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Die Erfindung betrifft die Identifizierung von Masernvaccine-
Virusstämmen.
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Masernvirus, der der Masern verursachende Virus ist, gehört zur
Paramyxoviridae-Familie von RNA-Virus.
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Die erste Isolierung von Masernvirus aus einem Patienten unter
Verwendung einer Primärkultur von menschlichen Nierenzellen wurde von J. F.
Enders et al. 1954 durchgeführt (J. F. Enders et al., Proc. Soc. Exp. Biol.
Med., 86 (1954) 227-286). Ein attenuierter Masern-Impfstoff (Vaccine) wurde
von Enders et al. (J. F. Enders et al.: New Engl. J. Med., 263 (1960) 153-
159) unter Verwendung des isolierten Edmonston-Stammes entwickelt. Der von
Enders et al. entwickelte Impfstoff verursachte jedoch häufig nachteilige
Wirkungen unter Ausbildung von Pyrogenizität und Exanthem hervor. Durch
weitere Attenuation des Edmonston-Stammes wurden viele Stämme von
attenuiertem Masern-Virus erhalten. Unter diesen Stämmen wurde der von A. J. F.
Schwarz erhaltene Schwarz-Stamm im allgemeinen für lebende Masern-
Impfstoffe verwendet.
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Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben vier Stämme einer
kalten Variante, die von einem attenuierten Masern-Virus des von Dr. Enders
bereitgestellten Edmonston-Stamms abgeleitet sind, isoliert (S. Makino et
al., J. Japan Microbiol. 14 (1970) 501-504).
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Die Verringerung der Immunogenität, d. h. Wirksamkeit, aufgrund der
Attenuierung des Masern-Virus war allgemein bekannt. Unter den isolierten
kalten Varianten ist ein viraler Stamm, der anpassungsfähig bei 33ºC
wächst, ein weiterer attenuierter Masern-Virus mit hoher Immunogenität, der
Eigenschaften besitzt, die von den in konventionellen Masern-Viren
beobachteten Eigenschaften verschieden sind (S. Makino et al., Japan J. Microbiol.
17 (1973) 75-79).
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Um den Samen für lebende Masern-Impfstoffe (Masern-Vaccine) aus der
kalten Variante zu entwickeln, hat ein Erfinder der vorliegenden Erfindung
einen Virus-Klon isoliert, der ein aus spezifischen Pathogen-freien Eiern
erhaltener Hühnerembryozellen angepaßter Stamm mit dem gleichen
Temperaturmarker ist, und als AIK-C-Stamm bezeichnet wird (K. Sasaki, Kitasato
Arch. Exp. Med. 47 (1974) 13-21).
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Das Pyrogenizitätsverhältnis (≤ 37,5ºC) des aus dem Samen von AIK-C-
Stamm in Masern-empfindlichen Kindern gebildeten AIK-C-Stamm-lebend
Impfstoffes beträgt ca. 1/3 bis 1/4 der des Schwarz-Stamm-Impfstoffes. Der AIK-
C-Stamm
ist attenuierter als der Schwarz-Stamm und besitzt eine unikale
Charakteristik: eine hohe Immunantwort ohne Verringerung der Immunogenität
(S. Makino et al., Kitasato Arch. Exp. Med. 47 (1974) 13-21).
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Enzephalitis, die von verabreichten Masern-Lebend-Impfstoff
verursacht werden dürfte, wurde in 1 bis 3 Kindern pro Million geimpfter Kinder
beobachtet. Für den AIK-C-Stamm-lebend-Masernimpfstoff wurden trotz der
Verabreichung dieses Impfstoffs an 10 Millionen Leute in Japan keine
solchen neurologischen Komplikationen berichtet. (M. Hirayama et al., Inf.
Dis. 5 (1983) 495-503, S. Makino, ibid. 5 (1983) 504-505).
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Die biologischen Eigenschaften des AIK-C-Stammes sind unikal und von
den anderen Stämmen von Masern-Viren verschieden. Der Virus wird jedoch
leicht mutiert und in der Wachstumsphase kann sogar für einen attenuierten
Masern-Virus-Stamm wie den AIK-C-Stamm eine geringe Bildung von varianten
Stämmen beobachtet werden. Bei der Herstellung von Masern-Lebend-Impfstoff
ist deshalb eine Qualitätskontrolle auf die Identität zwischen dem Samen-
Virus und dem daraus hergestellten Impfstoff-Virus äußerst wichtig.
