DE69521331T2

DE69521331T2 - Nukleinsäure-einbringungssystem

Info

Publication number: DE69521331T2
Application number: DE69521331T
Authority: DE
Inventors: Jesus Fominaya; Winfried Wels
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-11-01
Filing date: 1995-10-31
Publication date: 2001-09-20
Anticipated expiration: 2015-11-01
Also published as: US6498233B1; JPH09511916A; EP0789776A1; AU3926895A; DE69521331D1; NZ295673A; WO1996013599A1; EP0789776B1; AU695196B2; ATE202145T1

Description

Die Erfindung betrifft ein Nucleinsäuretransfersystem, das dazu geeignet ist, eine Nucleinsäure, z. B. ein Gen, gezielt zu einer spezifischen Zelle zu bringen, und die Expression dieser Nucleinsäure zu erhalten. Das Nucleinsäuretransfersystem der Erfindung umfasst eine Multidomänen-Proteinkomponente und eine Nucleinsäurekomponente. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung das Multidomänen-Protein, eine Nucleinsäure, die das Protein codiert, geeignete Amplifikations- und Expressionssysteme für die Nucleinsäure und Verfahren zur Herstellung und Verwendung der obigen Gegenstände.
Ein Gentransfer in eukaryotische Zellen kann erreicht werden unter Verwendung von Virenvektoren, z. B. rekombinanten Adenoviren oder nicht viralen Gentransfervektoren. Wegen verschiedener Nachteile, z. B. Beschränkungen bei der Größe der abzugebenden DNA, der Unfähigkeit, fertig differenzierte Zellen zu transduzieren, möglicher Sicherheitsbedenken und einer unzureichenden Ansteuerbarkeit scheinen solche viralen DNA- Transfersystem von begrenztem Nutzen bei Gentherapiestrategien zu sein. Als Alternative zu viralen Systemen wurden über Liganden vermittelte Annäherungen über molekulare Konjugatvektoren entwickelt. Solche molekularen konjugierten Vektoren umfassen das DNA-Molekül, das transferiert werden soll, und einen für die Zielzelle spezifischen Liganden, der chemisch an ein Polykation gekuppelt ist, insbesondere ein Polyamin (zur Übersicht siehe z. B. Michael & Curiel, Gene Therapy 1: 223, 1994). Das Polykation bindet an die DNA über elektrostatische Kräfte, und bewirkt damit, dass der Ligand an dem abzugebenden Gen gebunden wird. Z. B. wurden humanes Transferrin oder Geflügelconalbumin kovalent an Poly-L-lysin oder Protamin über eine Disulfidbindung gebunden. Komplexe des Protein-Polykation-Konjugats und eines bakteriellen Plasmids, das ein Luciferase codierendes Gen enthält, wurden eukaryontischen Zellen zugeführt, was zur Expression des Luciferasegens führte (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410, 1990). Um höhere Grade an Genexpression zu erreichen, wurden Adenovirusteilchen chemisch an den Komplex gekuppelt (siehe z. B. Curiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8850, 1991 Christiano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11548, 1993). Molekulare konjugierte Vektoren haben jedoch auch Beschränkungen, unter anderem die erhebliche Größe, Inhomogenität, Mangel an Spezifität bezüglich der Bindung an die DNA-Komponente und nichtspezifische Bindung aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen zwischen Polykation und Zellmembran, was die Zielsteuerung, die durch den Liganden erreicht wird, zumindest teilweise neutralisiert.
Es besteht daher ein Bedarf für ein einfaches, effizientes Nucleinsäuretransfersystem, mit dem z. B. eine zielzellspezifische Einführung von Nucleinsäuren, die exprimiert werden sollen, möglich ist, dem aber die Nachteile der Konzepte des Standes der Technik fehlen.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein solches System bereitzustellen. Das Nucleinsäuretransfersystem gemäß der Erfindung ist durch die folgenden zwei Komponenten gekennzeichet:
1. Ein Multidomänen-Protein mit verschiedenen funktionellen Domänen, unter anderem einer Nucleinsäure bindenden Domäne
2. Eine Effektornucleinsäure, insbesondere DNA, die die Nucleinsäure, z. B. das Gen, das abgegeben werden soll und in einer ausgewählten Zielzelle exprimiert werden soll, und eine Kognatstruktur umfasst, die von der Nucleinsäurebindungsdomäne des Proteins erkennbar ist.
Die Multidomänen-Proteinkomponente kombiniert in einem einzigen Molekül eine Zielzellen-Erkennungsfunktion, auch als Ligandendomäne bezeichnet, eine Endosomen-Vermeidungsfunktion und eine Nucleinsäure-Bindungsfunktion, insbesondere eine DNA-Bindungsfunktion. Ein solches Protein tritt in der Natur nicht auf. Die Nucleinsäure-Bindungsfunktion dient dazu, die spezifische, hochaffine, nicht kovalente Wechselwirkung der Proteinkomponente mit der Effektornucleinsäurekomponente zu vermitteln. Im Unterschied zu den oben beschriebenen molekularen konjugierten Vektoren des Standes der Technik wird der Protein/Nucleinsäurekomplex der vorliegenden Erfindung durch spezifische Wechselwirkung der Nucleinsäure-Bindungsdomäne mit ihrer Kognatstruktur oder Erkennungsstruktur auf der Effektornucleinsäure gebildet. Vorteilhafterweise übertrifft die Bindungsaffinität der proteinartigen Nucleinsäure-Bindungsdomäne für ihre Kognatstruktur auf der Effektornucleinsäure die Affinität der proteinartigen Zielzell-Erkennungsfunktion für ihre Kognatmolekularstruktur auf der Zielzelle. Innerhalb des Nucleinsäuretransfersystems der vorliegenden Erfindung kann die Effektornucleinsäurekomponente z. B. ein vollständiges Plasmid oder ein Teil davon sein, das die in der Zielzelle zu exprimierende Nucleinsäure trägt. Das Nucleinsäureabgabesystem oder Nucleinsäureübertragungssystem der Erfindung ist so aufgebaut, dass die Rate des Nucleinsäuretransfers optimiert ist.
Vorteilhafterweise macht das vorliegende System Verwendung von der physiologischen Zielzelle inhärenten Mechanismen des makromolekularen Transports unter Einbeziehung von Endosomen, insbesondere die durch Rezeptor vermittelte Endocytose. Der erfindungsgemäße Protein/Nucleinsäurekomplex ist steuerbar, da er wirksam nur von einem vorbestimmten Zelltyp oder einer vorbestimmten Zellpopulation, die eine Molekülstruktur, z. B. einen Rezeptor trägt, die/der spezifisch mit der Zielzellen- Erkennungsfunktion dieses Komplexes eine Wechselwirkung eingeht, effizient internalisiert werden kann. Nach dem Eintritt in die Zelle wird der Protein/Nucleinsäurekomplex der Erfindung in Endosomen lokalisiert, von wo er in das Cytoplasma freigegeben wird. Aufgrund der selektiven Internalisierung des Protein/Nucleinsäurekomplexes erfolgt die Expression der jeweiligen von dem erfindungsgemäßen Komplex abzugebenden Nucleinsäure(n) in einer Art und Weise, die (transfizierte) Zielzellen von (nicht transfizierten) Nichtzielzellen unterscheidet, z. B. ist die Expression im Wesentlichen auf die vorbestimmte Zielzelle beschränkt. Die zu der Zielzelle zu transportierende und darin zu exprimierende Nucleinsäure kann therapeutisch aktiv sein oder ein therapeutisch aktives Produkt codieren, z. B. können Tumorzellen transfiziert werden, um ein Gen einzuführen, das ein therapeutisch aktives Protein codiert.
Genauer betrifft die vorliegende Erfindung ein Zwei-Komponenten-System für die zielzellspezifische Abgabe und Aufnahme eines nicht kovalent gebundenen Protein/Nucleinsäurekomplexes, der zur Expression einer oder mehrerer Nucleinsäuren, aus denen die übertragene Effektornucleinsäure aufgebaut ist, in den Zielzellen führt. Bevorzugt besteht ein solches System der Erfindung im Wesentlichen aus einem Protein/Nucleinsäurekomplex mit zwei Komponenten:
- eine Polypeptidkette, die mehrere verschiedene funktionelle Domänen eukaryontischen, prokaryontischen oder synthetischen Ursprungs enthält und
- eine Effektornucleinsäure.
Vorteilhafterweise ist der Protein/Nucleinsäurekomplex in physiologischen Flüssigkeiten ausreichend stabil, um seine Anwendung in vivo zu ermöglichen. Der Komplex der Erfindung ist ein Molekülkomplex, dessen Stöchiometrie im Wesentlichen von der Anzahl der Kognatstrukturen der Protein/Nucleinsäure- Bindungsdomäne auf der Effektornucleinsäure bestimmt wird. Es wird z. B. angenommen, dass die Kognatstruktur der Hefe-GAL4- Bindungsdomäne ein Proteindimer bindet. Das Verhältnis von Multidomänen-Protein zu Effektornucleinsäure in dem Komplex der Erfindung ist somit 2 : 1, wenn eine Nucleinsäure-Bindungsdomäne verwendet wird. Es ist jedoch bevorzugt, Nucleinsäuren zu verwenden, die Mehrfachsequenzen enthalten (bevorzugt 2 bis 8, die die Nucleinsäure-Bindungsdomäne erkennen).
Ein erfolgreicher Transfer und eine erfolgreiche Expression der gewünschten Nucleinsäure hängt von der spezifischen Wechselwirkung des Protein/Nucleinsäurekomplexes mit der Zielzelle und dem wirksamen Transfer der interessierenden Nucleinsäure durch systemische oder subzelluläre Barrieren ab. Um zu untersuchen, ob der erfindungsgemäße Komplex in die oder innerhalb der Zielzelle transportiert wird, kann der Komplex in geeigneter Weise markiert sein und seine Akkumulation auf und in den Zellen kann z. B. durch Fluoreszenzbildgebung nachgewiesen werden. Der Komplex kann z. B. Fluoreszenz-markiert sein und seine zelluläre Lokalisierung kann sichtbar gemacht werden z. B. durch Video-verstärkte Mikroskopie und quantitatives konfokales Laserscanning. Andere Assays, die zur Bestimmung der Funktionalität des Nucleinsäuretransfersystems der Erfindung geeignet sind, z. B. ein Assay für die Expression eines abgegebenen Reportergens, werden in den Beispielen beschrieben. Weitere Assays sind im Stand der Technik und dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt.
Das Nucleinsäureabgabesystem der Erfindung sorgt unter anderem für einen effizienten Gentransfer, indem es z. B. den Transit des Gens durch die eukaryontische Zellplasmamembran, den Transport zum Kern, den Eintritt in den Kern und die funktionelle Aufrechterhaltung innerhalb des Kerns ermöglicht. Die Persistenz der Genexpression kann entweder durch stabile Chromosomenintegration heterologer DNA oder durch Erhalt eines extrachromosomalen Replikons erreicht werden. Bevorzugt fehlen dem System der Erfindung Sequenzen, die Sicherheitsbedenken aufwerfen, z. B. komplette virale Genome, die autonom repliziert werden können oder virale Onkogene enthalten. Ein System der vorliegenden Erfindung kann so aufgebaut sein, dass es ein sicheres, nicht toxisches und wirksames in-vivo-Nucleinsäuretransfersystem liefert.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung das oben angegebene Multidomänen-Protein, das spezifisch an eine Effektornucleinsäure, wie erfindungsgemäß definiert, über seine Nucleinsäure-Bindungsdomäne binden kann, und die Einführung der Effektornucleinsäure in eine Zielzelle vermitteln kann.
Das Multidomänen-Protein der Erfindung, das eine oder mehrere Polypeptidketten umfasst, wird erzeugt unter Verwendung chemischer und/oder rekombinanter Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind. Bevorzugt ist das Protein ein rekombinantes Einzelkettenprotein.
Die funktionellen Domänen, die das Protein der Erfindung kennzeichnen, sind:
(1) eine Zielzell-spezifische Bindungs- oder Ligandendomäne, die eine Zelloberflächenstruktur erkennt, z. B. eine antigene Struktur, ein Rezeptorprotein oder ein anderes Oberflächenprotein, die/das eine Internalisierung eines gebundenen Liganden vermittelt,
(2) eine Translokationsdomäne, die das Entweichen der Effektornucleinsäure aus endocytischen Vesikeln nach Internalisierung des Komplexes in Zielzellen erleichtert, z. B. durch Rezeptor vermittelte Endocytose,
(3) eine Nucleinsäure-Bindungsdomäne, die mit hoher Affinität eine definierte Struktur der Effektornucleinsäurekomponente erkennt und bindet, z. B. eine spezifische DNA-Sequenz auf einem geeigneten eukaryontischen Expressionsplasmid oder ein geeignetes lineares DNA-Fragment und gegebenenfalls
(4) ein Retentionssignal für das endoplasmatische Reticulum, das den intrazellulären Weg des internalisierten Protein/Nucleinsäurekomplexes beeinflusst und
(5) ein Kernlokalisierungssignal
Besonders bevorzugt gibt es
- ein Multidomänen-Protein, das als funktionelle Domänen eine zielzellspezifische Bindungsdomäne, eine Translokationsdomäne und eine Nucleinsäure-Bindungsdomäne umfasst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Translokationsdomäne von Diphtherietoxin ableitbar ist und nicht den Teil des Toxinmoleküls beinhaltet, der zu der cytotoxischen Wirkung des Moleküls beiträgt oder
- ein Multidomänen-Protein, das als funktionelle Domänen eine zielzellspezifische Bindungsdomäne, eine Translokationsdomäne und eine Nucleinsäure-Bindungsdomäne umfasst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Translokationsdomäne von bakteriellen Toxinen ableitbar ist und die zielzellspezifische Bindungsdomäne, die einen Zelloberflächenrezeptor erkennt, aus der Gruppe der mit den EGF-Rezeptoren verwandten Familie der Wachstumsfaktorrezeptoren ausgewählt ist oder
- ein Multidomänen-Protein, das als funktionelle Domänen eine zielzellspezifische Bindungsdomäne, eine Translokationsdomäne und eine Nucleinsäure-Bindungsdomäne umfasst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Translokationsdomäne von einem bakteriellen Toxin abgeleitet ist und die zielzellspezifische Bindungsdomäne einen Zelloberflächenrezeptor auf den Effektorzellen des Immunsystems erkennt.
Innerhalb des Multidomänen-Proteins der Erfindung wirken die oben angegebenen unabhängigen Komponenten in konzertierter Weise, um eine zielgerichtete, äußerst effiziente Internalisierung einer interessierenden Nucleinsäure, die von einer Effektornucleinsäure geliefert wird, z. B. durch ein eukaryontisches Expressionsplasmid, zu einer ausgewählten Zelle oder Zellpopulation zu erreichen, was zu der erfolgreichen Expression der interessierenden Nucleinsäure beiträgt. Die Anordnung der Domänen der Komponente wird gemäß der Funktionalität der einzelnen Domänen ausgewählt. In einer Ausführungsform der Erfindung unter Verwendung einer Translokationsdomäne, die von einem Toxin abgeleitet ist, z. B. P. aeruginosa exotoxin A oder Diphtherietoxin, kann die Anordnung der Domänen in N- zu C-terminaler Reihenfolge wie folgt sein: Liganden- Bindungsdomäne - Translokationsdomäne - Nucleinsäure-Bindungsdomäne - (gegebenenfalls) Retentionssignal für das endoplasmatische Reticulum.
Das erfindungsgemäße Protein kann eine oder mehrere erfindungsgemäße Domänen umfassen, die der gleichen Funktion dienen. Um z. B. die Bindung der Effektornucleinsäure zu erleichtern, kann das Protein eine oder mehrere Nucleinsäure-Bindungsdomänen umfassen, die die gleiche oder verschiedene Kognatstrukturen auf der Effektornucleinsäure erkennen. Das Protein kann eine oder mehrere Ligandendomänen umfassen mit der gleichen oder verschiedenen Spezifitäten. Wie die Beispiele zeigen, ist eine Kopie jeder funktionellen Domäne ausreichend für ein Multidomänen-Protein der Erfindung, um seine oben erwähnte Funktion zu erreichen.
Zusätzlich zu diesen funktionellen Domänen kann die Proteinkomponente ein oder mehrere, insbesondere ein, zwei, drei oder vier weitere Aminosäuresequenzen umfassen. Z. B. können solche Insertionen, die bevorzugt aus genetisch codierten Aminosäuren bestehen, vorteilhafterweise in das Multidomänen- Protein der Erfindung eingearbeitet werden, um als Linker oder Spacer zwischen den oben angegebenen funktionellen Domänen zu dienen. So verbindet das Insert die C-terminale Aminosäure einer funktionellen Domäne mit der N-terminalen Aminosäure einer weiteren funktionellen Domäne. Ein geeignetes Insert sollte die günstigen Eigenschaften des Multidomänen- Proteins als solches nicht stören. So kann z. B. ein Linker ein Peptid sein, das aus etwa 1 bis etwa 20 Aminosäuren besteht. Beispielhafte Insertionen schließen Peptide ein mit den Aminosäuresequenzen GluLysLeuGluSerSerAspTyrLysAspGluLeu (SEQ ID Nr. 40), HisHis, HisHisHisHis (SEQ ID Nr. 41), Ser- SerAspTyrLysAspGluLeu (SEQ ID Nr. 42) und weitere aus den Beispielen ersichtliche Sequenzen. Zusätzliche Aminosäuren können auch am N-Terminus des Multidomänen-Proteins eingeführt sein. Beispielhafte Aminosäuresequenzen schließen das FLAG-Epitop ein und sind als SEQ ID Nr. 1, 3 und 5 in den Beispielen angegeben.
Die zielzellspezifische Bindungsdomäne wird so ausgewählt, dass die gezielte Ansteuerung und zelluläre Internalisierung des Protein/Nucleinsäurekomplexes der Erfindung erreicht wird. Sie ermöglicht die spezifische Wechselwirkung des Protein/Nucleinsäurekomplexes der Erfindung mit einer ausgewählten Struktur auf der Zielzelle, wobei die Struktur die zelluläre Internalisierung z. B. durch das Verfahren der Endocytose vermittelt. Bevorzugt bindet die Domäne an die Zielzellen in einer Art und Weise, die mit einer Ligandenrezeptorvereinigung kompatibel ist, wodurch der Eintritt des Protein/Nucleinsäurekomplexes in die Zelle vermittelt wird. Bei dem Protein/Nucleinsäurekomplex der Erfindung behält die Ligandendomäne die Fähigkeit des "Stammproteins", von dem es stammt, an die Kognatstruktur, z. B. den Rezeptor, auf solche Art und Weise zu binden, dass eine Endocytose des Komplexes erreicht wird. Bevorzugt ist eine zielzellspezifische Bindungsdomäne, deren Erkennung und Bindung durch den geeigneten Zelloberflächenrezeptor die zelluläre Internalisierung des Protein/Nucleinsäurekomplexes über eine Rezeptor vermittelte Endocytose zulässt.
Eine Vorbedingung für ein proteinartiges Molekül dafür, dass es als Bindungsdomäne in dem Multidomänen-Protein der Erfindung geeignet ist, besteht darin, dass es an eine Oberflächenstruktur auf spezifischen Zielzellen bindet, wobei die Oberflächenstruktur die Internalisierung des Liganden in die Zielzelle über einen endocytischen Stoffwechselweg vermittelt und dass diese Eigenschaften bei dem Multidomänen-Protein der Erfindung nicht wesentlich beeinflusst werden.
Eine zielzellspezifische Bindungsdomäne, die eine Zelloberflächenstruktur erkennt, z. B. ein Rezeptorprotein oder ein Oberflächenantigen auf der Zielzelle, ist z. B. ableitbar von einem Liganden eines zellspezifischen Rezeptors, z. B. eines Fc-Rezeptors, Transferrinrezeptors, EGF-Rezeptors, Asialoglycoproteinrezeptors, Cytokinrezeptors, z. B. eines Lymphokinrezeptors, eines T-zellspezifischen Rezeptors, z. B. CD45, CD4 oder CD8, des CD3-Rezeptorkomplexes, des TNF-Rezeptors, CD25, erbB-2, eines Adhäsionsmoleküls, z. B. NCAM oder ICAM und Mucin. Geeignete Liganden schließen Antikörper ein, die für diese Rezeptoren oder Antigene spezifisch sind. Weitere Moleküle, die als Ligandendomäne für das Multidomänen-Protein der Erfindung geeignet sind, schließen Faktoren und Wachstumsfaktoren ein, z. B. Tumornekrosefaktor, z. B. TNF-α, menschlichen Wachstumsfaktor, epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), von Plättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF), transformierenden Wachstumsfaktor (TGF), z. B. TGF-α oder TGF-β, Nervenwachstumsfaktor, insulinartigen Wachstumsfaktor, ein Peptidhormon, z. B. Glucagon, Wachstumshormon, Prolactin oder Thyroidhormon, ein Cytokin, z. B. Interleukin, u. a. IL-2 oder IL-4, Interferon, z. B. IFN-g oder Fragmente oder Mutanten solcher Proteine, mit dem Vorbehalt, dass diese Fragmente und Mutanten die obigen Erfordernisse für eine Ligandendomäne erfüllen. Geeignete Antikörperfragmente schließen z. B. Fab- Fragmente, Fv-Konstrukte, z. B. einzelkettige Fv-Konstrukte (scFv) oder ein Fv-Konstrukt mit einer Disulfidbrücke und die variable Domäne der schweren Kette ein. Die Ligandendomäne kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein und variiert mit der jeweiligen Art der Zielzelle.
Besonders bevorzugt als zielzellspezifische Bindungsdomänen sind Domänen, die einen Zelloberflächenrezeptor erkennen (an ihn binden), der ausgewählt ist aus den Gruppen der mit dem EGF-Rezeptor verwandten Familie von Wachstumsfaktorrezeptoren. Solche Zelloberflächenrezeptoren sind z. B. TGFa-Rezeptor, EGF-Rezeptor, erbB2, erbB3 oder erbB4 (E. Pelles und Y. Yarden, Bioassays 15 (1993) 815-824). Als Bindungsdomänen bei dem Transfersystem bevorzugt sind Wachstumsfaktoren wie Herregulin, EGF, Betacellulin, TGF-α, Amphiregulin oder Heparin bindendes EGF, ebenso wie Antikörper gegen erbB2, erbB3, erbB4 oder EGF-Rezeptor.
Weiter bevorzugt sind Zelloberflächenstrukturen von Effektorzellen des Immunsystems, insbesondere T-Zellen. Solche Strukturen sind z. B. IL-2-Rezeptor, CD4 oder CD8.
Ob bei dem Multidomänen-Protein der Erfindung die Ligandendomäne die Kognatstruktur erkennen und binden kann, kann mit im Stand der Technik bekannten Methoden bestimmt werden. Z. B. kann ein kompetitiver Assay angewendet werden, um zu bestimmen, ob der Eintritt des Protein/DNA-Komplexes der Erfindung spezifisch über die zielzellspezifische Bindungsdomäne vermittelt wird. Wenn z. B. ein Überschuss des freien Liganden, der als Ligandendomäne dient, oder des freien Proteins, von dem die zielzellspezifische Bindungsdomäne abgeleitet ist, mit der Bindung, Endocytose und Kernlokalisierung des in geeigneter Weise markierten Komplexes konkurriert, wird die Bindung und das Eintreten des Komplexes in die Zelle spezifisch von der Zielkognateinheit des Komplexes vermittelt.
Eine bevorzugte Ligandendomäne ist z. B. eine Einzelkettenantigen-Bindungsdomäne eines Antikörpers, z. B. eine Domäne, die von der schweren Kette eines Antikörpers abgeleitet ist, und insbesondere ein einkettiger rekombinanter Antikörper (scFv). Bevorzugt ist die Antigen-Bindungsdomäne eine Einzelkette eines rekombinanten Antikörpers, die die variable Domäne der leichten Kette (VL) und, verbrückt über einen flexiblen Linker (Spacer), bevorzugt ein Peptid, die variable Domäne der schwere Kette (VH) umfasst. Vorteilhafterweise besteht das Peptid aus etwa 10 bis etwa 30 Aminosäuren, insbesondere natürlich vorkommenden Aminosäuren, z. B. etwa 15 natürlich vorkommenden Aminosäuren. Bevorzugt ist ein Peptid, das aus Aminosäuren besteht, die ausgewählt sind aus L-Glycin und L- Serin, insbesondere das Aminosäurepeptid mit 15 Aminosäuren, das aus drei repetitiven Einheiten von Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID Nr. 43) besteht. Vorteilhaft ist ein einzelkettiger Antikörper, bei dem VH am N-Ende des rekombinanten Antikörpers angeordnet ist. Die Antigen-Bindungsdomäne kann von einem monoklonalen Antikörper abgeleitet sein, z. B. einem gegen ein geeignetes Antigen auf einer Tumorzelle gerichteten und dafür spezifischen monoklonalen Antikörper.
