DE69526521T2 - Modulation der immunantwort - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft die Verabreichung von Immunogenen und die Modulation (entweder Hemmung oder Verstärkung) der Immunreaktion.
• Der erste Kontakt mit Antigen ist die schwierigste Phase einer Immunreaktion. Die Schwelle für das Aktivieren ungeprimter T-Zellen ist höher, und B-Zellen exprimieren nicht mutierte Antigen-Rezeptoren mit im Allgemeinen niedriger Affinität. Dies kann problematisch sein, wenn die Notwendigkeit oder der Wunsch besteht, eine Immunreaktion auf ein Immunogen von Interesse zu erzeugen - z. B. aus therapeutischen Gründen, oder uni Antikörper für nachfolgende Manipulation und Verwendung zu erhalten.
• Das Komplementsystem spielt bei der Verstärkung der Immunreaktion eine wesentliche Rolle. Vor fast 20 Jahren zeigte Pepys, dass eine Abreicherung von Mäusen an C3 ihre Immunreaktion auf Schaf-Erythrozyten reduzierte (gemessen anhand ihrer Antikörperreaktion auf dieses Antigen) (1). Nachfolgende Studien an Menschen, Meerschweinchen und Hunden mit genetisch determinierter Defizienz an C3 oder an C4 und C2, jenen Proteinen, die C3-aktivierende Enzyme bilden, bestätigten die Schlussfolgerung, dass die Aktivierung von C3 die primäre Immunreaktion verstärkte (2).
• C3 ist ein Plasmaprotein, das einen Thioester enthält, der die kovalente Bindung an andere biologische Moleküle mediiert (3). Die Aktivierung von C3 zu Cdb mittels "C3- Convertase" nach klassischer oder alternativer Methode macht den Thioester verwundbar gegenüber Angriffen durch schwache Nucleophile, wie z. B. -OH oder Kohlenhydrate, was die Bindung von C3b über eine Esterbindung an ein Ziel-OH-tragendes Molekül in unmittelbarer Nähe zur Aktivierungsreaktion bewirkt. C3b (oder die proteolytisch verarbeiteten Fragmente iC3b und C3dg) komplexiert mit Antigen und bindet dann die Rezeptoren CR1, CR2 und CR3. Die Bindung der Komplexe an C3-Rezeptoren auf Follikeldendritenzellen in den primären Follikeln und Keimzentren sekundärer Lymphorgane kann die Entwicklung und das Überleben von Gedächtnis-B-Lymphozyten fördern. Die Bindung von Komplexen an Antigen-spezifische B-Lymphozyten bewirkt Vernetzung von CR2 an den Antigenrezeptor, Membran-Immunglobulin (mlg). CR2 ist mit dem B- Lymphozyten-Membranprotein CD19 assoziiert, das die Signalisierung durch mlg um das etwa 100fache verstärkt, wenn es daran co-ligiert ist.
• Ein limitierender Schritt in dieser Gesamtreaktion ist die Bindung von C3b. Es ist erforderlich, dass das Antigen das Komplementsystem aktivieren kann (entweder auf dem klassischen oder dem alternativen Weg) und dass es eine Steile besitzt, an die sich C3b kovalent binden kann. Es treten dann Probleme auf, wenn das Immunogen von Interesse beispielsweise ein lösliches Peptid und Protein ist, da diese häufig keine Aktivatoren des alternativen Wegs oder zur effektiven Bindung von C3b sind. Außerdem binden kreuzreaktive IgM-Antikörper geringer Affinität einwertige Proteinantigene nicht mit ausreichender Avidität, um den klassischen Weg zu aktivieren.
• Diese Schwierigkeiten kommen möglicherweise besonders beim Immunisieren mit kleinen Peptiden, z. B. mit jenen, die als Epitope für B- oder T-Zellen definiert wurden, und bei der DNA-Immunisierung zum Tragen (4). Obwohl Adjuvanzien dazu dienen können, die Immunogenität von Peptiden und nicht-aggregierten Proteinen zu verstärken, wenn Versuchstiere, wie z. B. Mäuse, immunisiert werden, ist im Allgemeinen ihre Verabreichung an Menschen nicht möglich oder zumindest nicht vorzuziehen.
• Die Erfindung bietet nun eine Möglichkeit, die Immunreaktion auf ein immunogen zu verstärken.
• Außerdem können Umstände eintreten, unter denen es wünschenswert ist, die Immunreaktion auf eine immunogene Substanz zu hemmen, d. h. zumindest zu reduzieren. Beispielsweise gilt der Verabreichung therapeutischer Antikörper großes Interesse. Historisch jedoch waren die verfügbaren Antikörper monoklonale Mäuse-Antikörper. Da der menschliche Körper solche Mäuse-Antikörper als fremd erkennt, wird gegen sie eine Immunreaktion gestartet, was zu ihrer raschen Ausscheidung aus dem Blutstrom führt. Es stehen verschiedene Techniken zur "Humanisierung" von Nicht-Human-Antikörpern und andere Techniken zur Verringerung ihrer fremden Natur zur Verfügung, doch sie erfordern oft hochqualifierte Personen für ihre Durchführung. Außerdem kann selbst nach einer "Humanisierung" das Immunsystem eine anti-idiotypische Reaktion in Gang setzen, wenn der Antikörper nicht mit dem Wirts-Idiotyp verträglich ist.
• Außerdem gibt es viele andere fremde, d. h. nicht-menschliche Substanzen, die an Individuen aus einer Reihe von Gründen, z. B. Therapie, verabreicht werden und für die es keine "Humanisierungs"-Techniken gibt. Eines von zahlreichen, den Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Beispielen ist das als "Blutgerinnselkiller" eingesetzte Medikament Streptokinase, das an Patienten mit Herzinfarkt verabreicht wird. Dieses Enzym ist bakteriellen Ursprungs, und es wird in Rezipienten eine Immunreaktion dagegen in Gang gesetzt.
Die Erfindung bietet außerdem die Möglichkeit, die Immunreaktion auf ein Immunogen zu hemmen.
• Die Erfindung und ihre unterschiedlichen Aspekte sind auf der überraschenden Entdeckung begründet, dass ein Koppeln des Komplement-C3-Fragments C3d (eines Liganden für CD21 (CR2)) an das Immunogen von Interesse die Modulation der Immunreaktion auf das Immunogen ermöglicht. Die Modulation kann eine Verstärkung oder Abschwächung der Antikörperreaktion auf die Immunogen-Verabreichung sein. Völlig unerwartet stellte sich heraus, dass die Immunreaktion durch Koppeln mehrerer C3d-Moleküle an das Immunogen verstärkt und durch Koppeln eines C3d-Moleküls an das Immunogen reduziert werden kann. Angesichts dieser Tatsache betrifft die Erfindung in ihren unterschiedlichen Aspekten die Modulation einer Immunreaktion durch Binden eines Antigens an einen Liganden für CD21 oder - da sich CD21 auf der Oberfläche von B- Zellen mit CD19 verbindet - mit einem Liganden für CD19.
• Gemäß der Erfindung wird somit eine Zusammensetzung für die Änderung der Immunogenität eines Immunogens bereitgestellt; dies erfolgt durch eine Zusammensetzung, die das Immunogen in Assoziation mit einem Liganden (oder "gekoppelt an" einen Liganden) für CD21 (CR2) oder CD19 umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung das Koppeln eines oder mehrerer C3d-Moleküle an das Immunogen.
• Wenn das gekoppelte C3d monomer ist, wird die Immunogenität des Immunogens reduziert. Wenn das gekoppelte C3d multimer ist, z. B. dimer, wird die Immunogenität des Immungens verstärkt. Mit gesteigerter oder verringerter Immunogenität wird die Immunreaktion eines Individuums, das das Immunogen erhält, verstärkt bzw. reduziert. Die Stärke der Immunreaktion kann beispielsweise anhand von Antikörperspiegeln gemessen werden.
• Die Assoziation von Antigen und Ligand kann solcherart sein, dass Modulation einer Reaktion in einer B-Zelle durch zwei Rezeptoren auf der B-Zelle stattfindet - ein Membran-Immunlgobulin (mlg), das für das Antigen spezifisch ist, und einen CD21/CD19- Komplex. Vorzugsweise wird eine Reaktion in einer B-Zelle stimuliert, doch unter bestimmten Umständen, z. B. wie besprochen, kann eine Reaktion in einer B-Zelle gehemmt werden. Experimentelle Tests zur Beurteilung der Fähigkeit, B-Zellen-Reaktionen durch mlg und den CD21/CD19-Komplex zu modulieren, sind hierin beschrieben. Beispielsweise kann eine Zunahme der intrazellulären Calcium-Konzentration bei Stimulierung Antigen-spezifischer B-Zellen unter Anwendung der Erfindung (im Vergleich zur Stimulierung mit Antigen alleine) als Indikator dafür herangezogen werden, dass die Zusammensetzung B-Zellen durch mlg und CD21/CD19 stimuliert.
• Die hierin beschriebenen experimentellen Arbeiten weisen auf T-Zellen-Beteiligung an der Immunreaktion hin. B-Zellen-Reaktionen auf Proteinantigene sind T-Zellen-abhängig. Außerdem entwickeln T-Zellen-unabhängige Reaktionen kein Gedächtnis; Gedächtnis wird hierin aufgezeigt. Außerdem ist die Isotyp-Umschaltung für T-Zellen-abhängige B-Zellen-Reaktionen charakteristisch.
• In einem zweiten Aspekt bietet die Erfindung eine Zusammensetzung, die ein Antigen/Immunogen in Assoziation mit einem Liganden (oder "gekoppelt an" einen Liganden) für CD21(CR2) oder CD19 umfasst. Eine solche Zusammensetzung kann ein Molekül (Konjugat) umfassen, das ein Antigen oder Immunogen umfasst, das an ein oder mehrere C3d-Moleküle gebunden ist. Wenn mehrere C3d-Moleküle mit dem Antigen verknüpft sind, ist es unter Umständen vorzuziehen, 2 oder 3 zu verwenden, wie dies hierin veranschaulicht wird. Da die unten beschriebenen Experimente auf eine Wirkungssteigerung mit zunehmender Anzahl an C3d-Molekülen hinweisen, kann es je nach den Umständen auch vorzuziehen sein, eine höhere Anzahl zu verwenden, z. B. 4, 5 oder mehr.
