DE60124984T2

DE60124984T2 - Verfahren zum kontrollieren der qualität eines abgeschwächten varicella phasen-impfstoffes

Info

Publication number: DE60124984T2
Application number: DE60124984T
Authority: DE
Inventors: Yasuyuki Kanonji-shi GOMI; Hiroki Kanonji-shi SUNAMACHI; Michiaki Suita-shi TAKAHASHI; Koichi Toyono-gun Yamanishi
Original assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Current assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Priority date: 2000-01-31
Filing date: 2001-01-31
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2021-02-01
Also published as: CA2359659A1; EP1166797B1; CN1358101A; KR20010103783A; CN1188167C; US20030082210A1; US6653069B2; EP1166797A4; WO2001056600A1; JP3946045B2; KR100441459B1; DE60124984D1; EP1166797A1; CA2359659C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Qualitätskontrolle eines abgeschwächten bzw. attenuierten Varicella-Lebendimpfstoffs. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Qualitätskontrolle eines abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs, umfassend das Durchführen einer Sequenzanalyse mit der genomischen DNA einer Probe des Varicella-Impfstoffvirus und Bestätigen, dass die genomische DNA der Probe des Varicella-Impfstoffvirus die spezifischen Nucleotide ohne Mutation konserviert. Durch die Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist es möglich geworden, die Qualifikation eines abgeschwächten Varicellavirus als Wirkstoff eines abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs sehr genau zu bestimmen und folglich eine exakte Qualitätskontrolle der Impfstoffe durchzuführen.
Stand der Technik
Wie allgemein bekannt ist, werden heutzutage verwendete abgeschwächte Varicella-Lebendimpfstoffe aus einem Varicellavirus-Animpfstamm hergestellt, welcher aus dem abgeschwächten Varicellavirus-Oka-Stamm abgeleitet ist (siehe geprüfte japanische Patentanmeldungs-Veröffentlichung Nr. 53-41202 und U.S.- Patent Nr. 3 985 615), und die abgeschwächten Lebendimpfstoffe werden in weitem Umfang überall in der Welt verwendet (Anforderungen für Varicella-Impfstoff (lebend), angenommen 1984; überarbeitet 1993: WHO Technical Report Series, Nr. 848, S. 22–38, 1994). Um die Sicherheit und Effektivität des Impfstoffs zu gewährleisten, wird die Anzahl von Passagen eines zur Herstellung des Impfstoffs verwendeten Virus unter der Kontrolle eines Animpf-Chargen-Systems beschränkt, wobei die potenzielle genetische Mutation berücksichtigt wird, welche mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit während der Passage auftritt. Das heißt, die Hersteller stehen unter einer Verpflichtung, Varicella-Impfstoffe nur aus dem Virus herzustellen, welches von dem zugelassenen Animpfvirus für den Varicella-Lebendimpfstoff stammt, wobei die Anzahl von Passagen des Virus sich auf nicht mehr als 10 beläuft, gezählt von dem zugelassenen Animpfvirus bzw. Ansatzvirus ab, welches als die Passage 0 gezählt wird. Mit anderen Worten beruhen die Qualitätskontrolle und Qualitätsgewährleistung des abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs auf der Erfüllung des Animpf-Chargen-Systems seitens der Hersteller, und ein derartiges Verfahren für die Qualitätskontrolle und Qualitätsgewährleistung ist nicht ein Verfahren, das von einem Fachmann auf dem Gebiet nachverfolgt und analysiert werden kann.