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Als Qualitätskontrolltest wurde ein Temperaturmarkertest für den AIK-
C-Stamm verwendet (K. Sasaki, Kitasato Arch. Exp. Med. 47 (1974) 1-12).
Dies ist jedoch nicht immer eine absolute Identifikationsmethode für den
AIK-C-Stamm.
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Die fundamentalen biologischen Eigenschaften eines Virus hängen von
seinem Gen, das aus Nucleinsäure besteht, ab. Die Nucleinsäure von Masern-
Virus besteht aus einer einzelsträngigen negativen RNA. Jeder Masern-Virus-
Stamm hat seine eigene Nucleinsäure, die aus einer spezifischen
Nucleotidsequenz besteht.
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Eine vollständige differentielle Identifizierungsmethode unter
viralen Stämmen ist es deshalb, die Nucleotidsequenz der viralen Nucleinsäure
der Stämme zu bestimmen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben sich
darauf konzentriert und die Nucleotidsequenz der mit Masernvirusinfektion
zusammenhängenden Nucleinsäure analysiert, und damit ein anwendbares
Kontrollverfahren für einen stabilen AIK-C-Stamm von Masern-Virus ohne
Variante und Mutation bereitgestellt.
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Bisher bekannte Identifizierungsmethoden für verschiedene Masern-
Stämme sind spezifische Tests auf biologische Reaktionen. Dies sind jedoch
keine absoluten Identifizierungsmethoden. Für eine Qualitätskontrolle des
AIK-C-Stamm-Impfstoffes wurde der vorstehend genannte Temperaturmarker-Test
angewendet.
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Methoden zum Klonen und Sequenzieren von RNRs voller Länge sind z. B.
aus Schmid et al., 1987, Nucleic Acids Research, Band 15, Seiten 3987 bis
3996, bekannt. Aufgrund der hohen Mutationsrate der RNA-Viren hat es sich
jedoch als schwierig erwiesen, eine definitive Sequenz für den AIK-C-Stamm
zu erhalten.
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Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nun aber die gesamte
Nucleotidsequenz des Genoms des AIK-C-Stamn-Virus bestimmt, um eine
absolute Identifizierungsmethode bereitzustellen. Da die gesamte spezifische
Nucleotidsequenz, die aus 15894 Basen besteht, des AIK-C-Stammes genau
festgestellt wurde, kann der Virus auf genetischem Niveau identifiziert
werden. Die spezifische Nucleotidsequenz aus 15894 Basen ist nachfolgend
als Sequenz I. D. No. 1 angegeben. Diese Identifizierungsmethode ist somit
eine absolute Bestimmungsmethode, weshalb die Qualitätskontrolle an einem
stabilen AIK-C-Stamm-Impfstoff leicht genau durchgeführt werden kann. Die
vorliegende Erfindung beruht somit auf der Bestimmung einer spezifischen
Nucleotidsequenz, die aus 15894 Nucleotiden besteht, in einer Sequenz, die
der in Sequenz I. D. No. 1 angegebenen DNA-Sequenz entspricht, in der
genomischen RNA eines Masernimpfstoff-Virusstammes.
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Sequenzliste der vorstehend angegebenen Nucleotidsequenz.
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Sequenzart: Nucleinsäure
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Strangform: Einzelstrang
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Topologie: geradlinig
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Art des Moleküls: cDNA
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Ursprüngliche Herkunft
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Organismus: attenuierter Masern-Impfstoff
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Stamm: AIK-C
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Erfindungsgemäß wird somit ein Verfahren zur Identifizierung eines
Masern-Impfstoff-Virus-Stammes bereitgestellt, das umfaßt: Bestimmen der
Nucleotidsequenz der der genomischen RNA des Masernimpfstoff-Virus-Stammes
entsprechenden cDNA und Vergleichen der so bestimmten Sequenz mit der in
Sequenz I. D. No. 1 angegebenen DNA-Sequenz.
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Der Masern-Impfstoff-Virus-Stamm kann aus einem Kind entnommen worden
sein, das mit dem AIK-C-Stamm von Masern-Virus geimpft wurde. In einer
alternativen Ausführungsform wird der Masern-Virus für Impfstoffe aus Samen-.
AIK-C-Stamm-Masern-Virus gebildet und die Qualität des so hergestellten
Virus durch Bestimmen der Nucleotidsequenz der der genomischen RNA des Virus
entsprechenden cDNA und Vergleich der so bestimmten Sequenz mit der in
Sequenz I. D. No. 1 angegebenen DNA-Sequenz überprüft.
