CH622702A5

CH622702A5 -

Info

Publication number: CH622702A5
Application number: CH1487975A
Authority: CH
Inventors: James Long Bittle; Wayne J Rubic
Original assignee: Pitman Moore Inc
Priority date: 1974-11-21
Filing date: 1975-11-17
Publication date: 1981-04-30
Also published as: ES442892A1; AU508944B2; JPS5173118A; FI53593B; FI753274A; ZA757294B; SE7512828L; DE2552137A1; FI53593C; FR2291766B1; GB1522006A; CA1055844A; FR2291766A1; DK141339B; BE835784A; AU8675575A; DK516975A; US3944469A; ATA884975A; AT340584B

Description

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine Felincalicivirus-Vaccine zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem Befund, dass das Felincalicivirus (FCV) in Katzenzellkulturen, bevorzugt aus Nieren und der Zunge, gezüchtet werden kann. Dadurch wird die Virulenz des Virus so modifiziert und vermindert, dass die parenterale Inokulation zu keinen erkennbaren Symptomen mehr führt.

Die Erfindung bezweckt somit die Herstellung eines attenuierten Stammes eines vermehrungsfähigen Felincalicivirus, das bei der parenteralen Inokulation die Katze gegen virulente Felincaliciviren immunisiert. Das Virus soll so weit attenuiert sein, dass es die Antikörperbildung intensiv stimuliert und einen wirksamen Immunschutz der Katzen über einen längeren Zeitraum gewährleistet.

Das attenuierte FCV ist sicher, d.h. es macht Katzen, die es parenteral erhalten, nicht krank, und es wird nicht durch Kontakt einer vaccinierten Katze auf eine andere Katze übertragen. Dadurch wird die Möglichkeit ausgeschlossen, dass die Virulenz des Virus durch Tierpassagen wieder erhöht wird. Dies bedeutet einen grossen Fortschritt für die Behandlung aller Erkrankungen, die durch Felincaliciviren verursacht werden.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines attenuierten Felincalicivirus, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man virulentes Felincalicivirus bei Temperaturen von 30 ± 2° C über jeweils 1 bis 7 Tage und über mindestens 10 Serienpassagen in einer Katzenzellkultur in einem Nährmedium passagiert.

Lebendes, virulentes Felincalicivirus kann entsprechend den in der Literatur beschriebenen Methoden der Isolierung und Identifizierung aus infizierten Katzen gewonnen werden; vgl. z.B. J.L. Bittie u. Mitarb., Amer. J. Vet. Res., Bd. 21 (1960), S. 547. Die verfahrensgemäss bevorzugt eingesetzten Serotypen sind serologisch verwandt. Die serologische Verwandtschaft wird durch konventionelle Methoden, z. B. den Kreuzneutralisationstest, bestimmt. In der Monographie von Gillespie und Scott, a.a.O., Seite 183, Tabelle 1, sind die Serotypen der Felincaliciviren zusammengestellt. Im erfindungsge-mässen Verfahren werden besonders bevorzugt die mit «F-9» und «F-S» bezeichneten Serotypen eingesetzt. Der «F-9»-Stamm wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Code-Nr. VR-782 hinterlegt.

Grundsätzlich können Virusisolierungen folgendermassen durchgeführt werden: Die Nasen- oder Konjunktivalschleim-

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haut infizierter Katzen wird mit einem sterilen, feuchten Wattetupfer bestrichen und der Tupfer anschliessend in ein Zellkulturmedium, das optimal für Katzenzellen ist, gegeben. Um das Virus zu vermehren und zu isolieren, werden darauf Serienpassagen durchgeführt. Ein besonders geeignetes Kulturmedium wird von der Rindenschicht der Nieren 8 bis 12 Wochen alter Katzen gewonnen. Es wird durch die von Younger, Proc. Soc. Exptl. Biol. & Med., Bd. 85 (1954), S. 202 für Affennierenzellen beschriebene Methode der Trypsi-nierung gewonnen.