Ferner, vom Gesichtspunkt der Epidemiologie, welche eine Verfolgung der Effekte des Varicella-Impfstoffs und eine Nach-Markt-Überwachung (PMS – postmarket surveillance) beinhaltet, muss der virologische Unterschied zwischen den frischen Wildtypstämmen, isoliert aus den natürlich infizierten Varicella-Patienten, und den Impfstoffvirusstämmen, abgeleitet aus dem oben erwähnten Oka-Stamm, bestimmt werden, und verschiedene Analysen, wie diejenigen unter Verwendung von immunologischen Techniken und gentechnischen Vorgehensweisen sind für die Bestimmung des virologischen Unterschieds versucht worden. Zum Beispiel sind die folgenden Analysen berichtet worden: Der Unterschied hinsichtlich der DNA-Sequenz zwischen den verschiedenen VZV-Stämmen (Journal of Virology, 59, 660–668, 1986; und Journal of General Virology, 67, 1759–1816, 1986), der Unterschied hinsichtlich der Abwesenheit oder Gegenwart einer Spaltungsstelle für das Restriktionsenzym Pst I (Japanese Journal of Experimental Medicine, 59, 233–237, 1989), der Unterschied im RFLP (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus) des PCR(Polymerase-Kettenreaktions-)Produkts (Journal of Virology, 66, 1016–1020, 1992), und der Unterschied hinsichtlich der Abwesenheit oder Gegenwart einer Restriktionsstelle des Restriktionsenzyms Pst I, welcher in Kombination mit dem Unterschied im RFLP des PCR-Produkts betrachtet wird (Journal of Clinical Microbiology, 33, 658–660, 1995). Allerdings schlagen alle diese Analysen lediglich Kriterien vor, welche zum Unterscheiden eines frischen Wildtypstamms von einem Impfstoffstamm, der vom Oka-Stamm abgeleitet ist, verwendet werden können, und derartigen Analysen mangelt es an Zuverlässigkeit und Exaktheit. Darüber hinaus sind ein Verfahren zum Identifizieren des abgeschwächten Varicellavirus-Oka-Stamms durch Verwenden der Gen-14-Region (U.S.-Patent Nr. 6 093 535) und Verfahren zum Identifizieren des abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffvirus durch Verwenden der Gen-62-Region (Internationale Patentanmeldungs-Veröffentlichung Nr. WO 00/50603) bekannt gewesen. Beide dieser Verfahren ermöglichten eine Bestimmung der Unterschiede zwischen dem Varicellavirus-Oka-Stamm (virulenter Parental-Stamm), einem daraus abgeleiteten Impfstoffstamm (abgeschwächter Oka-Stamm) und einem vom Oka-Stamm verschiedenen Varicellavirusstamm, aber keines dieser Verfahren war als ein Standard für die Qualitätskontrolle und Qualitätsgewährleistung des abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs zufriedenstellend.
Wie oben erwähnt, wird die Qualität des abgeschwächten Varicellavirus, welcher als ein Wirkstoff eines abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs verwendet wird, derzeitig durch die Erfüllung des Animpf-Chargen-Systems durch die Hersteller kontrolliert. Mit anderen Worten, ist ein Verfahren, welches von einer dritten Seite zur Auswertung und Bestätigung der Effektivität des Impfstoffs nachverfolgt und analysiert werden kann, wie ein Verfahren unter Verwendung einer direkten und quantitativen genetischen Analyse der genomischen DNA eines Animpfvirus oder eines Impfstoffvirus nicht für die Qualitätskontrolle des Impfstoffs verwendet worden, und daher ist die Exaktheit der Qualitätskontrolle unberechenbar und unsicher. Deshalb ist eine Verbesserung hinsichtlich der Exaktheit der Qualitätskontrolle und Qualitätsgewährleistung von kritischer Bedeutung zur Gewährleistung der Wirksamkeit, Sicherheit und Einheitlichkeit des abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs. Allerdings, wie oben erwähnt, ist ein zuverlässiges Verfahren für die Qualitätskontrolle nicht etabliert worden, und eine Entwicklung eines derartigen Verfahrens ist im Fachgebiet ernsthaft gewünscht worden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In der oben genannten Situation haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung umfangreiche und intensive Untersuchungen im Hinblick auf die Entwicklung eines neuen Verfahrens für die akkurate und quantitative Durchführung der Qualitätskontrolle eines abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs vorgenommen. Spezifisch gesagt, ermittelten die Erfinder der vorliegenden Anmelder die gesamte genomische Nucleotidsequenz eines abgeschwächten Varicellavirus-Oka-Stamms, welche mehr als 120.000 Nucleotide enthält, führten eine vergleichende Analyse zwischen der ermittelten Nucleotidsequenz des abgeschwächten Oka-Stamms und den gesamten genomischen Nucleotidsequenzen des virulenten Stamms und des parentalen Oka-Stamms (virulenter Stamm) durch und identifizierten die genetischen Mutationen des abgeschwächten Varicellavirus-Oka-Stamms. Als ein Ergebnis haben sie festgestellt, dass durch Auswertung und Bestimmung, ob oder ob nicht ein Varicellavirusstamm die unten erwähnten spezifischen Nucleotide konserviert, ein Virusstamm, welcher die spezifischen Nucleotide konserviert, akkurat als ein Virusstamm bestimmt werden kann, der fähig zum Funktionieren als ein abgeschwächter Varicella-Impfstoffvirus ist. Die vorliegende Erfindung ist auf der Basis dieser neuen Erkenntnis vervollständigt worden.