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Erfindungsgemäß wird auch eine cDNA bereitgestellt, z. B. eine
isolierte cDNA, die die in Sequenz I. D. No. 1 angegebene Nucleotidsequenz
besitzt. Erfindungsgemäß wird außerdem eine RNA bereitgestellt, die eine
Nucleotidsequenz besitzt, die der in Sequenz I. D. No. 1 angegebenen
entspricht.
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In den beiliegenden Zeichnungen bedeuten:
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Fig. 1 ein Schemadiagramm der cDNA-Konstruktion.
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Fig. 2 eine Kartierung von cDNA-Klonen des AIK-C, und
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Fig. 3 gibt Primer-Sequenzen an.
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Erfindungsgemäß wird zuerst ein Samen-Virus des Masern-Virus-AIK-C-
Stammes verwendet. Dieser Virus wird in von spezifischen Pathogen-freien
Hühnereiern abgeleiteten Hühnerembryozellen vermehrt, um die sogenannte
Impfstoff-Menge (Vaccine-Bulk) herzustellen, aus der eine Virussuspension
zur weiteren Reinigung hergestellt werden kann. Die Impfstoff-Menge kann
Teil eines handelsüblich hergestellten Masern-AIK-C-Stamm-Impfstoff-
Viruspools sein.
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Die geklärte Virussuspension wird durch Ultrazentrifugation durch
kontinuierliche Sucrose-Gradienten gereinigt. Virus-RNA wird nach der SDS-
Phenol-Methode extrahiert. Synthetischer Primer kann nach der Amididmethode
als ca. 25-mer-synthetischer Primer synthetisiert werden.
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Deoxyoligonucleotide, die als synthetische Primer verwendet werden,
können z. B. an einem Cyclone DNA Synthesizer (Biosearch Inc.) synthetisiert
werden.
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Die AIK-C-Virus-Genom-RNA wird als Templat für die Synthese von cDNA
unter Verwendung der vorstehend genannten synthetischen
Oligonucleotidprimer verwendet. Die AIK-C-Virusgenom-RNA wird zur Herstellung einer
einzelsträngigen cDNA durch reverse Transkriptase revers-transkriptiert, die zur
Herstellung doppelsträngiger cDNA nach der RNase H-Methode behandelt wird.
Die doppelsträngigen cDNAs werden mit geeigneten Restriktionsenzymen
behandelt und in pUC-Plasmid (pUC 18 oder pUC 19) eingefügt, Das vorstehende
Verfahren wird in Fig. 1 dargestellt. E. coli K12-Stamm HB101 wird mit dem
resultierenden rekombinanten Plasmid transformiert. Die Transformanten
werden aufgrund ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber Ampicillin ausgewählt.
Kolonien, die rekombinante Flasmide enthalten, werden durch Messen der
Größe der Plasmid-DNA mit Agarose-Gelelektrophorese gescreent. Um die AIK-C-
Genom-Sequenz zu bestimmen, wird die cDNA in die Bakteriophagen M13-Serie
subkloniert, und die einzelsträngigen M13-Phagen-DNAs aus den
entsprechenden Subklonen isoliert.
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Die Bestimmung des erhaltenen cDNA-Klons kann durch verschiedene
Restriktionsenzym-Spaltungen durchgeführt werden. In der aus dem
synthetischen Primer, wie z. B. MP-1, erhaltenen cDNA werden die Restriktionsenzym-
Schnittstellen von BamHI, EcoRV und XbaI lokalisiert. In dem aus dem
Ampicillin-beständigen Stamm extrahierten Plasmid werden für den Fall, daß
dieser cDNA-Typ beobachtet wird, ca. 1504 Basenfragmente durch Spalten mit
BamHI und XbaI durch Agarose-Gelelektrophorese identifiziert. Weitere
Behandlung dieser Fragmente mit EcoRV ergibt zwei Fragmente, nämlich 650 und
854-Basen-Fragmente. Eine Identifizierung des erhaltenen cDNA-Klons wurde
somit durch Spalten des Insertionsfragments im Plasmid und seine
Größenbestimmung durchgeführt, oder durch Bestimmen der spezifischen Schnittstelle
von Masern-DNA in den Fragmenten.
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Um die Basensequenz zu bestimmen, wird die cDNA, die durch ein
Restriktionsenzym zur Herstellung kohäsiver oder stumpfer Enden gespalten
wird, in M 13-Phagenvektor eingefügt, in dem seine klonierenden Teile durch
die bevorzugten Restriktionsenzyme gespalten werden. Der Phage, der die so
hergestellte rekombinante DNA enthält, wird in E. coli eingeführt.
