DE19847364C1

DE19847364C1 - Tumor-Protein

Info

Publication number: DE19847364C1
Application number: DE19847364A
Authority: DE
Inventors: Johannes Wilhelmus Ger Janssen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-10-14
Filing date: 1998-10-14
Publication date: 2000-05-11
Anticipated expiration: 2018-10-15
Also published as: WO2000022117A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Tumor-Protein, eine für ein solches Protein kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Proteins. Ferner betrifft die Erfindung gegen das Protein gerichtete Antikörper sowie die Verwendung der DNA und des Proteins zur Diagnose und/oder Therapie von Tumor-Erkrankungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Tumor-Protein, eine für ein solches Protein kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Proteins. Ferner betrifft die Erfindung gegen das Protein gerichtete Antikörper sowie die Ver wendung der DNA und des Proteins zur Diagnose und/oder Therapie von Tumor- Erkrankungen.

Bei vielen Tumor-Erkrankungen liegen Veränderungen im Genom vor. Dies können z. B. Amplifikationen oder Translokationen sein. Solche Veränderungen finden sich z. B. bei Mantelzell-Lymphomen, squamösen Zellkarzinomen, Brust krebs und Nieren-Onkozytomen, wobei die Veränderungen oftmals im chromoso malen Bereich 11q13 vorliegen. Eine genaue Zuordnung der Veränderungen zu den einzelnen Tumor-Erkrankungen ist allerdings sehr schwierig. Insofern ist auch das Verstehen von molekularen Zusammenhängen bei der Entstehung und Ausbildung von Tumor-Erkrankungen gering.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu stellen, mit dem Tumor-Erkrankungen ursächlich untersucht und ggfs. Wege aufgezeigt werden können, mit denen in Tumor-Erkrankungen eingegriffen wer den kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß mit einer die Basensequenz von Fig. 3 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz umfassenden DNA NIH/3T3 Zellen trans formiert bzw. in Nacktmäusen Tumoren induziert werden können. Ferner hat er erkannt, daß die DNA in Tumoren, z. B. Colonkarzinom, Nierenkarzinom, Lungen karzinom, Magenkarzinom, Brustkarzinom, Kopftumoren, Nackentumoren, Blasentumoren, Ovarialtumoren, Melanom, Neuroblastom und multiples Myelom, stärker exprimiert wird als in Normal-Gewebe (vgl. Fig. 4). Desweiteren hat er gefunden, daß die DNA im chromosomalen Bereich 11q13, etwa 300 kb zen tromerisch entfernt vom Cyclin D1-Gen lokalisiert ist. Die DNA kodiert für ein Protein, das die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Sequenz umfaßt. Eine Variante des Proteins ist in Fig. 2 angegeben. Das Protein umfaßt 5 hydrophobe Bereiche, die als Transmembran-Helices fungieren können. Das Protein wird nachstehend mit Tumor-Protein (T-P) bezeichnet.

Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, ein Tumor- Protein (T-P) bereitzustellen, umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäure sequenz, wobei die DNA der letzteren Aminosäuresequenz mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert.

Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz" umfaßt jegliche für ein Tumor-Protein (T-P) kodierende Aminosäuresequenz, deren DNA-Sequenz mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert und NIH/3T3 Zellen transformiert bzw. in Nacktmäusen Tumoren induziert. Die DNA-Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 3 durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unter scheiden. Der Ausdruck "Hybridisierung" weist auf eine Hybridisierung unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der Sequenz hin.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für T-P kodiert. Die Nukleinsäure kann eine RNA oder eine DNA, z. B. eine cDNA, sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:

a) Die DNA von Fig. 3 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 3 hybri disiert, oder
b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code ver wandte DNA.

Die DNA von Fig. 3 wurde als E. coli pCl-14 OCIM bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) unter DSM 12327 am 21. Juli 1998 hinterlegt.

Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA" umfaßt jegliche für ein Tumor-Protein (T-P) kodierende DNA-Sequenz, die mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert und NIH/3T3 Zellen transformiert bzw. in Nackt mäusen Tumoren induziert. Die DNA-Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 3 durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Hinsichtlich des Ausdrucks "Hybri disierung" wird auf vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen.

