DE60029327T2

DE60029327T2 - Nukleinsaüre- und aminosaürensequenzen von infectious salmon anaemia virus, und deren verwendung als impfstoffe

Info

Publication number: DE60029327T2
Application number: DE60029327T
Authority: DE
Inventors: Steven Fredericton GRIFFITHS; Jane Rachel RITCHIE; Joel Chelsea HEPPELL
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1999-08-07
Filing date: 2000-08-07
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2020-08-08
Also published as: US7128917B2; CY1106175T1; DK1200132T3; NO20020573D0; US7199108B2; US7201910B2; US20120071630A1; WO2001010469A2; EP1200132B2; DK1200132T4; US20040146860A1; DK177298B1; EP1200132B1; ATE332712T1; EP1200132A2; WO2001010469A3; AU6304100A; US6919083B1; CA2378437A1; CA2378437C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Fischimpfstoff. Genauer gesagt betrifft die Erfindung einen Impfstoff, um Lachs gegen das infektiöse Lachsanämievirus zu schützen.
Das infektiöse Lachsanämievirus (ISAV) verursacht eine Mortalität von gezüchtetem Atlantiklachs. Typischerweise wird der Ertrag der Aquakultur um über 30% verringert. demnach besteht ein Bedarf für einen wirksamen Impfstoff gegen ISAV.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Impfstoff bereitzustellen, um gegen ISAV zu schützen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die zumindest eine Nukleinsäuresequenz und/oder zumindest eine Aminosäuresequenz oder ein synthetisch hergestelltes Analogon hiervon oder eine im wesentlichen homologe Sequenz umfasst, worin die Zusammensetzung sich vom infektiösen Lachsanämievirus ableitet oder hierauf basiert und worin zumindest eines der Nukleotid- und/oder Aminosäuresequenzen keine Lachsanämie verursacht und zur Verwendung als Impfstoff gegen ISAV oder zu dessen Herstellung verwendet werden kann.
Eine im wesentlichen homologe Nukleinsäuresequenz ist eine Sequenz, die unter Bildung einer Aminosäuresequenz transkribiert und/oder translatiert werden kann, die im wesentlichen zu mindestens einem Teil eines auf ISAV vorkommenden Oberflächenantigens homolog ist.
Vorzugsweise ist die im wesentlichen homologe Aminosäuresequenz zumindest zu 70% mit einem Teil eines Oberflächenantigens von ISAV homolog, das zur Auslösung einer Immunreaktion fähig ist.
Bevorzugter ist die im wesentlichen homologe Aminosäuresequenz zumindest zu 80% homolog zu einem Teil eines Oberflächenantigens von ISAV und kann eine Immunreaktion induzieren.
Bevorzugter ist die im wesentlichen homologe Aminosäuresequenz zumindest zu 90% homolog zu einem Teil eines Oberflächenantigens von ISAV und kann eine Immunreaktion induzieren.
Geeigneterweise wird die Aminosäuresequenz aus der Gruppe ausgewählt, die aus den Sequenz ID Nummern 2, 4, 6, 7, 8 oder 10 ausgewählt ist, wie sie hierin beschrieben sind.
Alternativ dazu kann die Aminosäuresequenz zumindest ein Fragment der Sequenz ID Nummern 2, 4, 6, 7, 8 oder 10 umfassen.
Alternativ dazu kann die Aminosäuresequenz aus einer Aminosäuresequenz der Sequenz ID Nummern 4, 6, 7, 8 oder 10 verkürzt sein, wie sie hierin beschrieben sind, welche eine Immunreaktion auslösen können.
Vorzugsweise ist die im wesentlichen homologe Nukleotidsequenz zumindest zu 60% homolog mit einem Teil der Nukleinsäuresequenz eines Oberflächenantigens von ISAV und das Translationsprodukt hiervon ist zur Induktion einer Immunreaktion fähig.
