zu werden scheinen. Verglichen mit solchen Assays, welche
hauptsächlich
lineare Epitope erkennen, ist es wahrscheinlich, dass ein serologischer
Test unter Verwendung von selbstmontierten L1-Partikeln ein genauere Messung
des Grades der Anti-HPV-Virion-Immunität in der menschlichen Bevölkerung
darstellt. Die hierin offenbarten rekombinanten L1-Kapsidproteine, welche
Konformationsepitope präsentieren,
können
deshalb als hochspezifische diagnostische Reagenzien verwendet werden,
um Immunität
verleihenden neutralisieren den Antikörper gegen Papillomavirus in
Bindungsassays von mehreren Typen nachzuweisen. Die Verfahrensweisen
können
allgemein entweder als Festphasen- oder Lösungs-Assays durchgeführt werden,
welche eine Methode zum Nachweisen von Antikörpern, die spezifisch an das
Kapsidprotein in Antigen-Antikörper-Paaren
binden, in Körperflüssigkeiten
vorsehen. Beispiele von Verfahrensweisen, welche dem Fachmann auf
dem Gebiet zur Untersuchung von im Kreislauf befindlichen Antikörpern bekannt
sind, sind Lösungsphasen-Assays,
wie Doppel-Antikörper-Radioimmunassays
oder Enzym-Immunoassays, oder Festphasen-Assays, wie der Strip-Radioimmunoassay,
basierend auf Western-Blotting, oder ein Enzym-Linked-Immunoabsorbent-Assay (ELISA),
wie offenbart im U.S.-Patent Nr. 4 520 113 von Gallo et al., oder
immunchromatographische Assays, wie offenbart im U.S.-Patent Nr.
5 039 607 von Skold et al. Ein bevorzugtes ELISA-Verfahren für den Nachweis von
Antikörpern
ist jenes, welches in Harlow, E., und Lane, D., in Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1988, S. 563–578, offenbart
ist.
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Die
hierin offenbarten rekombinanten L1- oder L1/L2-Kapsidproteine können ebenfalls
verwendet werden, um die zelluläre
Immunität
gegen Papillomavirus mittels in vivo- oder in vitro- Assays zu messen,
beispielsweise Antigen-induzierte T-Zell-Proliferationsantworten,
wie beschrieben von Bradley, L., 1980, und insbesondere zelluläre Antworten
gegen virale Antigene, wie beschrieben im U.S.-Patent Nr. 5 081
029 von Starling. Die zelluläre
Immunität
gegen Papillomavirus kann auch durch den klassischen verzögerten Hypersensitivitäts-Hauttest in vivo,
wie beschrieben von Stites, D., 1980; oder in einem bevorzugten
Verfahren, gemäß Höpfl, R.,
et al., 1991, durch die intradermale Injektion von rekombinanten
HPV-L1-Fusionsproteinen
bestimmt werden.
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Die
Kapsidproteine der Erfindung können
auch als Immunogene verwendet werden, um polyklonale oder monoklonale
Antikörper
gemäß im Fachgebiet
gut bekannten Verfahren zu gewinnen. Diese Papillomavirus-spezifischen
Antikörper,
insbesondere in Kombination mit markierten zweiten Antikörpern, welche
spezifisch für
eine Klasse oder Spezies von Antikörpern sind, können gemäß verschiedenen
herkömmlichen
Assay-Vorgehensweisen, wie Immunohistochemie, diagnostisch verwendet
werden, um das Vorhandensein von Kapsidproteinen in Proben von Körpergewebe
oder Körperflüssigkeiten
nachzuweisen.
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Die
nachstehend beschriebenen genetischen Manipulationen werden im Hinblick
auf ihre allgemeine Anwendung auf die Herstellung von Elementen
der genetischen regulatorischen Einheit der Erfindung offenbart.
