DE19819476C1

DE19819476C1 - Polypeptid mit immunogenen Eigenschaften und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins

Info

Publication number: DE19819476C1
Application number: DE19819476A
Authority: DE
Inventors: Lutz Gissmann; Ingrid Jochmus
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1998-04-30
Publication date: 2000-01-05
Anticipated expiration: 2018-05-01
Also published as: WO1999055876A2; JP2002512801A; WO1999055876A3; AU4895499A; EP1073751A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid mit immunogenen und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins, wobei das Polypeptid Abschnitte des Proteins von etwa 10-40 Aminosäuren in einer zum Protein veränderten Anordnung aufweist. Ferner betrifft die Erfindung eine ein solches Polypeptid kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Polypeptids. Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der DNA und des Polypeptids zur aktiven Immunisierung sowie gegen das Polypeptid gerichtete Antikörper.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid, das immunogene Eigenschaften und veränderte biologische Funktionen eines Proteins aufweist, eine ein solches Polypeptid kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Polypeptids. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der DNA und des Polypeptids zur aktiven Immunisierung sowie gegen das Polypeptid gerichtete Antikörper.

Bei aktiver Immunisierung eines Tieres bzw. Menschen wird vielfach ein Protein als Immunogen verabreicht, gegen das dann Antikörper bzw. zytotoxische T-Zellen induziert werden. Jüngste Versuche des Anmelders weisen darauf hin, daß ein solches Protein sehr lange im Körper des Tieres bzw. Menschen verweilen kann. Dies gilt insbesondere, wenn das Protein in Form eines es kodierenden Expressionsplasmids verabreicht wird. Somit ist das Tier bzw. der Mensch lange den biologischen Funktionen des Proteins, die z. B. toxisch oder transformierend sein können, ausgesetzt. Dies führt zu erheblichen Belastungen des Tieres bzw. Menschen, deren Folgen überhaupt nicht absehbar sind.

Aus der EP 0 344 940 A2 ist ein Polyeptid mit etwa 5-50 Aminosäuren bekannt, das einen Abschnitt eines latenten Papillom-Virus-Proteins darstellt. Das Polypeptid kann sich in seiner Aminosäuresequenz von jener des entsprechenden Abschnitts des Proteins durch Insertionen, Deletionen und Substitutionen von Aminosäuren unterscheiden.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem eine aktive Immunisierung ohne die vorstehenden Nachteile durchgeführt werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit ein Polypeptid mit immunogenen Eigenschaften und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins und eine für ein solches Polypeptid kodierende DNA. Diese Mittel erlauben eine aktive Immunisierung, ohne daß das Tier bzw. der Mensch zumindest in vollem Umfang den biologischen Funktionen des Proteins ausgesetzt ist.

Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß ein Polypeptid, das Abschnitte eines Proteins von etwa 10-40 Aminosäuren in einer zum Protein veränderten Anordnung aufweist, zwar eine mit dem Protein ver gleichbare Immunogenität besitzt, jedoch Veränderungen in den biologischen Funktionen des Proteins aufweist, wobei diese sogar gänzlich fehlen können. Ferner hat der Anmelder erkannt, daß es für die Immunogenität eines solchen Polypeptids günstig ist, wenn es Teile von etwa 10-20 Aminosäuren enthält, die im Protein als Übergänge zwischen den einzelnen Abschnitten vorliegen. Ein Polypeptid, das Abschnitte des HPV16-E7 Proteins in einer zum E7-Protein ver änderten Anordnung und weitere im E7-Protein als Übergänge zwischen den einzelnen Abschnitten vorliegende Teile enthält, ist in Fig. 1 angegeben.

Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, ein Polypep tid mit immunogenen Eigenschaften und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins bereitzustellen, wobei das Polypeptid Abschnitte des Proteins von etwa 10-40 Aminosäuren in einer zum Protein veränderten Anordnung aufweist.