Zur Herstellung des attenuierten FCV hat es sich als ausreichend erwiesen, die Attenuierung und Modifizierung des Felincalicivirus mit relativ wenigen, mindestens 10, vorzugsweise mindestens 13 und im allgemeinen durch 13 bis 35 Serienpassagen vorzunehmen, die gleichzeitig die Reinigung durch die Standard-Endverdünnungs-Methode einschliessen. Diese Passagen werden in Katzenzellkulturen bei niedrigen Temperaturen von 30±2°C, vorzugsweise bei 29 bis 31°C durchgeführt. Eine Reinigung der Viruspräparationen kann mit Hilfe konventioneller Röhrchenkulturen oder mit Hilfe der PIaquemethode während oder nach Abschluss der Serienpassagen durchgeführt werden.

Das Felincalicivirus kann beispielsweise in Katzenzellkulturen folgender Herkunft vermehrt werden: Lunge, Hoden, Niere, Thymus, Zunge und embryonale Gewebe sowie ab der 3. Zellkulturpassage in permanenten Zell-Linien, wie Cran-dells Katzennieren-Zell-Linie (CrFK), Katzenzungen-Zell-Li-nie (Fc3Tg) und einer felinen Neurofibrosarcom-Zell-Linie (FNFS). Katzenzungen-Zell-Linien werden bevorzugt.

Die Dauer einer Passage soll so gewählt werden, dass sich ausreichend Virus vermehren kann. Vorzugsweise beträgt sie 1 bis 6 Tage. Die optimale Passagedauer kann leicht durch Standardmethoden, wie die Beurteilung des cytopathischen Effektes (cpE) bestimmt werden. Man inkubiert hierbei so lange, bis die Kultur fast vollständig virusspezifisch zerstört ist.

Die Herstellung eines für die Bereitung einer wirksamen Vaccine geeigneten attenuierten FCV nach dem erfindungs-gemässen Verfahren der Passagierung bei niedrigen Temperaturen ist um so überraschender, als Serienpassagen in Katzenzellkulturen bei normalen Temperaturen von 35 bis 37°C das Virus oder dessen Pathogenität bei der gleichen Passagenzahl nicht zu ändern oder zu modifizieren vermögen.

Das erfindungsgemäss hergestellte Viruspräparat kann zur Vereinheitlichung seiner Wirksamkeit verdünnt werden. Ferner können Stabilisatoren zugefügt werden, wie Glucose und Lactose oder andere, nichttoxische Verbindungen. Das Viruspräparat kann ausserdem zur Lagerung oder nachfolgenden Herstellung einer flüssigen Vaccine getrocknet werden, z. B. durch Lyophilisierung. Stabilisatoren, die sich für die Lyophili-sierung von Virusmaterial eignen, sind beschrieben von W. A. Rightsel u. Mitarb., Cryobiology, Bd. 3 (1967), S. 423 und D. Greiff u. Mitarb., Advances in Freeze Drying, herausgegeben von L. Rey, Seiten 103 bis 122, Hermann, Paris, 1966.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Eine Probe von vermehrungsfähigem virulentem Felincalicivirus (F-9 Serotyp ATCC-Nr. VR-782), kultiviert und isoliert nach der von J. L. Bittie u. Mitarb., Amer. J. Vet. Res., Bd. 21 (1960), S. 547 beschriebenen Methode, wird auf Einschichtzellkulturen einer diploiden Katzenzungen-Zell-Linie in normalen Kulturröhrchen oder in Leighton-Röhrchen (16 x 125 mm) gegeben. Die Zellkulturen werden auf die nachstehend geschilderte Weise hergestellt.