Einzelsträngige rekombinante DNA wird aus der infizierten Phagen-Plaques
extrahiert und die Nucleotidsequenz nach der Dideoxy-Terminierungsmethode
(Dideoxy-Sequenzierungsmethode) bestimmt.
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Ein Primer, wie z. B. pMN2, die von MP-1 erhaltene cDNA, wird durch
BamHI und XbaI gespalten, und in ein pUC-Plasmid geklont. Nach Bestimmen
der cDNA wird das DNA-Fragment, das aus dem AIK-C-Stamm durch Spalten mit
dem gleichen Restriktionsenzym stammt, weiter durch EcoRV gespalten, um
zwei Fragmente mit 650 bp und 854 bp herzustellen.
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Diese Fragmente werden in M13-replikative doppelsträngige DNA
ligiert, die vorher durch BamHI und XbaI gespalten wurde, und in E. coli
übertragen. Nach Auswahl des rekombinanten Phagen wird der Phage in E. coli
eingeführt und vermehrt. Einzelsträngige rekombinante DNA wird aus der
überstehenden Phase der Phagenlösung extrahiert und die Nucleotidsequenz
nach der Dideoxy-Sequenzierungsmethode bestimmt.
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Es wurde gefunden, daß das Virusgenom von AIK-C-Stamm aus 15894
Nucleotiden besteht und die vollständige Sequenz ist vorstehend angegeben.
Ein Masern-Virus, der das RNA-Genom enthält, besitzt die guten
Eigenschaften des AIK-C-Virusstammes. Die spezifische Nucleotidsequenz des AIK-C-
Virusstamm-Genoms wird mittels PCR bestimmt und kann mit dem Virusstamm
verglichen werden, um festzustellen, ob dieser Stamm für einen AIK-C-Stamm-
Virus-Impfstoff verwendet werden kann, oder ob der hergestellte AIK-C-
Stamm-Virus-Impfstoff die Eigenschaften des AIK-C-Stammes aufweist. Wenn
ein Kind, dem ein Masern-Impfstoff verabreicht wurde, ein Exanthem aufweist
und in Lymphocyten des Kindes Masernvirus-Antikörper beobachtet werden,
kann außerdem die Ursache festgestellt werden, indem man die
Nucleotidsequenz des Masern-Impfstoff-Virus mit der Nucleotidsequenz des AIK-C-Virus
vergleicht.
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Im Text werden die folgenden Abkürzungen verwendet.
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Met: Methionin
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Thr: Threonin
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Leu: Leucin
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Arg: Arginin
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Ser: Serin
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Phe: Phenylalanin
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Lys: Lysin
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Asn: Asparagin
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Asp: Asparaginsäure
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Pro: Prolin
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Ile: Isoleucin
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Gly: Glycin
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His: Histidin
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Val: Valin
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Glu: Glutaminsäure
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Gln: Glutamin
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Die nachstehenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne
sie darauf zu beschränken.
Beispiel 1
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Bestimmung der Nucleotidsequenz eines aus AIK-C-Virus-Stamm-Vaccine-
Bulk erhaltenen Virus
Stufe a
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Ein Samen-Virus von Masern-AIK-C-Stamm (Samenart 0-2) wurde bis zu
einem Infektionstiter von 0,05 (in Hühnerembryozellen) eingeimpft, die sich
von spezifischen Pathogen-freien Hühnereiern ableiten und in einer
Zellkultur-Oberfläche (230 cm²) in einer großen Roux-Flasche (ca. 1 l Volumen)
kultiviert wurden. Ein Kulturmedium (150 ml) von Eagle's Medium Essential
Medium (MEM), das 1% Kälberserum enthielt, wurde zugefügt und der Virus
bei 33ºC kultiviert.
Stufe b
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Am dritten Tag nach Impfung wurde das Kulturmedium entfernt, und dann
neues Medium (150 ml), und zwar das gleiche wie vorstehend angegeben,
zugegeben, und die Kultivierung fortgesetzt.
Stufe c
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Nach Einimpfen von Virus wurde am sechsten Tag das Kulturmedium
entfernt. Infizierte Hühnerembryozellschichten wurden dreimal mit Hank's-
Lösung (100 ml) gewaschen. Dann wurde nach Zugabe von Eagle's MEM, das
0,1% Natriumglutamat enthielt, zur Zellkultur (200 ml), die Kultivierung
bei 33ºC fortgesetzt.
