DE69327307T2

DE69327307T2 - Herstellung von antigenen und impfstoffen vom mysterie-disease-virus, antigene und erworbene impfstoffe zur verhinderung dieser krankheit

Info

Publication number: DE69327307T2
Application number: DE69327307T
Authority: DE
Inventors: Andre Brun; Marie-Claude Tardy; Alain Vaganay; Joris Vandeputte
Original assignee: Merial SAS
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS
Priority date: 1992-01-14
Filing date: 1993-01-13
Publication date: 2000-08-10
Anticipated expiration: 2013-01-14
Also published as: EP0623167A1; FR2686097B1; WO1993014196A1; JPH07505049A; ES2142874T3; DE69327307D1; EP0623167B1; US5597721A; PT623167E; FR2686097A1; CA2127991A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Antigenen und Impfstoffen gegen das Virus der Mystery Disease sowie die erhaltenen Antigene und Impfstoffe.
Die sogenannte Mystery-Disease (M. D.) oder das Porcine Reproductive Respiratory Syndrome (P. R. R. S.) trat beim Schwein 1986 in den Vereinigten Staaten und 1990 in Europa auf. Diese Krankheit manifestiert sich beim Schwein im wesentlichen durch Anzeichen der Mattigkeit, der Anorexie und einer Hyperthermie im Bereich von 40ºC, die man klassischerweise an Sauen in von der Krankheit befallenen Zuchten beobachtet. Diese Anzeichen werden von Störungen der Vermehrung begleitet oder gefolgt (Frühgeburten oder Spätgeburten und das Werfen von toten, mumifizierten oder winzigen Ferkeln und erneutes Brünstigwerden der Sauen). Bei den Ferkeln kann man ein Atmungssyndrom mit Schäden einer intestitiellen Lungenentzündung feststellen. Ältere Schweine können ebenfalls von Atmungsstörungen befallen werden. Diese gesamten Symptome können von Erkrankungen begleitet werden, die durch gelegentliche Infektionen hervorgerufen werden, die man üblicherweise beim Schwein beobachtet.
In G. Wensvoort et al., Mystery Swine Disease in the Netherlands: The Isolation of Lelystad Virus, The Veterinary Quarterly, Vol. 13, Nr. 3, 19. Juli 1991, wird die Isolation eines Verursachers beschrieben, der mit der sogenannten Mystery Disease-Erkrankung verknüpft ist, der als ein Virus charakterisiert worden ist, der als Lelystad Virus bezeichnet wird und der als kausaler Verursacher der Krankheit angegeben wird. Diese Entdeckung könnte einen ersten Schritt für die Forschung nach einem Impfstoff gegen diese Krankheit sein.
Da eine technisches Verfahren zur Herstellung dieses Virus oder eines Antigens für dieses Virus nicht zur Verfügung stand, erschien die Zucht nur auf alveolären Makrophagen von Schweinen möglich.
Den Erfindern ist es nunmehr gelungen, ein weiteres Virus, das für diese Krank heit verantwortlich ist, zu isolieren und zu identifizieren. Dieses Virus ist nach der am Elektronenmikroskop durchgeführten Analyse vom Typ des Myxovirus und besitzt als Kennzeichen, daß es durch die Schweine-Antigrippe-Sera HIN1 und H3N2 nicht neutralisiert wird.
Ein Stamm dieses Virus wurde unter der Bezeichnung P129-294 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes beim Institut Pasteur unter der Nr. I-1153 hinterlegt.
In der französischen Patentanmeldung Nr. 9I 13338, die am 29. Oktober 1991 eingereicht worden ist, haben die Erfinder ein Verfahren zur Isolierung des Virus und seine Verwendung für die Herstellung von Antigenen, ein Verfahren zur technischen Herstellung dieses Virus sowie Impfstoffe ausgehend von den vorgenannten Antigenen, die eine für die Impfung wirksame Menge von Antigenen in geeigneten Trägermaterialien enthalten, beschrieben.
Parallel zu der Entdeckung und der Benutzung dieses anderen Virus, von dem ein Stamm unter der Bezeichnung P129-294 hinterlegt worden ist, haben die Erfinder ausgehend von dem gleichen Organ der gleichen Sau, die von einer Schweinezucht in Deutschland stammt und unter der Nr. 294 identifiziert worden ist, ein ganz andersartiges Virus isoliert, von dem ein Stamm mit der Bezeichnung P129-294B identifiziert worden ist. Sie haben weiterhin ausgehend von Organen eines Ferkels einer Zucht in Deutschland, die am 13. Februar 1991 entnommen worden sind, einen weiteren Virusstamm isoliert, welcher Stamm mit der Bezeichnung P120-117B identifiziert worden ist.
