PT540135E - Estirpe atenuada de virus da vacina do sarampo contendo uma sequencia nucleotidica especifica e um metodo para a sua identificacao absoluta - Google Patents

Description

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DESCRICÀO “Estirpe atenuada de vírus da vacina do sarampo contendo uma sequência nucleotídica específica e um método para a sua identificação absoluta”

Este invento refere-se à identificação de estirpes de vírus da vacina do sarampo. O vírus do sarampo, o qual é o vírus causador de sarampo, pertence à família Paramyxoviridae de vírus de ARN. O primeiro isolamento de vírus do sarampo de um doente utilizando uma cultura primária de células humanas de rim foi feito por J.F. Enders et al. em 1954 (Enders, J.F. et al.: Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 86: 227-286, 1954). Foi desenvolvida uma vacina do sarampo atenuada utilizando a estirpe isolada de Edmonston por Enders et al. (Enders, J.F. et al.\ New Engl. J. Med., 263: 153-159, 1960). No entanto, a vacina desenvolvida por Enders et al. induzia frequentemente efeitos adversos com pirogenicidade e exantema. Muitas estirpes de vírus do sarampo atenuado foram estabelecidas através de maior atenuação da estirpe de Edmonston. Entre estas estirpes, a estirpe de Schwarz estabelecida por A.J.F. Schwarz foi normalmente utilizada para vacinas de sarampo vivas.

Os inventores do presente invento isolaram quatro estirpes de uma variante fria derivada de um vírus do sarampo atenuado da estirpe de Edmonston fornecido pelo Dr. Enders (Makino, S. et al., Japan. J. Microbiol., 14: 501-504, 1970). A redução da imunogenicidade, i.e. eficácia, devido à atenuação do vírus do sarampo era geralmente conhecida. Entre as variantes frias isoladas, uma estirpe virai que cresce de forma adaptativa a 33°C é um vírus do sarampo mais atenuado com elevada imunogenicidade possuindo propriedades diferentes daquelas que são geralmente observadas no vírus do sarampo convencional (Makino, S. et al., Japan. J. Microbiol., 17: 75-79, 1973).

De forma a desenvolver as sementes para vacinas vivas de sarampo a partir da variante fria, um inventor do presente invento isolou um clone de vírus o qual é uma estirpe adaptada a células de embrião de pinto obtidas a partir de ovos isentos de patogénios específicos, possuindo o mesmo marcador de temperatura e designada como estirpe AJK-C (Sasaki K., Kitasato Arch. Exp. Med., 47: 13-21, 1974). A razão de pirogenicidade (< 37,5°C) da vacina viva da estirpe AIK-C produzida a

84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ partir das sementes da estirpe A1K-C em crianças sensíveis ao sarampo é aproximadamente 1/3 - 1/4 da vacina da estirpe de Schwarz. A estirpe AIK-C é mais atenuada que a estirpe de Schwarz e possui uma característica única: uma elevada resposta de imunogenicidade sem baixar a imunogenicidade (Makino, S. etal., Kitasato Arch. Exp. Med., 47: 13-21, 1974). A encefalite, que parece ser causada pela administração da vacina viva do sarampo, foi observada em 1 a 3 crianças por milhão de crianças vacinadas. Não foi relatada nenhuma informação sobre tais complicações neurológicas para a vacina viva do sarampo da estirpe AIK-C apesar da administração desta vacina a dez milhões de pessoas no Japão. (Hirayama, M. et al., Inf. Dis., 5: 495-503, 1983; Makino S., ibid., 5: 504-505, 1983).

As propriedades biológicas da estirpe AIK-C são únicas e diferentes das outras estirpes de vírus do sarampo. No entanto, o vírus é facilmente mutado e, mesmo para uma estirpe de vírus do sarampo atenuada tal como a estirpe AIK-C, pode ser observada uma pequena formação de estirpes variantes na fase de crescimento. De forma concordante, é muito importante, na produção da vacina viva de sarampo, uma verificação de controlo de qualidade para a identidade entre o vírus de semente e o vírus da vacina produzido a partir deste.

Um teste de marcador de temperatura para a estirpe AIK-C foi aplicado como teste de controlo de qualidade (Sasaki, K., Kitasato Arch. Exp. Med., 47: 1-12, 1974). No entanto este nem sempre é um método de identificação absoluta para a estirpe AIK-C.

As propriedades biológicas fundamentais de um vírus dependem do seu gene, o qual consiste em ácido nucleico. O ácido nucleico do viras do sarampo consiste numa única cadeia negativa de ARN. Cada estirpe do vírus do sarampo tem o seu próprio ácido nucleico que consiste numa sequência nucleotídica específica.

Um método de identificação diferencial completa entre estirpes virais consiste, por isso, em determinar a sequência nucleotídica do ácido nucleico virai das estirpes. Os inventores do presente invento focaram-se neste ponto e analisaram a sequência nucleotídica do ácido nucleico relacionado com a infecçào pelo vírus do sarampo e proporcionaram deste modo um método de controlo administrativo para a estirpe AIK-C estável do vírus do sarampo sem variante e mutação.

Os métodos de identificação até agora conhecidos para várias estirpes do sarampo são testes de resposta biológica específica. No entanto, estes não são métodos de identificação absoluta. Para o controlo de qualidade da vacina da estirpe AIK-C, foi aplicado o teste do marcador de temperatura acima mencionado. São conhecidos métodos para clonagem e sequenciação de ARN completos, por exemplo Schmid et al., 1987, Nucleic Acids Research, Volume 15, página 3987 a 3996. No entanto, provou-se ser difícil obter uma sequência definitiva para a estirpe AIK-C devido à alta taxa de mutação dos vírus de ARN.

No entanto, os inventores do presente invento determinaram agora toda a sequência nucleotídica do genoma do vírus de estirpe AIK-C de modo a estabelecer um método de identificação absoluta. Uma vez que toda a sequência nucleotídica específica consistindo em 15894 bases da estirpe AIK-C foi claramente determinada, o vírus pode ser identificado ao nível genético. A sequência nucleotídica específica de 15894 bases é abaixo exposta como Sequência I.D. N° 1. Este método de identificação pode assim ser um método de determinação absoluta, de forma a que o controlo de qualidade sobre a vacina da estirpe estável AIK-C possa ser facilmente determinada de forma exacta. O presente invento é assim baseado na detecção de uma sequência nucleotídica específica consistindo em 15894 nucleótidos numa sequência correspondendo à sequência de ADN exposta em Sequência I.D. N° 1, no ARN genómico de uma estirpe de vírus da vacina do sarampo. (Segue Sequência)

84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ ACCAAACAAA GTTGGGTAAG GATAGTTCAA TCAATGATCA TCTTCTAGTG CACTTAGGAT 60 TCAAGATCCT ATTATCAGGG ACAAGAGCAG GATTAGGGAT ATCCGAG ATG GCC ACA 116

Met Ala Thr CTT TTA AGG AGC TTA GCA TTG TTC AAA AGA AAC AAG GAC AAA CCA CCC 164

Leu Leu Arg Ser Leu Ala Leu Phe Lys Arg Asn Lys Asp Lys Pro Pro 5 10 15 ATT ACA TCA GGA TCC GGT GGA GCC ATC AGA GGA ATC AAA CAC ATT ATT 212

Ile Thr Ser Gly Ser Gly Gly Ala Ile Arg Gly Ile Lys His lie Ile 20 25 30 35 ATA GTA CCA ATC CCT GGA GAT TCC TCA ATT ACC ACT CGA TCC AGA CTT 260

Ile Vai Pro Ile Pro Gly Asp Ser Ser Ile Thr Thr Arg Ser Arg Leu 40 45 50 CTG GAC CGG TTG GTC AGG TTA ATT GGA AAC CCG GAT GTG AGC GGG CCC 308

Leu Asp Arg Leu Vai Arg Leu Ile Gly Asn Pro Asp Vai Ser Gly Pro 55 60 65 AAA CTA ACA GGG GCA CTA ATA GGT ATA TTA TCC TTA TTT GTG GAG TCT 356

Lys Leu Thr Gly Ala Leu Ile Gly Ile Leu Ser Leu Phe Vai Glu Ser 70 75 80 CCA GGT CAA TTG ATT CAG AGG ATC ACC GAT GAC CCT GAC GTT AGC ATA 404

Pro Gly Gin Leu Ile Gin Arg Ile Thr Asp Asp Pro Asp Vai Ser I le 85 90 95 AGG CTG TTA GAG GTT GTC CAG AGT GAC CAG TCA CAA TCT GGC CTT ACC 452

Arg Leu Leu Glu Vai Vai Gin Ser Asp Gin Ser Gin Ser Gly Leu Thr

100 105 110 11G TTC GCA TCA AGA GGT ACC AAC ATG GAG GAT GAG GCG GAC AAA TAC TTT 500

Phe Ala Ser Arg Gly Thr Asn Met Glu Asp Glu Ala Asp Lys Tyr Phe 120 125 130

84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 6

GGG ΑΤΑ GAA ACT ATG TAT CCT GCT CTT GOA CTG CAT GAA ΤΤΤ GCT GGT Gly Ile Glu Thr Met Tyr Pro Ala Leu Gly Leu His Glu Phe Ala Gly 280 285 290 GAG TTA TCC ACA CTT GAG TCC TTG ATG AAC CTT TAC CAG CAA ATG GGG Glu Leu Ser Thr Leu Glu Ser Leu Met Asn Leu Tyr Gin Gin Met Gly 295 300 305 GAA ACT GCA CCC TAC ATG GTA AAC CTG GAG AAC TCA ATT CAG AAC AAG Glu Thr Ala Pro Tyr Met Vai Asn Leu Glu Asn Ser Ile Gin Asn Lys 310 315 320 TTC AGT GCA GGA TCA TAC CCT CTG CTC TGG AGC TAT GCC ATG GGA GTA Phe Ser Ala Gly Ser Tyr Pro Leu Leu Trp Ser Tyr Ala Met Gly Vai 325 330 335 GGA GTG GAA CTT GAA AAC TCC ATG GGA GGT TTG AAC TTT GGC CGA TCT Gly Vai Glu Leu Glu Asn Ser Met Gly Gly Leu Asn Phe Gly Arg Ser 340 345 350 355 TAC TTT GAT CCA GCA TAT TTT AGA TTA GGG CAA GAG ATG GTA AGG AGG Tyr Phe Asp Pro Ala Tyr Phe Arg Leu Gly Gin Glu Met Vai Arg Arg 360 365 370 TCA GCT GGA AAG GTC AGT TCC ACA TTG GCA TCT GAA CTC GGT ATC ACT Ser Ala Gly Lys Vai Ser Ser Thr Leu Ala Ser Glu Leu Gly Ile Thr 375 380 3 85 GCC GAG GAT GCA AGG CTT GTT TCA GAG ATT GCA ATG CAT ACT ACT GAG Ala Glu Asp Ala Arg Leu Vai Ser Glu Ile Ala Met His Thr Thr Glu 390 395 400 GAC AAG ATC AGT AGA GCG GTT GGA CCC AGA CAA GCC CAA GTA TCA TTT Asp Lys Ile Ser Arg Ala Vai Gly Pro Arg Gin Ala Gin Vai Ser Phe 405 410 415 980 1Ò28 1076 1124 1172 1220 1268 1316 1364 7 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ CTA CAC GGT GAT CAA AGT GAG ΑΑΤ GAG CTA CCG AGA TTG GGG GGC AAG 1412

Leu His Gly Asp Gin Ser Glu Asn Gtu Leu Pro Arg Leu Gly Gly Lys 420 425 430 435 GAA GAT AGG AGG GTC AAA CAG AGT CGA GGA GAA GCC AGG GAG AGC TAC 1460

Glu Asp Arg Arg Vai Lys Gin Ser Arg Gly Glu Ala Arg Glu Ser Tyr 440 445 450 AGA GAA ACC GGG CCC AGC AGA GCA AGT GAT GCG AGA GCT GCC CAT CTT 1508

Arg Glu Thr Gly Pro Ser Arg Ala Ser Asp Ala Arg Ala Ala His Leu 455 460 465 CCA ACC GGC ACA CCC CTA GAC ATT GAC ACT GCA TCG GAG TCC AGC CAA 1556

Pro Thr Gly Thr Pro Leu Asp Ile Asp Thr Ala Ser Glu Ser Ser Gin 470 475 480 GAT CCG CAG GAC AGT CGA AGG TCA GCT GAC GCC CTG CTT AGG CTG CAA 1604

Asp Pro Gin Asp Ser Arg Arg Ser Ala Asp Ala Leu Leu Arg Leu Gin 485 490 495 GCC ATG GCA GGA ATC TCG GAA GAA CAA GGC TCA GAC ACG GAC ACC CCT 1652

Ala Met Ala Gly Ile Ser Glu Glu Gin Gly Ser Asp Thr Asp Thr Pro 500 505 510 515 ATA GTG TAC AAT GAC AGA AAT CTT CTA GAC TAGGTGCGAG AGGCCGAGGA 1702

Ile Vai Tyr Asn Asp Arg Asn Leu Leu Asp 520 525 CCAGAACAAC ATCCGCCTAC CCTCCATCAT TGTTATAAAA AACTTAGGAA CCAGGTCCAC 1762 ACAGCCGCCA GCCCATCAAC CATCCACTCC CACGATTGGA GCCG ATG GCA GAA GAG 1818

Met Ala Glu Glu CAG GCA CGC CAT GTC AAA AAC GGA CTG GAA TGC ATC CGG GCT CTC AAG 1866

Gin Ala Arg His Vai Lys Asn Gly Leu Glu Cys lie Arg Ala Leu Lys 5 10 15 20 8 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ GCC GAG CCC ATC GGC TCA CTG GCC ATC GAG GAA GCT ATG GCA GCA TGG 1914

Ala Glu Pro lie Gly Ser Leu Ala Ile Glu Glu Ala Met Ala Ala Trp 25 30 35 TCA GAA ATA TCA GAC AAC CCA GGA CAG GAG CGA GCC ACC TGC AGG GAA 1962

