DE3853672T2

DE3853672T2 - Nichtzurückschlagende RNS-Viren.

Info

Publication number: DE3853672T2
Application number: DE3853672T
Authority: DE
Inventors: Steven Joseph Mento; Carolyn Louise Weeks-Levy
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1988-01-11
Filing date: 1988-12-19
Publication date: 1996-01-11
Anticipated expiration: 2008-12-20
Also published as: IL88731A0; DK8789D0; EP0325768B1; DK8789A; ATE121779T1; EP0325768A2; JPH01222774A; AU2833789A; FI890116A0; DE3853672D1; ES2070846T3; EP0325768A3; FI890116L

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft abgeschwächte RNA-Virusstämme mit einer geringen Replikationsrate. Spezieller betrifft diese Erfindung Impfstoffe und die Verwendung derartiger Impfstoffe, die diese abgeschwächten RNA- Virusstämme enthalten.

Hintergrund der Erfindung

Verschiedene Viren mit positivem RNA-Strang oder Picorna-Viren sind gut bekannt. Typische Picorna-Viren schließen Polio-Viren, ECHO-Viren, Coxsackie-Viren und Rhino-Viren (gewöhnliche Erkältungsviren) ein.
Impfstcffe, die gegen durch derartige Viren induzierte Erkrankungen schützen, werden unter Verwendung lebender oder abgetöteter Virusvarianten oder -mutanten hergestellt, welche abgeschwächt sind. Abgeschwächte Viren zeigen eine verringerte Pathogenität. Beispielsweise isolierte Albert Sabin in den 1950er Jahren abgeschwächte Stämme des Polio-Virus, indem er das Virus aus Geweben von verschiedenen Tierwirten in kultivierte Zellen überführte, bis Varianten selektiert waren, die ihre Fähigkeit, Krankheit zu verursachen, verloren hatten [A.J. Sabin et al., "History of Sabin Attenuated Poliovirus Oral Live Vaccine Strains", J. Biol. Stard., 1, S. 115 (1973)]. Impfstoffe auf Virus-Basis sind nützlich, da sie in der Lage sind, zu replizieren und durch die Erzeugung von Antikörpern eine angemessene Immunität zu induzieren. Jedoch weisen Lebend-Impfstoffe den zusätzlichen Vorteil auf, Immunität an der Stelle der Infektion zu induzieren, während Tot-Impfstoffe auf die Induktion von Serumimmunität beschränkt sind. Lebend-Virus-Impfstoffe werden gewöhnlicherweise wegen der Leichtigkeit der oralen Verabreichung, der geringen Kosten und der Schnelligkeit verabreicht, mit der Impfstoffempfänger eine langanhaltende Immunität entwickeln. Unglücklicherweise können die Lebend-Viren zurückschlagen, d.h. aus dem lebenden Virus-Pool können neue Varianten hervorgehen, die unter Verursachung von Erkrankung entweder, wenn sie im Impfstoffempfänger angelangt sind, oder während der Herstellung replizieren können.
N. LaMonica et al., "A Mouse Model for Poliovirus Neurovirulence Identifies Mutations That Attenuate the Virus for Humans", J. Virology, 61, S. 2917-2920 (1987), erörtert das Potential für die Entwicklung von Impfstoffen, die mutagenisierte Viren enthalten, um die Zurückschlagungsrate der virulenten Form zu verringern.
Es wäre deshalb von Interesse, einen Stamm zur Verwendung als Impfstoff zu erzeugen, der mit weniger Wahrscheinlichkeit zurückschlägt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung löst das oben erörterte Problem, indem sie hoch abgeschwächte RNA-Virusstämme bereitstellt, die ein verringertes Potential aufweisen, wieder virulent zu werden. Die RNA-Virusstämme dieser Erfindung sind in Impfstoffen nützlich, um Empfänger oder die in nahem Kontakt Stehenden vor Virus-induzierter Erkrankung zu schützen.
Eine Ausführungsform eines Verfahrens dieser Erfindung zur Erzeugung dieser abgeschwächten RNA-Virusstämme besteht in der Modifikation eines RNA-Virusgenoms, um die Basenpaarung des Virusgenoms mit sich selbst zu steigern.