Der Ausdruck "Protein" umfaßt jegliches Protein, das immunogene Eigenschaf ten, z. B. die Fähigkeit zur Induktion von gegen das Protein gerichteten Antikör pern bzw. zytotoxischen T-Zellen, und biologische Funktionen aufweisen kann. Beispiele eines solchen Proteins sind toxische oder transformierende Proteine. Erstere können bakterielle Toxine oder virale Proteine sein, die bei persistieren den Infektionen exprimiert werden. Ein Beispiel solcher viraler Proteine ist HIV- Tat. Transformierende Proteine können zellulären Ursprungs sein, z. B. ein Mela nom-spezifisches Antigen (MAGE). Ferner können sie von Viren, z. B. humanpa thogenen Papillom-Viren (HPV), wie HPV 16 oder 18, stammen. Als Proteine solcher Viren sind insbesondere die Proteine E6 und E7 zu nennen.

Der Ausdruck "Polypeptid mit immunogenen Eigenschaften und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins" umfaßt jegliches Polypeptid, das eine bis alle immunogenen Eigenschaften eines Proteins aufweisen kann, wobei eine bis alle biologischen Funktionen des Proteins verändert, insbesondere ausge schaltet, sein können. Ein solches Polypeptid weist Abschnitte des Proteins von etwa 10-40 Aminosäuren, insbesondere 20-30 Aminosäuren, in einer zum Protein veränderten Anordnung auf. Günstig kann es sein, wenn sich die Ab schnitte von den entsprechenden Abschnitten im Protein durch eine oder mehre re Aminosäuren unterscheiden. Dies können z. B. Aminosäuren sein, die für die Herstellung des Polypeptids und/oder die Immunogenität der Abschnitte förder lich sind. Ferner kann es günstig sein, wenn das Polypeptid auch Teile von etwa 10-20 Aminosäuren, insbesondere 18-20 Aminosäuren, enthält, die im Protein als Übergänge zwischen den einzelnen Abschnitten vorliegen. Solche Teile können an beliebiger Stelle des Polypeptids, insbesondere am N- und/oder C- Terminus, einzeln oder in einer Gesamtheit vorliegen.

Ein bevorzugtes Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfaßt die in Fig. 1 angegebene Aminosäuresequenz oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz. Ein solches Polypeptid umfaßt Abschnitte des E7-Proteins von HPV 16 in einer zum Protein veränderten Anordnung und Teile des E7-Proteins, die in diesem als Übergänge zwischen den einzelnen Abschnitten vorliegen.

Der Ausdruck "eine durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz" weist darauf hin, daß die dieser Aminosäuresequenz zugrundeliegende DNA-Sequenz mit der DNA von Fig. 1 hybridisiert. Die DNA- Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 1 durch Additionen, Substitutionen, Deletionen und/oder Inversionen von einem oder mehreren Basenpaaren unter scheiden. Der Ausdruck "Hybridisierung" weist darauf hin, daß diese unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA-Sequenz erfolgt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine für ein vorstehendes Polypeptid kodierende Nukleinsäure. Dies kann eine RNA oder eine DNA sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:

a) Die DNA von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, oder
b) eine über den degenerierten Code mit der DNA von (a) verwandte DNA.

Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA" weist darauf hin, daß diese DNA mit der DNA von Fig. 1 hybridisiert. Erstere DNA kann sich von der DNA von Fig. 1 durch Additionen, Substitutionen, Deletionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unter scheiden. Hinsichtlich des Ausdrucks "Hybridisierung" wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen.

Eine erfindungsgemäße DNA kann als solche oder in einem Vektor, insbesondere einem Expressionsvektor, vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E.coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b, Bluscript und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tieri schen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressions vektor pAcSGHisNT-A.

Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine, erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und SG 13009, wobei letzterer bevorzugt ist, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9 oder Hi5.

Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Polypeptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fusionspolypep tids exprimiert werden kann.

Ferner kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungs gemäße DNA exprimierte Polypeptid zu isolieren und zu reinigen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehen des Polypeptid bzw. Fusionspolypeptid gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklona len Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fu sions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklo nalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.

Des weiteren kann eine erfindungsgemäße DNA direkt in Tieren bzw. dem Men schen exprimiert werden. Die erfindungsgemäße DNA kann hierzu in Expres sionsvektoren vorliegen, die von Plasmid- und/oder Virusvektoren abgeleitet sind. Beispiele von Virusvektoren umfassen AAV-, Adenovirus und Vacciniavi rus-Vektoren. Der Fachmann kennt Verfahren, eine erfindungsgemäße DNA in Tiere bzw. den Menschen einzuführen und zu exprimieren.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vakzinierungsmittel, umfassend:

a) Ein erfindungsgemäßes Polypeptid, und/oder
b) eine erfindungsgemäße DNA, sowie
c) übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Lösungsmittel und Träger.