Gelegentlich kann das Vorgehen nicht wie beschrieben auf jedes rekombinantes
Molekül
anwendbar sein, welches innerhalb des offenbarten Umfangs eingeschlossen
ist. Die Situationen, bei denen dies stattfindet, werden vom Fachmann
ohne weiteres erkannt werden. In allen solchen Fällen können die Operationen entweder
erfolgreich durch herkömmliche,
dem Fachmann bekannte Modifikationen, z. B. durch Wählen eines passenden
alternativen Restriktionsenzyms, durch Wechsel zu alternativen herkömmlichen
Reagenzien, oder durch routinemäßige Modifikation
von Reaktionsbedingungen ausgeführt
werden. Alternativ dazu werden andere hierin offenbarte oder ansonsten
herkömmliche
Vorgehensweisen auf die Herstellung der entsprechenden rekombinanten
Moleküle
der Erfindung anwendbar sein. In allen präparativen Verfahren sind alle
Ausgangsmaterialien bekannt oder leicht aus bekannten Ausgangsmaterialien
herstellbar. In den folgenden Beispielen werden alle Temperaturen
in Grad Celsius angegeben; und alle Teile und Prozentsätze beziehen
sich auf das Gewicht, es sei denn, es ist anderweitig angegeben.
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Ohne
weitere Ausarbeitung wird angenommen, dass der Fachmann auf dem
Gebiet unter Verwendung der vorangehenden Beschreibung die Erfindung
zu ihrem vollsten Ausmaß anwenden
kann. Die folgenden bevorzugten Ausführungsformen sollen deshalb
lediglich als veranschaulichend und nicht den Rest der Offenbarung
auf irgendeine beliebige Weise einschränkend ausgelegt werden.
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Beispiel 1
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Offene
Leseraster (ORF) für
Volllängen-L1,
oder L1 und L2, wurden durch PCR unter Verwendung der klonierten
Prototypen von BPV1-DNA (Chen, E., et al., 1982), GenBank-Zugangs-Nr. X02346,
oder HPV16-DNA (Seedorf, K., et al., 1985), GenBank-Zugangs-Nr.
K02718; oder Wildtyp-HPV16-DNA SEQ ID No: 2) als Matrizen amplifiziert.
Einmalige Restriktionsstellen wurden in die Oligonukleotidprimer
eingebunden (unterstrichen).
BPV1-L1-Primersequenz SEQ ID No:
3):
5'-CCGCTGAATTCAATATGGCGTTGTGGCAACAAGGCCAGAAGCTGTAT-3' (Sinn)
und
SEQ ID No: 4):
5'-GCGGTGGTACCGTGCAGTTGACTTACCTTCTGTTTTACATTTACAGA-3' (Antisinn);
HPV16-L1-Primersequenz
SEQ ID No: 5):
5'-CCGCTAGATCTAATATGTCTCTTTGGCTGCCTAGTGAGGCC-3' (Sinn); und
SEQ
ID No: 6):
5'-GCGGTAGATCTACACTAATTCAACATACATACAATACTTACAGC-3' (Antisinn).
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L1-kodierende
Sequenzen beginnen am ersten Methionin-Codon (Fettdruck) für BPV1 und
dem zweiten Methionin für
HPV16. BPV1-L1 wurde als ein 5'-EcoRI-
bis 3'-KpnI-Fragment
und HPV16-L1 als ein 5'-BglII-
bis 3'-BglII-Fragment
in die Mehrfachklonierungsstelle stromabwärts des Polyhedrinpromotors
des AcMNPV-basierenden Baculovirustransfervektors pEV mod (Wang,
X., et al., 1991) kloniert und durch Sequenzierung über die
AcMNPV/L1-Verbindungsstelle
hinweg bestätigt.
Eine Menge von 2 μg
CsCl-gereinigtem rekombinantem Plasmid wurde mit 1 μg Wildtyp-AcMNPV-DNA
(Invitrogen, San Diego, Californien) in Sf-9-Zellen (ATCC) unter Verwendung von
Lipofectin (Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland) (Hartig, P., et al.,
1991) co-transfiziert, und die rekombinanten Baculoviren wurden
plaquegereinigt, wie beschrieben (Sommers, M., et al., 1987).