Eine zweite Ausführungsform eines Verfahrens dieser Erfindung besteht in der Modifikation eines RNA-Virusgenoms, um die Basenpaarung zwischen der Virus-RNA und der ribosomalen Säugerwirt-RNA zu steigern oder zu verringern. Das Verfahren dieser Erfindung modifiziert Virus-RNA- Basen in Regionen, die eine Komplementarität mit ribosomaler Wirts-RNA enthalten. Eine dritte Ausführungsform eines Verfahrens dieser Erfindung besteht in der Kombination der obigen beiden Ausführungsformen, um hoch abgeschwächte RNA-Virusstämme bereitzustellen.
Derartige Modifikationen der Basenpaarung umfassen die Schritte der Isolierung von RNA-Viren, des Reversen Transcribierens der RNA, um cDNA- Kopien zu ergeben; des Mutagenisierens der cDNA, um einen oder beide der oben erörterten Effekte in den zwei Ausführungsformen zu verursachen; des Transfizierens von Zellen, die in der Lage sind, Virus-RNA mit der mutagenisierten RNA-viralen cDNA zu erzeugen; und des Kultivierens, um abgeschwächte RNA-Viren zu erzeugen. Diese Modifikationen sind zur Verringerung der Transcriptions- oder Translationseffizienz der RNA- Virusstämme wirksam.
Ein Ziel dieser Erfindung ist es, die abgeschwächten RNA-Viren in einem Lebend-Impfstoff zu verwenden. Die Verabreichung des Impfstoffes kann auf irgendeine der üblicherweise akzeptierten Arten der Verabreichung von Lebend-Impfstoffen vorgenommen werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 stellt eine Schleife dar, die durch das Paaren von komplementären Basen aus dem veröffentlichten cDNA-Poliogenom zwischen den Basen 370 und 471 der 5'-nicht-kodierenden Region [Toyoda et al., J. Mol. Biol., 174, S. 561 (1984)] vorhergesagt wurde, und die resultierende modifizierte Schleife nach Mutagenese.
Figur 2 ist eine schematische Darstellung des Polio-Virus-Genoms mit 7500 B.p., das Komplementarität mit zellulärer ribosomaler Maus-RNA aufweist.
Figur 3 stellt die Wechselwirkung der veröffentlichten 28 S ribosomalen Ratten-Sequenzen [Genbank, "Nucleotide Sequences, Band 1, S. 243, Oxford Press (1985)] mit Polio-cDNA-Sequenzen (Toyoda et al., oben) dar.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hoch abgeschwächten RNA-Virusstämmen. Abgeschwächte RNA-Virusstämme, wie sie durch diese Erfindung definiert sind, weisen eine verringerte Transcriptions- oder Translationseffizienz auf, die eine langsamere Replikation von Viren zur Folge hat. Da die Erzeugung von neuen Virus- Populationen verringert ist, tritt eine geringere Wahrscheinlichkeit auf, eine Virusvariante zu erzeugen, die Krankheit verursacht.
Wie vorstehend beschrieben, ist in der ersten Ausführungsform dieser Erfindung das Virus-RNA-Genom durch Steigerung der Basenpaarung mit sich selbst verändert worden. Ohne durch eine Theorie gebunden sein zu wollen, glauben wir, daß eine Vermehrung der Basenpaarung die Faltung der Virus- RNA stabilisiert, was es wiederum für diese schwieriger macht, sich zur Initiierung von Transcription oder Translation zu entfalten. Wir glauben auch, daß die modifizierte Basenpaarung Veränderungen in der Sekundärstruktur der Virus-RNA beinhaltet, was deren Bindung an ribosomale Wirts-RNA während der Transcription oder Translation aufbricht. Dieses Aufbrechen verringert die Wirksamkeit der Transcription oder Translation, und entsprechend verringert sich die Virusproduktion. Demgemäß sind Virusstämme, die durch das Verfahren dieser Erfindung modifiziert