Es wird die Zungen-Zell-Linie Fc3Tg verwendet, die von K.M. Lee u. Mitarb., Cornell Veterinarian, Bd. 59 (1969), S. 539 beschrieben ist. Jedes Kulturröhrchen enthält 1 bis 2 ml Wachstumsmedium, das aus Eagles Minimalmedium (MEM)

mit 10% fetalem Kälberserum, 0,1% Lactalbuminhydrolysat, 30 I.E. Penicillin, 30«g Streptomycin und 2,5 ug Amphotericin besteht. Pro Röhrchen werden 1 ml Zellsuspension (200 000 feline Zungenzellen/ml) gegeben. Wenn nötig wird der pH-Wert mit Hilfe von Natriumbicarbonat auf 7,2 bis 7,8 eingestellt. Bis zum Auswachsen eines geschlossenen Zellrasens werden die Kulturen bei 35 ± 2° C inkubiert. Das Wachstumsmedium wird anschliessend entfernt und durch 1 bis 2 ml Erhaltungsmedium (MEM, jedoch mit 1 bis 2 % fetalem Kälberserum) ersetzt. Pro Passage werden 4 bis 6 Röhrchen verwendet.

Jedes Kulturröhrchen wird nun mit dem Felincalicivirus F-9 beimpft und bei 29 bis 31 ° C so lange bebrütet, bis sich ein cytopathischer Effekt (cpE), der durch mikroskopische Betrachtung sichtbar ist, entwickelt hat. Dies erfordert ungefähr

2 bis 7 Tage. Wenn der cpE etwa 75 bis 90% erreicht hat, wird der Inhalt der Röhrchen geerntet, und jeweils 0,2 ml werden für identische Serienpassagen in weiteren 6 Passagen verwendet (insgesamt 7 Passagen). Nach der 7. Passage wird eine Standard-Endverdünnungs-Reihe mit dem vorstehend beschriebenen Eagles MEM unter Zusatz der vorgenannten Antibiotika als Verdünnungsmittel angesetzt und bei 29 bis 31° C inkubiert. Nach 7 Tagen wird das letzte Kulturröhrchen, das einen 75- bis 90prozentigen cpE zeigt, geerntet und die gesamte Prozedur mit dieser Virusernte noch zweimal wiederholt, so dass insgesamt 10 Passagen durchgeführt werden. Die 11. Passage wird zu dem Zweck angesetzt, das Virus zu vermehren. Hierfür werden Rouxflaschen, die Monolayer von diploiden Katzenzungen-Zellen enthalten, die nach der vorstehend beschriebenen Methode angezüchtet wurden, mit 0,5 ml der Virusernte der 10. Passage beimpft. Nach Abschluss der 11. Passage wird die Charge geerntet, identifiziert und nach bekannten Methoden titriert.

Die erhaltene Charge stellt eine Rohvaccine dar, die durch Verdünnung auf einen bestimmten Titer eingestellt werden kann oder der Stabilisatoren oder andere nichttoxische Substanzen zugesetzt werden können. Zur Verwendung als Vaccine kann sie entweder lyophilisiert oder in flüssiger Form vorliegen.

Für die Züchtung und Attenierung des Virus kann jedes nichttoxische flüssige Nährmedium verwendet werden. Zusätzlich zu dem mit verschiedenen Zusätzen versehenen Eagles MEM kann selbstverständlich auch jedes andere nichttoxische flüssige Nährmedium verwendet werden.

Versuch 1

1 ml einer Vaccine, die gemäss Beispiel 1 hergestellt, titriert und auf einen Virusgehalt von 104,1KID5O/ml bei 35 ± 2° C (bestimmt mit Hilfe des cpE) eingestellt wurde, wird

3 empfänglichen Katzen intramuskulär verabreicht. Zwei andere Katzen werden als Kontrollen gehalten.

