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DE10137102A1 - Polyvalente Vakzine gegen durch Papillomaviren verursachte Erkrankungen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung - Google Patents

Polyvalente Vakzine gegen durch Papillomaviren verursachte Erkrankungen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

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Publication number
DE10137102A1
DE10137102A1 DE10137102A DE10137102A DE10137102A1 DE 10137102 A1 DE10137102 A1 DE 10137102A1 DE 10137102 A DE10137102 A DE 10137102A DE 10137102 A DE10137102 A DE 10137102A DE 10137102 A1 DE10137102 A1 DE 10137102A1
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DE
Germany
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dna
vaccine
papillomavirus
structural protein
mammals
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE10137102A
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Inventor
Lutz Gissmann
Martin Mueller
Kai Pohlmeyer
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Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
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Publication date
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    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

Beschrieben wird eine Vakzine durch Papillomaviren verursachte Erkrankungen, die dadurch erhältlich ist, dass (a) Säugern ein oder mehrere Expressionsvektoren injiziert wird/werden, die die für ein Strukturprotein von Papillomaviren oder ein Fragment davon kodierende DNA aufweist/aufweisen, wobei mindestens bei einem Teil der Expressionsvektoren in die kodierende DNA zufällig generierte heterologe Sequenzen eingesetzt sind, (b) aus den Säugern Seren gewonnen werden, die auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen Partikel verschiedener Papillomavirus-Typen untersucht werden und (c) mit Hilfe der untersuchten Seren diejenigen Strukturprotein-Klone identifiziert werden, die für eine polyvalente Vakzine kodieren und (d) aus denen dann die Vakzine hergestellt werden. Des Weiteren wird ein Verfahren zur Herstellung der Vakzine beschrieben und deren Verwendung zur Impfung gegen durch Papillomaviren verursachte Erkrankungen.

Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf polyvalente Vakzine gegen durch Papillomaviren verursachte Erkrankungen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung.
  • Papillomaviren bilden eine Unterfamilie der Papovaviren mit weit mehr als 80 Genotypen. Eine Infektion mit Papillomaviren kann zu Warzen, Papillomen, Akanthomen, Haut- und Zervixcarcinomen führen. Dabei kann eine einzige Krankheit durch verschiedene Papillomaviren- Typen verursacht werden.
  • Die Capside der einzelnen Typen humanpathogener Papillomaviren (HPV) unterscheiden sich in ihren antigenenen Eigenschaften (Epitopen), so dass nach Immunisierung mit einem bestimmten HPV-Typ keine neutralisierenden Antikörper gegen Capside anderer HPV-Typen induziert werden. Solche Antikörper wären aber für einen umfassenden Schutz gegen solche Erkrankungen notwendig, die durch unterschiedliche HPV-Typen bedingt sein können.
  • Beispielsweise kann die Infektion mit einem von mehr als zehn verschiedenen HPV-Typen zur Entstehung von Gebärmuttershalskrebs führen. Obwohl die Viruspartikel der einzelnen Typen in ihrem Aufbau sehr ähnlich sind, tragen sie doch auf ihrer Oberfläche unterschiedliche neutralisierende Epitope und werden daher von dem Immunsystem nur dann erkannt, wenn vorher entweder eine natürliche Infektion oder eine Impfung mit Partikeln desselben Typs stattgefunden hat und typenspezifische (neutralisierende) Antikörper induziert werden.
  • Impfstoffe zur wirksamen Prävention HPV-bedingter Erkrankungen müssen also stets eine Mischung verschiedener Virustypen beinhalten, damit ein umfassender Schutz erreicht wird. Die Herstellung solcher Impfstoffe ist aber aufgrund der vorstehend beschriebenen Tatsache erschwert, dass ein und dieselbe Erkrankung durch verschiedene HPV-Typen hervorgerufen werden kann.