werden, durch eine verringerte Replikationsrate im Vergleich zu nativen oder anders unmodifizierten Stämmen gekennzeichnet. Daraus folgt ein abgeschwächterer Stamm, da die Rate der Erzeugung jeglicher potentieller Virusvariante, die Krankheit induzieren kann, verringert ist. Die Virus-RNA, die modifiziert wird, liegt in den Schleifen-Regionen des Genoms. In diesen Schleifen, die von Basen-Basen-Wechselwirkungen herrühren, liegen ungebundene Basenreste vor. Wir wählten, gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren ungebundene Basen durch Basen zu ersetzen, die Komplementarität mit einer anderen ungebundenen Base aufweisen.
Auch wird, wie vorstehend als eine andere Ausführungsform dieser Erfindung beschrieben, das Virus-RNA-Genom in Regionen modifiziert, die Komplementarität mit ribosomaler Wirts-RNA enthalten, um hochabgeschwächte Viren bereitzustellen. Modifikationen dieser Art schließen die Steigerung oder Verringerung von Basenpaarung zwischen der Virus-RNA und der ribosomalen Wirts-RNA ein. Wir glauben, daß eine derartige Basen-Basen-Abwandlung ebenso die Translationseffizienz unterbricht, was zur verringerten Produktion jeglicher potentieller Virus-Variante führt.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der hochabgeschwächten RNA-Viren dieser Erfindung. In der bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens reinigen wir Viren, um jegliche Zelltrümmer zu entfernen, gefolgt von der Synthese der viralen doppelsträngigen cDNA in voller Länge gemäß dem Verfahren von Racaniello et al. [Y.R. Racaniello et al., "Molecular Cloning of Poliovirus cDNA And Determination Of The Complete Nucleotide Sequence Of the Viral Genome", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, S. 4887 (1981)]. Als nächstes wird gemäß der ersten Ausführungsform dieser Erfindung die RNA-virale cDNA, die den RNA-Basen entspricht, die in der Schleifenstruktur des RNA- Virusgenoms ungebunden waren, unter Verwendung herkömmlicher Methoden mutagenisiert, um die Basenpaarung zu steigern. Auch wird gemäß der zweiten Ausführungsform dieser Erfindung die RNA-virale cDNA, die Regionen der Virus-RNA entspricht, die Komplementarität mit ribosomaler Wirts-RNA enthalten, so mutagenisiert, daß die Basenpaarung zwischen dem RNA-Genom und der ribosomalen RNA gesteigert oder verringert wird. Nach der Mutagenese werden Zellen, die zur RNA-Erzeugung in der Lage sind, z.B. CV-1-, VERO- oder Hela-Zellen, unter Verwendung herkömmlicher Methoden mit cDNA transfiziert. Als nächstes wird unter Verwendung bekannter Verfahren Lebend-Virus nachgewiesen und mittels bekannter Methoden sequenziert, um zu bestimmen, ob die RNA-Virussequenz der mutagenisierten cDNA-Seguenz entspricht. Schließlich wird der Grad an Abschwächung nachgewiesen. Wir verwenden einen Assay, der die Produktionsrate von mit 35S-Methionin markiertem Virusprotein mißt.
Die RNA-Virusstämme dieser Erfindung können unter Verwendung bekannter Verfahren in einem Impfstoff verwendet werden, um Lebend- Impfstoffe herzustellen. Der resultierende Impfstoff enthält eine Menge an Lebend-Virus, die im Empfänger zum Schutz gegen eine Virusinfektion wirksam ist.
Die Verabreichung dieser Impfstoffe kann auf irgendeine der üblicherweise akzeptierten Verabreichungsarten von Lebend-Impfstoffen vorgenommen werden. Das folgende Beispiel wird angegeben, damit diese Erfindung besser verstanden werden kann. Dieses Beispiel dient lediglich dem Zweck der Erläuterung und soll den Bereich der Erfindung nicht beschränken.