Ser Glu Ile Ser Asp Asn Pro Gly Gin Glu Arg Ala Thr Cys Arg Glu 40 45 50 GAG AAG GCA GGC AGT TCG GGT CTC AGC AAA CCA TGC CTC TCA GCA ATT 2010

Glu Lys Ala Gly Ser Ser Gly Leu Ser Lys Pro Cys Leu Ser Ala Ile 55 60 65 GGA TCA ACT GAA GGC GGT GCA CCT CGC ATC CGC GGT CAG GGA CCT GGA 2058

Gly Ser Thr Glu Gly Gly Ala Pro Arg Ile Arg Gly Gin Gly Pro Gly 70 75 80 GAG AGC GAT GAC GAC GCT GAA ACT TTG GGA ATC CCC CCA AGA AAT CTC 2106

Glu Ser Asp Asp Asp Ala Glu Thr Leu Gly Ile Pro Pro Arg Asn Leu 65 90 95 100 CAG GCA TCA AGC ACT GGG TTA CAG TGT TAT TAT GTT TAT GAT CAC AGC 2154

Gin Ala Ser Ser Thr Gly Leu Gin Cys Tyr Tyr Vai Tyr Asp His Ser 105 110 115 GGT GAA GCG GTT AAG GGA ATC CAA GAT GCT GAC TCT ATC ATG GTT CAA 2202

Gly Glu Ala Vai Lys Gly Ile Gin Asp Ala Asp Ser Ile Met Vai Gin 120 125 130 TCA GGC CTT GAT GGT GAT AGC ACC CTA TCA GGA GGA GAC AAT GAA TCT 2250

Ser Gly Leu Asp Gly Asp Ser Thr Leu Ser Gly Gly Asp Asn Glu Ser 135 140 145 GAA AAC AGC GAT GTG GAT ATT GGC GAA CCT GAT ACC GAG GGA TAT GCT 2298

Glu Asn Ser Asp Vai Asp Ile Gly Glu Pro Asp Thr Glu Gly Tyr Ala 160 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 9

ATC ACT GAC CGG GGA TCT GCT CCC ATC TCT ATG GGG TTC AGG GCT TCT Ile Thr Asp Arg Gly Ser Ala Pro Ile Ser Mel Gly Phe Arg Ala Ser 165 170 175 180 GAT GTT GAA ACT GCA GAA GGA GGG GAG ATC CAC GAG CTC CTG AGA CTC Asp Vai Glu Thr Ala Glu Gly Gly Glu Ile Hls Glu Leu Leu Arg Leu 185 190 195 CAA ICC AGA GGC AAC AAC TTT CCG AAG CTT GGG AAA ACT CTC AAT GTT' Gin Ser Arg Gly Asn Asn Phe Pro Lys Leu Gly Lys Thr Leu Asn Vai 200 205 210 CCT CCG CCC CCG GAC CCC GGT AGG GCC AGC ACT TCC GGG ACA CCC ATT Pro Pro Pro Pro Asp Pro Gly Arg Ala Ser Thr Ser Gly Thr Pro Ile 215 220 225 AAA AAG GGC ACA GAG CGC AGA TTA GCC TCA TTT GGA ACG GAG ATC GCG Lys Lys Gly Thr Glu Arg Arg Leu Ala Ser Phe Gly Thr Glu Ile Ala 230 235 240 TCT TTA TTG ACA GGT GGT GCA ACC CAA TGT GCT CGA AAG TCA CCC TCG 5er Leu Leu Thr Gly Gly Ala Thr Gin Cys Ala Arg Lys Ser Pro Ser 245 250 255 260 GAA CCA TCA GGG CCA GGT GCA CCT GCG GGG AAT GTC CCC GAG TAT GTG Glu Pro Ser Gly Pro Gly Ala Pro Ala Gly Asn Vai Pro Glu Tyr Vai 265 270 275 AGC AAT GCC GCA CTG ATA CAG GAG TGG ACA CCC GAA TCT GGT ACC ACA Ser Asn Ala Ala Leu Ile Gtn Glu Trp Thr Pro Glu Ser Gly Thr Thr 280 285 290 ATC TCC CCG AGA TCC CAG AAT AAT GAA GAA GGG GGA GAC TAT TAT GAT Ile Ser Pro Arg Ser Gin Asn Asn Glu Glu Gly Gly Asp Tyr Tyr Asp 295 300 2346 2394 2442 2490 2538 2586 2634 2682 2730 305

84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 10 GTC CAA GAT ATT AAA ACA Vai Gin Asp Ile Lys Thr 315 320 AAG ATA ATC TCC AAG CTA Lys Ile Ile Ser Lys Leu 335 GAG TCA ATT AAG AAG CAG Glu Ser Ile Lys Lys Gin 350 CTG GAA GGA CAC CTC TCA Leu Glu Gly His Leu Ser 365 AAG GAT CCC AAC GAC CCC Lys Asp Pro Asn Asp Pro 380 AAA CCC ATC ATA GGC AGA Lys Pro Ile Ile Gly Arg 395 400 AAG AAA CCC GTT GCC AGC Lys Lys Pro Vai Ala Ser 415 ACC AGT TCC AGA GGA CAG Thr Ser Ser Arg Gly Gin 430 GGG AAA AAG ATG AGC TCA Gly Lys Lys Met Ser Ser 445 GAT GAG CTG TTC TCT GAT Asp Glu Leu Phe Ser Asp 310 ATA CAC GAG GAT AAT CAG Γ t e His Glu Asp Asn Gin 325 330 TTA TTG AAG GGA GAA GTT Leu Leu Lys Gly Glu Vai 345 AAT ATC AGC ATA TCC ACC Asn !le Ser Ile Ser Thr 360 GCC ATT CCT GGA CTT GGG Ala Ile Pro Gly Leu Gly 375 GAA ATC AAT CCC GAC TTG Glu Ile Asn Pro Asp Leu 390 GCA CTG GCC GAA GTT CTC Ala Leu Ala Glu Vai Leu 405 410 GGA ATG ACA AAT GGA CGG Gly Met Thr Asn Gly Arg 425 ΤΪΤ CAG CCA AAG CCG ATC Phe Gin Pro Lys Pro Ile 440 GCC TTG GCC AAA 2778

Ala Leu Ala Lys GAA TCA CTG CTG 2826

Glu Ser Leu Leu 340 ATC AAC AGG CAA 2874 I le Asn Arg Gin 355 AGC ATC ATG ATC 2922

Ser Ile Met Ile 370 ACT GCA GAT GTC 2970

Thr Ala Asp Vai 385 GAT TCA GGC CGA 3018

Asp Ser Gly Arg CGA CAA CTC CAA 3066

Arg Gin Leu Gin 420 CTG CTG AAG GAA 3114

Leu Leu Lys Glu 435 GCC GTC GGG TTT 3162

Ala Vai Gly Phe 450

84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 11

GTT CCT GAC ACC GGC CCT GCA TCA CGC AGT GTA ATC CGC TCC ATT ATA 3210 Vai Pro Asp Thr Gly Pro Ala Ser Arg Ser Vai I le Arg Ser I le Ile 455 460 465 AAA TCC AGC CGG CTA GAG GAG GAT CGG AAG CGT TAC CTG ATG ACT CTC 325Θ Lys Ser Ser Arg Leu Glu Glu Asp Arg Lys Arg Tyr Leu Met Thr Leu 470 475 480 CTT GAT GAT ATC AAA GGA GCC AAT GAT CTT GCC AAG TTC CAC CAG ATG 3306 Leu Asp Asp Ile Lys Gly Ala Asn Asp Leu Ala Lys Phe His Gin Met 485 490 495 500 CTG ATG AAG ATA ATA ATG AAG TAGCTACAGC TCAACTTACC TGCCAACCCC 3357 Leu Mel Lys I le I le Met Lys 505 ATGCCAGTCG ACCCAACTAG TACAACCTAA ATCCATTATA AAAAACTTAG GAGCAAAGTG 3417 ATTGCCTCCC AAGTTCCACA ATG ACA GAG ATC TAC GAC TTC GAC AAG TCG GCA 3470

Met Thr Glu Ile Tyr Asp Phe Asp Lys Ser Ala 5 10 TGG GAC ATC AAA GGG TCG ATC GCT CCG ATA CAA CCC ACC ACC TAC AGT 3518

Trp Asp lie Lys Gly Ser Ile Ala Pro Ile Gin Pro Thr Thr Tyr Ser 15 20 25 GAT GGC AGG CTG GTG CCC CAG GTC AGA GTC ATA GAT CCT GGT CTA GGC 3566

Asp Gly Arg Leu Vai Pro Gin Vai Arg Vai Ile Asp Pro Gly Leu Gly 30 35 40 GAC AGG AAG GAT GAA TGC TTT ATG TAC ATG TCT CTG CTG GGG GTT GTT 3614

Asp Arg Lys Asp Glu Cys Phe Met Tyr Met Ser Leu Leu Gly Vai Vai 45 50 55 GAG GAC AGC GAT CCC CTA GGG CCT CCA ATC GGG CGA GCA TTT GGG TCC 3662

Glu Asp Ser Asp Pro Leu Gly Pro Pro Ile Gly Arg Ala Phe Gly Ser 60 65 70 75 CTG CCC TTA GGT GTT GGC AGA TCC ACA GCA AAG CCC GAA AAA CTC CTC 3710

Leu Pro Leu Gly Vai Gly Arg Ser Thr Ala Lys Pro Glu Lys Leu Leu 80 85 90 AAA GAG GCC ACT GAG CTT GAC ATA GTT GTT AGA CGT ACA GCA GGG CTC 3758

Lys Glu Ala Thr Glu Leu Asp Ile Vai Vai Arg Arg Thr Ala Gly Leu 95 100 105 AAT GAA AAA CTG GTG TTC TAC AAC AAC ACC CCA CTA ACT CTC GTC ACA 3806

Asn Glu Lys Leu Vai Phe Tyr Asn Asn Thr Pro Leu Thr Leu Leu Thr 110 115 120 CCT TGG AGA AAG GTC CTA ACA ACA GGG AGT GTC TTC AAC GCA AAC CAA 3854

Pro Trp Arg Lys Vai Leu Thr Thr Gly Ser Vai Phe Asn Ala Asn Gin 125 130 135 GTG TGC AAT GCG GTT AAT CTG ATA CCG CTC GAT ACC CCG CAG AGG TTC 3902

Vai Cys Asn Ala Vai Asn Leu Ile Pro Leu Asp Thr Pro Gin Arg Phe 140 145 150 155 CGT GTT GTT TAT ATG AGC ATC ACC CGT CTT TCG GAT AAC GGG TAT TAC 3950

Arg Vai Vai Tyr Mel Ser Ile Thr Arg Leu Ser Asp Asn Gly Tyr Tyr 160 165 170 ACC GTT CCT AGA AGA ATG CTG GAA TTC AGA TCG GTC AAT GCA GTG GCC 3998

Thr Vai Pro Arg Arg Met Leu Glu Phe Arg Ser Vai Asn Ala Vai Ala 175 180 185 TTC AAC CTG CTG GTG ACC CTT AGG ATT GAC AAG GCG ATA GGC CCT GGG 4046

Phe Asn Leu Leu Vai Thr Leu Arg Ile Asp Lys Ala Ile Gly Pro Gly 190 195 200 AAG ATC ATC GAC AAT ACA GAG CAA CTT CCT GAG GCA ACA TTT ATG GTC 4094

Lys Ile Ile Asp Asn Thr Glu Gin Leu Pro Glu Ala Thr Phe Met Vai 205 210 215

84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 13 CAC ATC GGG AAC TTC AGG AGA AAG AAG AGT GAA GTC TAC TCT GCC GAT 4142

His Ite Gly Asn Phe Arg Arg Lys Lys Ser Glu Vai Tyr Ser Ala Asp 220 225 230 235 TAT TGC AAA ATG AAA ATC GAA AAG ATG GGC CTG GTT TTT GCA CTT GGT 4190

Tyr Cys Lys Met Lys Ile Glu Lys Met Gly Leu Vai Phe Ala Leu Gly 240 245 250 GGG ATA GGG GGC ACC AGT CTT CAC ATT AGA AGC ACA GGC AAA ATG AGC 4238

Gly Ile Gly Gly Thr Ser Leu His Ile Arg Ser Thr Gly Lys Met Ser 255 260 265 AAG ACT CTC CAT GCA CAA CTC GGG TTC AAG AAG ACC TTA TGT TAC CCG 4286

Lys Thr Leu His Ala Gin Leu Gly Phe Lys Lys Thr Leu Cys Tyr Pro 270 275 280 CTG ATG GAT ATC AAT GAA GAC CTT AAT CGA TTA CTC TGG AGG AGC AGA 4334

Leu Met Asp lie Asn Glu Asp Leu Asn Arg Leu Leu Trp Arg Ser Arg 285 2S0 295 TGC AAG ATA GTA AGA ATC CAG GCA GTT TTG CAG CCA TCA GTT CCT CAA 4382

Cys Lys Ile Vai Arg Ile Gin Ala Vai Leu Gin Pro Ser Vai Pro Gin 300 305 310 315 GAA TTC CGC ATT TAC GAC GAC GTG ATC ATA AAT GAT GAC CAA GGA CTA 4430

Glu Phe Arg Ile Tyr Asp Asp Vai Ile Ile Asn Asp Asp Gin Gly Leu 320 325 330 TTC AAA GTT CTG TAGACCGTAG TGCCCAGCAA TGCCCGAAAA CGACCCCCCT 4482