Stufe d
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Am zehnten Tag nach Virussamen-Beimpfung wurde, nachdem ein
spezifischer cytopathogener Effekt für Masern-Virus auf der gesamten infizierten
Zellschicht beobachtet wurde, das Kulturmedium für die Vaccine-Bulk-Lösung
gesammelt (Volumen: ca. 200 ml, Infektionstiter: 107,2 TCID&sub5;&sub0; */ml) (*
mittlere Gewebskultur-Infektionsdosis).
Stufe e
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Vaccine-Bulk-Lösung wurde bei 3000 UpM 30 Minuten lang zentrifugiert
und die Überstandslösung weiter bei 25000 UpM 90 Minuten lang zentrifugiert
(Beckman L8-55M, Rotor: SW28)
Stufe f
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Nach Entfernen der Überstandslösung wurde TEN-Pufferlösung (10 mM-
Tris HCl, 1 mM-EDTA, 100 mM-NaCl, pH = 7,4) zu einem Niederschlag in jedem
Zentrifugenglas zugegeben, und gut suspendiert, um konzentrierten Virus
herzustellen. Die so erhaltene konzentrierte Virussuspension wurde durch
Zugabe von TEN-Pufferlösung auf ein Endvolumen von 10 ml eingestellt, um
eine klare Virussuspension herzustellen.
Stufe g
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Die klare Virussuspension (5 ml) wurde auf die 30 bis 60%-
kontinuierlichen Sucrosegradienten in zwei Zentrifugengläsern
aufgeschichtet (Beckman-Zentrifuge SW41-Rotor), (hergestellt aus 60% (Gew/Vol)
Sucroselösung in TEN-Pufferlösung (6,8 ml) und 30% (Gew/Vol) Sucroselösung in
TEN-Pufferlösung (6,8 ml) pro Glas), und dann 90 Minuten bei 207000 g bei
4ºC zentrifugiert. Die Suspension wurde fraktioniert und die Fraktionen,
die den höchsten Infektionstiter zeigten (108,3 TCID&sub5;&sub0;/ml) wurden gesammelt
und wieder auf gleiche Weise zur Herstellung gereinigter Virusteilchen
zentrifugiert.
Stufe h
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Die gereinigten Virusteilchen wurden fünffach mit TEN-Pufferlösung
verdünnt, je 200 ul in 1,5 ml Mikrotest-Gläser gegeben, dann 20% SDS
(5 ul), Phenol (100 ul) und Chloroform (100 ul) zugegeben, dann unter
Verwendung eines Vortex-Mischers sorgfältig gerührt. Die Mischung wurde dann
bei 12000 UpM 5 Minuten lang zentrifugiert, um die organische Schicht von
der wässerigen Schicht zu trennen. Die wässerige Schicht wurde in einem
anderen 1,5 ml-Mikrotestglas gesammelt und zweimal einer Phenolextraktion
unterworfen (SDS-Phenolextraktion). Die erhaltene wässerige Schicht wurde mit
5M NaCl (1/25 Volumen) und Ethanol (2,5 Volumen) gemischt, bei -20ºC
2 Stunden lang stehen gelassen, und dann bei 1200 UpM 10 Minuten lang
zentrifugiert, um ausgefallene RNA zu erhalten, die mit 70% Ethanol gewaschen
und dann getrocknet wurde. Das getrocknete Material wurde in doppelt
destilliertem Wasser (50 ul), das durch Autoklavisieren sterilisiert war, zur
Herstellung einer RNA-Suspension gelöst.
Stufe i
Cyclon-DNA-Synthesizer
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Synthetische Primer-Deoxyoligonucleotide, insbesondere die 12 Primer,
die ca. 25 mer-MP-1 bis MP-11 und BEP (dT), wie in Fig. 3 dargestellt,
umfassen, wurden unter Verwendung eines Cyclon-DNA-Synthesizer (Biosearch
Inc. USA) synthetisiert.
Stufe j
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Die in der vorstehende Stufe h erhaltene RNA-Suspension (10 ul) (AIK-
C-Virusgenom-RNA) wurde als Templat zur Synthese von DNA unter Verwendung
synthetischer Nucleotidprimer (die vorstehende synthetische DNA) (2 ul
synthetischer Primer, MP-1 oder MP-11) verwendet und cDNA durch Behandlung mit
reverser Transkriptase hergestellt. Die cDNA wurde unter Verwendung von
Rnase H-DNA-Polymerase 1 (Cubler und Hoffman, GENE 25 (1983), Seiten 263-
269) in doppelsträngige cDNA überführt.