Ein geeignetes Antigen ist ein Antigen mit einer verbesserten oder spezifischen Expression auf der Oberfläche einer Tumorzelle verglichen mit einer normalen Zelle, z. B. ein Antigen, das aus entsprechenden genetischen Veränderungen der Tumorzelle entsteht. Beispiele für geeignete Antigene schließen ductal-epitheliales Mucin, gp 36, TAG-72, Wachstumsfaktorrezeptoren und Glycosphingolipide und andere Kohlenhydratantigene, die bevorzugt auf Tumorzellen exprimiert werden, ein. Ductus-Epithelmucin wird verstärkt auf Brust-, Eierstock- und Pankreaskarzinomzellen exprimiert und wird z. B. von dem monoklonalen Antikörper SM3 erkannt (Zotter et al., Cancer Rev. 11, 55-101 (1988)). Das Glycoprotein gp 36 findet sich auf der Oberfläche von menschlichen Leukämie- und Lymphomzellen. Ein beispielhafter Antikörper, der dieses Antigen erkennt, ist SN 10. TAG-72 ist ein Pankarzinom-Antigen, das von dem monoklonalen Antikörper CC49 erkannt wird (Longenecker, Sem. Cancer Biol. 2, 355-356). Wachstumsfaktorrezeptoren sind z. B. der menschliche epidermale Wachstumsfaktor-(EGF)-Rezeptor (Khazaie et al., Cancer and Metastasis Rev. 12, 255-274 (1993)) und HER2, auch als erbB-2 oder gp 185 bezeichnet (A. Ullrich und J. Schlessinger, Cell 61, 203-212 (1990)). Der erbB-2-Rezeptor ist ein Transmembranmolekül, das in hohem Prozentanteil in menschlichen Karzinoma überexprimiert wird (N. E. Hynes, Sem. in Cancer Biol. 4, 19-2 6 (1993)). Die Expression von erbB-2 in normalem Gewebe von Erwachsenen ist gering. Dieser Unterschied in der Expression kennzeichnet den erbB-2-Rezeptor als "tumorverstärkt".
Bevorzugt ist die Antigen-Bindungsdomäne von einem monoklonalen Antikörper erhältlich, der durch Immunisierung mit lebenden menschlichen Tumorzellen erzeugt wird, die das Antigen in seiner nativen Form präsentieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bindet der Erkennungsteil des Multidomänen-Proteins der Erfindung spezifisch an eine antigene Determinante auf der extrazellulären Domäne eines Wachstumsfaktor-Rezeptors, insbesondere HER2. Monoklonale Antikörper, die gegen den HER2-Wachstumsfaktor-Rezeptor gerichtet sind, sind bekannt und werden z. B. von S. J. McKenzie et al., Oncogene 4, 543-548 (1990), R. M. Hudziak et al., Molecular and Cellular Biology 9, 1165-1172 (1989), der Internationalen Patentanmeldung WO 89/06692 und der Japanischen Patentanmeldung Kokai 02-150 293 beschrieben. Monoklonale Antikörper, die gegen menschliche Tumorzellen gezüchtet wurde, präsentieren HER2 in der nativen Form, z. B. als SKBR3-Zellen, wie z. B. in der Europäischen Patentanmeldung EP-A 502 812 beschrieben, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen wird, und schließen die Antikörper FRP5, FSP16, FSP77 und FWP51 ein (ECACC 90112115, 90112116, 90112117 und 90112118).
Am meisten bevorzugt ist der Einzelketten-Antikörper scFv (FRP5), der in den Beispielen und in SEQ ID Nr. 1 und 2 beschrieben wird.
Weiter bevorzugt als Ligandendomäne ist ein Kognatstruktur- Bindungsfragment, darvon einem Cytokin abgeleitet ist, insbesondere TGF-a oder Interleukin-2. Besonders bevorzugt ist ein TGF-a-Fragment mit der in SEQ ID Nr. 4 angegebenen Sequenz, wobei sich die Sequenz von der Aminosäure an Position 13 (Val) bis zu der Aminosäure an Position 62 (Ala) erstreckt. Ebenso bevorzugt ist ein IL-2-Fragment mit der in SEQ ID Nr. 6 angegebenen Sequenz, wobei sich die Sequenz von der Aminosäure an Position 18 (Ala) bis zu der Aminosäure an Position 150 (Thr) erstreckt.
Besonders bevorzugt sind die Ligandendomänen, die in den Beispielen angewendet wurden. Die Aminosäuresequenzen der mit sc (Fv) FRP5, TGF-a und IL-2 bezeichneten Domänen sind als SEQ ID Nr. 1, 3 bzw. 5 angegeben.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist eine Zielzelle eine Zelle, die über eine spezifische Zelloberflächenstruktur selektiv die zielzellspezifische Bindungsdomäne, die von dem Protein/Nucleinsäurekomplex der Erfindung gebildet wird, binden kann. Die Zelloberflächenstruktur kann ein Protein, ein Kohlenhydrat, ein Lipid oder eine Kombination davon sein. Vorteilhafterweise besitzt eine solche Zielzelle einen einzigartigen Rezeptor, der durch Bindung an die zielzellspezifische Bindungsdomäne des Multidomänen-Proteins der Erfindung die effiziente Internalisierung im Wesentlichen des Protein/Nucleinsäurekomplexes in die Zielzelle vermittelt.
Innerhalb des Multidomänen-Proteins der Erfindung dient die Translokationsdomäne dazu, das Entweichen der Nucleinsäure aus dem zellulären Vesikelsystem zu verstärken und somit den Nucleinsäuretransfer über diesen Weg zu erhöhen. Diese Domäne dient dazu, den lysosomalen Abbau nach der Internalisierung des Protein/Nucleinsäurekomplexes in die Zielzelle zu vermindern oder zu verhindern. WO 94/04696 beschreibt ein Nucleinsäuretransfersystem, bei dem als Translokationsdomäne und Rezeptor-Bindungsdomäne die Kognatdomänen von P. exotoxin A verwendet werden. Die-Transfektionseffizienz und Spezifizität solcher Transfersysteme ist jedoch sehr gering. Die Erfindung liefert daher ein verbessertes Nucleinsäuretransfersystem mit einer hohen Transfektionseffizienz und Spezifität. Geeignete Translokationsdomänen leiten sich von Toxinen, insbesondere bakteriellen Toxinen ab, z. B. Exotoxin A, Colicin A, d-Endotoxin, Diphtherietoxin, Bacillus-anthrox-Toxin, Choleratoxin, Pertussistoxin, E.-coli-Toxinen, Shigatoxin oder Shiga-artigem Toxin. Die Translokationsdomäne enthält nicht den Teil des Stammtoxinmoleküls, der dem Molekül die cytotoxische Wirkung vermittelt. Vorteilhafterweise wird die Translokationsdomäne des rekombinanten Proteins der Erfindung von dem Teil des Stammtoxins abgeleitet oder im Wesentlichen abgeleitet, der die Internalisierung des Toxins in die Zelle vermittelt, z. B. Aminosäuren 193 oder 196 bis 378 oder 384 des Diphtherietoxins. Der Teil des Toxins, der in dem Nucleinsäuretransfersystem der vorliegenden Erfindung verwendet wird, enthält daher keine zellbindende Domäne eines Toxins.
Die Nucleinsäure-Bindungsdomäne ermöglicht die spezifische Bindung der Proteinkomponente des Nucleinsäuretransfersystems der Erfindung an die Effektornucleinsäurekomponente des Komplexes. Die Wechselwirkung hoher Affinität der Nucleinsäure- Bindungsdomäne mit der entsprechenden Kognatstruktur auf der Effektornucleinsäure bindet den Zellerkennungsteil an den Expressionseffektorteil. Die Nucleinsäure-Bindungsdomäne kann eine RNA-Bindungsdomäne oder, bevorzugt, eine DNA-Bindungsdomäne sein, z. B. die DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors, insbesondere eines Transkriptionsfaktors von Mensch oder Hefe. Bevorzugt ist eine von GAL4 ableitbare Domäne, die die selektive Bindung des Proteins der Erfindung an die DNA-Sequenz CGGAGGACAGTCCTCCG (SEQ ID Nr. 44) vermittelt. Nach Cavey et al. (J. Mol. Biol. 209:423, 1989) haben die GAL4-Aminosäuren 1 bis 147 bei 2 · 10&supmin;¹¹ M eine Bindung mit 50% Sättigung an die GAL4-Erkennungssequenz. Am meisten bevorzugt besteht die DNA-Bindungsdomäne des erfindungsgemälben Proteins aus den GAL4-Aminosäuren 2 bis 147 und hat die in SEQ ID Nr. 1 angegebene Aminosäuresequenz (siehe Beispiel 10). Eine DNA-Bindungsdomäne kann an eine einzelsträngige oder, bevorzugt, doppelsträngige DNA auf der Effektornucleinsäure binden.
Ein Retentionssignal für das endoplasmatische Retikulum dient dazu, den intrazellulären Weg des internalisierten Protein/Nucleinsäurekomplexes der Erfindung zu beeinflussen. Ein geeignetes endoplasmatisches Retentionssignal kann ein Retentionssignal für das endoplasmatische Retikulum von Säugetieren sein, z. B. das Signal mit der Aminosäuresequenz LysAsp- GluLeu (SEQ ID Nr. 45), d. h. das KDEL-Signal, das in SEQ ID Nr. 1, 3 und 5 angegeben ist, oder eine funktionell äquivalente Aminosäuresequenz, die von einem bakteriellen Toxin ableitbar ist, z. B. REDLK (SEQ ID Nr. 46) (Einzelbuchstaben- Aminosäurecode, von ETA) oder aus Hefe (HDEL (SEQ ID Nr. 47), Einzelbuchstaben-Aminosäurecode).
Ein bevorzugtes rekombinantes Protein der Erfindung umfasst z. B. als Ligandendomäne eine Einzelketten-Antikörperdomäne, die für das menschliche erbB-2-Rezeptorprotein spezifisch ist, ein geeignetes von TTF-a ableitbares Fragment oder ein von IL-2 ableitbares Fragment, eine Translokationsdomäne, die von Pseudomonas-Exotoxin-A oder Diphtherietoxin ableitbar ist, eine DNA-Bindungsdomäne, die von dem Hefe-GAL4-Transkriptionsfaktor ableitbar ist und ein Retentionssignal KDEL für das endoplasmatische Retikulum von Säugetieren. Besonders bevorzugt sind Multidomänen-Proteine, die die folgenden Sequenzen umfassen: die Aminosäuren 18 bis 530 gemäß SEQ ID Nr. 2, die Aminosäuren 13 bis 342 gemäß SEQ ID Nr. 4 oder die Aminosäuren 18 bis 421 von SEQ ID Nr. 6.
Zusätzlich zu den oben angegebenen funktionellen Domänen kann ein rekombinantes Protein der Erfindung auch ein Signalpeptid enthalten, z. B. die OmPA-Signalsequenz von E. coli mit der Aminosäuresequenz MetbysLysThrAlaIleAlaIleAlaValAlaLeuAlaGly- PheAlaThrValAlaGlnAla (SEQ ID Nr. 48).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Nucleinsäure, d. h. eine RNA oder insbesondere DNA, die das oben beschriebene Multidomänen-Protein der Erfindung oder ein Fragment einer solchen Nucleinsäure codiert. Per definitionem umfasst eine solche DNA eine codierende einzelsträngige DNA, eine doppelsträngige DNA der codierenden DNA und einer dazu komplementären DNA oder diese komplementäre (einzelsträngige) DNA selbst. Beispielhafte Nucleinsäuren, die ein Protein der Erfindung codieren, sind in den SEQ ID Nr. 1, 3 und 5 angegeben. Eine DNA, die das mit TGF-α-deltaETA-deltaGAL4 bezeichnete Protein codiert, ist erhältlich aus E. coli XL1Blue/pWF47-TGF, der bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, mit der Hinterlegungsnummer 9513 am 24. Oktober 1994 hinterlegt wurde.
Nucleinsäuren mit der im Wesentlichen gleichen Nucleotidsequenz, wie die in den SEQ ID Nr. 1, 3 bzw. 5 angegebenen, als codierenden Sequenzen oder neue Fragmente davon sind bevorzugt. Nucleotidsequenzen, die im Wesentlichen gleich sind, sollen hier solche sein, die mindestens etwa 90% Sequenzidentität haben.
Beispielhafte Nucleinsäuren können alternativ als solche Nucleinsäuren gekennzeichnet werden, die ein Multidomänen- Protein der Erfindung codieren und mit irgendeiner der DNA- Sequenzen, die in den SEQ ID Nr. 1, 3 und 5 angegeben sind, hybridisieren. Bevorzugt sind solche Sequenzen, die unter stark stringenten Bedingungen mit den oben erwähnten DNAs hybridisieren.
Die Stringenz der Hybridisierung bezieht sich auf Bedingungen, unter denen Polynucleinsäurehybride stabil sind. Solche Bedingungen sind dem Fachmann auf diesem Gebiet eindeutig bekannt. Wie es dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, wird die Stabilität von Hybriden durch die Schmelztemperatur (Tm) des Hybrids wiedergegeben, die um ungefähr 1 bis 1,5ºC pro 1% Abnahme der Sequenzhomologie abnimmt. Im Allgemeinen ist die Stabilität eines Hybrids eine Funktion der Natriumionenkonzentration und der Temperatur. Typischerweise wird die Hybridisierungsreaktion unter Bedingungen hoher Stringenz durchgeführt und anschließend wird mit variierender Stringenz gewaschen. Der Fachmann auf diesem Gebiet kann leicht geeignete Hybridisierungsbedingungen auswählen.
Mit den hier angegebenen Hinweisen können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren mit Methoden erhalten werden, die im Stand der Technik wohl bekannt sind. Z. B. kann eine DNA der Erfindung erhalten werden durch chemische Synthese, unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) oder durch Screening einer Bibliothek, die ein interessierendes Protein exprimiert, z. B. eine Ligandendomäne oder ein Stammprotein, dessen Ligandendomäne daraus ableitbar ist, in einem nachweisbaren Ausmaß. Geeignete Bibliotheken sind im Handel erhältlich oder können z. B. aus Zelllinien, Gewebeproben und dgl. erstellt werden. Nach dem Screenen der Bibliothek werden positive Klone durch Nachweis eines Hybridisierungssignals identifiziert.
Chemische Methoden zur Synthese einer interessierenden Nucleinsäure sind im Stand der Technik bekannt und schließen Triester-, Phosphit-, Phosphoramidit- und H-Phosphonatmethoden, PCR und andere Autoprimermethoden ebenso wie eine Oligonucleotidsynthese an festen Trägern ein. Diese Methoden können verwendet werden, wenn die gesamte Nucleinsäuresequenz der Nucleinsäure bekannt ist oder die Sequenz der zum codierenden Strang komplementären Nucleinsäure verfügbar ist. Alternativ kann man, wenn die Zielaminosäuresequenz bekannt ist, potenzielle Nucleinsäuresequenzen ableiten unter Verwendung bekannter und bevorzugter codierender Reste für jeden Aminosäurerest.
Ein alternatives Mittel, um DNA zu isolieren, die eine der oben erwähnten funktionellen Domänen codiert, besteht darin, die PCR-Technologie zu verwenden, wie es z. B. in Abschnitt 14 von Sambrook et al., 1989 beschrieben wird. Diese Methode erfordert die Verwendung von Oligonucleotidsonden, die mit der interessierenden Nucleinsäure hybridisieren.
Der Ausdruck "Sonde", wie er hier verwendet wird, betrifft z. B. eine einzelsträngige DNA oder RNA, die eine Sequenz von Nucleotiden aufweist, die mindestens etwa 20 aufeinander folgende Basen enthält, die gleich mit (oder komplementär zu) irgendwelchen 20 oder mehr aufeinander folgenden Basen der interessierenden Nucleinsäure sind. Die als Sonden ausgewählten Nucleinsäuresequenzen sollten eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein, so dass falsch positive Ergebnisse minimiert werden. Die Nucleotidsequenzen basieren gewöhnlich auf konservierten oder äußerst homologen Nucleotidsequenzen oder Bereichen des interessierenden Proteins. Die als Sonden verwendeten Nucleinsäuren können an einer oder mehreren Positionen degeneriert sein. Die Verwendung von degenerierten Oligonucleotiden kann von spezieller Bedeutung sein, wenn eine Bibliothek einer Art, von der die bevorzugte Codon-Verwendung nicht bekannt ist, gescreent wird.
Bevorzugte Bereiche, aus denen Sonden konstruiert werden können, schließen 5'- und/oder 3'-codierende Sequenzen, Sequenzen, von denen vorhergesagt wird, dass sie Ligandenbindungsstellen codieren, und dgl. ein. Bevorzugt werden Nucleinsäuresonden mit einer geeigneten Markierung für einen schnellen Nachweis bei der Hybridisierung markiert. Z. B. ist eine geeignete Markierung eine radioaktive Markierung. Die bevorzugte Methode der Markierung eines DNA-Fragmentes besteht im Einbau von ³²P-markierter α-dATP mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase im Rahmen einer Random-Priming-Reaktion, wie sie im Stand der Technik wohl bekannt ist. Oligonucleotide werden gewöhnlich am Ende markiert mit ³²P-markierter g-ATP und Polynucleotidkinase. Andere Methoden (z. B. nicht radioaktive) können jedoch auch verwendet werden, um das Fragment oder Oligonucleotid zu markieren, unter anderem Enzymmarkierung und Biotinylierung.
Eine erfindungsgemäße Nucleinsäure kann leicht modifiziert werden durch Nucleotidsubstitution, Nucleotiddeletion, Nucleotidinsertion oder Inversion eines Nucleotidstücks und irgendeine Kombination davon. Solche Mutanten können z. B. verwendet werden, um ein multifunktionelles Mutantenprotein mit einer oder mehreren funktionellen Domänen zu erzeugen, die eine Aminosäuresequenz haben, die sich von den Sequenzen, die in der Natur gefunden werden, unterscheidet. Die Mutagenese kann vorbestimmt (punktspezifisch) oder statistisch oder zufällig sein. Eine Mutation, die keine stumme Mutation ist, darf nicht Sequenzen außerhalb des Leserahmens bringen und erzeugt bevorzugt keine komplementären Bereiche, die hybridisieren könnten unter Erzeugung von sekundären mRNA-Strukturen, wie Schleifen oder Haarnadeln.
DNA, die ein Multidomänen-Protein der Erfindung codiert, kann in Vektoren für die weitere Manipulation eingebaut werden. Der Begriff Vektor (oder Plasmid), wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf diskrete Elemente, die verwendet werden, um heterologe DNA in Zellen einzuführen, entweder für deren Expression oder Replikation. Die Selektion und Verwendung solcher Träger ist dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt. Es sind viele Vektoren verfügbar und die Auswahl eines geeigneten Vektors hängt ab von der vorgesehenen Verwendung des Vektors, d. h. ob er für die DNA-Amplifikation oder DNA-Expression verwendet werden soll, der Größe der in den Vektor zu insertierenden DNA und der Wirtszelle, die mit dem Vektor transformiert werden soll. Jeder Vektor enthält verschiedene Komponenten-abhängig von seiner Funktion (Amplifikation von DNA oder Expression von DNA) und der Wirtszelle, für die er kompatibel ist. Die Vektorkomponenten schließen im Allgemeinen eine oder mehrere der folgenden ein, ohne darauf beschränkt zu sein: einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor, eine Transkriptionsterminationssequenz und eine Signalsequenz.
Sowohl Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten im Allgemeinen eine Nucleinsäuresequenz, die es ermöglicht, dass der Vektor in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen repliziert werden kann. Typischerweise ist diese Sequenz in Klonierungsvektoren so, dass der Vektor unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA repliziert werden kann und schließt einen Replikationsursprung oder autonom replizierende Sequenzen ein. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefen und Viren wohl bekannt. Der Replikationsursprung des Plasmids pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, der Ursprung des 2 m-Plasmids ist für Hefen geeignet und verschiedene virale Ursprünge (z. B. SV 40, Polyoma, Adenovirus) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen geeignet. Allgemein ist die Replikationsursprungskomponente für Säugetierexpressionsvektoren nicht erforderlich, wenn diese nicht in Säugetierzellen verwendet werden, die kompetent sind für eine DNA-Replikation auf hohem Niveau, z. B. COS-Zellen.
Die meisten Expressionsvektoren sind Shuttle-Vektoren, d. h. sie können in mindestens einer Klasse von Organismen repliziert werden, können in aber in einen anderen Organismus zur Expression transfiziert werden. Z. B. wird ein Vektor in E. coli kloniert und dann wird der gleiche Vektor in Hefe- oder Säugetierzellen transfiziert, obwohl er dort nicht repliziert werden kann unabhängig von dem Wirtszellchromosom. Die DNA kann auch durch Insertion in das Wirtsgenom amplifiziert werden. Die Gewinnung solcher DNA ist jedoch komplizierter als die eines exogen replizierten Vektors, da sie einen Verdau mit Restriktionsenzymen erfordert. DNA kann mit PCR amplifiziert werden und direkt in die Wirtszellen ohne eine Replikationskomponente transfiziert werden.
Vorteilhafterweise enthält ein Expressions- und Klonierungsvektor ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Dieses Gen codiert ein Protein, das für das Überleben oder das Wachstum der transformierten Wirtszellen, die in einem selektiven Kulturmedium gezüchtet werden, notwendig ist. Nicht mit dem das Selektionsgen enthaltenden Vektor transformierte Wirtszellen überleben im Kulturmedium nicht. Typische Selektionsgene codieren Proteine, die eine Resistenz gegenüber Antibiotika und anderen Toxinen beitragen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, ergänzen auxotrophe Mängel oder liefern kritische Nährstoffe, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind.
Bezüglich eines selektiven Genmarkers, der für Hefen geeignet ist, kann jedes Markergen verwendet werden, das die Selektion von Transformanten aufgrund der phänotypischen Expression des Markergens erleichtert. Geeignete Marker für Hefe sind z. B. solche, die eine Resistenz gegenüber den Antibiotika G418, Hygromycin oder Bleomycin beitragen oder für eine Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante sorgen, z. B. das URA3-, LEU2-, LYS2-, TRP1- oder HIS3-Gen.
Da die Amplifikation der Vektoren geeigneterweise in E. coli erfolgt, ist vorteilhafterweise ein genetischer Marker für E. coli und ein Replikationsursprung von E. coli enthalten. Diese können aus E.-coli-Plasmiden, wie pBR322, Bluescript- Vektor oder pUC-Plasmid, z. B. pUC18 oder pUC19 erhalten werden, die sowohl einen E.-coli-Replikationsursprung als auch genetische Marker für E. coli, die eine Resistenz gegenüber Antibiotika, z. B. Ampicillin, beitragen, enthalten.
Geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind solche, die die Identifikation von Zellen zulassen, die kompetent sind zur Aufnahme der ein Protein der Erfindung codierenden Nucleinsäure, z. B. Dihydrofolatreduktase (DHFR, Methotrexatresistenz), Thymidinkinase oder Gene, die eine Resistenz gegenüber G418 oder Hygromycin beitragen. Die Säugetierzelltransformanten werden unter Selektionsdruck gebracht, den nur solche Transformanten als daran angepasst überleben, die den Marker aufgenommen haben und ihn exprimieren. Im Fall des DHFR-Markers kann Selektionsdruck erzeugt werden, indem die Transformanten unter solchen Bedingungen gezüchtet werden, bei denen die Methotrexatkonzentration als Selektionsmittel in dem Medium sukzessiv erhöht wird, was zur Amplifikation (an der Chromosomenintegrationsstelle) sowohl des Selektionsgens als auch der damit verbundenen DNA, die das Multidomänen-Protein der Erfindung codiert, führt. In diesem Fall ist Miplifikation das Verfahren, mit dem Gene mit größerem Bedarf zur Erzeugung eines Proteins, das für das Wachstum kritisch ist, in Tandemform innerhalb der Chromosomen nachfolgender Generationen von rekombinanten Zellen wiederholt werden. Erhöhte Mengen des erfindungsgemäßen Proteins werden gewöhnlich aus in dieser Weise amplifizierter DNA synthetisiert.