Phe Lys Vai Leu 335 CACAATGACA GCCAGAAGGC CCGGACAAAA AAGCCCCCTC CGAAAGACTC CACTGACCAA 4542 GCGAGAGGCC AGCCAGCAGC CGACGGCAAG CACGAACACC AGGCGGCCCC AGCACAGAAC 4602 AGCCCTGATA CAAGGCCACC ACCAGCCACC CCAATCTGCA TCCTCCTCGT GGGACCCCCG 4662 AGGACCAACC CCCAAGGCTG CCCCCGATCC AAACCACCAA CCGCATCCCC ACCACCCCCG 4722 GGAAAGAAAC CCCCAGCAAT TGGAAGGCCC CTCCCCCTCT TCCTCAACAC AAGAACTCCA 4782 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ λ 14 CAACCGAACC GCACAAGCGA CCGAGGTGAC CCAACCGCGC GGCATCCGAC TCCCTAGACA GATCCTCTCT CCCCGGCAAA CTAAACAAAA CTTAGGGCCA AGGAACATAC ACACCCAACA GAACCCAGAC CCCGGCCCAC GGCGCCGCGC CCCCAACCCC CGACAACCAG AGGGAGCCCC CAACCAATCC CGCCGGCTCC CCCGGTGCCC ACAGGCAGGG ACACCAACCC CCGAACAGAC CCAGCACCCA ACCATCGACA ATCCAAGACG GGGGGGCCCC CCCAAAAAAA GGCCCCCAGG GGCCGACAGC CAGCACCGCG AGGAAGCCCA CCCACCCCAC ACACGACCAC GGCAACCAAA CCAGAACCCA GACCACCCTG GCCACCAGCT CCCAGACTCG GCCATCACCC CGCAGAAAGG AAAGGCCACA ACCCGCGCAC CCCADCCCC5 AT£CGGCGGG GAGCCACCCA ACCCGAACCA GCACCCAAGA GCGATCCCCG AAGGACCCCC GAACCGCAAA GGACATCAGT ATCCCACAGC CTCTCCAAGT CCCCCGGTCT CCTCCTCTTC TCGAAGGGAC CAAAAGATCA ATCCACCACA CCCGACGACA CTCAACTCCC CACCCCTAAA GGAGACACCG GGAATCCCAG AATCAAGAC7 CATCCAATGT CCATC ATG GGT CTC AAG GTG AAC GTC TCT GCC ATA TTC ATG Met Gly Leu Lys Vai Asn Vai 5er Ala lie Phe Met 5 10 GCA GTA CTG TTA ACT CTC CAA ACA CCC ACC GGT CAA ATC CAT TGG GGC Ala Vai Leu Leu Thr Leu Gin Thr Pro Thr Gly Gin Ile His Trp Gly 15 20 25 AAT CTC TCT AAG ATA GGG GTG GTA GGA ATA GGA AGT GCA AGC TAC AAA Asn Leu Ser Lys Ile Gly Vai Vai Gly Ile Gly Ser Ala Ser Tyr Lys 30 35 40 GTT ATG ACT CGT TCC AGC CAT CAA TCA TTA GTC ATA AAA TTA ATG CCC Vai Met Thr Arg Ser Ser His Gin Ser Leu Vai Ile Lys Leu Met Pro 45 50 55 60 AAT ATA ACT CTC CTC AAT AAC TGC ACG AGG GTA GAG ATT GCA GAA TAC Asn Ile Thr Leu Leu Asn Asn Cys Thr Arg Vai Glu Ile Ala Glu Tyr 65 70 75 AGG AGA CTA CTG AGA ACA GTT TTG GAA CCA ATT AGA GAT GCA CTT AAT Arg Arg Leu Leu Arg Thr Vai Leu Glu Pro Ile Arg Asp Ata Leu Asn 80 85 90

4842 4902 4962 5022 5082 5142 5202 5262 5322 5382 5442 5493 5541 5589 5637 5685 5733

84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 15 GCA ATG ACC CAG ΑΑΤ ΑΤΑ AGA CCG GTT CAG AGT GTA GCT TCA AGT AGG 5781

Ala Met Thr Gin Asn lie Arg Pro Vai Gin Ser Vai Ala Ser Ser Arg 95 100 105 AGA CAC AAG AGA TTT GCG GGA GTA GTC CTG GCA GGT GCG GCC CTA GGC 5829

Arg His Lys Arg Phe Ala Gly Vai Vai Leu Ala Gly Ala Ala Leu Gly 110 115 120 GTT GCC ACA GCT GCT CAG ATA ACA GCC GGC ATT GCA CTT CAC CAG TCC 5877

Vai Ala Thr Ala Ala Gin lie Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gin Ser 125 130 135 140 ATG CTG AAC TCT CAA GCC ATC GAC AAT CTG AGA GCG AGC CTG GAA ACT 5925

Met Leu Asn Ser Gin Ala Ile Asp Asn Leu Arg Ala Ser Leu Glu Thr 145 150 155 ACT AAT CAG GCA ATT GAG GCA ATC AGA CAA GCA GGG CAG GAG ATG ATA 5973

Thr Asn Gin Ala Ile Glu Ala Ile Arg Gin Ala Gly Gin Glu Met Ile 160 165 170 TTG GCT GTT CAG GGT GTC CAA GAC TAC ATC AAT AAT GAG CTG ATA CCG 6021

Leu Ala Vai Gin Gly Vai Gin Asp Tyr Ile Asn Asn Glu Leu Ile Pro 175 180 185 TCT ATG AAC CAA CTA TCT TGT GAT TTA ATC GGC CAG AAG CTC GGG CTC 6069

Ser Met Asn Gin Leu Ser Cys Asp Leu Ile Gly Gin Lys Leu Gly Leu 190 195 200 AAA TTG CTC AGA TAC TAT ACA GAA ATC CTG TCA TTA TTT GGC CCC AGC 6117

Lys Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Glu Ile Leu Ser Leu Phe Gly Pro Ser 205 210 215 220 TTA CGG GAC rCC -ATA TCT GCG GAG ATA TCT ATC CAG GCT TTG AGC TAT 6165

Leu Arg Asp Pro Ile Ser Ala Glu Ile Ser Ile Gin Ala Leu Ser Tyr 225 230 235 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 16

GCG CTT GGA GGA GAC ATC ΑΑΤ AAG GTG Ala Leu Gly Gly Asp Ile Asn Lys Vai 240 245 GGA GGT GAT TTA CTG GGC ATC TTA GAG Gly Gly Asp Leu Leu Gly Ile Leu Glu 255 260 ATA ACT CAC GTC GAC ACA GAG TCC TAC Ile Thr His Vai Asp Thr Glu Ser Tyr 270 275 TAT CCG ACG CTG TCC GAG ATT AAG GGG Tyr Pro Thr Leu Ser Glu Ile Lys Gly 285 290 C-GG GTC TCG TAC A AC ATA GGC TCT CAA Gly Vai Ser Tyr Asn Ile Gly Ser Gin 305 AAG TAT GTT GCA ACC CAA GGG TAC CTT Lys Tyr Vai Ala Thr Gin Gly Tyr Leu 320 325 TCG TGT ACT TTC ATG CCA GAG GGG ACT Ser Cys Thr Phe Met Pro Glu Gly Thr 335 340 TAC CCG ATG AGT CCT CTG CTC CAA GAA Tyr Pro Met Ser Pro Leu Leu Gin Glu 350 355 TCC TGT GCT CGT ACA CTC GTA TCC GGG Ser Cys Ala Arg Thr Leu Vai Ser Gly 365 370 TTA GAA AAG CTC GGA TAC AGT 6213 Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Ser 250 AGC AGA GGA ATA AAG GCC CGG 6261 Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg 265 TTA ATT GTC CTC AGT ATA GCC 6309 Leu Ile Vai Leu Ser Ile Ala 280 GTG ATT GTC CAC CGG CTA GAG 6357 Vai Ile Vai His Arg Leu Glu 295 300 GAG TGG TAT ACC ACT GTG CCC 6405 Glu Trp Tyr Thr Thr Vai Pro 310 315 ATC TCG ΑΑΤ TTT GAT GAG TCA 6453 Ile Ser Asn Phe Asp Glu Ser 330 GTG TGC AGC CAA AAT GCC TTG 6501 Vai Cys Ser Gin Asn Ala Leu 345 TGC CTC CGG GGG TCC ACC AAG 6549 Cys Leu Arg Gly Ser Thr Lys 360 TCT TTT GGG AAC CGG TTC ATT 6597 Ser Phe Gly Asn Arg Phe Ile 375 380 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ . 17

ΤΤΑ TCA CAA GG6 AAC CTA ΑΤΑ GCC AAT TGT GCA TCA ATC CTT TGC AAG Leu Ser Gin Gly Asn Leu Ile Ata Asn Cys Ata' 5er I le Leu Cys Lys 6545 365 TGT TAC ACA ACA GGA ACG ATC ATT Cys Tyr Thr Thr Gty Thr Ile Ile 400 ACA TAC ATT GCT GCC GAT CAC TGC Thr Tyr Ile Ala Ata Asp His Cys 415 420 ACC ATC CAA GTC GGG AGC AGG AGG Thr Ile Gin Vat Gly Ser Arg Arg 430 435 AGA ATT GAC CTC GGT CCT CCC ATA Arg lie Asp Leu Gly Pro Pro Ile 445 450 ACA AAT CTG GGG AAT GCA ATT GCT Thr Asn Leu Gly Asn Ata ite Ata 465 TTG GAG TCA TCG GAC CAG ATA TTG Leu Glu Ser Ser Asp Gin Ile Leu 480 ACT TGC ATA GTC TAC ATC CTG ATT Thr Cys Ile Vai Tyr Ile Leu Ile 495 500 GGG ATC CCC GCT TTA ATA TGT TGC Gly Ile Pro Ala Leu Ite Cys Cys 510 515 390 395 AAT CAA GAC CCT GAC AAG ATC CTA Asn Gin Asp Pro Asp Lys I le Leu 405 410 CCG GTA GTC GAG GTG AAC GGC GTG Pro Vai Vai Glu Vai Asn Gly Vai 425 TAT CCA GAC GCT GTG TAC TTG CAC Tyr Pro Asp Ata Vai Tyr Leu His 440 TTA TTG GAG AGG TTG GAC GTA GGG Leu Leu Glu Arg Leu Asp Vai Gly 455 460 AAG TTG GAG GAT GCC AAG GAA TTG Lys Leu Glu Asp Ala Lys Glu Leu 470 475 AGG AGT ATG AAA GGT TTA TCG AGC Arg Ser Met Lys Gly Leu Ser Ser 485 490 GCA GTG TGT CTT GGA GGG TTG ATA Ala Vai Cys Leu Gly Gly Leu Ite 505 TGC AGG GGG CGT TGT AAC AAA AAG Cys Arg Gly Arg Cys Asn Lys t-ys 6693 6741 6789 6837 6885 6933 6981 7029 520 18 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ GGA GAA CAA GTT GGT ATG TCA AGA CCA GGC CTA AAG CCT GAT CTT ACG Gly Glu Gin Vai Gly Met Ser Arg Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Thr 525 530 535 540 GGA ACA TCA AAA TCC TAT GTA AGG TCG CTC TGATCCTCTA CAACTCTTGA Gly Thr Ser Lys Ser Tyr Vai Arg Ser Leu 545 550 AACACAAATG TCCCACAAGT CTCCTCTTCG TCATCAAGCA ACCACCGCAC CCAGCATCAA GCCCACCTGA AATTATCTCC GGCTTCCCTC TGGCCGAACA ATATCGGTAG TTAATTAAAA CTTAGGGTGC AAGATCATCC ACA ATG TCA CCA CAA CGA GAC CGG ATA AAT GCC Met Set Pro Gin Arg Asp Arg I le Asn Ala 5 10 TTC TAC AAA GAT AAC CCC CAT CCC AAG GGA AGT AGG ATA GTC ATT AAC Phe Tyr Lys Asp Asn Pro His Pro Lys Gly Ser Arg Ile Vai lie Asn 15 20 25 AC-A GAA CAT CTT ATG ATT GAT AGA CCT TAT GTT TTG. CTG GCT GTT CTG Arg Glu His Leu Met Ile Asp Arg Pro Tyr Vai Leu Leu Ala Vai Leu 30 25 40 TTT GTC ATG TT7 CTG AGC TTG ATC GGG TTG CTA GCC ATT GCA GGC ATT Phe Yal Met Phe Leu Ser Leu Ile Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ile 45 50 55 AGA CTT CAT CGG GCA GCC ATC TAC ACC GCA GAG ATC CAT AAA AGC CTC Arg Leu His Arg Ala Ala Ile Tyr Thr Ala Glu Ile His Lys Ser Leu 60 65 70 AGC ACC AAT CTA GAT GTA ACT AAC TCA ATC GAG CAT CAG GTC AAG GAC Ser Thr Asn Leu Asp Vai Thr Asn Ser Ile Glu His Gin Vai Lys Asp 75 80 85 90 GTG CTG ACA CCA CTC TTC AAA ATC ATC GGT GAT GAA GTG GGC CTG AGG Vai Leu Thr Pro Leu Phe Lys Me Ile Gly Asp Glu Vai Gly Leu Arg 7077 7127 7187 7247 7300 7348 7396 7444 74 92 7540 7588 95 100 105 19 84 .196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ ACA CCT CAG AGA Thr Pro Gin Arg 110 AAA TTC CTT AAT Lys Phe Leu Asn125 TGT ATG AAC CCG Cys Ne Asn Pr o UO GCA GAT GTG GCT Ala. Asp Vai Ala155 CIA CTG GAG ACC Leu Leu Glu Thr AAC TGC TCA GGG Asn Cys Ser Gly190 CTG TCC CTG TTA Leu Ser Leu Leu 205 ATA GTC ACT ATG Ile Vat Thr Met 220 GAA AAG CCT AAT Glu Lys Pro Asn235 TTC ACT GAC CTA Phe Thr Asp Leu CCG GAT AGG GAG Pro Asp Arg Glu130 CCA GAG AGA ATC Pro Glu Arg Ile 145 GCT GAA GAG CTC Ala Glu Glu Leu1S0 AGA ACA ACC AAT Arg Thr Thr Asn175 CCC ACT ACA ATC Pro Thr Thr Ile GAC TTG TAT TTA Asp Leu Tyr Leu 210 ACA TCC CAG GGA Thr Ser Gin Gly225 CTG AGC AGC AAA Leu Ser Ser Lys240 GTG AAA TTC ATC Vai Lys Phe Ile 115 TAC GAC TTC AGA Tyr Asp Phe Arg AAA TTG GAT TAT Lys Leu. Asp Tyr 150 ATG AAT GCA TTG Met Asn Ala Leu165 CAG TTC CTA GCT Gin Phe Leu Ala 160 AGA GGT CAA TTC Arg Gly Gin Phe195 GGT CGA GGT TAC Gly Arg Gly Tyr ATG TAT GGG GGA Met Tyr Gly Gly230 AGG TCA GAG TTG Arg Ser Glu Leu 245 TCT GAC AAG ATT Ser Asp Lys Ile 120 GAT CTC ACT TGG Asp Leu Thr Trp135 GAT CAA TAC TGT Asp Gin Tyr Cys GTG AAC TCA ACT Vai Asn Ser Thr170 GTC TCA AAG GGA Vai Ser Lys Gly185 TCA AAC ATG TCG Ser Asn Met Ser 200 AAT GTG TCA TCT Asn Vai Ser Ser215 ACT TAC CTA GTG Thr Tyr Leu Vai TCA CAA CTG AGC Ser Gin Leu Ser250 7636 7684 7722 7780 7828 7876 7924 7972 8020 » 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ ί 20