Vorzugsweise ist die im wesentlichen homologe Nukleotidsequenz zumindest zu 70% homolog mit einem Teil einer Nukleinsäuresequenz eines Oberflächenantigens von ISAV, wobei das Translationsprodukt hiervon zur Auslösung einer Immunreaktion fähig ist.
Bevorzugter ist die im wesentlichen homologe Nukleotidsequenz zumindest zu 80% homolog mit einem Teil einer Nukleinsäuresequenz eines Oberflächenantigens von ISAV, wobei das Translationsprodukt hiervon zur Auslösung einer Immunreaktion fähig ist.
Am bevorzugtesten ist die im wesentlichen homologe Nukleotidsequenz zumindest zu 90% homolog mit einem Teil einer Nukleinsäuresequenz eines Oberflächenantigens von ISAV, wobei das Translationsprodukt hiervon zur Auslösung einer Immunreaktion fähig ist.
Geeigneterweise werden die Nukleotidsequenzen aus der Gruppe ausgewählt, die die Sequenz ID Nummern 1, 3, 5 oder 9 umfasst, wie sie hierin beschrieben sind.
Alternativ dazu liefert die Erfindung Fragmente der in den Sequenznummern 1, 3, 5 und 9 beschriebenen Sequenzen, wobei die Translationsprodukte der Fragmente zur Induktion einer Immunreaktion führen.
Zusätzlich können die Sequenzen eine verkürzte Form der in 1, 3, 5 und 9 angegebenen Sequenzen umfassen.
Die Nukleotidsequenz kann in ein Plasmid eingearbeitet werden.
Die Nukleotidsequenz kann in einen geeigneten Expressionsvektor eingearbeitet werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert die Verwendung einer Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenz ID Nummern 1 bis 10 besteht, wie dies in der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Impfstoffs und/oder therapeutischen Arzneimittels zum Schutz von Fischen vor einer Infektion mit dem infektiösen Lachsanämievirus beschrieben ist.
Typische Nukleinsäuresequenzen sind ISA2cd (vorher bezeichnet als p1.38), ISA1mta (vorher bezeichnet als p8.17), ISAmx (vorher bezeichnet als p6.28) und ISA4ha.
Vorzugsweise werden die Peptidsequenzen von entweder einer, zwei oder allen Nukleinsäuresequenzen transkribiert und translatiert, wobei ISA2cd, ISA1mta, ISA3mx oder ISA4ha in eine Impfstoffstrategie eingearbeitet werden, die eine Immunreaktion gegenüber einem Oberflächenantigen von ISAV und so gegen das infektiöse Lachsanämievirus selbst hervorruft.
Die Erfindung liefert die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen oder Peptidsequenzen, wie sie hierin definiert sind, zur Herstellung eines Impfstoffs zum Schutz von Fisch gegen ISAV.
Die Erfindung liefert ferner einen Impfstoff zum Schutz von Fischen gegen ISAV, worin der Impfstoff Nukleinsäure- oder Peptidsequenzen umfasst, wie sie hierin definiert sind.
Charakterisierung der neuen Sequenzen der Erfindung
Die begleitenden Figuren beschreiben die Erfindung weiter im Detail.
Die 1 ist die Nukleotidsequenz von ISA2cd.
Die 2 ist die Aminosäuresequenz, die man aus der Translation der ISA2cd Nukleinsäuresequenz erhält, die in 1 aufgeführt ist.
Die 3 ist die Nukleotidsequenz von ISA1mta.
Die 4 ist die Aminosäuresequenz, die man nach einer Transkription der in 3 aufgeführten Nukleinsäuresequenz erhält.
Die 5 ist die exakte Nukleotidsequenz von ISA3mx.
Die 6a ist die Aminosäuresequenz (M1), die von der nicht gespleißten Nukleinsäure von ISA3mx translatiert ist, die in 5 gezeigt ist.
Die 6b ist die Aminosäuresequenz (M2), die von der gespleißten Nukleinsäuresequenz von ISA3mx translatiert ist, die in 5 gezeigt ist.