  • Bisher sind nur monovalente HPV-Impfstoffe in der Entwicklung, d. h. Impfstoffe, die sich nur gegen einen HPV-Typ richten. Diese weisen jedoch den schwerwiegenden Nachteil auf, dass sie nur Schutz gegen diesen einen speziellen HPV-Typ, nicht aber gegen andere HPV-Typen gewährleisten. Eine umfassende Immunantwort wird also durch monovalente HPV-Impfstoffe nicht erreicht.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen Impfstoff sowie ein Verfahren zu dessen einfacher Herstellung bereitzustellen, mit dem eine Immunantwort gegen verschiedene HPV-Typen erhalten werden kann.
  • Erfindungsgemäß wird dies erreicht durch eine Vakzine gegen durch Papillomaviren verursachte Erkrankungen, die dadurch erhältlich ist, dass
    • a) Säugern ein oder mehrere Expressionsvektor(en) injiziert wird/werden, der/die die für ein Strukturprotein von Papillomaviren (PV) oder ein Fragmente davon kodierende DNA aufweist/aufweisen, wobei mindestens bei einem Teil der Expressionsvektoren in die kodierende DNA zufällig generierte heterologe Sequenzen eingesetzt sind,
    • b) aus den Säugern Seren gewonnen werden, die auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen Partikel verschiedener Papillomavirus-Typen untersucht werden
    • c) mit Hilfe der untersuchten Seren diejenigen Strukturproteingen-Klone, insbesondere L1 Klone, identifiziert werden, die für eine polyvalente Vakzine kodieren und
    • d) aus denen die Vakzine hergestellt wird.
  • Der Ausdruck "Fragmente davon", wie er vorstehend verwendet wird, weist darauf hin, dass die DNA für ein Protein kodiert, das im Vergleich zum Wildtyp-Protein kürzer ist, jedoch die für vorliegende Erfindung erforderlichen Eigenschaften, insbesondere chemischen, physikalischen und/oder funktionellen Eigenschaften, aufweist.
  • Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Vakzine kann also das für PV-Capside eines bestimmten Typs kodierende Gen, beispielsweise L1, durch Einsetzen zufällig generierter Sequenzen modifiziert werden. Ohne vorherige Herstellung und Reinigung der Capside, beispielsweise durch Expression des L1-Gens mit Hilfe rekombinanter Vektoren, wie Plasmide, werden durch Immunisierung mit mehreren L1-Expressionsvektoren, die als Pools von Expressionsvektoren bezeichnet werden können, Seren hergestellt, die dann auf Reaktivität mit Capsiden verschiedener PV-Typen getestet werden. Erst danach werden die Pools vereinzelt und so Capside mit kreuzneutralisierenden Epitopen identifiziert.
  • Wie aus den vorstehenden Ausführungen hervorgeht, kann es sich bei der erfindungsgemäßen Vakzine um VLPs (virus-like particles) oder Capsomere handeln, die modifizierte L1-Proteine enthalten, die kreuneutralisierende Epitope aufweisen können, d. h. die zu einer gegen verschiedene PV-Typen gerichteten Antikörperantwort führen. Solche Vakzine können als polyvalente Vakzine bezeichnet werden, die gegen Infektionen mit verschiedenen PV-Typen verwendet werden kann.
  • Zur Induktion neutralisierender Antikörper können sich, wie vorstehend ausgeführt wurde, DNA- freie Viruscapside, so genannte virus-like particles (VLP), eignen, die sich nach Expression des Hauptstrukturproteins L1 mit Hilfe rekombinanter Vektoren in eukaryotischen Zellen zusammen lagern. Bei VLPs handelt es sich um gentechnisch hergestellte, leere (nukleinsäurefreie) Virus- Capside. Auch Substrukturen von VLPs, die als Capsomere bezeichnet werden, die aus einem unvollständigen Zusammenbau, beispielsweise bei vorliegen veränderter L1-Moleküle, resultieren, weisen neutralisierende Epitope auf, so dass sie zur Herstellung erfindungsgemäßer Vakzine geeignet sind.
  • Epitop ist eine andere Bezeichnung für Antigen-Determinanten. Dabei handelt es sich um Bereiche an der Oberfläche eines Antigens, an den ein spezifischer Antikörper über seine Antigen- Bindungsregion bindet.
  • Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vakzine wird eine zufällig generierte heterologe Sequenz in ein Hauptstrukturprotein, wie das L1-Gen, eines bestimmten Typs eines Papillomavirus eingesetzt, insbesondere in die hypervariablen Regionen von L1-Genen.
  • Der Ausdruck "einsetzen" im Sinne der vorliegenden Erfindung weist darauf hin, dass die zufällig generierten heterologen Sequenzen zusätzlich zu den natürlich vorkommenden Epitopen im Gen für das Strukturprotein vorliegen können und/oder das natürlich vorkommenden Epitop im Gen für das Strukturprotein durch eine zufällig generierte heterologe Sequenz ausgetauscht sein kann.
  • Nachfolgend wird beispielhaft die Herstellung einer L1-Genkassette beschrieben, die es ermöglicht, unterschiedliche, zufällig generierte Oligonukleotide in die hypervariablen Bereiche des L1 Strukturproteins einzufügen.
  • Für das Einsetzen der zufällig generierten Oligonukleotide in die DNA-Sequenz des L1 Strukturproteins kann zunächst eine Genkassette konstruiert werden. Diese Genkassette ist dadurch gekennzeichnet daß beispielsweise die für die hypervariablen Bereiche des L1 Strukturproteins kodierende DNA so modifiziert wird, daß durch stille Mutationen monovalente Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen eingefügt werden, die diese hypervariablen Bereiche flankieren. Die Bezeichnung stille Mutation ist eine Bezeichnung für die Einführung einer veränderten DNA-Sequenz, die eine Erkennungsstelle für eine bestimmte Restriktionsendonuklease trägt, ohne daß dadurch die Aminosäuresequenz verändert wird. Die Bezeichnung monovalente Schnittstelle bezeichnet eine Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuklease, die nur einmal in der DNA-Sequenz, die für das Zielprotein kodiert vorkommt. Aus technischen Gründen handelt es sich dabei um eine Erkennnungsequenz für ein Restriktionsenzym, die auch in dem verwendeten Plasmiden für die Herstellung der variablen DNA- Gemische nicht vorhanden sein darf. Die heterologen, zufällig degenerierten Oligonukleotide können so konstruiert werden, daß sie ebenfalls von den monovalente Schnittstellen flankiert werden, wie sie die hypervariablen Bereiche der L1 DNA-Sequenz flankieren. Dadurch können die Genkassette (in einem Klonierungsplasmid) und die Oligonukleotide mit den entsprechenden gleichen Restriktionsenzymen behandelt werden. Anschließend kann die Ligation der Oligonukleotide in die Genkassette erfolgen.
  • Der Ausdruck "heterologe Sequenzen", wie er im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet wird, weist auf eine DNA-Sequenz jeglicher Art hin, die von der für die natürlich vorkommenden Epitope im Strukturprotein von PV kodierende DNA-Sequenz in mindestens einem bis maximal allen Nukleotiden unterschiedlich ist. Dies kann durch Austausch von Nukleotiden erreicht werden. Da Epitope in der Regel nur einige Aminosäuren in der Größenordnung von Oligoproteinen umfassen, können ausgehend von den DNA-Sequenzen der bekannten Epitopen die heterologen Sequenzen in üblicher Weise hergestellt werden, beispielsweise durch eine Oligonukleotidsynthese.
  • Weist ein Epitop beispielsweise 12 Aminosäuren auf, so besteht die entsprechende DNA-Sequenz aus 36 Nukleotiden. Von diesen können für die zufällig generierte heterologe Sequenz ein bis maximal alle der Nukleotide ausgetaussht werden. Da ein Nukleotid gegen insgesamt drei andere dqvon unterschiedliche Nukleotide ersetzt werden kann, können bei der zufälligen Generierung der DNA-Sequenzen eine Vielzahl von bis zu mehreren Tausend neuen DNA-Sequenzen entstehen, die zur ursprünglichen DNA-Sequenz heterolog sind. Da die Herstellung dieser DNA nicht zielgerichtet ist, wie beispielsweise bei dem Austausch nur eines bestimmten Nukleotids in einer DNA-Sequenz, kann sie als eine zufällig generierte DNA-Sequenz bezeichnet werden.
