DE69835294T2

DE69835294T2 - Methode zur in vitro auseinander- und wiederzusammensetzung von papillomavirus virusähnlichen teilchen (vlps)

Info

Publication number: DE69835294T2
Application number: DE69835294T
Authority: DE
Inventors: P. Michael Poolesville MCCARTHY; JoAnn Washington Grove SUZICH
Original assignee: MedImmune LLC
Current assignee: MedImmune LLC
Priority date: 1997-09-05
Filing date: 1998-08-19
Publication date: 2007-07-26
Anticipated expiration: 2018-08-20
Also published as: LU91314I9; JP2001515922A; PT1015561E; FR07C0012I2; DE122007000015I1; NL300264I1; LU91314I2; CA2302545C; JP4486142B2; NL300264I2; US6416945B1; ES2268787T3; US6261765B1; DE69835294D1; EP1015561B1; CY2007007I1; FR07C0012I1; EP1015561A1; EP1700911A1; CA2302545A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein höchst effizientes Mittel zum Zerlegen Papillomavirus-virusähnlicher Partikel (VLPs) in Capsomere und/oder kleinere Untereinheiten und zum Wiederzusammensetzen derselben zu VLPs bereit. Diese durch die Erfindung hergestellten, wieder zusammengesetzten, VLP-haltigen Zusammensetzungen. exprimieren konformative neutralisierende Epitope und weisen eine hohe Homogenität auf und umfassen daher wirksame diagnostische und prophylaktische Mittel zur Diagnose oder Verhinderung einer Papillomavirusinfektion. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung solcher VLPs für die Einkapselung gewünschter Komponenten, d.h. diagnostischer oder therapeutischer Mittel, und auf deren Verwendung als „Pseudovirionen" zur Bewertung der Wirksamkeit mutmaßlicher Impfstoffe oder einer Therapeutik.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Papillomaviren infizieren eine breite Vielfalt verschiedener Tierarten, einschließlich des Menschen. Eine Infektion ist typischerweise durch das Hervorrufen gutartiger epithelialer und fibroepithelialer Tumore oder von Warzen an der Infektionsstelle gekennzeichnet. Jede Wirbeltierspezies wird durch eine artspezifische Gruppe von Papillomaviren infiziert, die selbst mehrere verschiedene Papillomavirustypen umfasst. Beispielsweise wurden mehr als sechzig verschiedene Genotypen des menschlichen Papillomavirus (HPV) isoliert. Papillomaviren sind höchst artspezifische infektiöse Wirkstoffe. Hunde- und Kaninchen-Papillomaviren können zum Beispiel bei heterologen Arten, wie z.B. beim Menschen, keine Papillomen hervorrufen. Eine neutralisierende Immunität gegenüber einer Infektion durch einen Papillomavirustyp verleiht im Allgemeinen keine Immunität gegenüber einem anderen Typ, selbst wenn die Typen eine homologe Spezies infizieren.
Beim Menschen verursachen Papillomaviren Genitalwarzen, eine weit verbreitete Geschlechtskrankheit. HPV des Typs 6 und 11 wird am häufigsten mit den gutartigen Genitalwarzen Condylomata acuminata in Verbindung gebracht. Genitalwarzen sind sehr weit verbreitet, und eine subklinische oder nicht offensichtliche HPV-Infektion kommt sogar noch häufiger vor als eine klinische Infektion. Während die meisten HPV-induzierten Läsionen gutartig sind, können Läsionen, die von bestimmten Papillomavirustypen, z.B. HPV-16 und HPV-18, herrühren, einen bösartigen Verlauf nehmen. Überdies wird eine Infektion durch einen der mit Malignität assoziierten Papillomavirustypen als erheblicher Risikofaktor bei der Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs, dem bei Frauen weltweit zweithäufigsten Krebs, angesehen. Von den HPV-Genotypen, die bei Gebärmutterhalskrebs eine Rolle spielen, ist HPV-16 der häufigste, da er bei etwa 50% der Gebärmutterhalskarzinome zu finden ist.
Angesichts der erheblichen Gesundheitsrisiken, die im Allgemeinen durch eine Papillomavirusinfektion und insbesondere durch eine Infektion mit dem menschlichen Papillomavirus entstehen, haben verschiedene Gruppen die Entwicklung rekombinanter Papillomavirus-Antigene und deren Verwendung als diagnostische Mittel und als prophylaktische Impfstoffe gemeldet. Im Allgemeinen konzentrierte sich eine solche Forschung auf die Produktion prophylaktischer Impfstoffe, die das Capsid-Hauptprotein (L1) allein oder in Kombination mit dem Capsid-Nebenprotein (L2) enthalten. Ghim et al, Virology, 190:548–552 (1992), berichteten beispielsweise über die Expression des HPV-1-L1-Proteins unter Verwendung einer Vaccinia-Expression in Cos-Zellen, welches konformative Epitope aufwies, und über dessen Verwendung als Impfstoff oder für das serologische Typisieren oder Nachweisen. Diese Arbeit bildet auch die Basis einer Patentanmeldung mit U.S.-Eingangsnummer 07/903,109, die am 25. Juni 1992 eingereicht wurde (fallengelassen zugunsten der am 22. März 1994 eingereichten U.S.-Eingangsnummer 08/216,506) und vom Zessionar dieser Anmeldung lizenziert wurde. Auch Suzich et al, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 92:11553–11557 (1995) berichten, dass die Immunisierung von Hunden mit einem in einem Baculovirus-/Insektenzellsystem exprimierten, rekombinanten oralen Hunde-Papillomavirus (COPV) die Entwicklung von viralen Schleimhaut-Papillomen vollständig verhinderte. Diese Ergebnisse sind wichtig angesichts der signifikanten Ähnlichkeiten zwischen zahlreichen HPVs und COPV. Ähnlich wie HPVs, die mit Anogenital- und Genitalkrebs in Zusammenhang stehen, infiziert und induziert COPV beispielsweise Läsionen an einer mukosalen Stelle. Die L1-Sequenzen von COPV teilen auch strukturelle Ähnlichkeiten mit HPV-L1-Sequenzen. Angesichts dieser Ähnlichkeiten ist das COPV/Beagle-Modell nützlich für eine Untersuchung von L1-Protein enthaltenden Impfstoffen, z.B. eine Untersuchung der schützenden Immunreaktion, des Schutzes vor natürlicher Infektion und der Optimierung der Impfprotokolle. (Id.)
Eine Forschergruppe der Universität von Rochester berichtete auch über die Produktion eines Capsid-Hauptproteins (L1) des menschlichen Papillomavirus und virusähnlicher Partikel, wobei ein Baculovirus-/Insektenzellen-Expressionssystem zur Anwendung kam (Rose et al, University of Rochester, WO 94/20137, veröffentlicht am 15. September 1994). Insbesondere berichteten sie über die Expression des L1-Capsid- Hauptproteins von HPV-6 und HPV-11 und über die Produktion von HPV-6-, HPV-11-, HPV-16- und HPV-18-Virus-ähnlichen Partikeln.
Weiters offenbarte eine Forschergruppe der Universität von Queensland angeblich auch die rekombinante Herstellung von Papillomavirus-L1- und/oder L2-Proteinen und von virusähnlichen Partikeln sowie deren potentielle Verwendung als Impfstoffe (Frazer et al, WO 93/02189, veröffentlicht am 4. Februar 1993).
Eine Forschergruppe der amerikanischen Regierung berichtete weiters über rekombinante Papillomavirus-Capsidproteine, die angeblich in der Lage sind, sich selbst zu Capsomerstrukturen und Viruscapsiden zusammenzufügen, welche konformative antigenische Epitope umfassen (U. S.-Patent Nr. 5,437,951, Lowy et al, herausgegeben am 1. August 1995). Die Ansprüche dieses Patents sind auf eine spezifische HPV-16-DNA-Sequenz gerichtet, die ein zum selbstständigen Zusammenfügen fähiges L1-Protein codiert, sowie auf deren Verwendung zum Exprimieren rekombinanter HPV-16-Capside, die dieses HPV-16-L1-Protein enthalten.
Bezüglich der Impfstoffe, die das HPV-Capsidprotein enthalten, wird von Fachleuten weitgehend anerkannt, dass eine notwendige Voraussetzung für einen wirksamen, auf einem HPV-L1-Capsid-Hauptprotein basierenden Impfstoff darin besteht, dass das L1-Protein konformative Epitope darstellt, die durch Capsid-Hauptproteine des nativen menschlichen Papillomavirus exprimiert werden (siehe z.B. Hines et al, Gynecologic Oncology, 53:13–20 (1994); Suzich et al, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 92:11553–11557 (1995)).
In der Literatur wurde sowohl über nicht partikuläre als auch über partikuläre rekombinante HPV-L1-Proteine, die native konformative HPV-L1-Epitope darstellen, berichtet. Es ist bekannt, dass L1 in mehreren oligomeren Konfigurationen stabil ist, z.B. (i) Capsomere, die Pentamere des L1-Proteins umfassen, und (ii) Capside, die aus zweiundsiebzig Capsomeren in einer T=7-Ikosaederstruktur gebildet sind. Ebenso ist bekannt, dass das L1-Protein, wenn es in Eukaryontenzellen alleine oder in Kombination mit L2 exprimiert wird, in der Lage ist, sich selbst effizient zu capsidähnlichen Strukturen zusammenzufügen, die im Allgemeinen als virusähnliche Partikel (VLPs) bezeichnet werden.
Es wurde berichtet, dass VLPs authentischen Virionen in morphologischer und antigenischer Hinsicht ähnlich sind. Überdies wurde berichtet, dass eine Immunisierung mit VLPs die Produktion virusneutralisierender Antikörper hervorruft. Genauer gesagt legten die Ergebnisse bei einer Vielzahl von tierischen Papillomaviren (orales Hunde-Papillomavirus und Rinder-Papillomavirus-4) nahe, dass eine Immunisierung mit VLPs den Schutz vor einer späteren Papillomavirusinfektion zur Folge hat. Folglich wurden aus HPV-L1-Proteinen zusammengesetzte VLPs als Impfstoffe vorgeschlagen, um Krankheiten vorzubeugen, die mit Infektionen durch das menschliche Papillomavirus in Zusammenhang stehen.
Beispielsweise wurde berichtet, dass sich das L1-Protein zu VLPs zusammenfügen kann, wenn es unter Verwendung von rekombinanten Baculovirus- und Vacciniavirusvektoren und in rekombinanter Hefe exprimiert wird (Hagensee et al, J. Virol., 68:4503–4505 (1994); Hofmann et al., Virology, 209:506–518 (1995); Kirnbauer et al, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:12180–12184 (1992); Kirnbauer et al, J. Virol., 67:6929–6936 (1993); Rose et al, J. Virol., 67:1936–1944 (1993); Sasagawa et al, Virology, 206:126–135 (1995); Suzich et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11553–11557 (1995); Volpers et al, Virology, 200:504–512 (1994); Zhou et al, J. Virol., 68:619–625 (1994)).
Die meisten früheren, aus Eukaryontenzellen isolierten, rekombinanten L1-Zubereitungen führten zu einer variablen Population von VLPs, deren Durchmesser annähernd 55 nm beträgt und die in ihrem Erscheinungsbild intakten Virionen ähneln. Eine VLP-Gruppierung ist jedoch gegenüber dem Zelltyp einigermaßen empfindlich. In Escherichia coli exprimiertes L1 wird beispielsweise größtenteils in Form von Capsomeren oder in kleinerer Form exprimiert, wobei entweder in der Zelle oder bei der Reinigung wenige oder keine Capside sichtbar sind (Rose et al, J. Virol., 67:1936–1944 (1993); Li et al, J. Virol., 71:2988–2995 (1997)). Ähnliche Resulate sind zu beobachten, wenn das Polyomavirus-VP1-Protein in E. coli exprimiert wird (Salunke et al, Biophys. J., 56:887–900 (1989)).
Bisher wurde über kein effektives in vitro-Verfahren zur quantitativen Zerlegung und anschließenden Wiederzusammensetzung von Papillomavirus-VLPs berichtet. Ein solches Verfahren wäre höchst vorteilhaft, da es potentiell die Herstellung stabilerer und/oder homogenerer Papillomavirus-VLPs ermöglichen würde. Dies wäre von Vorteil, da sowohl Homogenität als auch Stabilität bei der Impfstoffherstellung und bei der Kennzeichnung während der Herstellung wichtige Themen sind. Weiters hat die Fähigkeit zum Zerlegen und Wiederzusammensetzen von VLPs eine wichtige Bedeutung für die VLP-Reinigung. In Eukaryontenzellen exprimierte HPV-L1-Proteine fügen sich, wie obenstehend besprochen, spontan zusammen, um VLPs zu bilden. Die meisten Proteinreinigungsverfahren wurden. jedoch zum Reinigen von Proteinen ausgelegt, die viel kleiner als das ~20 Millionen-Dalton-, 55 nm-VLP sind. Das Potential, aus Eukaryontenzellen extrahierte VLPs bis zur Stufe von L1-Capsomeren oder kleiner zu zerlegen, die kleineren Komponenten durch herkömmliche Techniken zu reinigen und danach wieder zusammenzusetzen, um in der gewünschten Stufe des Reinigungsverfahrens VLPs zu bilden, ist äußerst stark und wird derzeit bei der Reinigung von HPV-16_Tr-VLPs eingesetzt, wie untenstehend besprochen (gebildet aus einer mutierten Form des HPV-16-L1-Proteins, aus dem die 34 C-terminalen Aminosäuren herausgelöscht wurden). Schließlich ermöglicht die Fähigkeit, VLPs in vitro zu zerlegen und wieder zusammenzusetzen, das Verpacken gewünschter exogener Verbindungen in dem wieder zusammengesetzten VLP.
Frühere Versuche hinsichtlich einer Papilloma-VLP-Zerlegung inkludierten Experimente, die auf einer früheren Arbeit beruhten, die mit dem Polyomavirus, einem verwandten Papovavirus, durchgeführt wurde, wobei sich zeigte, dass sowohl die Reduktion von Disulfiden als auch die Chelatierung von Kationen für die Virionenzerlegung wesentlich waren (Brady et al, J. Virol., 23:717–724 (1977)). Im Falle von HPV VLPs zeigte sich jedoch, dass die geringen Reduktionsmittelpegel (1–10 mM DTT), die in Gegenwart geringer Pegel von Chelatbildnern (z.B. 0,5–10 mM EGTA) für eine optimale Polyomavirus-zerlegung sorgen, beim Zerlegen von Papillomavirus-VLPs nur wenig effektiv waren (siehe Tabelle 1, Li et al, J. Virol., 71:2988–2995 (1997)). Im Gegensatz dazu wurde berichtet, dass teilweise trypsinierte HPV-11-L1-VLPs sich unter solchen Bedingungen effektiv aufspalteten (Li et al, J. Virol., 71:2988–2995 (1997)). Dies ist jedoch von Nachteil, da die Verwendung von Protease negative Auswirkungen, z.B. eine Entfernung der neutralisierenden Epitope, zur Folge haben kann.
Auch Sapp und Kollegen wiesen nach, dass eine „teilweise Zerlegung" von HPV-33-VLPs allein durch Behandlung mit Reduktionsmittel (20 mM DTT) erzielt werden konnte. Das Ausmaß der VLP-Aufspaltung wurde jedoch nicht bestimmt (Sapp et al, J. Gen. Virol., 76:2407–2412 (1995)).
Wie obenstehend besprochen, erfordert eine HPV-Capsid-Gruppe ein korrekt gefaltetes L1-Protein. Die Zusatzfaktoren, die für die VLP-Formulierung und -Stabilität wichtig sind, wurden jedoch nicht gut aufgeklärt. Diesbezüglich ist allgemein bekannt, dass eine VLP-Gruppe von zahlreichen Faktoren beeinflusst werden kann. Faktoren und Bedingungen, die bekanntermaßen das Zusammenfügen bei anderen Viren beeinflussen, umfassen beispielsweise unter anderem den pH-Wert, die Ionenstärke, post-translatorische Modifikationen viraler Capsidproteine, Disulfidbindungen und die zweiwertige Kationenbindung. Die Bedeutung der Kationenbindung, insbesondere von Kalzium, bei der Bewahrung der Virionenintegrität wurde beispielsweise für das Polyomavirus (Brady et al, J. Virol. 23:717–724 (1977)) und das Rotovirus (Gajardo et al, J. Virol. 71:2211–2216 (1997)) aufgezeigt. Auch Disulfidbindungen scheinen für das Stabilisieren des Polyomavirus (Walter et al, Cold Spring Har. Symp. Quant. Biol., 39:255–257 (1975); Brady et al, J. Virol., 23:717–724 (1977)) und von SV40-Viren (Christansen et al, J. Virol., 21:1079–1084 (1977)) wichtig zu sein. Ebenso ist bekannt, dass Faktoren wie z.B. der pH-Wert und die Ionenstärke die Stabilität des Polyomavirus-Capsids beeinflussen, vermutlich durch Beeinflussung elektrostatischer Wechselwirkungen (Brady et al, J. Virol., 23:717–724 (1977); Salunke et al, Cell, 46:895–904 (1986); Salunke et al, Biophys. J, 56:887–900 (1980)). Es ist auch bekannt, dass post-translatorische Modifikationen mancher viraler Capsidproteine die Capsidstabilität und -zusammenfügung beeinflussen können, z.B. die Glykosylierung, die Phosphorylierung und die Acetylierung (Garcea et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:3613–3617 (1983); Xi et al, J. Gen. Virol., 72:2981–2988 (1991)). Somit gibt es zahlreiche untereinander zusammenhängende Faktoren, welche die Capsidstabilität, -zusammenfügung und -zerlegung beeinflussen können, die sogar bei verwandten Viren stark variieren.
Im Stand der Technik besteht daher ein Bedarf an einer Klärung der Faktoren, welche die Papillomavirus-VLP-Zusammenfügung und -Zerlegung beeinflussen. Darauf basierend besteht im Stand der Technik überdies ein Bedarf an einem effizienten in vitro-Verfahren zum Zerlegen und Wiederzusammensetzen von Papillomavirus-VLPs, welches zu VLPs mit guter Homogenität, guter Stabilität und guten immunisierenden Eigenschaften führt, d.h. zu solchen, die konformative und genauer gesagt neutralisierende Epitope darstellen, die an der Oberfläche nativer, intakter Papillomavirus-Virionen exprimiert werden. Überdies besteht ein erheblicher Bedarf an Verfahren zum Zerlegen und Wiederzusammensetzen von Papillomavirus-VLPs, welche die Probleme der teilweisen VLP-Zerlegung umgehen und die Verwendung von Protease vermeiden, das bei früheren Verfahren zur Erzeugung von Papillomavirus-VLPs verwendet wurde.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der Erfindung besteht somit in der Lösung der Probleme des Stands der Technik.
Genauer gesagt besteht eine Aufgabe der Erfindung in der Bereitstellung eines neuartigen Verfahrens zum Zerlegen und Wiederzusammensetzen von Papillomavirus-VLPs. Noch genauer besteht eine Aufgabe der Erfindung in der Bereitstellung eines neuartigen Verfahrens zum Zerlegen und Wiederzusammensetzen von menschlichen Papillomavirus-VLPs.
Eine Aufgabe der Erfindung besteht auch in der Bereitstellung eines Verfahrens, das ein quantitatives Zerlegen und Zusammenfügen von Papillomavirus-VLPs in großen Mengen ermöglicht.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Papillomavirus-VLP enthaltenden Zusammensetzungen, vorzugsweise menschliche Papillomavirus- VLP enthaltenden Zusammensetzungen, von verbesserter Qualität, z.B. verbesserter Homogenität, Immunogenität und/oder Stabilität.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines verbesserten Mittels zur VLP-Reinigung durch Einbau einer VLP-Zerlegung/Wiederzusammensetzung im Reinigungsverfahren.