BEISPIEL

Wir wählten, diese Erfindung unter Verwendung von ribosomaler Ratten-RNA als Wirt und Polio-Virus-RNA als Modell zu erläutern. Der bevorzugte Wirt und die entsprechende ribosomale RNA sind der Mensch bzw. die des Menschen. Wegen der hoch bewahrten Homologie unter ribosomaler eukaryontischer RNA konnte der Fachmann einen Rattenwirt verwenden, um die Lehren dieser Erfindung beispielhaft zu erläutern.

1. Virus-Reinigung

Wir verwendeten Polio-Viren (erhältlich von der F.D.A.), die in Kulturbedingungen gehalten wurden, welche von A. Sabin et al., "Studies on Variants of Poliomyelitis Virus" J. Exp. Med., 99:551 (1954), beschrieben wurden. Speziell infizierten wir primäres Affen-Nierengewebe bei einer geringen Multiplizität der Infektion und inkubierten das Virus bei 34º bei ph 7,3. Um jegliche zellulären Trümmer zu entfernen, zentrifugierten wir die geerntete Flüssigkeit, die den Stamm enthielt, bei geringer Geschwindigkeit (2000 U/min über 20 Minuten). Wir fällten das Virus durch Zugabe von NaCl (0,12 M) und Polyethylenglykol 8000 (12 Gew.-%), gefolgt vom Rühren über Nacht bei 4ºC. Der gefällte Virus wurde durch Zentrifugation bei 10000 U/min über 20 Minuten gesammelt.
Nach Resuspendieren des Virus-Pellets in einem Gesamtvolumen von 1,2 ml TNE (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA bei pH 8,0) setzten wir NONIDET P-40 zu, bis die Endkonzentration 1 Gew.-% betrug. Als nächstes legten wir das Virus auf 15%-45% Saccharosegradienten [P.P. Minor, "Comparative Biochemical Studies of Type 3 Polio Virus", J. Virol., 34, S. 73 (1980)] und drehten sie 16 Stunden bei 12300 U/min in einem SW 28.1-Rotor. Wir sammelten vom oberen Teil des Gradienten 1 ml-Fraktionen. Von jeder Probe wurden 25 Mikroliter-Proben entnommen und über diskontinuierliche 15%-ige Polyacrylamid-Gele laufengelassen. Wir lokalisierten das Polio-Virus in den Fraktionen durch Sichtbarmachen des Capsid-Proteins im Gel durch Anfärbung der Gele mit Silber [W. Wray et al., "Silver Staining of Proteins In Polyacrylamide Gels", Analy. Bioch., 118, S. 197 (1981)]. Saccharose-Fraktionen, die das Polio-Virus enthielten, wurden zusammengegeben, und Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde zu einer Endkonzentration von 0,5% zugesetzt. Als nächstes extrahierten wir das Virus aus den zusammengegebenen Saccharose-Fraktionen einmal mit einem gleichen Volumen von Phenol, das Chloroform und Isoamylalkohol -enthielt (25:24:1), und extrahierten das Phenol einmal zurück. Die wäßrigen Schichten wurden zusainmengegeben, und 0,5 Volumina 7,5 M Ammoniumacetat wurden zugesetzt. Unter Verwendung von 2,5 Volumina absolutem Ethanol und Tiefkühlen bei -70ºC über Nacht wurde die Polio- Virus-RNA gefällt. Danach resuspendierten wir das RNA-Pellet in Wasser zur Injektion (WF1), das zuvor mit Diethylpyrocarbonat (DEP) behandelt worden war, und fällten die RNA durch Zugabe von 2,5 Volumina absolutem Ethanol wieder aus. Nachdem die RNA wieder in ein Pellet überführt und zweimal mit eiskaltem 70%-igem Ethanol gewaschen worden war, wurde das End-RNA-Pellet in 20 ul DEP resuspendiert, das mit WF1 behandelt worden war. Als nächstes seguenzierten wir die RNA nach dem Verfahren von Sanger [Sanger et al., "DNA Sequencing With Chain Terminating Inhibitors", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, S. 5463 (1973)] mit Modifikationen für RNA und Problemen mit der Sekundärstruktur, die mit RNA-Matrizen einhergehen [D.C. DeBorde et al., "Resolution Of A Common RNA Sequencing Ambiguity By Terminal Deoxynucleotidyl Transferase", Analy. Bioch. 157, S. 275 (1986)]. Zum Beispiel wird terminale Desoxynukleotidyl-Transferase verwendet, um die Artefakte aufgrund der Sekundärstruktur zu beseitigen.

