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Gebiet der
Erfindung
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Das
Gebiet der Erfindung betrifft allgemein variante humane Papillomavirus(HPV)-Proteine
und insbesondere nicht transformierende variante HPV-Proteine, die
zur Verwendung in Impfstoffen geeignet sind. Die Erfindung umfasst
diese Varianten zur Verwendung als Medikamente und in Zusammensetzungen
zum Auslösen
einer Immunantwort gegen HPV in einem Wirtstier.
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Hintergrund
der Erfindung
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Papillomaviren
sind kleine DNA-Viren, die eine Vielzahl von Tierarten infizieren.
Einige stehen mit der Entwicklung bösartiger Erkrankungen in deren
natürlichen
Wirten in Verbindung. Über
60 Arten des humanen Papillomavirus(HPV) wurden identifiziert. Diese
infizieren Menschen an einer Vielzahl von Körperstellen und sind für gewöhnliche
Hautwarzen, Larynxpapillome, Genitalwarzen und andere warzenähnliche
Läsionen
verantwortlich. Genital-HPV-Infektionen sind besonders häufig und
eine Zahl von HPV-Typen, jedoch am häufigsten die Typen 6, 11, 16
und 18 infizieren den Genitaltrakt bei sowohl Männern als auch Frauen. Bei
Frauen infizieren HPVs verschiedene Bereiche des Genitaltrakts einschließlich des
Gebärmutterhalses.
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Genitale
HPVs sind ein bedeutendes klinisches Problem. Eine HPV-Infektion
der anogenitalen Region wird derzeit als die häufigste Form einer viralen,
sexuell übertragenen
Erkrankung (STD) betrachtet. Die Viren können Genitalinfektionen verursachen,
die auf einem von drei Wegen manifest werden:
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eine klinische Infektion, wobei große Genitalwarzen sichtbar sind;
- (ii) eine subklinische Infektion, wobei virale Läsionen nicht
offensichtlich sind, jedoch unter Verwendung spezieller Betrachtungstechniken
detektierbar sind; und
- (iii) Latenz, wobei das einzige Zeichen einer Infektion das
Vorhandensein von HPV-DNA ist.
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Subklinische
Infektionen sind häufig.
Es wird geschätzt,
dass 2 bis 4 % von Papanicolaou(Pap.)-Abstrichen Anzeichen von HPV
zeigen. Latente Infektionen sind noch häufiger und der größte Teil
der Erwachsenen beherbergt eine oder mehrere Arten von genitalen
HPV.
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Zervixkarzinom
(CaCx) ist eine häufige
Krebserkrankung bei Frauen. Zwei Formen von Gebärmutterhalskrebs sind bekannt;
Plattenepithelkarzinom (SCC) ist bei weitem der häufigste,
der etwa 90 % der beobachteten Fälle
darstellt; Adenokarzinom, eine Krebserkrankung der Sekretionszellen,
macht etwa 10 % aus. Gebärmutterhalskrebs
entwickelt sich über
vorkanzeröse
Zwischenstufen zu invasiven Formen (dem Karzinom), das lebensbedrohlich
werden kann. Die vorkanzerösen
Stufen zunehmender Schwere sind als zervikale Plattenepitheldysplasie
(CIN) der Grade 1 bis 3 bekannt. Über einen Zeitraum von 20 Jahren
entwickeln etwa 40 % der unbehandelten CIN3-Patienten invasiven
Krebs, dessen zunehmend schwere Formen als Stufe I bis IV bekannt
sind. Invasiver Krebs führt
häufig
zum Tod.
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Gebärmutterhalskrebs
ist sowohl in dessen vorkanzerösen
als auch invasiven Stadien eine der wenigen Krebserkrankungen, für die ein
hoch zuverlässiges
und relativ billiges Screeningverfahren verfügbar ist. Der Papanicolaou(Pap.)-Abstrich
umfasst eine zytologische Untersuchung von Gebärmutterhalsabstrichen zum Test
auf das Vorhandensein anomaler Gebärmutterhalszellen, die in ein
Zeichen für
präinvasiven
oder invasiven Krebs sind. Die Detektion von Anomalitäten führt zu weiterer
Untersuchung und, falls nötig,
Behandlung.
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Um
zur Verringerung der Zahl von Gebärmutterhalskrebserkrankungen
und daraus folgender Todesfälle
wirksam zu sein, wird ein Pap.-Abstrichscreening im Massenmaßstab durchgeführt und
es umfasst idealerweise alle Frauen im sexuell aktiven Alter. Die
Detektion und anschließende
Behandlung von CIN hat eine sehr hohe Erfolgsrate im Hinblick auf
die Prävention
von invasivem Krebs, während
eine frühe
Detektion des letzteren eine deutliche Wirkung auf die Sterblichkeit
haben kann.
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Die
meisten Industrieländer
weisen hoch entwickelte Pap.-Abstrichscreeningprogramme
auf, die zu einer 30 eigen Abnahme der altersspezifischen Sterblichkeit
aufgrund von CaCx zwischen 1960 und 1980 führten. Jedoch führen, abgesehen
von den skandinavischen Ländern,
wenige Industrieländer
ein Screening bei mehr als 50 bis 60 % der Frauen durch, wodurch
CaCx und daraus resultierende Todesfälle ein signifikantes Problem
bleiben. In den Entwicklungsländern
ist die Situation noch schlechter, da wenige organisierte Screeningprogramme
existieren, was zu 400.000 neuen Fällen von invasivem Krebs jährlich in
diesen Ländern
führt.
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Wie
früher
angegeben, verursacht eine Vielzahl von Arten von HPV Genitalinfektionen
bei Menschen, obwohl vier Arten (6, 11, 16, 18) vorherrschen. Über die
vergangenen 15 Jahre angesammelte Beweisanzeichen legen stark nahe,
dass mehrere der HPVs mit der Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs
in Verbindung stehen. Tatsächlich
folgerten viele Forscher, dass spezifische HPV-Arten der wesentliche ätiologische
Faktor, der für
die Entwicklung von vielen der Krebserkrankungen verantwortlich
ist, sind.