Die Erfinder haben feststellen können, daß die beiden Viren, d. h. das Virus vom Typ Myxovirus (beispielsweise P129-294), das nachfolgend als Virus A bezeichnet wird, und die entsprechenden Viren der Stämme P129-294B oder P120-117B - nachfolgend als Virus B bezeichnet - sich in Präparaten fanden, die ausgehend von kranken oder infizierten Schweinen und von den gleichen Organen entnommen worden sind und die als gemeinsame Verursacher der sogenannten Mystery Disease-Krankheit verantwortlich sind.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung der Mischung von Viren (A, B) der Mystery Disease, das heißt eines Myxovirus (A) des Typs, der dem Stamm P129-294 entspricht, der beim CNCM unter der Nr. I-1153 hinterlegt worden ist, und eines Virus (B), der dem Stamm P120-117B entspricht, der beim CNCM unter der Nr. I-1163 hinterlegt worden ist, umfassend die Entnahme von Organen oder Blut von kranken oder infizierten Schweinen und Überleiten des Vermahlungsüberstands oder von Blutbestandteilen über heterologe oder homologe sensible Zellen und Gewinnung des Überstands.
Die homologen sensiblen Zellen können insbesondere Primärzellen des Schweins sein, Zellen der Linie vom Schwein (porcine) oder heterologe Zellen, wie Zellen der Zellinie Vero, MDCK (in Gegenwart von Trypsin), ST, BHK.
Vorzugsweise bewirkt man die Entnahme ausgehend von der Lunge des infizierten Tieres oder aus einem Organpool, der bei beispielsweise Herz, Milz, Leber, Niere und Lymphgewebe enthält.
Die gewonnenen Viren führen nicht zu einer Hämagglutination der roten Blutkörperchen vom Huhn, sind empfindlich gegen Chloroform, reagieren mit konvaleszenten Seren, die von infizierten Zuchten stammen, wie es durch indirekte Immunofluoreszenz gezeigt werden konnte. Die mit dem Elektronenmikroskop gefundene Struktur zeigt umhüllte Strukturen mit einer Größe von 50 nm.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur technischen Herstellung der Mischung von Viren (A, B) der Mystery Disease, das heißt eines Myxovirus (A) des Typs, der dem Stamm P 129-294 entspricht, der beim CNCM unter der Nr. I-1153 hinterlegt worden ist, und eines Virus (B), der dem Stamm P 120-117 B entspricht, der beim CNCM unter der Nr. I-1163 hinterlegt worden ist, gemäß dem das Virus auf homologen sensiblen Zellen, primären Schweinezellen, Zellen der Schweine-Zellinie, oder heterologen Zellen, insbesondere Zellen der Linie Vero, MDCK, ST, BHK gezüchtet wird und der letzte Überstand gewonnen wird. Das Virus kann für die Herstellung von Antigenen verwendet werden.
Das technische Verfahren zur Herstellung des Virus A, das in der oben angesprochenen französischen Patentanmeldung beschrieben ist, hat in überraschender Weise gleichzeitig zu dem Virus B geführt.
Das gewonnene Virus oder die gewonnene Virusmischung kann für die Herstellung von Antigenen eingesetzt werden. Zu diesem Zweck wird es vorzugsweise in geeigneter Weise mit Hilfe üblicher Methoden gereinigt, beispielsweise durch Ul trazentrifugation oder durch Chromatographie. Es kann auch mit Hilfe üblicher Methoden aufkonzentriert werden.
Gemäß der angestrebten Verwendung können die erfindungsgemäßen Antigenpräparate aus lebenden, abgeschwächten oder nicht abgeschwächten Viruspartikeln, aus Antigenen für Untereinheiten oder auch Antigenen, die durch genetische Rekombination ausgehend von Genen des oder der isolierten Viren bestehen, die in das Genom von prokariotischen oder eukariotischen rekombinanten Wirtsgenomen eingeführt und exprimiert werden können, hergestellt worden sind.