2. Synthese von doppelsträngiger Polio-Virus-cDNA in voller Länge

Die RNA aus dem vorherigen Schritt wird als Matrize für die Synthese von doppelsträngiger cDNA verwendet, Racaniello et al., oben. Unter Verwendung des Oligo(dg).Oligo(dc)-Enden-Verfahrens von Bothwell et al. [A.L.M. Bothwell, Cell, 24, S. 625 (1981)] wird doppelsträngige cDNA in die PstI-Stelle des Plasmids pBR322 insertiert. Tetracyclin-resistente Klone werden durch Kolonienhybridisierung unter Verwendung einer Polio- Virus-cDNA-Sonde auf ihre Inserte durchmustert [M. Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, S. 3961 (1975)]. Unter Verwendung von Nucleotidsequenz-Analyse und Restriktionsenzym-Kartierungsmethoden werden die Inserte auf dem Virusgenom orientiert. (V.R. Racanicello et al., unten). Schließlich werden die partiellen Poliovirus-cDNA-Klone an deren gemeinsamen Spaltungsstellen zu einem einzigen Klon mit voller Länge ligiert [Rancanicello et al., "Cloned Poliovirus cDNA Is Infectious In Mammalian Cells", Science, 214, S. 916 (1981)].

3. Mutagenese von Polio-Virus-cDNA

Gemäß der ersten Ausführungsform dieser Erfindung wird Polio-Virus- cDNA aus dem vorangehenden Schritt, die ungebundenen Basen in dem Schleifenteil des RNA-Genoms entspricht, mutagenisiert, um die Basenpaarung mit anderen ungebundenen Basen zu steigern, die innerhalb der Schleife oder außerhalb der Schleife im linearen Teil des Genoms liegen.
Als Mittel zur Mutagenisierung von ungebundenen Basenpaaren wird unter Verwendung des M13-Verfahrens eine auf einen Mutationsort gerichtete Mutagenese der Polio-Virus-cDNA verwendet [C.A. Hutchinson III et al., "Mutagenesis At A Specific Position In A DNA Sequence", J. Biol. Chem., 253, S. 655 (1978); A. Razin et al., "Efficient Correction Of A Mutation By Use Of A Chemically Synthesized DNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, S. 4268 (1978)].
Fig. 1 stellt eine cDNA-Schleife des Poliogenoms mit ungebundenen Basen dar. Um die Basenpaarung zu steigern, wird die Adeninbase in der Stellung "397" durch eine Cytosin-Base ersetzt, um das ungebundene Guanin zu binden (siehe Fig. 1). Andere ungebundene Basen können auf diese Weise ersetzt werden, um die Basenpaarung zu steigern.
Cemäß der zweiten Ausführungsform dieser Erfindung mutagenisieren wir Polio-Virus-cDNA entsprechend den Regionen, die Komplementarität mit ribosomaler Ratten-RNA enthalten, entweder durch Steigern oder Verringern der Basenpaarung zwischen dem Polio-Virus-Genom und der ribosomalen Ratten-RNA.
Wie in Figur 2 gezeigt, ist gezeigt worden, daß Bereiche des Polio- Genoms mit zellulärer Ratten-RNA binden. Innerhalb dieser Bereiche befinden sich Sequenzen, die Komplementarität mit ribosomaler Ratten-RNA aufweisen (siehe Fig. 3). Basenreste innerhalb dieser Sequenzen werden durch das obige Verfahren mutagenisiert, um die Basenpaarung mit der ribosomalen Ratten-RNA entweder zu steigern oder zu verringern.