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Eine
Infektion mit HPV-16 und HPV-18 wurde mit der Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs
in Verbindung gebracht. Es wurde postuliert, dass HPV als Auslöser der
Zervixkarzinogenese fungiert und dass eine maligne Transformation
von der Interaktion mit anderen Faktoren abhängt. Infektionen mit HPV-6
und HPV-11 wurden mit der Entwicklung von Genitalwarzen in Verbindung
gebracht. Das Auftreten einer HPV-Infektion scheint zuzunehmen, was durch
eine starke Zunahme in der letzten Zeit von Patientenbesuchen im
Zusammenhang mit Genital-HPV-Infektionen bei sowohl Männern als
auch Frauen und das Vorhandensein von HPV in Pap.-Abstrichen von
einigen Frauen eines Alters unter 30 Jahren gezeigt wurde.
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Die
Natur von HPV-16 in speziellen und Papillomaviren im allgemeinen
wurde in der letzten Zeit gut untersucht. HPV-16 enthält ein doppelsträngiges DNA-Genom
von 7904 bp (K. Seedorf et al., Virology (1985) 145:181–185). Das
Capsid ist 50 nm groß und
enthält
72 Capsomere (A. Klug, J. Mol. Biol. (1965) 11:403–423). Das
US-Patent 4 777 239 offenbart eine Reihe von 17 synthetischen Pepsiden,
für die
angegeben wird, dass sie Antikörper
gegen HPV-16 bilden können
und daher für
diagnostische Zwecke verwendbar sein können. Ferner offenbart das
europäische
Patent 0 412 762 Polypeptide, die Antagonisten der biochemischen
Interaktion des HPV-E7-Proteins
und des Retinoblastomgen(RBG)-Proteins sind und für die angegeben
wird, dass sie bei der Behandlung von Genitalwarzen und Gebärmutterhalskrebs
verwendbar sind.
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Die
DNAs mehrerer Papillomaviren wurden sequenziert, wobei diese mehrere
HPV-Arten, Rinder-Papillomavirus (BPV) und Cottontail Rabbit-Papillomavirus
(CRPV) umfassen. Alle von diesen zeigen ähnliche Muster der Nucleotidsequenz
in Bezug auf offene Leseraster. Die offenen Leseraster können funktional
in frühe
Regionen (E) und späte
Regionen (L) unterteilt werden: es wird postuliert, dass die E-Regionen
zur Replikation und Transformation benötigte Proteine codieren und
die L-Regionen die Viruscapsidproteine codieren (O. Danos et al.,
J. Invest. Derm. (1984) 83:75–11s).
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Es
wird angenommen, dass zwei HPV-codierte Proteine, E6 und E7, an
der Pathogenese von HPV-induzierter. anomaler Zellproliferation
beteiligt sind (Übersicht
in Stoppler et al., Intervirology (1994) 37:168–179). Die Aminosäuresequenzen
der HPV-16-E6- und E7-Proteine, die von der Nucleinsäuresequenz abgeleitet
sind, sind in Seedorf et al., Virology (1985) 145:181–185, angegeben.
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Die
HPV-Gene mit Codierung für
die E6- und E7-Proteine werden unveränderlich in Gewebe- oder Tumorzellen,
die von Gebärmutterhalskrebserkrankungen
erhalten wurden, die mit einer HPV-Infektion in Verbindung stehen,
exprimiert. Ferner sind die von dem HPV-16-Stamm abgeleiteten HPV-E6-
und -E7-Gene zur Induktion von Epithelzellentransformation in Zellkultur
ohne das Vorhandensein anderer HPV-Gene fähig. Diese Beobachtungen zeigen,
dass mindestens ein Teil der durch eine HPV-Infektion verursachten
Stimulation der Zellproliferation auf den E6- und E7-Virusproteinen
beruht.
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Es
wird angenommen, dass die HPV-E6- und -E7-Proteine wirksame immunologische
Ziele zur Tumorregression sind. Wie oben beschrieben, ist jedoch
bekannt, dass die E6- und E7-Gene Zellen möglicherweise durch die Wirkung
ihrer Proteinprodukte der Störung
zellulärer
Proteine, die am Kontrollzellwachstum beteiligt sind, "transformieren". Daher könnte, auch
wenn nur winzige Spuren von DNA mit Codierung für die E6- und E7-Proteine in
einer Impfstoffzubereitung vorhanden wären, dies bewirken, dass eine
Impfzubereitung irreversible Transformationsereignisse in den Zellen
eines Empfängers
der Impfstoffzubereitung auslöst.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung nicht
transformierender Varianten der HPV-E6- und -E7-Proteine, die in
einem Wirtstier (insbesondere einem Menschen) einen Bereich humoraler
und zellulärer Immunantworten
induzieren können
und daher zur Verwendung bei der Produktion von Impfstoffen zur
Prävention,
Prophylaxe, Therapie und Behandlung HPV-induzierter Er krankungen
oder anderer Zustände,
die aus einer Hemmung einer HPV-Infektion Nutzen ziehen könnten, geeignet
sind.
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Bei
den zur vorliegenden Erfindung führenden
Arbeiten wurde erkannt, dass es vier Wege zur Induktion von Immunantworten
auf E6- und/oder E7-Proteine gibt:
- (i) die
Verwendung ganzer Proteine (diese führt die Möglichkeit ein, das kontaminierende
DNA mit den Proteinen assoziiert sein kann);
- (ii) die Verwendung von Punktmutanten (dies kann zur Rückkehr zu
nativem Protein führen,
was die Vermeidung mehrfacher Mutationen erfordert; ferner führt jede
Punktmutation zum Verlust potentiell vitaler Epitope);
- (iii) die Verwendung spezifischer Peptide (dies erfordert eine
große
Zahl von Peptiden, deren Identifizierung sehr komplex ist, um einen
Impfstoff breiter Verwendbarkeit herzustellen); und
- (iv) die Verwendung von Varianten, beispielsweise Fusionen und
Kombinationen von Deletionsmutanten (dieses Verfahren weist keine
der obigen Beschränkungen
auf).
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Zusätzlich zu
den zelltransformierenden Eigenschaften des E7-Proteins selbst wurde auch gezeigt, dass
Fusionen dieses Proteins mit β-Galactosidase
zelltransformierend sind (Fujikawa et al., Virology, 204, 789–793, 1994).
