DE19534763C1

DE19534763C1 - FMR1-verwandtes Protein

Info

Publication number: DE19534763C1
Application number: DE1995134763
Authority: DE
Inventors: Annemarie Dipl Biol Dr Poustka; Johannes Dipl Biol Coy
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1995-09-19
Filing date: 1995-09-19
Publication date: 1997-05-15
Anticipated expiration: 2015-09-20
Also published as: EP0851923A2; JP2000500962A; WO1997012969A2; WO1997012969A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein FMR1-verwandtes Protein, eine ein solches codierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der DNA und des Proteins sowie gegen das Protein gerichtete Antikörper.

FMR1 ist ein RNA-bindendes Protein, das z. B. mRNA von FMR1 und mRNA von fötalem Gehirn bindet. FMR1 findet sich häufig in Hoden, fötalen Ovarien und Gehirnneuronen. Defekte in FMR1 bzw. seine Defizienz finden sich bei Patienten mit mentaler Retardierung, insbesondere bei solchen des fragilen X-Syndroms. Diese Geisteskrankheit, die sich u. a. in Hyperaktivität äußert, ist vererbbar und tritt mit einer Häufigkeit von etwa 1 : 1500 bei Männern und 1 : 2500 bei Frauen auf, wobei ihr Schweregrad in der Regel bei Männern höher ist als bei Frauen.

Die genaue Wirkungsweise, wie Defekte in FMR1 bzw. seine Defizienz eine mentale Retardierung, insbesondere das fragile X-Syndrom, bedingen, ist al lerdings nicht bekannt. Dies wäre aber notwendig, um bei mentaler Retardierung diagnostisch und therapeutisch besser eingreifen zu können.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu stellen, mit dem mentale Retardierungen, insbesondere das fragile X-Syndrom, besser untersucht und gegebenenfalls therapiert werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein FMR1-verwandtes Protein, das die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch eine oder mehre re Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz umfaßt, wobei das Protein mit letzterer Aminosäuresequent sich von FMR1 auf dem DNA-Level durch Hybridisierung unter üblichen Bedingungen unterscheidet. Ein solches Protein wird nachstehend mit "FXR2" bezeichnet.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß in Tieren, besonders Säugetieren, ganz besonders dem Menschen, ein Protein existiert, das Homologien zu FMR1, gegebenenfalls eine FMR1 Aktivität auf weist, sich aber von FMR1 auf dem DNA-Level durch Hybridisierung unter üblichen Bedingungen unterscheidet. Ein solches Protein umfaßt die Aminosäure sequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine für FXR2 kodierende Nukleinsäure. Dies kann eine RNA oder eine DNA sein. Letztere kann z. B. eine genomische DNA oder eine cDNA sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:

(a) die DNA von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA sich von jener von FMR1 durch Hybridisierung unter üblichen Bedingungen unterscheidet,
(b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.

Der Ausdruck "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisiert.

Nachstehend wird eine erfindungsgemäße DNA in Form einer cDNA beschrieben. Diese steht beispielhaft für jede unter die vorliegende Erfindung fallende DNA.

Zur Herstellung einer erfindungsgemäßen cDNA ist es günstig, von einer menschlichen cDNA-Bibliothek, z. B. einer von fötalem Gehirn, wie der cDNA- Bibliothek λ-Zap, Stratagene, Kat.-Nr. 936206, oder einer von fötalem Herz, wie der cDNA-Bibliothek HL 3018b, Clontech, auszugehen. Klone solcher cDNA- Bibliotheken werden auf einer Filtermembran fixiert und mit einer markierten FMR1 cDNA-Probe bei reduzierter Stringenz, insbesondere bei 27°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, hybridisiert. Positive Klone werden sequenziert, wo durch jene identifiziert werden, die eine für FXR2 kodierende DNA umfassen.

Eine erfindungsgemäße cDNA kann in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Ex pressionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8, wobei letzterer bevorzugt ist. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expres sion in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A.

Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine, erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende cDNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM 109, BL21 und SG 13009, wobei letzterer bevorzugt ist, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9.

Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße cDNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße cDNA in Form eines Fu sionsproteins exprimiert werden kann.

Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfin dungsgemäße cDNA exprimierte Protein zu isolieren und zu reinigen. Ein solches Protein, das auch ein Fusionsprotein sein kann, ist somit ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehen des Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklona len Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fu sions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklo nalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, mentale Retardierungen, insbesondere das fragile X-Syndrom, besser zu untersuchen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann FXR2 in Körperflüssigkeiten von Personen nachgewiesen werden. Es kann eine Beziehung von FXR2 zur Entstehung und Ausbildung vorstehender Erkrankungen hergestellt werden. Ferner kann mit einem erfin dungsgemäßen FXR2 ein gegen dieses Protein gerichteter Autoantikörper nach gewiesen werden. Des weiteren können mit einem FXR2 der vorliegenden Erfin dung Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, ins besondere solchen, die mit mentalen Retardierungen in Bezug gebracht werden, detektiert werden, wodurch die Funktionen dieser Proteine aufgeklärt und gegebenenfalls therapeutische Maßnahmen für oder gegen die Proteine ergriffen werden können. Vorstehende Nachweise können durch übliche Verfahren, insbesondere einen Western Blot, einen ELISA, eine Immunpräzipitation oder durch Immunfluoreszenz, erfolgen. Des weiteren kann mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA und hiervon abgeleiteten Primern, die Expression des für FXR2 kodierenden Gens nachgewiesen werden. Dieser Nachweis kann in üblicher Weise, insbeson dere in einem Southern Blot, erfolgen.