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der von dem Wirtsorganismus erkannt wird und operativ mit der Nucleinsäure der Erfindung verbunden ist. Ein solcher Promotor kann induzierbar oder konstitutiv sein. Die Promotoren sind operativ mit DNA, die das erfindungsgemäße Protein codiert, verbunden, indem der Promotor aus der Quellen-DNA durch Verdau mit Restriktionsenzymen entfernt wird und die isolierte Promotorsequenz in den Vektor insertiert wird.
Promotoren, die zur Verwendung in prokaryontischen Wirten geeignet sind, schließen z. B. β-Lactamase- und Lactosepromotorsysteme, alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp)-Promotorsystem und Hybridpromotoren, wie den tac-Promotor ein. Ihre Nucleinsäuresequenzen wurden veröffentlicht, was es dem Fachmann ermöglicht, sie mit der DNA, die das erfindungsgemäße Protein codiert, in operativer Weise zu ligieren unter Verwendung von Linkem oder Adaptern, um irgendwelche erforderlichen Restriktionsstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten üblicherweise auch eine Shine-Dalgarno-Sequenz, die operativ mit der das erfindungsgemäße Protein codierenden DNA verbunden ist.
Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung in Hefewirten können reguliert oder konstitutiv sein und können aus einem stark exprimierenden Hefegen, insbesondere einem Saccharomyces-cerevisiae-Gen abgeleitet sein. Solche Gene sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt.
Die DNA-Transkription aus Vektoren in Säugetierwirten kann von Promotoren kontrolliert werden, die aus den Genomen von Viren, wie Polyomavirus, Adenovirus, Geflügelpockenvirus, Rinderpapillomavirus, Affensarkomavirus, Cytomegalovirus (CMV), einem Retrovirus und Simianvirus 40 (SV40) abgeleitet sind, von heterologenSäugetierpromotoren, wie dem Actinpromotor oder einem sehr starken Promotor, z. B. einem ribosomalen Proteinpromotor, unter der Voraussetzung, dass die Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
Die Transkription einer ein Multidomänen-Protein der Erfindung codierenden DNA in höheren Eukaryonten kann erhöht werden, indem eine Enhancer-Sequenz in den Vektor insertiert wird. Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig. Viele Enhancer-Sequenzen sind aus Säugetiergenen bekannt (z. B. Elastase und Globin). Typischerweise wird man jedoch einen Enhancer aus einem eukaryontischen Zellvirus anwenden. Beispiele schließen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100-270) und den frühen CMV-Promotor-Enhancer ein.
Expressionsvektoren, die in eukaryontischen Wirtszellen verwendet werden - und geeignete in Betracht gezogene Wirtszellen schließen Hefe, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere, Menschen oder kernhaltige Zellen aus anderen Vielzellorganismen ein, enthalten auch Sequenzen, die für das Ende der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA notwendig sind. Solche Sequenzen sind üblicherweise aus 5'- und 3'-untranslatierten Regionen von eukaryontischer oder viraler DNA oder cDNA verfügbar.
Ein Expressionsvektor bezieht sich auf ein rekombinantes DNA- oder RNA-Konstrukt, z. B. ein Plasmid, einen Phagen, ein rekombinantes Virus oder einen anderen Vektor, das bei Einführung in eine geeignete Wirtszelle zur Expression der klonierten DNA führt. Geeignete Expressionsvektoren sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt und schließen solche ein, die in eukaryontischen und/oder prokaryontischen Zellen replizierbar sind, und solche, die episomal bleiben oder solche, die in das Wirtszellgenom integriert werden.
Für die Konstruktion von erfindungsgemäßen Vektoren werden konventionelle Ligationstechniken angewendet. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschnitten und wieder in der Form, die erwünscht ist, um die erforderlichen Plasmide zu erzeugen, ligiert. Falls erwünscht, wird eine Analyse in an sich bekannter Weise durchgeführt, um die korrekte Sequenz in dem konstruierten Plasmid zu bestätigen. Geeignete Methoden zur Konstruktion von Expressionsvektoren, zur Herstellung von in-vitro-Transkripten, zur Einführung von DNA in Wirtszellen und zur Durchführung von Analysen, um die Expression der erfindungsgemäßen DNA und die Funktion zu überprüfen, sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Die DNA-Präsenz, Amplifikation und/oder Expression kann in einer Probe direkt, z. B. durch übliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA quantitativ auszuwerten, Dot-Blotting (DNA oder RNA-Analyse) oder in-situ- Hybridisierung gemessen werden unter Verwendung einer in geeigneter Weise markierten Sonde auf Basis einer hier vorgestellten Sequenz.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Zellen bereitgestellt, die die oben beschriebenen Nucleinsäuren (d. h. DNA oder mRNA) enthalten. Solche Wirtszellen, unter anderem prokaryontische, Hefe- und höher eukaryontische Zellen können zur Replikation von DNA und zur Produktion des Multidomänen-Proteins der Erfindung verwendet werden. Geeignete Prokaryonten schließen Eubakterien, z. B. Gram-negative oder Gram-positive Organismen, wie E. coli, z. B. E.-coli-K12-Stäinme, DHSa, HB101 und XL1 Blue oder Bacilli ein. Weitere Wirte, die für Multidomänen-Protein codierende Vektoren geeignet sind, schließen eukaryontische Mikroben, z. B. Fadenpilze oder Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae ein. Höher eukaryontische Zellen schließen Insekten- und Wirbeltierzellen, insbesondere Säugetierzellen ein. In den letzten Jahren wurde die Vermehrung von Säugetierzellen in Kultur (Gewebekultur) ein Routineverfahren. Die in dieser Offenbarung angegebenen Wirtszellen umfassen Zellen in in-vitro- Kultur ebenso wie Zellen, die innerhalb eines Wirtstieres vorliegen.
DNA kann stabil in Zellen eingebaut werden oder kann vorübergehend exprimiert werden unter Verwendung von Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind. Stabil transfizierte Säugetierzellen können hergestellt werden, indem Zellen mit einem Expressionsvektor, der ein selektierbares Markergen aufweist, transfiziert werden und die transfizierten Zellen unter solchen Bedingungen gezüchtet werden, die selektiv sind für Zellen, die das Markergen exprimieren. Um vorübergehende Transfizienten herzustellen, werden Säugetierzellen mit einem Reportergen transfiziert, um die Transfektionseffizienz zu überwachen.
Um solche stabil oder vorübergehend transfizierten Zellen herzustellen, sollten die Zellen mit einer Menge an Protein codierender Nucleinsäure transfiziert werden, die ausreicht, um das Multidomänen-Protein der Erfindung zu bilden.
Wirtszellen werden mit den oben erwähnten Expressions- oder Klonierungsvektoren der Erfindung transfiziert oder transformiert und in üblichen Nährmedien gezüchtet, die in geeigneter Weise modifiziert wurden zur Einführung von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifikation der die gewünschten Sequenzen codierenden Gene. Heterologe DNA kann in Wirtszellen eingeführt werden mit irgendwelchen im Stand der Technik bekannten Methoden, z. B. Transfektion mit einem Vektor, der eine heterologe DNA codiert, durch Calciumphosphat- Co-Präzipitationstechnik oder Elektroporation. Zahlreiche Methoden der Transfektion sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Eine erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen erkannt, wenn irgendein Hinweis auf das Funktionieren des Vektors in der Wirtszelle auftritt. Die Transformation wird erreicht unter Verwendung von Standardtechniken, die für die jeweilig verwendeten Wirtszellen geeignet sind.
Der Einbau von klonierter DNA in einen geeigneten Expressionsvektor, die Transfektion von eukaryontischen Zellen mit einem Plasmidvektor oder einer Kombination von Plasmidvektoren, die jeweils ein oder mehrere distinkte Gene codieren oder mit linearer DNA und die Selektion transfizierter Zellen sind im Stand der Technik wohl bekannt (siehe z. B. Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Transfizierte oder transformierte Zellen werden unter Verwendung von Medien und Kulturmethoden, die im Stand der Technik bekannt sind, kultiviert oder gezüchtet, bevorzugt unter solchen Bedingungen, unter denen das von der DNA codierte Multidomänen-Protein exprimiert wird. Die Zusammensetzung geeigneter Medien ist dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt, so dass sie leicht hergestellt werden können. Geeignete Kulturmedien sind auch im Handel erhältlich.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst eine Effektornucleinsäure eine gewünschte Nucleinsäure, die z. B. eine therapeutisch aktive Nucleinsäure oder ein Reportergen sein kann, und eine spezifische Nucleinsäuresequenz (auch als Nucleinsäureerkennungssequenz oder Kognatstruktur bezeichnet), die von der Nucleinsäure-Bindungsdomäne des Multidomänen-Fusionsproteins erkannt werden kann, und, falls erforderlich, geeignete regulatorische Elemente für die Expression der gewünschten Nucleinsäure. Falls erforderlich, kann eine als eine Komponente in dem erfindungsgemäßen Komplex geeignete Effektornucleinsäure die Expression der gewünschten Nucleinsäure, die an die Zielzelle abgegeben werden soll, lenken. Eine therapeutisch wirksame Nucleinsäure, die in die Zielzelle durch das erfindungsgemäße Transfersystem abgegeben werden soll, kann selbst therapeutisch aktiv sein, z. B. indem sie selektiv ein vorbestimmtes Verfahren innerhalb der Zielzelle beeinflusst, z. B. die Synthese eines speziellen Proteins hemmt, oder sie kann ein therapeutisch aktives Genprodukt, das in der Zielzelle exprimiert werden soll, codieren. Z. B. kann ein solches Genprodukt ein neues oder modifiziertes Gen sein, z. B. ein Tumorsuppressorgen oder ein Antikörpergen für die intrazelluläre Immunisierung, eine Nucleinsäure, die ein Prodrug aktivierendes Enzym codiert, z. B. eine Herpessimplex-Thymidinkinase, eine Nucleinsäure, die einen Immunmodulator codiert oder ein Fremdantigen, das geeignet ist, um die Zielzelle "als fremd zu erkennen".
Die Kognatstruktur kann eine RNA oder, bevorzugt, eine DNA sein. Die Effektornucleinsäure kann ein oder mehrere, bevorzugt 2 bis 8, Nucleinsäureerkennungssequenzen umfassen. Wenn zwei oder mehr solche Sequenzen auf einer Effektornucleinsäure vorhanden sind, sind diese vorteilhafterweise so angeordnet, dass eine sterische Hinderung der Bindung des Multidomänen-Proteins der Erfindung verhindert wird. Bevorzugt ist eine Effektornucleinsäure mit einer oder mehreren Kopien, insbesondere zwei Kopien, der oben angegebenen GAL4-Erkennungssequenz. Diese Sequenz bindet Proteindimere.
Typischerweise ist die Nucleinsäure, die in der Zielzelle exprimiert werden soll, ein Gen, im Allgemeinen in Form von DNA, die ein gewünschtes Protein codiert, z. B. ein therapeutisch aktives Protein. Das Gen umfasst ein Strukturgen, das das Protein codiert, z. B. ein immunmodulatorisches Protein, in einer Form, die zur Prozessierung und Sekretion als lösliches oder Zelloberflächenprotein der Zielzelle geeignet ist. Z. B. codiert das Gen geeignete Signalsequenzen, die die Prozessierung und Sekretion des Proteins oder Polypeptids steuern. Die Signalsequenz kann die natürliche Sequenz des Proteins oder eine exogene Sequenz sein. Das Strukturgen ist mit geeigneten genetischen regulatorischen Elementen verbunden, die für die Expression des von dem Gen codierten Proteins oder Polypeptids durch die Zielzelle erforderlich sind. Diese schließen einen Promotor und gegebenenfalls ein Enhancer- Element, die in der Zielzelle operativ sind, ein. Das Gen kann in einem Expressionsvektor, z. B. einem Plasmid, oder einem transponierbaren genetischen Element enthalten sein, auch mit den genetischen regulatorischen Elementen, die zur Expression des Gens und Sekretion des von dem Gen codierten Produkts notwendig sind. Z. B. kann eine Komponente des Nucleinsäure-Abgabesystems der Erfindung ein eukaryontisches Expressionsplasmid sein, z. B. ein Plasmid mit DNA, die Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) codiert, gesteuert von einem SV40-Promotor, z. B. Plasmid pSV2 CAT. Die Effektornucleinsäure kann auch ein lineares DNA-Fragment sein.
Die Effektornucleinsäure kann bakterielle Elemente umfassen, die für die Selektion und Klonierung des Vektors geeignet sind.
Geeignete eukaryontische Expressionsplasmide oder lineare DNA-Fragmente tragen eine Promotorstruktur, die Nucleinsäure, die in die Zielzelle eingeführt und dort exprimiert werden soll, eukaryontische Spleiß- und Polyadenylierungssignale und eine spezifische DNA-Sequenz, die von der DNA-Bindungsdomäne des Multidomänen-Fusionsproteins erkannt wird.
Beispielhafte Gene, die in der Zielzelle exprimiert werden sollen, schließen auch Reporter- oder Markergene ein, z. B. Gene, die Luciferase oder β-Galactosidase codieren.
Falls erforderlich, kann die Effektornucleinsäure ein eukaryontisches Spleiß-Signal oder ein Polyadenylierungssignal umfassen.
Die Herstellung einer Effektornucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet Methoden, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, z. B. solche, die oben genauer ausgeführt wurden.
Typ und Art der in die Zielzelle einzuführenden Nucleinsäure werden bestimmt von der Wirkung, die in der Zielzelle erreicht werden soll, z. B. im Fall der Verwendung für die Gentherapie durch das Gen oder die Gensektion, die exprimiert werden soll, um ein defektes Gen zu ersetzen, oder durch die Zielsequenz eines Gens, dessen Expression gehemmt werden soll. Die in die Zelle zu liefernde Nucleinsäure kann eine DNA oder RNA sein, ohne Beschränkungen bezüglich der Sequenz der Nucleinsäure.
Wenn das erfindungsgemäße System für Tumorzellen eingesetzt wird, um als Tumorvakzine angewendet zu werden, codiert die in die Zelle einzuführende DNA bevorzugt ein immunmodulierendes Protein, z. B. ein Cytokin oder ein Zelloberflächenantigen, das geeignet ist, um eine Immunantwort zu aktivieren. Kombinationen von DNAs, die Cyctokine codieren, z. B. IL-2 und IFN-g, B7.1, B7.2, MHCl oder MHC2, werden als besonders nützlich angesehen.
Falls erwünscht, können zwei oder mehr verschiedene Nucleinsäuren in die Zelle eingeführt werden, z. B. ein Plasmid, das cDNAs umfasst, die verschiedene Proteine codieren, unter der Kontrolle von in geeigneter Weise regulierbaren Sequenzen, oder zwei verschiedene Plasmide, die verschiedene cDNAs umfassen.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Mittel, um die Expression von gewünschten Proteinen (oder RNA) in Zielzellen, transgenen Tieren oder Insekten zu steuern oder zu verbessern. Das Multidomänen-Protein oder der Protein/Nucleinsäurekomplex der Erfindung wird verwendet, um Nucleinsäure in eukaryontische Zellen einzuführen, insbesondere in höhere eukaryontische Zellen. Bevorzugt ist die Verwendung für die Transfektion von Säugetierzellen, insbesondere menschlichen Zellen, z. B. Tumorzellen, Myoblasten, Fibroblasten, Hepatocyten, Endothelzellen oder Zellen des Respirationstraktes. Das erfindungsgemäße Nucleinsäuretransfersystem ist geeignet für den selektiven DNA-Transfer in Zielzellen für in-vitro- Anwendungen, um z. B. die Immunantwort auf ein spezielles Antigen zu bestimmen und für ex-vivo- oder in-vivo-Gentherapieprotokolle für die therapeutische oder prophylaktische Behandlung von Säugetieren, die dies benötigen, insbesondere Menschen. Solche Säugetiere schließen solche ein, die unter ererbten oder erworbenen Krankheiten leiden, z. B. genetischen Defekten, z. B. Mukoviszidose (Transmembranleitfähigkeitsgen für Fibrosis cystica), Hypercholesterämie (Low-Density- Lipoprotein-(LDL)-Rezeptorgen, β-Thallassämie, krebsartige, Autoimmun- oder infektiöse Krankheiten. Die ex-vivo- oder invivo-Anwendung des erfindungsgemäßen Protein/Nucleinsäurekomplexes kann zur Verhütung, Stabilisierung oder Reversion von Krankheiten wie HIV, Melanomen, Diabetes, Alzheimer- Krankheit oder Herzkrankheiten führen. Erfindungsgemäß kann die Behandlung von Krebs erreicht werden durch Blockade der Onkogenexpression mit Antisense-Konstrukten, durch Einführung und Expression von Tumorsuppressorgenen, durch Prodrugaktivierende Enzyme oder toxische Effektoren, z. B. durch Verabreichung von Tumorvakzinen oder intrazelluläre Immunisierung. Gegebenenfalls kann das erfindungsgemäße Nucleinsäuretransfersystem in Kombination mit einem Polykation, z. B. Polylysin, Polyarginin oder Polyornithin, einem heterologen Polykation mit zwei oder mehr verschiedenen, positiv geladenen Aminosäuren, nicht peptidischen synthetischen Polykationen, z. B. Polyethylenimin, einem Protamin oder einem Histon angewendet werden. Vorteilhafterweise wird das Polykation nach der Bildung des erfindungsgemäßen Protein/Nucleinsäurekomplexes, aber vor dessen Anwendung, zugegeben.
Das erfindungsgemäße Nucleinsäuretransfersystem kann auch für die Immunregulierung in Organismen verwendet werden, insbesondere für die Impfung oder für die Erzeugung von Antikörpern für experimentelle, diagnostische oder therapeutische Verwendung. Für die Zwecke der Impfung umfasst die Effektornucleinsäurekomponente des erfindungsgemäßen Komplexes ein exprimierbares Gen, das ein gewünschtes immunogenes Protein oder Peptid codiert, das bevorzugt eine co-stimulierende Wirkung hat. Das Gen wird in die Zielzelle eingebracht, exprimiert und nach der Sekretion des Genproduktes als lösliches Protein oder Zelloberflächenprotein wird in dem Wirtsorganismus eine Immunantwort gegen das immunogene Protein oder Peptid, z. B. das gesamte Hepatitis-B- oder -C-Antigen oder ein Teil davon, erzeugt. Wenn das Protein, gegen das eine Immunantwort erwünscht ist, nicht oder schlecht immunogen ist, kann das Protein an ein Trägerprotein gekuppelt werden, das für eine ausreichende Immunogenizität sorgt. Dies wird erreicht auf rekombinantem Weg, indem ein chimäres DNA-Konstrukt hergestellt wird, das ein Fusionsprotein codiert, das das Protein der Erfindung und den Träger umfasst.
Die Einführung von Genen in Zielzellen mit dem Ziel, eine invivo-Synthese von therapeutisch wirksamen Genprodukten zu erreichen, z. B. im Fall eines genetischen Mangels, um das defiziente Gen zu ersetzen, kann auch erreicht werden unter Verwendung des Nucleinsäuretransfersystems der Erfindung. Abgesehen von "konventionellen" Gentherapiekonzepten, die das Ziel haben, nach einmaliger Behandlung einen langzeitigen Behandlungserfolg zu erreichen, liefert die vorliegende Erfindung ein Mittel, um eine therapeutisch wirksame Nucleinsäure, z. B. ein pharmazeutisches Mittel ("Genarzneimittel") einmal oder mehrmals zu verabreichen. Das erfindungsgemäße Nucleinsäuretransfersystem kann auch für die vorübergehende Gentherapie (TGT) eingesetzt werden, bevorzugt zum Transfer eines rekombinanten Antigen-Rezeptors in Lymphozyten (insbesondere CTLs). Falls erwünscht, kann ein konstanter Expressionspegel der transferierten Gene durch wiederholte Anwendung des erfindungsgemäßen Protein/DNA-Komplexes erhalten werden.
Die Erfindung liefert auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als wirksame Komponente einen erfindungsgemäßen Protein/Nucleinsäurekomplex und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Der Komplex umfasst eine therapeutisch wirksame Nucleinsäure, vorteilhafterweise als eine Komponente eines Genkonstrukts. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die pharmazeutische Zusammensetzung als Lyophilisat oder in einem geeigneten Puffer gefroren bereitgestellt. Ein pharmazeutisch annehmbarer Träger ist irgendein Träger, in dem der Protein/Nucleinsäurekomplex so solubilisiert werden kann, dass er erfindungsgemäß verwendet werden kann. Eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann zusätzlich ein oben angegebenes Polykation enthalten.
Weiterhin liefert die Erfindung einen Transfektionskit mit einem Träger, Behälter oder Gläschen, das den erfindungsgemäßen Protein/Nucleinsäurekomplex und weitere Materialien, die für die Transfektion höherer eukaryontischer Zellen gemäß der Erfindung erforderlich sind, enthält. In dem Kit können die beiden Komponenten des Komplexes zusammen oder getrennt aufbewahrt werden, abhängig von der vorgesehenen Verwendung und der Stabilität des Komplexes. Wenn sie getrennt aufbewahrt werden, können die beiden Komponenten des Protein/Nucleinsäurekomplexes der Erfindung direkt, bevor der Komplex verwendet wird, vermischt werden.
Die therapeutische Verabreichung in vivo kann über einen systemischen Weg, über transdermale Anwendung, z. B. als Aerosolpräparat erfolgen, wobei die intravenöse Injektion bevorzugt ist. Zielorgane für solche Anwendungen schließen Leber, Milz, Lunge, Knochenmark und Tumoren ein.
Die Verabreichung für therapeutische Zwecke kann auch ex vivo erfolgen, was die Entfernung geeigneter Zellen aus dem Patienten oder einer anderen Person, Züchtung und Behandlung der Zellen mit dem erfindungsgemäßen Protein/Nucleinsäurekomplex unter Bedingungen, die die Internalisierung des Komplexes zulassen, und anschließende (Wieder)-Verabreichung der behandelten Zellen an den Patienten beinhaltet. Zellen, die für eine solche ex-vivo-Behandlung geeignet sind, schließen Knochenmarkzellen, Hepatozyten oder Myeoloblasten ein. Die exvivo-Behandlung ist auch für Krebsvakzine möglich. Eine therapeutische Behandlung unter Anwendung von Krebsvakzinen umfasst die Transfektion von Tumorzellen, die aus einem Patienten isoliert wurden, mit einer Nucleinsäure, die ein Cytokin codiert, und die anschließende erneute Verabreichung der transfizierten Zellen, die das Cytokin erzeugen.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Abgabe einer Nucleinsäure an eine Zielzelle, insbesondere eine höhere eukaryontische Zelle, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Zellen dem erfindungsgemäßen Protein/Nucleinsäureabgabesystem in solcher Art und Weise aussetzt, dass der Komplex internalisiert wird und von Endosomen freigesetzt wird.
Die Erfindung betrifft insbesondere die spezifischen Ausführungsformen, die in den Beispielen beschrieben werden, die dazu dienen, die vorliegende Erfindung zu erläutern, aber nicht als eine Beschränkung angesehen werden sollen.
Abkürzungen: Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin-A = ETA; GAL4 - Galactose Genclustergen 4; DTT = Dithiothreitol; aa = Aminosäuren.