ATG TAC CGA GTG ΤΤΤ GAA GTA GGT GTT ATC AGA ΑΑΤ CCG GGT TTG GGG Met Tyr Arg Vai Phe Glu Vai Gly Vai Ile Arg Asn Pro Gly Leu Gly 255 260 265 GCT CCG GTG TTC· CAT ATG ACA AAC TAT CTT GAG CAA CCA GTC AGT AAT Ala Pro Yal Phe Kis Met Thr Asn Tyr Leu Glu Gin Pro Vai Ser Asn 270 275 280 GAT CTC AGC AAC TGT ATG GTG GCT TTG GGG GAG CTC AAA CTC GCA GCC Asp Leu Ser Asn Cys Met Vai Ala Leu Gly Glu Leu Lys Leu Ala Ala 285 2S0 295 CTT TGT CAC CGG GAA GAT TCT ATC ACA ATT CCC TAT CAG GGA TCA GGG Leu Cys His Arg Glu Asp Ser Ile Thr Ile Pro Tyr Gin Gly Ser Gly 300 305 310 AAA GGT GTC AGC TTC CAG CTC GTC A AG CTA GGT GTC TGG AAA TCC CCA Lys Gly Vai Ser Phe Gin Leu Vai Lys Leu Gly Vai Trp Lys Ser Pro 315 320 325 330 ACC GAC ATG CAA TCC TGG GTC ACC TTA TCA ACG GAT GAT CCA GTG ATA Thr Asp Met Gin Ser Trp Vai Thr Leu Ser Thr Asp Asp Pro Vai Ile 335 340 345 8068 8116 8164 8212 6260 8308 GAC AGG CTT TAC CTC TCA TCT CAC AGA GGT GTT ATC GCT GAC AAT CAA Asp Arg Leu Tyr Leu Ser Ser His Arg Gly Vai Ile Ala Asp Asn Gin 350 355 360 GCA AAA TGG GCT GTC CCG ACA ACA CGA ACA GAT GAC AAG TTG CGA ATG Ala Lys Trp Ala Vai Pro Thr Thr Arg Thr Asp Asp Lys Leu Arg Met 365 370 375 GAG ACA TGC TTC CAA CAG GCG TGT AAG GGT AAA ATC CAA GCA CTC TGC Glu Thr Cys Phe Gin Gin Ata Cys Lys Gly Lys Ile Gin Ala Leu Cys 8356 8404 8452 380 385 390 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 21

GAG ΑΑΤ CCC GAG TGG GCA CCA TTG AAG GAT AAC AGG ATT CCT TCA TAC Glu Asn Pro Glu Trp Ala Pro Leu Lys Asp Asn Arg Ile Pro Ser Tyr 395 400 405 410 GGG GTC TTG TCT GTT GAT CTG AGT CTG ACA GTT GAG CTT AAA ATC AAA Gly Vai Leu Ser Vai Asp Leu Ser Leu Thr Vai Glu Leu Lys Ile Lys 415 420 425 ATT GCT TCG GGA TTC GGG CCA TTG ATC ACA CAC GGT TCA GGG ATG GAC lie Ala Ser Gly Phe Gly Pro Leu Ile Thr His Gly Ser Gly Met Asp 430 435 440 CTA TAC AAA TCC AAC CAC AAC AAT GTG TAT TGG CTG ACT ATC CCA CCA Leu Tyr Lys Ser Asn His Asn Asn Vai Tyr Trp Leu Thr Ile Pro Pro 445 450 455 ATG AAG AAC CTA GCC TTA GGT GTA ATC AAC ACA TTG GAG TGG ATA CCG Met Lys Asn Leu Ala Leu Gly Vai Ile Asn Thr Leu Glu Trp Ile Pro 430 435 470 AGA TTC AAG GTT AGT CCC TAC CTC TTC AAT GTC CCA ATT AAG GAA GCA Arg Phe Lys Vai Ser Pro Tyr Leu Phe Asn Vai Pro Ile Lys Glu Ala 475 480 485 490 GGC GAA GAC TGC CAT GCC CCA ACA TAC CTA CCT GCG GAG GTG GAT GGT Gly Glu Asp Cys His Ala Pro Thr Tyr Leu Pro Ala Glu Vai Asp Gly 495 500 505 GAT GTC AAA CTC AGT TCC AAT CTG GTG ATT CTA CCT GGT CAA GAT CTC Asp Vai Lys Leu Ser Ser Asn Leu Vai lie Leu Pro Gly Gin Asp Leu 510 515 520 CAA TAT GTT TTG GCA ACC TAC GAT ACT TCC AGG GTT GAA CAT GCT GTG Gin Tyr Vai Leu Ala Thr Tyr Asp Thr Ser Arg Vai Glu His Ala Vai 8500 854 8 8596 8344 8592 8740 8788 8836 8884 525 530 535 22 22 & 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ GTT ΤΑΤ TAC GTT 7AC AGC CCA AGC CGC TCA ΤΤΤ TCT TAC ΤΤΤ ΤΑΤ CCT 8932

Vai Tyr Tyr Vai Tyr Çer Pro Ser Arg Ser Phe Ser Tyr Phe Tyr Pro 540 545 550 TTT AGG TTG CCT ATA AAG GGG GTC CCC ATC GAA TTA CAA GTG GAA TGC 8980

Phe Arg Leu Pro Ile Lys Gly Vai Pro Ile Glu Leu Gin Vai Glu Cys 555 560 565 570 TT£ ACA TGG GAC CAA AAA £7£ TGG TGC CGT CAC TTC TGT GTG CTT GCG 9028

Phe Thr Trp Asp Gin Lys Leu Trp Cys Arg His Phe Cys Vai Leu Ala 575 580 585 GAC TCA GAA TCT GGT GGA CAT ATC ACT CAC TCT GGG ATG GTG GGC ATG 9076

Asp Ser Glu Ser Gly Gly His lie Thr His Ser Gly Met Vai Gly Met 590 595 600 GGA GTC AGC TGC ACA GTC ACC CGG GAA GAT GGA ACC AAT CGC AGA 9121

Gly Vai Ser Cys Thr Vai Thr Arg Glu Asp Gly Thr Asn Arg Arg 605 610 615 TAGGGCTGCT AGTGAACTAA TCT C ATG ATG TCACCCAGAC ATCAC-GCATA CCCACTAGTG 9181 TGAAATAGAC ATCAGAATTA AGAAAAACGT AGGGTCCAAG TGGTTCCCCG TT ATG GAC 9239

Met Asp TCG CTA TCT GTC AAC CAG ATC TTA TAC CCT GAA GTT CAC CTA GAT AGC 9287

Ser Leu Ser Vat Asn Gin lie Leu Tyr Pro Glu Vai His Leu Asp Ser 5 10 15 CCG ATA GTT ACC AAT AAG ATA GTA GCC ATC CTG GAG TAT GCT CGA GTT 9335

Pro lie Vai Thr Asn Lys Ile Vai Ala Ile Leu Glu Tyr Ala Arg Vai 20 25 30 CCT CAC GCT TAC AGC CTG GAG GAC CCT ACA CTG TGT CAG AAC ATC AAG 9383

Pro His Ala Tyr Ser Leu Glu Asp Pro Thr Leu Cys Gin Asn Ile Lys 50 45 35 40 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 23

CAA ATG ATT ATA AAC AAT GTG 9431 Gin Met lie Ile Asn Asn Vai 60 65 CTT AGG AGT TAT CCG GCC CAC 9479 Leu Arg Ser Tyr Pro Ala His 80 CAG GAT TTA TTT AAC ATA GAA 9527 Gin Asp Leu Phe Asn Ile Glu 95 GAA CTC CTC AAA AAG GGG AAT 9575 Glu Leu Leu Lys Lys Gly Asn 110 GTT TTC CAA TGC TTA AGG GAC 9623 Vai Phe Gin Cys Leu Arg Asp 125 130 GAA TTG AGG GAG GAC ATC AAG 9671 Glu Leu Arg Glu Asp Ile Lys M0 145 ATG CAC AGC TCC CAG TGG TTT 9719 Met His Ser Ser Gin Trp Phe 160 AAG ACT GAG ATG AGG TCA GTG 9767 Lys Thr Glu Met Arg Ser Vai 175 AGG AGG AGA CAC ACA CCT GTA 9815 Arg Arg Arg His Thr Pro Vai

CAC CGC CTA ΑΑΑ AAC GGA TXT TCC AAC

His Arg Leu Lys Asn Gly Phe Ser Asn 55

GAA GTT GGG AAT GTC ATC AAG TCC AAG

Glu Vat Gly Asn Vai Ile Lys Ser Lys 70 75

TCT CAT ATT CCA TAT CCA AAT TGT AAT

Ser His Ite Pro Tyr Pro Asn Cys Asn 85 90 GAC AAA GAG TCA ACG AGG AAG ATC CGT Asp Lys Glu Ser Thr Arg Lys Ile Arg 100 105 TCG CTG TAC TCC AAA GTC AGT GAT AAG Ser Leu Tyr Ser Lys Vai Ser Asp Lys 115 120

ACT AAC TCA CGG CTT GGC CTA GGC TCC

Thr Asn Ser Arg Leu Gly Leu Gly Ser 135 GAG AAA GTT ATT AAC TTG GGA GTT TAC Glu Lys Vai Ile Asn Leu Gly Vai Tyr 150 155 GAG CCA TTT CTG TTT TGG TTT ACA GTC Glu Pro Phe Leu Phe Trp Phe Thr Vai 165 170 ATT AAA TCA CAA ACC CAT ACT TGC CAT Ite Lys Ser Gin Thr His Thr Cys His 180 185 190 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 24

TTC TTC ACT GGT AGT TCA GTT GAG TTG CTA ATC TCT CGT GAC CTT GTT 9863

Phe Phe Thr Gly Ser Ser Vai Glu Leu Leu Ite Ser Arg Asp Leu Vai 195 200 205 210 GCT ATA ATC AGT AAA GAG TCT CAA CAT GTA TAT TAC CTG ACA TTT GAA 9911

Ala Ile Ile Ser Lys Glu Ser Gin His Vai Tyr Tyr Leu Thr Phe Glu 215 220 225 CTG GTT TTG ATG TAT TGT GAT GTC ATA GAG GGG AGG TTA ATG ACA GAG 9959

Leu Vai Leu Met Tyr Cys Asp Vai Ile Glu Gly Arg Leu Met Thr Glu 230 235 240 ACC GCT ATG ACT ATT GAT GCT AGG TAT ACA GAG CTT CTA GGA AGA GTC 10007

Thr Ala Mel Thr I le Asp Ata Arg Tyr Thr Glu Leu Leu Gly Arg Vai 245 250 255 AGA TAC ATG TGG AAA CTG ATA GAT GGT TTC TTC CCT GCA CTC GGG AAT 10055

Arg Tyr Met Trp Lys Leu Ile Asp Gly Phe Phe Pro Ala Leu Gly Asn 260 265 270 CCA ACT TAT CAA ATT GTA GCC ATG CTG GAG CCT CTT TCA CTT GCT TAC 10103

Pro Thr Tyr Gin Ile Vai Ala Met Leu Glu Pro Leu Ser Leu Ala Tyr 275 280 285 290 CTG CAG CTG AGG GAT ATA ACA GTA GAA CTC AGA GGT GCT TTC CTT AAC 10151

Leu Gin Leu Arg Asp Ile Thr Vai Glu Leu Arg Gly Ala Phe Leu Asn 295 300 305 CAC TGC TTT ACT GAA ATA CAT GAT GTT CTT GAC CAA AAC GGG TTT TCT 10199

His Cys Phe Thr Glu Ile His Asp Vâl Leu Asp Gin Asn Gly Phe Ser 310 315 320 GAT GAA GGT ACT TAT CAT GAG TTA ATT GAA GCT CTA GAT TAC ATT TTC 10247

Asp Glu Gly Thr Tyr His Glu Leu Ile Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Phe 325 330 335