Deshalb ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren für die Qualitätskontrolle eines abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs bereitzustellen.
Die vorangehenden und andere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann auf dem Gebiet aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung und den beigefügten Patentansprüchen offensichtlich werden, wobei diese im Zusammenhang mit der begleitenden Sequenzauflistung und den Zeichnungen betrachtet werden sollen.
SEQUENZAUFLISTUNG, FREIER TEXT
SEQ ID Nr. 3 und 4 sind von PCR-Primern, welche zum Detektieren einer Mutation des 560. Nucleotids eines Varicella-Impfstoffvirus verwendet werden.
SEQ ID Nr. 5 und 6 stammen von PCR-Primern, verwendet zum Detektieren einer Mutation des 5745. Nucleotids eines Varicella-Impfstoffvirus.
SEQ ID Nr. 7 und 8 sind von PCR-Primern, verwendet zum Detektieren einer Mutation des 26125. Nucleotids eines Varicella-Impfstoffvirus.
SEQ ID Nr. 9 und 10 sind von PCR-Primern, verwendet zum Detektieren einer Mutation des 94167. Nucleotids eines Varicella-Impfstoffvirus.
SEQ ID Nr. 11 und 12 sind von PCR-Primern, verwendet zum Detektieren von Mutationen des 105356., 105544., 124353. und 124541. Nucleotids eines Varicella-Impfstoffvirus.
SEQ ID Nr. 13 und 14 sind von PCR-Primern, verwendet zum Detektieren von Mutationen des 105705., 106262., 123635. und 124192. Nucleotids eines Varicella-Impfstoffvirus.
SEQ ID Nr. 15 und 16 sind von PCR-Primern, verwendet zum Detektieren von Mutationen der 107136., 107252., 122645. und 122761. Nucleotide eines Varicella-Impfstoffvirus.
SEQ ID Nr. 17 und 18 sind von PCR-Primern, verwendet zum Detektieren von Mutationen der 108111. und 121786. Nucleotide eines Varicella-Impfstoffvirus.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
In den Zeichnungen:
Ist 1 eine genetische Karte des Varicellavirus-Oka-Stamms, welche die Anzahl und Richtung von jedem Gen zeigt, wobei
eine synonyme Substitution repräsentiert,
eine nichtsynonyme Substitution repräsentiert,
eine Mutation in einer nicht-codierenden Region repräsentiert, ❍ eine Deletion oder Insertion repräsentiert, alle 20 kb die Genomlänge gezeigt wird, R1 bis R4 repetitive Sequenzen repräsentieren, Ori einen Replikationsstartpunkt repräsentiert, TRL ein "terminal Repeat Long" repräsentiert, UL eine "Unique Long" repräsentiert, IRL eine "Internal Repeat Long" repräsentiert, IRS eine "interne Repetition, kurz (Internal Repeat Short)" repräsentiert, US eine "Unique Short" repräsentiert, und TRS eine "Terminal Repeat Short" repräsentiert; und worin die Nucleotidsequenz von Gen 62 bis Gen 64 und die Nucleotidsequenz von Gen 69 bis Gen 71 zueinander symmetrisch sind (d. h., die zwei Nucleotidsequenzen sind invertierte Repetitionen); und
2 zeigt die Elektropherogramme, welche die Ergebnisse der RFLP-Analysen, welche in Beispiel 4 ausgeführt werden, sind, wobei die zur Behandlung der PCR-Produkte verwendeten Restriktionsenzyme wie folgend sind: 2(a) wurde unter Verwendung von Nla III erhalten, 2(b) wurde unter Verwendung von Alu I erhalten, 2(c) wurde unter Verwendung von BstX I erhalten, 2(d) wurde unter Verwendung von SfaN I erhalten, 2(e) wurde unter Verwendung von Acc II erhalten, 2(f) wurde unter Verwendung von Sac II erhalten, 2(g) wurde unter Verwendung von Sma I erhalten, 2(h) wurde unter Verwendung von BssH II und Nae I in Kombination erhalten, und 2(h) wurde unter Verwendung von Bsr I erhalten, und wobei V den abgeschwächten Oka-Stamm repräsentiert, P den parentalen Oka-Stamm repräsentiert und K den Kawaguchi-Stamm repräsentiert.