• Da eine bevorzugte Methode des Koppelns an C3d eine Peptidbindung vorsieht, kann das Konjugat ein zusammenhängendes Polypeptid, d. h. ein Fusionsprotein sein. In einem Fusionsprotein der Erfindung sind verschiedene Peptide oder Polypeptide im Rahmen miteinander verbunden, um ein zusammenhängendes Polypeptid zu bilden. Somit umfasst ein erster Abschnitt des Fusionsproteins ein Antigen oder Immunogen und ein zweiter Abschnitt des Fusionsproteins (entweder N- oder C-terminal zum ersten Abschnitt) einen CD21- oder CD19-Liganden. Es ist vorzuziehen, dass das Antigen mit dem Aminoterminus des C3d-Moleküls oder Repeats verbunden ist. Wenn der CD21- oder CD19-Ligand ein Antikörperfragment, wie z. B. ein einkettiges Fv-Molekül (scFv), ist, befindet sich die Fusion vorzugsweise am C-terminalen Ende des scFv-Moleküls, um die Beeinträchtigung seiner Bindungsleistung zu vermeiden.
• Eine flexible Linkersequenz (z. B. eine Polyglycin/Polyserin enthaltende Sequenz wie etwa [Gly&sub4;Ser]&sub2; (Huston et al., Meth. Enzymol. 203, 46-88 (1991)) kann in das Fusionsprotein zwischen dem Antigen und dem Liganden insertiert sein. Das Fusionsprotein kann auch so konstruiert sein, dass es einen "Epitop-Marker" enthält, der es dem Fusionsprotein ermöglicht, sich an Antikörper (z. B. monoklonalen Antikörper) zu binden, beispielsweise zwecks Markierung oder Reinigung. Ein Beispiel für einen Epitop-Marker ist ein Glu-Glu-Phe-Tripeptid, das vom monoklonalen Antikörper YL1/2 erkannt wird.
• Wenn das Immunogen ein Peptid oder Polypeptid ist, kann üblicherweise für das Immunogen kodierende Nucleinsäure mit für den Liganden, wie z. B. C3d (entweder ein einzelnes C3d-Molekül oder ein Repeat), kodierender Nucleinsäure fusioniert sein.
• Demzufolge bietet ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Nucleinsäure-Konstrukt, das eine Sequenz von Nucleotiden umfasst, die für einen Liganden von CD21 oder CD19 (z. B. C3d) kodiert und mit einer Sequenz von Nucleotiden fusioniert ist, die für ein Antigen/Immunogen von Interesse kodieren. Vorzugsweise ist das Nucleinsäure-Konstrukt ein Expressionsvektor, der einen geeigneten Promotor für die Expression der Fusion umfasst.
• Systeme zum Klonieren und Exprimieren eines Polypeptids in unterschiedlichen Wirtszellen sind allgemein bekannt. Geeignete Wirtszellen sind z. B. Bakterien, Säugetierzellen, Hefe und Bacolovirus-Systeme. Säugetier-Zeillinien, die auf dem Gebiet zur Expression eines heterologen Polypeptids zur Verfügung stehen, sind China-Hamster-Eierstockzellen, COS-Zellen, HeLa-Zellen, Babyhamster-Nierenzelten und dergleichen. Ein häufig verwendeter, bevorzugter bakterieller Wirt ist E. coli.
• Es können zweckentsprechende Vektoren ausgewählt oder konstruiert werden, die geeignete regulatorische Sequenzen enthalten, z. B. Promotorsequenzen, Terminatorfragmente, Polyadenylierungssequenzen, Enhancersequenzen, Markergene und andere Sequenzen. Neitere Details finden sich beispielsweise in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder in "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons, 1992. Die Transformationsverfahren hängen vom verwendeten Wirt ab, sind aber allgemein bekannt.
• Ein weiterer Aspekt der Erfindung bietet eine Wirtszelle, die ein oben geoffenbartes Nucleinsäure-Konstrukt umfasst. Ein zusätzlicher Aspekt bietet ein in vitro-Verfahren zur Herstellung einer Polypeptidfusion, umfassend einen Liganden von CD21 oder CD19, vorzugsweise ein oder mehrere C3d-Moleküle und ein weiteres (heterologes) Polypeptid oder Peptid, wobei das Verfahren das Kultivieren von Wirtszellen umfasst, die ein Nucleinsäure-Konstrukt enthalten, das eine Sequenz von für die Polypeptidfusion kodierenden Nucleotiden umfasst (unter Bedingungen zur Expression der Polypeptidfusion). An die Expression kann sich die Isolation der Polypeptidfusion aus den Zellen oder - falls durch die Zellen sekretiert - aus dem Kulturmedium schließen.
• Nucleinsäure zur erfindungsgemäßen Verwendung kann DNA oder RNA, einzelstrangig oder doppelstrangig, cDNA, genomische DNA oder voll- oder teilsynthetisch sein. Doppelstrangige DNA ist vorzuziehen.
• Die Nucleotidsequenz und vorhergesagte Aminosäuresequenz von Mäuse-C3d werden von Domdey et al., PNAS USA 79, 7619-7623 (1982), und Fey et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 421, 307-312 (1983), geoffenbart. Die Nucleotidsequenz und vorhergesagte Aminosäuresequenz für Human-C3d sind bei de Bruijn und Fey, PNAS USA 82, 708-712 (1985), geoffenbart. Nucleinsäure, die für C3d anderer Sioezies kodiert, kann mittels der Human- oder Mäuse-Sequenzinformation isoliert werden, um eine oder mehrere Sonden zur Verwendung in Standard-Hybridisierungsverfahren zu bilden. Wenn C3d in der Erfindung verwendet und an einen Probanden verabreicht weren soll, kann das C3d an die zu immunisierende Spezies angepasst werden (z. B. wird Mäuse-C3d für Mäuse verwendet, Human-C3d für Menschen usw.). Es sind hierin allerdings experimentelle Erkenntnisse geoffenbart, die Spezies-Kreuzreaktivität, zumindest zwischen Mäusen und Menschen (z. B. Mäuse-C3d, das sich an CD21 auf Humanzellen bindet, z. B. Raji-B- Lymphoblast-Zellen), aufzeigen, sodass das Spezies-Matching von C3d und dem Probanden möglicherweise nicht essenziell, wenn auch bevorzugt ist.
• In einer Ausführungsform, die eine Alternative zum Koppeln von Antigen/Immunogen und CD21/CD19-Ligand durch Expression als Fusionsprotein darstellt, kann chemische Vernetzung herangezogen werden. "Chemisch vernetzt" bedeutet die kovalente Verknüpfung unter Verwendung eines chemischen Vernetzers. Es wird ein chemischer Vernetzer ausgewählt, der mit funktionellen Gruppen auf dem Antigen und dem Liganden reagiert (z. B. Aminosäure-Seitenketten oder Amino- oder Carboxyterminus einer Peptidkette), sodass bei Reaktion mit dem Vernetzer das Antigen und der Ligand kovalent verbunden werden. Außerdem kann der Vernetzer ein Spacermolekül enthalten, das dazu dient, das Antigen und den Liganden richtig zu positionieren, sodass sie mit mlg bzw. dem CD21/CD19-Komplex in Wechselwirkung treten.
• Es ist eine Vielzahl an bifunktionellen oder polyfunktionellen Vernetzern (sowohl homo- als auch heterofunktionell) auf dem Gebiet bekannt und im Handel erhältlich (z. B. bei Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA). Solche Vernetzer können mit dem Antigen und Liganden durch Standardverfahren umgesetzt werden (z. B. gemäß den Angaben des Herstellers). Nach dem Vernetzen kann der Antigen-Ligand-Komplex von nicht umgesetztem Antigen und Liganden mittels herkömmlicher Verfahren gereinigt werden (z. B. Chromatographie, SDS-PAGE und dergleichen). Die Wirksamkeit chemisch vernetzter Zusammensetzungen beim Stimulieren intrazellulärerer Signale in B-Zellen (z. B. erhöhter intrazellulärer Calcium-Konzentrationen) und/oder Modulieren von Immunreaktionen kann durch Tests - wie sie z. B. hierin beschrieben sind - evaluiert werden.
• Liganden zur Verwendung in einer chemisch vernetzten Zusammensetzung sind hierin geoffenbart. Ein bevorzugter Ligand ist ein oder mehrere C3d-Moleküle. C3d zur Verwendung in einer chemisch vernetzten Zusammensetzung kann rekombinantes C3d (z. B. hergestellt durch Expression aus kodierender Nucleinsäure) oder gereinigtes natürliches C3d sein. Beispielsweise kann C3 aus Plasma (z. B. Humanplasma) gereinigt und C3d daraus durch Verdau erhalten werden; siehe Lambris, J.D. et al., J. Exp. Med. 152, 1625 (1980).
• In einer weiteren Ausführungsform können Antigen und Ligand auf einer Oberfläche einer Trägerstruktur co-exprimiert werden (d. h. beide sind vorhanden). Vorzugsweise werden das Antigen und der Ligand auf der Oberfläche der Trägerstruktur solcherart coexprimiert, dass beim Kontakt mit einer B-Zelle das Antigen mit Membran-Immunglobulinen (mlg), die für das Antigen auf der Oberfäche der B-Zelle spezifisch sind, in Wechselwirkung treten kann und der Ligand mit dem CD21/CD19-Komplex auf der Oberfläche der B-Zelle in Wechselwirkung treten kann.