Die 6c ist die Aminosäuresequenz (M3), die von der nicht-gespleißten Nukleinsäuresequenz von ISA3mx translatiert ist, die in 5 gezeigt ist.
Zusätzlich wird die Information, die das spezifische Molekulargewicht (MW) und die theoretischen isoelektrischen Punkte (pI) angibt, unterhalb der jeweiligen Aminosäuresequenzlisten angegeben.
Die in den Figuren gezeigten Nukleotid- und Aminosäuresequenzen werden ferner in den mittels Patent-In erzeugten Sequenzlisten dargestellt.
Die Sequenz ID Nummer 1 ist die Nukleotidsequenz von ISA2cd, wie sie in 1 dargestellt ist. Die Sequenz ID Nummer 2 ist die Aminosäuresequenz von ISA2cd, wie sie in 2 dargestellt ist.
Die Sequenz ID Nummer 3 ist die Nukleotidsequenz von ISA1mta, wie sie in 3 dargestellt ist.
Die Sequenz ID Nummer 4 ist die Aminosäuresequenz von ISA1mta, wie sie in 4 dargestellt ist.
Die Sequenz ID Nummer 5 ist die Nukleotidsequenz von ISA3mx, wie sie in 5 dargestellt ist.
Die Sequenz ID Nummer 6 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz des nicht-gespleißten Produkts von ISA3mx, wie sie in 6a dargestellt ist.
Die Sequenz ID Nummer 7 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz des gespleißten ISA3mx, wie sie in 6b dargestellt ist.
Die Sequenz ID Nummer 8 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz des gespleißten ISA3mx, wie sie in 6c dargestellt ist.
Die Sequenz ID Nummer 9 ist die Nukleotidsequenz von ISA4ha, wie sie in 7 dargestellt ist. Die Sequenz ID Nummer 10 ist die Aminosäuresequenz von ISA4ha, wie sie in 8 dargestellt ist.
Die genetischen Sequenzen, die für ISA1mta und ISA2cd gezeigt sind, und die ungespleißten und gespleißten genetischen Sequenzen für ISA3mx stammen von einer klonierten cDNA, worin die cDNA Klone von genomischem Material des infektiösen Lachsanämievirus (ISAV) stammen. Das klonierte Material wird vom 5'-Ende und den Insertionsstellen am 3'-Ende mittels überlappender Amplikons unter Bildung einer durchgängigen Sequenz sequenziert.
Die Exaktheit der durchgängigen Sequenz wird durch Polymerasekettenreaktionamplifizierung mittels Reverser Transkriptase (RT-PCR) der Amplicons der korrekten Größe von ISAV-infiziertem Lachsgewebe und Gewebekulturen bestätigt. Solche Amplikone werden jedoch von nicht-infiziertem Kontrollmaterial erhalten, was zeigt, dass das genetische Material aus ISAV Ursprung stammt.
Die offenen Leserahmen (ORFs) werden durch schnelle Amplifizierung der cDNA Enden (RACE) von der unvollständigen Sequenz aus Virus-infizierter Gewebekultur vervollständigt. Die Korrekturen werden für die in vivo transkribierte mRNA ausgeführt, die aus den ursprünglich klonierten cDNAs nicht ersichtlich waren.
Der ORF von ISA2cd hat keine signifikante Homologie der Nukleotid- oder Aminosäuresequenz mit vorherigen Einträgen in Datenbanken, die durch BLAST zugänglich sind. Jedoch umfassen Proteine mit ähnlichen Molekulargewichten (MW) und isoelektrischen Punkten (pI) 14 virale Proteine in der Swiss-Prot Datenbank, wie Hämagglutinin-Neuraminidase.