Daher kann nicht vorhergesagt werden, dass Fusionen von E6- und/oder
E7-Einheiten, von entweder
voller Länge
oder nicht voller Länge,
nicht ebenfalls zelltransformierend sind.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine isoliertes variantes
humanes Papillomavirus(HPV)-Protein zur Verwendung als Medikament
bereit, wobei das Protein eine Immunantwort gegenüber HPV
in einem Wirtstier auslösen
kann, jedoch in dem Wirtstier nicht zelltransformierend ist, wobei
das variante Protein ein Fusionsprotein umfasst, das
- (i) ein erstes HPV-Protein, das aus der Gruppe von einem E6-Protein
voller Länge,
einer E6-Deletionsmutante von nicht voller Länge, einem E7-Protein voller
Länge und
einer E7-Deletionsmutante von nicht voller Länge ausgewählt ist, und
- (ii) ein zweites HPV-Protein, das aus der Gruppe von einem E6-Protein
voller Länge,
einer E6-Deletionsmutante von nicht voller Länge, einem E7-Protein voller
Länge und
einer E7-Deletionsmutante von nicht voller Länge ausgewählt ist, und
- (iii) optional einen Linker, der das erste HPV-Protein und das
zweite HPV-Protein verknüpft,
umfasst.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung
eines isolierten varianten HPV-Proteins gemäß der obigen Beschreibung bei
der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung zum Auslösen einer
Immunantwort gegenüber
HPV in einem Wirtstier bereit.
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In
einem noch weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine
Zusammensetzung zur Verwendung zum Auslösen einer Immunantwort gegenüber HPV
in einem Wirtstier, die ein variantes Protein gemäß der obigen
Beschreibung zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder
Verdünnungsmittel
und optional einem Adjuvans umfasst, bereit.
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Durchgängig in
dieser Beschreibung ist, wenn es nicht der Kontext anders erfordert,
das Wort "umfassen" oder Variationen
wie "umfasst" oder "umfassen" so zu verstehen,
dass es den Einschluss einer angegebenen ganzen Zahl oder Gruppe
ganzer Zahlen, jedoch nicht den Ausschluss einer anderen ganzen
Zahl oder Gruppe ganzer Zahlen impliziert.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
hier verwendeten Verweise darauf, dass die Variante dieser Erfindung "nicht zelltransformierend in
dem Wirtstier" ist,
bedeuten, dass die zelltransformierende Eigenschaft des "Stamm-" oder Wildtyp-HPV-E6- oder
-E7-Proteins in der Variante verringert und vorzugsweise wirksam
beseitigt ist. Insbesondere geben diese Verweise an, dass diese
zelltransformierende Eigenschaft im Vergleich zu Wildtyp-E6- oder
-E7-Protein in geeigneten
Testsystemen signifikant verringert ist.
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Es
ist klar, dass, wenn das nicht transformierende variante HPV-Protein
dieser Erfindung durch Expression eines geeigneten codierenden rekombinanten
DNA-Moleküls
produziert wird, die Natur der codierenden DNA im Gegensatz zu den
Wildtyp-E6- oder
-E7-Genen nicht das Potential zum Auslösen irreversibler Transformationsereignisse
in den Zellen des Wirtstiers aufweist.
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Die
varianten HPV-Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung können Deletionsmutanten
der Wildtyp-E6- oder -E7-Proteine in der Form von Fragmenten nicht
voller Länge
der Wildtyp-Proteine
umfassen. Das erste und zweite Protein des Fusionsproteins werden – optional
mit einer Verknüpfung
von 1 bis 50, vorzugsweise einer kurzen Verknüpfung von 1–20 und noch besser 1 – 5 Aminosäureresten – fusioniert.
Die E6- und/oder
E7-Einheiten in einem derartigen Fusionsprotein können die
vollen Wildtyp-E6- oder E7-Proteine umfassen oder sie können alternativ
Fragmente der Wildtyp-Proteine nicht voller Länge umfassen. Die Fusionsproteine
können
auch andere Einheiten, die daran fusioniert oder in anderer Weise
gekoppelt sind, beispielsweise Einheiten zur Unterstützung der
Reinigung des Fusionsproteins (beispielsweise eine Glutathion-S-Transferase-
oder GST-Einheit oder hexa-His-Einheit)
oder zur Verstärkung
der Immunogenität
des Fusionsproteins (beispielsweise ein Adjuvans, wie Diphtherie- oder Choleratoxin
oder ein nichttoxisches Derivat dersel- ben, wie das Holotoxoid
oder die B-Untereinheit des Choleratoxins), umfassen.
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Der
Ausdruck "Deletionsmutante
nicht voller Länge" wird hier zur Beschreibung
von Polypeptiden verwendet, die Deletionsmutanten der E6- oder E7-Proteine
enthalten, die mindestens 50 %, noch günstiger 60–70 % und sogar 80–90 % der
E6- oder E7-Proteinsequenz voller Länge entsprechen. Nur als Beispiel
können
die Fragmente Deletionsmutanten, die den N-terminalen oder C-terminalen
zwei Dritteln der E6- oder E7-Proteine entsprechen, sein.
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Geeignete
Fusionsproteine, die die E6- und/oder E7-Proteine oder Fragmente
derselben nicht voller Länge
gemäß der obigen
Beschreibung umfassen, können
durch Techniken ohne weiteres produziert werden, die einschlägig bekannt
sind und im Folgenden mittels Beispielen beschrieben sind. Fachleuten
ist klar, dass variante HPV-E6- oder -E7-Proteine gemäß der obigen
Beschreibung, die Fusionsproteine umfassen, die verschiedene Kombinationen
der E6- und/oder E7-Einheiten umfassen, ohne weiteres unter Verwendung
dieser bekannten Techniken produziert werden können und dann unter Verwendung
von Routinemethoden getestet werden können, um festzustellen, ob
das erhaltene Fusionsprotein die Kriterien der vorliegenden Erfindung
erfüllt,
d. h. ob es eine humorale und/oder zelluläre Immunantwort in einem Wirtstier
auslösen
kann, jedoch in dem Wirtstier nicht zelltransformierend ist.