Die Erfindung betrifft weiterhin Impfstoffe ausgehend von mindestens einem der oben angegebenen Antigene, die eine impfende Menge eines Antigenpräparats ausgehend von dem Virenstamm P120-117B, der unter der Nr. I-1163 beim CNCM hinterlegt worden ist, in geeigneten Trägermaterialien enthalten. Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäßen Impfstoffe die Antigene für das Virus A in Kombination mit Antigenen für das Virus B und gegebenenfalls anderen infektiösen Antigenen für die Immunisierung von Schweinen oder anderen Tierarten.
Die Impfstoffe können für die Verabreichung an Schweine vorgesehen sein, jedoch auch für andere Tiere, welche für dieses Virus empfindlich sind.
Ein abgeschwächter Impfstoff kann durch Überleiten des Virus über eine Zellkultur hergestellt werden.
Die Menge jedes Virus pro Impfdosis liegt pro Dosis vorzugsweise zwischen 103 und 108 DICC50.
Der lebende abgeschwächte Impfstoff kann in flüssiger oder gefriergetrockneter Form in Gegenwart von sehr stark variierenden Stabilisatoren für die Formulierungen vorliegen, welche Zucker, Proteine und Puffer einschließen können. Dieser Impfstoff kann mit anorganischen oder organischen Adjuvantien versetzt werden.
Der lebende Impfstoff kann vor dem Beginn der Mastperiode oder vor der künstli chen Besamung oder dem Beschälen oder im Verlaufe der Trachtzeit an die zu schützenden Tiere verabreicht werden mit einer und vorzugsweise zwei Injektionen mit einem Zeitintervall dazwischen von drei oder vier Wochen.
Ein inaktivierter Impfstoff kann ausgehend von Virensuspensionen hergestellt werden, die man durch Überleiten über homologe (Schwein) oder heterologe Zellsysteme und dann Inaktivierung durch übliche chemische Inaktivierungsmittel, wie Beta-Propiolacton, Enzyme oder organische Lösungsmittel oder Detergenzien, erhält. Die Inaktivierung kann auch durch eine physikalische Einwirkung, wie Bestrahlung mit ultravioletter Strahlung, Gammastrahlung oder Röntgenstrahlen, erreicht werden. Das Inaktivierungsmittel kann erforderlichenfalls neutralisiert werden.
Der inaktivierte Impfstoff enthält vorzugsweise mindestens das Äquivalent von 105 DICC50 eines jeden Virus pro Impfdosis, wobei die Konzentration vor der Inaktivierung bestimmt wird.
Der inaktivierte Impfstoff kann vom Beginn der Mastperiode oder vor der künstlichen Besamung oder der Beschälung, oder im Verlaufe der Trachtzeit mit Hilfe von einer oder vorzugsweise Zwei Injektionen mit einem dazwischenliegenden Intervall von drei oder vier Wochen verabreicht werden. Es ist bevorzugt, daß der Impfstoff ein anorganisches oder organisches Adjuvans enthält.
Man kann einen rekombinanten Impfstoff beispielsweise durch Einfügen der Sequenz, die für das gewünschte Antigen für das Virus codiert, in das Genom des Wirts erhalten. Der Wirt kann ein Virus sein, insbesondere für die Herstellung eines lebenden Impfstoffs.
Dieser Wirt kann auch ein System von Bakterien, Hefe oder anderen eukariotischen Zellen sein. In diesem Fall wird der Wirtsorganismus vorzugsweise für die Herstellung von Antigenen verwendet, die anschließend für die Herstellung des Impfstoffs gereinigt und konditioniert werden.
Der Impfstoff kann in monovalenter Form vorliegen oder in Kombination mit anderen viralen oder bakteriellen Mitteln, die für die Krankheiten vom Schwein verantwortlich sind.
Die Erfindung betrifft weiterhin Antigenpräparate für diagnostische Zwecke, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die Antigene für das Virus A oder eine Mischung von Antigenen für das Virus A und B enthalten. Diese Antigenpräparate für diagnostische Zwecke werden in üblicher Weise hergestellt und enthalten die üblichen Mittel, welche die Identifizierung und gegebenenfalls die quantitative Bestimmung von positiven serologischen Reaktionen ermöglichen.
Die Erfindung betrifft weiterhin Präparate von Antikörpern gegen diese Antigene, welche als Diagnostikum für die Krankheit verwendet werden können.
Weitere Vorteile und Eigenschaften der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, die als Beispiel dient und nicht einschränkend sein soll.