Eine erfindungsgemäße DNA kann als solche oder in Kombination mit jeglicher anderen DNA vorliegen. Insbesondere kann eine erfindungsgemäße, für ein Tumor-Protein (T-P) kodierende DNA in einem Expressionsvektor vorliegen. Bei spiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4 anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Bacculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A.

Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um die erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E. coli-Stämme HB101, DH1, X1776, JM101, JM109, BL21 und SG 13009, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen Sf9.

Der Fachmann weiß, in welcher Weise die erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fu sionsproteins exprimiert werden kann.

Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfin dungsgemäße DNA exprimierte Protein bzw. Fusionsprotein zu isolieren und zu reinigen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehen des Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklona len Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragmenten davon zu immunisieren, wobei es günstig sein kann, wenn diese an ein Trägermolekül, wie KLH oder BSA, gekoppelt sind. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fusions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklonalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit. Ein solcher umfaßt eine oder mehrere der folgenden Komponenten:

a) eine erfindungsgemäße DNA,
b) ein erfindungsgemäßes Tumor- Protein (T-P),
c) einen erfindungsgemäßen Antikörper, sowie
d) übliche Hilfsstoffe, wie Träger, Puffer, Lösungsmittel, Kontrollen, etc.

Von den einzelnen Komponenten können jeweils ein oder mehrere Vertreter vorliegen. Hinsichtlich der einzelnen Ausdrücke wird auf vorstehende Ausführun gen verwiesen. Diese gelten hier entsprechend.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, Tumor-Erkrankungen ursächlich zu untersuchen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann T-P nachgewiesen werden. Es kann eine Beziehung von T-P zu einer Tumor-Erkrankung hergestellt werden. Ferner kann mit T-P ein gegen dieses Protein gerichteter Autoantikörper nachgewiesen werden. Beide Nachweise können durch übliche Verfahren, insbesondere einen Western Blot, einen ELISA, eine Immunpräzipitation oder durch Immunfluoreszenz, erfolgen. Desweiteren kann mit einer erfindungsgemä ßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA und hiervon abgeleiteten Primern, die Organisation und die Expression des für T-P kodierenden Gens nachgewiesen werden. Dieser Nachweis kann in üblicher Weise, insbesondere in einem Sout hern oder Northern Blot oder über "in situ" Hybridisierung bzw. durch RT-PCR, erfolgen.

Darüberhinaus eignet sich die vorliegende Erfindung, Maßnahmen gegen das Vorliegen von T-P in Personen zu ergreifen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann T-P inhibiert werden. Auch kann die Expression der für T-P kodierenden DNA inhibiert werden, indem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, insbesondere eine DNA, als Basis zur Erstellung von Anti-Sinn-RNA verwendet wird. Diese kann als solche oder in Form eines sie exprimierenden Vektors, wobei dieser einen induzierbaren Promotor enthalten kann, in Personen bzw. bestimmte Gewebe, insbesondere Tumoren, eingeführt werden. Desweiteren kann T-P als Basis dienen, chemische Verbindungen zu entwickeln, die T-P inhibieren können.

Somit stellt die vorliegende Erfindung Mittel dar, Tumor-Erkrankungen besser zu diagnostizieren und in diese Erkrankungen therapeutisch eingreifen zu können.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen.

Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Tumor- Proteins (T-P).

Fig. 2 zeigt die Aminosäuresequenz einer Variante von T-P von Fig. 1.

Fig. 3 zeigt die für ein erfindungsgemäßes Tumor-Protein (T-P) kodierende DNA-Sequenz. Die Codons 810-1577 betreffen T-P von Fig. 1, während die Codons 540-680 und 777-1577 sich auf die T-P- Variante von Fig. 2 beziehen.

Fig. 4 zeigt den Nachweis von T-P-Sequenzen in Normal-Geweben (4A) bzw. Tumoren (4B).