  • Beispiel für eine Sammlung verschiedener heterologer zufällig generierter Sequenzen stellt eine sogenannte "random library" dar.
  • Bei den zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vakzine eingesetzten zufällig generierten heterologen DNA-Sequenzen handelt es sich also um solche, die nicht durch eine zielgerichtete Mutationen erzeugt werden, sondern es werden vielmehr basierend auf bekannten Epitopsequenzen mindestens ein Nukleotid bis maximal alle Nukleotide in zufälliger Weise durch eines der drei anderen denkbaren Nukleotide ausgetauscht, wodurch eine zufällig generierte Sammlung verschiedenster DNA-Sequenzen entsteht. Günstig ist es, wenn die zufällig generierte heterologe DNA-Sequenz hinsichtlich der Anzahl der Nukleotide sich an den natürlich vorkommenden Epitopen orientieren, im Idealfall sogar die gleiche Anzahl an Nukleotiden aufweist.
  • Bei der Herstellung der zufällig generierten heterologen DNA-Sequenzen geschieht es zwangsläufig, dass durch die zufällige Kombination der Nukleotide wieder die DNA-Sequenz der Wildtyp-Epitope erhalten wird.
  • Nachfolgend wird beispielhaft beschrieben, wie zufällig generierte Oligonukleotide erhältlich sind. Die Oligonukleotide können über das Verfahren der Oligonukleotidsynthese hergestellt werden. Dabei wird die Nukleotidsequenz linear erzeugt, d. h. die Kettenverlängerung erfolgt durch die Reaktion der bereits vorhanden Nukleotidsequenz mit einer aktivierten Vorstufe des folgenden Nukleotids. Für die Herstellung degenerierter Oligonukleotide kann nun aber nicht nur die aktivierte Vorstufe eines Nukleotids, sondern auch aktivierte Vorstufen von 2, 3 oder 4 Nukleotiden eingesetzt werden. Dadurch entstehen Oligonukleotidgemische, die an dieser Stelle für mehrere verschiedenen Aminosäuren kodieren. Wird dieses Verfahren bei weiteren Reaktionsschritten wiederholt, entsteht eine Kombination verschiedenartiger DNA-Sequenzen. Dabei resultieren sowohl DNA-Sequenzen, die in humanpathogenen PVs nicht vorkommen, als auch die, für die Wildtypepitope kodierenden Sequenzen. Beispielhaft für das Hauptstrukturprotein L1 kann der Sequenzbereich von Aminosäure 130 bis 152 (Sequenznummerierung von HPV16L1) gelten. Für die 23 Aminosäuren dieses Sequenzabschnittes kodiert eine DNA-Sequenz aus 69 Nukleotiden. Durch die zusätzliche Einführung der monovalenten Schnittstellen entstehen DNA-Sequenzen mit über 80 Nukleotiden. Alternativ kann auch der Bereich von Aminosäure 260-299 oder Aminosäure 349-360 gewählt werden. Mit komplementären Primern kann durch verschiedene Auffüllreaktionen mit DNA Polymerasen der Gegenstrang synthetisiert werden. Die so erhaltene doppelsträngige DNA kann dann direkt mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen modifiziert und in die L1 Genkassette ligiert werden. Der Fachmann kann, um höhere Effizienzen zu erhalten, die doppelsträngigen DNA Sequenzen zunächst über "blunt end" Klonierungen in Klonierungsvektoren ligieren. Aus diesen "random libraries" können die DNA-Sequenzen dann mit hohen Effizienzen in die L1-Genkassetten umkloniert werden.