Alle 5 Katzen werden vorher serologisch auf das Fehlen von Antikörpern gegenüber Felincaliciviren getestet. Eine schwere FCV-Erkrankung beginnt in der Regel am 2. Tag nach normalem Kontakt oder nach einer Belastungsinfektion mit virulentem Felincalicivirus mit Fieber. Andere klinische Symptome werden ab dem 4. Tag beobachtet. Alle 5 Katzen besassen vor dem Versuch einen Antikörpertiter von <1:3. Einen Monat später, vor der Belastungsinfektion, hatten die vaccinierten Katzen einen durchschnittlichen Antikörpertiter von 1:15, die 2 Kontrollkatzen waren weiterhin negativ (< 1:3). Alle 5 Katzen wurden mit Hilfe eines Aerosol-Gerä-tes intranasal mit virulentem Felincalicivirus (F-9 Serotyp) infiziert. Jede Katze erhielt in einem geschlossenen System eine Gesamtdosis von 106KID50 in 0,025 ml. Die Katzen wurden weitere 3 Wochen klinisch überwacht. Alle 3 geimpften Katzen blieben gesund und zeigten keinerlei klinische Erkrankung oder Symptome. Im Gegensatz dazu erkrankten

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die 2 Kontrollkatzen schwer. Sie zeigten die charakteristischen Symptome einer FCV-Infektion, wie Fieber, Nasen- und Augenausfluss, Inappetenz und Störung des Allgemeinbefindens.

Beispiel 2

A. Vergleich

Vermehrungsfähiges, virulentes Felincalicivirus, kultiviert und isoliert nach der von J.L. Bittie u.Mitarb., a.a.O., beschriebenen Methode und von den genannten Autoren als «F-9»-Isolat bezeichnet, wird 7mal in primären Katzennieren-kulturen passagiert. Die Passagen werden mit Intervallen von

1 bis 6 Tagen bei etwa 35° C durchgeführt. Daran schliessen sich 3 Passagen mit Endverdünnungen in den gleichen Kulturen an (insgesamt 10 Passagen, virulentes Virus). Das Virus wird nun auf die feline Zungen-Zell-Linie Fc3Tg bei 37° C adaptiert (11. Passage). 3 weitere Passagen werden in CrFK-Zellen bei 37° C durchgeführt. Die Virusernte der 14. Passage wurde in Katzen getestet und verursachte typische klinische Symptome einer FCV-Infektion: das Virus war also noch virulent.

B. Erfindung

Die 11. Passage (bezeichnet als P-O) wurde 8mal in Katzenzungenzellen (Fc3Tg) bei 29 bis 31 ° C passagiert (P-8). Die Passagen wurden mit Intervallen von 1 bis 6 Tagen durchgeführt. In 3 weiteren Passagen in Fc3Tg-Zellen wurden Endverdünnungen bei der gleichen Temperatur angesetzt (P-ll).

2 weitere Passagen dienten dazu, einen Pool zu gewinnen (P-13), die 2 folgenden, um als Anzuchtstamm Verwendung zu finden (P-15). In 5 weiteren Passagen wurde das Volumen vermehrt (P-20). Die P-13-, P-15- und P-20-Virusernten wurden mit Hilfe des Serumneutralisationstests gegen ein F-9-Ziegenimmunserum geprüft. Die Impfung von Katzen mit den P-13-, P-15- und P-20-Virusernten hatte die Bildung von Antikörpern zur Folge, die ausreichten, um die Tiere vor einer Infektion mit virulentem Felincalicivirus zu schützen.

Versuch 2

Je 1 ml der gemäss Beispiel 2 hergestellten Vaccine (P-20-Passage) mit einem Virustiter von 105'5KIDso/ml bei 35 °C (bestimmt mit Hilfe des cpE) wurde 4 Katzen, welche in vorangegangenen Testen serologisch positiv gegenüber FCV (unbekannter Serotyp) reagiert hatten, intramuskulär injiziert. Der durchschnittliche Antikörpertiter lag vor der Impfung bei 1:64, 1 Monat nach der Impfung betrug der durchschnittliche Titer 1:292. 2 dieser Katzen wurden einer Belastungsinfektion mit virulentem Felincalicivirus (FPV-255-Serotyp; vgl. Kahn und Gillespie, Cornell Vet., Bd. 60 (1970), S. 669 und Amer. J. Vet. Res., Bd. 32 (1971), S. 521; und Holzinger & Kahn, Amer. J. Vet. Res., Bd. 31 (1970), S. 1623; Probe von Kahn erhalten) nach 3 V2 Monaten und 2 andere Katzen nach 5 Monaten ausgesetzt. Die Belastungsinfektion erfolgte wie im Versuch 1 mit einem Aerosol-Gerät. Die Katzen wurden bis