Stufe k
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Die erhaltene cDNA wurde an jeder Restriktionsenzym-Schnittstelle
durch BamHI-XbaI, XbaI-BamHI, BamHI-EcoRI, EcoRI-BamHI, BamHI-EcoRI, EcoRI-
BgIII, Bg1II-SacI und SacI-NcoI-XbaI gespalten. Jedes Fragment wurde in
eine entsprechende Klonierstelle in pUC-Plasmid eingefügt (pUC 18 und pUC
19).
Stufe 1
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E. coli HB101 wurde mit den vorstehend rekombinanten Plasmiden
transformiert, und Ampicillin-beständige Kolonien erhalten. Aus den so
erhaltenen Kolonien wurde Plasmid-DNA extrahiert, und die die rekombinanten
Plasmide enthaltenen Kolonien wurden durch Messen der Länge der Fragmente der
Plasmid-DNA mittels 0,8% Agarosegelelektrophorese gescreent.
Stufe m
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Um den 3'-terminalen Klon des AIK-C-Genoms zu erhalten, wurde das
Poly(A) am 3'-Ende der genomischen RNA, einer in der vorstehenden Stufe h
erhaltenen RNA-Suspension, mit Poly(A)-Polymerase und Adenosin-Triphosphat
(ATP) modifiziert. Die so erhaltene 3'A-modifizierte RNA-Suspension, d. h.
die polyadenylierte RNA, wurde unter Verwendung von BEP (dT)7-Primer revers
transkripiert, um nach Stufe j cDNA herzustellen. Der BEP (dT)7-Primer
besaß die Sequenz: 5'- CTGTGAATTCTGCAGGATCCTTTTTTT-3'.
Stufe n
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Der 5'-terminale Klon wurde unter Verwendung eines zum 5'-Ende nahe
benachbarten lokalisierten Primers syntetisiert. Der Primer enthielt im
Bereich der Nucleotide 15592-15615 des Masernvirus-Genoms komplementäre DNA.
Der synthetische Primer besaß die Sequenz: 5'-
TGGAAGCTTATCCAGAATCTCAAGTCCGGCT-3'.
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Unter Verwendung dieser synthetischen DNA als Primer wurde mit
reverser Transkriptase ein DNA-RNA-Hybrid hergestellt. Nach Alkalibehandlung des
Hybrids wurde Poly(dA), d. h. dATP, an das 3'-Ende der resultierenden cDNA
mit terminaler Deoxynucleotidyltransferase angebracht. Es wurde dann unter
Verwendung des BEP (dT)&sub7;-Primers in Stufe m und des Klenow-Fragments in die
doppelsträngige cDNA überführt.
Stufe o
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Die so erhaltenen cDNAs wurden im Bakteriophagen M13-Serien-Vektor
(mp 18 und mp 19) subkloniert, und die einzelsträngige M13 Phagen-DNA
isoliert. Die Nucleotidsequenz dieser cDNAs wurde mit der einzelsträngigen DNA
mittels der Dideoxykettenterminationsmethode unter Verwendung des
7-DEAZAdGTP-Sequenzier-Kits (Takara Shuzo) bestimmt.
Stufe p
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Computeranalyse des Nucleotids und die Peptidsequenz wurden mittels
GENETYX-Software durchgeführt.
Beispiel 2
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Bestimmung viraler Nucleotide von AIK-C-Stamm-Samen-Virus, gewachsen
in Vero-Zellen (African green monkey cell live)
Stufe a
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AIK-C-Stamm-Virus (Samen-Art Nr. 0-2) wurde in Vero-Zellen, die
vorher in einer großen Roux-Flasche nach der im Beispiel 1 beschriebenen
Methode kultiviert worden waren, eingeimpft und bei 33ºC inkubiert.
Stufe b
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Am 5. Tag nach Beimpfung wurden die infizierten Zellschichten mit
Hank's Lösung gewaschen, dann Eagle's MEM (200 ml) ohne Kälberserum
zugegeben und weitere 2 Tage lang inkubiert. Die inkubierte Viruskultur wurde zum
Erhalt einer Virusbulk-Suspension gesammelt (ca. 200 ml, Infektionstiter:
106,5 TCID&sub5;&sub0;/ml).