Der ORF von ISA1mta ist auch ohne signifikante Homologie zu vorher charakterisierten Proteinen, die in die durch BLAST durchsuchbaren Datenbanken eingegeben wurden. Jedoch ist es von Interesse, dass es Eigenschaften bezüglich Molekulargewicht und isoelektrischem Punkt aufweist (68–69 kDa und pI 8,2), die nahezu identisch zu einem der dominantesten viralen Proteine sind, das durch zweidimensionale Elektrophorese identifiziert wurde. Das Protein scheint integral mit den Membranen der mit ISAV infizierten Gewebekulturen assoziiert zu sein. Falls der ORF ein solches Protein ergibt, würde es in jeder Impfstrategie als wertvoll betrachtet werden, um das Ausmaß an ISAV Infektion in jeder lachsartigen Spezies zu reduzieren.
Ferner weist in den für ISA3mx gezeigten Sequenzen der nicht-gespleißte ORF (die Basis für die abgeleitete Aminosäuresequenz M1) keine signifikante Homologie auf dem Nukleotid- oder Aminosäuresequenzniveau mit einer vorherigen Eingabe in Datenbasen auf, die durch BLAST zugänglich sind. Jedoch umfassen Proteine mit ähnlichen Molekulargewichten und isoelektrischen Punkten mehrere virale Mantel- und Hüllproteine, die in der Swiss-Prot Datenbank aufgeführt sind. Beide abgeleiteten M1 und M2 Proteine (erhalten von ORFs nach einem Spleißen der Nukleotidsequenz) werden als Membran-assoziierte Proteine vorhergesagt und falls die von ISA3mx kodierten ORFs solche Proteine ergeben würden, würden sie bei jeder Impfstrategie als wertvoll betrachtet werden, um das Ausmaß der ISAV Infektion in jeder lachsartigen Spezies zu verringern.
Die abgeleitete Proteintranslation von M3 (in 6c und den begleitenden Sequenzlisten gezeigt) zeigt die Homologie zu einem Paromyxovirusfusionsprotein, das mit der Zellmembran assoziiert ist und bei der Zelladhäsion beteiligt sein dürfte. In Anbetracht dieser gezeigten Homologie ist M3 potentiell bei jeder Impfstrategie wertvoll, die auf eine Verringerung des Ausmaßes einer ISAV Infektion in jeder lachsartigen Spezies abzielt.
Die weitere Sequenz, die mit der ISA4ha Nukleotidsequenz zusammenhängt, wird durch das folgende Verfahren erhalten. Das ISA4ha Protein wird durch polyklonale Antikörper nach einer Hybridisierung detektiert. Es wird festgestellt, dass das Protein in 2 alternativen Formen vorkommt. Diese 2 alternativen Formen haben unterschiedliche Größen und können beobachtet werden, wenn die Proteine in verschiedenen Zelllinien kultiviert werden, beispielsweise shc und chse.
Da diese alternativen Formen beide durch den Antikörper detektierbar sind und sich in der Größe in Abhängigkeit davon unterscheiden, wie sie angezogen wurden, ist das Protein potentiell ein guter Kandidat für eine Virulenz.
Das Protein wird isoliert und sequenziert, was zu einem 24 Aminosäuren langen Fragment führt, das gebildet wird. Wenn diese Sequenz in BLAST suchbare Datenbanken eingegeben wird, zeigt es Ähnlichkeiten zu Sequenzen von britischen und norwegischen ISAV Stämmen.
Anschließend werden Primer auf der Basis der erhaltenen Aminosäuresequenz zusammen mit der Referenz auf Sequenzen entworfen, die für die ähnlichen britischen und norwegischen Stämme bekannt sind.
Die Primer werden dann anschließend in einer Polymerasekettenreaktion zur Amplifizierung des relevanten DNA Fragments verwendet, das anschleißend sequenziert und in die Aminosäurekodierung übersetzt wird.
Die offenen Leserahmen, die in der vorliegenden Erfindung erhalten werden, haben aus folgenden Gründen einen besonderen kommerziellen Wert:

1. Es liegt ein ausreichender Grund vor anzunehmen, dass die den Nukleotidsequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen aus ISAV Ursprung sind. Daher kann ihr Einbau in Nukleinsäureimpfstoffe eine Auswirkung auf die Verringerung der Mortalität von Atlantischem Zuchtlachs haben, die durch ISAV verursacht wird und wie vorher erwähnt die Erträge einer Aquakultur typischerweise um über 30% verringern kann.