3 Wochen nach der Belastungsinfektion täglich auf klinische Symptome kontrolliert. Alle geimpften Tiere blieben gesund, während die ungeimpften Kontrolltiere an einer schweren FCV-Infektion erkrankten. Dieses Beispiel zeigt, dass eine einfache Dosis dieser Vaccine genügt, um bei Katzen mit vorangegangenem Kontakt mit FCV einen 4- bis Stachen Antikörperanstieg zu induzieren und die Tiere vor einer Belastungsinfektion mit virulentem Felincalicivirus zu schützen.

Versuch 3

500 ml Virusmaterial der 20. Passage aus Beispiel 2 (P-20) wurden mit 500 ml N-Z-Amin-Lactose-Glutamat-Stabilisator gemischt, in üblichen Vaccineampullen abgefüllt und in üblicher Weise lyophilisiert. Für die Impfungen wurde der Inhalt einer Ampulle jeweils in 1 ml pyrogen-freiem, sterilem, destilliertem Wasser resuspendiert (durchschnittlicher Titer

10s,3KID5O/ml). Für die Impfversuche wurden Katzen ausgewählt, die serologisch negativ reagierten (Titer < 1:2). 10 empfängliche Katzen erhielten je 1 ml der vorstehend beschriebenen Vaccine intramuskulär, 5 weitere empfängliche Katzen dienten als Kontrollen. Einen Monat später erhielten die 10 geimpften Katzen eine Boosterinjektion mit der gleichen Dosis intramuskulär. Die Antikörpertiter wurden 2 Wochen vor und 2 Wochen nach der Boosterimpfung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefasst. Sie zeigen einen 7fachen Antikörperanstieg.

Tabelle I

vor der Boosterung

2 Wochen nach der Boosterung

Katze Nr. 1

1:3

1:93

Katze Nr. 2

1:23

1:370

Katze Nr. 3

1:30

1:837

Katze Nr. 4

1:8

1:40

Katze Nr. 5

1:40

1:70

Katze Nr. 6

1:70

1:120

Katze Nr. 7

1:53

1:70

Katze Nr. 8

1:4

1:14

Katze Nr. 9

1:53

1:471

Katze Nr. 10

1:53

1:160

1:34 (Mittelwert)

1:225 (Mittelwert)

Die Erfindung betrifft nicht nur die Herstellung einer Vaccine aus vermehrungsfähigem, virulentem Felincalicivirus, sondern auch die Herstellung einer FCV-Vaccine aus einem Virus, bevorzugt dem F-9-Serotyp, das nach dem erfindungs-gemässen Verfahren modifiziert bzw. attenuiert wurde. Für die technische Herstellung wäre es unpraktisch, bei der Herstellung jeder neuen Charge von Impfstoff von einem frischen Isolât aus infizierten Katzen auszugehen und die erforderlichen Serienpassagen zur Modifizierung des Virus durchführen zu müssen.

Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung des erfindungsgemäss hergestellten attenuierten FCV-Materials zur Herstellung einer FCV-Vaccine. Das «Saatvirus» wird aus einem «master batch» von attenuiertem Virus genommen. Die erfindungsgemässe Verwendung zur Herstellung einer Felinca-licivirus-Vaccine ist dadurch gekennzeichnet, dass man se-rienmässig das nach dem obigen Verfahren attenuierte Felincalicivirus bei Inkubierungstemperaturen von 32 bis 37° C in Katzenzellkulturen unter Verwendung eines für das Virus nichttoxischen flüssigen Nährmediums passagiert. Die Passa-gierung wird am besten so lange fortgesetzt, bis die Virusernten mit dem attenuierten Virus im Medium ungefähr 103 bis 108 kulturinfektiöse Dosen pro ml Kulturmedium enthalten.