Stufe c
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Der Vaccine-Bulk wurde bei 3000 UpM 30 Minuten lang zentrifugiert,
danach die überstehende Suspension bei 2500 UpM 90 Minuten lang
zentrifugiert (Zentrifuge: Beckman L8-55M, Rotor: SW 28)
Stufe d
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Nach Entfernen der überstehenden Lösung wurde TEN-Pufferlösung (10 mM
Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH = 7,4, 1 ml) zum Niederschlag jedes
Zentrifugenglases zugegeben. Der Niederschlag wurde zur Herstellung einer
konzentrierten Virussuspension sorgfältig suspendiert, die dann durch
Zugaben von TEN-Pufferlösung auf ein Volumen von 10 ml eingestellt wurde, um
eine Ausgangs-Virussuspension herzustellen.
Stufe e
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Die Ausgangs-Virussuspension (5 ml) wurde auf 30 bis 60%
kontinuierliche Sucrosegradienten in zwei Gläsern aufgeschichtet, wobei in einem Glas
60% (Gew/Vol) Sucroselösung (TEN-Pufferlösung) (6,8 ml) und 30%
(Gew/Vol)-Sucroselösung (TEN-Pufferlösung) (6,8 ml) enthalten waren, und
dann bei 207000 g 90 Minuten bei 4ºC zentrifugiert.
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Die zentrifugierte Suspension jedes Glases wurde mittels eines
Fraktionenkollektors fraktioniert und Fraktionen mit einer hohen Infektivität
(108,3 TCID&sub5;&sub0;/ml) gesammelt. Die gesammelte Fraktion wurde wieder auf
gleiche Weise zentrifugiert, um gereinigten Virus zu erhalten.
Stufe f
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Aliquote 200 ul-Anteile von gereinigtem Virus, auf das fünffache mit
TEN-Pufferlösung verdünnt, wurden getrennt in 1,5 ml-Mikrotestgläser
gege
ben. Dazu wurde 20% SDS (5 ul), Phenol (100 ul) und Chloroform (100 ul)
zugegeben, und sorgfältig unter Verwendung eines Vortex-Mischers gerührt.
Die organischen und wässerigen Schichten wurden mittels einer Zentrifuge
bei 12000 UpM während 5 Minuten getrennt. Die wässerige Schicht wurde in
einem anderen 1,5 ml-Mikrotestglas gesammelt und zweimal mit dem gleichen
obigen SDS-Phenol extrahiert.
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Die gewonnene wässerige Schicht wurde mit 5 M NaCl (2/25 Volumen) und
Ethanol (2,5 Volumen) gemischt, bei - 20ºC 2 Stunden lang stehen gelassen,
bei 12000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert, und die ausgefallene RNA
gewonnen, die mit 70% Ethanol gewaschen und getrocknet wurde. Unter
Sterilisation wurde ein RNA-Suspension des getrockneten Materials hergestellt und
in redestilliertem Wasser (50 ul) gelöst.
Stufe g
Cyclon DNA-Synthesizer
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Unter Verwendung des Cyclon-DNA-Synthesizer (Biosearch Inc., USA)
wurden synthetische Primer-Deoxyoligonucleotide, insbesondere die 12
Primer, die ca. 25 mer-MP 1 bis MP 11 und BEP (dT)&sub7; umfassen, wie in Fig. 3
dargestellt, synthetisiert.
Stufe h
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Die im obigen Beispiel 1 erhaltene RNA-Suspension (10 ul) (AIK-C-
Virusgenom-RNA) Wurde als Templat zur Synthese von cDNA unter Verwendung
der synthetischen Oligonucleotidprimer (die obige synthetische DNA) (2 ul
synthetischer Primer, MP-1 oder MP-11) verwendet und die cDNA durch
Behandlung mit reverser Transkriptase hergestellt. Die cDNA wurde in
doppelsträngige cDNR unter Verwendung von RNaseH-DNA-Polymerase 1 (Gubler und Hoffman,
GENE 25, 1983, Seiten 263-269) überführt.
Stufe i
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Die erhaltene cDNA wurde an jeder Restriktionsenzym-Schnittstelle
mittels BamHI-XbaI, XbaI-BamHI, BamHI-EcoRI, EcoRI-BamHI, BamHI-EcoRI, Eco-
RI-BglII, BglII-SacI und SacI-NcoI-XbaI geschnitten. Jedes Fragment wurde
in eine entsprechende Klonierungsstelle in pUC-Plasmid (pUC18 und pUC19)
eingeführt.