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Beispiel 2
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Expression von L1-Proteinen
oder L1/L2-Proteinen in Insektenzellen
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Sf-9-Zellen
wurden entweder schein-infiziert ("mock")
oder bei einer Multiplizität
der Infektion von 10 entweder mit wt-AcMNPV (wt) oder den rekombinanten
Viren AcBPV-L1 (B-L1),
AcHPV16-L1 (16-L1) oder AcHPV16-L1 (16-L1) und AcHPV16-L2 (16-L2)
infiziert. Nach 72 Stunden wurden Zellen durch Kochen in Laemmli-Puffer
lysiert, und die Lysate wurden einer SDS-PAGE in 10%igen Gelen unterzogen.
Die Proteine wurden entweder mit 0,25% Coomassieblau gefärbt oder
immunogeblottet und mit BPV-L1-mAb AU-1 (Nakai, Y., et al., 1986)
oder HPV16-L1-mAb CAMVIR-1 (McLean, C., et al., 1990) und 125I-markiertem
Fab-Anti-Maus-IgG (Amersham) sondiert. P bezeichnet das Polyhedrin-Protein.
Der Anti-BPV-L1-mAb erkannte das erwartete 55-kd-Protein. Der Anti-HPV16-L1-mAb
färbte
das erwartete 58-kd-Protein stark, und er färbte des Weiteren fünf Banden
mit niedrigerem Molekulargewicht geringfügig, wie obenstehend erörtert. Wie
ebenfalls obenstehend erörtert,
zeigte dieser Anti-HPV16-L1 eine geringfügige Kreuzreaktion mit dem
BPV-L1-Protein.
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Beispiel 3
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Herstellung
von Antiseren
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Kaninchen
wurden durch subkutane Injektion entweder mit Ganzzell-Sf-9-Lysaten
(3 × 107 Zellen), hergestellt durch einen Gefrier/Auftau-Zyklus
und 20x-Dounce-Homogenisieren, (Kaninchen # 1, 2, und 8) oder 200 μg L1-Protein,
welches teilweise gereinigt war durch Differenzialzentrifugation
und 35%-Ammoniumsulfat-Fällung,
(# 3, 4, 6 und 7) in vollständigem
Freund'schen Adjuvans
immunisiert und dann in 2-Wochen-Intervallen zweimal unter Verwendung
der gleichen Präparationen
in unvollständigem
Freund'schen Adjuvans geboostert.
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Beispiel 4
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Reinigung von Partikeln
und Transmissionselektronenmikroskopie(EMK)-Analyse
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500
ml Sf-9-Zellen (2 × 106/ml) wurden mit den rekombinanten Baculoviren
AcBPV-L1 oder AcHPV16-L1 oder AcHPV16-L1/L2 (16-L1/L2) infiziert.
Nach 72 Stunden wurden die geernteten Zellen in PBS 60 Sekunden
lang schallbehandelt. Nach einer Niedergeschwindigkeitsklärung wurden
die Lysate einer 2,5 Stunden langen Zentrifugation bei 110 000 g
durch ein 40%iges (w/v) Saccharose/PBS-Kissen unterzogen (SW-28).
Die resuspendierten Pellets wurden 20 Stunden lang bei 141 000 g
bei Raumtemperatur in einem 10–40%igen
(w/w) CsCl/PBS-Gradienten bis zum Gleichgewicht zentrifugiert. Fraktionen
wurden vom Boden her abgenommen und durch SDS-PAGE analysiert. Immunreaktive
Fraktionen wurden gegen PBS dialysiert, mittels Centricon 30 (Millipore)-Ultrafiltration
konzentriert und (für
HPV16-L1) durch
10 Minuten lange Zentrifugation bei 30 psi in einem A-100-Rotor
in einer Airfuge (Beckman) pelletiert. BPV1-Virionen (2B) wurden aus einer Rinderwarze (großzügigerweise
bereitgestellt von A. E. Jenson) wie beschrieben gereinigt (Cowsert, L.,
et al., 1987). Gereinigte Partikel wurden an Kohlenstoff-beschichtete
TEM-Gitter adsorbiert, mit 1% Uranylacetat gefärbt und mit einem Elektronenmikroskop
EM 400T von Philips bei einer Vergrößerung von 36 000 untersucht.
