DE68927380T2

DE68927380T2 - Impfstoff

Info

Publication number: DE68927380T2
Application number: DE68927380T
Authority: DE
Inventors: John Brownlie; Michael Cyril Clarke; John Christopher Howard
Original assignee: Grampian Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Grampian Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 1988-08-03
Filing date: 1989-08-03
Publication date: 1997-03-27
Anticipated expiration: 2009-08-04
Also published as: GB2239799B; IE892495L; GB2239799A; ATE144429T1; NL300073I1; IE77508B1; DE68927380D1; GB8818415D0; GB9102162D0; AU4049189A; DK16591D0; EP0427767B1; EP0427767A1; DK174167B1; AU628845B2; JPH04500069A; JP3043353B2; DE10199014I1; CA1319634C; DK16591A

Description

Das Rindervirusdurchfall-Virus (BVDV) ist bei Rindern im Vereinigten Königreich, im restlichen Westeuropa, in Nordamerika, in Australien und in Afrika extrem verbreitet. Die Infektion mit diesem Virus kann zu den verschiedensten Syndromen und pathologischen Zuständen führen. Diese werden in hohem Maße durch das Alter der Tiere bei der Erstinfektion beeinflußt. Bei jungen, zuvor nicht infizierten Kälbern verursacht das Virus eine vorübergehende Infektion. Diese ist mit Leukopenie, einer damit im Zusammenhang stehenden Immunsuppressionsperiode und einer erhöhten Anfälligkeit für eine Infektion mit anderen Mikroorganismen verbunden. BVDV ist nach RSV (Atmungssynzytium-Virus) wahrscheinlich das am Ausbruch von Atemwegserkrankungen bei jungen Hauskälbern am stärksten beteiligte Virus. Wegen seiner immunsuppressiven Wirkung kann es auch an anderen Kälber-Infektionen, beispielsweise Enteritis, beteiligt sein. Dieses Virus trägt ferner vermutlich wesentlich zu Erkrankungen von "Futter- Kälbern" (feetlot calves) in den USA und Kanada bei. Nach der Genesung zeigen die Tiere eine gewisse Immunität gegenüber einer erneuten Infektion. Diese Immunität scheint jedoch nicht absolut bzw. lebenslang zu sein.
Ernstere Probleme resultieren aus einer Infektion trächtiger Kühe. Es kann zu einem Abort oder andererseits zu Mißbildungen im ausgetragenen Fötus kommen. Diese Mißbildungen können aus einer Viruseinwirkung zum Zeitpunkt der Entwicklung einer Immunfähigkeit resultieren und das Ergebnis einer unvollständigen Immunantwort sein. Eine Infektion des Fötus vor Entwicklung der Immunfähigkeit kann dazu führen, daß der Fötus während der Tragzeit virämisch bleibt. Ferner kann nach dem späteren Werfen das Kalb bei einer nicht-cytopathogenen Form des Virus anhaltend virämisch und für BVDV lebenslang spezifisch immuntolerant bleiben. Solche Kälber sind die Tiere, die später an Schleimhauterkrankungen eingehen. Diese Erscheinung wird durch eine Superinfektion mit einer cytopathogenen Variante von BVDV ausgelöst.
Schätzungsweise sind etwa 0,4% der scheinbar normalen Rinderkälber im Vereinigten Königreich virämisch. Diese Tiere stellen eine Hauptquelle für Infektionen auf Bauernhöfen dar.
Traditionell fallen Virusimpfstoffe in zwei Klassen: Lebendimpfstoffe mit lebenden Viren, die dahingehend behandelt oder gezüchtet (abgeschwächt) wurden, daß sie weniger pathogen sind, und Impfstoffe mit abgetöteten (inaktivierten) Virusteilchen. Im Zusammenhang mit BVDV können die Viren als solche cytopathogen oder nicht-cytopathogen sein. Somit könnten, obwohl der überwiegende Großteil handelsüblicher Impfstoffe auf dem cytopathogenen Virus basiert, im Prinzip vier Hauptklassen von BVDV-Impfstoffen existieren. Darüber hinaus wird von zahlreichen Fachleuten vermutet, daß Lebendimpfstoffe inakzeptabel sind, da lebende cytopathogene Impfstoffstämme bei fortdauernd virämischen Tieren möglicherweise zum Tod aufgrund von Schleimhauterkrankungen führen und ein nicht-cytopathogene Viren enthaltender Lebendimpfstoff den Fötus bei trächtigen Kühen infizieren und eine der zuvor genannten Erkrankungen zur Folge haben könnte.
Die US-PS-3 869 547 beschreibt Impfstoffe gegen Durchfall bei Kälbern, die durch ein- bis etwa 250malige Passage von aus Kot infizierter Kälber erhaltenem Kälberdurchfall-Virus in einer Gewebekultur hergestellt werden. Die Verwendung von Quil A (Marke) als Adjuvans ist nicht beschrieben.