84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 25 CTG ACA GGG GAG ATT TTC Leu Thr Gly Glu Ile Phe 345 350 CTT GAA GCA GTA ACG GCT Leu Glu Ala Vai Thr Ala 365 CCT AAA GTC ATT GTG TAT Pro Lys Vai Ile Vai Tyr 380 TGT GGA ATC ATA ATC AAC Cys Gly Ile lie Ile Asn 395 CCA CCG CTG ACC CTC CCC Pro Pro Leu Thr Leu Pro 410 CAA GCT TCA GGT GAA GGG Gin Ala Ser Gly Glu Gly 425 430 AAA TCT TTT GCT GGA GTG Lys Ser Phe Ala Gly Vai 445 GAT AGT GAT CTG ACA ATG Asp Ser Asp Leu Thr Met 460 CAA AGG GAA TGG GAT TCA Gin Arg Glu Trp Asp Ser 475 ΑΤΑ ACT GAT GAC ΑΤΑ CAT Ile Thr Asp Asp 1le H is 340 AGT TTC GGC CAC CCC AGA Ser Phe Gly His Pro Arg 355 360 AGG AAA TAC ATG AAT CAG Arg Lys Tyr Met Asn Gin 375 AAA GGT CAT GCC ATA TTT Lys Gly His Ala Ile Phe 390 AGG CAC GGA GGC AGT TGG Arg His Gly Gly Ser Trp 405 GAC ACA ATC CGG AAT GCT Asp Thr Ile Arg Asn Ala 420 CAG TGC GTT GAT AAC TGG Gin Cys Vai Asp Asn Trp 435 440 TTT ATG CCT CTT AGC CTG Phe Met Pro Leu Ser Leu 455 AAG GCA CTT GCT GCT CTC Lys Ala Leu Ala Ala Leu 470 TCA TTT TTC AGA 10296 Ser Phe Phe Arg GCT GAA AAT GTT 10343

Ala Glu Asn Vai 370 GAG ACT CTG ATG 10391

Glu Thr Leu Met 385 GGC TAT CGT GAC 10439

Gly Tyr Arg Asp 400 CTG CAT GCT GCA 10487

Leu His Ala Ala 415 TTA ACA CAT GAG 10535

Leu Thr His Glu AAA TTT GGC TGC 10583

Lys Phe Gly Cys 450 TAC CTA AAG GAC 10631

Tyr Leu Lys Asp 465 GTT TAC CCG AAA 10679

Vai Tyr Pro Lys 480

84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 26

GAG TTC CTG CGT TAC GAC CCT CCC AAG Glu Phe Leu Arg Tyr Asp Pro Pro Lys 485 490 GTA GAT GTT TTC CTT AAT GAT TCG AGC Vai Asp Vai Phe Leu Asn Asp Ser Ser 500 505 ATG TAT GTT GTA AGT GGA GCT TAC CTC Met Tyr Vai Vai Ser Gly Ala Tyr Leu 515 520 TCT TAC AGC CTG AAA GAA AAG GAG ATC Ser Tyr Ser Leu Lys Glu Lys Glu lie 535 GCT AAA ATG ACT TAC AAA ATG AGG GCA Ala Lys Met Thr Tyr Lys Met Arg Ala 550 555 CTA ATC TCA AAC GGG ATT GGC AAA TAT Leu Ile Ser Asn Gly Ile Gly Lys Tyr 565 570 AAG GAT GAG CAC GAT TTG ACT AAG GCA Lys Asp Glu His Asp Leu Thr Lys Ata 580 585 GGA GTC CCC AAA GAT CTC AAA GAA AGT Gly Vai Pro Lys Asp Leu Lys Glu Ser 595 600 AAA ACC TAC TCC CGA AGC CCA GTC CAC Lys Thr Tyr Ser Arg Ser Pro Vai His GGA ACC GGG TCA CGG AGG CTT 10727 Gly Thr Gly Ser Arg Arg Leu 495 TTT GAC CCA TAT GAT GTG ATA 10775 Phe Asp Pro Tyr Asp Vai lie 510 CAT GAC CCT GAG TTC AAC CTG 10823 His Asp Pro Glu Phe Asn Leu 525 530 AAG GAA ACA GGT AGA CTT TTT 10871 Lys Glu Thr Gly Arg Leu Phe 540 545 TGC CAA GTG ATT GCT GAA AAT 10919 Cys Gin Vai lie Ala Glu Asn 560 TTT AAG GAC AAT GGG ATG GCC 10967 Phe Lys Asp Asn Gly Met Ala 575 CTC CAC ACT CTA GCT GTC TCA 11015 Leu His Thr Leu Ala Vai Ser 590 CAC AGG GGG GGG CCA GTC TTA 11063 His Arg Gly Gly Pro Vai Leu 605 610 ACA AGT ACC AGG AAC GTG AG A Π111

Thr Ser Thr Arg Asn Vai Arg 615 620 625

84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 27 GGG TTC CCT CAA GTA ATT Gly Phe Pro Gin Vai Ile 635 AAT ATG GAA GCT TAC GAG Asn Met Glu Ala Tyr Glu 650 AAG AAG TAC TGC CTT AAT Lys Lys Tyr Cys Leu Asn 665 670 CAG AGG CTA AAT GAG ATT Gin Arg Leu Asn Glu Ile 685 CAT AAG AGG CTT GAG ACC His Lys Arg Leu Glu Thr 700 CCC CCC GAC CTT GAC GCC Pro Pro Asp Leu Asp Ala 715 CAA ATC TTC ATT AAG TAC Gin Ile Phe Ile Lys Tyr 730 AAG CTG TGG ACC ATC AGC Lys Leu Trp Thr Ile Ser 745 750 GAG AGC GGA GTA AGG ATT Glu Ser Gjy Vai Arg Ile GCA GCA ΑΑΑ GGG ΤΤΤ ΑΤΑ Ala Ala Lys Gly Phe Ile 630 GAC ACT GAT CAT CCG GAG Asp Thr Asp His Pro Glu 645 TTT ATC ACG ACT GAT CTC Phe Ile Thr Thr Asp Leu 660 ACC ATC AGC TTG TTT GCA Thr Ile Ser Leu Phe Ala 675 680 TCA TTT TTC CAG TGG CTG Ser Phe Phe Gin Trp Leu 695 GTA AGT GAC CCT CAT TGC Vai Ser Asp Pro His Cys 710 TAT AAA GTC CCC AAT GAT Tyr Lys Vai Pro Asn Asp 725 ATA GAA GGG TAT TGT CAG Ile Glu Gly Tyr Cys Gin 740 CTA TAC CTG GCT GCT TAT Leu Tyr Leu Ala Ala Tyr 755 760 CGG CAG GAC CAA 1]

Arg Gin Asp Gln 640 ACA GTC AGT GCA 11207

Thr Vai Ser Ala 655 TGG AGA TAT GAG Π255

Trp Arg Tyr Glu TAC GGA TTG CCC 11303

Tyr Gly Leu Pro 690 TCT GTC CTG TAT 11351

Ser Vai Leu Tyr 705 CAT ATC CCG TTA 11399

His lie Pro Leu 720 CCT ATG GGA GGT Π447

Pro Met Gly Gly 735 ACC ATT CCC TAT 11495

Thr Ile Pro Tyr GCT TCG TTA GTG 11543

Ala Ser l-eu Vai 770 765 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 28 CAA GGG GAC ΑΑΤ CAG ACC ΑΤΑ GCC GTA Gtn Gly Asp Asn Gin Thr Ile Ala Vai 775

TGG CCC TAC AAC CTT AAG AAA CGG GAA

Trp Pro Tyr Asn Leu Lys Lys Arg Glu 790 795

TAC ITT GTA ATT CTT AGG CAA AGG CTA

Tyr Phe Vat Ile Leu Arg Gin Arg Leu 805 810

AAG GCA AAT GAG ACA ATT GTT TCA TC A

Lys Ala Asn Glu Thr Ile Vat Ser Ser 820 825

GGA ATA TAT TAT GAT GGG CTA CTT GTG

Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Leu Leu Vai 835 840

GCA AGA TGT GTA TTC TGG TCA GAG ACT

Ala Arg Cys Vai Phe Trp Ser Glu Thr 855

GCA TGC AGT AAT ATT GCT ACA ACA ATG

Ala Cys Ser Asn Ile Ala Thr Thr Met 870 875

TAT GAC CGT TAC CTT GCA TAT TCC CTG

Tyr Asp Arg Tyr Leu Ala Tyr Ser Leu 885 890

CAA ATT CTG ATC TCT CTT GGC TTC ACA

Gin Ile Leu Ile Ser Leu Gly Phe Thr 900 905

ACA AAA AGG GTA CCC AGC ACA 1 1591 Thr Lys Arg Vai Pro Ser Thr 780 785 GCT GCT AGA GTA ACT AGA GAT 11639 Ala Ala Arg Vai Thr Arg Asp 800 CAT GAT ATT GGC CAT CAC CTC 11687 His Asp lie Gly His His Leu 815 CAT TTT TTT GTC TAT TCA AAA 11735 His Phe Phe Vai Tyr Ser Lys 830 TCC CAA TCA CTC AAG AGC ATC 11783 Ser Gin Ser Leu Lys Ser Ile 845 850 ATA GTT GAT GAA ACA AGG GCA 11831 Ile Vai Asp Glu Thr Arg Ala 860 865 GCT AAA AGC ATC GAG AGA GGT 11879 Ala Lys Ser Ile Glu Arg Gly 880 AAC GTC CTA AAA GTG ATA CAG 11927 Asn Vai Leu Lys Vai Ile Gtn 895 ATC AAT TCA ACC ATG ACC CGG 11975 Ile Asn Ser Thr Mel Thr Arg 910 ΕΡ 0 540 135/ΡΤ 29 GAT GTA GTC ΑΤΑ CCC CTC CTC ACA AAC AAC GAC CTC TTA ΑΤΑ AGG ATG Asp Vai Vai Ile Pro Leu Leu Thr Asn Asn Asp Leu Leu l le Arg Met 915 920 925 930 12023 GCA CTG TTG CCC GCT CCT ATT GGG GGG ATG AAT TAT CTG AAT ATG AGC Ala Leu Leu Pro Ala Pro Ile Gly Gly Met Asn Tyr Leu Asn Met Ser 935 940 945 12071 AGG CTG TTT GTC AGA AAC ATC GGT GAT CCA GTA ACA TCA TCA ATT GCT Arg Leu Phe Vai Arg Asn Ile Gly Asp Pro Vai Thr Ser Ser Ile Ala 950 955 960 12119 GAT CTC AAG AGA ATG ATT CTC GCC TCA CTA ATG CCT GAA GAG ACC CTC Asp Leu Lys Arg Met Ile Leu Ala Ser Leu Met Pro Glu Glu Thr Leu 965 970 975 12167 CAT CAA GTA ATG ACA CAA CAA CCG GGG GAC TCT TCA TTC CTA GAC TGG His Gin Yal Met Thr Gin Gin Pro Gly Asp Ser Ser Phe Leu Asp Trp 980 965 990 12215 GCT AGC GAC CCT TAC TCA GCA AAT CTT GTA TGT GTC CAG AGC ATC ACT Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Ala Asn Leu Vai Cys Vat Gin Ser Ile Thr 995 1000 1005 1010 12263 AGA CTC CTC AAG AAC ATA ACT GCA AGG TTT GTC CTG ATC CAT AGT CCA Arg Leu Leu Lys Asn Ile Thr Ala Arg Phe Vai Leu Ile His Ser Pro 1015 1020 1025 12311 AAC CCA ATG TTA AAA GGA TTA TTC CAT GAT GAC AGT AAA GAA GAG GAC Asn Pro Met Leu Lys Gly Leu Phe His Asp Asp Ser Lys Glu Glu Asp 1030 1 035 1040 12359 GAG GGA CTG GCG GCA TTC CTC ATG GAC AGG CAT ATT ATA GTA CCT AGG Glu Gly Leu Ala Ala Phe Leu Met Asp Arg His lie Ile Vai Pro Arg 1045 1050 1055 12407 1055

84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 30 GCA GCT CAT GAA ATC CTG GAT CAT AGT G7C ACA GGG GCA AGA GAG TCT 12455

Ala Ala His Glu Ile Leu Asp His Ser Vai Thr Gly Ala Arg Glu Ser 1060 1065 1070 ATT GCA GGC ATG CTG GAT ACC ACA AAA GGC CTG ATT CGA GCC AGC ATG 12503

Ile Ala Gly Met Leu Asp Thr Thr Lys Gly Leu Ile Arg Ala Ser Met 1075 1080 1085 1090 AGG AAG GGG GGG TTA ACC TCT CGA GTG ATA ACC AGA TTG TCC AAT TAT 12551

Arg Lys Gly Gly Leu Thr Ser Arg Vai Ile Thr Arg Leu Ser Asn Tyr 1095 1100 1105 GAC TAT GAA CAA TTC AGA GCA GGG ATG GTG CTA TTG ACG GGA AGA AAG 12599

Asp Tyr Glu Gin Phe Arg Ala Gly Met Vai Leu Leu Thr Gly Arg Lys 1110 1115 1120 AGA AAT GTC CTC ATT GAC AAA GAG TCA TGT TCA GTG CAG CTG GCG AGA 12647

Arg Asn Vai Leu Ile Asp Lys Glu Ser Cys Ser Vai Gin Leu Ala Arg 1125 1130 1135 GCT CTA AGA AGC CAT ATG TGG GCG AGG CTA GCT CGA GGA CGG CCT ATT 12695

Ala Leu Arg Ser His Met Trp Ala Arg Leu Ala Arg Gly Arg Pro Ile 1140 1145 1150 TAC GGC CTT GAG GTC CCT GAT GTA CTA GAA TCT ATG CGA GGC CAC CTT 12743

Tyr Gly Leu Glu Vai Pro Asp Vai Leu Glu Ser Met Arg Gly His Leu 1155 1160 1165 1170 ATT CGG CGT CAT GAG ACA TGT GTC ATC TGC GAG TGT GGA TCA GTC AAC 12791

Ile Arg Arg His Glu Thr Cys Vai Ile Cys Glu Cys Gly Ser Vai Asn 1175 1180 1185 TAC GGA TGG TTT TTT GTC CCC TCG GGT TGC CAA CTG GAT GAT ATT GAC 12839

Tyr Gly Trp Phe Phe Vai Pro Ser Gly Cys Gin Leu Asp Asp Ile Asp 1190 1195 1200 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 31