Wiederum eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zum Einkapseln gewünschter Komponenten in Papillomavirus-VLPs, z.B. therapeutischer oder diagnostischer Mittel.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Papillomavirus-VLPs, vorzugsweise menschlichen Papillomavirus-VLPs, welche darin enthaltene, gewünschte therapeutische oder diagnostische Mittel, z.B. Antikrebsmittel oder Antivirusmittel, enthalten.
Wiederum eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Erzeugung von „Pseudovirionen" für HPV-Virustypen, bei welchen derzeit keine rückgewinnbaren Mengen an HPV-Virionen erhältlich sind, und zwar durch Einkapselung von exogenen Verbindungen in HPV VLPs, welche unter Verwendung von L1- und L1/L2-Proteinen des HPV-Papillomavirus konstruiert wird, insbesondere einer DNA, die mit dem Genom des HPV oder einem Fragment davon übereinstimmt, oder einer einen auswählbaren Marker, wie z.B. β-Galactosidase, codierenden DNA.
Wiederum eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines neuartigen Verfahrens zum Abgeben einer gewünschten Komponente, z.B. einer DNA, an gewünschte Zellen, wobei das Abgabevehikel für eine solche Komponente, z.B. Sinn- oder Antisinn-DNA, ein Papillomavirus-VLP umfasst.
Wiederum eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung von Pseudovirionen, die auf HPV VLPs basieren, in einer in vitro-Analyse zum Untersuchen der Wirksamkeit potentieller HPV-Impfstoffe, welche die Fähigkeit neutralisierender Antikörper untersucht, das Einfügen einer darin eingekapselten DNA in normalerweise durch dieses HPV infizierten Zellen zu verhindern.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich daher allgemein auf ein neuartiges Verfahren zum Zerlegen und Wiederzusammensetzen von Papillomavirus-VLPs, vorzugsweise menschlichen Papillomavirus-VLPs, und zwar in vitro.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer homogenen, Papillomavirus-virusähnliche Partikel (VLP) enthaltenden Zusammensetzung bereit, welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(i) das Zerlegen einer virusähnliche Partikel (VLP) enthaltenden Zusammensetzung durch Behandlung dieser virusähnliche Partikel enthaltenden Zusammensetzung mit einer Lösung, die ein Sulfhydrylreduktionsmittel umfasst, um diese VLPs zu zerlegen; und
(ii) das Wiederzusammensetzen dieser zerlegten VLPs durch Entfernung oder Oxidation des Sulfhydrylreduktionsmittels, wobei die wieder zusammengesetzten VLPs zum Hervorrufen virusneutralisierender Antikörper in der Lage sind.

Wie obenstehend besprochen, sind Papillomavirus-VLPs hauptsächlich aus einem Strukturprotein L1 gebildet, das als pentamere Capsomere oder aus 72 Capsomeren zusammengesetzte Capside stabil ist. Solche VLPs können auch das L2-Protein umfassen.
Insbesondere durch eine wohlüberlegte Auswahl der Versuchsbedingungen fanden die vorliegenden Erfinder überraschenderweise heraus, dass eine quantitative Zerlegung von Papillomavirus-VLPs (fast gänzlich auf die Stufe von Capsomeren oder kleiner) und eine nachfolgende Wiederzusammensetzung beständig erzielt werden kann, indem VLPs für längere Zeit einer Lösung ausgesetzt werden, die eine hohe Konzentration von zumindest einem Sulfhydrylreduktionsmittel umfasst, das vorzugsweise in Puffern von mäßiger bis niedriger Ionenstärke enthalten ist. Speziell führt das gegenständliche Verfahren zu Zusammensetzungen, enthaltend wieder zusammengesetzte VLPs, von sehr hoher Homogenität, die vorwiegend Partikel im Bereich der VLPs voller Größe, d.h. von durchschnittlich 56,5 ± 7,0 nm (n = 15), umfassen, und zwar mit sehr wenigen teilweise zusammengefügten VLPs oder kleineren Komplexen. Die Ausbeuten sind ebenfalls sehr hoch, d.h. mengenmäßig erreichen sie unter optimalen Zerlegungsbedingungen durchschnittlich 80–90% bezüglich des L1-Gesamtproteins aus Ausgangsmaterial gegenüber wieder zusammengesetzten VLPs. Überdies fügen sich im Wesentlichen alle der zuvor aufgespalteten Capsomere wieder zusammen, um lösliche, filtrierbare VLPs voller Größe zu produzieren.
Unerwarteterweise wurde festgestellt, dass die Anwendung solcher Bedingungen zu Papillomavirus-VLP-Zusammensetzungen von gesteigerter Homogenität (im Verhältnis zum VLP-Ausgangsmaterial und zu den erhältlichen VLP-Zusammensetzungen) führt, d.h., zu homogenen Zusammensetzungen, die fast gänzlich aus Papillomavirus-VLPs von 55 nm, 150 S, gebildet sind. Weiters zeigte sich, dass diese homogenen VLPs konformative neutralisierende HPV-Epitope darstellen, was eine Voraussetzung für einen wirksamen, prophylaktischen, auf HPV VLP basierenden Impfstoff ist. Ebenso wurde von den Erfindern überraschenderweise herausgefunden, dass Chelatoren die VLP-Zerlegung nicht verstärken und überdies die Wiederzusammensetzung von Capsomeren zu VLPs hemmen können. Wie untenstehend detaillierter besprochen wird, waren diese Ergebnisse überraschend, da sich bei einem verwandten Papovavirus, dem Polyomavirus, zeigte, dass sowohl ein Ausgesetztsein an geringe Pegel von Sulfhydrylreduktionsmittel als auch eine Chelatierung von Kalziumionen für die Virionenzerlegung wesentlich waren. Im Gegensatz dazu sind solche Bedingungen bei der Zerlegung von Papilloma-VLPs nur wenig effektiv.
Wie angemerkt, wurde ebenso festgestellt, dass die Papillomavirus-Capsomer- und VLP-Zusammensetzungen, die erfindungsgemäß hergestellt werden, strukturspezifische (konformative), insbesondere neutralisierende, Epitope darstellen, die an der Oberfläche von intakten Papillomavirus-Virionen zu finden sind. Dies wurde sowohl durch deren Reaktionsfähigkeit mit neutralisierenden und strukturspezifischen monoklonalen Anti-L1-Papillomavirus-Antikörpern in einem ELISA-Assay als auch durch deren Fähigkeit zum Induzieren der Synthese von Antikörpern, welche die Papillomavirusinfektion neutralisieren, in einer RT-PCT-Infektionsanalyse nachgewiesen. Daher sind sie für die Verwendung als prophylaktische Mittel zur Verhinderung einer PV-Infektion und für Diagnosezwecke gut geeignet. Weiters können die gegenständlichen Verfahren zur VLP-Zerlegung und -Wiederzusammensetzung bei verschiedenen VLP-Reinheitsgraden angewandt werden. Dies ermöglicht eine Zerlegung von Rohmischungen von VLPs, eine Reinigung der kleineren löslichen VLP-Komponenten (was aufgrund deren stark verringerter Größe einfacher ist), gefolgt von einer Wiederzusammensetzung in der gewünschten Stufe des Reinigungsprozesses.
Wie ebenfalls untenstehend detaillierter besprochen wird, sorgen die gegenständlichen Verfahren weiters für das Einbringen von gewünschten Komponenten, z.B. DNAs, Proteinen, Peptiden, Hormonen, Radionukliden, Antikrebsmitteln und Antivirusmitteln, in VLPs während der Wiederzusammensetzung. Dies ist vorteilhaft, da solche VLPs als Abgabevehikel (für das Einfügen gewünschter Komponenten in Zellen) und als „Pseudovirionen" zum Bewerten der prophylaktischen Wirksamkeit von Papillomavirus-Impfstoffen verwendet werden können.
Die vorliegenden Erfinder stellen die Hypothese auf, dass eine Papillomavirus-VLP-Zerlegung aufgrund des Vorhandenseins von stabilisierenden Disulfidbindungen, die wahrscheinlich vergraben und unerreichbar sind, ein längeres Ausgesetztsein an sehr hohe Reduktionsmittelpegel erfordert und dass das Ausgesetztsein dieser Bindungen an ein Lösungsmittel durch lokale strukturelle Schwankungen äußerst selten ist. (Dieses Phänomen wird detaillierter in der am 3. Juli 1997 eingereichten Anmeldung mit Eingangsnummer 08/888,050 besprochen.) Offensichtlich werden diese Bindungen bei längerem Ausgesetztsein an hohe Reduktionsmittelkonzentrationen und bei niedriger bis mäßiger Ionenstärke mit der Zeit erreichbar.
Definitionen:
Capsid-Hauptprotein oder L1-Protein
Dies bezieht sich auf das Strukturprotein eines Papillomavirus (PV), welches den größten Teil der PV-Capsidstruktur bildet. Dieses Protein kommt, wie berichtet, bei der Herstellung von HPV-Impfstoffen und als Diagnosemittel zu Anwendung.
Capsid-Nebenprotein oder L2-Protein
Dies bezieht sich auf das Strukturprotein eines Papillomavirus, welches einen kleineren Teil der PV-Viruscapsidstruktur bildet.
Virusähnliche Partikel oder VLPs
Dies bezieht sich auf die capsidähnlichen Strukturen, die sich bei der Expression und Zusammenfügung einer Papillomavirus-L1-DNA-Sequenz allein oder in Kombination mit einer L2-DNA-Sequenz ergeben. VLPs sind in morphologischer und antigenischer Hinsicht authentischen Virionen ähnlich. VLPs können in vivo in geeigneten Wirtszellen, z.B. Säugetier- und Insektenwirtszellen, hergestellt werden oder können sich bei der Reinigung rekombinanter L1-Proteine spontan bilden.
Pseudovirionen
Dies bezieht sich auf VLPs, die exogene Markerverbindungen enthalten, welche aus L1- oder L1- und L2-Proteinen eines spezifischen PV-Typs zusammengesetzt sind. Pseudovirionen können zum Testen der Wirksamkeit, die spezifische Virusbindung und/oder -aufnahme in Zielzellen zu blockieren, von Substanzen, wie z.B. Antikörpern, in Fällen, wo kein authentisches Virus verfügbar ist, verwendet werden.
Korrekt gefaltetes L1-Protein
Dies bezieht sich auf ein L1-Protein (entweder monomer, in Form von kleinen Oligomeren (Dimer-Tetrameren) oder Capsomeren), welches in einer Konformation vorliegt, die für das Wiederzusammensetzen zu VLPs geeignet ist, und welches Epitope bewahrt, die an Viruscapsiden oder VLPs vorhanden sind.
Capsomere
Dies bezieht sich auf eine oligomere Konfiguration des L1-Proteins, die aus L1-Pentameren gebildet ist.
Capside
Dies bezieht sich auf den strukturellen Teil des Papillomavirus, der aus Capsomeren zusammengesetzt ist. Genauer gesagt ist er aus zweiundsiebzig Capsomeren in einer T=7-Ikosaederstruktur gebildet.
Konformatives L1-HPV-Epitop
Dies bezieht sich auf ein Epitop, das an der Oberfläche eines korrekt gefalteten L1-Proteins exprimiert wird, welches ebenfalls durch ein L1-Protein eines entsprechenden infektiösen Wildtyp-HPV exprimiert wird. In der Fachwelt ist anerkannt, dass die Darstellung konformativer Epitope für die Wirksamkeit von HPV-L1-Protein-Immunogenen (sowohl als prophylaktische als auch als diagnostische Mittel) wesentlich ist.
Konformatives neutralisierendes L1-HPV-Epitop
Dies bezieht sich auf ein Epitop, das an der Oberfläche eines korrekt gefalteten L1-Proteins exprimiert wird, welches ebenfalls durch ein L1-Protein eines entsprechenden infektiösen Wildtyp-HPV exprimiert wird und neutralisierende Antikörper hervorruft. In der Fachwelt ist anerkannt, dass die Darstellung konformativer neutralisierender Epitope für die Wirksamkeit von HPV-L1-Protein-Immunogenen (sowohl als prophylaktische als auch als diagnostische Mittel) wesentlich ist.
Konformativer Antikörper
Dies bezieht sich auf einen Antikörper, der spezifisch ein Epitop bindet, das auf einem korrekt gefalteten L1-Protein, aber nicht auf einem denaturierten L1-Protein exprimiert wird.
Reduktionsmittellösung in hoher Konzentration
Dies bezieht sich auf eine Lösung, die eine Menge von zumindest einem Sulfhydrylreduktionsmittel, z.B. Glutathion, β-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol, enthält, welches für eine zumindest 70%ige Zerlegung von Papillomavirus-VLPs sorgt, wenn die VLPs für längere Zeiträume, typischerweise für mindestens 2 Stunden und noch bevorzugter für mindestens 16 Stunden, damit kontaktiert werden. Die Konzentration des Reduktionsmittels kann abhängig von dem jeweiligen Reduktionsmittel schwanken. Im Falle von β-Mercaptoethanol beträgt diese Menge vorzugsweise zumindest 1 Gew.%, noch bevorzugter zumindest 3–5 Gew.%. Im Falle von Dithiothreitol beträgt die Menge vorzugsweise zumindest etwa 100 mM.
Längeres Ausgesetztsein oder Kontaktieren von VLPs an eine bzw. mit einer Reduktionsmittellösung in hoher Konzentration
Dies bezieht sich auf die Zeitdauer des Kontaktierens von VLPs mit einer Reduktionsmittellösung in hoher Konzentration, welche ausreicht, um für eine zumindest 70%ige Zerlegung der VLPs in Capsomere zu sorgen. Ein solches längeres Ausgesetztsein hat vorzugsweise eine 70–90%ige Zerlegung und optimal eine praktisch vollständige VLP-Zerlegung zur Folge. Diese Zeitdauer variiert bei unterschiedlichen PV-Typen und kann auch von den Zellen, in denen VLPs exprimiert werden (dem Ausgangsmaterial), dem Reinheitsgrad (Vorhandensein oder Fehlen von Aggregaten), dem pH-Wert und der Ionenstärke abhängen. Zusätzlich können VLPs, die aus einem mutierten oder chemisch veränderten L1-Protein, z.B. einem C-terminal gekürzten L1-Protein, gebildet sind, unter milderen Bedingungen zerfallen. Im Allgemeinen dauert dieses Ausgesetztsein mindestens 2 Stunden (im Falle von HPV-16_Tr-VLPs) und noch typischer länger, d.h. mindestens 12 Stunden, noch bevorzugter mindestens 16 Stunden (im Falle von HPV-11-VLPs).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: SDS/PAGE-Analyse eines gereinigten HPV-11-L1-Proteins. Das Protein wurde bei Fehlen (Bahn 1) oder Vorhandensein (Bahn 2) von 2 mM DTT mit einem Probenvorbereitungspuffer vermischt und vor der Gelelektrophorese 2 Minuten lang gekocht. Links werden die Positionen gezeigt, an denen die Molekulargewichtsstandards (in Da × 10^–3) wanderten.
2: 30%-Sucrosepolsteranalyse einer HPV-11-VLP-Zerlegung. HPV-11-Zubereitungen wurden, wie im Text beschrieben, bei 4°C behandelt, und am oberen (T) oder unteren Ende (B) des Sucrosepolsters wurden vor der Gelelektrophorese Proben entnommen. Gruppe 1, unbehandelt, gereinigtes HPV-11-VLP-Ausgangsmaterial in PBS. Gruppe 2, VLPs, die 16 Stunden lang mit 5%igem βME inkubiert wurden. Gruppe 3, VLPs, die 1 Stunde lang mit 5%igem βME inkubiert wurden. Gruppe 4, VLPs, die 16 Stunden lang mit 2%igem βME inkubiert wurden. Gruppe 5, VLPs, die 16 Stunden lang mit 0,5%igem βME inkubiert wurden. Gruppe 6, VLPs, die 16 Stunden lang mit 10 mM DTT, 5 mM EDTA inkubiert wurden.
3: 5–20%ige lineare Sucrosegradientenanalyse von zerlegten HPV-11-VLPs. VLPs in PBS wurden bei 4°C 16 Stunden lang mit 5%igem βME (a) oder 200 mM NaHCO₃, pH 9,6 (b), inkubiert und danach, wie im Text beschrieben, auf einen 5–20%igen linearen Sucrosegradienten zentrifugiert. Der Gradient wurde in 25 Fraktionen (0,5 ml) gesammelt, und das Pellet (P) wurde in 0,5 ml PBS resuspendiert. Ein Immunoblot ist dargestellt, welcher die Position des L1-Proteins quer durch den Gradienten zeigt. Die Peak-Positionen, an denen die Sedimentationsstandards wanderten, wenn sie an separaten Gradienten laufen gelassen wurden, sind ebenfalls angegeben.
4: 10–65%ige lineare Sucrosegradientenanalyse von HPV-11-VLPs in verschiedenen Stadien der Zusammenfügung. Ein Aliquot des gereinigten VLP-Ausgangsmaterials (a) wurde bei 4°C 16 Stunden lang mit 5%igem βME inkubiert (b). Ein Teil der βME-behandelten VLPs wurde dann durch Dialyse in PBS-0,5 NaCl wieder zusammengesetzt, um das Reduktionsmittel zu entfernen (c). Danach werden die Proben, wie im Text beschrieben, auf 10–65%ige lineare Sucrosegradienten zentrifugiert. Jeder Gradient wurde in 12 Fraktionen (1 ml) gesammelt, und das Pellet (P) wurde in 1 ml PBS resuspendiert. Immunoblots sind dargestellt, welche die Positionen zeigen, an denen das L1-Protein an den verschiedenen Gradienten wanderte. Die Peak-Positionen, an denen die Sedimentationsstandards wanderten, sind wie in 3 ebenfalls angegeben.
5: Elektronenmikroskopbilder von HPV-11-VLPs in verschiedenen Stadien der Zusammenfügung. VLPs, die wie beschrieben behandelt wurden, wurden mit 2%iger Phosphorwolframsäure gefärbt, auf Gitter aufgebracht und in 15–25.000-facher Vergrößerung fotografiert. a, gereinigtes VLP-Ausgangsmaterial, b, VLPs, die durch eine 16-stündige Inkubation bei 4°C mit 5%igem βME bis zur Stufe von Capsomeren zerlegt wurden. c, VLPs, die durch eine Dialyse in PBS-0,5 NaCl aus zerlegten VLPs wieder zusammengesetzt wurden, d, der Mittelbereich des Bilds c in stärkerer Vergrößerung. Skalenleiste: a,c = 200 nm; b,d = 100 nm.
6: Reaktion von intakten und zerlegten VLPs mit strukturspezifischen monoklonalen HPV-11-Antikörpern. HPV-11-L1-VLP-Ausgangsmaterial (A), VLPs, die durch Behandlung mit 5%igem βME entweder ohne (B) oder mit (C) anschließender Dialyse in PBS-0,5 M NaCl zerlegt wurden, um das Reduktionsmittel zu entfernen, und VLPs, die in Gegenwart von 200 mM Carbonat, pH 9,6, zerlegt und danach in PBS-0,5 M NaCl (D) dialysiert wurden, wurden an den Mulden von Mikrotiterplatten aufgebracht. Die strukturspezifischen monoklonalen HPV-11-Antikörper H11.F1 (HPV-11-neutralisierend; ∇) und H11.A3 (nicht HPV-11-neutralisierend; •) wurden in einem ELISA hinsichtlich der Immunreaktivität mit den gebundenen Antigenen untersucht, wie unter „Materialien und Verfahren" beschrieben. Die Reaktionsfähigkeit mit dem monoklonalen Antikörper AU1 (
), der ein auf HPV-11-L1 vorgefundenes, lineares Epitop erkennt, wurde als Kontrolle zum Nachweisen der Antigenhaftung an den Mikrotitermulden eingesetzt.