Eine Infektion über die Atemwege ist wahrscheinlich der wichtigste Übertragungsweg des Virus auf Bauernhöfen und ein Schutz gegen die Ausbreitung auf diesem Weg dürfte für eine Bekämpfung von auf BVDV zurückzuführenden Krankheiten äußerst vorteilhaft sein.
Eine parenterale Impfung mit inaktiviertem BVDV bietet einen Schutz gegen Atemwegsinfektionen. Bei einem Versuch waren sämtliche fünf geimpften Kälber gegen eine Atemwegsprovokation bzw. -herausforderung resistent. Sämtliche fünf Kontrolltiere wurden infiziert.
Die getesteten Antigene von abgetötetem BVDV induzierten die Produktion hoher Titer neutralisierender Antikörper. Es hat sich gezeigt, daß diese von weniger als 50 vor der Impfung auf mehr als oder gleich 2000 bis 10.000 Einheiten nach der Impfung anstiegen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Impfstoff mit einem abgetöteten, nicht-cytopathogenen Virus, das in einer von Rinderzellen herrührenden Zellinie, wie der MDBK-Zelllinie (Madin Darby Bovine Kidney; Madin & Darby (1958); erhältlich von ECACC, Salisbury, Wiltshire, Vereinigtes Königreich), wachsen gelassen wird. MDBK-Zellen sind von zahlreichen Laboratorien in der ganzen Welt erhältlich. Andere, für die praktische Ausführung der vorliegenden Erfindung brauchbare Rinderzellinien sind (beispielsweise) EBL-Zellen, NM5-Zellen, LWC874-Zellen und CTe-Zellen.
Die MDBK-Zellinie wird bei den Passagen 147 bis 187, zweckmäßigerweise 147 bis 157 und vorzugsweise 147, benutzt. Das Saatvirus wird vorzugsweise durch Zusatz von etwa 10&sup6; TCD&sub5;&sub0; von BVDV (nicht-cytopathogener Stamm) zu konfluenten Kulturen von Kälberhodenzellen hergestellt. Kälberhodenzellen werden zum Züchten der Saatkultur bevorzugt, weil die Virusausbeuten in diesen Zellen höher sind. Dagegen sind die Ausbeuten an Antigen in MDBK-Zellen größer. Die Zellen können in Rollflaschen mit Eagle-MEM-Medium und einem Zusatz von 7,5% fötalem Rinderserum, 0,11% Natriumbicarbonat und 0,25% Lactalbuminhydrolysat gezüchtet werden. Nach Zusatz des Virus kann die Kultur mit 50 ml Medium, Eagle'schem BME mit 2% fötalem Rinderserum, 0,17% Natriumbicarbonat, 0,25% Lactalbuminhydrolysat und 0,6% Magnesiumchloridhexahydrat, gehalten werden. Die Kultur kann 5 bis 9, vorzugsweise 7 Tage lang bei etwa 36ºC inkubiert und dann einem einzigen Gefrier/Auftau-Zyklus unterworfen werden. Die Suspension kann 4 bis 6, vorzugsweise 5 min, bei etwa 500 g zentrifugiert werden, um grobe Bruchstücke zu entfernen. Der gebrauchsfertige, flussige Überstand kann in kleinen Volumina bei etwa - 70 ºC gelagert werden. Der Titer des gelagerten Saatvirus kann durch Austesten in Kälberhodenzellkulturen ermittelt werden.
Das Virusantigen wird durch Zusatz von etwa 1 ml Saatvirus, das etwa 10&sup6; TCD&sub5;&sub0; von BVDV enthält, zu Kulturen von MDBK- Zellen hergestellt. Diese Zellen können in Rollflaschen mit Eagle"schem MEM, 10% fötalem Rinderserum und 0,11% Natriumbicarbonat kultiviert und nach etwa viertägigem Wachstum bei etwa 75%igem Zusammenfließen der Kulturen verwendet werden. Nach Zusatz des Virus kann die Kultur mit 125 ml BME-Medium (s. oben) gehalten werden. 7 Tage später, wenn die Kultur etwa 108 Zellen und einen Virustiter von etwa 108,5 TCD&sub5;&sub0; enthält, wird zur Inaktivierung des Virus β-Propiolacton bis zu einer Konzentration von 1 auf 500 zugesetzt und die Flasche 3 h bei 36ºC umgewälzt bzw. gerollt (rolled). Die vollständige Inaktivierung des Antigenpräparats wird durch Passage von Proben in Kälberhodenzellkulturen geprüft. Das Antigen wird bei -20ºC gelagert.
Bevor die Zellkulturen zur Herstellung von Saatvirus und Virusantigen benutzt werden, werden sie auf zufällig vorhandenes BVDV geprüft. Das fötale Rinderserum wird auf Freiheit von Virus und BVDV-Antikörpern geprüft.
Eine Dosis des Impfstoffs wird durch Vermischen von 1 mg "Quil A" (Marke von Superfos A/S, Dänemark) in Form von 50 µl einer Vorratslösung (20 mg/ml in Wasser) mit 4 ml des durch β-Propiolacton inaktivierten Virus zubereitet. Diese wird subkutan hinter die Schulter von etwa 3 Monate alten, von BVDV-Antikörpern (die entweder von der Mutter stammen oder als Ergebnis einer Infektion produziert wurden) freien Kälbern injiziert.