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Vorzugsweise
ist das Wirtstier ein Mensch, jedoch kann das Wirtstier auch ein
nichthumaner Säuger sein.
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Die
vorliegende Erfindung ist insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, auf
variante HPV-Fusionsproteine der HPV-16- und HPV-18-Genotypen gerichtet,
es ist jedoch klar, dass sich die Erfindung auf variante HPV-Fusionsproteine
in anderen HPV-Genotypen, insbesondere den HPV-6- und HPV-11-Genotypen, die Verursacher
von Condylomata acuminta sind, und anderen Genotypen, die onkogenes
Potential einer HPV-16 und
HPV-18 ähnlichen
Art aufweisen, erstreckt.
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Frühere Arbeiten
auf diesem Gebiet zeigten, dass eine Impfung von Ratten mit lebenden
Virusvektoren, die HPV-E6- oder
-E7-Proteine exprimieren, zur Abstoßung transplantierter, E7 tragender
Tumorzellen führt
(Meneguzzi et al., Virology, 181:62–69, 1991), während die
Impfung von Rindern mit einem HPV-E7-Impfstoff mit Adjuvans zur
beschleunigten Abstoßung
von Tumoren, die durch bovines Papillomavirus induziert sind, führt (Campo,
Cancer Cells, 3:421–426,
1991).
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Die
varianten HPV-Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung werden
als isolierte Proteine bereitgestellt, d. h. sie sind im Wesentlichen
frei von anderen HPV-Proteinen, und sie finden spezielle Verwendbarkeit zur
Behandlung von Genitalwarzen, Gebärmutterhalskrebs oder anderen
durch HPV beim Menschen verursachten Zuständen. Die varianten Proteine
können
in pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung oder Prävention
von Erkrankungen, an denen HPV beteiligt ist, sowie der anderen
Zustände,
die oben diskutiert wurden, eingearbeitet werden.
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Die
varianten HPV-Fusionsproteine der Erfindung können zur Bildung von Antikörpern und/oder
zur Induktion von zellulären
Immunantworten entweder in Subjekten, für die Schutz vor einer Infektion
durch HPV gewünscht
wird, d. h. als prophylaktische Impfstoffe, oder zur Erhöhung der
Immunantwort gegenüber
einer bereits vorhandenen HPV-Infektion, d. h. als therapeutische
Impfstoffe, verwendet werden. Sie können auch in Produktionsreihen
zur Gewinnung von Antiseren injiziert werden. Anstelle der in der
Produktionsreihe erhaltenen polyklonalen Antiseren können monoklonale
Antikörper
unter Verwendung der Standardverfahren oder durch jüngere Modifikationen
derselben durch Immortalisierung von Milz- oder anderen, Antikörper produzierenden
Zellen zur Injektion in tierische Lebewesen zur Gewinnung von Antikörper produzie renden
Klonen produziert werden. Die erhaltenen polyklonalen oder monoklonalen
Antikörper,
die, falls nötig,
bezüglich
Artvariationen korrigiert sind, können auch als Therapeutika
verwendet werden.
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Eine
direkte Verabreichung der varianten Proteine an einen Wirt kann
entweder Schutzimmunität
gegen HPV oder, wenn das Subjekt bereits infiziert ist, eine Auffrischung
der eigenen Immunantwort des Subjekts zur wirksameren Bekämpfung des
Fortschreitens der HPV-infizierten Erkrankung verleihen.
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Die
Größe der prophylaktischen
oder therapeutischen Dosis eines varianten HPV-Proteins dieser Erfindung
variiert natürlich
mit der Patientengruppe (Alter, Geschlecht und dergleichen), der
Natur oder Schwere des zu behandelnden Zustands und mit dem speziellen
varianten Protein und dessen Verabreichungsweg. Allgemein liegt
der Wochendosisbereich zur Verwendung im Bereich von etwa 0,1 bis
etwa 5 μg
pro kg Körpergewicht
eines Säugers.
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Jeder
geeignete Verabreichungsweg kann verwendet werden, um einen Säuger, insbesondere
einen Menschen, mit einer wirksamen Dosierung eines varianten Proteins
dieser Erfindung zu versorgen. Beispielsweise kann eine orale, rektale,
vaginale, topische, parenterale, okuläre, nasale, sublinguale, bukkale,
intravenöse
Verabreichung und dergleichen verwendet werden. Dosierungsformen
umfassen Tabletten, Lutschtabletten, Dispersionen, Suspensionen,
Lösungen,
Kapseln, Cremes, Salben, Suppositorien, Aerosole und dergleichen.
Diese Dosierungsformen umfassen auch injizierte oder implantierte,
langsam freisetzende Vorrichtungen, die für diesen Zweck speziell gestaltet
sind, oder andere Implantatformen, die zur zusätzlichen Wirkung auf diese
Weise modifiziert sind.
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Wenn
die varianten Proteine als Impfstoffe zu verabreichen sind, können sie
gemäß herkömmlichen Verfahren
für eine
derartige Verabreichung an das zu schützende Subjekt formuliert werden.
Wenn die Antikörper
für therapeutische
Zwecke verwendet werden sollen, ist es allgemein günstig, ihnen
mit dem zu behandelnden Subjekt kompatible Arteigenschaften zu verleihen.
Daher ist es häufig
günstig,
diese Antikörper
in monoklonaler Form herzustellen, da eine Fusion mit geeigneten
Partnern den sezernierten monoklonalen Antikörpern die gewünschten
Eigenschaften verleihen kann.
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Die
varianten Proteine können
in ISCOMSTM (immunstimulierenden Komplexen),
Liposomen oder in Verbindungen wie Acrylaten oder poly(DL-Lactid-co-glykosid)
unter Bildung von Mikrokügelchen
verkapselt zugeführt
werden. Die varianten Proteine können
auch in ölige
Emulsionen eingearbeitet und oral zugeführt werden.