7: Vergleich der Fähigkeit von gegen gereinigte Anfangs-HPV-11-VLPs und wieder zusammengesetzte VLPs geschaffenen Antiseren, den HPV-11-Virus zu neutralisieren. Anti-HPV-11-Seren wurden vor dem Hinzufügen zu HaCaT-Zellen bei 37°C 60 Minuten lang mit HPV-11-Virionen inkubiert. Alternativ wurden die Virionen ohne Vorinkubation mit Serum zu den Zellen hinzugefügt. Sechs Tage nach der Infektion wurden die Zellen geerntet, und die Gesamt-RNA wurde extrahiert. Zehn Prozent der Gesamt-RNA wurden für eine Reverse Transcription verwendet, und zehn Prozent der resultierenden cDNA wurden dann als Matrize für eine verschachtelte PCR eingesetzt, wobei Primer verwendet wurden, die für die gespleißte HPV-11-E1∧E4-Botschaft spezifisch waren. Die PCR-Produkte wurden auf 2%igen Agarosegels getrennt. Die Gels wurden mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht hinsichtlich des Vorhandenseins der ~0,6 kb-E1∧E4-Bande untersucht (a). Als interne Kontrolle wurde an allen cDNA-Proben eine PCR-Amplifikation von β-Actin durchgeführt (b). Die erwartete Größe der β-Actin-Bande beträgt ~0,6 kb. Bahn S enthält Molekulargrößenmarker. Bahn C stellt Reaktionen dar, die mit RNA aus Zellen, die ohne Virus inkubiert wurden, erfolgten, und Bahn V stellt Zellen dar, die mit einem Virus inkubiert wurden, das nicht mit Serum vorinkubiert wurde. Erwartungsgemäß wird die E1∧E4-Bande in virusinfizierten, aber nicht in uninfizierten Zellen nachgewiesen. Die nächsten Bahnen enthalten PCR-Produkte aus Zellen, die mit einem Virus infiziert sind, der mit seriellen log₁₀-Verdünnungen eines Anti-HPV-11-Antiserums (10^–3–10^–7) vorinkubiert wurde, welches, wie angeführt, gegen gereinigte Anfangs-HPV-11-VLPs und wieder zusammengesetzte VLPs geschaffen wurde.
8: SDS/Page-Vergleich von HPV-16_Tr-VLPs im zusammengefügten (–βME) und im zerlegten (+βME, Durchgang 2) Zustand, welcher die größere Reinheit der im zerlegten Zustand gereinigten VLPs zeigt. Die Position, an der das HPV-16_Tr-L1-Protein wandert, wird durch den Pfeil angezeigt.
9: 5–20%ige lineare Sucrosegradientenanalyse von zerlegten HPV-16_Tr-VLPs. Endgültige gereinigte +βME-Durchgang 2-VLPs (siehe Tabelle 3) in PBS wurden bei 4°C 16 Stunden lang mit 4%igem βME inkubiert und danach, wie im Abschnitt „Verfahren" beschrieben, auf einen 5–20%igen linearen Sucrosegradienten zentrifugiert. Der Gradient wurde in 25 Fraktionen (0,5 ml) gesammelt, und das Pellet (P) wurde in 0,5 ml PBS resuspendiert. Ein Immunoblot ist dargestellt, welcher mit dem spezifischen monoklonalen HPV-16-Antikörper 16-E untersucht wurde und die Position des L1-Proteins über dem Gradienten zeigt. Die Peak-Positionen, an denen die Sedimentationsstandards wanderten, wenn sie an separaten Gradienten laufen gelassen wurden, sind ebenfalls angegeben.
10: 10–65%ige lineare Sucrosegradientenanalyse von HPV-16_Tr-VLPs in verschiedenen Stadien der Zusammenfügung. Ein Aliquot von (a) gereinigtem VLP-Ausgangsmaterial (+βME Durchgang 2: siehe Tabelle 3) wurde bei 4°C 16 Stunden lang mit 4%igem βME inkubiert (b). Ein Teil der βME-behandelten VLPs wurde dann durch eine. Dialyse in PBS-0,5 NaCl wieder zusammengesetzt, um das Reduktionsmittel zu entfernen (c). Danach wurden die Proben, wie im Text beschrieben, auf 10–65%ige lineare Sucrose gadienten zentrifugiert. Jeder Gradient wurde in 12 Fraktionen (1 ml) gesammelt, und das Pellet (P) wurde in 1 ml PBS resuspendiert. Immunoblots sind dargestellt, welche mit dem spezifischen monoklonalen HPV-16-Antikörper 16-E untersucht wurden und die Positionen zeigen, an denen das L1-Protein an den verschiedenen Gradienten wanderte. Die Peak-Positionen, an denen die Sedimentationsstandards wanderten, sind wie in 9 ebenfalls angegeben.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie besprochen, bezieht sich die vorliegende Erfindung im Allgemeinen auf ein neuartiges Verfahren, das für eine höchst effiziente Zerlegung von Papillomavirus-VLPs; d.h. eine zumindest 70%ige Zerlegung, noch bevorzugter eine 70–90%ige Zerlegung und am meisten bevorzugt eine vollständige VLP-Zerlegung, sorgt und das längere Ausgesetztsein von Papillomavirus-VLPs, die aus L1- oder einer Kombination von L1- und L2-Proteinen zusammengesetzt sind, an eine Sulfhydrylreduktionsmittellösung in hoher Konzentration umfasst. Im Allgemeinen beträgt die Konzentration des Reduktionsmittels zumindest 1 Gew.% und noch bevorzugter etwa 3–5 Gew.%, wobei die Reduktionsmittel enthaltende Lösung bevorzugt eine Ionenstärke aufweist, die höchstens etwa 0,5 beträgt und vorzugsweise niedriger ist.
Die Reduktionsmittelkonzentrationen und die Ionenstärke können jedoch bei verschiedenen Papillomavirustypen, verschiedenen Wirtszellen, aus denen diese erhalten werden, verschiedenen mutierten und/oder chemisch veränderten Formen des L1-Proteins und bei verschiedener Reinheit variieren. Genauer gesagt klärten die vorliegenden Erfinder die Bedingungen für eine maximale in vitro-Zerlegung von gereinigten VLPs, welche für eine effiziente anschließende Wiederzusammensetzung sorgt. Es wurde herausgefunden, dass eine längere Inkubation von Papillomavirus-VLPs mit relativ hohen Konzentrationen von Reduktionsmitteln bei Ionenstärken, die höchstens 0,5 M betragen, und noch bevorzugter bei einer annähernd physiologischen oder bei einer schwächeren Ionenstärke sowohl notwendig als auch ausreichend ist, um aus gereinigten VLPs homogene lösliche Capsomere zu erzeugen. Überdies wurde festgestellt, dass bei einer Entfernung oder alternativ bei einer Oxidation des Reduktionsmittels eine definierte Population von intakten VLPs passender Größe erhalten wird.
Dies zeigte sich insbesondere bei Verwendung von HPV-11-VLPs, die in einem Baculovirus-/Insektenzellsystem produziert wurden, d.h. in Trichoplasia ni (High Five^®)-Zellen, die mit einem rekombinanten, die gesamte HPV-11-L1-DNA-Sequenz enthaltenden Baculovirus infiziert waren. Basierend auf diesen Ergebnissen ist jedoch die Schluss folgerung plausibel, dass ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von Papillomavirus-VLPs erzielt werden, die aus anderen Typen und Spezien, insbesondere anderen menschlichen Papillomavirustypen, hergestellt wurden. Dies ist plausibel, da nachgewiesen wurde, dass zahlreiche Papillomavirus-L1-Proteine zu VLPs führen, wenn sie in geeigneten rekombinanten Expressionsvektorsystemen exprimiert werden.
Ebenso ist es plausibel zu erwarten, dass ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von Papillomavirus-VLPs erzielt werden, die aus einer Kombination von L1- und L2-Proteinen zusammengesetzt sind, da diese mit nur aus L1-Proteinen hergestellten VLPs praktisch identisch zu sein scheinen. [Die vorliegenden Erfinder räumen unter der Annahme, dass L2 eine bedeutende stabilisierende Funktion erfüllt, jedoch ein, dass eine Zerlegung die Verwendung höherer Reduktionsmittelkonzentrationen, ein längeres Ausgesetztsein an diese, einen erhöhten pH-Wert und/oder eine verringerte Ionenstärke während der Zerlegung erfordern kann.] Überdies ist zu erwarten, dass die gegenständlichen Verfahren für die Zerlegung/Zusammenfügung von VLPs geeignet sind, die von irgendeinem Wirtszellsystem erhalten werden, das zur Produktion von Papillomavirus-VLPs führt. Obgleich die Anmelder einräumen, dass es bei Wirtszellen einige Unterschiede gibt, wie obenstehend besprochen, exprimieren viele Wirtszellen, wie berichtet, Papillomavirus-VLPs in Form von VLPs.
Im Allgemeinen wird das gewünschte VLP-Ausgangsmaterial in einem geeigneten Wirtszellsystem, z.B. einem Baculovirus-/Insektenzellsystem, produziert und unter Anwendung bekannter Verfahren daraus extrahiert. Die Extraktionstechnik hängt von Faktoren ab wie z.B. unter anderem den spezifischen Wirtszellen, die verwendet werden, der Konzentration und der Frage, ob das Protein intrazellulär bleibt oder sekretiert wird.
Die Zerlegung der VLPs kann bei verschiedenen VLP-Reinheitsgraden erfolgen. Wenn sie in Verbindung mit der Reinigung erfolgt, werden VLPs aus Zellen extrahiert, zerlegt, durch herkömmliche Techniken gereinigt und beim gewünschten Reinheitsgrad wieder zusammengesetzt. Falls VLPs zum Verpacken von exogenen Verbindungen verwendet werden oder falls zur Verbesserung der Homogenität des Endprodukts eine Zerlegung/Wiederzusammensetzung durchgeführt wird, weisen die eingesetzten VLPs eine ziemlich hohe Reinheit auf. In diesen Fällen betragen die für die Zerlegung verwendeten VLPs vorzugsweise zumindest 10–30 Gew.%, noch bevorzugter 50 Gew.% und am meisten bevorzugt zumindest 70–90 Gew.%. Verfahren zur Bestimmung der VLP-Reinheit sind wohlbekannt und umfassen densitometrische SDS-PAGE-Verfahren.
Wie untenstehend im Abschnitt „Materialien und Verfahren" im Detail besprochen wird, entwickelten die vorliegenden Erfinder eine rasche Screening-Analyse für die Untersuchung der VLP-Zerlegung, bei der ein Sucrosegradientensystem zur Anwendung kommt. Bei diesem System perlen intakte VLPs durch einen 30%igen Sucrosepolster, während nicht aggregierte Capsomere, kleinere L1-Oligomere oder L1-Monomere am oberen Ende des Polsters bleiben. Dieses Analyseverfahren ist daher vorteilhaft, weil es die exakte Identifizierung von Bedingungen ermöglicht, welche zu einer maximalen VLP-Zerlegung führen.
Im Allgemeinen wurde festgestellt, dass eine maximale VLP-Zerlegung ein längeres Ausgesetztsein nicht aggregierter VLPs an eine Lösung erfordert, die eine hohe Konzentration von Sulfhydrylreduktionsmittel enthält. Wie zuvor erläutert, ist ein längeres Ausgesetztsein jene Dauer, die ausreicht, um zu einer zumindest 70%igen Zerlegung von VLPs, noch bevorzugter einer 70–90%igen VLP-Zerlegung und idealerweise einer praktisch vollständigen VLP-Zerlegung zu führen. Im Falle von rekombinanten HPV-11-L1-VLPs, die in dem veranschaulichten Insektenzellsystem produziert wurden, erfolgte nach etwa 16 Stunden bei 4°C eine maximale Zerlegung (unter Verwendung einer 5 Gew.% β-Mercaptoethanol enthaltenden Lösung). Solche Expositionszeiten können jedoch bei Verwendung anderer VLP-Ausgangsmaterialien, anderer pH-Bedingungen, höherer Reduktionsmittelkonzentrationen und niedrigerer Ionenstärken möglicherweise verringert werden. Beispielsweise wurde festgestellt [Resultate nicht dargestellt], dass eine beträchtliche Zerlegung von VLPs, die durch eine C-terminal gekürzte Form des HPV-16-L1-Proteins gebildet wurden, nach etwa 2 Stunden bei 4°C durch Ausgesetztsein solcher VLPs mit einer β-Mercaptoethanollösung (4%) bewirkt werden kann.
Es wurde nachgewiesen, dass das gegenständliche Verfahren zur VLP-Zerlegung bei Verwendung von β-Mercaptoethanol und Dithiothreitol als Reduktionsmittel effektiv ist. Es ist jedoch zu erwarten, dass andere bekannte Reduktionsmittel ähnliche Resultate erbringen. Beispiele für geeignete, bei der Erfindung nützliche Reduktionsmittel umfassen Glutathion, β-Mercaptoethanol, Dithiothreitol, Dithioerythrit, Cystein, Hydrogensulfid und Mischungen davon.
Wie angemerkt, werden beim vorliegenden Verfahren VLPs mit einer Lösung kontaktiert, die eine hohe Sulfhydrylreduktionsmittelkonzentration aufweist. Hier wird dies als eine Reduktionsmittelkonzentration definiert, die nach einem längeren Ausgesetztsein zu einer beträchtlichen Zerlegung von VLPs, d.h. einer zumindest 70%igen, vorzugsweise zumindest 70–90%igen und noch bevorzugter praktisch vollständigen VLP-Zerlegung führt.
Diese hohen Reduktionsmittelkonzentrationen variieren abhängig von den jeweiligen Reduktionsmitteln oder der jeweiligen Kombination. Im Falle von β-Mercaptoethanol wurde festgestellt, dass eine Konzentration von zumindest etwa 5 Gew.% (713 mM) zu einer optimalen HPV-11-L1-VLP-Zerlegung bei physiologischer Ionenstärke führt. Niedrigere Reduktionsmittelkonzentrationen und verringerte Expositionszeiträume führen zu einer weniger effektiven VLP-Zerlegung. Beispielsweise wurde festgestellt, dass 4%ige β-Mercaptoethanollösungen ebenfalls für eine effektive (zumindest 70%ige) Zerlegung sorgen.
Ebenso wurde festgestellt, dass die Ionenstärke ein wichtiger Parameter beim Zerlegungsverfahren ist. Vorzugsweise erfolgt die Zerlegung unter Verwendung einer Lösung mit einer Ionenstärke, die höchstens 0,5 beträgt und vorzugsweise geringer ist, noch bevorzugter erfolgt die Zerlegung bei einer annähernd „physiologischen" (d.h. 0,15 NaCl) oder geringeren Ionenstärke. Es wurde festgestellt, dass höhere Ionenstärken das VLP-Zerlegungsverfahren weniger effektiv machen. Im Allgemeinen beträgt die Ionenstärke höchstens etwa 0,5, noch bevorzugter höchstens etwa 0,25 und am meisten bevorzugt höchstens etwa 0,15.
Ebenso wurde herausgefunden, dass das Vorhandensein einer VLP-Aggregation nachteilige Auswirkungen auf die Zerlegung hat. Diese Auswirkung kann durch Entfernung des aggregierten Materials oder möglicherweise durch ein noch längeres Ausgesetztsein der VLPs an die hohe Konzentration von Reduktionsmittellösung vermieden werden. Dies geschieht wahrscheinlich, da die Disulfidbindungen vergraben und somit für das Reduktionsmittel in Aggregaten unerreichbar sind, wodurch eine Zerlegung verhindert wird.
Wie besprochen, wurde überraschenderweise auch festgestellt, dass Chelatoren sogar bei hohen Konzentrationen keine erhebliche Auswirkung auf die HPV-11-VLP-Zerlegung haben. Dies zeigte sich bei Verwendung sowohl von EGTA als auch von EDTA, beides wohlbekannte Chelatoren, allein und in Kombination mit Dithiothreitol. Wie zuvor besprochen, ist dies überraschend, da berichtet wurde, dass Chelatbildner bei der VLP-Zerlegung für ein verwandtes Papovavirus erforderlich sind.
Weiters wurde festgestellt, dass ein Carbonatpuffer (0,2 M NaHCO₃, pH 9,6) eine beträchtliche Zerlegung von HPV-11-VLPs bewirkte. Anders als bei der durch ein längeres Ausgesetztsein an Sulfhydrylreduktionsmittel hervorgerufenen Zerlegung war es jedoch nicht möglich, Carbonat-behandelte VLPs wieder zusammenzusetzen. Es wird angenommen, dass die Carbonatbehandlung das L1-Protein teilweise denaturierte. Dies zeigt, dass nur jene Verfahren (wie z.B. ein längeres Ausgesetztsein an wirksame Konzentrationen von Sulfhydrylreduktionsmitteln), die VLPs zerlegen und dabei die korrekt gefaltete L1-Proteinstruktur bewahren, ein Material produzieren, das fähig ist, sich wieder zu löslichen VLPs voller Größe zusammenzusetzen.
Wie angemerkt, führt die gegenständliche Zerlegung von HPV-11-VLPs zu Capsomeren von hoher Homogenität, die konformative neutralisierende Epitope darstellen, wie durch deren Reaktionsfähigkeit mit konformativen und neutralisierenden monoklonalen Antikörpern, die gegen das bestimmte Papillomavirus (als Beispiel ist HPV-11 angeführt) produziert wurden, bewiesen wird. Bei optimalen Bedingungen führt das gegenständliche Verfahren überdies zu einer Zusammensetzung, in der die VLPs vollständig in Capsomere zerlegt zu sein scheinen. Umgekehrt scheint die gegenständliche Zerlegung von HPV-16_Tr-VLPs zu einer Mischung aus Capsomeren, kleineren L1-Oligomeren und L1-Monomeren zu führen. Diese Mischung von L1-Oligomeren ist jedoch auch zu einer quantitativen Wiederzusammensetzung fähig. Dies zeigt, dass das gegenständliche Verfahren ein korrekt gefaltetes L1-Protein in Form von Capsomeren, kleinere L1-Oligomere oder ein L1-Monomer hervorbringt, das zur VLP-Wiederzusammensetzung fähig ist.
Wie besprochen, besteht ein besonderer Vorteil der Erfindung darin, dass diese Capsomere sich dann quantitativ zu VLPs zusammenfügen können, einfach indem die Reduktionsmittellösung entfernt wird. Die Entfernung des Reduktionsmittels kann durch verschiedene Verfahren, z.B. Dialyse oder Säulenchromatographie, bewerkstelligt werden. Alternativ kann das Hinzufügen eines Überschusses von Oxidationsmitteln möglicherweise die erneute Bildung der passenden Disulfidbindungen fördern, was zu einer VLP-Wiederzusammensetzung führt. Wie obenstehend besprochen, wird die Wiederzusammensetzung von der strukturellen Integrität des Ausgangsmaterials aus korrekt gefaltetem L1-Protein beeinflusst. Die Löslichkeit des Ausgangsmaterials beeinflusst ebenso die Wiederzusammensetzung, da sich aggregiertes Material nicht wieder quantitativ zusammensetzt.