Die in der vorliegenden Patentschrift verwendeten Terminologien werden in den folgenden Punkten (a) bis (g) definiert.

(a) VZV: Ein Virus, welches Varicella und Herpes zoster verursacht. "VZV" ist eine Abkürzung für "Varicella-Zoster-Virus", welches häufig lediglich als "Varicellavirus" bezeichnet wird.
(b) Varicella-Impfstoffvirus und Varicella-Impfstoff: Ein Varicella-Impfstoffvirus ist ein aktiver Bestandteil eines Impfstoffs und es ist ein abgeschwächtes Virus. Ein Varicella-Impfstoff ist ein Impfstoff, effektiv zum Verhindern der Infektion mit einem VZV oder des Ausbruchs der Krankheit nach der Infektion.
(c) Abgeschwächter Oka-Stamm: Abgeschwächter Oka-Stamm ist der abgeschwächte Varicellavirus-Oka-Stamm (siehe geprüfte japanische Patentanmeldungs-Veröffentlichung 53-41202 und U.S.-Patent Nr. 3 985 615) oder ein abgeschwächtes Varicellavirus, welches davon abgeleitet ist. Der abgeschwächte Oka-Stamm ist unter der Hinterlegungsnummer VR-795 am 14. März 1975 bei der ATCC hinterlegt worden.
(d) Parentaler Oka-Stamm: Der parentale Oka-Stamm ist der ursprünglich isolierte (virulente) Wildtyp-Varicellavirus-Oka-Stamm.
(e) Qualitätskontrolle: Zur Gewährleistung der Effektivität, Sicherheit und Einheitlichkeit eines Impfstoffs werden Rohmaterialien für einen Impfstoff, Intermediate, erhalten während der Produktion eines Impfstoffs, und Endprodukte verschiedenen Tests oder Analysen zur Bestätigung und Gewährleistung ihrer Qualifikation als ein Impfstoff unterzogen. In Hinsicht auf einen abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoff wird die Qualitätskontrolle des Impfstoffs gegenwärtig in Übereinstimmung mit dem "Pharmaceutical Affairs Law" (dem Gesetz Nr. 145, erlassen 1960), Artikel 42, Punkt 1, und einer Vorschrift mit dem Titel "Dried Attenuated Varicella Virus Live Vaccine" in der Mitteilung Nr. 217 des Japanischen "Ministry of Health and Welfare": Seibutsugakuteki Seizai Kijun (Minimalanforderungen für biologische Produkte) oder den oben erwähnten "Requirements for Varicella Vaccine (Live)" der WHO durchgeführt.