Beispiel 1: Isolierung des Virus P129-294B

Man entnimmt die Lungen einer Sau einer Schweinezucht in Deutschland und identifiziert sie mit der Nr. 294.

a) Methode:

Vermahlung der Organe: Jede Probe wird individuell in dem Medium MEM + Antibiotika zerkleinert und vermahlen.
Verdünnung: Gewicht des Organs pro Volumen etwa 1 zu 10.
Klärende Zentrifugierung zur Gewinnung der überstehenden Flüssigkeit (ÜF). Filtration bei 0,22 ii.

b) Untersuchung an Zellkulturen:

Erste Überleitungen: Die überstehende Flüssigkeit wird auf einem Zellstamm, der auf Makrophagen von Lungen vom Schwein SPF gebildet worden ist, inokuliert. Drei Tage nach der Inokulation beobachtet man einen cytopathischen Effekt, der sich durch eine morphologische Modifizierung der Makrophagen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien manifestiert. Dieser cytopathische Effekt ist am fünften Tag am stärksten.
Elektronenmikroskopische Untersuchung: Methode an Schnitten von infizierten und gesunden Makrophagen. Die infizierten Makrophagen besitzen ein vollstän dig anderes Aussehen als die gesunden Makrophagen. Man beobachtet im Inneren der infizierten Zellen Vakuolen, die Teilchen von etwa 50 nm enthalten.
Beispiel 2: Isolierung des Virus P120-117B aus Organen eines Ferkels, die am 13. Februar 1991 entnommen worden sind

a) Methode:

Organvermahlung: Das Organ wird in einem MIM-Medium plus Antibiotika vermahlen.
Verdünnung: Gewicht des Organs pro Volumen etwa 1 zu 10.
Klärende Zentrifugierung zur Gewinnung der überstehenden Flüssigkeit (ÜF). Filtration bei 0,22 u.

b) Untersuchung an Zellkulturen:

Erste Überleitungen: Die überstehende Flüssigkeit wird auf einem Zellstamm inokuliert, der aus Makrophagen von Lungen vom Schwein SPF gebildet worden ist. Drei Tage nach der Inokulation beobachtet man einen cytopathischen Effekt, der sich in einer morphologischen Modifizierung der Makrophagen in unterschiedlichen Evolutionsstadien manifestiert. Dieser cytopathische Effekt ist am stärksten am fünften Tag.

Beispiel 3: Serologische Untersuchung

Die durch die Virenpräparate P129/294 B und P120/ 117 B sowie durch zwei weitere Virenstämme P 206 und P 208 gebildeten Antigene wurden untersucht gegenüber:
- eines üblichen Referenzserums, welches als Ploufragan bezeichnet wird;
- Seren von Säuen, die für die experimentelle Reproduktion der Krankheit gedient haben (Entnahme 21 Tage nach der Inokulation und nach der Niederkunft der Säue);
- Seren von Ferkeln, die experimentell auf intranasalem Wege inokuliert worden sind.
Die serologische Bilanz durch indirekte Immunofluoreszenzreaktion ist die fol gende:

Beispiel 4: Untersuchung der pathogenen Wirkung im Vergleich der beiden Viren: P129-294 und P129-294B