• Die Trägerstruktur für die Co-Expression des Antigens und des Liganden kann ein Liposom oder eine ähnliche Vesikel-artige Struktur, die Material auf ihrer Oberfläche tragen kann, z. B. Mikrokügelchen, Polyacrylstärke-Mikropartikel, Mikrokapseln und dergleichen, sein. Antigene und Liganden können durch Standardverfahren kovalent an die Oberfläche eines Liposoms oder anderer Trägervesikel gebunden werden. Ein Überblick findet sich bei Jones, M. N., Adv. Colloid. Interface Sci. 54, 93-128 (1995). Siehe auch z. B. Heath, T. D. et al., Biochim. Biphys. Acta 599, 42-62 (1980); Heath, T. D. und Martin Ei., Chem. Phys. Lipids 40, 347-358 (1986); Hutchinson, F. J. et al., Biochim. Biophys. Acta 978, 17-24 (1989); Therien, H. M. et al., Cell. Immunol. 136, 402-413 (1991); Freide, M. et al., Anal. Biochem. 21, 117-122 (1993). Für die Stimulierung von Immunreaktionen auf das Antigen kann die Verwendung eines Liposoms oder eines Polyacrylstärke-Mikropartikels als Trägerstruktur für das Antigen und den Liganden den zusätzlichen Nutzen bieten, dass das Liposom oder Mikropartikel selbst Adjuvans-Aktivität aufweisen oder ein zusätzliches Adjuvans, wie z. B. das Monophosphoryl-Adjuvans-Lipid A, tragen kann. Ein Überblick findet sich bei Alving, C. R., Immunol. Rev. 145, 5-31 (1995). Siehe auch z. B. Raphael, L. und Tom, B. H., Clin. Exp. Immunol. 55, 1-13 (1984); Artursson, P. et al., J. Pharm. Sci. 75, 697-701 (1986); Degling, L. und Stjaernkvist, P., Vaccine 13, 629-636 (1995); Lachman, L. B. et al., AIDS Res. Hum. Retrovirus 11, 921-932 (1995). Eine bevorzugte Liposomenformulierung zur Stimulierung von Immunreakaionen kann ein Alaun-adsorbiertes Liposom umfassen, das Lipid A enthält und ein Antigen sowie einen CD21- oder CD19-Liganden aufweist, der an die Oberfläche des Liposoms gebunden ist.
• Die Trägerstruktur kann eine Zelle sein. Beispielsweise kann eine Zelle mit rekombinanten Expressionsvektoren transfiziert werden, die für Membran-gebundene Formen des Antigens und des Liganden kodieren, sodass die. Expression der Vektoren in der Zelle zur Zelloberflächen-Expression des Antigens und des Liganden führt. Die Oberflächenexpression des Antigens kann z. B. durch Verbinden eines für eine Signalsequenz kodierenden DNA-Fragments mit dem 5'-Ende einer für das Antigen kodierenden DNA (wenn das Antigen selbst keine. Signalsequenz enthält) und Verbinden eines für eine Transmembran-Domäne kodierenden DNA-Fragments mit dem B'-Ende der für das Antigen kodierenden DNA (wenn das Antigen selbst keine Transmembran-Domäne enthält) unter Anwendung herkömmlicher DNA-Rekombinationstechniken erreicht werden. Der Ligand kann in ähnlicher Weise modifiziert werden, um die Zelloberflächen-Expression des Liganden zu erreichen. Ein hoher Expressionsgrad des Antigens und Liganden ist möglicherweise erforderlich, um Vernetzung sowohl von mlg als auch von CD21/CD19 auf B-Zellen zu erreichen. Rekombinante Expressionsvektoren unter Verwendung starker Regulatorelemente (z. B. eines oder mehrerer Enhancer) sind demnach möglicherweise für die Expression des Antigens und Liganden auf der Oberfläche der Trägerzelle vorzuziehen.
• Die Trägerstruktur kann jede Vakzine oder jedes biologische Partikel zur Verabreichung sein, z. B. in der Membran oder auf der Oberfläche eines Virus, auf HBsAG-Partikeln usw. Die Co-Expression des Antigens/Immunogens und Liganden für CD21 oder CD19 kann sich an die Inkorporation geeigneter Nucleinsäure in das virale Genom schließen.
• Die Trägerstruktur kann ein fester Träger, wie z. B. eine Perle (z. B. Agarose, Sepharose, Polystyrol und dergleichen) oder eine Platte sein. Ein Antigen und ein CD21- oder CD19-Ligand kann an einen festen Träger mittels Standardtechniken gebunden werden. Beispielsweise können chemische Vernetzer wie die hierin beschriebenen dazu dienen, das Antigen und den Liganden an den festen Träger zu binden.
• Die Verabreichung einer Zusammensetzung, wie z. B. eines (C3d)n-Antigenkonjugats, moduliert die Immunreaktion des Rezipienten. Die Verstärkung, Erhöhung oder Steigerung der Immunreaktion kann durch Koppeln mehrere C3d-Moleküle an das lmmunogen erreicht werden. Die Hemmung, Reduktion oder Abnahme der Immunreaktion kann durch Koppeln eines C3d-Moleküls erreicht werden.
• Die Verabreichung kann aus einem prophylaktischen Grund (Impfung, z. B. antimikrobiell) oder therapeutischen Grund, z. B. in der Immuntherapie (etwa antimikrobiell oder Anti-Tumor) erfolgen. Die Impfung dient dazu, einem Individuum schützende Immunität gegenüber einem Antigen zu verleihen.
• Statt der Verabreichung des Konjugats im Falle eines Peptids oder Polypeptids kann für eine Fusion kodierende DNA gemäß bekannter Techniken verabreicht werden (4, 5, 6). Dies kann besonders zur Stimulierung von CTL-Reaktionen vorteilhaft sein (siehe unten), da die Fusion intrazellulär in Zellen des Probanden exprimiert wird, was bekanntermaßen die Antigen-Präsentation durch MHC Klasse I-Moleküle fördert, die CD8&spplus;-Zellen, wie z. B. CTL, stimulieren. DNA kann beispielsweise durch direkte intramuskuläre Injektion von DNA oder Verabreichung einer DNA-kationischen Lipid-Formulierung verabreicht werden (siehe z. B. Cohen, J., Science 259, 1691-1692 (1993); Yankauekas, M. A. et al., DNA Cell Biol. 12, 771-776 (1993); Boots, A. M. et al., Vaccine 10, 1 19-124 (1992); Conry, R. M. et al., Cancer Res. 54, 1164-1168 (1994); Montgomery, D. L. et al., DNA Cell. Biol. 12, 777-783 (1993); Wang, B. et al., DNA Cell Biol. 12, 7099-805 (1993); San, H. et al., Hum. Gene Ther. 4, 781-788 (1993); Felgner,).H. et al., J. Biol. Chem. 269, 2550-2561 (1994); Duzgunes, N. und Felgner, J. H., Methods Enzymol. 221, 303-306 (1993); Jiao, S. et al., Exp. Neurol. 115, 400-413 (1992)).
• Anwendungsbeispiele für solche Verabreichungen werden oben besprochen, z. B. das Bilden von Antikörpern gegen das Immunogen. In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung ein Verfahren zum Hervorrufen einer Antikörperreaktion (mit dem Erhalt von Antikörpern) auf ein Antigen/Immunogen von Interesse, umfassend die Verabreichung des Antigens/Immunogens in Verbindung mit einem Liganden von CD21 oder CD19, z. B. gekoppelt an mehrere C3d-Moleküle (wie geoffenbart), an ein Säugetier. Allgemein kann das Säugetier ein Mensch, eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, ein Pferd, eine Ziege, ein Schaf oder ein Affe sein. Der Zweck der Verabreichung kann ein therapeutischer oder die Bildung von Antikörpern zur späteren Nutzung/Manipulation, z. B. durch Anwendung von Rekombinationstechniken, wie z. B. monoklonale Antikörpertechnologie und/oder Bakteriophagen-Display (siehe z. B. WO 92/01047), sein. Die Isolierung von Antikörpern und/oder Antikörper produzierenden Zellen aus dem Nicht-Human- Säugetier kann mit einem Schritt des Tötens des Tiers einhergehen.
• Gemäß der Erfindung kann die Antikörper-Produktion in vitro, z. B. in Kultur, stimuliert werden. Beispielsweise können für ein Antigen von Interesse spezifische B-Zellen mit einer stimulatorischen Zusammensetzung der Erfindung kultiviert werden, um die Produktion der B-Zellen von Anitkörper für das Antigen von Ineresse zu stimulieren. Die produzierten Antikörper können aus dem Kulturmedium isoliert werden, z. B. aufgrund ihrer Bindungsfähigkeit für das Antigen.
• Die Verabreichung kann erfolgen, um eine T-Zellen-Reaktion auf das Immunogen, z. B. eine antimikrobielle (z. B. antivirale) und Anti-Krebs-Immuntherapie, zu modulieren (vorzugsweise zu induzieren oder stimulieren). Hinweise auf die T-Zellen-Beteiligung an einer Immunreaktion auf die Verabreichung einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung werden oben erläutert. Die Stimulierung von T-Helfer-Zellen, die für die B-Zellen- Aktivierung Unterstützung bieten, kann die Entwicklung zytotoxischer T-Zellen (CTL) fördern. Wenn somit ein Epitop eines Tumormarkers an einen CD21- oder CD19-Liganden gekoppelt ist, z. B. mehrere C3d-Moleküle, und an ein Individuum verabreicht wird, dessen Tumor das Epitop exprimiert, kann die verstärkte Immunreaktion auf das Epitop aufgrund der Verabreichung eine therapeutisch positive Auswirkung auf den Tumor haben. Da außerdem CTL IFN-γ sekretieren, was zu einem TH1-Bias führt, kann die Verabreichung für Allergiezwecke dienen.
• In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Antigen/Immunogen in Assoziation mit einem Liganden von CD21 oder CD19, wie z. B. (C3d)n-Immunogenkonjugat, umfasst (siehe oben).
• Pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung können zusätzlich zum Antigen/- Immunogen in Assoziation mit einem CD21- oder CD19-Liganden z. B. (C3d)n-Immunogenkonjugat, pharmazeutisch annehmbare Exzipienten, Träger, Vehikel, Puffer, Stabilisatoren oder andere Materialien umfassen, wie Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist. Solche Materialien sollten nicht-toxisch sein und die Wirksamkeit des Wirkstoffs nicht beeinträchtigen. Die genaue Beschaffenheit des Trägers oder zusätzlichen Materials hängt von der Verabreichungsweise ab, bei der es sich vorzugsweise um kutane, subkutane oder intravenöse Injektion handelt, vor allem um subkutane Injektion.