Im Allgemeinen erfolgt eine Wiederzusammensetzung durch Entfernung des Sulfhydrylreduktionsmittels oder durch Hinzufügen von Oxidationsmitteln und das Ausgesetztsein des Ausgangsmaterials aus korrekt gefaltetem L1-Protein an Bedingungen höherer Ionenstärke, die z.B. zumindest etwa 0,5 beträgt oder höher ist. Höhere Salzkonzentrationen wirken dahingehend, die VLPs zu stabilisieren. Das Hinzufügen von Chelatbildnern hat jedoch die entgegengesetzte Wirkung, d.h., es hemmt in mäßiger Weise die Wiederzusammensetzung.
Überraschenderweise führt eine solche Wiederzusammensetzung zu VLPs, die hinsichtlich der Partikelgröße viel homogener als das ursprüngliche VLP-Ausgangsmaterial sind. Dies wurde durch einen Vergleich des VLP-Ausgangsmaterials und des wieder zusammengesetzten VLP-Produkts auf 10–65%igen linearen Sucrosegradienten und durch eine Untersuchung unter dem Elektronenmikroskop nachgewiesen. Vorwiegend wurden Partikel im Bereich der VLPs voller Größe, d.h. von durchschnittlich 56,5 ± 7,0 nm, detektiert, wobei sehr wenige teilweise zusammengefügte VLPs oder kleinere Komplexe sichtbar waren. Die Ausbeuten sind ebenfalls sehr hoch, bei Anwendung optimaler Wiederzusammensetzungsbedingungen erreichen sie durchschnittlich etwa 80–90%, was das Verhältnis zwischen dem L1-Gesamtprotein aus Ausgangsmaterial und wieder zusammengesetzten VLPs angeht. Im Wesentlichen scheint das gesamte zerlegte Ausgangsmaterial erneut lösliche, filtrierbare VLPs voller Größe zu bilden. Diese VLPs weisen auch konformative neutralisierende Epitope auf, die an der Oberfläche von authentischen Papillomavirus-Virionen zu finden sind, und rufen neutralisierende Antikörper genauso stark wie das VLP-Ausgangsmaterial hervor.
Obgleich diese Ergebnisse neu und unerwartet sind, wird dennoch erwartet, dass der Fachmann auf Basis der Lehren der Anmeldung durch Veränderung der Proteinkonzentration, des pH-Werts, der Ionenstärke und/oder der Kinetik sogar noch größere VLP-Ausbeuten erzielen kann.
Wie besprochen, stellt die vorliegende Erfindung weiters Verfahren zur Herstellung von Papillomavirus-VLPs bereit, in denen eine gewünschte Komponente oder gewünschte Komponenten eingekapselt ist bzw. sind. Dies wird im Allgemeinen durch die folgenden Schritte erzielt:

(i) das Erhalten von VLPs eines gewünschten Papillomavirus, die aus L1- oder einer Kombination von L1- und L2-Proteinen gebildet sind;
(ii) das Zerlegen solcher VLPs durch Kontaktieren solcher VLPs mit einer Lösung, die eine hohe Konzentration von Sulfhydrylreduktionsmittel mit einer Ionenstärke von höchstens 0,5 enthält;
(iii) das Kontaktieren der zerlegten VLPs mit einer Lösung, die eine darin einzukapselnde Komponente und gegebenenfalls auch ein gereinigtes L2-Protein (z.B. wenn die zerlegten VLPs kein L2-Protein umfassten) enthält; und
(iv) das Wiederzusammensetzen der zerlegten VLPs durch Entfernung des Sulfhydrylreduktionsmittels oder durch Hinzufügen eines Überschusses an Oxidationsmittel, wodurch VLPs produziert werden, welche die gewünschte(n) Komponente(n) enthalten.

Die Schritte des Zerlegens und Zusammenfügens werden wie zuvor beschrieben durchgeführt, d.h., die Zerlegung wird durch Verwendung hoher Konzentrationen von Sulfhydrylreduktionsmitteln, typischerweise zumindest 1 Gew.% oder mehr, und für längere Zeiträume, d.h. für mindestens 2 Stunden, und typischerweise länger, z.B. für mindestens 16 Stunden, durchgeführt. Wie besprochen, werden die Expositionszeit und die Konzentration des Reduktionsmittels vom Typ der Papillomavirus-VLPs, vom Wirtszellsystem, in dem diese produziert werden, von Mutationen innerhalb des L1-Proteins (z.B. C-terminalen Kürzungen), vom Reinheitsgrad, von der Frage, ob Aggregate vorhanden sind, und möglicherweise, ob die VLPs aus L1 oder einer Kombination von L1 und L2 zusammen gesetzt sind, beeinflusst. Eine Wiederzusammensetzung erfolgt bei Entfernung oder Oxidation des Sulfhydrylreduktionsmittels.
Obgleich plausiblerweise angenommen werden kann, dass aus L1 und L2 zusammengesetzte VLPs unter ähnlichen Bedingungen wie auf L1 basierende VLPs zerfallen, kann das L2-Protein, wie zuvor besprochen, eine stabilisierende Funktion erfüllen. Daher kann die Zerlegung der aus L1 und L2 zusammengesetzten VLPs möglicherweise höhere Reduktionsmittelkonzentrationen, ein längeres Ausgesetztsein an diese, eine reduzierte Ionenstärke, einen erhöhten pH-Wert oder eine Kombination davon erfordern. Alternativ können VLPs, die gänzlich aus PV-L1-Proteinen gebildet sind, wie hier gelehrt zerlegt werden, und (durch rekombinante Verfahren hergestelltes) gereinigtes L2-Protein kann während des Schritts des Wiederzusammensetzens hinzugefügt werden.
Die Komponenten, die in den VLPs eingekapselt werden können, umfassen therapeutische und diagnostische Komponenten, z.B. Nucleinsäuresequenzen, Radionuklide, Hormone, Peptide, Antivirusmittel, Antitumormittel, das Zellwachstum modulierende Mittel, Zellwachstumshemmer, Cytokine, Antigene, Toxine etc.
Die gegenständlichen VLPs, die eine gewünschte, darin eingekapselte Komponente enthalten, sollten bei Verabreichung an einen gewünschten Wirt, vorzugsweise einen Menschen, von normalerweise durch das bestimmte Papillomavirus infizierten Zellen, z.B. Epithelzellen, Keratinozyten etc., aufgenommen werden, wodurch für die potentielle Internalisierung der eingekapselten Komponente in diese Zellen gesorgt wird. Diese könnte die Verwendung der gegenständlichen VLPs für eine Therapie (im Gegensatz zu einer Prophylaktik) ermöglichen, da sie die Zufuhr eines therapeutischen Mittels zu einem gewünschten Zellort, z.B. zur Stelle eines Gebärmutterhalskarzinoms, ermöglicht. Angesichts der – im Allgemeinen – Überempfindlichkeit von PVs könnte dies ein höchst selektives Mittel zum Zuführen gewünschter Komponenten zu Zielzellen ergeben. Es könnte beispielsweise ein Mittel zum Zuführen von Nucleinsäuresequenzen, z.B. einer ein therapeutisches Polypeptid codierenden DNA oder einer Antisinnsequenz, schaffen.
Die Komponente oder die Komponenten, die eingekapselt ist bzw. sind, sollte bzw. sollten die VLP-Zusammenfügung und/oder -Stabilität natürlich nicht negativ beeinflussen. Dies kann festgestellt werden, indem die gewünschte Komponente enthaltende VLPs hergestellt und deren Auswirkungen, falls vorhanden, auf die VLP-Zusammenfügung und/oder -Stabilität bewertet werden.
Im Falle von DNAs oder RNAs kann die eingekapselte Nucleinsequenz bis zu 8 Kilobasen, die Größe des PV-Genoms, umfassen. Typischerweise sind die eingekapselten Sequenzen jedoch kleiner und liegen z.B. in der Größenordnung von 1–2 Kilobasen.
Typischerweise codieren diese DNAs ein gewünschtes Polypeptid, z.B. ein therapeutisches Polypeptid, wie z.B. ein Enzym, ein Hormon, einen Wachstumsfaktor etc. Diese Sequenz wird weiters betriebsfähig mit Sequenzen verbunden, welche deren Expression in den Wirtszellen, auf die abgezielt wird, erleichtern.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit von VLPs, die eingekapselte DNAs enthalten, ist jene als „Pseudovirionen". Diesbezüglich sind zahlreiche Papillomaviren, einschließlich jener, die bei menschlichen Erkrankungen eine Rolle spielen, selten, können nicht leicht in vitro vermehrt werden und nicht leicht in Mengen, die deren Verwendung bei Antikörper-Neutralisationsanalysen ermöglichen, aus menschlichen Zellquellen herausgesäubert werden. Dies ist problematisch, da es die Bewertung der Realisierbarkeit von Impfstoffen oder einer Therapeutik zum Schutz vor diesen spezifischen HPV-Viren verhindert oder schwierig macht. Beispiele für HPV-Typen, von denen derzeit keine Vorräte verfügbar sind, umfassen HPV-31, 33, 35 und 45.
Die vorliegende Erfindung sollte derartige Probleme vermeiden oder zumindest reduzieren. „Pseudovirionen" werden im Wesentlichen in Übereinstimmung mit jenen Viren konstruiert, die VLPs umfassen, die aus L1- oder einer Kombination von L1- und L2-Proteinen des jeweiligen PV gebildet sind, und in denen weiters ein Teil des Genoms dieses Papillomavirus oder eine einen auswählbaren Marker codierende DNA eingekapselt ist.
Dieses Pseudovirion wird bei einer in vitro-Analyse der Zell-„Infektiosität" verwendet, um die Wirksamkeit der entsprechenden VLP-Impfstoffe zu bewerten. Dies wird im Wesentlichen durch das Kontaktieren der Zellen mit solchen Pseudovirionen bewerkstelligt. Diese Pseudovirionen sollten solche Zellen binden und für die Insertion dieser DNA sorgen. Danach kann die Insertion der DNA durch bekannte Verfahren, z.B. PCR-Hydridisierungsverfahren, oder basierend auf der Expression des auswählbaren Markers, z.B. β-Galactosidase, bewertet werden.
Dies wird sowohl bei Vorhandensein als auch bei Fehlen von Antikörpern bewirkt, die gegen L1- oder L2-Proteine, welche für das bestimmte HPV spezifisch sind, geschaffen wurden. Wenn die Insertion, wie festgestellt, z.B. auf Basis einer reduzierten Expression des auswählbaren Markers gehemmt wird, so ist dies ein Hinweis darauf, dass das L1- oder L2-Protein die Produktion virusneutralisierender Antikörper hervorgerufen hat.
Die vorliegende Erfindung ist bei der Herstellung von VLPs für jedes Papillomavirus und insbesondere jedes menschliche Papillomavirus anwendbar. In der Literatur wurde über zahlreiche HPV-L1- und -L2-DNAs berichtet, und diese sind öffentlich erhältlich (siehe z.B. Baker, Sequence Analysis of Papillomavirus, Genomes, S. 321–384; Long et al, U.S.-Patent Nr. 5,437,931, Cole et al, J. Mol. Biol., 193:599–608 (1987); Danos et al, EMBO J., 1:231– 236 (1982); Cole et al J. Virol., 38(3):991–995 (1986)). Es ist auch wohlbekannt, dass HPV-L1-DNAs eine signifikante Homologie aufweisen. Daher kann eine gewünschte HPV-L1-DNA leicht erhalten werden, z.B. indem eine HPV-L1-DNA, über die zuvor berichtet wurde, oder ein Fragment davon während einer Polymerisationskettenreaktions(PCR)-Amplifikation als Hybridisierungssonde oder als Primer verwendet wird. Tatsächlich wurden zahlreiche HPV-L1-DNAs kloniert und exprimiert.
Bei der gegenständlichen Erfindung wird die HPV-L1-DNA vorzugsweise von einem HPV abgeleitet, das an Krebs oder Condylomata acuminata beteiligt ist, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52 und HPV-56 spielen zum Beispiel bei Krebs eine Rolle, und HPV-6, HPV-11, HPV-30, HPV-42, HPV-43, HPV-44, HPV-54, HPV-55 und HPV-70 spielen bei Warzen eine Rolle. Die gegenständlichen homogenen VLPs können jedoch aus jeder gewünschten HPV-L1-DNA hergestellt werden.
Die ausgewählten HPV-L1- und gegebenenfalls -L2-Sequenzen werden im Allgemeinen in einem gewünschten rekombinanten Wirtszellsystem exprimiert und zur Herstellung von HPV VLPs für die Zerlegung verwendet.
Der ausgewählte Wirt und der ausgewählte Expressionsvektor werden unter Bedingungen kultiviert, welche die Produktion von VLPs begünstigen. Dies hängt größtenteils vom ausgewählten Wirtssystem und den im Vektor enthaltenen Regulationssequenzen ab, z.B. davon, ob die Expression eine Induktion erfordert. Nach der Expression werden die HPV VLPs aus den Wirtszellen extrahiert. Die Extraktionsmittel hängen in einem gewissen Maß auch vom Wirt/Vektorsystem ab.
Wenn beispielsweise ein intrazellulärer Expressionsvektor ausgewählt wird, müssen die Wirtszellen lysiert und die HPV VLPs aus dem Lysat rückgewonnen werden. Wenn der Expressionsvektor Sequenzen enthält, die eine Sekretion erleichtern, können die HPV VLPs im Gegensatz dazu direkt aus dem Kulturmedium rückgewonnen werden. Verfahren zur Rückgewinnung heterologer Proteine aus rekombinanten Wirtszellen und einem Kulturmedium sind im Stand der Technik wohlbekannt.
HPV-L1-Sequenzen können in jeder Wirtszelle exprimiert werden, die für die Expression gewinnbarer Ausbeuten an HPV VLPs sorgt. Geeignete Wirtssysteme für die Expression rekombinanter Proteine sind wohlbekannt und umfassen beispielsweise Bakterien, Säugetierzellen, Hefe und Insektenzellen. Ein bevorzugtes Expressionssystem umfasst das in den Beispielen verwendete Baculovirus-/Insektenzellsystem, da dieses System für hohe Proteinausbeuten sorgt. HPV-L1- und -L2-Proteine können jedoch in anderen Systemen, insbesondere in Bakterien und Hefe, produziert werden.
Geeignete Vektoren für das Klonieren der Expression der gegenständlichen HPV-L1-codierenden DNA-Sequenzen sind im Stand der Technik wohlbekannt und handelsüblich. Weiters sind geeignete Regulationssequenzen zum Erzielen einer Klonierung und Expression, z.B. Promotoren, Polyadenylierungssequenzen, Verstärker und auswählbare Marker, ebenfalls wohlbekannt. Das Auswählen geeigneter Sequenzen zum Erzielen gewinnbarer Proteinausbeuten ist für den Fachmann Routine.
Wie berichtet, kommen VLPs bei prophylaktischen HPV-Impfstoffen und bei der Diagnostik zur Anwendung. Durch Zerlegung hergestellte Capsomere können ebenfalls nützlich sein, da herausgefunden wurde, dass sie konformative neutralisierende Epitope darstellen und neutralisierende Antikörper induzieren. Die gegenständlichen VLPs können aufgrund ihrer gesteigerten Homogenität und möglicherweise Stabilität dabei von Vorteil sein.
Wie besprochen, sollte die vorliegende Erfindung bei jeglicher HPV-L1-Sequenz allgemein anwendbar sein. Im Stand der Technik ist eine Vielfalt von HPV-Typen bekannt. Weiters stehen bestimmte Typen von HPVs mit bestimmten Infektionen, wie z.B. Flachwarzen, Hautwarzen, Epidermodysplasia verruciformis, Läsionen und Gebärmutterhalskrebs, in Zusammenhang. Bei klinischen Läsionen wurden durch Untersuchungen der viralen Nucleotidsequenzhomologie über 60 verschiedene HPV-Typen identifiziert. Siehe z.B. Jenson et al, in: Belshe, R. Hrsg., Textbook of Human Virology, zweite Auflage, MASS:PSG, 1989:951 und Kremsdorf et al, J. Virol., 52:1013–1018 (1984). Der HPV-Typ bestimmt teilweise den Ort der Infektion, die pathologischen Merkmale und das klinische Erscheinungsbild sowie den klinischen Verlauf der jeweiligen Läsion.
Da angenommen wird, dass wenig oder keine Kreuzimmunität für HPV-Typen existiert und die Immunität gegenüber einer Infektion HPV-Typ-spezifisch ist, wird es erforderlich sein, rekombinante HPV VLPs für jeden spezifischen HPV-Typ, bei dem ein Schutz oder eine Behandlung notwendig ist, zu produzieren. Aufgrund der Homologie zwischen den L1-Proteinen und -Genen können jedoch zum Isolieren des bestimmten L1-Gens, das von Interesse ist, Hybridisierungstechniken eingesetzt werden. Nucleotidsonden, die aus Bereichen des L1-Proteins ausgewählt wurden, welche nachweislich eine Sequenzhomologie aufweisen, können zum Isolieren anderer L1-Gene eingesetzt werden. Im Stand der Technik sind Verfahren zur Hybridisierung bekannt (siehe z.B. Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington D.C. (1985); Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis et al, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); und Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory, zweite Auflage, Cold Spring Harbor, NY (1989)).
Alternativ können PCR-Verfahren zur Amplifikation von L1-Genen oder -Genfragmenten eingesetzt werden (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 4,683,195; 4,683,202 und 4,800,159).
Viruspartikel können auch für einen bestimmten Papillomavirustyp isoliert werden, die DNA kann kloniert werden, und die L1-Proteine codierenden Nucleinsäuresequenzen können isoliert werden. Über Verfahren zum Isolieren von Viruspartikeln und zum Klonieren von Virus-DNAs wurde berichtet (siehe z.B. Heilman et al, J. Virology, 36:395–407 (1980); Beaudenon et al, Nature, 321:246–249 (1986); Georges et al, J. Virology, 51:530–538 (1984); Kremsdorf et al, J. Virology, 52:1013–1018 (1984); Clad et al, Virology, 118:254–259 (1982); De Villiers et al, J. Virology, 40:932–935 (1981); und die europäische Patentanmeldung 0,133,123).
Alternativ kann das L1-Protein für ein bestimmtes menschliches Papillomavirus isoliert werden, die Aminosäuresequenz kann bestimmt werden, und basierend auf der vorhergesagten DNA-Sequenz können Nucleinsäuresonden konstruiert werden. Solche Sonden können beim Isolieren des L1-Gens aus einer Bibliothek der Papillomavirus-DNA verwendet werden (siehe z.B. Suggs et al, PNAS, 78(11):6613–6617 (1981) und Young and Davis, PNAS, 80:1194 (1983)).
Wie besprochen, ist das VLP-Gebilde einigermaßen empfindlich gegenüber dem Zelltyp, in dem eine Expression bewirkt wird. Daher ist es vorteilhaft, Systeme auszuwählen, die große Mengen an VLPs als Ausgangsmaterial für die VLP-Zerlegung produzieren. Das Expressionssystem umfasst im Allgemeinen einen Vektor, der das L1-Protein, das von Interesse ist, und die passenden Regulationsbereiche aufweist, sowie eine geeignete Wirtszelle.