Beispiel 1

Klonierung des Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin-A- Genfragmentes, das die Aminosäuren 252 bis 366 codiert

1.1 Ableitung von DNA-Fragmenten und Reinigung:

Plasmid pWW20 (Wels et al., Cancer Res. 52: 6310, 1992) trägt ein trunkiertes ETA-Gen, das die Aminosäuren 252 bis 613 des Exotoxins A von Pseudomonas aeruginosa PAK codiert (Gray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 2645, 1984; Lory et al., J. Bacteriol. 170: 714, 1989). Dieses Gen enthält die Domänen II und III, die Translokations- bzw. ADP-Ribosylierungsdomänen des Wildtyptoxins. pWW20 (1 mg) wird mit XbaI und Xhol verdaut. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) aufgetrennt und das erwartete 769 XbaI/XhoI-DNA-Fragment, das die ETA-Aminosäuren 252 bis 506 codiert, wird eluiert unter Verwendung des QIAquick- Gelextraktions-Kits (QIAGEN) mit den vom Hersteller vorgegebenen Verfahren. Das eluierte Fragment wird anschließend mit MaeII verdaut, die DNA-Fragmente werden auf einem 1,5% (G/V) Agarosegel getrennt und das erwartete 349 bp XbaI/MaeII-DNA- Fragment, das die ETA-Aminosäuren 252 bis 366 codiert (als DETA bezeichnet) wird, wie oben beschrieben, eluiert.

1.2 Oligonucleotide:

Ein doppelsträngiger DNA-Adaptor mit mit MaeII- und EcoRIkompatiblen Enden wird konstruiert, indem 0,5 nmol des Oligonucleotids mit der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 7 angegeben ist, mit 0,5 nmol des Oligonucleotids mit der in SEQ ID Nr. 8 angegebenen Sequenz, durch 3-minütige Inkubation bei 65ºC und Abkühlen auf Raumtemperatur reassoziieren gelassen werden.
Die Sequenz des teilweise doppelsträngigen MaeII/EcoRI- Adaptor-Oligonucleotids ist:
Bp 1 bis 2 bedeuten das mit MaeII kompatible überhängende Ende, bp 5 bis 10 eine HindIII-Restriktionsstelle, bp 13 bis 18 eine SacI-Restriktionsstelle und bp 42 bis 45 das mit EcoRI kompatible überhängende Ende.

1.3 Ligation:

Plasmid pWW191 ist ein von pUC19 abstammendes Plasmid, bei dem die ursprüngliche HindIII-Restriktionsstelle der multiplen Klonierungsstelle von pUC19 zerstört wurde und in eine XbaI-Restriktionsstelle umgewandelt wurde. pWW191 (50 ng) wird mit XbaI und EcoRI verdaut und 30 ng gereinigtes DETA- Fragment (siehe Beispiel 1.1) und 20 umol MaeII/EcoRI- Oligonucleotidadaptor werden unter Verwendung von 0,5 U T4- DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mM ATP, über Nacht bei 16ºC ligiert. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid-"Miniprep"-Methode (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/2. Ausgabe, Coldspring Harbor Laboratory, 1989). Das erhaltene Plasmid wird als pWW25 bezeichnet. Die teilweise DNA-Sequenz von pWW25, die das modifizierte Exotoxin A aus P. aeruginosa codiert, ist in SEQ ID Nr. 9 gezeigt. Diese DNA-Sequenz hat die folgenden Merkmale:
bp 1 bis 4 synthetischer Spacer
bp 5 bis 349 codiert aa252 bis 366 von P. aeruginosa Exotoxin A (DETA)
bp 349 bis 393 synthetischer MaeII/EcoRI-Adaptor
bp 386 bis 388 ochre-Stopcodon
bp 389 bis 394 nicht codierender synthetischer Spacer.

Beispiel 2

Klonierung des Hefetranskriptionsfaktor GAL4-Genfragmentes, das die Aminosäuren 2 bis 147 codiert

Plasmid p02G2A (Yang et al., EMBO J. 10: 2291, 1991), das ein GAL4-Genfragment enthält, das die Aminosäuren 1 bis 147 von GAL4 codiert (Laughon and Gesteland, Mol. Cell. Biol. 4: 260, 1984) wird als Matritze in einer Polymerasekettenreaktion verwendet, um das GAL4-DNA-Fragment, das die Aminosäuren 2 bis 147 codiert (als DGAL4 bezeichnet) zu amplifizieren.

2.1 Polymerasekettenreaktion:

12 ng von p02G2A (Yang et al., EMBO J. 10: 2291, 1991) werden verwendet für die DNA-Amplifikation in einem 50-ml-Ansatz, der jeweils 50 umol der zwei Oligonucleotide, die komplementär sind zu den Regionen in dem Hefe-GAL4-Gen 5'-CAGATGAAGCTTCTGTCTTC-3' (SEQ ID Nr. 10) und 5'- GAATGAGCTCGATACAGTCAACTG-3' (SEQ ID Nr. 11), 4 ml 2,5 mM dNTP- (N = G, A, T, C) -Mischung, 5 ml 10 · Taq DNA-Polymerasepuffer (Boehringer Mannheim) und 2,5 U Taq DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) enthält. Taq DNA-Polymerase wird nach der anfänglichen 2-minütigen Denaturierung bei 94ºC zugegeben. Es werden 30 Zyklen Annealing 1 Minute bei 55ºC, Primerextension 1 Minute bei 72ºC, Denaturierung 1 Minute bei 94ºC durchgeführt. Schließlich wird die Amplifikation vervollständigt durch eine 3-minütige Primerextensionsstufe bei 72ºC.

2.2 Ableitung des GAL4-DNA-Fragments und Reinigung:

Die Amplifikationsprodukte werden auf einem 1,2% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) aufgetrennt, DNA der erwarteten Größe wird eluiert und anschließend mit HindIII und SacI verdaut. Das erwartete 441 bp DGAL4-DNA-Fragment, das die Aminosäuren 2 bis 147 von GAL4 codiert, wird auf einem 1, 2% Agarosegel abgetrennt und durch Elution aus dem Gel, wie oben beschrieben, gereinigt.

2.3 Ligation:

pWW25 (50 ng), das mit HindIII und SacI verdaut wurde, und 30 ng gereinigtes Amplifikationsprodukt werden über Nacht bei 16ºC unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mM ATP ligiert. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid- "Miniprep"-Methode (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Das erhaltene Plasmid wird mit pWW35 bezeichnet. Die teilweise DNA-Sequenz von pWW35, die einen Teil von GAL4 aus Hefe codiert, ist in SEQ ID Nr. 12 gezeigt. Die Merkmale dieser Sequenz sind wie folgt:
bp 1 bis 438 codieffen Aminosäuren 2 bis 147 der Hefe GAL4 bp 439 bis 443 synthetischer Spacer.

Beispiel 3

Isolierung der RNA aus der Hybridoma-Zelllinie FRP5

3.1 Wachstum von FRP5-Zellen:

FRP5-Hybridomazellen (1 · 10&sup8;; hinterlegt gemäß Budapester Vertrag am 21. November 1990 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) in Porton Down, Salisbury, GB, mit der Hinterlegungsnummer 90112115) werden in Suspensionskultur bei 37ºC in DMEM (Seromed), das außerdem 10% FCS (Amimed), 1 mM Natriumpyruvat (Seromed), 2 mM Glutamin (Seromed), 50 mM 2-Mercaptoethanol und 100 mg/ml Gentamycin (Seromed) enthält, in einer angefeuchteten Luftatmosphäre mit 7,5% CO&sub2; in 175 cm Gewebekulturschalten (Falcon 3028) gezüchtet. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, einmal in PBS gewaschen, in flüssigem Stickstoff blitzgefroren und als Pellet bei -80ºC in einem sauberen, sterilen, mit einer Plastikkappe verschlossenen Röhrchen gefroren aufbewahrt.

3.2 Extraktion der gesamten zellulären RNA aus FRP5-Zellen:

Die gesamte RNA wird extrahiert unter Verwendung der sauren Guanidiumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Methode, die von Chomczynski & Sacchi beschrieben wird (Anal. Biochem. 162 : 156, 1987). Zellpellets von FRP5-Zellen (1 · 108) werden direkt im Röhrchen in Gegenwart von 10 ml Denaturierungslösung (4 M Guanidiumthiocyanat (Fluka), 25 mM Natriumcitrat, pH 7,0, 0,5% N-Lauroylsarcosin (Sigma), 0,1 M 2-Mercaptoethanol) aufgetaut. Die Lösung wird bei Raumtemperatur homogenisiert. Anschließend werden 1 ml 2 M Natriumacetat, pH 4, 10 ml Phenol (mit Wasser gesättigt) und 2 ml Chloroform-Isoamylalkohol- Mischung (49 : 1) zu dem Homogenisat zugegeben. Die fertige Suspension wird 10 Sekunden lang heftig geschüttelt und 15 Minuten lang auf Eis gekühlt. Die Proben werden mit 10 000 · g 20 Minuten lang bei 400 zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird RNA, die in der wässrigen Phase vorhanden ist, mit 10 ml Isopropanol vermischt und 1 Stunde lang bei -20ºC aufbewahrt. Der RNA-Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt, das Pellet in 3 ml Wasser gelöst und die RNA durch Zugabe von 1 Volumen Isopropanol bei -20ºC wieder ausgefällt. Nach Zentrifugation und Waschen des Pellets in Ethanol wird das fertige Pellet von RNA in Wasser gelöst. Die Methode liefert ungefähr 300 mg der gesamten zellulären RNA. Das fertige gereinigte Material wird bei -20ºC gefroren aufbewahrt.

3.3 Isolierung von Poly(A)-haltiger RNA:

Poly(A)-haltige RNA wird aus der Gesamt-RNA selektiert durch Chromatographie auf Oligo(dT)-Cellulose (Boehringer Mannheim), wie ursprünglich von Edruonds et al. beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68: 1336, 1971) und von Maniatis et al. modifiziert (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, Seite 197). Die Poly(A)- haltige RNA wird präpariert, wie in dem veröffentlichten Verfahren beschrieben, mit der Ausnahme, dass die RNA von der Oligo(dT)-Cellulose mit Wasser statt mit SDS-haltigem Puffer eluiert wird. Die Poly(A) = haltige RNA wird mit Ethanol ausgefällt und durch Zentrifugation gesammelt. Die Ausbeute an Poly(A)-haltiger RNA ist ungefähr 30 mg aus 300 mg der gesamten zellulären RNA. Das fertige gereinigte Material wird bei -20ºC gefroren aufbewahrt.

Beispiel 4

Klonierung von funktionellen Umlagerungen der schweren und leichten Kette aus der FRP5-Hybridomazellline

Poly(A)-haltige RNA, die aus FRP5-Hybridomazellen isoliert wurde, wie in Beispiel 3.3 beschrieben, liefert die Quelle für die cDNA-Synthese und die anschließende Amplifikation der V-Region-Minigene. Die Amplifikationsprodukte mit der erwarteten Größe werden auf Agarosegelen gereinigt und in geeignete Vektoren kloniert. Funktionelle Umlagerungen werden durch Sequenzierung identifiziert.

9.1 Oligonucleotide:

Oligonucleotid MCK2 wird so aufgebaut, dass es komplementär ist zu einem Bereich des konstanten Minigens von Immunglobulin k (kappa) der Maus und hat die in SEQ ID Nr. 13 angegebene Nucleotidsequenz. Oligonucleotid MCHC2 wird so aufgebaut, dass es komplementär ist zu einem Bereich des konstanten Minigens von Immunglobulin gl der Maus und hat die in SEQ ID Nr. 14 angegebene Nucleotidsequenz. Die Oligonucleotide VHIFOR, VHIBACK und VKIBACK werden von Orlandi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833, 1989) so entwickelt, dass sie zu den Konsensussequenzen passen.
VH1FOR: 5 - TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGGCCCAG - 3'
VH1BACK: 5' - AGGT(C/G)(C/A)A(G/A)CGCAG(G/C)AGTC(T/A)GG - 3'
VK1BACK: 5' - GACATTCMCTGACCCAGTCTCC - 3'

4.2 cDNA-Synthese:

55 ng der Poly(A)-haltigen RNA werden in einem Puffer gelöst, der 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 3 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT, 75 mM KCl, 400 mM dNTPs (N = G, A, T und C), 100 mg BSA (molekularbiologische Qualität, Boehringer Mannheim), 100 U RNAse-Inhibitor (Boehringer Mannheim), 25 umol MCK2 und 25 umol MCHC2 enthält. Die RNA wird bei 70ºC 5 Minuten lang denaturiert und dann 2 Minuten lang auf Eis gekühlt. Nach Zugabe von 200 U MMLV reverser Transkriptase (Gibco, BRL) erfolgt die cDNA-Synthese durch 1-stündige Inkubation bei 37ºC.