  • Die zufällig generierten heterologen DNA-Sequenzen werden dann, wie vorstehend beschrieben, in die Gene der Strukturproteine der PV, insbesondere in die L1-Gene von Papillomaviren eines bestimmten Typs eingesetzt. Vertreter der Papillomaviren sind HPV, BPV und CRPV. Insbesondere erfolgt das Einsetzen in die hypervariablen Regionen von L1-Genen. Die Erfindung wird vorliegend anhand des bevorzugten Strukturprotein-Gens L1 beschrieben, ohne aber darauf beschränkt zu sein.
  • Die Länge der eingesetzten heterologen DNA, d. h. die Anzahl der Nukleotide, orientiert sich dabei, wie bereits vorstehend erwähnt, an der Länge der natürlich vorkommenden Epitope. Sie wird vor allem so gewählt, dass die Bildung der Capsomeren und der VLPs nicht beeinträchtigt wird.
  • Werden die ursprünglichen Epitope des L1-Gens durch die zufällig generierten heterologen DNA- Sequenzen ausgetauscht, kann nur eines der Epitope ausgetauscht werden. Es können aber auch mehrere, bis zu allen der maximal möglichen Epitopen im L1-Gen durch zufällig generierte heterologen Sequenzen ersetzt werden.
  • Die L1-Gene, in die die zufällig generierten heterologen Sequenzen eingesetzt sind, können nachfolgend in eukaryontische Expressionsvektoren kloniert werden. Dabei können eine Vielzahl von Bakterienklonen entstehen, wobei aus dieser Vielzahl von Bakterienklonen dann Untergruppen gebildet werden können, d. h. diese Vielzahl von Baktierienklonen wird in Pools von einigen Tausend Bakterienklonen geteilt und weiter für die Herstellung der erfindungsgemäßen Vakzine eingesetzt.
  • Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vakzine wird/werden Säugern ein oder mehrere Expressionsvektor(en) injiziert, die wie vorstehend beschrieben, charakterisiert werden können. Der Begriff "mehrere" weist dabei darauf hin, dass ein Pool von Expressionsvektoren verwendet werden kann, der bis zu 10 000, insbesondere bis zu 5 000, voneinander unterschiedliche Expressionsvektoren enthalten kann. Die Unterschiede in den Expressionsvektoren bestehen dabei insbesondere in der einklonierten zufällig generierten heterologen DNA. Wie aus den vorstehenden Erläuterungen zur zufällig generierten heterologen DNA hervorgeht, können die Expressionsvektoren auch solche DNA-Sequenzen enthalten, die zwar bei der zufälligen Generierung der DNA-Sequenzen erhalten wurden, aber - weil die Generierung eben zufällig ist - mit der DNA-Sequenz für die Wildtyp-Epitope identisch ist. Demzufolge werden den Säugern Expressionsvektoren injiziert, bei denen bei mindestens einem Teil bis maximal allen in die kodierende DNA zufällig generierte heterologe DNA-Sequenzen eingesetzt sind.
  • Diese vorselektierten Pools werden somit für eine DNA-Vakzinierung (genetischen Immunisierung) verwendet. Dabei handelt es sich um ein an sich bekanntes Verfahren zur Immunisierung, bei der im Gegensatz zur konventionellen Immunisierung keine Antigene, sondern die kodierende DNA in einem entsprechenden Expressionsvektor injiziert wird. Die intramuskuläre Applikationsform hat sich für die DNA-Vakzinierung als günstig erwiesen, da hier offensichtlich eine Aufnahme und Expression des Gens durch die Zelle erfolgt, bevor die DNA abgebaut wird. Gegen das exprimierte Protein erfolgt dann die Immunreaktion.
  • Ein Vorteil der DNA-Vakzinierung ist insbesondere darin zu sehen, dass die Viruspartikel nicht mehr vorher hergestellt und gereinigt werden müssen, beispielsweise durch Expression des L1- Gens mit Hilfe rekombinanter Vektoren. Die DNA-Vakzinierung kann somit in einfacher und schneller Weise durchgeführt werden.
  • Diese DNA-Vakzinierung kann in Säugern, wie Ratten, Mäusen, Hamstern und Meerschweinchen durchgeführt werden.