Die geimpften Kälber zeigten eine durch ELISA (Howard, darke & Brownlie, 1985) bestimmte Antikörperreaktion (Tabelle 1). Diese war 6 Wochen nach der ersten Impfung nachweisbar. Die Versuchstiere und nicht geimpfte Kontrolltiere wurden mit einem wegen seines Tropismus für die Atemwege und seiner konsistenten nasopharyngealen Ergußrate ausgewählten BVDV-Stamm (11249nc) provoziert. Die Kälber wurden intranasal in der achten Woche infiziert. Die Virusausstoßung wurde durch Untersuchung mittels Nasenrachenraum-Abstrichtupfern (auch Blut wurde getestet) bis zu 10 Tage nach der Provokation bestimmt. Ferner wurden Proben in Kälberhodenzellkulturen getestet. BVDV wurde aus den Kontrolltieren (Tabellen 2, 3), jedoch nicht aus der geimpften Gruppe gewonnen. Die Beziehung (bei einzelnen Tieren) zwischen den Antikörperspiegeln und dem Provokationszeitpunkt und der Infektionsanfälligkeit ergibt sich aus Tabelle 3.
Keines der Kontrolltiere besaß nachweisbare Antikörper zum Provokationszeitpunkt. Sie wurden alle infiziert und serokonvertiert (Tabelle 1).
Das BVDV-Antigen kann mit anderen (vorzugsweise inaktivierten) Mikroorganismen zur Bildung eines mehrwertigen Impfstoffs vereinigt werden. Geeignete Organismen sind das Atmungssynzytiumvirus, das Parainfluenza-3-Virus und Mycoplasma-bovis-Virus.
Anstelle der Verwendung des gesamten Virus kann es von Vorteil sein, die Antigene von dem Virus abzutrennen und sie zusammen mit Quil A (Marke) und gegebenenfalls geeigneten Trägern und dgl. zu benutzen. Dies läßt sich in üblicher bekannter Weise erreichen. Tabelle 1 Durch ELISA¹ ermittelte Antikörperantworten bei mit dem Stamm Ky1203nc geimpften Kälbern
¹ Mittlere Anzahl der Antikörpereinheiten (10n) ± Standardabweichung
² In den Wochen 0, 3 und 6 geimpfte Kälber; die Provokation erfolgte in der achten Woche intranasal mit dem Stamm 11249nc
ND = nicht bestimmt. Tabelle 2 Einfluß einer Impfung mit dem Stamm Ky1203nc auf die Infektion mit BVDV
¹ Isoliert aus Nasenrachenraum-Abstrichtupfern Tabelle 3 Beziehung zwischen den Antikörpern zum Provokationszeitpunkt und der Infektionsanfälligkeit bei einzelnen Tieren
¹ Die Versuchstiere erhielten die Standarddosis (S) oder keinen Impfstoff (-)
² Durch ELISA bestimmte Antikörpereinheiten (10n) am Provokationstag; die Tiere sind in abnehmender Reihenfolge aufgeführt
³ Isolierung aus einem Nasenrachenraum-Abstrichtupfer wie in Tabelle 2; die Isolierung aus Blut erfolgte am 6. Tag
&sup4; Prozentuale Verminderung der Zellenzahl im Vergleich zum Durchschnittswert von 3 Vorimpfungswerten
Die MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney)-Zellinie ist seit etwa 25 Jahren von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA als ATCC CCL 22 erhältlich. Seit 1982 ist diese Linie BVD-frei. Dieselbe Zellinie war auch von ist European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, Vereinigtes Königreich ebenso wie die MDBK-Zellinie aus einer anderen Quelle unter der Hinterlegungs-Nr. ECACC Nr. 85102401 erhältlich. Eine Probe letzterer Hinterlegung wurde nunmehr entsprechend ECACC nach dem Budapester Vertrag mit Datum vom 2. August 1989 unter der Hinterlegungs-Nr. 89080201 hinterlegt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs durch (a) Wachsenlassen bzw. Züchten eines nicht-cytopathogenen Rindervirusdurchfall-Virus (BVDV) in einer von Rinderzellen herrührenden Zellinie, (b) Inaktivieren des Virus aus Stufe (a) und (c) Vermischen des vom Virus herrührenden Materials aus Stufe (b) mit Quil A.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellinie MDBK-, EBL-, NM5-, LWC874- oder CTe-Zellen umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zellinie MDBK-Zellen umfaßt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei, als anfängliche Stufe, die Zellinie mit in Kälberhodenzellen gezüchtetem BVDV beimpft wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das vom Virus herrührende Material ganze Viren umfaßt.

6. Impfstoff gegen Rindervirusdurchfall-Virus (BVDV)-Infektionen, umfassend inaktiviertes nicht-cytopathogenes BVDV und Quil A als Hilfsmittel hierfür.