4.3 Polymerasekettenreaktion:

Ein Zehntel des cDNA-Ansatzes wird für die DNA-Amplifikation verwendet in Puffer, der 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 10 mM β-Mercaptoethanol, 200 mM dNTPs (N = G, A, T und C), 0,05% Tween-20% (Merck), 0,05% NP-40% (Merck), 10% DM50 (Merck), 25 umol Oligonucleotid 1 (siehe unten), 25 umol Oligonucleotid 2 (siehe unten) und 2,5 U Amplitaq% DNA-Polymerase (Perkin Eimer Cetus) enthält. Taq Polymerase wird nach 1-minütiger anfänglicher Denaturierung bei 93ºC zugegeben und anschließend bei 37ºC vereinigt. In den ersten 4 Zyklen wird die Primerextension 0,2 Minuten lang bei 71ºC durchgeführt, die Denaturierung 0,01 Minuten bei 93ºC und das Annealing 0,2 Minuten lang bei 37ºC. Bei den letzten 25 Zyklen wird die Annealing-Temperatur auf 62ºC erhöht. Schließlich wird die Amplifikation vervollständigt durch eine 3-minütige Primeraxtensionsstufe bai 71ºC.

4.4 Modifikation und Reinigung:

Amplifiziertes Material wird mit CHCl&sub3; extrahiert und mit Ethanol in Gegenwart von 200 mM LiCl ausgefällt. Um das Klonieren zu erleichtern, werden glatte Enden erzeugt durch 3- minütige Behandlung mit 1 U T4-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) in 66 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 132 mM Kaliumacetat, 20 mM Magnesiumacetat, 1huM DTT, 200 mg/ml BSA (molekularbiologische Qualität, Boehringer Mannheim) und 400 mM dNTPs (N = G, A, T und C). Die Polymerase wird durch 15-minütiges Erhitzen auf 65ºC inaktiviert vor der Phosphorylierung der DNA 1 Stunde bei 37ºC mit 10 U T4-Polynucleotidkinase (Pharmacia). Für diesen Zweck wird der Puffer eingestellt auf 50 mM EDTA und 1 mM ATP. Die modifizierten Amplifikationsprodukte werden auf einem 1,2% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, DNA- Qualität, Biorad) aufgetrennt und DNA mit der erwarteten Größe wird eluiert mit Hilfe von DEAE NA 45-Membranen (Schleicher & Schüll).

4.5 Ligation:

Bluescript% KS+ (70 ng), das mit XbaI linearisiert wurde, mit Klenow-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) behandelt wurde, um glatte Enden zu ergeben, und mit Kälberdarmphosphatase dephosphoryliert wurde, und 30 ng gereinigtes Amplifikationsprodukt werden über Nacht bei 16ºC ligiert unter Verwendung von 0, 5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris- HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mM ATP. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. Coli K803 zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf die gewünschten Ligationsprodukte gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid-"Miniprep"-Methode (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Die folgenden Plasmide werden erhalten:

PCR-Produkt Plasmidklone

H pMZ16/1
LC pMZ18/1

4.6 Sequenzierung:

Die Sequenzierung erfolgt unter Verwendung von Sequenase%- Kits (United States Biochemicals) mit T3- und T7-Oligonucleotidprimern gemäß den Verfahren, die vom Hersteller vorgegeben werden. Plasmid pMZ18/1 enthält ein funktionelles Insert der variablen Domäne der leichten kappa-Kette von FRP5. Plasmid pMZ16/1 enthält ein funktionelles Insert der variablen Domäne der schweren Kette von FRP5. Die Plasmide pMZ16/1 und pMZ18/1 werden als Quelle für weitere Subklonierungsstufen verwendet.

Beispiel 5

Konstruktion des MAb FRP5-Einzelketten-Fv-Gens

5.1 Konstruktion und Sequenz eines Klonierungslinkers für die cDNAs der variablen Domäne für schwere und leichte Kette:

Unter Verwendung von Oligonucleotiden wird eine Linkersequenz, die die Klonierung von mit PCR amplifizierter cDNA der variablen Domäne der schweren Kette der Maus als PstI/BstEII- Fragment und von mit PCR der cDNA der variablen Domäne der leichten kappa-Kette von Maus als PvuII/BglII-Fragment zulässt, konstruiert, wie von Wels et al., Biotechnology 10: 1128, 1992 beschrieben. Dies erzeugt einen offenen Leserahmen, in dem die variablen Domänen für die schwere und leichte Kette verbunden sind durch eine Sequenz, die das Stück mit -15 Aminosäuren Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly- Gly-Gly-Ser (SEQ ID Nr. 49) codiert. Es wurde gezeigt, dass dieser Aminosäurelinker die korrekte Faltung einer Antigen- Bindungsdomäne, die in den variablen Domänen der schweren und leichten Kette in einem Einzelketten-Fv vorhanden ist, zulässt (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879, 1988).
Für die Konstruktion des Klonierungslinkers werden die 6 komplementären Oligonucleotide 1A (SEQ ID Nr. 15), 1B (SEQ ID Nr. 16), 2A (SEQ ID Nr. 17), 2B (SEQ ID Nr. 18), 3A (SEQ ID Nr. 19), 3B (SEQ ID Nr. 20) verwendet.
40 umol der Oligonucleotide 1B, 2A, 2B, 3A-werden am 5'-Ende unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase (Boehringer Mannheim) in vier getrennten Ansätzen in einem Gesamtvolumen von 20 ml mit der von Maniatis et al., oben, beschriebenen Methode phosphoryliert. Die Oligonucleotide 1A und 3B werden nicht phosphoryliert, um eine Selbstligation des Linkers in der letzten Ligationsreaktion zu vermeiden. Nach der Kinasereaktion wird das Enzym inaktiviert durch 30-minütige Inkubation bei 70ºC. In drei getrennten Ansätzen, die jeweils 40 umol von zwei Oligonucleotiden in einem Gesamtvolumen von 40 ml enthalten, werden nicht phosphoryliertes 1A und phosphoryliertes 1B, phosphoryliertes 2A und phosphoryliertes 2B und phosphoryliertes 3A und nicht phosphoryliertes 3B vermischt. Die Hybridisierung der Oligonucleotide in den drei Ansätzen wird durchgeführt durch 5-minütige Erwärmung auf 95ºC, 5- minütige Inkubation bei 65ºC und langsames Abkühlen auf Raumtemperatur. 10 ml von jedem der drei Ansätze werden vermischt, 4 ml 10 · Ligationspuffer (Boehringer) und 4 Einheiten T4-DNA-Ligase (Boehringer) werden zugegeben und das Gesamtvolumen wird auf 40 ml mit sterilem Wasser eingestellt. Die vereinigten Paare von Oligonucleotiden werden 16 Stunden bei 14ºC in eine Linkersequenz ligiert. Die Reaktionsmischung wird mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1 : 1) extrahiert und anschließend wird die wässrige Phase mit einem gleichen Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) wieder extrahiert. Die wässrige Phase wird gesammelt, 0,1 Volumina 3 M Natriumacetat, pH 4,8, und 2 Volumina Ethanol werden zugegeben und die DNA bei -70ºC 4 Stunden lang ausgefällt und durch Zentrifugation gesammelt. Die entstehende Linkersequenz hat ein SphI- und ein XbaI-Adaptorende. Sie wird in einen mit SphI und XbaI verdauten pUC19 ligiert in einem Ansatz, der 100 ng ligierten Linker und 200 ng mit SphI/XbaI verdauten pUC19 enthält. Nach der Transformation in E. coli XL1 Blue% (Stratagene) wird die Plasmid-DNA aus vier unabhängigen Kolonien isoliert durch Minipräparationsmethoden auf Basis von alkalischer Lyse (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Die DNA- Sequenz des in pUC19 klonierten Linkers wird bestimmt durch Sequenzieren der doppelsträngigen DNA in beiden Richtungen mit Sequenase II (United States Biochemicals) und mit universellen und reversen pUC-Primern (Boehringer) nach der Anleitung des Herstellers. Drei von vier rekombinanten pUC19- Isolaten, die sequenziert wurden, enthalten die korrekte Linkersequenz. Eine davon wird als pWW19 bezeichnet und in den weiteren Versuchen verwendet. Die Teil-DNA-Sequenz von pWW19, die in SEQ ID Nr. 21 angegeben ist, hat die folgenden Merkmale:
bp 30 bis 35 PstI-Stelle
bp 38 bis 44 BstEII-Stelle zur Subklonierung der variablen Domäne der schweren Kette
bp 54 bis 98 codierende Sequenz für den (GlyGlyGlyGly- Ser)&sub3;-Linker
bp 105 bis 110 PvuII-Stelle
bp 112 bis 117 BglII-Stelle
bp 120 bis 125 BclI-Stelle zur Subklonierung der variablen Domäne der leichten Kette

5.2 Herstellung eines Plasmids für die Subklonierung der variablen Domänen:

Die Fv klonierende Linkersequenz stammt von einem HindIII SacI-Fragment aus pWW19 mit 144 bp und wird in ein mit HindIII/SacI verdautes Bluescript% KS+ (von PvuII) (Stratagene) insertiert, das keine PvuII-Restriktionsstellen enthält. Das entstehende Plasmid, pWW15, lässt das Klonieren der variablen Domänen der schweren und leichten Kette als PstI/BstEII- bzw. PvuII/BglII-Fragmente zu.

5.2.1 Subklonierung der variablen Domäne der schweren Kette von FRP5:

Plasmid pMZl6/l wird mit PstI und BstEII verdaut und das Fragment der variablen Domäne der schweren Kette mit 338 bp von FRP5 wird isoliert. Es wird in mit PstI/BstEII verdauten pWWl9 kloniert, was das Plasmid pWW31 liefert.

5.2.2 Mutation der variablen Domäne der leichten Kette von FRP5 und Zusammenbau des Fv-Fusionsgens:

Um die Subklonierung der variablen Domäne der leichten Kette von FRP5 in den Fv-Klonierungslinker zu erleichtern, wird eine PwII-Restriktionsstelle und eine BglII-Restriktionsstelle am 5'- bzw. 3'-Ende der codierenden Region eingeführt. Die die variable Domäne der leichten Kette von FRP5 codierende Region wird als SacI/BamHI-Fragment aus pMZ18/1 isoliert. SacI und BamHI sind Restriktionsstellen auf dem Bluescript% Polylinker, der in pMZ18/1 vorhanden ist. Das Fragment enthält das komplette Fragment für die variable Domäne der leichten Kette mit 392 bp, amplifiziert durch PCR unter Verwendung des Oligonucleotids MCK2 (siehe oben). Dieses Fragment wird mutiert und amplifiziert mit PCR unter Verwendung der Oligonucleotide
zur Einführung einer PvuII-Restriktionsstelle am 5'-Ende (VL5') und einer BglII-Restriktionsstelle am 3'-Ende (VL3') der DNA der variablen Domäne der leichten kappa-Kette. 20 ng des SacI/BamHI-Fragments der variablen leichten Kette von FRP5 werden als Matritze verwendet in einem 100-ml-Ansatz gemäß den in Beispiel 4.3 beschriebenen PCR-Bedingungen. Das amplifizierte und mutierte Fragment wird nach PvuII/BglII- Verdau als 309-bp-Fragment auf einem 1,5% Agarosegel isoliert und in mit PvuII/BglII-verdauten pWWlS kloniert, was Plasmid pWW41 erzeugt. Die variable Domäne der leichten kappa-Kette von FRP5 wird isoliert als BstEII/XbaI-Fragment aus pWW41 und in mit BstEII/XbaI verdauten pWW31 insertiert. Somit werden die variable Domäne der schweren Kette von FRP5 in pWW31 und die variable Domäne der leichten kappa-Kette von FRP5 zu einem offenen Leserahmen fusioniert. Doppelsträngige DNA der drei unabhängigen Klone wird mit einem Sequenase II%-Kit (United Biochemicals) in beiden Richtungen unter Verwendung von universellen und reversen pUC-Primern (Boehringer) nach der Anleitung des Hersteller sequenziert. Eines der Plasmide, das die variable Domäne der schweren Kette von FRP5 trägt, die an die mutierte variable Domäne der leichten Kette von FRP5 fusioniert ist, wird selektiert und mit pWW52 bezeichnet.

5.3 Mutation des einzelkettigen Fv(FRP5)-Gens:

Um eine Genfusion mit dem einzelkettigen Fv(FRP5) codierenden Gen aus pWW52 zuzulassen, wird ein Stopcodon in der Sequenz an der Position am 3'-Ende in pWW52 wie folgt deletiert: Plasmid-DNA von pWW52 wird mit BstEII und BglII verdaut und die Linkersequenz und das die variable Domäne der leichten Kette von FRP5 codierende Fragment isoliert. In einem weiteren Verdau wird pWW52 mit BstEII und BclI gespalten. Somit wird das große Fragment, das die Vektorsequenzen und die Sequenz, die die variable Domäne der schweren Kette von FRP5 enthält, isoliert. Das BstEII/BglII-VL-Fragment wird nun in mit BstEII/BclI gespaltenen pWW52, der VH enthält, insertiert. In dem entstehenden Plasmid, pWW53, wird die BglII/BclI-Verbindung bestimmt, indem doppelsträngige DNA, wie oben beschrieben, sequenziert wird (SEQ ID Nr. 24).

Beispiel 6

Konstruktion des Plasmids pWW152-5

6.1 Oligonucleotide

Ein doppelsträngiger DNA-Adaptor mit HindIII- und PstIkompatiblen Enden wird konstruiert, indem 0,5 nmol des Oligonucleotids mit der in SEQ ID Nr. 25 angegebenen Sequenz mit - 0,5 nmol des Oligonucleotids mit der in SEQ ID Nr. 26 angegebenen Sequenz durch 3-minütige Inkubation bei 65ºC vereinigt und auf Raumtemperatur gekühlt werden. Die Struktur des Oligonucleotidadaptors ist wie folgt:

6.2 Ableitung des pWW15-Vektorfragments und Reinigung:

Plasmid pWWlS (1 mg, siehe Beispiel 5.2) wird mit HindIII und PstI verdaut. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) aufgetrennt und das erwartete 3,1 kb HindIII/PstI-Vektorfragment wird eluiert.

6.3 Ligation des pWW15-HindIII/PstI-Fragments und des Oligonucleotidadaptors:

Das HindIII/PstI-Fragment aus pWW15 (50 ng) und 50 umol Oligonucleotidadaptor werden über Nacht bei 16ºC ligiert unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0, 8 mM ATP. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Strategene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid-"Miniprep"-Methode. Das erhaltene Plasmid wird mit pWW152 bezeichnet.

6.4 Ableitung der DNA-Fragmente und Reinigung:

Das Plasmid pWW152 (1 mg) wird mit PstI und XbaI verdaut. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt und das erwartete 3,1 kb PstI/XbaI-Vektorfragment wird eluiert. Das Plasmid pWW53 (1 mg) wird mit PstI und XbaI verdaut. Die DNA-Fragmente werden getrennt und das PstI/XbaI-DNA-Fragment, das scFv(FRP5) codiert, wird, wie oben beschrieben, eluiert.

6.5 Ligation despWW152-Vektorfragments und des scFv(FRP5)- Genfragments:

Das Plasmid pWW152 (50 ng), das mit PstI und XbaI verdaut wurde, und 30 ng gereinigtes PstI/XbaI scFv(FRP5)-Fragment werden über Nacht bei 16ºC ligiert unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DDT und 0,8 mM ATP. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid-"Miniprep"-Methode. Das erhaltene Plasmid wird mit pWW152-5 bezeichnet. Die DNA-Sequenz für das scFv(FRP5)- Gen zwischen HindIII- und XbaI-Restriktionsstelle ist identisch mit der Sequenz von Plasmid pWF46-5 (siehe Beispiel 8) von Nucleotidposition bp 109 bis Position bp 845, wie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt.

Beispiel 7

Konstruktion des Einzelketten-Fv(FRP5)-DETA-DGAL4-Fusionsgens

7.1 Ableitung der DNA-Fragmente und Reinigung:

pWW35 (1 mg) wird mit XbaI und EcoRI verdaut. Die DNA- Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt und das erwartete 821 bp XbaI/EcoRI- DNA-Fragment, das das DETA-DGAL4-Fusionsgen und benachbarte synthetische Sequenzen trägt, wird eluiert. Plasmid pWW152-5 (1 mg), das das Gen trägt, das das für erbB-2 spezifische Einzelketten-Fv(scFv)-Molekül scFv(FRP5) codiert, wird mit HindIII und XbaI verdaut. Die DNA-Fragmente werden getrennt und das erwartete 735 bp HindIII/XbaI-DNA-Fragment, das das scFv-Gen trägt, wird wie oben beschrieben eluiert.

7.2 Ligation:

pFLAG-1 (50 ng) (IBI Biochemicals), das mit HindIII und EcoRI verdaut wurde, und 30 ng gereinigtes HindIII/XbaI-scFv(FRP5)- Fragment und 30 ng gereinigtes XbaI/EcoRI-DETA-DGAL4-Fragment werden unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mM ATP über Nacht bei 16ºC ligiert. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid-"Miniprep"-Methode. Das erhaltene Plasmid wird mit pWF45-5 bezeichnet.

Beispiel 8

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das das scFv(FRP5)- DETA-DGAL4-Fusionsgen trägt

8.1 Ableitung der DNA-Fragmente und Reinigung:

pWF45-5 (1 mg) wird mit HindIII und SalI verdaut. Die DNA- Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt und das erwartete 907 bp HindIII/SalI- DNA-Fragment, das das scFv (FRP5) -DETA&sub2;&sub5;&sub2;&submin;&sub3;&sub0;&sub8;-(codierend für die ETA-Aminosäuren 252 bis 308)-Fusionsgen trägt, wird eluiert. pWF45-5 (1 mg) wird mit SalI und XbaI verdaut. Die DNA- Fragmente werden getrennt und das erwartete 655 bp SalI/XbaI- DNA-Fragment, das DETA&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub6;-DGAL4 codiert, wird wie oben beschrieben eluiert.

8.2 Ligation:

Plasmid pFLAG-1 wird mit HindIII und XbaI verdaut und ein doppelsträngiger DNA-Linker, der 6 His-Reste am 5'-Ende und die ursprünglichen HindIII-, EcoRI- und XbaI-Restriktionsstellen von pFLAG-1 am 3'-Ende codiert, wird 3' vom FLAG- Epitop insertiert. Das entstehende Plasmid pSW50 (50 ng), das mit HindIII und XbaI verdaut wurde, und 30 ng gereinigtes HindIl/SalI scFv(FRP5)-DETA2s2309-Fragment und 30 ng gereinigtes Sal/XbaI DETA3093ss-DGAL4-Fragment werden unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mM ATP über Nacht bei 16ºC ligiert. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid- "Miniprep"-Methode (Maniatis et al., oben). Das erhaltene Plasmid wird mit pWF46-5 bezeichnet. Die teilweise DNA- Sequenz von pWF46-5 ist in SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Diese Sequenz hat die folgenden Merkmale:
bp 1 bis 63 codieren E. coli ompA-Signalpeptid
bp 64 bis 87 codieren synthetisches FLAG-Epitop
bp 88 bis 114 synthetische Spacersequenz
bp 115 bis 834 codieren scFv(FRP5)
bp 835 bis 843 synthetische Spacersequenz
bp 844 bis 1188 codieren Aminosäuren 252 bis 366 von ETA
bp 1189 bis 1191 synthetische Spacersequenz
bp 1192 bis 1629 codieren Aminosäuren 2 bis 147 der Hefe GAL4
bp 1630 bis 1653 synthetischer Spacer mit Sequenz, die KDEL-Retentionssignal codiert
bp 1654 bis 1656 ochre-Stopcodon
bp 1657 bis 1692 nicht codierender synthetischer Spacer
Die abgeleitete Aminosäuresequenz des von pWF46-5 codierten scFv(FRP5)-DETA-DGAL4-Proteins einschließlich eines Peptidspacers am N-Ende (aa 1 bis 17) ist in SEQ ID Nr. 2 gezeigt.

Beispiel 9

Bakterielle Expression und Reinigung von scFv(FRP5)-DETA-DGAL4

Das Plasmid pWF46-5 wird in E. coli K12 transformiert. Eine rekombinante einzelne Kolonie wird über Nacht in 50 ml LB- Medium, das 100 ug/ml Ampicillin und 0,6% Glucose enthält, gezüchtet. Die Über-Nacht-Kultur wird 1 : 30 in 1 l frischem LB-Medium, das 100 ug/ml Ampicillin und 0,6% Glucose enthält, verdünnt und bei 37ºC bis zu einer OD&sub5;&sub5;&sub0; von 0,5 gezüchtet. Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) wird auf eine Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben und die Expression wird 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur induziert. Die Zellen werden bei 4ºC durch Zentrifugation mit 17.000 g 10 Minuten lang in einer J2-HS-Zentrifuge (Beckman) unter Verwendung eines JA10-Rotors (Beckman) geerntet.

9.1 Isolierung von scFv(FRP5)-ΔETA-ΔGAL4 aus dem bakteriellen Zellpellet:

Das bakterielle Zellpellet wird in 30 ml Lysepuffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 uM ZnCl&sub2;, 0,3 mM PMSF, 8 M Harnstoff enthält, resuspendiert. Die Bakterienzelle werden durch 3-minütige Beschallung auf Eis lysiert. Das Lysat wird vorsichtig 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt und dann bei 4ºC in einer TL100-Ultrazentrifuge (Beckman) 25 Minuten lang mit 100.000 g zentrifugiert. Der Überstand wird gesammelt, Imidazol wird auf eine Endkonzentration von 10 mM zugegeben und bei 4ºC aufbewahrt.