Wie besprochen, werden Baculovirusvektoren bevorzugt verwendet. Ein Baculovirussystem bietet den Vorteil, dass ein großer Prozentsatz der Zellen aufgrund der Verwendung von Infektionstechniken anstelle von Transfektionstechniken dazu stimuliert werden kann, Protein zu exprimieren. Obgleich Baculovirus ein Insektenvirus ist und in Insektenzellen (Sf9) wächst, bewahren diese Zellen viele der eukaryontischen Mechanismen zum Verarbeiten von Proteinen, einschließlich der Glykosylierung und Phosphorylierung, welche für das Erzeugen von Proteinen mit passender Konformation wichtig sein könnten. Baculovirusvektorsysteme sind im Stand der Technik bekannt (siehe z.B. Summers und Smith, Texas Agricultural Experimental Bulletin, Nr. 1555 (1987); Smith et al, Mol. Cell Biol., 3:2156–2165 (1985); Posse, Virus Research, 5:4359 (1986); und Matsuura, J. Gen. Virol., 68:1233–1250 (1987)). Es wurde auch berichtet, dass Baculovirus-infizierte Zellen HPV-L1-Proteine exprimieren, welche die passende Konformation aufweisen.
Für die Expression in einem geeigneten Expressionssystem wird ein L1-Gen oder ein modifiziertes L1-Gen betriebsfähig in einem Expressionsvektor eingebunden und in eine Wirtszelle eingebracht, um die Expression des L1-Proteins durch diese Zelle zu ermöglichen. Das Gen mit den passenden Regulationsbereichen wird in der richtigen Ausrichtung und im richtigen Leseraster bereitgestellt, um eine Expression zu ermöglichen. Im Stand der Technik sind Verfahren zur Genkonstruktion bekannt (siehe insbesondere Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory, zweite Auflage, Cold Spring Harbor, NY (1989) und die darin zitierten Referenzen).
Eine breite Vielfalt von Transcriptions- und Regulationssequenzen kann eingesetzt werden. Die Signale können von Virusquellen abgeleitet werden, wo die Regulationssignale mit einem bestimmten Gen, das eine hohe Expressionsstärke aufweist, in Zusammenhang stehen. Das heißt, starke Promotoren z.B. von Virus- oder Säugetierquellen werden verwendet. Auf diese Weise umfassen die optimalen Bedingungen für die Durchführung der Erfindung das Klonieren des L1-Gens in einen Expressionsvektor, der konformativ abhängige virusneutralisierende Epitope des L1-Proteins in transfizierten oder infizierten Zielzellen überexprimiert.
Die Eignung der erfindungsgemäß hergestellten HPV VLPs als Impfstoffe oder als Diagnosemittel wird durch die Reaktion mit Antikörpern oder monoklonalen Antikörpern bestätigt, die am intakten Virion vorhandene, konformative Epitope erkennen oder mit diesen reagieren, sowie basierend auf deren Fähigkeit zum Hervorrufen der Produktion eines neutralisierenden Antiserums. Dem Fachmann sind geeignete Analysen bekannt, welche feststellen, ob neutralisierende Antikörper produziert werden. Dies ist ein wesentliches Charakteristikum von HPV VLPs, die bei HPV-Impfstoffen zu verwenden sind. Auf diese Weise kann geprüft werden, ob die HPV VLPs die Produktion von Anti-HPV-neutralisierenden Antikörpern hervorrufen. So können andere Expressionsvektoren und Expressionssysteme hinsichtlich der Verwendung bei der Erfindung getestet werden.
Wie besprochen, können die VLPs der vorliegenden Erfindung zum Detektieren, Diagnostizieren, Serotypisieren und Behandeln einer Papillomavirusinfektion verwendet werden. Erfindungsgemäße VLPs können unter Verwendung irgendeiner aus einer Vielzahl von Markierungen und Markierungsmethoden gekennzeichnet werden, wenn sie zum Diagnostizieren oder Serotypisieren eingesetzt werden. Beispiele für die Typen von Markierungen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Enzymmarkierungen, Radioisotopenmarkierungen, nicht radioaktive Istotopenmarkierungen, Fluoreszenzmarkierungen, Toxinmarkierungen und Chemolumineszenzmarkierungen, ohne darauf beschränkt zu sein.
Beispiele für geeignete Enzymmarkierungen umfassen Malathydrogenase, Staphylokokkennuclease, Delta-5-Steroidisomerase, Hefe-Alkohol-Dehydrogenase, Alpha-Glycerinphosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, Beta-Galactosidase, Ribonuclease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Glucoamylase, Acetylcholinesterase etc..
Beispiele für geeignete Radioisotopenmarkierungen umfassen ³H, ¹²⁵I, ¹²¹I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ⁵⁷To, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ¹⁵²Eu, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹¹At, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc, und ¹⁰⁹Pd.
Beispiele für geeignete Fluoreszenzmarkierungen umfassen eine ¹⁵²Eu-Markierung, eine Fluorescein-Markierung, eine Isothiocyanat-Markierung, eine Rhodamin-Markierung, eine Phycoerythrin-Markierung, eine Phycocyanin-Markierung, eine Allophycocyanin-Markierung, eine o-Phthaldehyd-Markierung, eine Fluorescamin-Markierung etc.
Beispiele für geeignete Toxinmarkierungen umfassen Diphtherie-Toxin, Ricin und Cholera-Toxin. Beispiele für Chemolumineszenzmarkierungen umfassen eine Luminal-Markierung, eine Isoluminal-Markierung, eine aromatische Acridiniumester-Markierung, eine Imidazol-Markierung, eine Acridiniumsalz-Markierung, eine Oxalatester-Markierung, eine Luciferin-Markierung, eine Luciferase-Markierung, eine Aequorin-Markierung etc.
Der Durchschnittsfachmann kennt andere geeignete Markierungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Die Bindung dieser Markierungen an VLPs kann unter Anwendung von Standardtechniken erzielt werden, die dem Durchschnittsfachmann üblicherweise bekannt sind. Typische Techniken werden von Kennedy et al., Clin. Chim. Acta, 70:1–31 (1976), und Schurs et al, Clin. Chim. Acta, 81:1–40 (1977), beschrieben. Kopplungstechniken, die bei letzterem erwähnt werden, sind das Glutaraldehyd-Verfahren, das Periodat-Verfahren, das Dimaleimid-Verfahren, das m-Maleimidobenzyl-N-hydroxysuccinimidester-Verfahren, wobei all diese Verfahren hier durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Die Detektion der Anti-HPV-Antikörper mittels der gegenständlichen VLPs kann durch die Verwendung von Trägern verbessert werden. Wohlbekannte Träger umfassen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Die Beschaffenheit des Trägers kann für die Zwecke der vorliegenden Erfindung entweder bis zu einem gewissen Grad löslich oder unlöslich sein. Der Fachmann wird viele andere Träger, die zum Binden von Proteinen geeignet sind, zur Kenntnis nehmen oder wird diese unter Anwendung eines routinemäßigen Experimentierens bestimmen können.
Der wichtigste Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst jedoch die Entwicklung von PV-Impfstoffen. Die erfindungsgemäßen Impfstoffe enthalten eine Menge der gegenständlichen HPV VLPs, die ausreicht, um in dem Wirt die Bildung neutralisierender, in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthaltener Antikörper auszulösen.
Die Verabreichung der gegenständlichen VLP-haltigen Impfstoffe kann durch jedes pharmazeutisch akzeptable Mittel z.B. parenteral, lokal oder systemisch erfolgen, einschließlich zum Beispiel einer oralen, intranasalen, intravenösen, intramuskulären und topischen Verabreichung. Die Art der Verabreichung hängt von Faktoren ab, die den natürlichen Infektionsweg einschließen. Die verabreichte Dosis hängt von Faktoren ab, die das Alter, die Gesundheit, das Gewicht, die Art der Behandlung, die fallweise gleichzeitig erfolgt, sowie die Beschaffenheit und den Typ des jeweiligen menschlichen Papillomavirus einschließen. Der Impfstoffkann in einer Dosierungsform verwendet werden wie z.B. in Form von Kapseln, flüssigen Lösungen, Suspensionen oder Elixieren für die orale Verabreichung oder in Form von sterilen flüssigen Formulierungen, z.B. Lösungen oder Suspensionen, für die parenterale oder intranasale Verwendung. Ein inerter, immunologisch akzeptabler Träger, wie z.B. eine Salzlösung oder eine phosphatgepufferte Salzlösung, wird bevorzugt verwendet.
Die Impfstoffe werden in therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht. Das heißt, in Mengen, die ausreichen, um eine schützende immunologische Reaktion hervorzurufen. Im Allgemeinen werden die Impfstoffe in Dosierungen verabreicht, die von etwa 0,1 mg Protein bis etwa 20 mg Protein, noch allgemeiner von etwa 0,001 mg bis etwa 100 mg Protein, reichen. Einzelne oder mehrfache Dosierungen können verabreicht werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Herstellung von HPV VLPs enthaltenden Impfstoffen zur Verhinderung einer Papillomavirusinfektion. Durch Befolgung der erfindungsgemäßen Verfahren können weiters Impfstoffe für jedes Papillomavirus, das für den Menschen spezifisch ist, hergestellt werden.
Da mehr als ein PV-Typ mit PV-Infektionen in Zusammenhang gebracht werden kann, können die Impfstoffe stabile HPV VLPs umfassen, die von mehr als einem PV-Typ abgeleitet sind. Da HPV 16 und 18 beispielsweise mit Gebärmutterhalskarzinomen in Zusammenhang stehen, kann ein Impfstoff für eine zervikale Neoplasie daher VLPs von HPV 16, von HPV 18 oder sowohl von HPV 16 als auch 18 umfassen.
Tatsächlich steht eine Vielzahl von Neoplasien bekanntermaßen mit PV-Infektionen in Zusammenhang. Die HPVs 3a and 10 wurden beispielsweise mit Flachwarzen in Zusammenhang gebracht. Es wurde berichtet, das eine Anzahl von HPV-Typen, einschließlich der HPVs 3a, 5, 8, 9, 10 und 12, mit Epidermodysplasia verruciformis (EV) in Zusammenhang steht. Bezüglich der HPVs 1, 2, 4 und 7 wurde berichtet, dass sie mit Hautwarzen in Zusammenhang stehen, und die HPVs 6b, 11a, 13 und 16 stehen mit Läsionen der Schleimhhäute in Zusammenhang (siehe z.B. Kremsdorf et al, J. Virol., 52:1013–1018 (1984); Beaudenon et al, Nature, 321:246–249 (1986); Heilman et al, J. Virol., 36:395–407 (1980); und De Villiers et al, J. Virol., 40:932–935 (1981)). Somit können die gegenständlichen Impfstoffformulierungen eine Mischung von wieder zusammengesetzten VLPs umfassen, die je nach dem gewünschten Schutz von verschiedenen HPV-Typen abgeleitet wurden.
Wie gezeigt wurde, können die erfindungsgemäßen HPV VLPs auch zum Serotypisieren und zum Einbau in Serotypisierungs-Kits verwendet werden.
Für das serologische Testen umfassen die Kits die gegenständlichen HPV VLPs und Detektionsmittel wie z.B. Enzymsubstrate, einen markierten Antikörper und dergleichen. Nach der allgemeinen Beschreibung der Erfindung werden nun die nachfolgenden Beispiele angeführt, die, falls nicht anders angegeben, zur Veranschaulichung und nicht einschränkend gedacht sind.
BEISPIELE
Die folgenden Materialien und Verfahren wurden in den Beispielen verwendet.
Materialien und Verfahren
HPV-11-VLPs
Für die Verwendung bei Untersuchungen der VLP-Zerlegung und -Wiederzusammensetzung unter Verwendung von reinem Protein wurden HPV-11-L1-Proteine in Trichoplusia ni (High Five^®)-Zellen heterolog exprimiert, welche mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert waren, der, wie beschrieben, den vollständigen offenen L1-Leseraster stromabwärts vom Polyhedrin-Promotor codierte (Ghim et al, in M.A. Stanley (Hrsg.) Immunology of human papillomaviruses, Plenum, New York, S. 147–153 (1993). Die Zellen wurden ungefähr 72 Stunden nach der Infektion geerntet, durch Zentrifugation pelletiert und eingefroren. Zur Herstellung von VLPs wurde die Zellpaste in einem Homogenisierungspuffer (20 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7,4, enthaltend 10 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Aprotinin und 1 μg/ml Pepstatin A) resuspendiert und in einem Mikroverflüssiger (Microfluidics Modell HC8000/3A) lysiert. Das homogenisierte Lysat wurde dann mit 100.000 × g 90 Minuten lang zentrifugiert, und das HPV-11-VLPs enthaltende Pellet wurde in PBS, enthaltend CsCl (405 g/l), resuspendiert. Das geklärte Lysat wurde danach über Nacht mit 83.000 × g zentrifugiert, und die VLP-Bande wurde gesammelt. Die VLPs wurden in PBS-0,5M NaCl verdünnt und auf einen aus 30 und 63%iger Sucrose gebildeten Zweikomponenten-Stufengradienten geschichtet. Die Gradienten wurden mit 167.000 × g 3 Stunden lang zentrifugiert, und die gereinigte VLP-Bande wurde an der Schnittstelle zwischen der 30%igen und der 63%igen Sucroselösung gesammelt. Die VLPs wurden dann in ausgewählte Puffer (entweder PBS oder PBS, zu dem NaCl bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,3 M oder 0,5 M hinzugefügt wurde) dialysiert und bei 4°C gelagert. Die Proteinkonzentration wurde durch die Bradford-Analyse bestimmt (Bradford et al, Anal. Biochem., 72:248–254 (1976)), wobei Rinder-Serumalbumin als Referenzprotein eingesetzt wurde, und der L1-Gehalt wurde wie beschrieben bestimmt (Suzich et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1553–11557 (1995)). Ausgehend von 25–30 g feuchter Zellpaste ergab das obige Protokoll 15–25 mg HPV-11-VLPs.
HPV-16_Tr-VLPs
Für die Verwendung bei Untersuchungen der VLP-Zerlegung und -Wiederzusammensetzung während der Reinigung wurden HPV-16_Tr-L1-Proteine (bestehend aus einer mutierten Form des HPV-16-L1-Proteins, aus dem die 34 C-terminalen Aminosäuren herausgelöscht wurden) wie obenstehend beschrieben in High-Five^®-Zellen exprimiert. Die Zellpaste wurde in einem Extraktionspuffer (10 mM Tris, 1,0% Triton X-100, pH 6,0) resuspendiert, durch Rühren vermischt und kurz mit 1.000 × g zentrifugiert. Das die HPV-16_Tr-VLPs enthaltende Pellet wurde in 20 mM Tris, 0,1 M NaCl, pH 8,0-Puffer resuspendiert, kurz geschleudert und mit 3.000 × g 30 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde aufgefangen, durch 0,45 μ-Celluloseacetat-Spritzenfilter filtriert und dann, vor der Verwendung in Säulenreinigungsversuchen, bei Vorhandensein oder Fehlen von 4%igem βME bei 4°C für > 2 Stunden inkubiert. Der geklärte filtrierte Überstand (+/–βME) wurde auf verschiedene Ionenaustauscherharze mit niedrigen Leitfähigkeitswerten (5–15 Milliohm) aufgebracht, mit mehreren Säulenvolumen von Äquilibrierungspuffer gewaschen mit einem Gradienten von ansteigendem NaCl eluiert. Um die Nützlichkeit von HIC bei der Entfernung von Rest-DNA und von Proteinkontaminanten zu untersuchen, wurden die Fraktionen, die den Peak des eluierten L1-Proteins aus IEC enthielten, gepoolt, in Ammoniumsulfat auf 0,7 M eingestellt und auf eine in demselben Puffer äquilibrierte HIC-Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit mehreren Säulenvolumen von Äquilibrierungspuffer gewaschen und dann wurde das L1-Protein bei einer niedrigeren Ammoniumsulfatkonzentration aus der HIC-Säule eluiert. Die Endprodukte der Reinigungsprozesse (+/–βME) wurden ausgiebig gegen PBS (0,5 M NaCl) dialysiert und hinsichtlich der Reinheit, der Ausbeute und der Rest-DNA verglichen. Das Erscheinungsbild der VLPs wurde durch Elektronenmikroskopie und eine lineare Sucrosegradientenanalyse charakterisiert (siehe unten).
Sucrosegradientenzentrifugation
Bei diesen Versuchen wurden drei Typen von Sucrosegradienten verwendet. Als erstes wurde eine Zentrifugation auf 30%igen Sucrosepolstern zum Identifizieren jener Bedingungen eingesetzt, welche die Zerlegung von VLPs in kleinere lösliche Komponenten begünstigten. 100–200 μl Reaktionsmischungen, die VLPs (50–100 μg Gesamtprotein) mit oder ohne potentiellen Zerstörungsmitteln enthielten, wurden auf 5 ml-Zentrifugenröhrchen geschichtet, die mit 4,8 ml 30%iger Sucrose (w/w in PBS-0,5M NaCl) gefüllt waren, und bei 40°C 2 Stunden lang mit 197.000 × g in einem Schwenkbecher-Rotor zentrifugiert. Ein 50 μl-Aliquot wurde ganz oben aus dem Glas entnommen und mit 2X Laemmli-Probenvorbereitungspuffer vermischt (Laemmli, U.K., Nature, 227:680–685 (1970)). Der Rest des 30%igen Sucrosepolsters wurde mit einer Pipette entfernt, und das „Pellet" (typischerweise war keines zu sehen) wurde in 100 μl von 1X Laemmli-Probenvorbereitungspuffer resuspendiert. Das Vorhandensein von HPV-11-L1-Protein am oberen oder unteren Ende des 30%igen Sucrosepolsters wurde dann durch SDS/PAGE festgestellt, und die relative Menge an L1 wurde durch Analyse von digitalisierten Gels quantitativ bestimmt. Als zweites wurde der Zustand der zerlegten VLPs mittels einer Raten-Zonen-Zentrifugation durch 5–20%ige lineare Sucrosegradienten bestimmt. Die zerlegten VLPs (100–200 μg Gesamtprotein in 400 μl) wurden auf vorgeformte 11,6 ml-Gradienten geschichtet, die aus 5–20%iger Sucrose (w/v in PBS-0,5M NaCl) gebildet waren, und bei 4°C 24 Stunden lang mit 111.000 × g in einem Schwenkbecher-Rotor zentrifugiert. Fraktionen (0,5 ml) wurden quer durch den Gradienten gesammelt, und das „Pellet" (typischerweise war keines zu sehen) wurde durch Dounce-Homogenisierung in 0,5 ml PBS resuspendiert. Die Position des HPV-11-L1-Proteins quer durch den Gradienten wurde durch Immunoblotting bestimmt. Die Gradienten wurden unter Verwendung von Standardproteinen mit bewährten Sedimentationskoeffizienten kalibriert (E. coli β-Galactosidase, 19 S; Rinderleber-Katalase, 11,3 S; Rinder-Serumalbumin, 4,3 S), und der Prozentsatz von Sucrose in den Fraktionen wurde durch Refraktometrie bestimmt.
Als drittes wurde der Zustand der zerlegten und wieder zusammengesetzten Anfangs-VLPs mittels einer Raten-Zonen-Zentrifugation durch 10–65%ige lineare Sucrosegradienten bestimmt. HPV-11-L1-Protein (100–200 μg Gesamtprotein in 400 μl) in verschiedenen Stadien der Zusammenfügung wurde auf vorgeformte 11,6 ml-Gradienten geschichtet, die aus 10–65%iger Sucrose (w/v in PBS-0,5M NaCl) gebildet waren, und bei 40°C 2,5 Stunden lang mit 188.000 × g in einem Schwenkbecher-Rotor zentrifugiert. Die Gradienten wurden wie oben (in 1,0 ml-Fraktionen) gesammelt, analysiert und kalibriert, wobei Parvovirus B19 (70 S) und HPV-18-L1-VLPs (160 S) als zusätzliche Kalibrierstandards verwendet wurden.