• Für die intravenöse, kutane oder subkutane Injektion liegt der Wirkstoff in Form einer parenteral annehmbaren wässrigen Lösung vor, die pyrogenfrei ist und einen geeigneten pH-Wert sowie geeignete Isotonie und Stabilität aufweist. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung sind in der Lage, geeignete Lösungen unter Verwendung von beispielsweise isotonischen Vehikeln, wie z. B. Natriumchlorid-Injektionslösung, Ringer-Injektionslösung, lactierter Ringer-Injektionslösung herzustellen. Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Puffer, Antioxidanzien und/oder andere Additive können gegebenenfalls vorhanden sein. Die subkutane Injektion ist die bevorzugte Verabreichungsweise.
• Eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann einen oder mehrere zusätzliche Wirkstoffe umfassen. Beispielsweise kann die Zusammensetzung ein zusätzliches Mittel enthalten, das immunmodulatorische Eigenschaften aufweist, z. B. Cytokin oder ein (zusätzliches) Adjuvans.
• Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines Antigens/Immunogens in Assoziation mit einem CD21- oder CD19-Liganden, z. B. (C3d)n-Immunogen (wie geoffenbart) zur Herstellung einer Zusammensetzung oder eines Medikaments zur Verabreichung an ein Individuum, um seine Immunreaktion auf das Immunogen zu modulieren. Der Verabreichungszweck kann - wie besprochen - der Erhalt von Antikörpern sein.
• Die Erfindung ist auf eine Vielzahl an Antigenen anwendbar. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Antigen proteinhältig, ein Protein, ein Polypeptid oder ein Peptid. In einer weiteren Ausführungsform ist das Antigen DNA. Das Antigen kann ein Lipid oder ein Kohlenhydrat sein. Bevorzugte Antigene umfassen jene von einem Pathogen (z. B. von Viren, Bakterien, Parasiten) und von Tumoren (insbesondere Tumor-assoziierte Antigene oder "Tumormarker"). Andere bevorzugte Antigene sind Autoantigene. Beispiele für Tumor-assoziierte Antigene sind karzinoembryonales Antigen (CEA), Prostataspezifisches Antigen (PSA), muc-1 (Agrawal et al., Cancer Res. 55, 2257-2261 (1995)), MART-1 (Kawakami et al., J. Exp. Med. 180, 347-352 (1994)) und gp100 (Adema et al., ). Biol. Chem. 269, 20126-20133 (1994)). Beispiele für virale Antigene sind Herpes simplex-Virus-1-Proteine wie z. B. gB, gC, gD, gEW, gG, gH, gl, gK, gL, Vmw65, ICPO und Icp4, Hämagglutinin eines Myxovirus (z. B. Influenza, Mumps oder Masern) und gp120 eines Human-Immunschwächevirus.
• Man beachte dass das hierin angeführte "C3d" eine Mutante, ein Derivat oder ein Fragment davon sein kann (z. B. durch Addition, Insertion, Substitution oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren entstanden), sofern die Fähigkeit, die Immunogenität/eine Immunreaktion zu verstärken oder zu verringern, bewahrt wird. Beispielsweise kann ein Abschnitt von C3d verwendet werden, der die Fähigkeit aufrechterhält, CD21 zu binden und B-Zellen durch den CC21/CD19-Komplex zu stimulieren. Eine CD21-Bindungsstelle auf C3 wurde den Aminosäureresten 1205-1214 der C3-Sequenz (Lambris et al., PNAS USA 82, 4235 (1985)) zugeschrieben, und es wurde aufgezeigt, dass synthetische C3-Peptide, die die Aminosäurereste 1201-1214 oder 1187-1214 umfassen, CD21 binden (Servis und Lambris, J. Immunol. 142, 2207 (1989)). Ähnliche Peptide oder andere CD21-bindlende C3-Peptide kommen hierin ebenfalls in Frage.
• C3d kann solcherart modifiziert sein, dass es keinen internen Thioester enthält. Beispielsweise kann Cys&sub1;&sub0;&sub2;&sub8; von C3d, das an der Bildung des Thioesters beteiligt ist, durch Standardtechniken zu Ser mutiert werden.
• Anstelle von C3d können andere CD21- oder CD19-Liganden verwendet werden, z. B. ein oder mehrere iC3b-Moleküle, ein oder mehrere C3dg-Moleküle, ein Antikörper oder Antigen-Bindungsfragment oder Abschnitt davon, der sich spezifisch an CD21 oder CD19 bindet. Im Vergleich zu C3d sind die iC3b- und C3dg-Subfragmente wahrscheinlich gegenüber Trypsin-Spaltung anfälliger, sodass C3d zur Verwendung in vivo gegenüber iC3d oder C3dg vorzuziehen ist. Modifizierte Formen von iC3d oder C3dg, in denen eine oder mehrere Trypsin-Spaltungsstellen mutiert wurden, sodass die Fragmente gegenüber proteolytischer Spaltung resistenter sind, sind jedoch möglicherweise für in vivo-Anwendungen besser geeignet.
• Wenn ein Antikörper, Fragment oder Derivat davon verwendet wird, muss er bzw. es an das Antigen oder Immunogen solcherart gekoppelt (z. B. mit ihm fusioniert) werden, dass die Fähigkeit der Bindung von CD21 oder CD19 beibehalten wird. Dies kann durch Fusion mit einer Konstantregion einer Schwer- oder Leichtkette eines Antikörpers erfolgen. Die Fusion am C-Terminus einkettiger Fv- (scFv-) Antikörperfragmente beeinträchtigt, wie aufgezeigt wurde, die Bindungsfähigkeit der scFv nicht. Da Antikörper in unterschiedlicher Weise modifiziert werden können, sollte der Ausdruck "Antikörper" so ausgelegt werden, dass er jede spezifische Bindungssubstanz umfasst, die eine Bindungsdomäne mit der erforderlichen Spezifität aufweist. Somit umfasst dieser Ausdruck Antikörperfragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und Homologe von Antikörpern, z. B. jedes Polypeptid, das eine Immunglobulin-Bindungsdomäne enthält (natürlich oder synthetisch). Chimäre Moleküle mit einer Immunglobulin-Bindungsdomäne oder einem Äquivalent (fusioniert mit einem anderen Polypeptid) sind daher in dieser Definition enthalten. Das Klonieren und Exprimieren von chimären Antikörpern wird in EP- A-0.120.694 und EP-A-0.125.023 beschrieben.
• Es wurde gezeigt, dass Fragmente eines ganzen Antikörpers die Funktion von Bindungsantigenen ülbernehmen können. Beispiele für Bindungsfragmente sind (i) das Fab-Fragment, bestehend aus VL-, VH-, CL- und CH1-Domänen; (ii) das Fd-Fragment, bestehend aus den VH- und CH1-Domänen; (iii) das Fv-Fragment, bestehend aus den VL- und VH- Domänen eines einzelnen Antikörpers; (iv) das dAb-Fragment (Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)), bestehend aus einer VH-Domäne; (v) isolierte CDR-Regionen; (vi) F(ab')2-Fragmente, ein bivalentes Fragment, das zwei verbundene Fab-Fragmente umfasst; (vii) einkettige Fv-Moleküle (scFv), worin eine VH-Domäne und eine VL-Domäne über einen Peptidlinker verknüpft sind, der die Assoziation der zwei Domänen ermöglicht, damit sie eine Antigen-Bindungsstelle bilden (Bird et al., Science 242, 423-426 (1988); Huston et al., PNAS USA, 85, 5879-5883 (1988)); (viii) bispeziliche einkettige Fv-Dimere (PCT/US92/09965); und (ix) "Diakörper", mehrwertige oder multispezifische Fragmente, die durch Genfusion konstruiert sind (WO 94/14804; P. Holliger et al., PNAS USA 90, 6444-6448 (1993)).
• Antikörper gegen CD21 wurden bereits beschrieben und ind erhältlich (z. B. OKB7, Ortho Pharmaceuticals, Raritan, N), USA; und HB-5, American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA, Nr. HB 135). Antikörper gegen CD19 stehen ebenfalls zur Verfügung (z. B. Carter et al., J. Immunol. 147, 3663-3671 (1991); und Holder et al., Eur. J. Immunol. 22, 2725-2728 (1992)).
• Antikörper, die für ein Ziel von Interesse spezifisch sind, können mit Standardtechniken erhalten werden. Verfahren zur Produktion von Antikörpern sind z. B. das Immunisieren eines Säugetiers (z. B. einer Maus, einer Ratte, eines Kaninchens, eines Pferds, einer Ziege, eines Schafs oder eines Affen) mit dem Protein oder einem Fragment davon bzw. einer Zelle oder eines Virus, die/das das Protein oder Fragment exprimiert. Die Immunisierung mit für ein Ziel-Polypeptid kodierender DNA ist auch möglich. Antikörper können aus immunisierten Tieren mittels einer Vielzahl auf dem Gebiet bekannter Techniken erhalten und gescreent werden, vorzugsweise mittels Bindung von Antikörpern gegen das Artigen von Interesse. Beispielsweise eignen sich Western-Blotting-Techniken oder Immunfällung (Armitage et al., Nature 357, 80-82 (1992)).
• Als Alternative oder Ergänzung zur Immunisierung eines Säugetiers kann ein Antikörper aus einer rekombinant produzierten Bibliothek exprimierter Immunglobulin-variabler Domänen erhalten werden, z. B. unter Verwendung von λ-Bakteriophagen oder filamentösen Bakteriophagen, die funktionelle Immunglobulin-Bindungsdomänen auf ihren Oberflächen aufweisen; siehe z. B. WO 92/01047. Die Bibliothek kann naiv sein, d. h. aus Sequenzen konstruiert sein, die aus einem Organismus stammen, der mit dem Ziel nicht immunisiert wurde; oder sie können aus Sequenzen konstruiert sein, die aus einem Organismus stammen, der dem Antigen von Interesse ausgesetzt wurde (oder einem Fragment davon).