Durch die beschriebene Verwendung ist es leicht möglich, modifiziertes Felincalicivirus in grossen Mengen und hohen Konzentrationen herzustellen. Durch Einsatz eines in Katzenzellkulturen modifizierten Felincalicivirus, z. B. des Serotyps F-9, in einer Konzentration von mindestens 103 und gewöhnlich IO3 bis 108 kulturinfektiösen Dosen pro ml der fertigen Vaccine ist es möglich, Katzen zu immunisieren. Katzen, die mit 1 ml einer derartigen Vaccine parenteral geimpft werden, produzieren Antikörper gegen das FCV, die denen nach einer natürlichen Infektion ebenbürtig sind. Die Applikation dieses modifizierten Felincalicivirus führt dabei nicht zu den für eine FCV-Infektion charakteristischen klinischen Symptomen. Die geimpften Katzen sind ausserdem gegenüber einer Belastungsinfektion mit virulentem Virus geschützt.

Ein signifikanter Antikörperanstieg kann beobachtet werden, wenn nach der parenteralen Applikation der Vaccine eine

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zweite oder dritte Boosterinjektion vorgenommen wird. So konnten z. B. gute Resultate durch eine zweite intramuskuläre Impfung zwei Wochen nach der ersten Impfung erzielt werden. Um optimale Resultate zu erhalten wird empfohlen, die 2. Impfung nicht früher als ungefähr 3 bis 4 Wochen nach der ersten durchzuführen.

Ferner wurde festgestellt, dass ein Boostereffekt auch anders erzielt werden kann. Neben der bereits beschriebenen Applikation einer zweiten Dosis der modifizierten Felincalici-virus-Vaccine, z. B. mit dem Serotyp F-9, auf parenteralem, vorzugsweise intramuskulärem Wege, können die kürzlich geimpften Katzen auch über die intranasale Route geboostert werden. Das verwendete Virusmaterial kann hierbei sowohl in modifizierter als auch in nichtmodifizierter Form vorliegen.

Derartige intranasale Applikationen, die nach einer ersten parenteralen Impfung vorgenommen werden, produzieren signifikant hohe Antikörperspiegel, die über eine lange Zeit anhalten. Wenn derartig behandelte Tiere zum Beispiel mit einem virulenten Virus infiziert werden, ist der Immunschutz wesentlich ausgeprägter und äussert sich in dem Fehlen jeglicher klinischer Symptome, auch wenn das virulente, nicht-modifizierte Virus in hohen kulturinfektiösen Dosen verabreicht wird. Zur Erzielung optimaler Ergebnisse wird empfohlen, eine ausreichende Zeit verstreichen zu lassen, bevor Katzen nach der ersten parenteralen Impfung intranasal geboostert werden. Sie sollen zuvor eine gute (solide) Grundimmunität, die sich am Antikörperanstieg erkennen lässt, entwickeln, bevor sie auf intranasalem Wege mit virulentem FCV in Kontakt gebracht werden. Am besten wird die intranasale Boosterung ungefähr 2 bis 5 Wochen nach der ersten parenteralen Impfung durchgeführt.

Die intranasale Applikation von Felincalicivirus kann leicht entweder mittels eines Aerosolpräparats, d. h. durch das Einbringen in die Nasengänge mittels Spray, oder durch Aufbringen von Tropfen auf die äussere Nasenöffnung oder in die Nasengänge durchgeführt werden. Für die intranasale Applikation von Felincalicivirus im Anschluss an eine vorangegangene parenterale Impfung liegt die geeignete Viruskonzentration bei IO3 bis 10® kulturinfektiösen Dosen pro ml. Das Felincalicivirus, z. B. der Serotyp F-9, wird dabei entweder in der vorstehend beschriebenen, modifizierten Form oder in vermehrungsfähiger, virulenter, nichtattenuierter Form angewendet.