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Andere
Adjuvantien sowie herkömmliche
pharmazeutisch akzeptable Träger,
Streckmittel, Puffer oder Verdünnungsmittel
können
ebenfalls in die Impfstoffzusammensetzungen dieser Erfindung eingearbeitet
werden. Allgemein umfasst eine Impfstoffzusammensetzung gemäß der vorliegenden
Erfindung eine immunologisch wirksame Menge des varianten HPV-Proteins
gemäß der obigen
Beschreibung und optional ein Adjuvans in Verbindung mit einem oder
mehreren herkömmlichen
pharmazeutisch akzeptablen Trägern
und/oder Verdünnungsmitteln.
Eine umfangreiche, wenn auch nicht erschöpfende Liste von Adjuvantien
findet sich in Coulter und Cox, "Advances
in Adjuvant Technology and Application", in Animal Parasite Control Utilizing
Biotechnology, Kapitel 4, Hrsg. W. K. Young, CRC Press, 1992. Die
hier verwendeten "pharmazeutisch
akzeptablen Träger
und/oder Verdünnungsmittel" umfassen beliebig
und alle Lösemittel,
Dispersionsmedien, wässrige
Lösungen,
Beschichtungen, antibakterielle und antifungale Mittel, isotonische
und Absorption verzögernde
Mittel und dergleichen. Die Verwendung derartiger Medien und Mittel
für pharmazeutisch
aktive Substanzen ist einschlägig
bekannt und beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.
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Auflage,
Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA, beschrieben.
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Bei
der praktischen Verwendung kann ein variantes Protein dieser Erfindung
als Wirkstoff in innigem Gemisch mit einem pharmazeutischen Träger gemäß herkömmlichen
pharmazeutischen Mischtechniken kombiniert werden. Der Träger kann
eine breite Vielzahl von Formen in Abhängigkeit von der zur Verabreichung, beispielsweise
oralen oder parenteralen (einschließlich intravenösen und
intraarteriellen) Verabreichung, gewünschten Form der Zubereitung
erhalten. Bei der Herstellung der Zusammensetzungen zur oralen Dosierungsform
können
jedes der üblichen
pharmazeutischen Medien, beispielsweise Wasser, Glykole, Öle, Alkohole,
Aromatisierungsmittel, Konservierungsmittel, Farbmittel und dergleichen
im Falle oraler flüssiger
Zubereitungen, beispielsweise Suspensionen, Elixiere und Lösungen;
oder Träger,
wie Stärkearten,
Zucker, mikrokristalline Cellulose, Verdünnungsmittel, Granulierungsmittel,
Gleitmittel, Bindemittel, Disintegrationsmittel und dergleichen
im Falle oraler fester Zubereitungen, beispielsweise Pulver, Kapseln
und Tabletten, verwendet werden. Wegen ihrer leichten Verabreichung
stellen Tabletten und Kapseln die am stärksten vorteilhafte orale Dosierungseinheitsform
dar, wobei in diesem Fall feste pharmazeutische Träger offensichtlich
verwendet werden. Falls gewünscht,
können
Tabletten durch Standardtechniken mit Zucker überzogen oder enterisch überzogen
werden.
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Zusätzlich zu
den oben angegebenen üblichen
Dosierungsformen können
die varianten Proteine dieser Erfindung auch durch Mittel zur gesteuerten
Freisetzung und/oder Abgabevorrichtungen verabreicht werden, die
beispielsweise die in der internationalen Patenbeschreibung PCT/AU/93/00677
(Veröffentlichung
WO 94/15636) offenbarten Zubereitungen mit gesteuerter Freisetzung
umfassen.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die zur oralen oder
parenteralen Verabreichung geeignet sind, können als diskrete Einheiten,
wie Kapseln, Cachets oder Tabletten, die jeweils eine vorgegebene
Menge des Wirkstoffs enthalten, als Pulver oder Granulatkörnchen oder
als Lösung
oder Suspension in einer wässrigen
Flüssigkeit,
einer nichtwässrigen
Flüssigkeit,
einer Öl-in-Wasser-Emulsion oder Wasser-in-Öl-Flüssigkeitsemulsion
präsentiert
werden. Derartige Zusammensetzungen können durch beliebige pharmazeutische
Verfahren hergestellt werden, doch umfassen alle Verfahren die Stufe
des Inverbindungbringens des Wirkstoffs mit dem Träger, der
einen oder mehrere notwendige Bestandteile bildet. Allgemein werden
die Zusammensetzungen durch gleichförmiges und inniges Mischen
des Wirkstoffs mit flüssigen
Trägern
oder fein zerteilten festen Trägern
oder beiden und dann, falls nötig,
Formen des Produkts zur gewünschten
Zubereitung hergestellt.
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Weitere
Merkmale der vorliegenden Erfindung werden im folgenden Beispiel
bzw. in den folgenden Beispielen vollständiger beschrieben. Selbstverständlich ist
diese detaillierte Beschreibung jedoch nur für die Zwecke von Beispielen
der vorliegenden Erfindung eingearbeitet und sie sollte in keinster
Weise als eine Beschränkung
der breiten Beschreibung der Erfindung, die oben angegeben ist,
verstanden werden.
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Beispiel 1
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Klonierung und Expression
des GST-E6/E7-Fusionsproteins
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Ein
Molekül,
das aus HPV-16-E6- und -E7-Sequenzen als "in-frame"-Fusion bestand,
wurde wie im Folgenden angegeben erzeugt. Ein Klon von HPV-16-DNA,
der sowohl E6- als auch E7-Genomsequenzen enthielt, diente als Templat
zur getrennten PCR-Amplifikation von E6 und E7 unter Verwendung
der Oligonucleotide:
- (a) (5')CGCTCGAGAGATCTCATATGCACCAAAAGAGAACTGC(3') und
- (b) (5')CGCCCGGGCAGCTGGGTTTCTCTACGTG(3') für E6; und
- (c) (5')CGCCCGGGATGCATGGAGATACACCTACATTGCATG(3') und
- (d) (5')CGGTCGACGGATCCTGGTTTCTGAGAACAGATGGG(3') für E7.
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Eine
SmaI-Erkennungsstelle am 3'-Ende
von E6 und 5'-Ende
von E7 ermöglichte
die Fusion und führte zwei
zusätzliche
Aminosäuren
(Prolin und Glycin) zwischen E6 und E7 ein. Weitere Restriktionsenzymerkennungsstellen
an den 5'- und 3'-Grenzen des Fusionsmoleküls (die
in die Oligonucleotide eingeführt
wurden) unterstützten
anschließende
Klonierungsverfahren.