• Es ist möglich, Antikörper zu verwenden und sich der DNA-Rekombinationstechnologie zu bedienen, um andere Antikörper oder chimäre Moleküle zu produzieren, die die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers bewahren. Solche Techniken umfassen möglicherweise die Einführung von DNA, die für die variable Immunglobulin-Region oder die Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDR) kodiert, eines Antikörpers gegen die Konstantregionen (oder Konstantregionen plus Rahmenregionen) eines unterschiedlichen Immunglobulins. Siehe z. B. EP-A-1.941.187, GB 2188638A oder EP-A-239.400. Ein Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper produziert, kann genetischer Mutation oder anderen Veränderungen unterzogen werden, die möglicherweise die Bindungsspezifität der produzierten Antikörper modifizieren.
• Es kann wünschenswert sein, Nicht-Human-Antikörper (z. B. Mäuse-Antikörper) zu "humanisieren", um Antikörper mit den Antigen-Bindungseigenschaften des Nicht-Human- Antikörpers bereitzustellen, während die immunogene Reaktion der Antikörper minimiert wird, z. B. beim Einsatz in Humantherapie. Somit umfassen humanisierte Antikörper Rahmenregionen aus Human-Immunglobulinen (Akzeptor-Antikörper), worin Reste aus einer oder mehreren CDR durch Reste aus CDR einer Nicht-Human-Spezies (Donorantikörper), wie z. B. Maus, Ratte oder Kaninchen-Antikörper, mit den gewünschten Eigenschaften, z. B. Spezifität, Affinität oder Kapazität, ersetzt sind. Einige der Rahmenreste des Human-Antikörpers können auch durch entsprechende Nicht-Human-Reste oder Reste, die weder in Donor- noch in Akzeptor-Antikörpern vorhanden sind, ersetzt sein. Diese Modifikationen erfolgen, um die Eigenschaften des Antikörpers weiter zu verfeinern und zu optimieren.
• So genanntes "Phagen-Display" kann auch beim Humanisieren von Antikörpern herangezogen werden; siehe z. B. WO 93/06213.
• Die vorliegende Erfindung erstreckt sich nicht auf natürlich vorkommende Antigen/Immunogen-Komplexe und ein C3-Fragment, das produziert wird, wenn der alternative Komplementpfad aktiviert ist und C3-Fragmente auf Antigen mittels Reaktion durch die interne Thioester-Bindung des C3 abgelagert werden. Demzufolge erfolgt in erfindungsgemäßen Zusammensetzungen die Assoziation von Antigen/Immunogen mit einem Liganden für CD21 (CR2) oder CD19 mit der Maßgabe, dass das Antigen/Immunogen nicht mit einem C3-Komplementfragment über eine aus dem internen Thioester des C3- Komplementfragments abgeleitete Esterbindung verbundenist. (Der Cysteinrest, der den Thioesterrest bildet, kann chemisch vernetzt über eine Disulfidbrücke verwendet werden, doch dies ist keine Esterbindung.)
• Weitere Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung sind für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich.
• Es folgt eine Veranschaulichung von - und keine Einschränkung durch - Ausführungsformen der Erfindung anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die Abbildungen.
• Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Struktur von rekombinanten Hühnerei-Lysozym-C3d- Proteinen. Modell von HEL-, HEL-C3d, HEL-C3d&sub2; und HEL-C3d&sub3;-Proteinen mit den Verbindungssequenzen zwischen den Domänen der Kassette. Die Abkürzungen für die Aminosäurereste bedeuten Folgendes: C, Cys; E, Glu; F, Phe; G, Gly; und S, Ser. Die Ligation von BamHI- und BgIII-Restriktionsstellen erzeugt den Gly-Ser-Linker (14), der die HEL-, C3d- und [Gly&sub4;Ser]&sub2;-Sequenzen flankiert. Es ist auch die Mutation von Cys&sub1;&sub0;&sub2;&sub8; zu Ser angezeigt. Jedes Konstrukt endet mit dem Glu-Glu-Phe-Tripeptid, das vom monoklonalen Antikörper YL 1/2 erkannt wird.
• Fig. 2 zeigt ein 5-20% SDS-Polyacrylamidgel, auf dem unter reduzierenden Bedingungen gereinigte rekombinante Hühnerei-Lysozym-C3d-Proteine laufen gelassen wurden. Molekülgrößen-Standards sind am linken Rand in kD angeführt.
• Fig. 3 veranschaulicht die Hemmung der [¹²&sup5;I]HEL-C3d&sub2;-Bindung von Raji-Zellen. [ - HEL.C3d; O-HEL.C3d&sub2;; Δ-HEL.C3d&sub3;; IgG1; kein Inhibitor; CR2).
• Fig. 4 zeigt die IgG1-Reaktion auf rekombinantes Antigen in CFA. Rekombinantes HEL- (Quadrate), HEL-C3d- (Kreise) und HEL-C3d&sub2;- (Dreiecke) Antigen wurde in einer Endkonzentration von 500 pMol (Bild A), 50 pMol (Bild B) oder 5 pMol (Bild C) in 0,05 ml PBS verdünnt. Die Antigene wurden mit gleichen Volumina an vollständigem Freund- Adjuvans emulgiert und 0,1 ml der Emulsion intraperitoneal in Gruppen 4-6 Wochen alter männlicher CBA/Ca-Mäuse (Harlan, UK) injiziert. Vergleichsmäuse erhielten nur mit PBS emulgiertes CFA (Rauten). Den Mäusen wurde aufeinanderfolgend in 7-Tages-Intervallen Blut abgenommen. Alle Tiergruppen erhielten 50 pMol HEL in 0,5 ml PBS, emulgiert mit demselben Volumen an unvollständigem Freund-Adjuvans, an Tag 56 (Pfeil). HEL-spezifische Reaktion wurde wie beschrieben mittels ELISA bestimmt. Die Ergebnisse sind Mittelwerte von Gruppen von 5 Tieren + 1 Standardabweichung.
• Fig. 5 zeigt die IgGI-Reaktion auf subkutanes rekombinantes Antigen in Kochsalzlösung. HEL- (Quadrate), HEL-C3d- (Kreise) und HEL-C3d&sub2;- (Dreiecke) Antigene wurden in einer Endkonzentration von 7000 pMol (Bild A), 700 pMol (Bild B), 70 pMol (Bild C) oder 7 pMol (Bild D) in 0,1 ml in PBS verdünnt. Die Antigene wurden subkutan in der rechten hinteren Flanke von 4-6 Wochen alten männlichen CBA/c-Mäusen injiziiert. Die Vergleichsmäuse erhielten nur PBS (Rauten). Den Mäusen wurde aufeinander folgend in 7-Tages-Intervallen Blut abgenommen. Alle Gruppen erhielten 50 pMol HEL in 0,05 ml PBS, emulgiert mit einem gleichen Volumen unvollständigem Freund-Adjuvans, an Tag 77 (Pfeil). Die HEL-spezifische Reaktion wurde durch Grenzverdünnungs-ELISA bestimmt, worin die letzte zweifache Reihenverdünnung mit A&sub5;&sub7;&sub0; > 2 Standardabweichungen über jener von nicht-immunem Serum als spezifischer Titer herangezogen wurde.
• Die Ergebnisse sind das Mittel von 4 (700 pMol HEL-C3d) oder 5 (alle anderen Gruppen) Tieren + 1 Standardabweichung.
• Fig. 6 zeigt die Suppression durch 7G6-Anti-CR2 der Reaktion auf HEL-C3d&sub2;. 4-6 Wochen alte männliche CBA/c-Mäuse erhielten intravenöse Injektionen von 0,2 mg 7G6 (volle Kreise) oder Vergleichs-IgG2b (leere Quadrate und Kreise). 24 h später erhielten die Mäuse 7 pMol HEL-C3d&sub2; in 0,1 ml PßS (Kreise) oder 0,1 ml PBS (Quadrate) subkutan in die rechte hintere Flanke. Den Mäusen wurde aufeinander folgend in 7-Tages-Intervallen Blut abgenommen und die HEL-spezifische Reaktion wie beschrieben mittels ELISA bestimmt. Die Ergebnisse zeigen das Mittel von Gruppen von 3 Mäusen.
• Fig. 7 zeigt die Stimulierung durch rekombinantes HEL und HEL-C3d1-3 von Steigerungen in [Ca²&spplus;]i in HEL-spezifischen B-Zellen. Milz-Lymphozyten aus transgenen Mäusen mit B-Zellen, die für HEL spezifisches mlgM und mlgD exprimieren, wurden mit indo-1 beladen und mit inkrementellen Konzentrationen von HEL, HEL-C3d, HEL-C3d2 bzw. HEL-C3d3 inkubiert: 70 nM ( ), 7 nM (O), 0,7 nM (Δ), 70 pM ( ), 7 pM ( ), 0,7 pM ( ) sowie Puffer alleine ( ) Veränderungen in {Ca²&spplus;}i in B-Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie überwacht.
• Fig. 8 zeigt die IgG1-Anti-HEL-Reaktion in mit rekombinanten HEL-Antigenen subkutan in PBS immunisierten Mäusen. Am Tag 0 erhielten Gruppen von 4 Mäusen nur Puffer (leere Symbole) oder inkrementelle Mengen an HEL, HEL-C3d&sub2; oder HEL-C3d&sub3; (volle Symbole) subkutan in PBS. Die Mäuse wurden an Tag 35 mit 50 pMol HEL intraperitoneal in IFA aufgefrischt (siehe Pfeil). Seren wurden mittels ELISA auf HEL spezifisches IgGI untersucht, und die Titer sind als relative Einheiten (RU) angegeben.
• Fig. 9 zeigt einen Vergleich der Wirkung von CFA und vorn C3d auf die Immunogenität von HEL. Am Tag 0 wurden Gruppen von 5 Mäusen 500 pMol ( ), 50 mMol (O), 5 pMol (Δ), 500 fMol ( ), 50 fMol ( ) oder 5 fMol ( ) HEL oder Puffer alleine ( ) subkutan in CFA verabreicht. Andere Gruppen von 5 Mäusen Erhielten 5 pMol (Δ), 500 fMol ( ), 50 fMol ( ) oder 5 fMol ( ) HEL-C3d&sub3; oder Puffer alleine ( ) subkutan in PBS. Alle Mäuse wurden an Tag 28 mit 50 pMol HEL in 1FA aufgefrischt (siehe Pfeil). Die Serumtiter von HEL-spezifischem IgG1 sind als RU angegeben.
• Fig. 10 zeigt einen Vergleich der IgG1-Anti-HEL-Reaktion in mit HEL oder HEL-C3d&sub2; in PBS auf unterschiedlichen Verabreichungswegen immunisierten Mäusen. Am Tag 0 erhielten Gruppen von 5 Mäusen entweder 1 pMol oder 50 pMol Protein subkutan (Rauten), intramuskulär (Kreise) oder intraperitoneal (Dreiecke). Die Mäuse wurden an Tag 35 mit 50 pMol HEL in IFA intraperitoneal aufgefrischt (siehe Pfeil). Seren wurden auf HEL spezifisches IgG1 untersucht, und die Titer sind als RU angegeben.
Konstruktion und Expression von C3d/Antigen-Chimären
• Für die für C3d kodierende DNA (7, 8) wurde C3d durch NCR unter Verwendung des EcoRI-linearisierten pMLC3-7-cDNA-Klons als Templat und durch 25 Zyklen zweiminütiger Denaturierung, Annelierung und Extension amplfiziert. Die verwendeten Primer waren wie folgt: 5' C3d (SEQ.-ID Nr.): 3' C3d (SEQ.-ID Nr. 2):