Die vorstehend beschriebene Methode, eine erste parenterale Impfung mit einer nachfolgenden Boosterimpfung über den Respirationstrakt mit modifiziertem oder nichtmodifizier-tem Felincalicivirus zu kombinieren, induziert in den Tieren eine humorale Antikörperantwort und eine lokale Immunität im Respirationstrakt, die einen erheblich besseren Schutz

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gegen eine Erkrankung durch eine FCV-Infektion vermitteln. Es wird ein wirksamer und langanhaltender Schutz gegen die meisten Serotypen des Felincalicivirus erzielt.

Versuch 4

Einer Katze (Katze A), die zuvor auf das Freisein von Antikörpern gegenüber dem FCV getestet worden war, wurde 1 ml der gemäss Beispiel 2 hergestellten Vaccine (P-20-Passage) mit einem Virustiter von 105'5KIDso/ml bei 35° C intramuskulär gespritzt. Eine zweite Katze (Katze B) wurde als unbehandelte Kontrolle gehalten. 1 Monat nach der ersten Impfung erhielt die geimpfte Katze wiederum 1 ml Vaccine intramuskulär. Ungefähr 3V2 Monate nach der Erstimpfung wurden die geimpfte Katze und die Kontrollkatze mit <103KID5o virulentem Felincalicivirus (FPV-255) intranasal infiziert. Die Infektion erfolgte gemäss Beispiel 2 mit einem Aerosolgerät. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammenge-fasst. Die Ergebnisse zeigen, dass die Antikörperantwort signifikant höher ist und klinische Symptome nicht auftreten, wenn eine intranasal vorgenommene Belastungsinfektion nach einer parenteralen Vaccinierung durchgeführt wird.

Tabelle II Antikörpergewicht

Titer zum Zeit- Titer 1 Monat klinische punkt der nach der Symptome nach intranasalen intranasalen der intranasalen

Infektion Infektion Infektion

Katze A 1:18 1:180 keine

Katze B <1:2 1:120 schwere

Erkrankung

Katzen erhalten einen langanhaltenden Immunschutz gegen das Felincalicivirus durch eine erste parenterale Impfung mit einer Vaccine, die mindestens 103 kulturinfektiöse Dosen eines attenuierten Felincalicivirus, vorzugsweise des Serotyps F-9, enthält. Dieses Virus wird durch mindestens 10 Serienpassagen von jeweils 1 bis 6 Tagen in Katzenzellkulturen mit einem flüssigen Nährmedium bei einer Bebrütungstemperatur von 30±2° C attenuiert. Daran anschliessend erhalten die Tiere über den Respirationstrakt ungefähr IO3 bis 108 kulturinfektiöse Dosen eines Felincalicivirus in vermehrungsfähiger, virulenter, nichtattenuierter Form. Gleiche Ergebnisse können auch durch Applikation von IO3 bis 108 kulturinfektiösen Dosen eines erfindungsgemäss attenuierten Felincalicivirus über den Respirationstrakt erzielt werden.

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Claims

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1. Verfahren zur Herstellung von attenuiertem Felincalici-virus, dadurch gekennzeichnet, dass man virulentes felines Calicivirus bei Temperaturen von 30±2° C über jeweils 1 bis 7 Tage und über mindestens 10 Serienpassagen in einer Kat-zenzellkultur in einem Nährmedium passagiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Katzenzellkultur Katzenzungenzellen verwendet.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als virulentes Felincalicivirus den Serotyp 9, ATCC VR-782, einsetzt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die serienmässige Passagierung bei Temperaturen von 29 bis 310 C durchführt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man 13 bis 35 Serienpassagen durchführt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene Virusmaterial gefriertrocknet.

7. Verwendung des nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 attenuierten Felincalicivirus zur Herstellung vermehrten Virusmaterials in Form einer Vaccine, dadurch gekennzeichnet, dass man das Virus bei Temperaturen von 32 bis 37° C in einer Katzenzellkultur in einem Nährmedium vermehrt.

8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vermehrung so lange fortsetzt, bis sich eine Viruskonzentration von IO3 bis 108 kulturinfektiöse Dosen pro ml Kulturmedium gebildet hat.