Gelelektrophorese
SDS/PAGE
Die SDS/PAGE wurde größtenteils gemäß dem Verfahren von Laemmli durchgeführt (Laemmli, U.K., Nature, 227:680–685 (1970)). Die Proben wurden mit einem Probenvorbereitungspuffer vermischt, 2 Minuten lang gekocht, kurz in einer Minifuge geschleudert und auf 7,5%ige (1) oder 10%ige (2–4) Minigels geladen, und zwar mit einem 4%igen Stapelgel. Die Gels wurden bei Raumtemperatur und einem 20 mA-Dauerstrom ungefähr 1 Stunde lang laufen gelassen, und das Protein wurde durch Einfärben mit Coomassie Brilliant Blue R250 sichtbar gemacht.
Immunoblotting
Elektroblots von HPV-11-L1 von SDS/PAGE-Gels wurden größtenteils gemäß dem Verfahren von Towbin et al hergestellt (Proc. Natl. Acad Sci., USA, 76:4350–4354 (1979)). Die Blots wurden bei 4°C über Nacht mit Protein aus 1%iger fettfreier Milch in PBS blockiert. Die Blots wurden mit AU1 (Berkely Antibody Co.), einem Maus-Monoklonal, das gegen ein lineares Epitop an Papillomavirus-L1-Proteinen (25) gerichtet war, 90 Minuten lang untersucht, mit PBS, 0,1%igem Triton X-100 gewaschen und dann erneut 30 Minuten lang blockiert. Die Blots wurden danach mit HRP-markiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (Southern Biotechnology Associates, Inc.) 40 Minuten lang inkubiert und wie oben gewaschen. Dann wurden die Blots mit einem ECL-Western-Blotting-Reagens (Amersham) entwickelt und einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Analyse der Gels
Die M_r des monomeren und oligomeren L1 wurden aus deren R_f-Werten auf 7,5%iger SDS/PAGE ermittelt, und zwar im Vergleich zu Standardproteinen (siehe Jackowski et al, in T.E. Creighton (Hrsg.), Protein structure: a practical approach, IRL Press, New York, S. 1–21 (1989)). Wenn sie angezeigt wurden, wurden die Gels auf einem Hewlett Packard Scanjet Plus-Flachbett-Densitometer digitalisiert, und die relative Intensität der Banden wurde unter Verwendung einer Scan Analysis-Software (Version 2,2; Specom Research) bestimmt.
Elektronenmikroskopie
Die Proteinproben wurden auf Formvar- und Kohlenstoff beschichteten Kupfergittern absetzen gelassen (Electron Microscopy Sciences), sie wurden trocken getupft und mit frisch filtierter 2%iger Phosphorwolframsäure (pH 6,8) gefärbt. Die Gitter wurden bei einer Beschleunigungsspannung von 100 KV in einem JEOL-Transmissionselektronen mikroskop Modell 1005 untersucht und mit 15–25.000-facher Nennvergrößerung fotografiert.
Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (ELISA)
HPV-11-L1-VLPs (0,5–1,0 mg/ml L1) in PBS-0,3 M NaCl wurden entweder ohne Behandlung bei 4°C gelagert oder nach Hinzufügen von βME (bis zu einer endgültigen Konzentration von 5%) oder von 2,0 M Carbonatpuffer, pH 9,6 (bis zu einer endgültigen Konzentration von 200 mM Carbonat), über Nacht bei 4°C inkubiert. Ein Teil der behandelten Proben wurde dann bei 4°C für > 24 Stunden gegen 4 × IL PBS-0,5 M NaCl dialysiert. Alle Proben wurden bis zu einer Konzentration von 0,8 μg L1/ml verdünnt und in den Mulden von Mikrotiterplatten verteilt (80 ng L1 pro Mulde). Unbehandelte VLPs und dialysiertes Material wurden in PBS verdünnt. Die Probe, die ohne nachfolgende Dialyse mit βME behandelt wurde, wurde in PBS, das 5% βME enthielt, verdünnt, und die in 200 mM Carbonat inkubierte, nicht dialysierte Probe wurde in 200 mM Carbonat, pH 9,6, verdünnt. Im Anschluss an eine einstündige Inkubation bei 37°C wurden die Platten mit PBS, 0,1%igem Tween –20 (PBS-Tw) gewaschen und mit Protein aus 5%iger fettfreier Milch in PBS blockiert. Monoklonale Antikörper (AU1 oder H11.F1 und H11.A3, die aus Ascites, die von der Pennsylvania State University erworben wurden, herausgesäubert wurden (Christensen et al, J. Virol., 64:5678–5681 (1990)), wurden in 1%iger fettfreier Milch in PBS verdünnt und in die Mulden hinzugefügt. Nach einer zweistündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten mit PBS-TW gewaschen, und HRP-markiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG wurde hinzugefügt. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Platten wie oben gewaschen und mit HRP-Substrat (Kirkegaard and Perry Laboratories) entwickelt. Bei 405 nm wurden optische Dichtemessungen am 15-Minuten-Endpunkt durchgeführt. Die Mittelwerte von doppelten Mulden wurden als die endgültigen optischen Dichtewerte berechnet.
HPV-11-Neutralisationsanalyse
In BALB/c-Mäusen (Fünfergruppen) wurden Antiseren gegen ursprüngliche gereinigte HPV-11-VLPs und HPV-11-VLPs, die durch längeres Ausgesetztsein an ein Sulfhydrylreduktionsmittel zerlegt und dann bei Entfernung des Reduktionsmittels durch. Dialyse wieder zusammengesetzt wurden, erzeugt. Den Mäusen wurde in Woche 0, 4 und 9 subkutan 1 μg VLPs, die in 1 mg/ml Alhydrogel-Adjuvans adsorbiert waren, injiziert, wobei in Woche 13 terminale Blutungen durchgeführt wurden. Um festzustellen, ob die in den Mäusen geschaffenen Antiseren in der Lage waren, den HPV-11-Virus zu neutralisieren, wurde die Fähigkeit der Antiseren getestet, die Expression einer spezifischen gespleißten HPV-11-mRNA in einer menschlichen Zelllinie (HaCaT) zu blockieren.
Von Dr. Norbert Fusenig wurde HaCaT, eine immortalisierte menschliche Keratinozytenzelllinie (Boukamp et al, J. Cell Biol., 106:761–771 (1988)), zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden in 154/HKGS (Cascade Biologics, Inc.), das mit Penicillin (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (100 μg/m1) ergänzt war, in 24-Mulden-Platten bis zur Konfluenz gezüchtet. Ein HPV-11_Hershey-Stammvirus, erworben von Dr. John Kreider (Kreider et al, J. Virol., 61:590–593 (1987)), wurde auf Eis 25 Sekunden lang beschallt, in einem 154/HKGS-Medium verdünnt und bei 37°C eine Stunde lang inkubiert. Das Medium wurde aus den HaCaT-Zellen herausgesaugt, und pro Mulde wurden 0,5 ml verdünntes Virus hinzugefügt. Als Kontrolle erhielt eine Mulde mit Zellen an jeder Platte 0,5 ml Medium ohne Virus. Für eine Antikörper-vermittelte Neutralisation wurden Antiseren in 154/HKGS verdünnt und vor dem Hinzufügen zu den HaCaT-Zellen bei 37°C mit einer festgelegten Menge des HPV-11-Stammvirus in einem Endvolumen von 0,5 ml eine Stunde lang inkubiert. Vier Tage nach der Infektion wurde frisches Medium in jede Mulde mit Zellen hinzugefügt, und am sechsten Tag wurden die Zellen geerntet und eine zelluläre Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines Tri-Reagens (Molecular Research Center, Inc.) vorbereitet. Die endgültigen RNA-Pellets wurden in 20 μl DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert und durch Spektrophotometrie quantitativ bestimmt.
Die Fähigkeit der Antiseren, die Expression einer HPV-11-spezifischen gespleißten mRNA zu blockieren, wurde durch Reverse-Transcriptase-(RT)-PCR bestimmt. Unter Verwendung eines First-Strand-cDNA-Kits (Boehringer Mannheim) wurden RT-Reaktionen durchgeführt, und zwar mit 2 μg Gesamt-RNA als Matrize und Oligo-dT als Primer. Zum Detektieren der HPV-11-E1∧E4-cDNA war eine verschachtelte PCR erforderlich. Die erste Amplifikationsrunde wurde mit 25% der cDNA aus jeder RT-Reaktion und mit 5'-TACAAGACCTTTTGCTGGGCACA-3'' (lokalisiert an den Basen 765–787 in der HPV-11-Genomsequenz) als äußerem Vorwärtsprimer und 5'-AAAGGCAGGAAAATAGCACAC-3' (lokalisiert an den Basen 4088–4110 in der HPV-11-Genomsequenz) als äußerem Reverse-Primer für 30 PCR-Zyklen durchgeführt. Zehn Prozent der PCR-Mischung der ersten Runde wurden für verschachtelte Reaktionen mit 5'-ATATTGTGTGTCCCATCT GCG-3'' (lokalisiert an den Basen 792–812) als verschachteltem Vorwärtsprimer und 5'-CAGCAATTTGTACAGGCACTAC-3' (lokalisiert an den Basen 3877–3898 in der HPV-11-Genomsequenz) als verschachteltem Reverse-Primer für 30 PCR-Zyklen verwendet. Die PCR-Reaktion der ersten Runde und die verschachtelte PCR-Reaktion wurden mit heißen Wachsperlen (1,5 mM) und pH 9,5-Puffer (In Vitrogen), mit 200 μM dNTPs, mit jeweils 125 ng Vorwärts- und Reverse-Primer und mit 2,5 Einheiten von Taq-Polymerase (Perkin-Elmer) in einem Endvolumen von 50 μl aufgestellt. Das Temperaturprofil betrug sowohl für die PCR der ersten Runde als auch für die verschachtelte PCR 80°C/5 Minuten, 95°C/30 Sekunden, 72°C/30 Sekunden, mit einer endgültigen Verlängerung von 10 Minuten bei 72°C.
Als Kontrolle zum Nachweisen, dass die Analyse fähig war, aus HaCaT-Zellen extrahierte mRNA zu detektieren, wurden alle cDNA-Proben in getrennten PCR-Reaktionen mit Primern verwendet, die für gespleißte zelluläre β-Actin-mRNA spezifisch waren, wie obenstehend beschrieben und ausgeführt (Smith et al, J. Invest. Dermatol., 105:1–7) (1995)).
Alle PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese auf einem 2%igen Agarosegel aufgetrennt und durch Ethidiumbromid-Fluoreszenz sichtbar gemacht.
BEISPIEL 1
Quantitative Zerlegung von HPV-11-VLPs
Relativ große Mengen an HPV-11-L1-VLPs wurden als Ausgangsmaterial für die Untersuchung der VLP-Zerlegung und -Wiederzusammensetzung vorbereitet. HPV-11-L1-VLPs wurden durch CsCl und Sucrosegradientenzentrifugation aus rekombinanten Baculovirus-infizierten High-Five^®-Zellen isoliert. Basierend auf einer densitometrischen Analyse einer SDS/PAGE lag die berechnete Reinheit dieser L1-Zubereitungen zwischen 70 und 90% (siehe 1, Bahn 2). Außerdem wanderte bei linearen Sucrosegradienten der Großteil des Proteins wie für eine Mischung aus einzelnen und verklumpten VLPs erwartet (4a), und unter dem Elektronenmikroskop war eine Mischung aus Partikeln von mittlerer und voller Größe (50–55 nm) sichtbar (5a).
Die kovalenten und nicht kovalenten Wechselwirkungen, welche die zusammengefügten L1-VLPs stabilisieren, sind nicht vollständig bekannt, frühere Arbeiten bezüglich Papillomavirus-VLPs und verwandten Polyomavirus-Virionen und -VLPs wiesen jedoch auf die Bedeutung der Ionenstärke, der zweiwertigen Kationen (Brady et al, J. Virol., 23:717–724 (1977); Salunke et al, Biophys. J, 56:887–900 (1987) und der Disulfidbindungen (Sapp et al, J. Gen. Virol., 76:2407–2512 (1995); Volpers et al, Virology, 200:504–512 (1994)) hin. Sapp und Kollegen wiesen durch Immunoblotting insbesondere nach, dass ~50 Prozent des L1-Proteins von HPV-33-VLPs in einem Bereich größerer Oligomere mit einem scheinbaren M_r, der mit den Trimeren von L1 übereinstimmte, Disulfid-gebunden waren und dass milde Reduktionsbedingungen HPV-33-VLPs teilweise bis zur Stufe von Capsomeren zerlegten (Sapp et al, J. Gen. Virol., 76:2407–2412 (1995); Volpers et al, Virol. 200:504–512 (1994)). In unseren Studien wanderte bei Fehlen von Reduktionsmitteln nur ein Teil des HPV-11-L1-Proteins bei einer SDS/PAGE mit einem scheinbaren M_r von 55.000 Da (1, Bahn 1). Ungefähr 40% (der Prozentsatz variierte bei unterschiedlichen VLP-Zubereitungen) des L1- Proteins von HPV-11-VLPs waren zu größeren Oligomeren Disulfid-gebunden (1, Bahn 1), und zwar mit vorhergesagten M_r-Werten von ungefähr 144.000 Da (möglicher-weise L1-Trimer) und 210.000 Da (möglicherweise L1-Tetramer). Die L1-Oligomere wanderten nicht als einzelne Bande und schienen größenmäßig heterogen zu sein. Auch das 200.000 Da-Oligomer wurde von Sapp und Kollegen auf Immunoblots beobachtet (Sapp et al, J. Gen. Virol., 76:2407–2412 (1995); Volpers et al, Virol. 200:504–512 (1994)), und zwar als Teil einer breiten Bande mit höherem Molekulargewicht. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass ein Teil der L1-Proteine in HPV-11-VLPs zu höheren Oligomeren Disulfid-gekoppelt ist. Um die Funktion der Disulfid-Kopplungen und anderer Wechselwirkungen bei der VLP-Stabilität zu untersuchen, wurde eine rasche Screening-Analyse für die VLP-Zerlegung entwickelt. Gereinigte HPV-11-L1-VLPs wurden sowohl vor als auch nach verschiedenen Behandlungen auf 30%ige Sucrosepolster geschichtet und zentrifugiert, und die Verteilung des L1-Proteins am oberen und unteren Ende des 30%igen Polsters wurde durch SDS/PAGE sichtbar gemacht. Es wurde erwartet, dass intakte VLPs durch den 30%igen Sucrosepolster perlen; es wurde erwartet, dass nicht aggregierte Capsomere und das L1-Monomer am oberen Ende des Polsters bleiben. Ein Beispiel für diese Analyse wird in 2 gezeigt. Um die relative Anordnung des L1-Proteins quantitativ zu bestimmen, wurden die Gels digitalisiert, die Gesamtintensität der L1-Banden am oberen und unteren Ende des Polsters wurde bestimmt, und dann wurde der an beiden Positionen vorgefundene Prozentsatz der L1-Färbungsintensität berechnet. Die Resultate einer Reihe solcher Bestimmungen sind in den Tabellen 1 und 2 tabellarisch dargestellt. Wie in 2 gezeigt, sedimentierte das gereinigte VLP-Ausgangsmaterial, wie vorhergesagt, durch die 30%ige Sucrose, wobei am oberen Ende kein L1 sichtbar war. Bei einer Inkubation mit einer hohen Konzentration des Reduktionsmittels β-Mercaptoethanol (βME) wurde das L1-Protein jedoch größtenteils am oberen Ende des 30%igen Sucrosepolsters vorgefunden, was darauf hinweist, dass das Reduktionsmittel die HPV-11-VLPs in kleinere, nicht aggregierte Komponenten zerlegt hatte. Interessanterweise erforderte eine maximale Zerlegung der VLPs typischerweise ein Ausgesetztsein an eine sehr hohe Reduktionsmittelkonzentration (in diesem Fall 5% oder 713 mM βME) für einen relativ langen Zeitraum (~16 Stunden bei 4°C). Niedrigere Reduktionsmittelkonzentrationen oder kürzere Reduktionszeiträume waren bei der VLP-Zerlegung nicht derart verlässlich effektiv. Das Hinzufügen einer geringen Konzentration eines Chelatbildners verstärkte die Zerlegung nicht (2 und Tabelle 1).
Es stellte sich heraus, dass die anderen wichtigen Variablen für eine quantitative Zerlegung von VLPs neben den Reduktoren die Ionenstärke während der Zerlegungsreaktion und die Löslichkeit des VLP-Ausgangsmaterials waren. Wie zuvor bei Polyomavirus- Virionen beobachtet wurde, destabilisieren Bedingungen einer niedrigeren Ionenstärke die VLPs (Brady et al, J. Virol., 23:717–724 (1977)), obwohl Sapp et al (J. Gen. Virol., 76:2407–2412 (1996)) berichteten, dass die Erzeugung von HPV-33-Capsomeren aus VLPs gegenüber einer Salzkonzentration, die zwischen 0,15 M und 0,6 M NaCl lag, unempfindlich war. Bei HPV-11-VLPs wurde die maximale Zerlegung (~90%) der VLPs, die 16 Stunden lang 5%igem βME ausgesetzt wurden, bei einer „physiologischen" Ionenstärke (d.h. 0,15 M NaCl) beobachtet, sie wurde jedoch bei einer Erhöhung der Ionenstärke dementsprechend weniger effektiv (Tabelle 1). Die stabilisierende Wirkung einer erhöhten Ionenstärke konnte durch eine Inkubation der VLPs mit Reduktionsmitteln für längere Zeiträume oder bei erhöhten Temperaturen teilweise überwunden werden. Obwohl eine Inkubation der VLPs mit 5%igem βME für 120 Stunden bei 4°C oder für 24 Stunden bei 24°C das Ausmaß der Zerlegung bei 0,5 M NaCl auf 60–70% erhöhte, war die Zerlegung jedoch nach wie vor bei weitem nicht vollständig (Daten werden nicht gezeigt). Weiters war bei einer quantitativen Zerlegung auch der Grad der Aggregation des VLP-Ausgangsmaterials wichtig. Bei den Versuchen, über die hier berichtet wird, wurden die VLP-Lösungen in Puffer verschiedener Ionenstärke dialysiert und bei 4°C bis zur Verwendung in Zerlegungsversuchen gelagert. Nach mehreren Tagen, insbesondere bei 0,15 M NaCl, wurden die Lösungen leicht trüb, was auf einen gewissen Aggregationsgrad hindeutete (obwohl wenig oder kein Präzipitat beobachtet wurde). Die Behandlung der trüben VLP-Lösungen mit Reduktionsmitteln erbrachte nicht denselben Zerlegungsgrad, der bei der anfänglichen löslichen VLP-Lösung beobachtet wurde, was darauf hinweist, dass die aggregierten VLPs gegenüber einer Zerlegung resistent waren. Beim Entfernen des aggregierten Materials (das abhängig vom Alter der Zubereitung 10 bis 50% der gesamten VLPs ausmachte) durch Filtration konnten die restlichen löslichen VLPs jedoch wieder in demselben Ausmaß zerlegt werden wie das anfängliche lösliche VLP-Ausgangsmaterial.