9.2 Reinigung von scFv(FRP5)-ΔETA-ΔGAL4 mit Affinitätschromatographie:

Eine Nickel-NTA-Affinitätssäule (QIAGEN) wird mit 50 mM Tris- HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 uM ZnCl&sub2;, 0,3 mM PMSF, 8 M Harnstoff, 10 mM Imidazol equilibriert. Der geklärte Überstand aus Stufe 9.1, der das scFv(FRP5)-ΔETA-ΔGAL4-Protein enthält, wird durch die Säule geleitet. Die Säule wird mit Equilibrierungspuffer gewaschen. Gebundenes Protein wird mit 250 mM Imidazol in Equilibrierungspuffer eluiert. Das Eluat wird zuerst 16 Stunden lang bei 4ºC gegen 60 Volumina 50 mM Tris- HCl, pH 8,0, 50 mM KCl, 5 mM MgCl&sub2;, 10 uM ZnCl&sub2;, 20% Glycerin, 400 mM L-Arginin dialysiert. L-Arginin wird durch eine zweite Dialyse 16 Stunden bei 4ºC gegen 60 Volumina des gleichen Dialysepuffers, dem L-Arginin fehlt, entfernt. Die dialysierte Proteinlösung wird bei 4ºC durch Zentrifugation mit 23.000 g 30 Minuten lang in einer J2-HS-Zentrifuge (Beckman) unter Verwendung eines JA20-Rotors (Beckman) geklärt. Der Überstand wird gesammelt und bei 4ºC aufbewahrt. Die Proteinreinheit wird mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in einem 12,5% Polyacrylamidgel bestimmt. Die typische Proteinreinheit nach der Reinigung ist größer 90%.

Beispiel 10

Konstruktion von eukaryontischen Expressionsplasmiden, die GAL4-Erkennungssequenzen enthalten

Eine Familie von Plasmiden, die jeweils zwei GAL4-Erkennungssequenzen enthalten, wird konstruiert. Die Plasmide bestehen aus einem bakteriellen Replikationsursprung, einem bakteriellen selektierbaren Markergen und einer eukaryontischen Expressionseinheit mit der folgenden allgemeinen Struktur:
eukaryontischer Promotor - interessierendes Gen - Intron - dimere GAL4-Erkennungssequenz - Polyadenylierungsstelle

10.1 Oligonucleotide:

Ein doppelsträngiger DNA-Adaptor mit für HindIII und BamHI kompatiblen Enden wird konstruiert, indem 0,5 nmol des in SEQ 1D Nr. 27 angegebenen Oligonucleotids mit 0,5 nmol des in SEQ 1D Nr. 28 angegebenen Oligonucleotids durch 3-minütige Inkubation bei 65ºC reassoziiert und auf Raumtemperatur gekühlt werden. Das teilweise doppelsträngige DNA-Oligonucleotid, das zwei GAL4-Bindungsmotive enthält, wird mit G4 bezeichnet. Die Struktur des Oligonucleotidadaptors ist unten gezeigt:
Die Merkmale sind wie folgt:
bp 1 bis 4 HindIII-kompatibles überhängendes Ende;
bp 6 bis 11 BamHI-Restriktionsstelle;
bp 11 bis 27 GAL4-Bindungsmotiv I;
bp 28 bis 32 Spacersequenz;
bp 33 bis 49 GAL4-Bindungsmotiv 11;
bp 48 bis 52 BamHI-kompatibles überhängendes Ende.
Die Ligation des BamHI-kompatiblen Endes mit der BamHI-Stelle eines Restriktionsfragmenes führt zur Zerstörung der BamHI- Restriktionsstelle.

10.2 Ableitung der pSV2CAT-DNA-Fragmente und Reinigung:

Das Plasmid pSV2CAT (1 mg) (Gorman et al., Mol. Cell. Biol. 2: 1044, 1982) wird mit HindIII und BamHI verdaut. Die DNA- Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt und das erwartete 3,4 kb HindIII/BamHI-pSV2D-Vektorfragment und das 1,6 kb HindIII/BamHI-Insertionsfragment, das das Chloramphenicolacetyltransferase- (CAT)-Gen trägt, und benachbarte Vektorsequenzen werden eluiert.

10.3 Ligation des pSV2D-Fragments und Oligonucleotidadaptors:

pSV2D (50 ng) HindIII/BamHI-Fragment und 50 umol Oligonucleotidadaptor werden unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mM ATP über Nacht bei 16ºC ligiert. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid-"Miniprep"-Methode (Maniatis et al., oben). Das folgende Plasmid wird erhälten: pSV2D-G4.

10.4 Ligation von pSV2D-G4 und CAT-DNA-Fragment:

pSV2D-G4 (50 ng), das mit HindIII und BamHI verdaut wurde, und 30 ng des 1,6 kb HindIII/BamHI-Insertionsfragments von pSV2CAT, das das Chloramphenicolacetyltransferase-(CAT)-Gen und benachbarte Vektorsequenzen trägt, werden ligiert, die Ligationsmischung in E. coli transformiert und die Ligationsprodukte werden, wie in 10.3 beschrieben, gescreent. Das folgende Plasmid wird erhalten: pSV2CAT-G4.

10.5 Ableitung des pSV2NE0-DNA-Fragments und Reinigung:

psV2NE0 (1 mg) (Southern & Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327, 1982) wird mit HindIII und BamHI verdaut. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt und das erwartete 2,3 kb HindIII/BamHI-Insertionsfragment, das das Neomycinphosphoribosyltransferase- (NEO)-Gen und benachbarte Vektorsequenzen trägt, wird eluiert.

10.6 Ligation von pSV2D-G4 und NEO-DNA-Fragment:

Plasmid pSV2D-G4 (50 ng), das mit HindIII und BamHI verdaut wurde, und 30 ng des 2,3 kb HindIII/BamHI-Insertionsfragmentes, das das Neomycinphosphoribosyltransferase-(NEO)-Gen und benachbarte Vektorsequenzen trägt, werden ligiert, die Ligationsmischung in E. coli transformiert und die Ligationsprodukte, wie in 10.3 beschrieben, gescreent. Das folgende Plasmid wird erhalten: pSV2NE0-G4.

10.7 Ableitung des pCH110-β-Galactosidase-DNA-Fragments und Reinigung:

Das Plasmid pCH110 (1 mg) (Pharmacia) wird mit HindIII und BamHI verdaut. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt, und das erwartete 3,7 kb HindIII/BamHI-Insertionsfragment, das das β- Galactosidasegen und benachbarte Vektorsequenzen trägt, wird eluiert.

10.8 Ligation von pSV2D-G4 und β-Galactosidase-DNA-Fragment:

pSV2D-G4 (50 ng), das mit HindIII und BamHI verdaut wurde, und 30 ng des 3,7 kb HindIII/BamHI-Insertionsfragmentes, das das β-Galactosidasegen und benachbarte Vektorsequenzen trägt, werden ligiert, die Ligationsmischung in E. coli transformiert und die Ligationsprodukte werden, wie in 6.3 beschrieben, gescreent. Das folgende Plasmid wird erhalten: pSV2bGal- G4.

10.9 Ligation von pSV2D-Fragment und β-Galactosidase-DNA- Fragment:

pSV2D (50 ng) HindIII/BamHI-Fragment und 30 ng des 3,7 kb HindIII/BamHI-Insertionsfragmentes, das das β-Galactosidasegen und benachbarte Vektorsequenzen trägt, werden ligiert, die Ligationsmischung in E. coli transformiert und die Ligationsprodukte, wie in 10.3 beschrieben, gescreent. Das folgende Plasmid wird erhalten: pSV2bGal.

10.10 Ableitung des pSVDSLUC-Luciferase-DNA-Fragments und Reinigung:

pSVDSLUC (1 mg) (Gouilleux et al., Nuc. Acid Res. 19: 1563, 1991) wird mit HindIII und BamHI verdaut. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt und das erwartete 2,7 kb HindIII/BamHI- Insertionsfragment, das das Luciferasegen und benachbarte Vektorsequenzen trägt, wird eluiert.

10.11 Ligation von pSV2D-G4 und Luciferase-DNA-Fragment:

pSV2D-G4 (50 ng), das mit HindIII und BamHI verdaut wurde, und 30 ng des 2,7 kb HindIII/BaznHI-Insertionsfragmentes, das das Luciferasegen und benachbarte Vektorsequenzen trägt, werden ligiert, die Ligationsmischung in E. coli transformiert und die Ligationsprodukte, wie in 10.3 beschrieben, gescreent. Das folgende Plasmid wird erhalten: pSV2LUC-G4.

10.12 Ligation von pSV2D-Fragment und Luciferase-DNA-Fragment:

pSV2D (50 ng) HindIII/BamHI-Fragment und 30 ng des 2,7 kb HindIII/BamHI-Insertionsfragmentes, das das Luciferasegen und benachbarte Vektorsequenzen trägt, werden ligiert, die Ligationsmischung in E. coli transformiert und die Ligationsprodukte, wie in 6.3 beschrieben, gescreent. Das folgende Plasmid wird erhalten: pSV2LUC.

Beispiel 11

Bestimmung der DNA-Bindungsaktivität von scFv(FRP5)-DETA- DGAL4-Protein

Die DNA-Bindungsaktivität und Spezifität des scFv(FRP5)-ETA- DGAL4-Proteins, das in Beispiel 9 beschrieben wurde, wird in Gelretardierungsassays analysiert.

11.1 5'-DNA-Markierungsreaktion:

5 umol des teilweise doppelsträngigen DNA-Oligonucleotids von G4, das in Beispiel 6.1 beschrieben wurde, das 2 GAL4- Bindungsmotive enthält, wird 45 Minuten lang bei 37ºC mit 50 mci(g-³²P)dATP (10 mCi/ml) (Amersham) und 10 U T4- Polynucleotidkinase (Boehringer Mannheim) in einem Puffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM Magnesiumchlorid, 5 mM DTT und 0,1 mM EDTA enthält, inkubiert. ³²P-markiertes G4- Oligonucleotid wird durch Extraktion mit 1 Volumen einer 1 : 1- Mischung von Tris-HCl, pH 8,0 und gesättigtem Phenol und Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) gereinigt und anschließend wird die wässrige Phase mit 1 Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert und das G4-Oligonucleotid aus der wässrigen Phase durch Zugabe von 1 Volumen 4 M Ammoniumacetat, 0,2 Volumina 1 M Magnesiumchlorid und 2 Volumina Ethanol bei -20ºC über Nacht ausgefällt. Das Oligonucleotidpellet wird im Vakuum getrocknet und das trockene Pellet wird in Wasser auf eine Endkonzentration von 100 nM (1124 cpm/fmol) gelöst.

11.2 Gelretardierungsassay

1 umol scFv(FRP5)-DETA-DGAL4-Protein und 50 fmol 32Pmarkiertes G4-Oligonucleotid werden in einem 20-ml-Ansatz in einem Puffer, der 50 mM Hepes, pH 7,5, 50 mM Kaliumchlorid, 5 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Zinkchlorid, 6% Glycerin, 200 mg/ml Rinderserumalbumin und 50 mg/ml Poly-(dI-dC) (Boehringer Mannheim) enthält, vermischt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben werden auf einem nicht denaturierenden Polyacrylamidgel getrennt, wie von Carey et al. (J. Mol. Biol. 209: 423, 1989) beschrieben. Ein 18 · 20 cm 4,5% Acrylamidgel wird in einem Puffer bei pH 8,4 hergestellt, der 45 mM Tris-Base, 45 mM Borsäure, 1% Glycerin enthält. Die Proben werden durch Elektrophorese 2 bis 3 Stunden bei 200 V mit einem Laufpuffer mit pH 8,4, der 45 mM Tris- Base, 45 mM Borsäure, 1% Glycerin enthält, getrennt. Die Banden werden sichtbar gemacht, indem das Gel bei -80ºC über Nacht einen X-OMAT DS-Film (Kodak) belichtet. Die Intensität der Banden wird quantitativ ausgewertet unter Verwendung eines FUJIX BAS1000 Phosphorimager (Fuji). Als Ergebnis des Gelretardierungsassays werden zwei Banden mit gegenüber der freien Sonde verminderter Mobilität sichtbar, wobei der intensivere Komplex mit höherem Molekulargewicht zwei scFv(FRP5)-DETA-DGAL4-Dimere, gebunden an die Tandern-GAL4- Bindungsstellen auf der radioaktiven Sonde bedeutet und der Komplex mit geringerem Molekulargewicht ein scFv(FRP5)-DETA- DGAL4-Dimer gebunden an eines der Tandern-GAL4-Bindungsstellen auf der radioaktiven Sonde darstellt. Die nicht gebundene freie Sonde ist am Boden des Gels sichtbar.

11.3 Kompetitiver Assay:

Ein Gelretardierungsassay wird genau wie in Beispiel 10.2 beschrieben, durchgeführt, indem 1 umol scFv(FRP5)-DETA-DGAL4- Protein und 50 fmol ³²P-markiertes G4-Oligonucleotid in Gegenwart von nicht radioaktivem G4-Oligonucleotid, dessen Menge von 50 fmol auf 12,8 umol ansteigt, als Konkurrent inkubiert wird, was zu G4/³²P-G4-Verhältnissen von 1, 4, 16, 64, 256 führt. Die Ergebnisse des kompetitiven Assays zeigen, dass die Bindung von scFv(FRP5)-DETA-DGAL4 an das ³²P-markierte G4-Oligonucleotid spezifisch ist, da steigende Konzentrationen des nicht radioaktiven Konkurrenten die Menge des Komplexes, der aus scFv(FRP5)-DET'A-DGAL4 und ³²P-markiertem G4-Oligonucleotid besteht, exponentiell vermindern.

Beispiel 12

Bestimmung der p185 erbB-2-Bindungsspezifität von scFv(FRP5)-DETA-DGAL4-Protein

Die p185 erbB-2-Bindungsaktivität und Spezifität des im Beispiel 9 beschriebenen scFv(FRP5)-DETA-DGAL4-Proteins wird in einem Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) analysiert.

12.1 Vorbereitung der ELISA-Platten:

Menschliche Brustkarzinomzellen SK-BR-3 (ATCC HTB30) werden in 96-Napf-Gewebekulturplatten mit einer Dichte von 1 · 10&sup5; Zellen pro Napfgeimpft und 24 Stunden bei 37ºC wachsen gelassen. Die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen, mit 3,7% Formaldehyd in PBS 20 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert und mit einem Puffer blockiert, der 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, !!1.I '.5
150 mM Natriumchlorid (TBS) und 3% Rinderserumalbumin enthält.

12.2 Bindungsassay:

100 ml scFv(FRP5)-DETA-DGAL4-Protein in TBS, das 3% Rinderserumalbumin enthält, in Konzentrationen im Bereich von 60 pM bis 1 mM werden in Dreifachansätzen zu den Zellen zugegeben und 1 Stunde bei 37ºC in angefeuchteter Atmosphäre inkubiert. Die Zellen werden zweimal mit TBS gewaschen und 100 ml einer 1 : 2000-Verdünnung eines polyklonalen Kaninchen-Antiserums, das gegen gereinigtes Pseudomonas Exotoxin A gezüchtet wurde (Wels et al., Cancer Res. 52: 6310, 1992) in TBS, das 3% Rinderserumalbumin enthält, werden 30 Minuten lang bei 37ºC in angefeuchteter Atmosphäre jedem Napfzugegeben. Die Zellen werden zweimal mit TBS gewaschen und 100 ml einer 1 : 4000- Verdünnung von mit alkalischer Phosphatase gekuppeltem Ziege- Antikaninchen-Serum (Sigma) in TBS, das 3% Rinderserumalbumin enthält, werden jedem Napf 30 Minuten bei 37ºC in feuchter Atmosphäre zugegeben. Die Zellen werden zweimal mit TBS gewaschen und die Aktivität von gebundener alkalischer Phosphatase wird bestimmt, indem die Zellen mit 100 ml pro Napfmit 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 1 M Tris-HCl, pH 8,0, inkubiert werden. Die alkalische Phosphataseaktivität in jedem Napfwird quantitativ ausgewertet, indem die spezifische Absorption bei 405 nm im Vergleich zur unspezifischen Absorption bei 490 nm in einem Mikroplattenlesegerät (Dynatech) bestimmt wird. scFv(FRP5)-DETA-DGAL4 bindet an SK-BR-3-Zellen mit einem Wert für die halbmaximale Sättigung von 2 · 10&supmin;&sup8; M.

Beispiel 13

DNA-Transferversuche

13.1 Calciumphosphattransfektion:

Calciumphosphattransfektionen von COS-1- und SK-BR-3-Zellen werden mit dem in Beispiel 10 beschriebenen pSV2LUC-G4-Repor- terplasmid durchgeführt. Zu DNA-Lösungen in Wasser wird 2,5 M Calciumchlorid auf eine Endkonzentration von 166 mM Calciumchlorid zugegeben. 1 Volumen 2x HBS-Puffer, pH 7,12, der 50 mM HEPES, 15 mM Na&sub2;HPO&sub4; und 280 mM Natriumchlorid enthält, wird tropfenweise bei konstantem Durchströmen von Luftblasen durch die Mischung zugegeben. Die endgültige DNA-Konzentration in der Mischung ist 10 nM in dem Versuch mit den COS-1- Zellen und 1,9 nM in dem Versuch mit SK-BR-3-Zellen. In der Lösung werden sich 30 Minuten lang bei Raumtemperatur Kristalle bilden gelassen. 100 ml der Lösung werden zu einem Napfder Gewebekulturzellen in 12-Napf-Gewebekulturplatten zugegeben, wie in 13.2 beschrieben, die Zellen werden geerntet und Luciferaseeinheiten werden bestimmt, wie in 13.3 beschrieben.

13.2 Zellkultur und DNA-Transfer:

Menschliche Brustkarzinomzellen SK-BR-3 (ATCC HTB30) und mit COS-1 SV40-transformierte Nierenzellen vom African Green Monkey (ATCC CRL1650) werden in 12-Napf-Gewebekulturplatten mit einer Dichte von 3,6 · 10&sup4; Zellen/Napfgeimpft und über Nacht bei 37ºC gezüchtet. Das Gewebekulturmedium wird gegen 1 ml/Napffrisches Medium ausgetauscht und die Zellen werden weitere 5 Stunden lang gezüchtet. 100 ml der jeweiligen Probe, die in 13.4, 13.5, 13.6 oder 13.7 beschriebene DNA- Transfermischung enthält, wird jedem Napfzugegeben und die Zellen werden bei 37ºC über Nacht inkubiert. Das Gewebekulturmedium wird durch 2 ml/Napffrisches Medium ersetzt und die Zellen werden weitere 24 Stunden inkubiert, bevor sie für die Analyse, wie in 13.3 beschrieben, geerntet werden.

13.3 Luciferaseassay:

Das Medium wird von den Zellen entfernt und die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen. 100 ml Lysepuffer, pH 7,8, der 25 mM Gly-Gly-Dipeptid (Sigma), 1 mM DTT, 15% Glycerin, 8 mM Magnesiumsulfat, 1 mM EDTA, 1% Triton X100 enthält, wird jedem Napfzugegeben und die Zellen werden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Lysat wird gesammelt und 5 Sekunden lang in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert, um teilchenförmiges Material zu entfernen. 50 ml des t)berstandes werden mit 50 ml Verdünnungspuffer, pH 7, 8, der 25 mM Gly- Gly-Dipeptid, 10 mM Magnesiumsulfat, 5 mM ATP enthält, gemischt. 300 ml Luciferinlösung, pH 7, 8, die 25 mM Gly-Gly- Dipeptid, 0,5 mM Co-Enzym A (Boehringer Mannheim), 250 mM Luciferin (Sigma) enthält, wird zu der Probe zugegeben und die Luciferaseaktivität wird mit einem Luminometer bestimmt.

13.4 Durch scFv(FRP5)-DETA-DGAL4-vermittelter DNA-Transfer in COS-1-Zellen:

DNA des pSV2LUC-G4-Reporterplasmids, das in Beispiel 10 beschrieben wurde, wird mit scFv(FRP5)-DETA-DGAL4-Protein mit einer endgültigen Konzentration von 10 nM (DNA) und 40 nM (Protein) in einem Puffer vermischt, der 50 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM Kaliumchlorid, 5 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Zinkchlorid enthält. Die Mischung wird 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, damit sich Protein/DNA-Komplexe bilden können. Poly-L-lysin (Sigma) wird zu der Mischung auf eine endgültige Konzentration von 100 bzw. 500 nM zugegeben und die Mischung wird weitere 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. 100 ml der Lösung werden zu einem Napfmit COS-1- Zellen in 12-Napf-Gewebekulturplatten, wie in 13.2 beschrieben, zugegeben, die Zellen werden geerntet und Luciferaseeinheiten werden bestimmt, wie in 13.3 beschrieben. Die Expression von Luciferase wird in Zellen, die mit der in 13.1 beschriebenen Calciumphosphattransfektionsmethode transfiziert wurden, und Zellen, die mit dem scFv(FRP5)-DETA-DGAL4/ pSV2LUC-G4-Komplex, der Poly-L-lysin enthält, behandelt wurden, nachgewiesen, nicht aber in Zellen, die mit pSV2LUC-G4 und Poly-L-lysin allein behandelt wurden.