Die Infektion mit Felincaliciviren ist eine weitverbreitete und schwere Erkrankung der Katze, die sich gewöhnlich im Respirationstrakt manifestiert. Aus der Literatur ist bekannt, dass sehr viele Serotypen vorkommen, die unterschiedlich pathogen sind, d.h. leichte respiratorische Symptome bis schwere Pneumonien verursachen können. Berichte aus der Literatur sprechen davon, dass diese Infektionen für ungefähr die Hälfte aller klinischen Fälle von respiratorischen Erkrankungen der Katze verantwortlich gemacht werden müssen.

Das Virus infiziert die Epithelzellen der Nase, Lunge, des Pharynx, der Trachea und der Augen und verursacht in diesen Lysis und Nekrose. Daraus resultieren entweder klinisch inapparente Infektionen oder leichte Affektionen des Respirationstraktes bis schwere Erkrankungen mit Pneumonien und gelegentlichen Todesfällen. Ulcerative Läsionen an der Nase und auf der Zunge sowie Fieber und Inappetenz sind häufig mit dieser Erkrankung vergesellschaftet. Virus wird über die Nase, die Augen und das Maul während der klinischen Erkrankung ausgeschieden. Infektionen mit Felincaliciviren werden bedingt durch Resistenzminderungen, häufig durch bakterielle Sekundärinfektionen kompliziert. Die Mortalität kann hoch sein, vor allem wenn junge Katzen erkranken. Die Übertragung der Felincaliciviren auf empfängliche Katzen erfolgt im allgemeinen aerogen, z.B. durch Tröpfchen beim Niesen oder durch Kontakt (gewöhnlich von Nase zu Nase). Das Überstehen von natürlichen wie experimentellen Infektionen führt zu einer nur relativ kurzen Immunität.

Die Serotypen der Gruppe der Felincaliciviren wurden früher Picornaviren genannt. Dieser Name wurde 1971 durch das International Committee on Viral Nomenclature geändert. Die Virusgruppe bzw. -familie heisst nun «Picornaviridae», das Genus «Calicivirus». Über die erste Isolierung eines Felincalicivirus wurde von L. B. Fastier, Am. J. Vet. Res., Bd. 18 (1957 ), S. 382, berichtet. Seitdem sind verschiedene Veröffentlichungen erschienen, die über die Isolierung von Felincaliciviren aus Katzen in verschiedenen Teilen der Welt berichten. Sie beschreiben die Identifizierung dieser Viren als Caliciviren, ihre Übertragung, Epidemiologie und die charakteristischen histologischen Veränderungen der Erkrankung sowie auch den unterschiedlichen Verlauf der Infektion, je nachdem welcher Serotyp beteiligt war; vgl. beispielsweise J.L. Bittie u. Mitarb., Amer. J. Vet. Res., Bd. 21 (1960), S. 547 und Bd. 22 (1961), S. 374; F. Burki, Arch. F. die Gesam. Vir., Bd. 15 (1965), S. 690; R. A. Crandall, Proc. Soc. Exptl. Biol. & Med., Bd. 126 (1967), S. 240; Kahn & Gillespie, Cornell Vet., Bd. 60 (1970), S. 669; Holzinger & Kahn, Amer. J. Vet. Res., Bd. 31 (1970), S. 1623; und E. Takahashi u. Mitarb., Jap. J. Vet. Sei., Bd. 33 (1971), S. 81.

Eine ausgezeichnete, sich auf dem neuesten Stand befindende Monographie von Gillespie und Scott findet sich in dem Buch «Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine», Bd. 17, herausgegeben von C.A. Brandly und C.E. Cornelius, Seiten 176 bis 188, Academic Press, Inc., New York, 1973.

Bisherige Versuche mit der Immunisierung gegen Felincaliciviren bezeichnen Gillespie und Scott, a.a.O., Seite 189, als nicht praktikabel. Bis jetzt steht keine wirksame Vaccine zum Schutz der Katzen gegen das Felincalicivirus zur Verfügung.