AAG GAA ACA TCA TCC TTG AGA GTC CCA ΤΑΤ ATT GGT TCT ACC ACT GAT 12ΘΘ7

Lys Glu Thr Ser Ser Leu Arg Vai Pro Tyr Ile Gly Ser Thr Thr Asp 1205 1210 1215 GAG AGA ACA GAC ATG AAG CTT GCC TTC GTA AGA GCC CCA AGT CGA TCC 12S35

Glu Arg Thr Asp Met Lys Leu Ala Phe Vai Arg Ala Pro Ser Arg Ser 1220 1225 1230 TTG CGA TCT GCT GTT AGA ATA GCA ACA GTG TAC TCA TGG GCT TAC GGT 12983

Leu Arg Ser Ala Vai Arg Ile Ala Thr Vai Tyr Ser Trp Ala Tyr Gly 1235 1240 1245 1250 GAT GAT GAT AGC TCT TGG AAC GAA GCC TGG TTG TTG GCT AGG CAA AGG 13031

Asp Asp Asp Ser Ser Trp Asn Glu Ala Trp Leu Leu Ala Arg Gin Arg 1255 1260 1265 GCC AAT GTG AGC CTG GAG GAG CTA AGG GTG ATC ACT CCC ATC TCA ACT 13079

Ala Asn Vai Ser Leu Glu Glu Leu Arg Vai Ile Thr Pro Ile Ser Thr 1270 1275 1280 TCG ACT AAT TTA GCG CAT AGG TTG AGG GAT CGT AGC ACT CAA GTG AAA 13127

Ser Thr Asn Leu Ala His Arg Leu Arg Asp Arg Ser Thr Gin Vai Lys 1285 1290 1295 TAC TCA GGT ACA TCC CTT GTC CGA GTG GCG AGG TAT ACC ACA ATC TCC 13175

Tyr Ser Gly T.hr Ser Leu Yal Arg Vai Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Ser 1300 1305 1310 AAC GAC AAT CTC TCA TTT GTC ATA TCA GAT AAG AAG GTT GAT ACT AAC 13223

Asn Asp Asn Leu Ser Phe Vai Ile Ser Asp Lys Lys Vai Asp Thr Asn 1315 1320 1325 1330 TTT ATA TAC CAA CAA GGA ATG CTT CTA GGG TTG GGT GTT TTA GAA ACA 13271

Phe Ile Tyr Gin Gin Gly Met Leu Leu Gly Leu Gly Vai Leu Glu Thr 1335 1340 1345 84 196 ΗΡ Ο 540 135/ΡΤ 32

TTG ΤΤΤ CGA CTC GAG ΑΑΑ GAT ACC GGA TCA TCT AAC ACG GTA ΤΤΑ CAT 13319

Leu Phe Arg Leu GIu Lys Asp Thr Gly Ser Ser Asn Thr Vai Leu Hls 1350 1355 1360 CTT CAC GTC GAA ACA GAT TGT TGC GTG ATC CCG ATG ATA GAT CAT CCC Leu His Vai Glu Thr Asp Cys Cys Vai Ile Pro Met 1le Asp His Pro 1365 1370 1375 AGG ATA CCC AGC TCC CGC AAG CTA GAG CXG AGG GCA GAG CTA TGT ACC 13367 13415

Arg lie Pro Ser Ser Arg Lys Leu Glu Leu Arg Ala Glu Leu Cys Thr 1380 1385 1390 AAC CCA TTG ATA TAT GAT AAT GCA CCT TTA ATT GAC AGA GAT ACA ACA Asn Pro Leu Ile Tyr Asp Asn Ala Pro Leu Ile Asp Arg Asp Thr Thr 13S5 1400 1405 1410 AGG CTA TAC ACC CAG AGC CAT AGG AGG CAC CTT GTG GAA TTT GTT ACA Arg Leu Tyr Thr Gin Ser His Arg Arg His Leu Vai Glu Phe Vai Thr 1415 1420 1425 TGG TCC ACA CCC CAA CTA TAT CAC ATT TTA GCT AAG TCC ACA GCA CTA Trp Ser Thr Pro Gin Leu Tyr His Ile Leu Ala Lys Ser Thr Ala Leu 1430 1435 1440 13463 13511 13559

TCT ATG ATT GAC CTG GTA ACA AAA TTT GAG AAG GAC CAT ATG AAT GAA 13607

Ser Mel Ile Asp Leu Vai Thr Lys Phe Glu Lys Asp His Met Asn Glu 1445 1450 1455

ATT TCA GCT CTC ATA GGG GAT GAC GAT ATC AAT AGT TTC ATA ACT GAG Ile Ser Ala Leu Ile Gly Asp Asp Asp Ile Asn Ser Phe Ile Thr Glu 1460 1465 1470 TTT CTC GTC ATA GAG CCA AGA TTA TTC ACT ATC TAC TTG GGC CAG TGT 13655 13703

Phe Leu Vai lie Glu Pro Arg Leu Phe Thr Ile Tyr Leu Gly Gin Cys 1475 1480 1485 1490

84 196 ΕΡ 0 540 135/ΡΤ GCG GCC ATC ΑΑΤ TGG GCA TTT GAT GTA CAT TAT CAT AGA CCA TCA GGG 13751

Ala Ala He Asn Trp Ala Phe Asp Vai His Tyr His Arg Pro Ser Gly 1495 1500 1505 AAA TAT CAG ATG GGT GAG CTG TTG TCA TCG TTC CTT TCT AGA ATG AGC 13799

Lys Tyr Gin Met Gly Glu Leu Leu Ser Ser Phe Leu Ser Arg Met Ser 1510 1515 1520 AAA GGA GTG TTT AAG GIG CTT GTC AAT GCT CTA AGC CAC CCA AAG ATC 13847

Lys Gly Vai Phe Lys Vai Leu Vai Asn Ala Leu Ser His Pro Lys Ile 1525 1530 1535 TAC AAG AAA TTC TGG CAT TGT GGT ATT ATA GAG CCT ATC CAT GGT CCT 13895

Tyr Lys Lys Phe Trp His Cys Gly Ile Ile Glu Pro Ile His Gly Pro 1540 1545 1550 TCA CTT GAT GCT CAA AAC TTG CAC ACA ACT GTC TGC AAC ATG GTT TAC 13943

Ser Leu Asp Ala Gin Asn Leu His Thr Thr Vai Cys Asn Met Vai Tyr 1555 1560 1565 1570 ACA TGC TAT ATG ACC TAC CTC GAC CTG TTG TTG AAT GAA GAG TTA GAA 13991

Thr Cys Tyr Met Thr Tyr Leu Asp Leu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu 1575 1580 1585 GAG TTC ACA TTT CTC TTG TGT GAA AGC GAC GAG GAT GTA GTA CCG GAC 14039

Glu Phe Thr Phe Leu Leu Cys Glu Ser Asp Glu Asp Vai Vai Pro Asp 1590 1595 1600 AGA TTC GAC AAC ATC CAG GCA AAA CAC TTA TGT GTT CTG GCA GAT TTG 14087

Arg Phe Asp Asn Ile Gin Ala Lys His Leu Cys Vai Leu Ala Asp Leu 1605 1610 1615 TAC TGT CAA CCA GGG GCC TGC CCA CCA ATT CG A GGT CTA AGA CCG GTA 14135

Tyr Cys Gin Pro Gly Ala Cys Pro Pro lie Arg Gly Leu Arg Pro Vai 1620 1625 1630 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 34

GAG ΑΑΑ TGT GCAGTT CTA ACC GAC CAT ATC AAG GCA GAG GCT AGG 7ΤΑ 14183

Glu Lys Cys Ala Vai Leu Thr Asp Hls Ile Lys Ala Glu Ala Arg Leu 1635 1640 1645 1650 TCT CCA GCA GGA TCT TCG TGG AAC ATA AAT CCA ATT ATT GTA GAC CAT 14231

Ser Pro Ala Gly Ser Ser Trp Asn Ile Asn Pro Ile Ile Vai Asp His 1655 1660 1665 TAC TCA TGC TCT CTG ACT TAT CTC CG3 CGA GGA TCG ATC AAA CAG ATA 14273

Tyr Ser Cys Ser Leu Thr Tyr Leu Arg Arg Gly Ser Ile Lys Gtn Ile 1670 1675 1680 AGA TTG AGA GTT GAT CCA GGA TTC ATT TTC GAC GCC CTC GCT GAG GTA 14327

Arg Leu Arg Vai Asp Pro Gly Phe Ile Phe Asp Ala Leu Ala Glu Vai 1685 1630 1695 AAT GTC AGT CAG CCA AAG ATC GGC AGC AAC AAC ATC TCA AAT ATG AGC 14375

Asn Vai Ser Gin Pro Lys Ile Gly Ser Asn Asn Ile Ser Asn Met Ser 1700 1705 1710 ATC AAG GCT TTC AGA CCC CCA CAC GAT GAT GTT GCA AAA TTG CTC AAA 14423

Ile Lys Ala Phe Arg Pro Pro His Asp Asp Vai Ala Lys Leu Leu Lys 1715 1720 1725 1730 GAT ATC AAC ACA AGC AAG CAC AAT CTT CCC ATT TCA GGG GGC AAT CTC 14471

Asp Ile Asn Thr Ser Lys His Asn Leu Pro Ile Ser Gly Gly Asn Leu 1735 1740 1745 GCC AAT TAT GAA ATC CAT GCT TTC CGC AGA ATC GGG TTG AAC TCA TCT 14519 Âlíi Asn fyr Glu Ile His Ala Phe Arg Arg Ile Gly Leu Asn Ser Ser 1750 1755 1760 GCT TGC TAÇ AAA GCT GTT GAG ATA TCA ACA TTA ATT AGG AGA TGC CTT 14567 AI* Cy$ Tyr lys Ala V.al Glu Ile Ser Thr Leu Ile Arg Arg Cys Leu 1775 1765 1770

84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 35 GAG CCA GGG GAG GAC GGC TTG TTC TTG GGT GAG GGA TCG GGT TCT ATG 1461Ε

Glu Pro Gly Glu Asp G!y Leu Phe Leu Gly Glu Gly Ser Gly Ser Met 1780 1785 1790 TTG ATC ACT TAT AAG GAG ATA CTT AAA CTA AAC AAG TGC TTC TAT AAT 14663

Leu Ií e Thr Tyr Lys Glu Ile Leu Lys Leu Asn Lys Cys Phe Tyr Asn 1795 1800 1805 1810 AGT GGG GTT TCC GCC AAT TCT AGA TCT GGT CAA AGG GAA TTA GCA CCC 14711

Ser Gly Vai Ser Ala Asn Ser Arg Ser Gly Gin Arg Glu Leu Ala Pro 1815 1820 1825 TAT CCC TCC GAA GTT GGC CTT GTC GAA CAC AGA ATG GGA GTA GGT AAT 14759

Tyr Pro Ser Glu Vai Gly Leu Vai Glu His Arg Met Gly Vai Gly Asn 1830 1835 1840 ATT GTC AAA GTG CTC TTT AAC GGG AGG CCC GAA GTC ACG TGG GTA GGC 14607

Ile Vai Lys Vai Leu Phe Asn Gly Arg Pro Glu Vai Thr Trp Vai Gly 1845 1850 1855 AGT GTA GAT TGC TTC AAT TTC ATA GTT AGT AAT ATC CCT ACC TCT AGT 14855

Ser Vai Asp Cys Phe Asn Phe Ilè Vai Ser Asn Ile Pro Thr Ser Ser 1860 1865 1870 GTG GGG TTT ATC CAT TCA GAT ATA GAG ACC TTG CCT AAC AAA GAT ACT 14903

Vai Gly Phe I.te His Ser Asp Ile Glu Thr Leu Pro Asn Lys Asp Thr 1375 1880 1885 1890 ATA GAG AAG CTA GAG GAA TTG GCA GCC ATC TTA TCG ATG GCT CTG CTC 14951 lie Glu Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ala Ile Leu Ser Met Ala Leu Leu 1895 1900 1905 CTC CSC AAA ATA GCA TCA ATA CTG GTG ATT AAG CTT ATG CCT TTC AGC 14999 L*u Gly Lys Ile Gly Ser Ile Leu Vai Ile Lys Leu Met Pro Phe Ser 1910 1915 1920

84 196 EPO 540 135/PT 36

GGG GAT TTT GTT CAG GGA TTT ATA AGT TAT GTA GGG TCT TAT TAT AGA Cly Asp Phe Vai Gin Gly Phe Ile Ser Tyr Vai Gly Ser Tyr Tyr Arg 1925 1930 1935 GAA GTG AAC CTT GTA TAC CCT AGA TAC AGC AAC TTC ATA TCT ACT GAA Glu Vai Asn Leu Vai Tyr Pro Arg Tyr Ser Asn Phe Ile Ser Thr Gtu 1940 1945 1950 TCT TAT TTG GTT ATG ACA GAT CTC A AG GCT AAC CGG CTA ATG AAT CCT Ser Tyr Leu Vai Met Thr Asp Leu Lys Ala Asn Arg Leu Met Asn Pro 1955 1960 1965 1S70 GAA AAO ATT AAG CAG CAG ATA ATT GAA TCA TCT GTG AGG ACT TCA CCT Glu Lys Ile Lys Gin Gin Ile Ile Glu Ser Ser Vai Arg Thr Ser Pro 1975 1980 1985 GGA CTT ATA GGT CAC ATC CTA TCC ATT AAG CAA CTA AGC TGC ATA CAA Gly Leu Ile Gly His Ile Leu Ser Ile Lys Gin Leu Ser Cys Ile Gin 1990 1995 2000 GCA ATT GTG GGA GAC GTA GTT AGT AGA GGT GAT ATC AAT CCT ACT CTG Ata Ile Vai Gly Asp Vai Vat Ser Arg Gly Asp Ile Asn Pro Thr Leu 2005 2010 2015 AAA AAA CTT ACA CCT ATA GAG CAG GTG CTG ATC AAT TGC GGG TTG GCA Lys Lys Leu Thr Pro Ile Glu Gin Vai Leu Ile Asn Cys Gly Leu Ala 2020 2025 2030 ATT AAC GGA CCT AAG CTG TGC AAA GAA TTG ATC CAC CAT GAT GTT GCC Ile Asn Gly Pro Lys Leu Cys Lys Glu Leu Ile His His Asp Vai Ala 2035 2040 2045 2050 TCA GGG CAA GAT GGA TTG CTT. AAT TCT ATC CTC ATC CTC TAC AGG GAG Sei· Gly Gin Λ·ςρ Gly I. *u Leu Asn Ser Ile Leu Ile Leu Tyr Arg Glu 15047 15095 15143 15191 15239 15287 15335 15383 15431 2035 2060 2065 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 37