Interessanterweise beeinflusste eine Chelatierung von Kationen die VLP-Zerlegung sogar bei hohen Konzentrationen von Chelatoren nicht maßgeblich. Eine Dialyse der VLPs in 200 mM EDTA- oder EGTA-Puffer (PBS-0,3 M NaCl, pH 7,4) führte zu keiner offensichtlichen Zerlegung, und das Hinzufügen von 10 mM Dithiothreitol (DTT) zu den Dialysepuffern hatte einen geringen Effekt (Tabelle 2). Das Unvermögen hoher Konzentrationen von Chelatoren, VLPs zu zerlegen, wurde durch eine elektronenmikroskopische Analyse bestätigt, obwohl es schien, dass EDTA (aber nicht EGTA) die VLPs leicht aufquellen ließ (Daten werden nicht gezeigt). Entweder reichen die Chelatorkonzentrationen nicht aus, um dicht gebundene, strukturell bedeutende Ionen zu extrahieren, oder Kationen sind für das Bewahren der strukturellen VLP-Integrität nicht wesentlich. Umgekehrt bewirkte das Hinzufügen eines konzentrierten Aliquots eines NaHCO₃-Puffers (pH 9,6) zu einer Lösung von VLPs, bis eine endgültige Konzentration von 200 mM Carbonat (in PBS-0,3 M NaCl) erreicht war, einen erheblichen Zerfall der VLPs (Tabelle 2). Das Hinzufügen von DTT (bis zu einer endgültigen Konzentration von 10 mM) verstärkte den Carbonat-induzierten Zerfall nicht weiter. Eine Inkubation von VLPs mit 200 mM Carbonat/10 mM DTT wird allgemein eingesetzt, um HPV-Virionen oder -VLPs in ELISAs zu denaturieren (Favre et al, J. Virol., 15:1239–1237 (1975); Christensen et al, J. Virol., 64:3151–3156 (1990); Christensen et al, J. Gen. Virol., 75:2271–2276 (1994)). Die Wirkung des Carbonats scheint Puffer-spezifisch und nicht bloß eine Funktion des pH-Werts zu sein, da eine Inkubation von HPV-11-VLPs mit pH 9,6-Glycinpuffer (endgültige Konzentration von 200 mM) einen sehr geringen VLP-Zerfall bewirkte, wie durch die 30%-Sucrosepolsteranalyse gemessen wurde (Tabelle 2). Brady et al (J. Virol., 23:717–724 (1977)) beobachteten ebenso, dass ein Carbonatpuffer bei einem alkalischen pH-Wert, aber nicht allein bei einem alkalischen pH-Wert, Polyomavirus-Virionen dissoziierte. Die spezifische Wirkung des Carbonats bei einem pH-Wert von 9,6 scheint jedoch nicht an der potentiellen Fähigkeit des Carbonats zur Chelatbildung zu liegen, wie von Brady et al (J. Virol., 23:717–724 (1977)) behauptet, da 200 mM EDTA bei einem pH-Wert von 9,6 (+/– 10 mM DTT) bei der VLP-Zerlegung völlig ineffektiv waren (Daten werden nicht gezeigt).
BEISPIEL 2
Charakterisierung zerlegter HPV-11-VLPs
Nach einem langfristigen Ausgesetztsein an hohe Reduktionsmittelkonzentrationen scheinen die gereinigten VLPs bis zur Stufe von Capsomeren zerfallen zu sein. Wie in 3a gezeigt, wanderten die zerlegten VLPs, die durch eine 16-stündige Inkubation mit 5%igem βME bei 4°C erzeugt wurden, auf 5–20%igen linearen Sucrosegradienten mit einem durchschnittlichen Sedimentationskoeffizienten von 11,3 ± 1,5 S (n = 5), der im Verhältnis zu den Sedimentationsstandards bestimmt wurde. Gelegentlich wurden größere Spezien mit einem berechneten Sedimentationskoeffizienten von 16–18 S (möglicherweise dimere Capsomere) und sogar pelletierte Materialien beobachtet. Weniger als 10% des L1 wurde jedoch am oberen Ende des Gradienten (die erwartete Position für das L1-Monomer) oder im Pellet (die erwartete Position für intakte VLPs oder aggregierte Capsomere) detektiert, was darauf hinweist, dass das gereinigte VLP-Ausgangsmaterial bei einer längeren Reduktion größtenteils bis zur Stufe von einzelnen Capsomeren zerlegt wurde. Diese Schlussfolgerung wird durch eine elektronenmikroskopische Analyse der VLPs im Anschluss an eine längere Inkubation mit 5%igem βME bestätigt, welche ein Feld von homogenen Capsomeren (5b) mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 9,7 ± 1,2 nm (n = 15) darstellte, wobei gelegentlich einige größere aggregierte Strukturen sichtbar waren (monomeres L1 würde mit dieser Technik nicht detektiert werden). Der geschätzte Capsomer-Durchmesser ist etwas kleiner als jener, der mittels Kryoelektronenmikroskopie zu beobachten ist (11–12 nm) (Baker et al, Biophys. J., 60:1445–1456 (1991); Hagensee et al, J. Virol., 68:4503–4505 (1994) ; Belnap et al, J. Mol. Biol., 259:249–263 (1996)), möglicherweise aufgrund der Schrumpfung während der Vorbereitung des Elektronenmikroskopgitters. Die in den 3a und 5b gezeigten Daten weisen darauf hin, dass ein längeres Ausgesetztsein an hohe Konzentrationen von Reduktionsmitteln die gereinigten löslichen VLPs quantitativ in eine homogene Population von Capsomeren zerlegt.
Capsomere, die nach einem langfristigen Ausgesetztsein an hohe Reduktionsmittelkonzentrationen aus HPV-11-VLPs erzeugt wurden, enthalten strukturelle Epitope, die auf intakten VLPs zu finden sind. Ein Panel von HPV-11-spezifischen monoklonalen Antikörpern wurde beschrieben, welche mit intakten HPV-11-L1-VLPs, aber nicht mit „denaturiertem" L1 reagieren. Diese Monoklonalen umfassen H11.F1, das nachweislich ein dominantes neutralisierendes Epitop an HPV-11-Virionen erkennt, und H11.A3, einen individuellen, nicht neutralisierenden stukturabhängigen Antikörper (Christensen und Kreider, J. Virol., 64:3151–3156 (1990); Christensen et al, J. Virol., 64:5678–5681 (1990)). Erwartungsgemäß reagierten H11.F1 und H11.A3, wenn sie durch einen ELISA analysiert wurden, stark mit dem gereinigten HPV-11-VLP-Ausgangsmaterial (6a). Diese Antikörper reagierten allerdings auch mit Capsomeren, die durch Ausgesetztsein an ein Reduktionsmittel aus dem VLP-Ausgangsmaterial erzeugt wurden (6b). Somit besitzen Capsomere zumindest einige der an der Oberfläche von intakten VLPs und authentischen Virionen vorgefundenen, strukturabhängigen Epitope, in Übereinstimmung mit Untersuchungen, die von Li et al (J. Virol., 71:2988–2995 (1997)) an in E. coli exprimierten HPV-11-Capsomeren durchgeführt wurden. Diese Ergebnisse zeigen weiters, dass die monoklonalen Antikörper H11.F1 und H11.A3, obgleich sie für die Bindung eine „nativ-ähnliche" Konformation erfordern, nicht VLP-abhängig sind, wie zuvor beschrieben wurde (Ludmerer et al, J. Virol., 71:3834–3839 (1997)).
Im Gegensatz dazu erkennen die monoklonalen Antikörper H11.F1 und H11.A3 keine HPV-11-VLPs, die durch Behandlung mit einem Carbonatpuffer bei einem pH-Wert von 9,6 dissoziiert wurden (Daten werden nicht gezeigt; Christensen et al, J. Gen. Virol., 75:2271–2275 (1994)). Die Carbonatbehandlung führte nicht zu einer homogenen Lösung von Capsomeren, sondern stattdessen zeigte sich bei einer Untersuchung mit dem Elektronenmikroskop eine unklare Mischung von kleinen Objekten, die teilweise aggregiert waren (Daten werden nicht gezeigt). Diese Ansicht wurde durch eine Analyse der Carbonatbehandelten VLPs auf 5–20%igen linearen Sucrosegradienten teilweise bestätigt, wobei das L1-Protein größtenteils bei ~4 S wanderte, obwohl eine kleine Population bei 9–11 S beobachtet wurde (3b), was mit den Auswirkungen eines Carbonatpuffers (bei pH 10,6, mit 10 mM DTT) auf BPV-Virionen übereinstimmte (Favre et al, J. Virol., 15:1239–1247 (1975)). Während eine Behandlung mit einem Glycinpuffer bei einem pH-Wert von 9,6 die VLPs nicht in kleinere individuelle Partikel dissoziierte (Tabelle 2), hatte dies doch eine gewisse Wirkung. Mit pH 9,6-Glycin behandelte VLPs erschienen unter dem Elektronenmikroskop als schlecht definierte Mischung aus intakten und teilweise zerfallenen und aggregierten VLPs (Daten werden nicht gezeigt).
BEISPIEL 3
Quantitative Wiederzusammensetzung von HPV-11-VLPs
Eine VLP-Wiederzusammensetzung aus HPV-11-Capsomeren erfolgte bei der Entfernung des Reduktionsmittels, entweder durch Dialyse oder durch Säulenchromatographie. Ausgehend von einer homogenen Zubereitung von löslichen Capsomeren erbrachte eine längere Dialyse bei Fehlen von Reduktionsmitteln beständig eine definierte Population von wieder zusammengesetzten VLPs (4c und 5c, d). Die wieder zusammengesetzten VLPs bewahrten die durch die monoklonalen Antikörper H11.F1 und H11.A3 erkannten, strukturellen Epitope (6c).
Für die Wiederzusammensetzung wurden Capsomere (1–5 ml bei 0,5–1,0 mg/ml Gesamtprotein) bei 4°C für > 24 Stunden gegen 4 × 1 l PBS-0,5M NaCl dialysiert; die erhöhte Salzkonzentration war zum Stabilisieren der VLPs vorgesehen. Während das Hinzufügen von Chelatbildnern die Fähigkeit der Reduktionsmittel, VLPs zu zerlegen, nicht nennenswert verbesserte (Tabelle 1), hatte das Vorhandensein von 2 mM EDTA einen mäßigen Einfluss auf die Wiederzusammensetzung, wodurch VLPs hervorgebracht wurden, die auf einem 10–65%igen linearen Sucrosegradienten als ziemlich eigenständige Population von 150 S-Partikeln wanderten, unter dem Elektronenmikroskop jedoch abgeflacht und teilweise geöffnet erschienen (Daten werden nicht gezeigt). Umgekehrt bewirkte das Hinzufügen von 2 mM Ca²⁺ während der Wiederzusammensetzungsreaktion ein Aneinanderhaften der VLPs, wie durch eine 10–65%ige lineare Sucrosegradientenanalyse gezeigt wurde, bei der VLPs, die in Gegenwart von Kalzium wieder zusammengesetzt wurden, vollständig im Pellet wanderten. Das Vorhandensein von Ca²⁺ schien jedoch ansonsten die grundlegende VLP-Morphologie nicht zu beeinflussen, wenn diese unter dem Elektronenmikroskop untersucht wurde (Daten werden nicht gezeigt). Schließlich führte eine Dialyse von Carbonat-behandelten VLPs in PBS-0,5 M NaCl nicht zu einem Wiederzusammensetzen der VLPs. Stattdessen blieb das L1-Protein entweder als kleine lösliche Komponenten oder als amorphes aggregiertes Präzipitat zurück, wie sowohl durch Elektronenmikroskopie als auch durch eine 10–65%ige lineare Sucrosegradientenanalyse bewiesen wurde (Daten werden nicht gezeigt). Die Dialyse von Carbonat-behandelten VLPs stellte die Reaktionsfähigkeit mit den strukurspezifischen monoklonalen Antikörpern H11.F1 und H11.A3 nicht wieder her (6d).
Charakterisierung von wieder zusammengesetzten HPV-11-VLPs
Nach der Entfernung des Reduktionsmittels setzten sich die Capsomere quantitativ wieder zu VLPs zuammen. Überraschenderweise waren die wieder zusammengesetzten VLPs hinsichtlich der Partikelgröße viel homogener als das mit einem Cäsium- und Sucrosegradienten gereinigte VLP-Ausgangsmaterial. Bei einem Vergleich der drei Stufen der Zerlegungs/Wiederzusammsetzungsreaktion durch 10–65%ige lineare Sucrosegradienten war das gereinigte VLP-Ausgangsmaterial über den Gradienten verteilt, wobei viele Partikel zu der für intakte VLPs erwarteten Position wanderten (150–160 S), der Großteil des Proteins jedoch weiter unten am Gradienten und im Pellet wanderte (4a). Bei einer Untersuchung unter dem Elektronenmikroskop (5a) war ebenso zu sehen, dass das VLP-Ausgangsmaterial eine Mischung von Partikeln unterschiedlicher Größe, einschließlich der vollen Größe, d.h. von VLPs mit einem Durchmesser von 50–55 nm, war. Es ist möglich, dass es während der Extraktion und der Reinigung zu einer gewissen Zerstörung der VLPs kam, da eine lineare Sucrosegradientenanalyse der früheren Stadien des Reinigungsprozesses eine homogenere Verteilung der Partikelgrößen zeigte (Daten werden nicht gezeigt).
Bei einem langfristigen Ausgesetztsein an hohe Konzentrationen von Reduktionsmitteln wurden die VLPs, wie obenstehend beschrieben, in Capsomere zerlegt. Im Vergleich zum VLP-Ausgangsmaterial wanderten die Capsomere am oberen Ende der 10–65%igen linearen Sucrosegradienten (wobei im Pellet wenig oder kein L1 nachgewiesen wurde; 4b) und erschienen unter dem Elektronenmikroskop als ununterbrochenes Feld von Capsomeren (5b).
Das Wiederzusammensetzen der Capsomere ergab eine homogene Population von kugelförmigen VLPs voller Größe. Die wieder zusammengesetzten VLPs bildeten in der Mitte der 10–65%igen linearen Sucrosegradienten eine Bande, und zwar mit einem vorhergesagten Sedimentationskoeffizienten von 150,4 ± 4,6 S (n = 7), wobei entweder im Pellet oder am unteren Ende des Gradienten viel weniger L1 nachgewiesen wurde als beim gereinigten VLP-Ausgangsmaterial zu beobachten war (4c). Die Homogenität der wieder zuammengesetzten VLPs war bei einer Untersuchung unter dem Elektronen mikroskop sogar noch auffallender, wie in 5c, d gezeigt wird. Vorwiegend wurden Partikel im Bereich der VLPs voller Größe, d.h. von durchschnittlich 56,5 ± 7,0 nm (n = 15), nachgewiesen, wobei sehr wenige teilweise zusammengefügte VLPs oder kleinere Komplexe sichtbar waren. Die Ausbeuten des Prozesses der Wiederzusammensetzung waren ebenfalls beeindruckend (durchschnittlich 83% bezüglich des L1-Gesamtproteins aus Ausgangsmaterial gegenüber wieder zusammengesetzten VLPs unter optimalen Zerlegungsbedingungen), da im Wesentlichen alle Capsomere lösliche filtrierbare VLPs voller Größe neu zu bilden schienen.
BEISPIEL 4
Vergleich der Fähigkeit gereinigter Anfangs-HPV-11-VLPs und wieder zusammengesetzter HPV-11-VLPs, virusneutralisierende Antikörper zu erzeugen
Damit die wieder zusammengesetzten VLPs erfolgreich als Impfstoffkandidaten wirken können, ist es wesentlich, dass sie die Fähigkeit, virusneutralisierende Antikörper hervorzurufen, bewahren, wenn sie Versuchstieren injiziert werden. Um dies zu testen, wurden in BALB/c-Mäusen polyklonale Antiseren sowohl gegen die gereinigten Anfangs-HPV-11-VLPs als auch gegen zerlegte/wieder zusammengesetzte HPV-11-VLPs erzeugt, wie im Abschnitt „Verfahren" beschrieben. Jedes Antiserum war gegenüber dem entsprechenden Immunogen gleichermaßen reaktiv, wenn es in einem ELISA-Format analysiert wurde (Daten werden nicht gezeigt). Noch wichtiger ist, dass die nach der Immunisierung wieder zusammengesetzten, HPV-11-VLP-spezifischen polyklonalen Antiseren, wenn sie in der RT-PCR-Neutralisationsanalyse unter Einbeziehung infektiöser HPV-11-Virionen untersucht wurden (Smith et al, J. Invest. Dermatol., 105:1–7 (1995)), einen Neutralisationstiter von 10^–5–10^–6 aufwiesen, der jenem entspricht, welcher mit den gegen die gereinigten Anfangs-HPV-11-VLPs erzeugten Antiseren erhalten wurde (7). Dies beweist, dass die wieder zusammengesetzten HPV-11-VLPs die hoch immunisierende, Capsid-neutralisierende, antigenische Domäne der HPV-11-Virionen bewahren und das Potential haben, als Impfstoffe zur Verhinderung einer genitalen HPV-Erkrankung zu dienen. Angesichts der Tatsache, dass die wieder zusammengesetzten VLPs eine homogene Zubereitung von VLPs voller Größe (d.h. der Größe des infektiösen Virus) darstellen, ist es weiters möglich, dass die wieder zusammengesetzten VLPs stärkere Immunogene als die gereinigten Anfangs-VLPs sind, die größenmäßig heterogen sind, welche Möglichkeit derzeit untersucht wird, indem Mäusen abnehmende Dosierungen von Anfangs-VLPs und wieder zusammengesetzten VLPs verabreicht werden.
BEISPIEL 5
Anwendung einer VLP-Zerlegung und -Wiederzusammensetzung während der Reinigung von HPV VLPs
Wie obenstehend besprochen wurde, werden herkömmliche Proteinreinigungsverfahren nicht für die Verwendung mit Proteinkomplexen, die so groß wie VLPs sind (Partikel von 20.000.000 Da mit einem Durchmesser von 55 nm), optimiert. Besonders die bloße Größe der VLPs reduziert in drastischer Weise die Leistungsfähigkeit und Nützlichkeit der meisten chromatographischen Harze, da viel von der Reaktionschemie am Harz für das VLP sterisch unerreichbar ist. Diese Schwierigkeit kann jedoch möglicherweise vermieden werden, indem aus Zellen extrahierte, rohe VLPs zerlegt, die zerlegten VLPs unter Anwendung von Standardverfahren gereinigt und die VLPs beim gewünschten Reinheitsgrad wieder zusammengesetzt werden. Eine zweite Sorge bei der VLP-Reinigung ist die Kontaminierung mit Rest-DNA. Bei früheren, mit gereinigten HPV-11-VLPs durchgeführten Arbeiten bleibt ein bestimmter Pegel an Hintergrund-DNA bestehen, der nicht durch Behandlung mit DNAse entfernt wird, was darauf hinweist, dass die DNA entweder in den VLPs eingekapselt oder sehr eng mit diesen verbunden ist. Die Zerlegung der VLPs sollte eine vermehrte Entfernung von kontaminierender DNA ermöglichen, was bei jeder biologischen Verbindung, die für die klinische Verwendung bestimmt ist, ein wichtiger Gesichtspunkt ist.