a) Virenstamm P 129-294: Das aus Eiern isolierte virale Mittel wurde in Form einer Virussuspension der allantoidalen Flüssigkeit der dritten Überleitung an 2 Schweine SPF auf intravenösem Wege in einem Volumen von 1 cm³ verabreicht. 2 weitere Schweine SPF wurden ebenfalls auf intravenösem Wege mit dem Newcastle Virus, Stamm Texas inokuliert. 2 Schweine wurden als Kontrolltiere verwendet und mit der nicht verdünnten allantoidalen Flüssigkeit inokuliert. Die Tiere wurden in unterschiedlichen Boxen gehalten. Sie wurden während 14 Tagen beobachtet bei täglicher Messung der Temperatur und wurden am Tag 0 und am Tag 7 gewogen. An den Tagen 0 und 14 wurden Blutproben genommen.
Die zwei mit dem hämagglutinierenden Mittel inokulierten Schweine zeigten eine Hyperthermie zwischen 39,5 und 40ºC zwischen dem 1. Tag nach der Inokulation und dem Tag 7, während die 4 anderen Schweine keine Temperaturerhöhung zeigten. Am 2. Tage konnten Spuren des Erbrechens in der Box der beiden Schweine festgestellt werden, die mit dem hämagglutinierenden Mittel inokuliert worden sind. Andererseits konnte man eine Appetitlosigkeit während einiger Tage bei den beiden Tieren feststellen, was sich in einer sehr deutlich ungünstigen Gewichtsentwicklung für diese beiden Tiere niederschlug im Vergleich zu den Tieren, die mit der Kontroll-allantoidalen Flüssigkeit oder mit dem Newcastle-Virus behandelt worden sind. Die nachfolgende Graphik verdeutlicht diesen Unterschied des Wachstums. Bei der Autopsie zeigte eines der beiden Schweine, welche mit dem hämagglutinierenden Mittel behandelt worden sind, wenig deutliche Anzeichen einer Lungenentzündung.
b) Der Virenstamm P129-294B wurde auf nasalem Wege mit 103º5 infizierende Dosierungen des Isolats am 58. und 66. Tag der Trächtigkeit an zwei Sauen ver abreicht. Die Sauen zeigten nach der Inokulation keinerlei klinisches Anzeichen einer Krankheit. Am Tag 110 der Tracht warf die Sau Nr. 25 2 tote Ferkel und 8 lebende Ferkel. Die lebenden Tiere waren winzig und nicht in der Lage zu laufen. Ihr Verhalten ähnelte exakt jenem, was man bei den Ferkeln in infizierten Zuchten beobachtet. 3 Ferkel starben am Tag des Wurfs, 2 24 Stunden später, 3 72 Stunden später und schließlich fand sich 1 totes Ferkel 72 Stunden nach seinem verspäteten Wurf. An diesem Tag zeigte die zweite Sau in frühzeitiger Tracht das Auftreten von Fieber und Anorexie am Tag 106 der Tracht. Am Tag 112 der Tracht warf sie 5 tote Ferkel und ein sehr kleines lebendes Ferkel.
Schlußfolgerung: Das Virus P 129-294 ist für die klinischen Anzeichen an Ferkeln verantwortlich, die sich als Hyperthermie und Anorexie zeigen, während das Virus P129-294B für die Störungen der Reproduktion verantwortlich ist. Dieses klinische Gesamtbild spiegelt die Beobachtungen wider, die man bei infizierten Zuchten feststellt. Schließlich wurden diese beiden Viren aus dem gleichen Organ, nämlich der Lunge, ein und derselben Sau isoliert.

Beispiel 5: Untersuchung der pathogenen Wirkung des Virus 120/ 117 B

Eine experimentelle Inokulation, die an Ferkeln mit einem Gewicht von etwa 20 kg mit Hilfe des Stammes P120/117 B, der auf intranasalem Wege mit einem Inokulum von 105,5 DICC50/ml verabreicht wird, führt zu Fieber und Appetitlosigkeit während einiger Tage.

Beispiel 6: Serologische Überprüfung. Anwesenheit von Antikörpern gegen den Stamm P129-294

Man untersucht 238 Sera, die von infizierten Zuchten Stammen, bezüglich der Anwesenheit von Antikörpern gegen den Stamm P 129-294.
Bei diesen Aufzuchten hat man manifeste Anzeichen der mysteriösen Krankheit des Schweins beobachtet (Frühgeburten, Atmungsprobleme). Die serologische Methode ist ein indirekter Elisa-Test; das verwendete Antigen ist ein Antigen, das von Eiern nach der Ultrazentrifugation erhalten worden ist. Die zu untersuchenden Sera werden zuvor mit Hilfe eines negativen Ei-Antigens behandelt, welche der gleichen Ultrazentrifugationsbehandlung unterworfen worden sind. Die 238 Sera, die von infizierten Zuchten in Deutschland, Belgien oder Holland stammen, zeigen stark positive Antikörper für 43% der Proben, schwach positive für 37% der Proben und negative für 20% der Proben.
Schlußfolgerung: Bei den klinischen Fällen der mysteriösen Krankheit beobachtet man eine positive serologische Wirkung gegen den Stamm P129-294 in 80% der Fälle. Es ist festzuhalten, daß die Sera, die von nicht verdächtigen Zuchten stammen, negativ sind, während die Frequenz der positiven Fälle signifikant geringer ist als man sie bei den klinisch befallenen Zuchten beobachtet. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Bedeutung der Myxovirus-Infektion in dem Syndrom der mysteriösen Krankheit.