4. Transfektion von Zellen mit mutagenisiertem Polio-Virus-Klon

Nach der Mutagenisierung von Polio-Virus-cDNA werden Wirtszellen, die zur RNA-Produktion in der Lage sind, z.B. VERO- oder HeLa-Zellen, mit Plasmid-cDNA transfiziert. Die Transfektion wird unter Verwendung einer Calcium-Phosphat-Methode durchgeführt [B.A. Parker, J. Virol., 31, S. 360 (1979)], die durch Behandeln der Wirtszellen mit Elektroporation abgewandelt wird, um diesen bei der Aufnahme dieser cDNA zu helfen (Apparatur von Promega, Madison, Wisconsin).

5. Nachweis von Lebend-Polio-Virus

Nach Transfektion der mutagenisierten Polio-cDNA wird eine Viruserzeugung nachgewiesen, indem man durch Zell-Lyse, auch zytopathischer Effekt genannt (CPE), nach der aktiven Produktion von Polio-Virus Ausschau hält [T.H. Donnebacker, "Correlation Of The Stage Of Cytopathic Change With The Release Of Poliomyelitis Virus", Virology, 2, S. 399 (1956)]. Um zu bestätigen, daß die RNA-Virussequenz der mutagenisierten cDNA-Sequenz entspricht, wird das RNA-Genom nach dem Verfahren von Sanger et al., oben, sequenziert.

6. Bestimmung des Grades der Abschwächung

Die Produktionsrate von Virusprotein wird als Assay für die Abschwächung verwendet, wobei man den gegenwärtig verwendeten Sabin-Stamm und den Stamm dieser Erfindung vergleicht. Virusprotein wird in Gegenwart von ³&sup5;S-Methionin markiert, und die Proteinprodukte werden durch SDS- Polyacrylamid-Elektrophorese aufgetrennt, gefolgt von Audioradiographie und Durchmustern des Gels, um die verschiedenen Konzentrationen an Virusproteinen und den Grad der Hemmung der Wirtsproteinsynthese zu bestimmen. Die Bestätigung, daß die Abnahme bei der Translationseffizienz eine verringerte Neurovirulenz zur Folge hat, wird vorgenommen, indem man existierende Impfstämme mit neu hergestellten Stämmen gemäß dieser Erfindung in einem Affen-Neurovirulenztest vergleicht (21 CFR 600-799, 1987).

7. Herstellung des Lebend-Impfstoffs

Nach dem Assay auf Abschwächung wird das ausgewählte Virusteilchen nun der Muttersamen, von dem andere Kolonien abgeleitet werden. Beispielsweise wird der Muttersamen in Vero-Zellen auf Mikroträgern infiziert, die in einem Bioreaktor enthalten sind, geerntet und für die Verwendung in einem Impfstoff gereinigt.
Während wir vorstehend eine Anzahl von Ausführungsformen dieser Erfindung beschrieben haben, ist es offensichtlich, daß unsere Grundvorgehensweisen abgewandelt werden können, um andere Ausführungsformen bereitzustellen, die die Verfahren und Zusammensetzungen dieser Erfindung verwenden.

Claims

1. Verfahren zur Erzeugung modifizierter, hoch abgeschwächter RNA-Virusstämme, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine verringerte Replikationsrate in einem Säugerwirt aufweisen, wobei das Verfahren umfaßt:

a) das Isolieren von RNA-Virussequenzen aus Virusteilchen;

b) das Herstellen von RNA-viraler cDNA aus den RNA- Virussequenzen;

c) das Mutagenisieren der RNA-viralen cDNA, um die Basenpaarung der cDNA mit sich selbst zu vergrößern, so daß die Mutagenese die Transkriptions- und Translationseffizienz von RNA-Virusstämmen verringert, die aus der RNA-viralen cDNA erzeugt wurden;

d) das Transfizieren von Zellen mit der mutagenisierten RNA-viralen cDNA;

e) das Kultivieren der Wirtszellen; und

f) das Extrahieren von RNA-Virusstämmen aus den Zellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der RNA-Virusstamm Poliovirus ist.