13.5 scFv(FRP5)-DETA-DGAL4-vermittelter DNA-Transfer in 5K- BR-3-Zellen:

Eine Mischung, die DNA des pSV2LUC-G4-Reporterplasmids und scFv(FRP5)-DETA-DGAL4-Protein enthält, wird hergestellt, wie in 13.4 beschrieben. Die Mischung wird 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, damit sich Protein/DNA-Komplexe bilden können. Poly-L-lysin (Sigma) wird zu der Mischung auf eine endgültige Konzentration von 100 nM zugegeben und die Mischung wird weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 100 ml der Lösung werden zu einem Napfmit SK-BR-3-Zellen in 12-Napf-Gewebekulturplatten zugegeben, wie in 13.2 beschrieben, die Zellen werden geerntet und Luciferaseeinheiten werden bestimmt, wie in 13.3 beschrieben. Die Expression von Luciferase wird in Zellen, die mit der Calciumphosphattransfektionsmethode, die in 13.1 beschrieben wurde, transfiziert wurden, und in Zellen, die mit scFv(FRP5)-DETA-DGAL4/pSV2LUC- G4-Komplex, der Poly-L-lysin enthält, behandelt wurden, nachgewiesen, nicht aber in Zellen, die mit pSV2LUC-G4 allein oder scFv(FRP5)-DETA-DGAL4/pSV2LUC-G4-Komplex ohne Zugabe von Poly-L-lysin behandelt wurden.

13.6 Kompetitiver Assay:

Eine Mischung, die DNA des pSV2LUC-G4-Reporterplasmids und scFv(FRP5)-DETA-DGAL4-Protein enthält, wird hergestellt, wie in 13.4 beschrieben. Die Mischung wird 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubtert, damit sich Protein/DNA-Komplexe bilden können. Poly-L-lysin (Sigma) wird zu der Mischung auf eine Endkonzentration von 500 nM zugegeben und die Mischung wird weitere 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Probe wird hergestellt, die zusätzlich zu dem pSV2LUC- G4-Reporterplasmid, scFv(FRP5)-DETA-DGAL4 und Poly-L-lysin den monoklonalen Antikörper FRP5 enthält, der die gleiche Bindungsspezifität, wie scFv(FRP5)-DETA-DGAL4 hat, als Konkurrent für die Bindung an p18SerbB2 auf eine Endkonzentration von 1, 2 mM. 100 ml der Lösung werden in einen Napfmit COS-1- Zellen in 12-Napf-Gewebekulturplatten zugegeben, wie in 13.2 beschrieben, die Zellen werden geerntet und die Luciferaseeinheiten bestimmt, wie in 13.3 beschrieben. Die Expression von Luciferase wird in Zellen nachgewiesen, die mit scFv(FRP5)-DETA-DGAL4/pSV2LUC-G4-Komplex, der Poly-L-lysin enthält, behandelt wurden, nicht aber in Zellen, die nur mit pSV2LUC-G4 und Poly-L-lysin oder scFv(FRP5)-DETA-DGAL4/ pSV2LUC-G4-Komplex, der Poly-L-lysin enthält, in Gegenwart eines Überschusses von monoklonalem Antikörper FRP5 als Konkurrent behandelt wurden.

Beispiel 14

Isolierung von RNA aus der Brustkarzinomzelllinie MDA-MB-468

14.1 Wachstum der MDA-MB-468-Zellen:

MDA-MB-468-Brustkarzinomzellen (ATCC HTB 132) werden als Monolayers auf Gewebekulturplatten bei 37ºC in DMEM (Seromed), das weiterhin 8% FCS (Amined) und 100 mg/ml Gentamycin (Seromed) enthält, in einer angefeuchteten Luftatmosphäre mit 7,5% CO&sub2; gezüchtet. Die Zellen werden zweimal mit PBS auf Eis gewaschen, das PBS wird entfernt und die Platten werden auf Eis gehalten.

14.2 Extraktion der gesamten zellulären RNA aus MDA-MB-468- Zellen

Die gesamte RNA wird extrahiert unter Verwendung der Säure- Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Methode, die von Choczynski & Dacchi (Anal. Biochem. 162: 156, 1987) beschrieben wird. Die Zellen aus zwei halb zusammenfließenden Gewebekulturplatten werden auf Eis in Gegenwart von 2 ml denaturierender Lösung (siehe Beispiel 3.2) lysiert. Das Lysat wird bei Raumtemperatur homogenisiert. Aufeinander folgend werden 0,2 ml 2 M Natriumacetat, pH 4,2 ml Phenol (mit Wasser gesättigt) und 0,4 ml Chloroform-Isoamylalkoholmischung (49 : 1) zu dem Lysat zugegeben. Die fertige Suspension wird 10 Sekunden lang heftig geschüttelt und 15 Minuten lang auf Eis gekühlt. Die Proben werden 20 Minuten lang mit 10.000 · g bei 4ºC zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird RNA, die in der wässrigen Phase vorhanden ist, mit 2 ml Isopropanol vermischt und 1 Stunde lang auf -20ºC gebracht. Der RNA- Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt, das Pellet in 0,5 ml Wasser gelöst und die RNA durch Zugabe von 1 Volumen Isopropanol bei -20ºC ausgefällt. Nach Zentrifugation und Waschen des Pellets in Ethanol wird das endgültige Pellet aus RNA in Wasser gelöst. Die Methode liefert ungefähr 100 mg der gesamten zellulären RNA. Das fertige gereinigte Material wird gefroren bei -20ºC aufbewahrt.

Beispiel 15

Klonierung eines menschlichen transformierenden Wachstumsfaktor-a-cDNA-Fragments

Die gesamte aus MDA-M-468-Zellen isolierte zelluläre RNA, wie in Beispiel 14 beschrieben, liefert die Quelle für die cDNA- Synthese und die anschließende Amplifikation eines menschlichen transformierenden Wachstumsfaktor (TGF)-a codierenden cDNA-Fragments. Die Amplifikationsprodukte mit der erwarteten Größe werden mit Agarosegelen gereinigt und in geeigneten Vektoren kloniert. Intakte cDNA-Klone werden durch Sequenzierung identifiziert.

15.1 eDNA-Synthese:

5 mg der gesamten aus MDA-MB-468-Zellen isolierten RNA werden in 33 ml einer Erst-Strang-cDNA-Synthesereaktion mit 11 ml Bulk First Strand Reaction Mix (Pharmacia), 200 ng NotId(T)&sub1;&sub8;-Primer (Pharmacia) und 1 ml 200 mM DTT-Lösung gemäß den vom Vertreiber vorgeschriebenen Verfahren verwendet.

15.2 Polymerasekettenreaktion:

2 ml des cDNA-Ansatzes werden für die DNA-Amplifikation in einem 50-ml-Ansatz verwendet, der jeweils 25 umol der zwei Oligonucleotide, die komplementär zu Regionen in dem Human- TGF-a-Gen sind:
5' - GACCCGAAGCTTGGTACCGGTGTGGTGTCCCATTTTAATG-3'
(SEQ ID Nr. 29) und
5'- TTCTGGGAGCTCTCTCTAGAGAGGCCAGGAGGTCCGC-3"
(SEQ ID Nr. 30), 4 ml 2,5 mM dNTP- (N = G, A, T, C) -Mischung und 5 ml 10 · Vent-DNA-Polymerasepuffer (New England Biolabs) und 2,5 U Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs) enthält. Vent-DNA-Polymerase wird nach anfänglicher 4-minütiger Denaturierung bei 94ºC zugegeben. über 30 Zyklen wird das Annealing 1 Minute bei 52ºC durchgeführt, die Primerextension 45 Sekunden bei 72ºC, die Denaturierung 1 Minute bei 94ºC. Schließlich wird die Amplifikation vervollständigt durch eine 2-minütige Primerextensionsstufe bei 72ºC.

15.3 Modifikation und Reinigung:

Die Amplifikationsprodukte werden auf einem 1,5% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt. DNA mit der erwarteten Größe wird eluiert und anschließend mit HindIII und XbaI verdaut. Das erwartete 171-bp-DNA-Fragment, das die Aminosäuren 1 bis 50 von menschlichem TGF-a codiert, wird auf einem 1,5% Agarosegel abgetrennt und durch Elution aus dem Gel gereinigt, wie oben beschrieben.

15.4 Ligation:

Das Plasmid pFLAG-1 wird mit SalI verdaut und mit Klenow- Enzym behandelt, um glatte Enden zu erzeugen; das linearisierte Fragment wird mit XbaI verdaut. Ein trunkiertes Pseudomonas-ETA-Gen, dem die zellbindende Domäne Ia fehlt, wird aus pWW20 (siehe Beispiel 1.1) durch EcoRI-Spaltung, Klenowfill-in und anschließenden XbaI-Verdau isoliert. Dieses XbaI- Fragment mit glatten Enden wird in den XbaI-pFLAG-1-Vektor mit glatten Enden insertiert: Das entstehende Plasmid, pSG100, wird mit HindIII und XbaI verdaut und ein doppelsträngiger DNA-Linker, der 6 Histidinreste codiert, wird im Leserahmen 5' der ETA-Sequenzen insertiert, was pSW200 liefert. Ein DNA-Fragment, das das ompA-Signalpeptid, das FLAG- Epitop und die N-terminalen Histidin codierenden Sequenzen enthält, wird durch NdeI- und XbaI-Verdau von pSW50 (siehe Beispiel 8.2) isoliert und in mit NdeI/XbaI verdauten pSW200 insertiert. Das entstehende Plasmid wird mit pSW202 bezeichnet. pSW202 (50 ng), das mit HindIII und XbaI verdaut wurde, und 30 ng gereinigtes Amplifikationsprodukt werden über Nacht bei 16ºC ligiert unter Verwendung von 0,5 U T4- DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8-mM ATP. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid-"Miniprep"-Methode (Maniatis et al., oben). Das folgende Plasmid wird erhalten: pSW202-TGF. Die Teil-DNA- Sequenz von pSW202-TGF ist in SEQ ID Nr. 31 gezeigt. Diese Sequenz hat die folgenden Merkmale:
bp 1 bis 15 synthetischer Spacer
bp 16 bis 165 codieren Aminosäuren 1 bis 50 von menschlichem TGF-a
bp 166 bis 173 synthetischer Spacer

Beispiel 16

Konstruktion des TGF-a-DETA-DGAL4-Fusionsgens

16.1 Ableitung von DNA-Fragmenten und Reinigung

pSW202-TGF (1 mg) wird mit HindIII und SalI verdaut. Die DNA- Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt und das erwartete bp HindIII/SalI DNA- Fragment, das das TGF-a-DETA&sub2;&sub5;&sub2;&submin;&sub3;&sub0;&sub8;-Fusionsgen trägt, wird eluiert. Das Plasmid pWF45-5 (1 mg) wird mit SalI und XbaI verdaut. Die DNA-Fragmente werden getrennt und das erwartete 655 bp SalI/XbaI-DNA-Fragment, das DETA&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub6;-DGAL4 codiert, wird wie oben beschrieben eluiert. pWF45-5 (1 mg) wird mit HindIII und XbaI verdaut. Die DNA-Fragmente werden getrennt und das erwartete HindIII/XbaI-Vektorfragment wird wie oben beschrieben eluiert.

16.2 Ligation:

50 ng gereinigtes HindIII/XbaI pWF45-5-Vektorfragment und 30 ng gereinigtes HindIII/SalI TGF-a-DETA-Fragment und 30 ng gereinigtes Sal/XbaI DETA-DGAL4-Fragment werden über Nacht bei 16ºC ligiert unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7, 8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mM ATP. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid- "Miniprep"-Methode. Das folgende Plasmid wird erhalten: pWF47-TGF. Die Teil-DNA-Sequenz von pWF47-TGF codiert das TGF-a-DETA-DGAL4-Fusionsprotein, das in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist. Diese Sequenz hat die folgenden Merkmale:
bp 1 bis 63 codieren E. coli ompA-Signalpeptid
bp 64 bis 87 codieren das synthetische FLAG-Epitop
bp 88 bis 99 Spacersequenz
bp 100 bis 249 codieren Aminosäuren 1 bis 50 von Human- TGF-a
bp 259 bis 276 codieren 6 His-Reste
bp 277 bis 279 synthetische Spacersequenz
bp 280 bis 624 codieren Aminosäuren 252 bis 366 von ETA
bp 625 bis 627 Spacer
bp 628 bis 1065 codieren aa 2 bis 147 der Hefe GAL4
bp 1066 bis 1089 Spacer mit Sequenz, die KDEL-Retentionssignal codiert.
Die teilweise abgeleitete Aminosäuresequenz des pWF47-TGF codierte TGF-a-DETA-DGAL4-Protein einschließlich eines Peptidspacers am N-Ende (aa 1 bis 12), und ist in SEQ ID Nr. 4 gezeigt.

Beispiel 17

Bakterielle Expression und Reinigung von TGF-a-DETA-DGAL4

Eine Translokationsdomäne, die von P. aeruginosa Exotoxin A (ETA) ableitbar ist, insbesondere eine Domäne, die im Wesentlichen aus Domäne 11 von ETA (Aminosäuren 253 bis 364 von ETA, wie in Gray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 2645, 1984 angegeben) besteht, z. B. eine Translokationsdomäne, die aus den Aminosäuren 252 bis 366 von ETA besteht, wird in den Beispielen 17 und 18 im Zusammenhang mit den SEQ ID Nr. 1, 3 und 5 beschrieben.
Das Plasmid pWF47-TGF wird in E. coli K12 (Manoil & Beckwith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 8129, 1985) transformiert. Die Expression und Reinigung von TGF-a-DETA-DGAL4 wird durchgeführt, wie in Beispiel 9 für die Expression und Reinigung von scFv(FRP5)-DETA-DGAL4 beschrieben.

Beispiel 18

Konstruktion eines Interleukin-2-DETA-DGAL4-Fusionsgens

18.1 Polymerasekettenreaktion:

20 ng eines pBR322-Derivats, das ein Human-Interleukin (IL)- 2-cDNA-Insert (Taniguchi et al., Nature 302: 305, 1983) trägt, wird für die DNA-Amplifikation in einen 50-ml-Ansatz, der jeweils 25 umol der zwei Oligonucleotide, die komplementär zu Regionen im menschlichen IL-2-Gen sind
5'-TATAATAAGCTYGCACCTACTTCAAEG -3'
(SEQ ID Nr. 32) und
5'-TTGAATGCTAGCGTTAGTGTTGAGAATG -3'
(SEQ ID Nr. 33),
4 ml 2,5 mM dNTP-(N = G, A, T, C)-Mischung und 5 ml lOx Vent- DNA-Polymerasepuffer (New England Biolabs) und 2,5 U Vent- DNA-Polymerase (New England Biolabs) enthält, verwendet. Vent-DNA-Polymerase wird nach anfänglicher Denaturierung, 4 Minuten bei 94ºC, zugegeben. Über 30 Zyklen wird das Annealing 1 Minute bei 50ºC durchgeführt, die Primerextension 45 Sekunden bei 72ºC, die Denaturierung 1 Minute bei 94ºC.
Schließlich wird die Amplifikation vervollständigt durch eine 2-minütige Primerextensionsstufe bei 72ºC.

18.2 Modifikation und Reinigung:

Die Amplifikationsprodukte werden auf einem 1,5% (W/G) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt, die DNA der erwarteten Größe wird eluiert und anschließend mit HindIII und NheI verdaut. Das erwartete 408-bp-DNA-Fragment, das die Aminosäuren 1 bis 113 von menschlichem IL-2 codiert, wird auf einem 1,5% Agarosegel getrennt und durch Elution von dem Gel gereinigt, wie oben beschrieben.

18.3 Ableitung der DNA-Fragmente und Reinigung:

pWF46-5 (1 mg) (siehe Beispiel 8) wird mit XbaI und EcoRI verdaut. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt und das erwartete 821 bp XbaI/EcoRI-DNA-Fragment, das die DETA-DGAL4-codierende Region trägt, wird eluiert. In einem getrennten Verdau wird pWF46-5 (1 mg) mit HindIII und EcoRI verdaut. Die DNA- Fragmente werden getrennt und das erwartete 5,4 kb HindIII/EcoRI-Vektorfragment wird wie oben beschrieben eluiert.

18.4 Ligation:

Das pWF46-5-HindIII/EcoRI-Vektorfragment (50 ng), 30 ng gereinigtes HindIII/NheI IL-2-cDNA-Fragment und 30 ng gereinigtes XbaI/EcoRI DETA-DGAL4-Fragment werden über Nacht bei 16ºC ligiert unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7, 8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mM ATP. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid-"Miniprep"- Methode. Das folgende Plasmid wird erhalten: pWF46-IL-2. Die Teil-DNA-Sequenz von pWF46-IL-2 wird in SEQ ID Nr. 5 gezeigt. Die Sequenz hat die folgenden Merkmale:
bp 1 bis 63 codieren E. coli ompA-Signalpeptid
bp 64 bis 87 codieren FLAG-Epitop
bp 88 bis 114 Spacersequenz
bp 109 bis 114 Spacersequenz
bp 115 bis 513 codieren Human-IL-2-Aminosäuren 1 bis 113
bp 514 bis 516 Spacersequenz
bp 517 bis 861 codieren Aminosäuren 252 bis 366 von ETA
bp 862 bis 865 Spacer
bp 866 bis 1302 codieren aa 2 bis 147 der Hefe GAL4
bp 1303 bis 1326 Spacer mit Sequenz, die KDEL-Retentionssignal codiert
bp 1327 bis 1329 Ochre-Stopcodon
Die teilweise abgeleitete Aminosäuresequenz von pWF46-IL-2, das IL-2-DETA-DGAL4-Protein mit einem N-terminalen Peptidspacer codiert (aa), ist in SEQ ID Nr. 6 gezeigt.

18.5 Bakterielle Expression und Reinigung von IL-2-DETA- DGAL4:

Das Plasmid pW46-IL-2 wird in E. coli CC118 (Manoil & Beckwith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8129, 1985) transformiert. Die Expression und Reinigung von IL-2-DETA-DGAL4 wird ausgeführt, wie in Beispiel 8 für die Expression und Reinigung von scFv(FRP5)-DETA-DGAL4 beschrieben.
Hinterlegungsdaten:
E. coli XL 1 Blue/pWF47-TGF wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, am 24. Oktober 1994 mit der Hinterlegungsnummer DSM 9513 hinterlegt.

Beispiel 19

Konstruktion von Plasmid pSW50-GD5

Ein Plasmid für die bakterielle Expression eines Fusionsproteins, das aus dem ompA-Signalpeptid, ΔGAL4, einem Fragment, das die Aminosäuren Vall96 bis Gly384 des Diphtherie-Toxin- (DT)-B-Fragments (Translokationsdomäne) überspannt, der scFv- (FRP5)-Einzelkettenantikörperdomäne und benachbarten Linkersequenzen besteht, wird konstruiert.

19.1 Deletion von scFv(FRP5) und ΔETA-Domänen aus Plasmid pWF46-5:

pWF46-5 (1 ug) wird mit HindIII verdaut. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt und das DNA-Fragment, das aus dem pSW50-Vektor und dem AGAL4-Fragment besteht, wird wie oben beschrieben eluiert. Das eluierte Fragment wird anschließend über Nacht bei 16ºC ligiert unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mM ATP. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid- "Miniprep"-Methode (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Das folgende Plasmid wird erhalten: pSW50-G.

19.2 Insertion einer Linkersequenz:

Ein doppelsträngier DNA-Adaptor mit SacI- und SalI-kompatiblen Enden, der eine innere NheI-Restriktionsstelle enthält, wird konstruiert, indem 0,5 nmol des Oligonucleotids 5'-CGCTAGCTGGTGGTG-3' (SEQ ID Nr. 50) mit 0,5 nmol des Oligonucleotids 5'-TCGACACCACCAGCTAGCGAGCT-3' (SEQ ID Nr. 51) durch 3-minütige Inkubation bei 65ºC und Abkühlen auf Raumtemperatur vereinigt werden. pSW50-G (1 ug) wird mit SacI und SalI verdaut. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt und das DNA- Fragment, das aus dem pSW50-Vektor und dem ΔGAL4-Fragment besteht, wird wie oben beschrieben eluiert. Das eluierte Fragment (50 ng) und 20 umol SacI/SalI-Oligonucleotidadaptor werden anschließend über Nacht bei 16ºC ligiert unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mM ATP. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid-"Miniprep"-Methode (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Das folgende Plasmid wird erhalten: pSW50-G/Nhel.