Um dieses Potential zu testen, wurden HPV-16_Tr-VLPs aus Baculovirus-infizierten Insektenzellen extrahiert und durch eine herkömmliche IEC- und HIC-Chromatographie gereinigt, wie im Abschnitt „Verfahren" beschrieben, und zwar entweder bei Fehlen eines Sulfhydrylreduktionsmittels (intakte VLPs) oder bei Vorhandensein von 4%igem βME (zerlegte VLPs). Im letzteren Fall wurden die extrahierten VLPs vor der Chromatographie an IEC- und HIC-Säulen, die ebenfalls in βME äquilibriert wurden, bei 4°C für >2 Stunden mit 4%igem βME inkubiert. Die gereinigten Endprodukte beider Reinigungsverfahren (d.h. bei Vorhandensein oder Fehlen eines Sulfhydrylreduktionsmittels) wurden gegen 4 × 1 l PBS (0,5 M NaCl) dialysiert, und die Reinheit, die Ausbeute und die Rest-DNA-Pegel wurden bestimmt. Wie in Tabelle 3 gezeigt, führte eine repräsentative Zubereitung, die bei Fehlen von βME gereinigt wurde, zu HPV-16_Tr-VLPs, welche nur zu etwa 60% rein waren (hinsichtlich der Proteinkontamination) und DNA-Pegel enthielten, die höher waren als für die menschliche Verwendung erwünscht. Umgekehrt waren drei Zubereitungen von VLPs, die im zerlegten Zustand gereinigt wurden, durch größere Ausbeuten, eine wesentlich höhere Proteinreinheit und stark reduzierte Rest-DNA-Pegel gekennzeichnet. Die größere Proteinreinheit von VLPs, die im zerlegten Zustand gereinigt wurden, ist leicht erkennbar, wenn diese durch eine SDS/PAGE analysiert werden, wie in 8 dargestellt. Die Größe und die Homogenität der wieder zusammengesetzten HPV-16_Tr-VLPs waren nach der Reinigung heterogener als jene, die bei der Wiederzusammensetzung von gereinigten HPV-11-VLPs beobachtet wurden, im Durchschnitt waren sie jedoch so homogen wie bei HPV-16_Tr-VLPs, die ohne Zerlegung gereinigt wurden, und bildeten in manchen Fällen gleichmäßig homogene VLPs voller Größe, was wir bei HPV-16_Tr-VLPs, die ohne Zerlegung gereinigt wurden, niemals beobachteten (Daten werden nicht gezeigt).
Hinsichtlich der Auswirkungen einer längeren Behandlung mit Sulfhydrylreduktionsmitteln existieren interessante Unterschiede zwischen gereinigten HPV-16_Tr- und HPV-11-VLPs. Zuerst scheinen HPV-16_Tr-VLPs bei geringeren Reduktionsmittelpegeln und/oder kürzeren Expositionszeiträumen quantitativ zu zerfallen (Daten werden nicht gezeigt). Es ist nicht offensichtlich, ob dies einen echten Unterschied zwischen HPV-16- und HPV-11-VLPs widerspiegelt, oder ob dies an der C-terminalen Kürzung des HPV-16_Tr-L1-Proteins liegt, da wir in Vorversuchen beobachteten, dass ein proteolytisches Zurechtschneiden des C-Terminus des HPV-11-L1-Proteins auch den Zerfall der VLPs in Gegenwart eines Sulfhydrylreduktionsmittels beschleunigt. Ein interessanteres Merkmal besteht darin, dass eine Behandlung der gereinigten HPV-16_Tr-VLPs mit einem Sulfhydrylreduktionsmittel eine Mischung aus Capsomeren, kleineren Oligomeren des L1-Proteins und einem L1-Monomer hervorzubringen scheint, und zwar auf Basis einer linearen 5–20%igen Sucrosegradientenanalyse der zerlegten HPV-16_Tr-VLPs (9). Bei einer Entfernung des Reduktionsmittels durch Dialyse kann diese Mischung von kleinen löslichen Komponenten sich jedoch wieder zu intakten VLPs zusammensetzen, und zwar mit einer Ausbeute von ~90%, wie durch eine lineare 10–65%ige Sucrosegradientenanalyse nachgewiesen (10) und durch eine elektronenmikroskopische Analyse bestätigt wird (Daten werden nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass VLPs bis zur Stufe von Capsomeren oder sogar noch kleineren L1-Oligomeren zerlegt werden können und immer noch fähig sind, sich wieder zu intakten VLPs voller Größe zusammenzusetzen, solange die Zerlegungsbedingungen lösliche, korrekt gefaltete L1-Proteine hervorbringen.
TABELLE 1 Zerlegung von HPV-11-L1-VLPs; Wirkungen von Reduktionsmitteln^a

^aVLPs (0,5–1,0 mg/ml Protein) wurden, wie angegeben, bei 4°C behandelt, und die Verteilung von L1 über einen 30%igen Sucrosepolster wurde bestimmt, wie im Abschnitt „Verfahren" beschrieben. Die Mittelwerte von mehrfachen Bestimmungen (n = 3–7) ± Standardabweichung werden gezeigt.

TABELLE 2 Zerlegung von HPV-11-L1-VLPs; Wirkungen von Chelatoren und Puffern^a

^aVLPs (0,5–1,0 mg/ml Protein) wurden, wie angegeben, 16 Stunden lang bei 4°C behandelt, und die Verteilung von L1 über einen 30%igen Sucrosepolster wurde bestimmt, wie im Abschnitt „Verfahren" beschrieben. Die Mittelwerte von Kontrollbestimmungen ± Variationsbreite werden gezeigt.

TABELLE 3 Vergleich der Reinigung von intakten und zerlegten HPV-16_Tr-VLPs^a

^aEine Reinigung intakter VLPs (–βME) und drei Reinigungen zerlegter VLPs (+βME, Durchgänge 1–3) werden verglichen und wurden wie im Abschnitt „Verfahren" beschrieben vorbereitet. Der Maßstab gibt die Gramm der verwendeten Zellpaste an, die Reinheit wurde durch die densitometrische Analyse einer SDS/PAGE des Endprodukts bestimmt, und zwar verglichen mit der Menge, die in der anfänglichen Zellpaste vorhanden war, und die DNA wurde durch die Schwellenmethode bestimmt und wird pro 100 μg L1-Protein, der erwarteten maximalen Einzeldosierung beim Menschen, angegeben.

SCHLUSSFOLGERUNGEN
Die vorliegende Erfindung schafft somit genaue Bedingungen für das quantitative, in vitro erfolgende Zerlegen und anschließende Wiederzusammensetzen von Papillomavirus-VLPs. Wie besprochen, wurden frühere Versuche hinsichtlich einer Papilloma-VLP-Zerlegung in einem gewissen Maß von Arbeiten beeinflusst, die am Polyomavirus, einem verwandten Papovavirus, durchgeführt wurden, wobei sich zeigte, dass sowohl die Reduktion von Disulfiden als auch die Chelatierung von Kalziumionen für die Virionenzerlegung wesentlich waren (Brady et al, J. Virol., (1977)). Es wurde jedoch überraschenderweise festgestellt, dass die geringen Reduktionsmittelpegel (1–10 mM DTT), die für eine Polyomaviruszerlegung optimal waren, in Gegenwart geringer Pegel von Chelatbildnern (z.B. 0,5–10 mM EDTA) beim Zerlegen von Papilloma-VLPs nur wenig effektiv waren (Tabelle 1, Li et al (Id.) (1997)), obwohl teilweise trypsinierte HPV-11-L1-VLPs durch die obenstehenden Bedingungen dissoziiert wurden (Li et al, (Id.) (1997)). Sapp und Kollegen bewiesen jedoch, dass Capsomere allein durch Behandlung mit einem Reduktionsmittel (20 mM DTT) aus HPV-33-VLPs hergestellt werden konnten, obwohl das Ausmaß des VLP-Zerfalls nicht bestimmt wurde (Sapp et al, (Id.) (1995)). Bei den zuvor besprochenen Versuchen wurde festgestellt, dass es beim Untersuchen der Zerlegung mittels Gradienten analyse erforderlich war, eine Untersuchung hinsichtlich des Vorhandenseins von L1-Protein im „Pellet" anzustellen. Eine Untersuchung der Fraktionen quer durch den Gradienten zeigte in vielen Fällen, dass ein guter Zerfall erzielt wurde. Eine Untersuchung des Pellets, obwohl keines sichtbar war, zeigte jedoch, dass ein großer Prozentsatz des Proteins nach wie vor in Form von VLPs variabler Größe oder in anderweitig aggregierter Form vorlag, wie durch eine elektronenmikroskopische Analyse bestätigt wurde. Die Entwicklung der 30%-Sucrosepolsteranalyse ermöglichte uns, eine Reihe von Zerlegungsbedingungen rasch zu screenen und jene zu identifizieren, welche die VLPs beständig in kleinere lösliche Komponenten zerlegten. Es wurde festgestellt, dass eine quantitative Zerlegung zu einer homogenen Lösung von einzelnen Capsomeren (für HPV-11-VLPs) oder einer Mischung aus Capsomeren und korrekt gefalteten kleineren L1-Oligomeren und L1-Monomeren (HPV-16_Tr-VLPs) durch eine ausgedehnte Behandlung von nicht aggregierten VLPs mit hohen Reduktionsmittelpegeln in Puffern von mäßiger bis geringer Ionenstärke beständig erzielt werden konnte.
Wie besprochen, war die Beobachtung, dass die Chelatierung von Kationen die HVP-11-VLP-Zerlegung nicht wesentlich beeinflusste, überraschend, da dies einen Kontrast zu früheren Studien am Polyomavirus bildet, welche zeigten, dass eine Kalziumchelatierung die Virionenzerlegung förderte und dass hinzugefügtes Kalzium die Wirkung der Chelatoren überwinden konnte (Brady et al, (Id.) (1977)). Montross et al, (Id.) (1991) beobachteten ebenso, dass Polyomavirus-VLPs, die sich normalerweise nur im Zellkern zusammenfügen, nach dem Hinzufügen eines Kalziumionophors, der vermutlich die zytoplasmatische Kalziumkonzentration auf den notwendigen Pegel erhöhte, im Zytoplasma entstehen konnten. Kalzium ist für die HPV-11-L1-Capsidstabilität jedoch offensichtlich unwichtig. Umgekehrt „zerlegte" eine Behandlung mit Carbonatpuffer bei alkalischem pH-Wert die HPV-11-L1-VLPs, ähnlich den Ergebnissen, die bei Polyomavirus-Virionen zu beobachten sind (Brady et al, (Id.) (1977)). Diese Behandlung scheint jedoch schwer-wiegender zu sein, da die VLPs nach der Carbonatbehandlung nicht durch eine Dialyse in PBS-0,5 M NaCl regeneriert werden konnten.
Die HPV-11-VLP-Zerlegung durch Carbonatbehandlung führte zu einem L1-Protein, das mit strukturabhängigen, HPV-11-spezifischen monoklonalen Antikörpern nicht reagierte. Im Gegensatz dazu führte eine Zerlegung von HPV-11-L1-VLPs durch eine längere Reduktion zu Capsomeren, die strukturspezifische Epitope besaßen, welche an der Oberfläche sowohl von intakten HPV-11-L1-VLPs als auch von HPV-11-Virionen zu finden waren. Diese Ergebnisse untermauern den Gedanken, dass nur ein korrekt gefaltetes L1-Protein die Fähigkeit bewahrt, sich wieder zu VLPs zusammenzusetzen.
Die hier besprochenen Ergebnisse zeigen, dass die strukturelle Integrität, die Löslichkeit und die Homogenität des Ausgangsmaterial maßgeblich sind, um VLPs voller Größe in vitro effizient wieder zusammenzusetzen. Nach der Erzeugung einer solchen Population von Capsomeren (für HPV-11-VLPs) oder einer Mischung aus Capsomeren und korrekt gefalteten kleineren L1-Oligomeren und L1-Monomeren (HPV-16_Tr-VLPs) durch Thiolreduktion erfolgt nach der Entfernung des Reduktionsmittels spontan eine Wiederzusammensetzung. Die Wiederzusammensetzung wurde durch Entfernung des Sulfhydrylreduktionsmittels, entweder durch säulenchromatographische Verfahren oder durch Dialyse gegen einen großen Überschuss an Puffer, erzielt, wodurch sich eine Population von wieder zusammengesetzten VLPs voller Größe ergab, die größenmäßig homogener als das VLP-Ausgangsmaterial waren. In früheren Studien zum Polyomavirus beobachteten Salunke et al, (Id.) (1989), dass eine VLP-Zusammenfügung von Capsomeren abhängig von den Bedingungen der Zusammenfügung (pH-Wert, Ionenstärke und Kalziumkonzentration) mehrere polymorphe ikosaedrische Zusammenfügungen hervorbrachte. Interessanterweise war die am gleichmäßigsten geformte Struktur ein 24-Capsomer-Ikosaeder sowie ein 12-Capsomer-Ikosaeder, zusätzlich zu dem 72-Capsomer-Ikosaeder des Viruscapsids. Die Autoren erwähnten, dass die Bildung einer Disulfidbindung die Polyoma-VLP-Zusammenfügung unterstützen könnte, aber nicht wesentlich war, da sich bei hoher Ionenstärke (2 M Ammoniumsulfat) Capside variabler Größe sogar in Gegenwart von 15 mM βME bildeten. Li et al (Id.) (1997) beobachteten ebenso, dass in E. coli exprimierte, säulengereinigte HPV-11-Capsomere die Fähigkeit haben, in 1 M NaCl capsidähnliche Strukturen zu bilden, und zwar wiederum in Gegenwart von 15 mM βME. Während Bedingungen hoher Ionenstärke offensichtlich ein gewisses Maß an Capsidbildung begünstigen, geht aus unseren Studien jedoch klar hervor, dass Disulfidbindungen bei physiologischer Ionenstärke notwendig sind, um HPV-11- und HPV-16_Tr-L1-VLPs zusammenzuhalten.
Sogar angesichts der Tatsache, dass die Zerlegungsreaktionen typischerweise bei 4°C ohne Rühren erfolgten, ist es interessant, dass die maximale Zerlegung ein längeres Ausgesetztsein an sehr hohe Reduktionsmittelpegel erforderte. Wie wir zuvor besprochen haben, besteht die wahrscheinlichste Erklärung darin, dass die stabilisierenden Disulfidbindungen vergraben und unerreichbar sind und dass ein Ausgesetztsein dieser Bindungen an ein Lösungsmittel durch lokale strukturelle Schwankungen äußerst selten ist.
Die Fähigkeit zur massenhaften Wiederzusammensetzung von VLPs voller Größe eröffnet eine Reihe von Möglichkeiten. Wie in 7 gezeigt, sind wieder zusammengesetzte VLPs in hohen Dosierungen in der Lage, virusneutralisierende Antikörper als gereinigtes VLP-Ausgangsmaterial hervorzurufen. Derzeit untersuchen wir die Wirksamkeit der wieder zusammengesetzten VLPs, um festzustellen, ob sie genauso starke Immunogene wie das gereinigte VLP-Ausgangsmaterial sind, das hinsichtlich der Partikelgröße weniger homogen ist. Während im Kern von Zellen nach einer in vivo-Infektion eine Reihe von Partikeln unterschiedlicher Größe und Form zu beobachten ist (Kiselev et al, J. Mol. Biol., 40:155–171 (1969), sind vermutlich nur Viren voller Größe ergiebig infektiös. Wie besprochen, könnten die gegenständlichen, wieder zusammengesetzten VLPs aufgrund des gegenständlichen Verfahrens, das für gleichmäßigere VLP-Partikel sorgt, möglicherweise eine größere Stabilität aufweisen. Weiters könnte die Wiederzusammensetzungsreaktion, wie obenstehend besprochen, möglicherweise weiter verstärkt werden, indem die Proteinkonzentration, der pH-Wert, die Ionenstärke und die Kinetik verändert werden, um die Wiederzusammensetzung unter einer größeren Bandbreite von Ausgangsbedigungen zu optimieren. Schließlich ermöglicht die gegenständliche Erfindung das Verpacken exogener Verbindungen in VLPs, indem die Wiederzusammensetzungsreaktion in Gegenwart einer konzentrierten Lösung der ausgewählten Verbindung erfolgt. Die gegenständliche Erfindung kann, wie obenstehend besprochen, zum Erzeugen von Pseudovirionen eingesetzt werden, und zwar zur Verwendung als Ersatzpräparate für HPV-Virustypen, die derzeit nicht verfügbar sind, oder als Abgabesystem für Arzneimittel oder andere Verbindungen, auf die abgezielt wird.
Die Erfindung kann in anderen spezifischen Formen verkörpert sein, ohne von ihrem Sinn oder von wesentlichen charakteristischen Eigenschaften abzuweichen. Die beschriebenen Ausführungsformen sind in jeder Hinsicht nur als veranschaulichend und nicht als einschränkend zu betrachten, und der Umfang der Erfindung wird daher eher durch die angeschlossenen Ansprüche und nicht durch die vorhergehende Beschreibung angegeben. Alle Modifikationen, die in die Bedeutung und den Umfang der gesetzlichen Äquivalenz der Ansprüche fallen, sind in diesen Umfang einzubeziehen.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer homogenen, Papillomavirus-virusähnliche Partikel (VLP) enthaltenden Zusammensetzung, welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) das Zerlegen einer virusähnliche Partikel (VLP) enthaltenden Zusammensetzung durch Behandlung dieser virusähnliche Partikel enthaltenden Zusammensetzung mit einer Lösung, die ein Sulfhydrylreduktionsmittel umfasst, um diese VLPs zu zerlegen; und (ii) das Wiederzusammensetzen dieser zerlegten VLPs durch Entfernung oder Oxidation des Sulfhydrylreduktionsmittels, wobei die wieder zusammengesetzten VLPs zum Hervorrufen virusneutralisierender Antikörper in der Lage sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Lösung für die Zerlegung in Schritt (i) eine Ionenstärke aufweist, die 0,50 M nicht überschreitet.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Lösung für die Zerlegung in Schritt (i) eine Ionenstärke aufweist, die 0,15 M nicht überschreitet.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Papillomavirus-VLPs menschliche Papillomavirus-VLPs sind.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die menschlichen Papillomavirus-VLPs ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-41, HPV-42, HPV-43, HPV-44, HPV-45, HPV-52, HPV-54, HPV-55, HPV-56, HPV-70 und Mischungen davon.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das menschliche Papillomavirus-VLP ein HPV-16-VLP ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei es sich bei den menschlichen Papillomavirus-VLPs um eine Mischung von HPV-16 und HPV-18 handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die VLPs L1-Protein oder die C-terminal gekürzte Form des HPV-16-L1-Proteins umfassen.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Kontaktieren mit einer Lösung, die zumindest ein Sulfhydrylreduktionsmittel umfasst, für einen längeren Zeitraum erfolgt, der ausreicht, um zu einer zumindest 70%igen Zerlegung der VLPs in kleinere, L1-Protein enthaltende Moleküle und/oder mutierte und/oder chemisch veränderte Formen des L1-Proteins zu führen.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Papillomavirus-VLPs einen oder mehrere L1-Proteine, mutierte L1-Proteine und chemisch veränderte L1-Proteine sowie L2-Proteine umfassen.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Sulfhydrylreduktionsmittel oxidiert oder durch Dialyse, Diafiltration oder Säulenchromatographie entfernt wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzentration des Reduktionsmittels in Schritt (i) zumindest 1 Gew.% beträgt.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Sulfhydrylreduktionsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glutathion, Dithiothreitol, β-Mercaptoethanol, Dithioerythrit, Cystein, Hydrogensulfid und Mischungen davon.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die kleineren, L1-Protein enthaltenden Komponenten gereinigt werden, wodurch beim Wiederzusammensetzen gereinigte Papillomavirus-virusähnliche Partikel (VLPs) erzeugt werden.
Verfahren gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei die VLPs im zerlegten Zustand gereinigt und bei einem gewünschten Reinheitsgrad wieder zusammen gesetzt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Papillomavirus-VLP HPV-16 ist und im Anschluss an die Herstellung der homogenen HPV-16-VLPs solche VLPs mit HPV-18-VLPs kombiniert werden, um eine Zusammensetzung zu liefern, die HPV-16- und HPV-18-VLPs umfasst.