Die Ergebnisse wurden durch Elektronenmikroskopie erhalten und sind
obenstehend erörtert.
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Beispiel 5
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BPV1-Neutralisations-Assay
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Verdünnungsreihen
von 3 Wochen nach dem zweiten Boostern erhaltenen Seren wurden mit
ungefähr 500
focusbildenden Einheiten an BPV1-Virus 30 Minuten lang inkubiert,
das Virus wurde 1 Stunde lang an C127-Zellen adsorbiert und die
Zellen wurden 3 Wochen lang kultiviert (Dvoretzky, I., et al., 1980).
Die Foci wurden mit 0,5% Methylenblau/0,25% Carbolfuchsin/Methanol
gefärbt.
Die Ergebnisse wurden durch Auswerten der Anzahl an Foci erhalten;
diese Ergebnisse sind nachstehend erörtert. Anti-AcBPV-L1 wurde
aus Kaninchen #1 erhalten, und Anti-wt-AcMNPV aus Kaninchen #8 (Tabelle
1). Präimmunseren
bei einer Verdünnung
von 1:400 wurden als Standard verwendet. Anti-AcBPV-L1 eliminierte
entweder bei einer Verdünnung von
entweder 1:400 oder 1:600 im Wesentlichen die Foci, wohingegen Anti-wt-AcMNPV
bei entweder einer Verdünnung
von 1:400 oder 1:600 eine Erhöhung
der Anzahl an Foci zu erzeugen schien. Die normale, als "nrs" bezeichnete, Kaninchenserum-Negativkontrolle
wurde bei einer Verdünnung
von 1:00 als ein Standard für
das Anti-BPV-1-Virion
verwendet, welcher Foci bei einer Verdünnung von entweder 1:400 oder
1:600 im Wesentlichen zu eliminieren schien. Das Anti-BPV-1-Virion
wurde in einer früheren
Untersuchung gegen native BPV-Virionen erzeugt (Nakai, Y., et al.,
1986). Schließlich
ist Dako das kommerziell erhältliche
(Dako Corp., Santa Barbara, Californien) Kaninchen-Antiserum, welches
gegen denaturierte BPV-Virionen erzeugt wurde. Dieses Serum erzeugte
eine große
Anzahl von Foci, anscheinend stärker
als eine Kontrolle ohne Antikörper. Als
eine Negativkontrolle erzeugte ein ohne Virus ausgeführter Test
im Wesentlichen keine Foci.
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Beispiel 6
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Neutralisierende Serum-Titer
gegen BPV1
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Assays
wurden wie im Beispiel 5 ausgeführt.
Die Kaninchen # 1, 2 und 8 wurden mit Roh-Ganzzell-Sf-9-Lysaten und die Kaninchen
# 3, 4, 6 und 7 mit teilweise gereinigtem L1-Protein inokuliert
(Tabelle 1). Die Kaninchen # 6 und 7 wurden mit L1-Proteinpräparationen
immunisiert, welche durch Kochen in 1% SDS denaturiert worden waren.
Mindestens zwei Blutproben, entnommen 3–6 Wochen nach dem zweiten
Boostern, wurden für
jedes Kaninchen getestet, und wiesen festgestelltermaßen den
gleichen Titer auf. Der Titer der Präimmunseren aus jedem der Kaninchen
war kleiner als 20, der niedrigsten getesteten Verdünnung. Tabelle
1
- * Kehrwert der Vedünnung, welche 50% Focus-Verringerung
verursachte.
- ✝ zur Verfügung gestellt von A. B. Jenson
(Nakai, Y., et al., 1986).
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