19.3. Isolierung des Diphtherietoxin-Genfragments, das die Translokationsdomäne (ADT) codiert:

Ein Plasmid (pJV127), das das Diphtherietoxin-Interleukin-2- Fusionsgenfragment, das DAB389-IL-2 codiert, enthält (Williams et al., J. Biol. Chem. 265: 11885-11889, 1990) wird als Matritze in einer Polymerasekettenreaktion verwendet, um ein DNA-Fragment mit den Aminosäuren Vall96 bis Gly384 des Diphtherietoxin-(DT)-B-Fragments (Translokationsdomäne), das mit ADT bezeichnet wird, zu amplifizieren.
50 ng pJV127 werden für die DNA-Amplifikation in einem 50-ul- Ansatz verwendet, der jeweils 50 umol der zwei Oligonucleotide, die komplementär sind zu Regionen des Diphtherietoxingens 5'CGTGTCAGGCTAGCAGTAGGTAGC-3' (SEQ ID Nr. 52) und 5'- CATGCGTGTCGACACCCGGAGAGTAAGC-3' (SEQ ID Nr. 53), 4 ul 2,5 mM dNTP-(N = G, A, T, C)-Mischung, 5 ul lOx Taq DNA-Polymerasepuffer (Boehringer Mannheim) und 2,5 U Taq DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) enthält. Die Taq DNA-Polymerase wird nach anfänglicher 2-minütiger Denaturierung bei 94ºC zugegeben. Über 30 Zyklen wird das Annealing 1 Minute bei 55ºC, die Primerextension 1 Minute bei 72ºC, die Denaturierung 1 Minute bei 94ºC durchgeführt. Schließlich wird die Amplifikation durch eine 3-minütige Primerextensionsstufe bei 72ºC abgeschlossen.
Die Amplifikationsprodukte werden auf einem 1,2% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt, die DNA mit der erwarteten Größe wird wie oben beschrieben eluiert und anschließend mit NheI und SalI verdaut. Das erwartete 575 bp Diphtherietoxin-DNA-Fragment, das die Translokationsdomäne und benachbarte synthetische Linkersequenzen codiert, wird auf einem 1,2% Agarosegel abgetrennt und durch Elution aus dem Gel, wie oben beschrieben, gereinigt.

19.4 Ligation

pSW50-G/NheI (50 ng), das mit NheI und SalI verdaut wurde, und 30 ng gereinigtes Amplifikationsprodukt werden über Nacht bei 16ºC ligiert unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mM ATP. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid-"Miniprep"-Methode (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Das folgende Plasmid wird erhalten: pSW50-GD.

19.5 Ableitung des scFv(FRP5)-DNA-Fragments und Ligation von pSW50-GD5:

pWW152-5 (1 ug), das das Gen trägt, das das für ErbB-2 spezifische Einzelketten-Fv(scFv)-Molekül scFv(FRP5), das von Wels et al., Int. J. Cancer 60: 137-144, 1995, beschrieben wurde, trägt, wird mit SalI und BamHI verdaut. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt und das erwartete 756 bp SalI/BamHI-DNA- Fragment, das die scFv(FRP5)-Domäne und benachbarte synthetische Sequenzen trägt, wird wie oben beschrieben eluiert. pSW50-GD (50 ng), das mit SalI und BglII verdaut wurde, und scFv(FRP5)-SalI/BamHI (50 ng) DNA-Fragmente werden über Nacht bei 16ºC ligiert unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mM ATP. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird.verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid-"Miniprep"-Methode (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Das folgende Plasmid wird erhalten: pSW50-GD5. Die Teil-DNA-Sequenz von pSW50-GD5 ist in SEQ ID Nr. 34 gezeigt. Die Sequenz hat die folgenden Merkmale:
bp 1 bis 63 codieren E. coli ompA-Signalpeptid
bp 64 bis 87 codieren synthetisches FLAG-Epitop
bp 88 bis 108 synthetische Spacersequenz
bp 109 bis 546 codieren Aminosäuren 2 bis 147 der Hefe GAL 4
bp 547 bis 558 synthetische Spacersequenz
bp 559 bis 1125 codieren Aminosäuren Vall96 bis Gly384 von Diphtherietoxin
bp 1126 bis 1146 synthetische Spacersequenz
bp 1147 bis 1866 codieren scFv(FRP5)
bp 1867 bis 1908 synthetische Spacersequenz
bp 1909 bis 1911 Stopcodon
bp 1912 bis 1919 nicht codierender synthetischer Spacer Die abgeleitete Aminosäuresequenz von pSW50-GDS, das ΔGAL4- ΔDT-SCFV(FRP5) (= GD5)-Protein mit einem Peptidspacer am N- Ende (aa 1 bis 15) codiert, ist in SEQ ID Nr. 35 gezeigt.

Beispiel 20

Konstruktion von Plasmid pSW55-GD5

Ein Plasmid für die bakterielle Expression eines Fusionsproteins, das aus ΔGAL4, einem Fragment, das die Aminosäuren Vall96 bis Gly384 des Diphtherietoxin-(DT)-B-Fragments (Translokationsdomäne) überspannt, der scFv(FRP5)-Einzelketten-Antikörperdomäne und benachbarten Linkersequenzen besteht, wird konstruiert.

20.1 Insertion einer Linkersequenz:

Ein doppelsträngiger DNA-Adaptor mit NdeI- und HindIIIkompatiblen Enden wird konstruiert, indem 0,5 nmol des Oligonucleotids
5'-TATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGAGCTGCACCATCATCATCACCATCACA -3' (SEQ ID Nr. 54) mit 0,5 nmol des Oligonucleotids 3'-AGCTTGTGATGGTGATGATGGTGCAGCTTCTTGTCATCGTCCTTGTAGTCCA -3' (SEQ ID Nr. 55) durch 3-minütige Inkubation bei 65ºC und Abkühlen auf Raumtemperatur hybridisiert werden.
pSW50 (1 ug) wird mit NdeI und HindIII verdaut. Die DNA- Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt und das pSW50-Vektor-DNA-Fragment wird wie oben beschrieben eluiert. Das eluierte Fragment (50 ng) und 20 umol NdeI/HindIII-Oligonucleotidadaptor werden anschließend über Nacht bei 16ºC ligiert unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mM ATP. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillinresistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid-"Miniprep"-Methode (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Das folgende Plasmid wird erhalten: pSW55.

20.2 Ableitung der DNA-Fragmente und Ligation:

pSW50-GD5 (1 ug) wird mit HindIII und KpnI und in einer getrennten Reaktion mit KpnI und XhoI verdaut. Die DNA- Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt und das erwartete 673 bp HindIII/KpnI- DNA-Fragment, das die ΔGAL4-Domäne, den 5'-Teil der ADT- Domäne und benachbarte synthetische Sequenzen trägt, und das 1106 bp KpnI/XhoI-Fragment, das den 3'-Teil der ADT-Domäne, die scFv(FRP5)-Domäne und benachbarte synthetische Sequenzen trägt, werden wie oben beschrieben eluiert. pSW55 (50 ng), das mit HindIII und XhoI verdaut wurde, und die HindIII/KpnI- und KpnI/XhoI-(jeweils 50 ng)-DNA-Fragmente werden über Nacht bei 16ºC ligiert unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mm ATP. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid-"Miniprep"-Methode (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Das folgende Plasmid wird erhalten: pSW55-GD5. Die Teil-DNA-Sequenz von pSW55-GD5 ist in SEQ ID Nr. 36 gezeigt. Die Sequenz hat die folgenden Merkmale:
bp 1 bis 3 synthetische Spacersequenz
bp 4 bis 27 codieren synthetisches FLAG-Epitop
bp 28 bis 51 synthetische Spacersequenz
bp 52 bis 489 codieren Aminosäuren 2 bis 147 der Hefe GAL 4
bp 490 bis 501 synthetische Spacersequenz
bp 502 bis 1068 codieren Aminosäuren VaLL96 bis GLy384 des Diphtherietoxins
bp 1069 bis 1089 synthetische Spacersequenz
bp 1090 bis 1809 codieren seFv(FRP5)
bp 1810 bis 1851 synthetische Spacersequenz
bp 1852 bis 1854 Stopcodon
bp 1855 bis 1862 nicht codierender synthetischer Spacer Die abgeleitete Aminosäuresequenz von pSW55-GD5, das ΔGAL4- ΔDT-scFv(FRP5)-(= GD5)-Protein mit einem Peptidspacer am N- Ende (aa 1 bis 17) codiert, ist in SEQ ID Nr. 37 gezeigt.

Beispiel 21

Konstruktion von Plasmid pSW50-GDI

Ein Plasmid für die bakterielle Expression eines Fusionsproteins, das aus dem ompA-Signalpeptid, AGAL4, einem Fragment, das die Aminosäuren VaLL96 bis GLy384 des Diphtherietoxin- (DT)-B-Fragments (Translokationsdomäne) überspannt, der Human-Interleukin-2-(IL-2)-Domäne und benachbarten Linkersequenzen besteht, wird konstruiert.

21.1 Konstruktion von Plasmid pWW152-IL-2:

Das Plasmid pSW50-IL-2 (1 ug) wird mit EcoRI verdaut. Die linearisierte DNA wird mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) (Boehringer Mannheim) behandelt, um glatte Enden zu erzeugen (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) und anschließend mit HindIII verdaut. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt und das erwartete 418 bp HindIII/glattendige DNA- Fragment, das die IL-2-Domäne und benachbarte synthetische Sequenzen trägt, wird wie oben beschrieben eluiert. Das Plasmid pWW152, das mit HindIII und PvuII (50 ng) verdaut wurde, und das HindIII/glattendige IL-2-DNA-Fragment werden über Nacht bei 16ºC ligiert unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA- Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mM ATP. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid-"Miniprep"-Methode (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Das folgende Plasmid wird erhalten: pWWI52-IL-2.

21.2 Ableitung der DNA-Fragmente und Ligation:

pWW152-IL-2 (1 ug) wird mit SalI und BglII verdaut. Die DNA- Fragmente werden auf einem 1,0% (G/V) Agarosegel (ultrareine Agarose, BRL) getrennt und das SalI/BglII-DNA-Fragment, das die IL-2-Domäne und benachbarte synthetische Sequenzen trägt, wird wie oben beschrieben eluiert. pSW50-GD (50 ng), das mit SalI und BglII verdaut wurde, und IL-2-SalI/BglII-(50 ng) DNA-Fragmente werden über Nacht bei 16ºC ligiert unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mM ATP. Eine Hälfte der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli XL1 Blue (Stratagene) zu transformieren, um Ampicillin-resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf das gewünschte Ligationsprodukt gescreent unter Verwendung einer auf NaOH basierenden Plasmid-"Miniprep"-Methode (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Das folgende Plasmid wird erhalten: pSW50-GDI. Die Teil-DNA-Sequenz von pSW50-GDI ist in SEQ ID Nr. 38 gezeigt. Die Sequenz hat die folgenden Merkmale:
bp 1 bis 63 codieren E. coli ompA-Signalpeptid
bp 64 bis 87 codieren synthetisches FLAG-Epitop
bp 88 bis 108 synthetische Spacersequenz
bp 109 bis 546 codieren Aminosäuren 2 bis 147 der Hefe GAL 4
bp 547 bis 558 synthetische Spacersequenz
bp 559 bis 1125 codieren Aminosäuren Vall96 bis Gly384 von Diphtherietoxin
bp 1126 bis 1152 synthetische Spacersequenz
bp 1153 bis 1551 codieren Human-IL-2-Aminosäuren 1 bis 113
bp 1552 bis 1554 Stopcodon
bp 1555 bis 1605 nicht codierender synthetischer Spacer
Die abgeleitete Aminosäuresequenz von pSW50-GDI, das ΔGAL4- ΔDT-IL-2-(= GDI)-Protein mit einem Peptidspacer am N-Ende (aa 1 bis 15) codiert, ist in SEQ ID Nr. 39 gezeigt.

Beispiel 22

Bakterielle Expression und Reinigung von GD5

Die Plasmide pSW50-GD5 oder pSW55-GD5 werden in E. coli K12 transformiert. Die Expression und Reinigung des AGAL4-ADTscFv (FRP5) -Proteins GD5 wird durchgeführt, wie in Beispiel 9 für die Expression. und Reinigung von scFv(FRP5)-AETA-AGAL4 beschrieben.

Beispiel 23

Durch GD5 vermittelter DNA-Transfer in COS-1-Zellen

COS-1-Zellen werden in 12-Napf-Gewebekulturplatten geimpft, wie in Beispiel 13.2 beschrieben. Die DNA des pSV2LUC-G4- Reporterplasmids, das in Beispiel 10 beschrieben wurde, wird mit dem GDS-Protein mit einer Endkonzentration von 10 nM (DNA) und 40 nM (Protein) vermischt, unter Verwendung der Puffer- und Inkubationsbedingungen, die in 13.4 beschrieben sind. Poly-L-lysin (Sigma) wird zu der Mischung zugegeben, wie in 13.4 beschrieben und der Komplex wird den COS-1-Zellen zugegeben, wie in 13.2 beschrieben. Die Zellen werden geerntet und die Luciferaseeinheiten werden bestimmt, wie in 13.3 beschrieben. Die Expression von Luciferase wird in Zellen nachgewiesen, die mit GDS/pSV2LUC-G4-Komplex, der Poly-Llysin enthielt, behandelt wurden, nicht aber in Fällen, die mit pSV2LUC-G4 und Poly-L-lysin alleine behandelt wurden.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Wels, Winfried, Dr.
(B) STRASSE: Glimpenheimer Str. 55
(C) ORT: Emmendingen
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: D-79312
(G) TELEFON: 0761-206-1630
(H) TELEFAX: 0761-206-1599
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Nucleinsäure-Transfersystem
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 55
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1692 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) Klon: pWF46-5
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: SIG_PEPTIDE
(B) LAGE: 1..63
(D) SONSTIGE ANGABEN:/Produkt = "E.coli OmpA-Signalpeptid"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CD5
(B) LAGE: 64..1656
(D) SONSTIGE ANGABEN:/Produkt = "scFv(FRP5)-ΔETA-ΔGAL4"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN;
(A) LANGE: 530 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1128 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) Klon: pWF47-TGF
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CD5
(B) LAGE: 64..1092
(D) SONSTIGE ANGABEN: /teilweise/Produkt = "TGFα-ΔETA-ΔGAL4-Fusionsprotein"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: SIG_PEPTIDE
(B) LAGE: 1..63
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Produkt = "E.coli OmpA-Signalpeptid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 342 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) AET DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1365 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) Klon: pWF46-IL-2
ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: SIG_PEPTIDE
(B) LAGE: 1..63
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CD5
(B) LAGE: 64..1329
(D) SONSTIGE ANGABEN:/ Produkt = "IL-2-AETA-AGAL4 " (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 421 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 7:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 41 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 7:
CGAGAAGCTT GAGAGCTCTG ACTACAAAGA CGAACTTTAAT G 41
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 43 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genoniisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 8:
AATTCTTAAA GTTCGTCTTT GTAGTCAGAG CTCTCAAGCT 43
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 394 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) Klon: pWW 25 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 9:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 10:
CAGATGAAGC TTCTGTCTTC 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) SRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 11:
GAATGAGCTC GATACAGTCA ACTG 24
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 443 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) Klon: pWF35 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 12:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 13
TCACTGGATG GTGGGAAGAT GGA 23
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 14:
AGATCCAGGG GCCAGTGGAT AGA 23
(2)ANGABEN ZU SEQ ID N0: 15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 47 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 15:
CAAGCTTCTC AGGTACAACT GCAGGAGGTC ACCGTTTCCT CTGGCG 47
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 16:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 43 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 17:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 43 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 18:
GCCACCGCCG GAGCCACCGC CACCAGAACC GCCACCGCCA GAG 43
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 19:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 19:
ATCCAGCTGG AGATCTAGCT GATCAAAGCT 30
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 20:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 43 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 20:
CTAGAGCTTT GATCAGCTAG ATCTCCAGCT GGATGTCAGA ACC 43
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 21:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 175 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 21:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 22:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 22:
GACATTCAGC TGACCCAG 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 23:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 23:
GCCCGTTAGA TCTCCAATTT TGTCCCCGAG 30
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 24:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 24:
ACAAAATTGG AGATCAAAGC TCTAGA 26
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 25:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genonüsch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 25:
AGCTTCAGGT ACAACTGCA 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 26:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 11 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 26:
GTTGTACCTG A 11
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 27:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 48 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKIJLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 27:
AGCTTGGATC CGGAGGACAG TCCTCCGGAG ACCGGAGGAC AGTCCTCC 48
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 28:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 4B Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 28:
GATCGGAGGA CTGTCCTCCG GTCTCCGGAG GACTGTCCTC CGGATCCA 48
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 29:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genontisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 29:
GACCCGAAGC TTGGTACCGG TGTGGTGTCC CATTTTAATG 40
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 30:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKULS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 30:
TTCTGGGAGC TCTCTAGAGA GGCCAGGAGG TCCGC 35
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 31:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 173 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 31:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 32:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 32:

TATAATAAGC TTGCACCTAC TTCAAG 26
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 33:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 33:
TTGAATGCTA GCGTTAGTGT TGAGATG 27
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 34:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 1919 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 64..1908 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 34:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 35:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 615 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 35:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 36:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1862 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..1851 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 36:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 37:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 617 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 37:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 38:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 1605 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLUSSEL: CDS
(B) LAGE: 64..1551 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 38:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 39:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 496 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 39:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 40:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 40:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0 : 41:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKULS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 41:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 42:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 42:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 43:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(ii) ART DES MOLEKYLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 43:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 44:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 44:
CGGAGGACAG TCCTCCG 17
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 45:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 45:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 46:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 46:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 47:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 47:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 48:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 48:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 49:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 49:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 50:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 50:
CGCTAGCTGG TGGTG 15
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 51:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 51:
TCGACACCAC CAGCTAGCGA GCT 23
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 52:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKtYLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 52:
CGTGTCAGGC TAGCAGTAGG TAGC 24
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 53:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKtYLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 53:
CATGCGTGTC GACACCCGGA GAGTAAGC 28
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 54:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 53 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG; SEQ ID N0: 54:
TATGGACTAC AAGGACGACG ATGACAAGAA GCTGCACCAT CATCACCATC ACA 53
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 55:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 55 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 55:

AGCTTGTGAT GGTGATGATG GTGCAGCTTC TTGTCATCGT CGTCCTTGTA GTCCA 55

Claims

1. Multidomänenprotein umfassend als funktionelle Domänen eine zielzellspezifische Bindungsdomäne, eine Translokationsdomäne und eine Nucleinsäurebindungsdomäne, dadurch gekennzeichnet, dass die Translokationsdomäne von Diphterietoxin ableitbar ist und den Teil des Toxinmoleküls nicht beinhaltet, der zur cytotoxischen Wirkung des Moleküls beiträgt.

2. Multidomänenprotein umfassend als funktionelle Domänen eine zielzellspezifische Bindungsdomäne, eine Translokationsdomäne und eine Nucleinsäurebindungsdomäne, dadurch gekennzeichnet, dass die Translokationsdomäne von bakteriellen Toxinen ableitbar ist und die zielzellspezifische Bindungsdomäne einen Zelloberflächenrezeptor erkennt, der ausgewählt ist aus der Gruppe der mit dem EGF-Rezeptor verwandten Familie von Wachstumsfaktorrezeptoren.

3. Multidomänenprotein umfassend als funktionelle Domänen eine zielzellspezifische Bindungsdomäne, eine Translokationsdomäne und eine Nucleinsäurebindungsdomäne, dadurch gekennzeichnet, dass die Translokationsdomäne von einem bakteriellen Toxin ableitbar ist und die zielzellspezifische Bindungsdomäne einen Zelloberflächenrezeptor auf den Effektorzellen des Immunsystems erkennt.

4. Multidomänenprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Translokationsdomäne von dem Teil des Toxins ableitbar ist, der die Internalisierung des Toxins in die Zelle vermittelt.

5. Multidomänenprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Translokationsdomäne von den Aminosäuren 193 bis 378 oder 196 bis 384 des Diphterietoxins ableitbar ist.

6. Multidomänenprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zielzellspezifische Bindungsdomäne eine Einzelkettenantigenbindungsdomäne eines Antikörpers ist.

7. Multidomänenprotein nach Anspruch 1 umfassend als funktionelle Domänen eine zielzellspezifische Bindungsdomäne, eine Translokationsdomäne, eine Nucleinsäurebindungsdomäne und ggf. ein Retentionssignal für das endoplasmatische Retikulum und ein Kernlokalisationssignal, insbesondere ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Protein mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 35, SEQ ID Nr. 37 oder SEQ ID Nr. 39 angegeben ist.

8. Nucleinsäure, die ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert.

9. Vector umfassend eine Nucleinsäure nach Anspruch 8.

10. Protein/Nucleinsäurekomplex umfassend ein Multidomänenprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und eine Effektornucleinsäure, die an eine Zielzelle übergeben werden soll.

11. Verwendung eines Komplexes nach Anspruch 10 zur Übergabe einer gewünschten Nucleinsäure an eine Zielzelle in vitro.

12. Nucleinsäureübergabesystem umfassend den Komplex nach Anspruch 10.

13. Zusammensetzung zur Transfektion von eukaryontischen Zellen umfassend den Komplex nach Anspruch 10.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen Komplex nach Anspruch 10.

15. Komplex nach Anspruch 10 zur Verwendung für die therapeutische oder prophylaktische Behandlung eines Säugetiers.

16. Verwendung eines Komplexes nach Anspruch 10 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur therapeutischen und prophylaktischen Behandlung eines Säugetiers.

17. Transfektionskit umfassend ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und eine Effektornucleinsäure, die an eine Zielzelle übergeben werden soll.

18. Verfahren zur Übergabe einer Nucleinsäure an eine Zielzelle, insbesondere eine höhere eukaryontische Zelle, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Zellen dem Komplex gemäß Anspruch 10 in vitro aussetzt.

19. Wirtszelle enthaltend eine Nucleinsäure nach Anspruch 8.