  • Aus den Versuchstieren können dann in üblicher Weise Seren gewonnen werden, die auf Reaktivität mit verschiedenen Papillomavirus-Typen getestet werden können. Dies kann beispielsweise mittels ELISA, die für Papillomavirus-Typen spezifisch sind, erfolgen.
  • Diejenigen der für die DNA-Vakzinierung eingesetzten DNA-Pools, die eine Immunantwort gegen verschiedene Papillomavirus-Typen hervorrufen, können nachfolgend vereinzelt und wiederum durch DNA analysiert werden. Dadurch können solche Klone identifiziert werden, die für VLPs oder Capsomere kodieren, die kreuzneutralisierende Epitope aufweisen. Dabei handelt es sich um solche Epitope, die zu einer gegen verschiedene Papillomavirus-Typen gerichtete Antikörperantwort führen.
  • Danach können die entsprechenden DNA-Klone durch übliche gentechnische Verfahren weiter untersucht und gegebenenfalls die entsprechenden Viruspartikel produziert, isoliert und gereinigt werden. Dazu können beispielsweise die L1-Moleküle exprimiert, VLPs bzw. Capsomere können hergestellt und die Immunität der gereinigten Partikel kann untersucht werden. Letztendlich ist es auf diese Weise möglich, die erfindungsgemäße Vakzine zu gewinnen, die sich dadurch auszeichnet, dass eine Immunisierung gegen mehr als einen Papillomavirus-Typ möglich ist. Bei der erfindungsgemäßen Vakzine handelt es sich somit also um eine multivalente Vakzine, die Immunschutz gegen durch verschiedene PV-Typen hervorgerufene Erkrankungen induzieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vakzine handelt es sich bei dem Papillomavirus um einen humanpathogenen Papillomavirus. Dadurch wird die Behandlung von durch humanpathogene Papillomaviren entstandenen Erkrankungen beim Menschen mit der erfindungsgemäßen Vakzine möglich.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Strukturprotein L1, da dies für die Herstellung der erfindungsgemäßen Vakzine besonders gut geeignet ist.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bildet das Strukturprotein DNA-freie Virus-Capside oder Capsomere.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine DNA-Vakzine, umfassend einen oder mehrere Expressionsvektor(en), der/die die für ein Strukturprotein von Papillomaviren oder ein Fragment davon kodierende DNA aufweist/aufweisen, wobei mindestens bei einem Teil der Expressionsvektoren in die kodierende DNA zufällig generierte heterologe Sequenzen eingesetzt sind.
  • Hinsichtlich der Strukturen und der Herstellung der DNA-Vakzine wird auf vorstehenden Ausführungen verwiesen:
    Bei Verabreichung der erfindungsgemäßen DNA-Vakzine wird das Strukturproteingen exprimiert und gegen das exprimierte Protein erfolgt dann die Immunisierung. Auf diese Weise wird in besonders einfacher Weise eine Immunisierung erreicht.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der vorbeschriebenen Vakzine, wobei
    • a) Säugern ein oder mehrere Expressionsvektor(en) injiziert wird/werden, der/die die für ein Strukturprotein von Papillomaviren oder ein Fragment davon kodierende DNA aufweist/aufweisen, wobei mindestens bei einem Teil der Expressionsvektoren in die kodierende DNA zufällig generierte heterologe Sequenzen eingesetzt sind,
    • b) aus den Säugern Seren gewonnen werden, die auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen Partikel verschiedener Papillomavirus-Typen untersucht werden und
    • c) mit Hilfe der untersuchten Seren diejenigen Strukturproteingen-Klone, insbesondere L1 Klone, identifiziert werden, die für eine polyvalente Vakzine kodieren und
    • d) aus denen dann die Vakzine hergestellt wird.