Beispiel 7: Herstellung eines lebenden Impfstoffs

Man vermehrt die Viren P129-294 und P120-117B oder P129-294B durch Überleitungen über ein oder mehrere angepaßte Zellsysteme. Das gewonnene Material wird entsprechend dem herzustellenden Impfstoff behandelt: gefriergetrockneter Impfstoff zur Wiederaufnahme mit einem wäßrigen Lösungsmittel, einem öligen Lösungsmittel oder anderen Impfstoffen. Er kann auch in Form eines flüssigen Impfstoffs in wäßrigem, öligem Lösungsmittel oder einem anderen Impfstoff vorliegen.

Beispiel 8: Herstellung von inaktivem Impfstoff

Man vermehrt die Viren P129-294 und P120-117B oder P129-294B auf den Zellen BHK, Vero, Makrophagenzellen oder Zellen einer Schweinezellinie und inaktiviert sie mit Beta-Propiolacton, Ethylenimin und gibt dann ein wäßriges oder öliges Adjuvans zu.
Die Virenstämme P 129-117B und P 129-294B wurden bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) hinterlegt:
P 120-117B wurde unter der Nr. I-1163 hinterlegt,
P129-294B wurde unter der Nr. I-1164 hinterlegt.
Das Virus P120-117B erscheint als ein Togavirus.

Claims

1. Verfahren zur Isolierung der Mischung von Viren (A, B) der Mystery Disease, das heißt eines Myxovirus (A) des Typs, der dem Stamm P129-294 entspricht, der beim CNCM unter der Nr. I-1153 hinterlegt worden ist, und eines Virus (B), der dem Stamm P 120-117B entspricht, der beim CNCM unter der Nr. I-1163 hinterlegt worden ist, umfassend die Entnahme von Organen oder Blut von kranken oder infizierten Schweinen und Überleiten des Vermahlungsüberstands oder von Blutbestandteilen über heterologe oder homologe sensible Zellen und Gewinnung des Überstands.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Überleitungen über Zellen der Zellinie Vero, MDCK, ST, BHK bewirkt werden.

3. Verfahren zur technischen Herstellung der Mischung von Viren (A, B) der Mystery Disease, das heißt eines Myxovirus (A) des Typs, der dem Stamm P 129-294 entspricht, der beim CNCM unter der Nr. I-1153 hinterlegt worden ist, und eines Virus (B), der dem Stamm P 120-117 B entspricht, der beim CNCM unter der Nr. I-1163 hinterlegt worden ist, gemäß dem das Virus auf homologen sensiblen Zellen, primären Schweinezellen, Zellen der Schweine-Zellinie, oder heterologen Zellen, insbesondere Zellen der Linie Vero, MDCK, ST, BHK gezüchtet wird und der letzte Überstand gewonnen wird.

4. Gereinigtes Präparat des Virenstammes P 120-117 B, der unter der Nr. I- 1163 beim CNCM hinterlegt worden ist.

5. Antigenes Präparat umfassend gegebenenfalls geschwächte lebende Teilchen oder inaktivierte Teilchen oder Antigene für eine virale Untereinheit, erhalten ausgehend von dem Präparat nach Anspruch 4.

6. Impfstoff gegen die Mystery Disease, dadurch gekennzeichnet, daß er in einem geeigneten Träger eine impfende Menge eines Präparats nach einem der Ansprüche 4 und 5 enthält.

7. Abgeschwächter Impfstoff nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er durch Überleiten des oder der betreffenden Viren über eine Zellkultur hergestellt worden ist.

8. Abgeschwächter Impfstoff nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Virenmenge pro Impfdosis zwischen 10³ und 10&sup8; DICC&sub5;&sub0; liegt.

9. Inaktivierter Impfstoff nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Überstand der Kultur mit einem chemischen oder physikalischen inaktivierenden Mittel inaktiviert worden ist.

10. Inaktivierter Impfstoff nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens das Äquivalent von 10&sup5; DICC&sub5;&sub0; des Virus pro Impfdosis enthält.

11. Präparat zur Verwendung als Diagnostikum für die als Mystery Disease bezeichnete Erkrankung, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Präparat nach einem der Ansprüche 4 und 5 und Antikörper gegen ein solches Präparat umfaßt.