Stufe j
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Mit den obigen rekombinanten Plasmiden wurde E. coli HB101
transformiert und Ampicillin-beständige Kolonien erhalten. Aus den so erhaltenen
Kolonien wurde Plasmid-DNA extrahiert und die die rekombinanten Plasmide
enthaltenden Kolonien wurde durch Messen der Länge der Fragment-Plasmid-DNA
mittels 0,8% Agarosegelelektrophorese gescreent.
Stufe k
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Um den 3'-terminalen Klon des AIK-C-Genoms zu erhalten, wurde Poly(R)
am 3'-Ende der genomischen RNA, einer in der vorstehenden Stufe f
erhalte
nen RNA-Suspension, mit Poly(A)-Polymerase und Adenosintriphosphat (ATP)
modifiziert. Die so erhaltene 3'-veränderte RNA-Suspension, d. h. die
polyadenylierte RNA, wurde unter Verwendung von BEP (dT)&sub7;-Primer zur Herstellung
von cDNA gemäß Stufe h revers transkripiert. Der BEP (dT)&sub7;-Primer besaß die
Sequenz: 5'-CTGTGAATTCTGCAGGATCCTTTTTTT-3'.
Stufe l
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Der 5'-terminale Klon wurde unter Verwendung eines Primers
synthetisiert, der nahe des 5'-Endes lokalisiert war. Der Primer enthielt im
Bereich der Nucleotide 15592 bis 15615 des Masernvirus-Genoms komplementäre
DNA. Der synthetische Primer besaß die Sequenz: 5'-
TGGAAGCTTATCCAGAATCTCAAGTCCGGCT-3'.
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DNA-RNA-Hybrid wurde unter Verwendung dieser synthetischen DNA als
Primer mit reverser Transkriptase hergestellt. Nach Alkalibehandlung des
Hybrids wurde Poly(dA), d. h. dATP, an das 3'-Ende der resultierenden cDNA
mit terminaler Deoxynucleotidyltransferase angebracht. Es wurde danach
unter Verwendung des BEP (dT)&sub7;-Primers in Stufe k und des Klenow-Fragments in
doppelsträngige cDNA überführt.
Stufe m
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Die so erhaltenen cDNRs wurden in den Bakteriophagen M13-Serien-
Vektor (mp 18 und mp 19) subkloniert, und die einzelsträngige M13-Phagen-
DNAs isoliert. Die Nucleotidsequenz dieser cDNAs wurde mit der
einzelsträngigen DNA mittels der Dideoxykettenterminationsmethode unter Verwendung von
7-DEAZA-dGTP-Sequenzierkit (Takara Shuzo) bestimmt.
Stufe n
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Die Computeranalyse des Nucleotids und die Peptidsequenzen wurden
mittels GENETYX-Software durchgeführt.
Beispiel 3
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Identifizierung von Masernvirus eines Patienten mittels PCR am ersten
Tag, an dem sich die Maserninfektion zeigte.
Stufe a
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Eine Blutprobe (ca. 5 ml) wurde am ersten Tag, an dem sich ein
Masern-Exanthem zeigte, einem Patienten entnommen. Lymphocyten wurden mittels
Ficoll (Handelsname) getrennt.
Stufe b
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Die Lymphocyten wurden zweimal mit PBS gewaschen. Eine
Denaturierungslösung D (4M Guanidiumthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat, pH = 7,5; 0,5%
Sarcosin, 0,1 M 2-Mercaptoethanol, 200 ul) wurden zugegeben. Nach leichtem
Rühren wurden 2 M Natriumacetat (20 ul, pH = 4), Phenol (200 ul} und
Chloroform (100 ul) in dieser Reihenfolge zugegeben.
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Die Mischung wurde mit einem Vortex-Mischer 10 Sekunden lang
behandelt und dann in Eiswasser 15 Minuten lang stehen gelassen. Dann wurde die
Mischung bei 10000 g 20 Minuten lang zentrifugiert, um die wässerige
Schicht zu gewinnen. Ein gleiches Volumen Isopropanol wurde zugegeben. Die
Mischung wurde bei -20ºC eine Stunde stehen gelassen und dann bei 10000 g
20 Minuten lang zentrifugiert, um RNA auszufällen (Chomczynski und Sacchi,
Anal. Biochem., 162 (1987) 156-159).
Stufe c
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Die so erhaltene RNA wurde der Reaktion mit reverser Transkriptase
und der PCR-Methode unterworfen.
Stufe d
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Es wurde die Nucleotidsequenzierung und Identifizierung des
Masernvirus-AIK-C-Impflösungsstamms und des Wildstamms durchgeführt.