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Die
fusionierte E6/E7-Sequenz wurde als BglII-BamHI-Fragment in den
Vektor pDS56 (Stuber et al., EMBO J.; (1984) 3:3143–3148) kloniert,
was eine in-frame-3'-hexa-his(hh)-Sequenz
ergab. Aus dieser wurde E6/E7hh als EcoRI/HindIII-Fragment entfernt
und in pGEM7+3, das durch Insertion des BamHI/HindIII-Bereichs des
pGEM3-Zf(+)(Promega)-Polylinkers in die BamHI/HindIII-Stelle der
multiplen Klonierungsstelle des pGEM7-Zf(+)(Promega)-Vektors erzeugt
wurde, subkloniert. E6/E7hh wurde dann aus pGEM7+3 als EcoRI/SalI-Fragment
entfernt und in die multiple Klonierungsstelle von pGEX-4T-1 (Pharmacia)
unter Bildung von pGEX-4T-1 E6/E7hh insertiert. Dieses Plasmid wurde
zur Transformation einer Vielzahl von E. coli-Stämmen, die TOPP2 (Stratagene)
und BL2I (Amrad/Pharmacia) umfassen, verwendet. Beide Arten transformierter
Zellen produzierten eine signifikante Menge Fusionsprotein nach
IPTG-Induktion (2). Das Fusionsprotein (GST
E6/E7hh, schematisch in 1a dargestellt)
lag im erwarteten Größenbereich
von etwa 60 kDa. Die Identität
des Proteins wurde durch Western-Blots, die mit zwei gegen E7 gerichteten
Antikörpern (LHIL.16E7.8F
und LHIL.16E7.6D, Tindle et al., Journal of General Virology (1990)
71:1347–1354)
sondiert wurden, festgestellt (3).
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Beispiel 2
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Klonierung und Expression
von E6/E7-Fusionsprotein
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Um
E6/E7hh als Protein, dem GST fehlt, zu exprimieren, wurde ein Terminationscodon
in pGEX-4T-1 E6/E7hh an einer singulären BalI-Stelle 3' zum und in-frame
mit dem GST-Translationsinitiationscodon
unter Verwendung des phosphorylierten Linkers TGCTCTAGAGCA eingeführt. Nach
der Transformation des E. coli-Stamms BL21 mit diesem neuen Plasmid
([GST]E6/E7hh) wurde eine signifikante Proteinmenge (E6/E7hh, schematisch
in 1b dargestellt) nach IPTG-Induktion mit einer
Größe von etwa
33 kD, die der erwarteten Größe eines
E6/E7hh-Fusionsproteins entspricht, produziert (2).
Die Identität
dieses Proteins wurde durch Western-Blot unter Verwendung der gleichen monoklonalen
Antikörper
wie in Beispiel 1 festgestellt (3).
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Beispiel 3
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Klonierung und Expression
deletierter Formen (nicht voller Länge) von E6 und E7
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- (i) Konstruktion von ΔE6C/ΔE7N
E6/E7 voller Länge in pGEM3
(Promega) diente als Templat zur PCR-Amplifikation deletierter Formen
von E6/E7 unter Verwendung der Oligonucleotide 5'GCGCGAATTCTATTAAGGAGCCCGGGATGGGGAATCCATATGCTGTAT3' und 5'CGCGAGATCTCCGAAGCGTAGAGTCACACTTG3'. Die erhaltene gestutzte
Form von E6/E7, der Sequenzen (189 bp) am N-Terminus von E6 und
C-Terminus von E7 (96 bp) fehlten, wurde in pGEX-4T-1, das einen
Terminationscodon in der GST-Sequenz enthielt, subkloniert, wobei
[GST]ΔE6C/ΔE7Nhh produziert wurde.
Dieses Plasmid wurde zur Transformation des E. coli-Stamms BL21
verwendet. Transformierte Zellen exprimierten eine signifikante
Menge eines Fusionsproteins (ΔE6C/ΔE7Nhh, schematisch
in 1c dargestellt) nach IPTG-Induktion
(4a), wobei ein Protein der näherungsweisen erwarteten Größe (20 kD)
produziert wurde. Die Identität dieses
Proteins wurde durch Western-Blot unter Verwendung der gleichen
monoklonalen Antikörper
wie in Beispiel 1 festgestellt (4b).
- (ii) Konstruktion von ΔE7C/ΔE6N
Unter
Verwendung der Oligonucleotide (a) in Beispiel 1 und von 5'CGCCCGGGTAATGTTGTTCCATACAAACTA3' wurde eine N-terminale
Repräsentante
von E6, die 285 bp umfasste, aus dem gleichen HPV-16-Klon, der in
Beispiel 1 verwendet wurde, amplifiziert. Ebenso wurden die Oligonucleotide
5'CGCCCGGGGAGGAGGAGGATGAAATAGATG3' und (d) in Beispiel
1 zur Produktion einer C-terminalen E7-Sequenz von 198 bp verwendet.
Diese wurden jeweils stumpfendig in pGEM7-Zf(+)(Promega) kloniert.
Eine Fusionskassette wurde durch Restriktion des E6-Klons mit KpnI/BglII und
Insertion der E7-Sequenz strangaufwärts als KpnI/BamHI-Fragment gebildet.
Diese fusionierte Sequenz wurde dann mit SmaI- und BglII-Klonierungsstellen
zur Insertion in pGEX-4T-1, das einen Terminationscodon in der GST-Sequenz enthält, erneut
amplifiziert, wobei [GST] ΔE7C/ΔE6Nhh produziert
wurde. Nach Transformation in E. coli-BL21 wurde die Proteinproduktion
durch PAGE und anschließende
Coomassie-Anfärbung
und Western-Blotting getestet (5a und 5b).
Ein Protein (ΔE7C/ΔE6Nhh, schematisch
in 1d dargestellt) der erwarteten
Größe (20 kD)
war auf Western-Blots offensichtlich.