• Dieses und alle nachfolgenden PCR-Produkte wurden nach dem Didesoxynucleotid-Kettenterminationsverfahren mittels des Sequenzsets (U. S. Biochemical Corp.) sequenziert. Xbal- und BgIII-Stellen waren im 5'-Primer und BamHI im 3'-Primer enthalten. Die Primer waren konstruiert, die Sequenzen zwischen den Basenpaaren 3070 und 3960 der kompletten Mäuse-C3-Sequenz zu enthalten. Durch Vorsehen einer G-zu-C-Substitution im 5'-Primer konnte das Cys-Codon an Aminosäureposition 1028 zu einem für Ser kodierenden geändert werden, wodurch das an der Bildung der Thiolesterbindung beteiligte wesentliche Cys mutiert wurde. Nach Amplifikation wurden die Fragmente mit Xbal und BamHI gespalten und in Xbal- und BamHI-gespaltenes pBS ligiert, um pBS. C3d zu erzeugen.
• Zum Assemblieren von Monomerkonstrukten wurden ein vom monoklonalen Antikörper YL 1/2 erkannter Epitopmarker (9, 10) und ein Stopcodon an das 3-Ende von C3d mittels Oligonucleotiden ligiert. pBS. C3d wurde mit BamHI und EcoRI gespalten und mit den Oligonucleotiden ligiert, die für das YL 1/2-Epitop kodieren, um pBS. C3d.YL zu bilden. Die Oligonucleotide waren wie folgt: 5' YL 1/2 (SEQ.-ID Nr. 3): 3' YL 1/2 (SEQ.-ID Nr. 4):
• Zum Assemblieren oligomerer C3d-Konstrukte wurde ein [(Gly)&sub4;Ser]&sub2;-Linker als Teil einer Fusionssequenz mit Hühnereiweiß-Lysozym durch PCR unter Verwendung eines Pstl-linearisierten pSVG-spcHEL-Templats sowie mit 25 Zyklen Denaturieren, Annelieren und Extendieren (jeweils 30 s) amplifiziert. Die Primer waren wie folgt:
• Die Fragmente wurden in pCRII (InVitrogen) kloniert und der 34 bp-[(Gly)&sub4;Ser]&sub2;-Linker durch Spaltung mit BamHI und BgIII in BamHI-gespaltenes pBS. C3d subkloniert, um pBS. C3d.GS zu produzieren. Die Ligation des BamHI-BgIII-C3d.YL-Fragments aus pBS. C3d.YL in BamHI-gespaltenes pBS. C3d.GS lieferte pBS. C3d&sub2;YL. Die Erzeugung von pBS. C3d&sub3;YL erfolgte durch Wiederholen einer Runde von BamHI- und BgIII-Spaltung von pBS. C3d.GS und Subklonieren des 937 bp-C3d.GS-Fragments in BamHI-gespaltnes pBS. C3d.GS. Anschließend wurde das p8S. C3d&sub3;-Konstrukt durch BamHI- und BgIII-Spaltung von pBS. C3d-YL und die Ligation des 919 bp-C3d.YL-Fragments in mit BamH behandeltes pBS. C3d&sub2; abgeschlossen.
• Die Hunde-Präpro-Insulin-Signalsequenz (DPPISS) (11) wurde aus einem mit Pvull linearisierten pGIR-477-Templat (zur Verfügung gestellt von IK. Drickamer) mit 25 30 s-Zyklen von Denaurieren, Annelerien und Extendieren amplifiziert.
• Die verwendeten Primer waren:
• Die Fragmente wurden mit BamHI und EcoRI gespalten und in BamHI-EcoRI-gespaltenes pBS ligiert ("BLUESCRIPT"), um pBS. DPPISS zu ergeben. Der eukaryotische Expressionsvektor pSG5 (Stratagene) wurde durch EcoRI- und BgIII-Spaltung erzeugt, und das Subklonieren des EcoRI-BgIIIII-DPPISS-Fragments aus pBS.DPPISS ergab pSG.SS. C3d- enthaltende Fragmente wurden aus den pBS-Vektoren durch Spalten von pBS.C3d.YL, pBS.C3d&sub2;YL und pBS.C3d&sub3;.YL mit BamHI und BgIII und Ligieren in mit BgIII behandeltes pSG-SS subkloniert, um pSG.C3d.YL, pSG.C3d&sub2;.YL und pSG.C3d&sub3;YL zu ergeben.
• Das Antigen Hühnereiweiß-Lysozym (HEL) (12) (C. Goodnow) wurde aus einem PstI-linearisierten Templat pDamian mittels 25 30-s-Zyklen von Denaturieren, Annelieren und Extendieren amplifiziert. Die verwendeten Primer waren:
• Die Fragmente wurden in pCRII kloniert. Das HEL-Fragment wurde durch Spaltung von pCRIII. HEL mit BamHI und BgIII und Ligation des 404 bp-HEL-Fragments in BgIII- und BamHI-gespaltene pSG. C3d.YL-, pSG-C3d&sub2;.YL- und pSG. C3d&sub3;.YL-Plasmide subkloniert. Das pCRII.HEL-Plasmid wurde auch wie oben modifiziert, um das YL1/2-Epitop zu enthalten, und dieses 420 bp-BgIII-BamHI-HEL.YL-Fragment in einen BamHI- und BgIII-behandelten pSG-SS-Vektor ligiert, um pSG.HEL.YL zu ergeben.
• Anschließend wurde der pSG5-Vektor modifiziert, um dass YL1/2-Epitop zu enthalten, indem direkt in die BgIII-Stelle von pSGS das YL1/2-Epitop ligiert wurde. Die verwendeten Oligonucleotide waren:
• Für die vorübergehende Expression wurde pSG.HEL.C3d&sub3;.YL mit EcoRI und Xbal gespalten. Das 3468 bp große HEL.C3d&sub3;.YL-Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment von DNA Polymerase I abgestumpft und in den A71d-Vektor ligiert. A71d, gratis zur Verfügung gestellt von A. Venkitaraman, ein eukaryotischer Expressionsvektor, wurde durch Spaltung mit BamHI und Abstumpfen dieser Stelle für die Ligation vorbehandelt. Die anschließende Spaltung mit Smal führte zur Exzision eines Polyadenylierungssignals.
• Die Plasmide pSG.HEL.YL, pSG.HEL.C3d.YL und pSG.HEL.C3d&sub2;.YL wurden mit pSV2- neo in L-Zellen unter Anwendung des Calciumphosphat-Verfahrens co-transfiziert. Die Zellen wurden mit 0,8 mg/ml G418 selektiert. Zellen mit G418-Resistenz wurden einzelzellkloniert und jene, die hohe Mengen an Fusionsprotein sekretierten, mittels ELISA identifiziert. Anti-HEL-Antikörper HyHEL-8 und biotinylierter HyHEL-9 (13) wurden in einem Einfang-ELISA verwendet und durch Avidin-Meerrettich-Peroxidase (BioRad) detektiert. Diese Transfektanten wurden in Suspension oder auf Cytodex 1-Mikroträgerperlen (Pharmacia) in Chargen kultiviert und die Fusionsantigene aus Kulturüberständen durch Affinitätschromatographie auf YL1/2-Antikörper (gekoppelt an 10 mg/ml bis 5 ml Sepharose 4B) gereinigt. Die Kulturüberstände wurden über das Affinitätsharz geschickt und mit jeweils 10 Säulenvolumina Puffer 1 (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA) und mit 0,2% NP40 ergänztem Puffer 1 gewaschen. Die Säule wurde ferner mit 20 Säulenvolumina Puffer 1 und Fusionsantigen gewaschen und dann mit 50 mM TEA pH 11,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA eluiert. Antigen wurde neutralisiert, gepoolt und gegen PBS dialysiert. Das Plasmid A71d.HEL. C3d&sub3;.YL wurde transient in COS-Zellen unter Anwendung des DEAE-Dextram-Verfahrens exprimiert und das Fusionsprotein wie oben gereinigt. Gereinigte HEL.C3d&sub3;.YL- und HEL.C3d&sub2;.YL-Proteine wurden anschließend auf einer hochauflösenden Sephacryl S-200-Säule (Pharmacia) größenfraktioniert, um durch die transfizierten Zellen produzierte kontaminierende Recombinant-Formen des Proteins zu entfernen.
Stimulierung von rekombinantem HEL und HEL-C3dI-3 von Zunahmen in [Ca²&spplus;]i in HEL-spezifischen B-Zellen
• Milz-Lymphozyten aus transgenen Mäusen mit B-Zellen, die für HEL spezifisches mlgM und mlgD exprimieren, wurden mit indo-1 beladen. Splenozyten wurden mit Phycoerytherin-konjugiertem Ratten-Anti-CD43 eingefärbt. Die CD43-positiven Zellen wurden ausgeblendet und die Zellen mit inkrementellen Konzentrationen von HEL, HEL-C3d, HEL-C3d2 bzw. HEL-C3d3 inkubiert. Veränderungen in [Ca²&spplus;]i in B-Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie überwacht. Die Ergebnisse sind aus Fig. 7 ersichtlich.
• Das Co-Ligieren von CD21 oder CD19 an mlg mit Rezeptor-spezifischen monoklonalen Antikörpern senkt die Schwelle, an der mlg eine Zunahme der intrazellulären freien Ca²&spplus;-Konzertration ([Ca²&spplus;]i) stimuliert. (15, 16). B-Lymphozyten aus Mäusen, die Transgene exprimieren, die für mlgM und mlgD mit 2 nM Kd für HEL kodieren, wurden mit indo-1 beladen, mit inkrementellen Konzentrationen der rekombinanten HEL-Proteine inkubiert und mittels Durchflusszytometrie auf Veränderungen von [Ca²&spplus;]i untersucht. (Fig. 7)
• HEL bewirkte eine Dosis-abhängige Zunahme von [Ca²&spplus;]i, wobei die Schwelle 7 nM war. Die Gegenwart von 1, 2 und 3 Kopien von C3d auf HEL senkte die Schwelle auf 0,7, 0,07 bzw. 0,007 nM - ein Indiz dafür, dass jedes C3d die Fähigkeit von HEL um das Zehnfache steigerte, die zelluläre Reaktion zu induzieren. Eine Sättigungskonzentration von 7G6-Anti-CD21 (17) bewirkte, dass die Schwelle für die Reaktion von HEL-C3d2 zu jener von HEL zurückkehrte. B-Zellen aus den nicht-transgenen Mäusen reagierten nicht auf HEL oder HEL-C3d1-3. Diese Veränderungen in [Ca²&spplus;]i, die in nicht-transgenen B- Zellen durch Antikörper gegen mlgM hervorgerufen wurden, verschwanden in Gegenwart von 7 nM HEL-C3d3 nicht. Die 10-minütige Inkubation transgener B-Zellen mit 3 nM HEL und HEL-C3d3 führte zu 51% bzw. 47% Sättigung der Anti-HEL-Stellen (bewertet durch anschließende Bindung von Fluorescein-konjugiertem HEL) - ein Indikator dafür, dass die Bindung von C3d an HEL die Bindung an die transgenen B-Zellen nicht verbesserte, was vermutlich auf die hohe Affinität ihrer Antigenrezeptoren für HEL zurückzuführen ist. Daher spiegeln die verstärkten [Ca²&spplus;]i-Reaktionen verstärkte Signalisierung durch C3d-abhängige Rekrutierung des CD21-CD1 9-Komplexes wider.
Fähigkeit der C3d-Komponenten der Fusionsproteine, sich an CD21 zu binden