Ein solches Vakzinierungsmittel eignet sich zur aktiven Immunisierung, z. B. gegen HPV. Enthält das Vakzinierungsmittel anstelle von (a) und/oder (b) einen erfindungsgemäßen Antikörper (c), so eignet es sich zur passiven Immunisie rung, z. B. gegen HPV.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, umfassend:

a) Ein erfindungsgemäßes Polypeptid,
b) eine erfindungsgemäße DNA und/oder
c) einen erfindungsgemäßen Antikörper, sowie
d) übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Lösungsmittel, Träger und Kontrollen.

Von den einzelnen Komponenten des Vakzinierungsmittels bzw. des Kits können jeweils ein oder mehrere Vertreter vorliegen.

Die vorliegende Erfindung stellt Polypeptide bereit, die immunogene Eigenschaf ten und veränderte, insbesondere ausgeschaltete, biologische Funktionen eines Proteins aufweisen. Ferner stellt die vorliegende Erfindung DNAs bereit, die für solche Polypeptide kodieren. Mit diesen Mitteln können Tiere bzw. der Mensch aktiv immunisiert werden. Insbesondere kann durch die DNAs eine hohe Effizienz bei der Induktion von gegen das Protein gerichteten Antikörpern und vor allem von zytotoxischen T-Zellen erreicht werden. Ferner zeichnen sich die Mittel da durch aus, daß die immunisierten Tiere bzw. der Mensch nicht den Belastungen ausgesetzt sind, die bei herkömmlichen aktiven Immunisierungen auftreten. Des weiteren werden durch die erfindungsgemäßen Antikörper Mittel bereitgestellt, mit denen die aktive Immunisierung und deren Verlauf überwacht werden können. Gleichzeitig stellen die Antikörper auch Mittel dar, die für eine passive Immunisierung eingesetzt werden können. Somit stellt die vorliegende Erfindung einen großen Beitrag für die Entwicklung moderner Verfahren in der Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen dar.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Fig. 1 zeigt die Basensequenz (b) und die davon abgeleitete Aminosäure sequenz (a) eines erfindungsgemäßen, HPV16-E7 Abschnitte auf weisenden Polypeptids. Die Abschnitte a, b, c und d des natürli chen HPV16-Proteins sind angegeben. Ebenso sind die Übergänge a/b, b/c und c/d angegeben. Unterstrichene Sequenzen stellen zusätzliche Aminosäuren aufgrund der eingeführten Spaltstellen für Restriktionsenzyme dar.

Fig. 2 zeigt die Basensequenz (b) und die davon abgeleitete Aminosäure sequenz (a) des natürlichen HPV16-E7 Proteins. Die Abschnitte a, b, c und d sind angegeben. Diese werden durch abwärts gerichtete Pfeile voneinander getrennt. Ebenso sind die Übergänge a/b, b/c und c/d angegeben. Diese werden durch aufwärts gerichtete Pfeile verdeutlicht.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1: Herstellung einer erfindungsgemäßen DNA

Eine für das E7-Protein (98 Aminosäuren) von HPV 16 kodierende DNA umfaßt die in Fig. 2 angegebenen 297 Basenpaare plus Stopcodon TAA. Diese DNA wurde in vier Teile (a-d) zerlegt: 1-30 (a), 31-120 (b), 121-210 (c) und 211-294 (d; ohne Stopcodon). Zusätzlich wurden die Übergänge a/b (10-60), b/c (100- 144) und c/d (190-231; plus Stopcodon) synthetisiert.