-
Beispiel 4
-
DNA-Sequenzierung von
E6/E7-Konstrukten voller Länge
und -Deletionskonstrukten
-
E6/E7-Konstrukte
wurden in beiden Richtungen durch das Didesoxyverfahren unter Verwendung
von Primern, die überlappende
Sequenzinformation erzeugten, sequenziert. Das T7SequencingTM Kit (Pharmacia) wurde zur Erzeugung von
durch eine 35S-markierte Kette terminierten
Fragmenten verwendet, die auf einer Sequi-GenTM (Biorad)-Elektrophoresegelvorrichtung
analysiert wurden. Die DNA- und entsprechenden Aminosäuresequenzen
für E6/E7hh
(PPV162.DNA), ΔE6C/ΔE7Nhh (CAD600.SEQ)
und ΔE7C/ΔE6Nhh (C620.TXT) sind
im Folgenden angegeben.
- Datei: PPV162.DNA
- Bereich: 1–801
Modus: normal
- Codontabelle: Universal
- Datei:
CAD600.SEQ
- Bereich: 1–519
Modus: normal
- Codontabelle: Universal
- Datei:
C620.TXT
- Bereich: 1–519
Modus: normal
- Codontabelle: Universal
-
Beispiel 5
-
Immunogenität des E6/E7hh-Proteins
-
A. Reinigung von E6/E7hh
-
E.
coli-Zellen (Stamm BL21) die das [GST]E6/E7hh-Plasmid enthielten,
wurden unter Verwendung von 0,1–0,5
mM IPTG induziert und 3–4
h nach der Induktion geerntet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation
niedriger Geschwindigkeit pelletisiert und das E6/E7hh-Protein enthaltende
Einschlusskörper
wurden durch Ultraschallbehandlung und Zentrifugation isoliert.
Das Einschlusspellet wurde in 7M Harnstoff oder 6M Guanidin-HCl
solubilisiert und Nickelchelat-Säulenchromatographie
(Porath et al., Biochemistry 22, 1621–1630, 1983) unterzogen. Protein
wurde unter Verwendung von entweder einem zunehmenden Imidazolgradienten oder
abnehmenden pH-Gradienten eluiert und Fraktionen, die E6/E7hh enthielten,
wurden gepoolt und gegen 25 mM Tris, 0,5M NaCl, 1 % NOG, 10 mM DTT,
pH 7,5, dialysiert. Die Identität
und Reinheit des dialysierten Produkts wurde durch Coomassie-angefärbte Polyacrylamidgelelektrophorese
und Western-Blot unter Verwendung der in Beispiel 1 angegebenen
monoklonalen Antikörper
bestimmt (6a und 6b).
-
B. Immunogenität von E6/E7hh
-
Am
Tag 0 wurden zwei Gruppen von 5 C57BL/6-Mäusen (8 Wochen alt, weiblich)
subkutan an der Schwanzbasis mit 0,1 ml einer Formulierung, die
6 μg ISCOMATRIXTM, 19 μg
E6/E7hh (wie in A. oben gereinigt) in PBS, pH 7,2, enthielt, geimpft.
Eine zweite Dosis der Formulierung wurde am Tag 14 der Gruppe 1
und am Tag 17 der Gruppe 2 verabreicht. Am Tag 21 und 24 wurde den
Mäusen
in der Gruppe 1 bzw. 2 Blut entnommen. Serum-Antikörperreaktionen
gegenüber
E6/E7hh wurden dann unter Verwendung des im Folgenden angegebenen
Festphasen-EIA ermittelt.
-
Nunc
MaxiSorp EIA-Platten wurden mit E6/E7hh durch Inkubation von 0,1
ml/Vertiefung einer 10 μg/ml Lösung in
4M Harnstoff in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,5, 2 h bei 37 °C beschichtet.
Die Flüssigkeit
wurde entfernt und die Platten wurden ferner bei 37 °C 1 h mit
0,2 ml/Vertiefung von 1 mg/ml Kasein in PBS, pH 7,2, inkubiert.
Nach 6 Waschvorgängen
wurden 0,1 ml/Vertiefung Testserum (verdünnt in PBS, pH 7,2, 1 mg/ml
Kasein, 0,5 % Tween 20, 0,002 % Alphazurin A) zugegeben und die
Platten 1 h bei 37 °C
inkubiert. Die Platten wurden dann erneut 6 x mit PBS, pH 7,2, 0,5
% Tween 20, gewaschen. Zur Detektion von gebundenem Antikörper wurden
0,1 ml von 0,1 μg/ml
KPL-Meerrettichperoxidase-markiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG+IgM (H- und
L-kettenspezifisch) in PBS, pH 7,2, 1 mg/ml Kasein, 0,5 % Tween
20, 0,002 % Alphazurin A zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten
wurden 1 h bei 20 °C
inkubiert, 6 x mit PBS, pH 7,2, 0,5 % (V/V) Tween 20 gewaschen und
dann wurden 0,1 ml Enzymsubstrat (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin/H2O2-Formulierung,
gekauft von KPL) zugegeben. Nach 10 min Inkubation bei 20° wurde die
Reaktion durch Zugabe von 50 μl
0,5M H2SO4 gestoppt.
Das farbige Produkt wurde dann bei 450 nm in einem Vertikalstrahlspektrophotometer
gemessen. Titer wurden als Kehrwert der Serumverdünnung, die
zu einem Wert der optischen Dichte von 0,1 führte, ausgedrückt.
-
Die
Tabelle 1 zeigt, dass alle Mäuse
der beiden Gruppen 1 und 2 eine signifikante Antwort nach Immunisierung
produzierten. Titer reichten von 3,17 bis 5,66 (ausgedrückt als
log10 des Kehrwerts der Verdünnung, die
zur optischen Dichte von 0,1 in dem oben beschriebenen Festphasen-EIA
führte).
Vorher existierende Antikörperkonzentrationen
waren niedrig oder nicht detektierbar (gemessen in Seren, die am
Tag 0 unmittelbar vor der Impfung erhalten wurden).
-
Es
ist klar, dass das E6/E7hh-Fusionsprotein hoch immunogen ist, wenn
es Mäusen
durch dieses Verfahren verabreicht wird.