• Die Fähigkeit der C3d-Komponenten der Fusionsproteine, sich an CD21 zu binden, wurde durch kompetitive Bindungstests unter Einsatz von CD21 exprimierenden Raji B- Lymphoblastenzellen bestimmt. Raji-Zellen, 3-4 · 10&sup7; Zellen/ml, wurden 45 min lang bei 4ºC mit 1 nM [¹²&sup5;I]HEL-C3d&sub2; (spezifische Aktivität 9,1 · 10&sup5; cpm/mg) und inkrementellen Konzentrationen der HEL-C3d-Fusionsproteine, 500 nM (CR2)2-IgG1 (T. Hebel, J.M. Ahearn, D. T. Fearon, Science 24, 102 (1991)) oder IgG1 in PBS mit 0,1% Rinderserumalbumin inkubiert. Die Zellen wurden durch ein Dibutyl/Diisooctylphthalat- Kissen zentrifugiert und die Menge an am Zellpellet gebundenem ¹²&sup5;I bestimmt. In zwei Experimenten trat 50% Hemmung spezifischer Bindung von [¹²&sup5;I]HEL-C3d2 mit 185- 225 nM HEL-C3d, 8-20 nM HEL-C3d2 bzw. 1,5-2,2 nM HEL-C3d3 auf. Die Korrelation zwischen der Avidität der Bindungsreaktion und der Anzahl an CD3 legt nahe, dass jedes C3d in den Fusionsproteinen zur Wechselwirkung mit CD21 fähig war.
In vivo-Antikörperreaktion auf (C3d)n-Immunogenfusionen
• 4-6 Wochen alte männliche CBA/c-Mäuse stammten von Harlan, UK. Rekombinantes Antigen wurde in PBS verdünnt und in vollständigem Freund-Adjuvans emulgiert. 0,1 ml wurden intraperitoneal verabreicht. Alternativ dazu wurde rekombinantes Antigen in PBS verdünnt und 0,1 ml intraperitoneal verabreicht. Alternativ dazu wurde rekombinantes Antigen in PBS verdünnt und 0,1 ml je nach Indikation subkutan oder intramuskulär in die rechte hintere Flanke verabreicht. Anschließende Verabreichungen erfolgten durch Verclünnen von rekombinantem Antigen in 0,1 mg/ml Mäuse-Albumin enthaltender PBS (Sigma A-3559).
• Die Antikörperreaktion wurde durch Ziehen von Blutproben in Intervallen aus der Schwanzvene behandelter Mäuse und Bewerten des HEL-spezifischen Serum-Ig mittels ELISA überwacht. Nunc-Immuno-Platten wurden mit HEL (0,5 mg/ml; Sigma) über Nacht bei 4ºCin Carbonatpuffer (pH 10,0 beschichtet und mit 1% BSA in PBS blockiert. Das Blockieren und alle nachfolgenden Schritte erfolgten über 1 h bei Raumtemperatur. Zwischen den Schritten wurden die Platten dreimal mit 0,05% Tween 20 enthaltender PBS gewaschen. Seren wurden in 0,1% BSA/PBS verdünnt und die Gegenwart von HEL-spezifischem IgG1 mittels an Meerrettich-Peroxidase gekoppeltem Ziegen-Anti- Mäuse-IgG1 ermittelt (Southern Biotechnology Associates Inc.).
• Eine Standardkurve unter Verwendung gepoolter Seren aus Mäusen, die immunisiert und mit 0,1 mg HEL in CFA bzw. IFA aufgefrischt worden waren, war auf jeder Platte enthalten. Der ELISA wurde mit o-Phenylendiamin-dihydrochlorid (Sigma P-9187) entwickelt und die optische Dichte in einem Mikroplattenlesegerät von Molecular Devices bei 570 nm bestimmt.
Dosisreaktion auf die Immunisierung
• Die relative Immunogenität von HEL wurde mit jener von HEL-C3d2 und HEL-D3d3 verglichen, indem Mäuse mit inkrementellen Mengen der rekombinanten Proteine subkutan in PBS immunisiert wurden. Die höchste Dosis von HEL, 500 pMol, war die Schwelle, an der unmodifiziertes Antigen eine IgG1-Reaktion nach der primären Immunisierung induzierte (Fig. 8). Im Gegensatz dazu waren nur 500 fMol HEL-C3d3 und 50 fMol HEL-C3d3 erforderlich, um vergleichbare anfängliche IgG1-Reaktionen hervorzurufen. Diese Dosen der drei rekombinanten Proteine waren auch die Schwellenwerte, die zur Induktion von immunologischem Gedächtnis notwendig waren - angezeigt durch die beschleunigten und verstärkten IgG1-Reaktionen, die nach der Exposition geprimter Mäuse mit 50 pMol HEL in unvollständigem Freund-Adjuvans (IFA) eintraten. Außerdem deutet die Bildung von immunologischem Gedächtnis für HEL bei allen rekombinanten Proteinen darauf hin, dass diese Reaktionen T-Zellen-abhängig sind.
Vergleich mit vollständigem Freund-Adjuvans
• Die immunstärkende Funktion von C3d wurde in Mäusen mit jener von vollständigem Freund-Adjuvans (CFA) verglichen. Die Schwellendosen für das Hervorrufen von IgG1- Reaktionen betrugen 50 pMol für HEL in CFA bzw. 500 fMol für HEL-C3d3 in PBS (Fig. 9). Die für das Hervorrufen von Gedächtnis notwendigen Mengen betrugen 5 pMol bzw. 50 fMol für HEL in CFA bzw. HEL-C3d3 in PBS. Daher ist die Bindung dreier Moleküle von C3d an das Antigen hundertmal effektiver, die Schwelle für erworbene Immunerkennung zu senken, als das hochwirksame Adjuvans CFA.
Beteiligung von CD21 in vivo
• Es wurde die Beteiligung von CD21 an der IgG1-Reaktion auf HEL-C3d3 ermittelt. Mäusen wurden intraperitoneal 300 mg 7G6-Anti-CD21 oder ein zum Isotyp passender Vergleichsantikörper 24 h vor der Immunisierung mit 500 fMol HEL-C3d3 in PBS subkutan verabreicht. Der IgG1-Anti-HEL-Titer am Tag 29 betrug weniger als 25 RU für die mit 7G6 behandelten Mäuse und 4610 RU für die Vergleichsmäuse. Die Analyse der Milz- Lymphozyten (eingefärbt mit 7G6-Anti-CD21 bzw. 1D3-Anti-CD19) an Tag 29 mittels Durchflusszytometrie zeigte, dass die Behandlung mit 7G6 detektierbares CD21 auf B- Zellen ohne Reduktion ihrer Expression von CD19 eliminierte. (Für die FACS-Analyse wurden Splenozyten mit 5 ug/ml 7G6, 1 D3 oder Vergleichsantikörper, gefolgt von PE- konjugiertern Ziegen-Anti-Ratten-F(ab)2 (CaITag), eingefärbt.)
Spezifität der Reaktion
• Mäuse wurden subkutan in PBS mit 25 ug-Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) alleine oder in Gegenwart von 0,5 pMol HEL-C3d3 co-immunisiert. Die IGG1- Reaktion auf KLH am Tag 14 wurde durch HEL-C3d3 nicht verändert - ein Indikator dafür, dass C3d die Reaktion nur auf das Antigen modifiziert, an das es gebunden ist.
Konstruktion und Expression von Mäuse-SmB/SmB-C3d3
• Mäuse-SmB-cDNA in pGEM 7Hf+ stammte von J. Craft (Yale University). SmB ist eine Proteinkomponente des kleinen Ribonucleoproteinpartikels, das am RNA-Spleißen beteiligt ist, und wird normalerweise nur im Zytoplasma exprimiert. Den Anmeldern ist es gelungen, es als sekretierte lösliche Polypeptidfusion mit C3d durch verübergehende Transfektion von COS-Zellen zu exprimieren. Das Interesse an diesem Autoantigen liegt darin, die Toleranz des Immunsystems durch Ausnützen der modulierenden Wirkung von C3d zu überwinden.
• Die volle SmB-Sequenz wurde mittels EcoRI aus dem Vektor geschnitten und die Kodiersequenz durch PCR mit Primern amplifiziert, die eine BgIII-Restriktionsstelle dem 5'- Ende und eine BamHI-Stelle dem 3-Ende der Sequenz hinzufügten. Vorwärtsprimer (SEQ.-ID Nr. 13): Rückwärtsprimer (SEQ.-ID Nr. 14):
• Die PCR-Amplifikation bestand aus 35 1-min-Zyklen aus Denaturieren, Annelieren (55 ºC) und Extendieren. Das PCR-Produkt wurde Phenol/Chloroform-extrahiert und mit BamHI und BgIII gespalten und in BamHI/BgIII-gespaltenes pBS.C3d subkloniert (siehe oben), um pBS. Smb zu erzeugen. Kolonien wurden auf korrekte Orientierung durch Pvu II-Restriktions-Verdau gescreent und die SmB-Sequenz durch Didesoxy-mediiertes Sequenzieren unter Verwendung des Sequenase-Sets (U.S. Biochemical Corp.) bestätigt.
• SmB wurde dann mit BamHi und BgIII aus pBS.SmB geschnitten und in pSG5.YL subkloniert (siehe oben) und mit BamHI und BgIII geöffnet. Kolonien wurden durch Pvull- Verdau auf korrekte Orientierung gescreent. Die korrekte Insertion erforderte die Ligation der BgIII-Stelle auf SmB an die BamHI-Stelle in den pSG5-Vektoren und umgekehrt. Diese Stellen gehen daher verloren, was durch BamHI- und BgIII-Digeste bestätigt wird. Die resultierenden Konstrukte sind pSG5. SmB. YI und pSG5.SmB. C3d&sub3;.YL.
• Jede vollständige Kassette wurde dann aus den pSG5-Vektoren durch Spaltung mit Eco- RI und Xbal geschnitten, gelgereinigt, extrahiert und in pcDNA3 (Invitrogen) subkloniert, die zuvor durch Entfernung eines 1159 bp großen Smal-Bst-1107-I-Fragments modifiziert worden war, und dann geschlossen. Die resultierenden Plasmide wurden durch Pvull-Restriktions-Verdau gescreent und als pCMV.SmBYL und pCMV.SmB. C3d3.YL bezeichnet.
• Die Expression von löslichem rekombinantem Protein durch die pCMV-Vektoren wurde durch vorübergehende Transfektion von COS-Zellen durch das DEAE-Dextran-Verfahren bestätigt. Unter Anwendung von in vitro-Markieren mit ³&sup5;S-Methionin wurden geeignet dimensionierte Proteine für rSmB und rSmB.C3d3 aus COS-Zellüberständen unter Verwendung des YL1/2-Antikörpers immungefällt, der das YL-Epitop auf den rekombinanten Proteinen erkennt.
• Die hierin beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass eine Immunreaktion gegen ein Antigen durch diskrete molekulare Modifikation des Antigens, Bindung von C3d, moduliert werden kann. Die Reaktion kann durch eine Größenordnung des 10.000fachen verstärkt werden, was viel stärker ist als bei Verwendung von vollständigem Freund-Adjuvans (CFA).
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Claims (42)