TTG GCA , AGA . TTC AAA GAC AAC CGA AGA AGT CAA CAA GGG ATG TTC CAC 15479 Leu Ala Ar g Phe Lys Asp Asn Arg Arg Ser Gin Gtn Gly Met Phe His 2070 2075 2080 GCT TAC CCC GTA TTG GTA AGT AGC AGG CAA CGA GAA CTT ATA TCT AGG 15527 Ala Tyr Pro Vat Leu Vat Ser Ser Arg Gin Arg Glu Leu I le Ser Arg 2085 2090 2095 ATC ACC CGC AAA TIT TGG GGG CAC ATT CTT CTT TAC TCC GGG AAC AGA 15575 I te Thr Ar g Lys Phe Trp Gty His I le Leu Leu Tyr Ser Gly Asn Arg 2100 2105 2110 AAG TTG ATA AAT AAG TTT ATC CAG AAT CTC AAG TCC GGC TAT CTG ATA 15623 Lys Leu I le Asn Lys Phe 1 le G l n Asn Leu Lys Ser Gty Tyr Leu I le 2115 2120 2125 2130 CTA GAC TTA CAC CAG AAT ATC TTC GTT AAG AAT CTA TCC AAG TCA GAG 15671 Leu Asp Leu His G In Asn l te Phe Vat Lys Asn Leu Ser Lys Ser Glu 2135 2140 2145 AAA CAG ATT ATT ATG ACG GGG GGT TTG AAA CGT GAG TGG GTT TTT AAG 15719 Lys Gin I le 1 le Met Thr Gly G l y Leu Lys Arg G lu Trp Vai Phe Lys 2150 2155 2160 GTA ACA GTC AAG GAG ACC AAA GAA TGG TAT AAG TTA GTC GGA TAC AGT 15767 Vat Thr Vai Lys Glu Thr Lys Glu Trp Tyr Lys Leu Vai Gly Tyr Ser 21S5 2170 2175 GCC CTG ATT AAG GAC TAATTGGTTG AACTCCGGAA CCCTAATCCT GCCCTAGGTG 15822 Ala Leu 1le Lys Asp 2180 15882 15894

GTTAGGCATT ATTTGCAATA-TATTAAA5AA AACTTTGAAA ATACGAAGTT TCTATTCCCA

GCTTTGTCTG GT 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 38

Listagem de sequências da sequência nucleotídica de cima.

Tipo de sequência: ácido nucleico

Tipo de cadeia: simples

Topologia: linear

Tipo de molécula: ADNc

Fonte de Origem

Organismo: Estirpe:

vacina do sarampo atenuada AIK-C

De forma concordante, o presente invento proporciona um método para identificação de uma estirpe do vírus da vacina do sarampo, método esse que compreende a determinação da sequência nucleotídica do ADNc que corresponde ao ARN genómico da estirpe do vírus da vacina do sarampo e comparação da sequência assim determinada com a sequência de ADN exposta em Sequência I.D. N° 1. A estirpe do vírus da vacina do sarampo pode ter sido retirada de uma criança vacinada com a estirpe AIK-C do vírus do sarampo. Numa concretização alternativa, o vírus do sarampo para vacinas é produzido a partir da estirpe de semente AIK-C do vírus do sarampo e a qualidade do vírus assim produzido é verificada determinando a sequência nucleotídica do ADNc que corresponde ao ARN genómico do vírus e comparando a sequência assim determinada com a sequência de ADN exposta em Sequência I.D. N° 1. O invento proporciona também um ADNc, por exemplo um ADNc isolado, possuindo a sequência nucleotídica exposta em Sequência I.D. N° 1. O invento proporciona ainda um ARN possuindo uma sequência nucleotídica que corresponde à exposta em Sequência I.D. N° 1.

Nos desenhos anexos: A Fig. 1 é um esboço da construção de ADNc, A Fig. 2 é um mapa de clones de ADNc de AIK-C, e A Fig. 3 apresenta as sequências de iniciadores.

No presente invento, no início, são utilizados vírus de semente da estirpe AIK-C do vírus do sarampo. Este vírus é propagado em células de embrião de pinto derivadas de ovos 84 196 ΕΡ Ο 540 Ι35/ΡΤ 39

de galinha isentos de patogénios específicos para preparar a chamada solução-mãe de vacina, a partir da qual pode ser preparada uma suspensão de vírus para purificação. A solução-mãe de vacina pode ser parte de um conjunto de vírus, preparado para o mercado, da vacina da estirpe AIK-C do sarampo. A suspensão de vírus clarificada é purificada por ultracentrifugação através de gradientes contínuos de sacarose. O ARN virai é extraído pelo método de SDS-fenol. Pode ser sintetizado um iniciador sintético com aprox. 25 mero pelo método da amidida.

Desoxioligonucleótidos utilizados como iniciadores sintéticos, podem ser sintetizados, por exemplo, num CYCLONE DNA SYNTHESIZER (Biosearch, Inc.). O ARN do genoma do vírus AIK-C é utilizado como molde para a síntese de ADNc utilizando o iniciador oligonucleotídico sintético acima referido. O ARN do genoma do vírus AIK-C é transcrito de forma inversa pela transcriptase inversa para preparar ADNc de cadeia simples o qual é tratado através do método da ARNase H para preparar ADNc de cadeia dupla. Os ADNc de cadeia dupla são tratados com enzimas de restrição apropriadas e são inseridos no plasmídeo pUC (pUC18 ou pUC19). O processo de cima está ilustrado na Fig. 1. A estirpe HB101 de E. coli K12 é transformada com o resultante plasmídeo recombinante. Os transformantes são seleccionados por resistência à ampicilina. As colónias contendo plasmídeos recombinantes são pesquisadas medindo o tamanho do ADN plasmídico por electroforese em gel de agarose. Para determinar a sequência do genoma de AIK-C, o ADNc é subclonado na série de bacteriófagos Ml3 e os ADN dos fagos M13 de cadeia simples são isolados a partir dos subclones candidatos. A determinação do clone de ADNc obtido pode ser feita através de vários tipos de clivagem por enzimas de restrição. No ADNc obtido a partir de um iniciador sintético tal como MP-1, os locais de enzimas de restrição de ΒαηίΆΙ, EcoRV e Xbal estão localizados. No plasmídeo extraído da estirpe resistente à ampicilina, nos casos em que o referido tipo de ADNc é observado, fragmentos de aproximadamente 1504 bases são identificados por quebra com BamHl e Xbal numa electroforese em gel de agarose. O tratamento posterior destes fragmentos com EcoRV proporciona dois fragmentos de 650 e 854. De forma concordante, uma identificação do clone de ADNc obtido foi feita por clivagem do fragmento inserido no plasmídeo e determinação do seu tamanho, ou determinando o local específico de restrição do ADN do sarampo nos fragmentos.

Para determinar a sequência de bases, o ADNc, o qual é quebrado por uma enzima de

84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 40 restrição para preparar extremidades coesivas ou lisas, é inserido num vector fágico M13 no qual as suas partes clonadas são clivadas pelas enzimas de restrição preferíveis. O fago possuindo o ADN recombinante assim preparado é infectado em E. coli. É extraído o ADN recombinante de cadeia simples das placas fágicas infectadas, a partir do qual é determinada a sequência nucleotídica através do método de terminação da cadeia didesoxi (método de sequenciação didesoxi).

Um iniciador tal como pMN2, o ADNc obtido a partir de MP-1, é quebrado por BamHl e Xbctl e é clonado num plasmídeo pUC. Após determinação do ADNc, o fragmento de ADN originário da estirpe A1K-C por quebra com a mesma enzima de restrição é ainda quebrado por EcoKV para preparar dois fragmentos consistindo em 650 pb e 854 pb.

Estes fragmentos são ligados no ADN de cadeia dupla da forma replicativa de Ml 3, o qual tinha sido previamente quebrado por BamHl e Xbal, e transfectados para E. coli. Após ser seleccionado o fago recombinante, o fago é infectado em E. coli e multiplicado. ADN recombinante de cadeia simples é extraído da fase sobrenadante da solução fágica e a sequência nucleotídica é determinada pelo método de sequenciação didesoxi.

Verificou-se que o genoma do vírus da estirpe AIK-C consiste em 15894 nucleótidos e a sua sequência completa é mostrada acima. Um vírus do sarampo contendo o referido genoma de ARN tem as propriedades superiores da estirpe virai AIK-C. A sequência nucleotídica específica do genoma da estirpe virai AIK-C é determinada por PCR e pode ser comparada com a estirpe do vírus para determinar se a referida estirpe pode ser utilizada para a vacina de vírus da estirpe AIK-C ou se a vacina preparada de vírus da estirpe AIK-C conserva estritamente as propriedades da estirpe AIK-C. Ainda, se uma criança à qual foi administrada a vacina do sarampo apresenta exantema e se são observados anticorpos para o vírus do sarampo nos linfócitos da criança, a causa pode ser determinada comparando a sequência nucleotídica do vírus da vacina do sarampo com a sequência nucleotídica do vírus AIK-C.

No fascículo, são utilizadas as seguintes abreviaturas.

Met ; metionina

Ala ; alanina

Thr ; treonina

Leu ; leucina

Arg ; arginina 84 196 540 135/PT Ser ; serina Phe ; fenilalanina Lys ; lisina Asn ; asparagina Asp ; ácido aspártico Pro ; prolina Ile ; isoleucina Gly ; glicina His ; histidina Vai ; valina Glu ; ácido glutâmico Gin ; glutamina

Os seguintes exemplos ilustram o presente invento mas não se pretende que o limitem.

Exemplo 1

Determinação da sequência nucleotídica de um vírus obtido a partir da solucão-mãe de vacina da estirpe virai AIK-C:

Passo: a

Um vírus de semente da estirpe AIK-C do sarampo (Lote de Semente 0-2) foi inoculado até a um título de infecciosidade de 0,05 em células de embrião de pinto derivadas de ovos de galinha isentos de patogénios específicos cultivadas numa área de superfície de cultura celular (230 cm2) num frasco Roux grande (aprox. 1 litro de volume). Um meio de cultura (150 ml) de meio mínimo essencial de Eagle (MEM) contendo 1% de soro de vitelo foi adicionado a este e o vírus foi cultivado a 33°C.

Passo: b

No terceiro dia após a inoculação, o meio de cultura foi removido, depois foi ainda adicionado meio novo (150 ml), o mesmo que acima, e a cultura foi continuada. 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 42

Passo: c

Após inoculação do vírus, no sexto dia, o meio de cultura foi removido. A camada de células de embrião de pinto infectadas foi completamente lavada três vezes com solução de Hank (100 ml). A cultura foi continuada a 33°C após adicionar MEM de Eagle para cultura celular (200 ml) contendo 0,1% de glutamato de sódio.

Passo: d

No décimo dia após a inoculação das sementes de vírus, em que foi observado um efeito citopatogénico específico para o vírus do sarampo em toda a camada de células infectadas, o meio de cultura foi recolhido para solução-mãe de vacina (volume: aprox. 200 ml, título de infecciosidade: 107 : TCID50 */ml)(* dose infecciosa em meio de cultura de tecidos).

Passo: e A solução-mãe de vacina foi centrifugada a 3000 r.p.m. durante 30 minutos e a solução sobrenadante foi ainda centrifugada a 25000 r.p.m. durante 90 minutos. (Beckman. L 8 - 55 M, rotor: SW 28).

Passo: f

Após a solução sobrenadante ter sido removida, foi adicionada solução tampão TEN (Tris HC1 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4) (1 ml) a um precipitado em cada tubo de centrífuga e foi bem suspenso para preparar vírus concentrado. A suspensão de vírus concentrado assim obtida foi ajustada para um volume final de 10 ml por adição de solução tampão TEN para preparar uma suspensão de vírus clarificada.

Passo: g A suspensão de vírus clarificada (5 ml) foi colocada em camada nos gradientes contínuos de sacarose 30-60% em dois tubos de centrífuga (rotor SW 41 de centrífuga Beckman), preparados através de uma solução de sacarose a 60% (p/v) em solução tampão TEN (6,8 ml) e uma solução de sacarose a 30% (p/v) em solução tampão TEN (6,8 ml) por tubo, depois centrifugados durante 90 minutos a 207000 g a 4°C. A suspensão foi ffaccionada e as ffacções que mostravam o maior título de infecciosidade (IO8,3 TCID50/ml) 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 43

foram recolhidas e novamente centrifugadas do mesmo modo para preparar partículas virais purificadas.

Passo: h

As partículas virais purificadas foram diluídas cinco vezes com solução tampão TEN, foram adicionados 200 μΐ a cada tubo de microteste de 1,5 ml separadamente, foi ainda adicionado a estes SDS a 20% (5 μΐ), fenol (100 μΐ) e clorofórmio (100 μΐ), agitou-se depois completamente utilizando um agitador de vórtex. A mistura foi posteriormente centrifugada a 12000 r.p.m. durante 5 minutos para separar a camada orgânica da camada aquosa. A camada aquosa foi recolhida noutro tubo de microteste de 1,5 ml e sujeita duas vezes a extracção com fenol (extracção com SDS-fenol). A camada aquosa recuperada foi misturada com NaCl 5 M (1/25 de volume) e etanol (2,5 de volume), permitiu-se que ficasse a -20°C durante 2 horas, foi depois centrifugada a 12000 r.p.m. durante 10 minutos para recolher o ARN precipitado o qual foi lavado com etanol a 70% e seco. O material seco foi dissolvido em água bidestilada (50 μΐ) a qual foi esterilizada por autoclavagem para preparar uma suspensão de ARN.