1. Die Fragmente a und d wurden durch PCR zusammengesetzt; 5' zu a wurde eine HindIII Spaltstelle und 3' von d eine EcoRI Spaltstelle (jeweils mit 6 bp Spacer zur besseren Spaltbarkeit) eingesetzt. Im einzelnen wurde wie folgt vorgegangen:
Aus der DNA von Fig. 2 wurde durch die Primer II und III folgende Se quenz hergestellt:
(II/III): 5'-21 → 30/211 → 294/EcoRI - Spacer-3' (106 bp)
Dieses Fragment wurde nach Gelektrophorese isoliert und mit Hilfe der Primer I und III verlängert, so daß die Sequenz (I/II/III)
5'-Spacer - HindIII/1 → 30/211 → 294/EcoRI - Spacer-3' (138 bp)
erhalten wurde.
Primer:
2. Die Fragmente c und b wurden durch PCR zusammengesetzt; 5' zu c wurde eine EcoRI Spaltstelle und 3' zu b wurde eine BamHI Spaltstelle (jeweils mit 6 bp Spacer) eingesetzt. In einzelnen wurde wie folgt vor gegangen:
Aus der DNA von Fig. 2 wurden durch die Primerpaare IV-V und VI-VII folgende Sequenzen hergestellt:
(IV/V): 5'-Spacer- EcoRI/121 → 210/31 → 40-3' (112 bp)
(VI/VII): 5'-201 → 210/31 → 120 - BamHI - Spacer-3' (112 bp)
Diese Fragmente wurden nach Gelektrophorese isoliert und mit Hilfe der Primer IV und VII verlängert, so daß die Sequenz (IV/V/VI/VII)
5'-Spacer - EcoRI/121 → 210/31 → 120 - BamHI - Spacer-3' (204 bp)
erhalten wurde.
Primer:
3. Die Fragmente ad und cb wurden mit EcoRI gespalten und durch Ligation zusammengesetzt. Im einzelnen wurde wie folgt vorgegangen:
Die unter 2. und 3. erhaltenen Sequenzen (I/II/III) und (IV/V/VI/VII) wurden durch Geleelektrophorese isoliert, durch EcoRI gespalten und ligiert. Dadurch wurde die Sequenz 5'-Spacer-HindIII/1 → 30/211 → 294/EcoRI/121 → 210/31 → 120 - BamHI - Spacer-3' (318 bp) erhalten, die nach Spaltung mit HindIII und BamHI in dem Vektor Bluescript kloniert wurde.
4. Die Übergänge a/b, b/c und c/d wurden durch PCR zusammengesetzt, wobei 5' von a/b eine BamHI Spaltstelle und 3' von c/d eine Xbal Spalt stelle eingesetzt wurden. Im einzelnen wurde wie folgt vorgegangen:
Aus der DNA von Fig. 2 wurden durch die Primerpaare VIII-IX, X-XI und XII-XIII folgende Sequenzen hergestellt:
Die entsprechenden Fragmente wurden nach Gelektrophorese isoliert.
Die Fragmente (VIII/IX) und X/XI wurden mit Hilfe der Primer VIII und XI verbunden, so daß die Sequenz 5'-Spacer - BamHI - 7 → 54/97 → 144/187 → 198-3' (117 bp) entstand. Dieses Fragment wurde zusam men mit dem Fragment (XII/XIII) mit Hilfe der Primer VIII und XIII ver bunden, so daß die Sequenz 5'-Spacer - BamHI - 7 → 54/97 → 144/187 234 → - Stop - Xbal - Spacer-3' (171 bp) entstand.
Diese Sequenz wurde nach Spaltung mit BamHI und Xbal in dem Vektor Bluescript kloniert.
Primer:
5. Die Fragmente HindIII - a - d - EcoRI - c - b - BamHI und BamHI - a/b - b/c - c/d - Xbal wurden mit BamHI gespalten und durch Ligation zusammen gesetzt. Im einzelnen wurde wie folgt vorgegangen:
Die in 3. und 4. beschriebenen Sequenzen wurden mit BamHI gespalten und ligiert, so daß folgende Sequenz erhalten wurde:
5'-Spacer-HindIII/1 → 30/211 → 294/EcoRI/121 → 210/31 → 120 - BamHI - 7 → 54/97 → 144/187 → 234 - Stop - Xbal - Spacer-3' (477 bp) (vgl. Fig. 1). Diese Sequenz wurde mit HindIII und Xbal gespalten und in dem Vektor Bluescript kloniert.