  • Die einzelnen Verfahrensschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden bereits vorstehend im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Vakzine erläutert, so dass auf die diesbezüglichen Ausführungen verwiesen wird.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass die modifizierten Gene der Strukturproteine (Einsetzen zufällig generierter heterologer DNA) vor der Immunisierung nicht mehr individuell auf ihre Fähigkeit zur Bildung von VLPs oder Capsomeren überprüft werden müssen. Vielmehr werden Pools von rekombinanten DNA-Expressionsvektoren zur Immunisierung von Säugern, insbesondere Mäusen, verwendet. Die erhaltenen Seren werden auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen Partikel verschiedener Papillomavirus-Typen, insbesondere HPV-Typen, untersucht. Bei positiver Reaktion, wenn also kreuzneutralisierende Epitope nachgewiesen werden können, werden die Pools von Expressionsvektoren vereinzelt und die entsprechenden Proteine analysiert.
  • Dieses erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Untersuchung einer großen Zahl von Varianten von Papillomavirus-Partikeln, insbesondere Capsiden, auf ihre immunogenen Eigenschaften, ohne dass vorher die Partikel durch Expression des mutierten Strukturproteins einzeln exprimiert und gereinigt werden müssen. Des weiteren können durch das erfindungsgemäße Verfahren hochwirksame, multivalente Papillomavirus-Vakzine in schneller, einfacher und kostengünstiger Weise hergestellt werden.
  • Die erfindungsgemäße Vakzine eignet sich bestens als polyvalenter Impfstoff zur Impfung gegen durch Papillomavirus verursachte Erkrankungen, insbesondere solche Erkrankungen, die durch verschiedene Papillomavirus-Typen hervorgerufen werden. Beispiele dieser Erkrankungen sind Warzen, Papillome, Akanthome, Haut- und Zervixcarcinome.

Claims (9)

1. Vakzine gegen durch Papillomaviren verursachte Erkrankungen, die dadurch erhältlich ist, dass
a) Säugern ein oder mehrere Expressionsvektor(en) injiziert wird/werden, der/die die für ein Strukturprotein von Papillomaviren oder ein Fragment davon kodierende DNA aufweist/aufweisen, wobei mindestens bei einem Teil der Expressionsvektoren in die kodierende DNA zufällig generierte heterologe Sequenzen eingesetzt sind,
b) aus den Säugern Seren gewonnen werden, die auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen Partikel verschiedener Papillomavirus-Typen untersucht werden und
c) mit Hilfe der untersuchten Seren diejenigen Strukturproteingen-Klone identifiziert werden, die für eine polyvalente Vakzine kodieren und
d) aus denen dann die Vakzine hergestellt wird.
2. Vakzine nach Anspruch 1, wobei der Papillomavirus ein humanpathogener Papillomavirus ist.
3. Vakzine nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Strukturprotein L1 ist.
4. Vakzine nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Strukturprotein DNA-freie Viruscapside bildet.
5. Vakzine nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Strukturprotein Capsomere bildet.
6. DNA-Vakzine, umfassend einen oder mehrere Expressionsvektor(en), der/die die für ein Strukturprotein von Papillomaviren oder ein Fragment davon kodierende DNA aufweist/aufweisen, wobei bei mindestens einem Teil der Expressionsvektoren in die kodierende DNA zufällig generierte heterologe DNA-Sequenzen eingesetzt sind.
7. Herstellung der Vakzine nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
a) Säugern ein oder mehrere Expressionsvektor(en) injiziert wird/werden, der/die die für ein Strukturprotein von Papillomaviren oder ein Fragment davon kodierende DNA auweist/aufweisen, wobei mindestens bei einem Teil der Expressionsvektoren in die kodierende DNA zufällig generierte heterologe Sequenzen eingesetzt sind,
b) aus den Säugern Seren gewonnen werden, die auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen Partikel verschiedener Papillomavirus-Typen untersucht werden und
c) mit Hilfe der untersuchten Seren diejenigen Strukturproteingen-Klone, insbesondere L1 Klone, identifiziert werden, die für eine polyvalente Vakzine kodieren und
d) aus denen dann die Vakzine hergestellt wird.
8. Verwendung der Vakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Impfung gegen durch Papillomavirus verursachte Erkrankungen.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Erkrankung aus der Gruppe Warzen, Papillome, Akanthome, Haut- und Zervixcarcinome ausgewählt ist.
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