-
Ebenso
wurde ermittelt, dass E6/E7hh spezifische Überempfindlichkeit des verzögerten Typs
(DTH) nach einer Dosis einer Formulierung, die E6/E7hh plus ISCOMTM-Adjuvans enthielt, hervorrief. Die Mäuse produzierten
spezifische DTH-Reaktionen
auf sowohl E6 als auch E7, wenn sie im Ohr mit kleinen Dosen von
gereinigtem GST-E6- oder GST-E7-Proteinen
stimuliert wurden.
-
Tabelle
1 Log der Verdünnung
auf 0,1 OD
-
Beispiel 6
-
Transformationsuntersuchungen
des E6/E7-Genkonstrukts
-
Ein
E6/E7-Fusions-DNA-Konstrukt wurde in die multiple Klonierungsstelle
des Plasmidvektors pJ4Ω (Wilkinson
et al., J. Exp. Med. (1988) 167:1442–58) als BamHI-Fragment subkloniert,
wobei pJ4Ω E6/E7
hergestellt wurde. Für
Vergleichszwecke wurden pJ4Ω-Vektoren,
die HPV16 E6 (pJ4ΩE6)-
und HPV16 E7 (pJ4ΩE7)-ORFs
enthielten, verwendet. Wenn Neomycinselektion erforderlich war,
wurde der pcDNA3-Vektor (Invitrogen), der einen Neomycinresistenzmarker
enthielt, verwendet. Diese Plasmide wurden in E. coli amplifiziert
und Plasmid-DNA wurde durch alkalische Lyse extrahiert und auf einem
Harz (Qiagen) gereinigt, eluiert, durch Ethanol gefällt und
in H2O resuspendiert. Die DNA-Menge und
-Reinheit wurde durch spektrophotometrische Messung bei 260 und
280 nm bestimmt. Die DNA-Integrität wurde durch Elektrophorese
in 1 % Agarosegelen und Ethidiumbromidanfärbung überprüft. Targetzellen zur Transformation
waren Maus-NIH-3T3-Zellen (CSL Biosciences). Die Zellen wurden routinemäßig auf
Minimal Essential Medium (Eagle), das mit nicht-essentiellen Aminosäuren, 2
mM Glutamin und 10 % fetalem Rinderserum (Wachstumsmedium) ergänzt war,
vermehrt.
-
Die
Transfektion von NIH-3T3-Zellen mit Plasmid-DNA wurde im Wesentlichen
gemäß der Beschreibung
in dem Promega Technical Bulletin No. 216 unter Verwendung von TfxTM-50 zur Verstärkung der DNA-Aufnahme durchgeführt. Typische
Transfektionsgemische enthielten 5 μg Testplasmid (pJ4ΩE6/E7, pJ4ΩE7 oder
pJ4ΩE6
und pJ4ΩE7)
und, wenn erforderlich, 0,1 μg
pcDNA3. Wenn pJ4ΩE6
und pJ4ΩE7
cotransfiziert wurden, wurden 2,5 μg von jedem verwendet.
-
Die
Zellen wurden auf etwa 80 % Konfluenz gezüchtet, das Wachstumsmedium
wurde entfernt und Plasmid-DNA, die mit TfxTM-50
in einem Verhältnis
von 4:1 in Minimal Essential Medium gemischt war, wurde zugegeben
und die Zellen wurden bei 37 °C
inkubiert.
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Nach
1–2 h
Inkubation bei 37 °C
wurde das Transfektionsgemisch entfernt und frisches Wachstumsmedium
zugegeben. Nach 48 h Inkubation bei 37 °C wurden transfizierte Zellen
durch Trypsinisierung entfernt und entweder auf Koloniebildung in
Weichagar getestet oder weitere 24 h bei 37 °C inkubiert, bevor Neomycinselektion
angewandt wurde.
-
Zum
Test auf Koloniebildung in Weichagar wurden die trypsinisierten
Zellen mit einer Dichte von 1-5 x 105 Zellen/ml
in RPMI 1640, das mit 10 % FBS, 2 mM Glutamin, 10 mM Hepes und 0,084
% NaHCO3 ergänzt war (RPMI 1640+) und 0,4
% Agarose (Seaplaque low gelling temperature, FMC Bioproducts, USA)
enthielt, das bei einer Temperatur von 37 °C gehalten wurde, resuspendiert.
Nach dem Mischen wurden 2,5 ml dieser Suspension zu jeder Vertiefung
einer 6-Vertiefungen-Schale (Nunc) gegeben und absetzen gelassen.
Die Schalen wurden dann über
einen Zeitraum von 10–14
Tagen bei 37 °C
in einer Atmo- sphäre von 5
% CO2 inkubiert, bevor Kolonien unter Verwendung
eines invertierten Lichtmikroskops gezählt wurden.
-
Die
Selektion auf neomycinresistente Kolonien wurde an subkonfluenten
Zellmonoschichten unter Verwendung von RPMI 1640+, das 700 μg/ml Neomycin
(Geneticin) enthielt, durchgeführt.
Die Monoschichten wurden bei 37 °C
in einer Atmosphäre
von 5 % CO2 10–14 Tage inkubiert, bevor neomycinresistente
Kolonien unter Verwendung eines invertierten Lichtmikroskops gezählt wurden.
Nach dem Zählen
wurden die Kolonien durch Trypsinisierung dispergiert und auf Koloniebildung
in Weichagar wie oben beschrieben getestet. Die Ergebnisse eines
Neomycinselektionsexperiments nach Transfektion von 3T3-Zellen mit
verschiedenen Plasmidkonstrukten sind in Tabelle 2 angegeben.
-
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass die E6/E7-Fusion im Vergleich zu E7 oder
E6 + E7 nur schwach transformierend ist. Sowohl die Koloniezahlen
als auch das Zellwachstum für
die E6/E7-Fusion
waren niedrig im Vergleich zu den nicht-fusionierten Wildtyp-Sequenzen.
Dies zeigt, dass eine Folgeerscheinung der Fusion der E6- und E7-Sequenzen
die Beeinträchtigung
der Fähigkeit
dieser Sequenzen zur Förderung
der Zelltransformation ist.