Passo: i

Sintetizador de ADN Cvclone

Foram sintetizados iniciadores desoxioligonucleotídicos sintéticos, em particular os 12 iniciadores compreendendo aprox. 25 meros de MP-1 ~ MP-11 e BEP(dT)7 mostrados na Fig. 3, utilizando o sintetizador de ADN Cvclone (Biosearch INC. U.S.A.).

Passo: i A suspensão de ARN (10 μΐ) obtida no passo Passo: h acima (ARN do genoma do vírus AIK-C) foi utilizada como molde para a síntese de ADN utilizando iniciadores oligonucleotídicos sintéticos (o ADN sintético de cima) (2 μΐ de iniciador sintético, MP-1 ou MP-11) e o ADNc foi preparado por tratamento com transcriptase inversa. O ADNc foi convertido em ADNc de cadeia dupla utilizando ARNase H-AND-polimerase I (Gubler e Hoffman, GENE 25, págs. 263-269, 1983).

84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 44

Passo: k Ο ADNc obtido foi clivado em cada local de clivagem por enzimas de restrição por BamHl-Xbal, Xbal-BamHl, BamHl-EcoRl, EcoRl-BamHl, BcunHl-EcoRI, EcoRl-BgEI, Bglll-Sacl e Sacl-Ncol-Xbcú. Cada fragmento foi inserido num local de clonagem correspondente no plasmídeo pUC (pUC18 e pUC19).

Passo: 1 E. coli HB101 foi transformada com os plasmídeos recombinantes de cima para obter colónias resistentes à ampicilina. O ADN plasmídico foi extraído das colónias assim obtidas e as colónias contendo plasmídeos recombinantes foram pesquisadas medindo o comprimento dos fragmentos de ADN plasmídico com electroforese em gel de agarose a 0,8%.

Passo: m

Para obter o clone do terminal 3’ do genoma de AIK-C, foi adicionada uma cauda poli(A) na extremidade 3’ do ARN genómico, uma suspensão de ARN obtida no passo: h acima, com poli(A) polimerase e adenosina-trifosfato (ATP). A suspensão de ARN com cauda A 3’ assim obtida, i.e. o ARN poliadenilado, foi transcrito de forma inversa utilizando o iniciador BEP(dT)7 para preparar ADNc de acordo com o passo: j. O iniciador BEP(dT)7 tem a sequência: 5 ’-CTGTGAATTCTGCAGGATCCTTTTTTT-3 ’.

Passo: n O clone do terminal 5’ foi sintetizado utilizando um iniciador localizado próximo do terminal 5’. Nomeadamente o iniciador continha ADN complementar no domínio dos nucleótidos 15592-15615 do genoma do vírus do sarampo. O iniciador sintético tem a sequência; 5’-TGGAAGCTTATCCAGAATCTCAAGTCCGGCT-3’.

Foi preparado um híbrido de ADN-ARN utilizando o referido ADN sintético como iniciador com transcriptase inversa. Após tratamento alcalino do híbrido, poli(dA), i.e. foi adicionada uma cauda de dATP à extremidade 3’ do ADNc resultante com a desoxinucleotidil-transferase terminal. Foi subsequentemente convertido em ADNc de cadeia dupla utilizando o iniciador BEP(dT)7 no passo: m e o fragmento de Klenow.

Passo: ο

Os ADNC assim obtidos foram subclonados no vector bacteriófago da série Ml3 (mp!8 e mpl9) e os ADN do fago M13 de cadeia simples foram isolados. A sequência nucleotídica desses ADNC foi determinada com o referido ADN de cadeia simples através do método de terminação da cadeia didesoxi utilizando o estojo de sequenciação 7-DEAZA-dGTP (Takara Shuzo).

Passo:p A análise por computador da sequência nucleotídica e peptídica foi efectuada pelo programa GENETYX.

Exemplo 2

Determinação do nucleótido virai do vírus de semente da estirpe AIK-C em crescimento em células Vero (células vivas de macaco verde africano)

Passo: a O vírus de semente da estirpe AIK-C (Lote de Semente N° 0 - 2) foi inoculado em células Vero previamente postas em cultura num frasco Roux de tamanho grande de acordo com o método descrito no Exemplo 1 e incubadas a 33°C.

Passo: b

No quinto dia após a incubação, as camadas de células infectadas foram lavadas com solução de Hank, depois foi adicionado a MEM de Eagle (200 ml) sem soro de vitelo e posteriormente incubado durante 2 dias. A cultura virai incubada foi recolhida para obter uma suspensão-mãe de vírus (aprox. 200 ml, título infeccioso: 106'3 TCID50/ml).

Passo: c A solução-mãe de vacina foi centrifugada a 3000 r.p.m. durante 30 min., após o que a suspensão sobrenadante foi centrifugada a 25000 r.p.m. durante 90 min. (Centrífuga: Beckman L8-55M, rotor: SW 28). 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 46

Passo: d

Após a solução de sobrenadante ter sido removida, foi adicionada solução tampão TEN (Tris HC1 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4) (1 ml) ao precipitado em cada tubo de centrífuga. O precipitado foi completamente suspenso para preparar material virai concentrado, o qual foi ajustado para um volume de 10 ml adicionando solução tampão TEN para preparar uma suspensão de vírus inicial.

Passo: e A suspensão de vírus inicial (5 ml) foi disposta em camada sobre gradientes contínuos de sacarose 30-60% em dois tubos consistindo em, num tubo, solução de sacarose a 60% (p/v) (solução tampão TEN) (6,8 ml) e solução de sacarose a 30% (p/v) (solução tampão TEN) (6,8ml), depois foi centrifugada a 207000 g durante 90 min. a 4°C. A suspensão centrifugada em cada tubo foi fraccionada através de um colector de fracções e as fracções que mostravam elevada infecciosidade (IO8-3 TCID50/ml) foram recolhidas. A fracçào recolhida foi novamente centrifugada do mesmo modo para recuperar o vírus purificado.

Passo: f

Alíquotas de 200 μΐ de vírus purificado diluídas cinco vezes com solução tampão TEN foram introduzidas separadamente em tubos de microteste de 1,5 ml. A estes foi adicionado SDS a 20% (5 μΐ), fenol (100 μΐ) e clorofórmio (100 μΐ) e foram completamente agitados utilizando um agitador de vórtex. As camadas orgânica e aquosa foram separadas com uma centrifugação a 12000 r.p.m. durante 5 min. A fase aquosa foi recolhida noutro tubo de microteste de 1,5 ml e extraída duas vezes com o mesmo SDS-fenol de cima. A camada aquosa recuperada foi misturada com NaCl 5 M (1/25 de volume) e etanol (2,5 de volume), permitiu-se que estabilizasse a -20°C durante 2 horas, foi centrifugada a 12000 r.p.m. durante 10 min. para recolher o ARN precipitado, o qual foi lavado com etanol a 70% e seco. A suspensão de ARN foi preparada com esterilização do material seco e dissolvido em água bidestilada (50 μΐ). 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 47

Passo: g

Sintetizador de ADN Cvclone

Foram sintetizados iniciadores desoxioligonucleotídicos sintéticos, em particular os 12 iniciadores, compreendendo aprox. 25 meros de MP-l ~ MP-11 e BEP(dT)7 mostrados na Fig. 3, utilizando o sintetizador de ADN Cvclone (Biosearch INC. U.S.A.).

Passo: h A suspensão de ARN (10 μΐ) obtida no Exemplo: 1 de cima (ARN do genoma do vírus AIK-C) foi utilizada como molde para a síntese de ADNc utilizando os iniciadores oligonucleotídicos sintéticos (o ADN sintético de cima) (2 μΐ de iniciador sintético, MP-l ou MP-11) e o ADNc foi preparado por tratamento com transcriptase inversa. O ADNc foi convertido em ADNc de cadeia dupla utilizando ARNase H-AND-polimerase I de ADN (Gubler e Hoffman, GENE 25, págs. 263-269, 1983).

Passo: i O ADNc obtido foi clivado em cada local de clivagem por enzimas de restrição por BamRl-Xbal, Xbal-BamUl, BcunUl-EcoRl. EcoBX-BamUl, ΒωηΆΙ-EcoBl, EcoRl-BgEI, BgM-Sacl e Sacl-Ncol-Xbal. Cada fragmento foi inserido no local de clonagem correspondente no plasmídeo pUC (pUC18 e pUC19).

Passo: i E. coli HB101 foi transformada com os plasmídeos recombinantes de cima para obter colónias resistentes à ampicilina. O ADN plasmídico foi extraído das colónias assim obtidas e as colónias contendo plasmídeos recombinantes foram pesquisadas medindo o comprimento dos fragmentos de ADN plasmídico com electroforese em gel de agarose a 0,8%.

Passo: k

Para obter o clone do terminal 3’ do genoma de AIK-C, foi adicionada uma cauda poli(A) na extremidade 3’ do ARN genómico, uma suspensão de ARN obtida no passo: f acima, com poli(A)-polimerase e adenosina-trifosfato (ATP). A suspensão de ARN com 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ 48

cauda 3’ assim obtida, i.e. o ARN poliadenilado, foi transcrito de forma inversa utilizando o iniciador BEP(dT)7 para preparar ADNc de acordo com o passo: h. O iniciador BEP(dT)7 tem a sequência: 5 ’-CTGTGAATTCTGCAGGATCCTTTTTTT-3 ’.

Passo: 1 O clone do terminal 5’ foi sintetizado utilizando um iniciador localizado próximo do terminal 5’. Nomeadamente o iniciador continha ADN complementar no domínio de nucleótidos 15592-15615 do genoma do vírus do sarampo. O iniciador sintético tem a sequência; 5 ’-TGGAAGCTTATCCAGAATCTCAAGTCCGGCT-3 ’.

Foi preparado o híbrido de ADN-ARN utilizando o referido ADN sintético como iniciador com transcriptase inversa. Após tratamento alcalino do híbrido, foi adicionada poli(dA), i.e. uma cauda de dATP à extremidade 3’ do ADNc resultante com a desoxinucleotidil-transferase terminal. Este foi subsequentemente convertido em ADNc de cadeia dupla utilizando o iniciador BEP(dT)7 no passo: k e o fragmento de Klenow.

Passo: m

Os ADNC assim obtidos foram subclonados no vector bacteriófago da série M13 (mpl8 e mpl9) e os ADN do fago M13 de cadeia simples foram isolados. A sequência nucleotídica desses ADNC foi determinada com o referido ADN de cadeia simples através do método de terminação da cadeia didesoxi utilizando o estojo de sequenciação 7-DEAZA-dGTP (Takara Shuzo).

Passo: n A análise por computador das sequências nucleotídica e peptídica foi efectuada pelo programa GENETYX.

Exemplo 3

Identificação por PCR do vírus do sarampo obtido a partir de um doente no primeiro dia de manifestação da infeccão do sarampo 49 84 196 ΕΡ Ο 540 135/ΡΤ

Passo: a

Uma amostra de sangue (aprox. 5 ml) foi recolhida a partir de um doente no primeiro dia de manifestação do exantema do sarampo. Os linfócitos foram separados por Ficoll (nome comercial).

Passo:b

Os linfócitos foram lavados duas vezes com PBS. Foi adicionada a estes uma solução de desnaturação D (tiocianato de guanidínio 4 M, citrato de sódio 25 mM, pH 7,5; sacrosina a 0,5%, 2-mercaptoetanol 0,1 M, 200 pl). Após agitação suave, foram adicionados nesta ordem acetato de sódio 2 M (20 μΐ, pH 4), fenol (200 μΐ) e clorofórmio (100 μΐ). A mistura foi tratada num agitador de vórtex durante 10 seg. e foi permitido que ficasse em gelo durante 15 min. Depois a mistura foi centrifugada a 10000 g durante 20 min. para recuperar a camada aquosa. Foi adicionado um volume igual de isopropanol. Permitiu-se que a mistura ficasse a -20°C durante uma hora e foi depois centrifugada a 10000 g durante 20 min. para precipitar o ARN (Chomczynski e Sacchi, Anal. Biochem., 162, 156-159 (1987)).

Passo: c O ARN assim obtido foi sujeito à reacção com transcriptase inversa e ao método de PCR.

Passo: d

Foram efectuadas a sequenciação nucleotídica e a identificação da estirpe AIK-C e estirpe selvagem da vacina do vírus do sarampo.

Lisboa, ^

Por THE KITASATO INSTITUTE

©A CUNHA FERREIRA Ag. Ol. Pr. Ind. Êtua das Flores, 74 - 4.® 1EQO LISBOA

Claims (6)

1. 84 196 EPO 540 135/PT 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para identificar uma estirpe de vírus da vacina do sarampo, método esse que compreende a determinação da sequência nucleotídica de ADNc que corresponde ao ARN genómico da estirpe de vírus da vacina do sarampo e comparação da sequência assim determinada com a sequência de ADN exposta em Sequência I.D. N° 1.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a estirpe de vírus da vacina do sarampo foi retirada de uma criança vacinada com a estirpe AIK-C do vírus do sarampo.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o vírus do sarampo para vacinas é produzido a partir da estirpe semente AIK-C do vírus do sarampo e a qualidade do vírus assim produzido é avaliada determinando a sequência nucleotídica do ADNc correspondente ao ARN genómico do vírus e comparando a sequência assim determinada com a sequência de ADN exposta em Sequência I.D. N° 1.
4. 4. ADNc possuindo a sequência nucleotídica exposta em Sequência I.D. N° 1.
5. 5. ADNc isolado de acordo com a reivindicação 4.
6. 6. ARN possuindo uma sequência nucleotídica correspondendo à exposta em Sequência I.D. N° 1. Lisboa, -1. Γ.ΕΙ 2000 Por THE KITASATOINSTITUTE - O AGENTE OFICIAL -