2. Die Charakterisierung des Genprodukts wird zur Identifizierung von Schlüsselelementen bei der Pathogenese der Infektion und zum Entwurf von genaueren diagnostischen Tests führen, die auch bei epidemiologischen Studien helfen werden, die Verbreitung von unterschiedlichen Stämmen der Erkrankung zu dokumentieren.

Die Nukleotidsequenzen ISA1mta, ISA2cd, ISA3mx, ISA4ha und assoziierte Derivate hiervon sollten, wenn sie in Proteinsequenzen translatiert werden, die sich aus entweder identischen oder äquivalenten Aminosäuren zusammensetzen, eine Reaktion des Immunsystems des Wirts induzieren. Das Prinzip kann ferner auf die Verwendung dieser Proteine in diagnostischen Tests und Impfverfahren ausgedehnt werden.
Sequenzliste

Claims

Zusammensetzung, die zumindest eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus den Sequenz ID Nummern 2, 4, 6, 7, 8 und 10, im wesentlichen homologen Sequenzen, die hierzu zumindest 70% homolog sind und Fragmenten der Sequenz ID Nummern 2, 4, 6, 7, 8 und 10, worin die Aminosäuresequenz zur Induktion einer Immunreaktion fähig ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin zumindest eine Aminosäuresequenz eine verkürzte Form einer Aminosäuresequenz ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus den Sequenz ID Nummern 2, 4, 6, 7, 8 und 10.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin zumindest eine Aminosäuresequenz die Sequenz ID Nummer 2 oder eine im wesentlichen homologe Sequenz, die zumindest zu 70% hierzu homolog ist, oder ein Fragment der Sequenz ID Nummer 2 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die im wesentlichen homologen Sequenzen zumindest zu 80% homolog sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die im wesentlichen homologen Sequenzen zumindest zu 90% homolog sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin die Aminosäuresequenz die Sequenz ID Nummer 10 und eine im wesentlichen homologe Sequenz ist, die zumindest zu 90% hierzu homolog ist.
Zusammensetzung, die zumindest eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe die besteht aus den Sequenz ID Nummern 1, 3, 5 und 9, im wesentlichen homologen Sequenzen, die zumindest 70% hierzu homolog sind und Fragmenten der Sequenznummern 1, 3, 5 oder 9, worin das Translationsprodukt der Nukleinsäuresequenz zur Induktion einer Immunreaktion fähig ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin zumindest eine Nukleinsäuresequenz eine verkürzte Form einer der Sequenz ID Nummern 1, 3, 5 oder 9 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin zumindest eine Nukleinsäuresequenz die Sequenz ID Nummer 1 oder eine im wesentlichen homologe Sequenz, die zumindest 70% hierzu homolog ist, oder ein Fragment einer Sequenz ID Nummer 1 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder Anspruch 9, worin die im wesentlichen homologen Sequenzen zumindest zu 80% homolog sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin die im wesentlichen homologen Sequenzen zumindest zu 90% homolog sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, worin die Nukleinsäuresequenz die Sequenz ID Nummer 9 und eine im wesentlichen homologe Sequenz ist, die zumindest zu 90% hierzu homolog ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 12, worin die Nukleinsäuresequenz in ein Plasmid eingearbeitet ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 13, worin die Nukleinsäuresequenz in einen Expressionsvektor eingearbeitet ist.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung eines Impfstoffs und/oder eines therapeutischen Arzneimittels zum Schutz von Fischen vor einer Infektion mit dem infektiösen Lachsanämievirus.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines diagnostischen Tests zur Detektion des Vorkommens einer Infektion mit dem infektiösen Lachsanämievirus bei Fischen.
Impfstoff, der die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 umfasst.