1. Zusammensetzung, umfassend ein Antigen in Verbindung mit einem Liganden für CD21 (CR2) oder CD19, mit der Maßgabe, dass der Ligand kein für CD21 oder CD19 spezifischer Antikörper ist und dass das Antigen mit einem komplementären C3- Fragment nicht über eine vom internen Thioester des komplementären C3-Fragments stammende Esterbindung verbunden ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Antigen ein Peptid oder ein Polypeptid ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, umfassend ein Fusionsprotein, das das Antigen und den Liganden umfasst.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Ligand ein C3d- Molekül umfasst.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin der Ligand mehr als ein C3d-Molekül umfasst.

6. Konjugat, umfassend ein Antigen, das an ein C3d-Molekül gekoppelt ist, mit der Maßgabe, dass das Antigen mit einem komplementären C3-Fragment nicht über eine vom internen Thioester des komplementären C3-Fragments stammende Esterbindung verbunden ist.

7. Konjugat nach Anspruch 6, umfassend mehr als ein C3d-Molekül.

8. Konjugat nach Anspruch 6 oder 7, worin das Immunogen ein Peptid oder Polypeptid ist.

9. Konjugat nach Anspruch 8, das ein Fusionsprotein ist.

10. Fusionsprotein, umfassend ein Peptid- oder Polypeptid-Antigen, das mit einem Liganden für CD21 (CR2) oder CD19 verbunden ist.

11. Fusionsprotein nach Anspruch 10, worin der Ligancl ein C3d-Molekül umfasst.

12. Fusionsprotein nach Anspruch 11, umfassend mehr als ein C3d-Molekül.

13. Nucleinsäure, die für ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 9 bis 12 kodiert.

14. Expressionsvektor, der Nucleinsäure nach Anspruch 13 und Regulationssequenzen für die Expression des kodierten Fusionsproteins umfasst.

15. Wirtszeile, die Nucleinsäure nach Anspruch 13 oder einen Expressionsvektor nach Anspruch 14 umfasst.

16. In vitro-Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins, das ein Peptid oder Polypeptid und einen Liganden von CD21 oder CD19 umfasst, wobei das Verfahren die Expression ausgehend von Nucleinsäure umfasst, die für das Fusionsprotein kodiert.

17. In vitro-Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins, das ein Peptid oder Polypeptid und ein oder mehrere C3d-Moleküle umfasst, wobei das Verfahren die Expression ausgehend von Nucleinsäure umfasst, die für das Fusionsprotein kodiert.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, umfassend das Kultivieren von die Nucleinsäure umfassenden Wirtszellen unter Bedingungen für die Expression des Fusionsproteins.

19. Verfahren, das nach der Herstellung eines Fusionsproteins gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18 das Isolieren des Fusionsproteins umfasst.

20. Verfahren, das nach dem Isolieren des Fusionsproteins gemäß dem Verfahren nach Anspruch 19 die Formulierung einer Zusammensetzung umfasst, die (i) ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 9 bis 12 und (ii) einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten oder Träger umfasst.

21. Verfahren zum Verändern der Immunogenität eines Antigens, wobei das Verfahren die In vitro-Kopplung eines oder mehrerer C3d-Moleküle an das Antigen zur Bildung eines Konjugat-Moleküls umfasst.

22. Verfahren nach Anspruch 21, worin die Immunogenität des Antigens erhöht wird.

23. Verfahren nach Anspruch 22, worin mehrere C3d-Moleküle an das Antigen gekoppelt werden.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, worin das oder jedes C3d-Molekül über eine Peptidbindung an das Antigen gekoppelt wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, worin das Konjugatmolekül durch Expression ausgehend von kodierender Nucleinsäure hergestellt wird.

26. Zusammensetzung zur Verabreichung an ein Individuum, umfassend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten oder Träger.

27. Zusammensetzung zur Verabreichung an ein Individuum, umfassend ein Konjugat, das ein an ein C3d-Molekül gekoppeltes Antigen und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten oder Träger umfasst.

28. Zusammensetzung nach Anspruch 27, worin das Konjugat mehr als ein C3d-Molekül umfasst.

29. Zusammensetzung nach Anspruch 27 oder 28, worin das Antigen ein Peptid oder Polypeptid ist.

30. Zusammensetzung nach Anspruch 29, worin das Konjugat ein Fusionsprotein ist.

31. Zusammensetzung zur Verabreichung an ein Individuum, umfassend ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 10 bis 12 und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten oder Träger.

32. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26 bis 31 zur Verabreichung an ein Individuum, um die Immunreaktion des Individuums auf das Immunogen zu modulieren.

33. Verwendung einer Zusammensetzung, die ein Antigen in Verbindung mit einem Liganden für CD21 (CR2) oder CD19 umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zum Modulieren der Immunreaktion eines Säugetiers auf das Antigen, mit der Maßgabe, dass das Antigen mit einem komplementären C3-Fragment nicht über eine vom internen Thioester des komplementären C3-Fragments stammende Esterbindung verbunden ist.

34. Verwendung eines Konjugats, das ein an ein C3d-Molekül gekoppeltes Antigen umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zum Modulieren der Immunreaktion eines Individuums auf das Immunogen.

35. Verwendung nach Anspruch 34, worin das Konjugat mehr als ein C3d-Molekül umfasst.

36. Verwendung nach Anspruch 34 oder 35, worin das Antigen ein Peptid oder Polypeptid ist.

37. Verwendung nach Anspruch 36, worin das Konjugat ein Fusionsprotein ist.

38. Verwendung eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 10 bis 12 zur Herstellung eines Medikaments zum Modulieren der Immunreaktion eines Individuums auf das Immunogen.

39. Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 38, worin die Immunreaktion eine Antikörperreaktion umfasst.

40. Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 39, worin die Immunreaktion eine T-Zellen-Reaktion umfasst.

41. Verfahren zum Erhalt von Antikörpern gegen ein Antigen von Interesse, welches Folgendes umfasst: die Verabreichung einer Zusammensetzung, die das Antigen in Verbindung mit einem Liganden für CD21 oder CD19 umfasst, mit der Maßgabe, dass der Ligand kein Antikörper für CD21 oder CD19 ist, an ein Säugetier mit Ausnahme des Menschen, sowie das Isolieren von Antikörpern gegen das Antigen von Interesse aus dem Säugetier, das kein Mensch ist, wobei das Verfahren den Schritt des Tötens des Säugetiers umfasst.

42. Verfahren zum Erhalt von Antikörpern gegen ein Antigen von Interesse, welches Folgendes umfasst: das Verabreichen eines Konjugats, das das Antigen gekoppelt an mehrere C3d-Moleküle umfasst, an ein Säugetier mit Ausnahme des Menschen, sowie das Isolieren von Antikörpern gegen das Antigen von Interesse aus dem Säugetier, das kein Mensch ist, wobei das Verfahren den Schritt des Tötens des Säugetiers umfasst.