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1: Nachweis eines erfindungsgemäßen Tumor-Proteins (T-P) in Nor mal-Geweben bzw. Tumoren

Es wird PolyA⁺RNA aus Normal-Gewebe, d. h. Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge und Leber käuflich erhalten (Clontech). Ferner wird Gesamt-RNA aus Tumorzellinien von Colonkarzinom, Nierenkarzinom, Lungenkarzinom und multiplem Myelom isoliert. Jeweils 2 µg der PolyA⁺RNAs und 10 µg der Gesamt-RNAs werden einer Agarose-Gelektrophorese mit anschließender Northern Blot-Hybridisierung unterzogen. Als Hybridisierungsprobe wird eine [a³²P]dCTP markierte T-P spezifi sche DNA, d. h. die DNA von Fig. 3, verwendet. Die Hybridisierung erfolgt übernacht bei 63°C mit anschließenden Waschschritten, wobei die Blots mehr fach in 3 × SSC/0.1% SDS bei 63°C und anschließend unter hoher bzw. mitt lerer Stringenz gewaschen werden. Die Blots werden einer 7-tägigen Autoradio graphie unterzogen (vgl. Fig. 4A und 4B).

Es zeigt sich, daß in Tumoren eine starke Bande von T-P-Sequenzen nachgewie sen werden kann. Ferner zeigt es sich, daß diese Bande in Normalgewebe nur schwach ist.

Beispiel 2: Herstellung und Reinigung eines erfindungsgemäßen Tumor-Pro teins (T-P)

Die DNA von Fig. 3 wird mit BAMHI-Linkern versehen, mit BamHI nachgespalten und in den mit BamHI gespaltenen Expressionsvektors pQE-8 (Qiagen) inseriert. Es wird das Expressionsplasmid pQE-8/T-P erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungs gemäßen T-P von Fig. 1 (C-Terminuspartner). pQE-8/T-P wird zur Transformation von E. coli SG 13009 (vgl. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, 11981), 265- 273) verwendet. Die Bakterien werden in einem LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60 µM Isopropyl-β-D- Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydro chlorid wird eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wird mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff ent sprechend der Angaben des Herstellers (Qiagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wird in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wird das Fusionsprotein einer 18% SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J. O. und Kornberg, R. D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).

Es zeigt sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.

Beispiel 3: Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers

Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 2 wird einer 18% SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wird eine ca. 35 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke werden sedimentiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgt, bestimmt wird. Mit dem Gel-gereinigten Fusionsprotein werden Tiere wie folgt immunisiert:

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen

Pro Immunisierung werden 35 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt. Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten

Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird ein erfin dungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid-Gelelek trophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse- Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist das Serum des Kaninchens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen- IgG-Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgen mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36 µM 5' Bromo-4-chloro- 3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden.

Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn

Pro Immunisierung werden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt. Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)

Aus Eigelb werden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es werden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.

Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus

Pro Immunisierung werden 12 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung ist das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst. Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion

Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungs gemäße, monoklonale Antikörper werden nachgewiesen.

Claims

1. Tumor-Protein (T-P), umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Amino säuresequenz, wobei die DNA-Sequenz der letzteren Aminosäuresequenz mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert und NIH/3T3 Zellen transformiert bzw. in Nacktmäusen Tumoren induziert.

2. Tumor-Protein nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 2.

3. DNA, kodierend für das Tumor-Protein nach Anspruch 1 oder 2, umfassend:

a) die DNA von Fig. 3 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Ba senpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert und NIH/3T3 Zellen transformiert bzw. in Nacktmäu sen Tumoren induziert, oder
b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.

4. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach Anspruch 3.

5. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 4.

6. Verfahren zur Herstellung des Tumor-Proteins nach Anspruch 1 oder 2, umfas send die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 6 unter geeigneten Bedingungen.

7. Antikörper, gerichtet gegen das Tumor-Protein nach Anspruch 1 oder 2.

8. Verwendung des Tumor-Proteins nach Anspruch 1 oder 2 oder einer DNA nach Anspruch 3 zur Diagnose und/oder Therapie von Tumor-Erkrankungen.

9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Tumor-Erkrankungen Colonkar zinom, Nierenkarzinom, Lungenkarzinom, Magenkarzinom, Brustkarzinom, Kopftumoren, Nackentumoren, Blasentumoren, Ovarialtumoren, Melanom, Neuroblastom und multiples Myelom umfassen.