Beispiel 2: Herstellung und Reinigung eines erfindungsgemäßen Proteins

Die unter 5. von Beispiel 1 erhaltende DNA wurde in den mit HindIII und Xbal gespaltenen Expressionsvektors pQE-8 (Qiagen) inseriert. Es wurde das Expres sionsplasmid pQE-8/E7 erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungsgemäßen (Protein) von Fig. 1 (C-Terminuspartner). pQE-8/E7 wurde zur Transformation von E.coli SG 13009 (vgl. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273) verwen det. Die Bakterien wurden in einem LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60 µM Isopropyl-β-D-Thiogalactopyra nosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wurde eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wurde mit dem Lysat eine Chromato graphie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Diagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wurde in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wurde das Fusionsprotein einer 18% SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J. O. und Kornberg, R. D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).

Es zeigte sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.

Beispiel 3: Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers

Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 2 wurde einer 18% SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wurde eine ca. 15 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke wurden sedimen tiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Poly acrylamid-Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgte, bestimmt wurde. Mit dem Gel-gereinigten Fusionsprotein wurden Tiere wie folgt immuni siert:

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen

Pro Immunisierung wurden 35 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten

Das Serum des Kaninchens wurde im Immunoblot getestet. Hierzu wurde ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wurde das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war das Serum des Kaninchens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wurde das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30- minütiger Inkubation bei 37°C folgten mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36 µM 5' Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar waren.

Es zeigte sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn

Pro Immunisierung wurden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)

Aus Eigelb wurden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es wurden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.

Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus

Pro Immunisierung wurden 12 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung war das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion

Überstände von Hybridomen wurden im Western Blot getestet. Erfindungs gemäße, monoklonale Antikörper wurden nachgewiesen.

Claims

1. Polypeptid mit immunogenen und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins, wobei das Polypeptid Abschnitte des Proteins von etwa 10-40 Aminosäuren in einer zum Protein veränderten Anordnung aufweist.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die biologischen Funktionen ausgeschaltet sind.

3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein ein toxisches oder transformierendes Protein ist.

4. Polypeptid nach Anspruch 3, wobei das transformierende Protein von HPV, insbesondere HPV 16 oder HPV 18 stammt.

5. Polypeptid nach Anspruch 4, wobei das Protein ein E6- oder E7-Protein ist.

6. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-5, wobei die Abschnitte 20-30 Aminosäuren umfassen.

7. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-6, wobei sich die Abschnitte von den entsprechenden Abschnitten im Protein durch eine oder mehrere Aminosäuren unterscheiden.

8. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-7, wobei das Polypeptid auch Teile von etwa 10-20 Aminosäuren enthält, die im Protein als Übergänge zwischen den einzelnen Ab schnitten vorliegen.

9. Polypeptid nach Anspruch 8, wobei die Teile 18-20 Aminosäuren umfassen.

10. Polypeptid nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Teile am N- und/oder C-Terminus des Polypeptids einzeln oder in einer Gesamtheit vorliegen.

11. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-10, wobei das Polypeptid Abschnitte des E7-Proteins von HPV 16 in einer zum Protein veränderten Anordnung und Teile des E7- Proteins, die in diesem als Übergänge zwischen den einzelnen Abschnitten vorliegen, und die in Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, angegebene Aminosäuresequenz oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz umfaßt, wobei die DNA letzterer Aminosäuresequenz mit der DNA- Sequenz von Fig. 1 hybridisiert.

12. DNA, kodierend für das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-10.

13. DNA, kodierend für das Polypeptid nach Anspruch 11, wobei die DNA umfaßt:

a) eine DNA, die für Abschnitte des E7-Proteins von HPV16 in einer zum Protein veränderten Anordnung und für Teile des E7-Proteins kodiert, die in diesem als Übergänge zwischen den einzelnen Abschnitten vorliegen, und die in Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, angegebene DNA-Sequenz oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA-Sequenz umfaßt, wobei letztere DNA-Sequenz mit jener von Fig. 1 hybridisiert, oder
b) eine über den degenerierten Code mit der DNA von (a) verwandte DNA.

14. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach Anspruch 12 oder 13.

15. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 14.

16. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1-11, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 15 unter geeigneten Bedingungen.

17. Antikörper, gerichtet gegen das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-11.

18. Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1-11 oder der DNA nach Anspruch 12 oder 13 zur aktiven Immunisierung.