Darüberhinaus eignet sich die vorliegende Erfindung, Maßnahmen für und gegen das Vorliegen von FXR2 in Personen zu ergreifen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann FXR2 in Personen inhibiert werden. Andererseits kann mit einem erfindungsgemäßen FXR2, insbesondere nach Kopplung an ein vom Körper nicht als fremd angesehenes Protein, z. B. Transferrin oder BSA, die Menge von FXR2 in Personen erhöht werden. Entsprechendes kann auch mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA, erreicht wer den, die unter die Kontrolle eines in bestimmten Geweben, z. B. Gehirn, Herz, induzierbaren Promotors gestellt wird und nach ihrer Expression zur Bereitstel lung von FXR2 in diesen Geweben führt. Darüberhinaus kann eine erfindungs gemäße Nukleinsäure, insbesondere eine DNA, auch zur Inhibierung von FXR2 genutzt werden. Hierzu wird die Nukleinsäure, z. B. als Basis für die Erstellung von Anti-Sinn-Oligonukleotiden zur Expressions-Inhibierung des für FXR2 kodie renden Gens verwendet.

Die vorliegende Erfindung stellt somit einen großen Beitrag zur diagnostischen und therapeutischen Erfassung von mentalen Retardierungen, insbesondere des fragilen X-Syndroms, dar.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäurese quenz eines erfindungsgemäßen Proteins FXR2.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1: Herstellung und Reinigung eines erfindungsgemäßen Proteins FXR2

Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins FXR2 wurde die DNA von Fig. 1 als Template verwendet. Es wurde ein PCR-Verfahren durchgeführt. Als Primer-Paar wurde verwendet: 5′-CAGAGATCTATGCTGGCAATTGGGACT CACGGTGC-3′ und 5′-GGGAAGCTTTTAAGATTTATCCACAATCTCCTGGA-3′. Der PCR-Ansatz bzw. die PCR-Bedingungen waren jeweils wie folgt:

PCR-Ansatz

Template DNA (Fig. 1) 1 µl = 1 ng
Pfu-Polymerase 10x-Puffer: 10 µl = 1 x
DMSO: 10 µl = 10%
dNTP′s: 1 µL = je 200 µM
Oligonukleotide, je 1,5 µl: 3 µl = je 150 ng
H₂O-bidest: ad 99 µl.

PCR-Bedingungen

- 92°C - 5 min
- Zugabe von 1 µl Pfu-Polymerase (Stratagene) = 2,5 Einheiten
- Zugabe von Paraffin.

PCR

92°C 1 min
58°C 1 min 1 Zyklus
72°C 10 min
92°C 1 min
58°C 1 min 39 Zyklen
72°C 2 min
72°C 10 min 1 Zyklus.

Die amplifizierte DNA wurde jeweils mit Bgl II und Hind III gespalten und in den mit Bam HI und Hind III gespaltenen Expressionsvektor pQE-8 (Diagen) inseriert. Es wurde das Expressionsplasmid pQ/FXR2 erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und einem erfindungs gemäßen Protein FXR2 von Fig. 1 (C-Terminuspartner). pQ/FXR2 wurde zur Transformation von E.coli SG 13009 (vgl. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273) verwendet. Die Bakterien wurden in einem LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60 µM Iso propyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guani dinhydrochlorid wurde eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wurde mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harn stoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Diagen) des Chromatographie Materials durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wurde in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wurde das Fusionsprotein einer 18% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie- Blau angefärbt (vgl. Thomas, J.O. und Kornberg, R.D., J.Mol.Biol. 149 (1975), 709-733).

Es zeigte sich, daß ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein in hochreiner Form hergestellt werden kann.

Beispiel 2: Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers

Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 wurde einer 18% SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wurde eine ca. 8.8 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke wurden sedimen tiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Poly acrylamid-Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgte, bestimmt wurde. Mit dem Gel-gereinigten Fusionsprotein wurden Tiere wie folgt immuni siert:

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen

Pro Immunisierung wurden 35 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund′s Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund′s Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund′s Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten.

Das Serum des Kaninchens wurde im Immunoblot getestet. Hierzu wurde ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wurde das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war das Serum des Kaninchens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wurde das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30- minütiger Inkubation bei 37°C folgten mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36 µM 5′ Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar waren.

Es zeigte sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn

Pro Immunisierung wurden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund′s Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund′s Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund′s Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA).

Aus Eigelb wurden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es wurden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.

Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus

Pro Immunisierung wurden 12 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund′s Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung war das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund′s Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund′s Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion.

Überstände von Hybridomen wurden im Western Blot getestet. Erfindungs gemäße, monoklonale Antikörper wurden nachgewiesen.

Claims

1. FMR1-verwandtes Protein, wobei das Protein die Aminosäuresequenz von Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz umfaßt, wobei das Protein mit letzterer Aminosäuresequenz sich von FMR1 auf dem DNA-Level durch Hybridisierung unter üblichen Bedingungen unter scheidet.

2. DNA kodierend für ein Protein nach Anspruch 1, wobei die DNA umfaßt:

(a) die DNA von Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA sich von jener von FMR1 durch Hybridi sierung unter üblichen Bedingungen unterscheidet,
(b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.

3. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach Anspruch 2.

4. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 3.

5. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 1, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 4 unter geeigneten Bedin gungen.

6. Antikörper, gerichtet gegen das Protein nach Anspruch 1.

7. Verwendung des Proteins nach Anspruch 1 als Reagens zur Diagnose und/oder Therapie von mentaler Retardierung.

8. Verwendung der DNA nach Anspruch 2 als Reagens zur Diagnose und/oder Therapie von mentaler Retardierung.