(f) Nucleotidnummer von einer DNA-Sequenz: In der vorliegenden Erfindung stehen sämtliche Nucleotidnummern der Varicellaviren in Übereinstimmung mit dem Nucleotidnummerierungssystem der Nucleotidsequenz der genomischen DNA des Varicellavirus-Dumas-Stamms (Journal of General Virology, 67, 1759–1816, 1986, und GenBank (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Gebäude 38A, Zimmer 8N805, Bethesda, MD 20894, USA), Zugangs-Nr. X04370), welche in SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird. Ferner sind in der vorliegenden Erfindung die Nucleotidsequenzen die Sequenzen eines Sense-Strangs, es sei denn, es wird anderweitig angegeben.
(g) DNA-Mutation: Mutationen in der genomischen DNA des abgeschwächten Oka-Stamms wurden durch Ausführen von Homologiesuchen unter den Nucleotidsequenzen des abgeschwächten Oka-Stamms, des Dumas-Stamms und des virulenten parentalen Oka-Stamms identifiziert. Zum Beispiel wird die DNA-Mutation wie folgend beschrieben: "Das Nucleotid A, welches das 5745. Nucleotid des Dumas-Stamms ist, und ein Nucleotid an einer entsprechenden Stelle des parentalen Oka-Stamms, ist im abgeschwächten Oka-Stamm zu G mutiert worden. Diese Nucleotidmutation ist eine nicht-synonyme Substitution, in welcher Ser mit Pro ersetzt wird."

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein akkurates Verfahren für die Qualitätskontrolle eines abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs bereitgestellt.
Für ein leichtes Verstehen der vorliegenden Erfindung sind die wesentlichen Merkmale und verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unten aufgelistet.

1. Verfahren zur Qualitätskontrolle eines abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs, umfassend das Durchführen einer Sequenzanalyse mit der genomi schen DNA einer Probe des Varicella-Impfstoffvirus und Bestätigen, dass die genomische DNA der Probe des Varicella-Impfstoffvirus die folgenden 5 Nucleotide ohne Mutation konserviert: das 5745. G, das 105356. C, das 105544. G, das 106262. C und das 107252. C; wobei die Nucleotidnummern dem Nucleotidnummerierungssystem der Nucleotidsequenz der genomischen DNA des Varicellavirus-Dumas-Stamms der SEQ ID Nr. 1 entsprechen.
2. Verfahren gemäß obigem Punkt 1, wobei die Konservierung der Kombination von 5 Nucleotiden durch eine RFLP-Analyse unter Verwendung der folgenden Primer bestätigt wird: ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 5 und 6 zur Bestätigung des 5745. G; ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 11 und 12 zur Bestätigung des 105356. C und des 105544. G; ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 13 und 14 zur Bestätigung des 106262. C; und ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 15 und 16 zur Bestätigung des 107252. C.
3. Verfahren gemäß obigem Punkt 1 oder 2, das weiterhin Folgendes umfasst: Bestätigen, dass die genomische DNA der Probe des Varicella-Impfstoffvirus die folgenden 4 Nucleotide ohne Mutation konserviert: das 122645. G, das 123635. G, das 124353. C und das 124541. G; wobei die Nucleotidnummern dem Nucleotidnummerierungssystem der Nucleotidsequenz der genomischen DNA des Varicellavirus-Dumas-Stamms der SEQ ID Nr. 1 entsprechen.
4. Verfahren gemäß obigem Punkt 3, wobei die Konservierung der 4 Nucleotide durch eine RFLP-Analyse unter Verwendung der folgenden Primer bestätigt wird: ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 11 und 12 zur Bestätigung des 124353. C und des 124541. G; ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 13 und 14 zur Bestätigung des 123635. G; und ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 15 und 16 zur Bestätigung des 122645. G.
5. Verfahren gemäß einem der obigen Punkte 1 bis 4, das weiterhin Folgendes umfasst: Bestätigen, dass die genomische DNA der Probe des Vartcella-Impfstoffvirus die folgenden 49 Nucleotide ohne Mutation konserviert: das 560. C, das 703. Y, das 763. Y, das 2515. Y, das 10900. Y, das 12779. Y, das 19431. Y, das 26125. G, das 31732. Y, das 38036. Y, das 39227. K, das 58595. R, das 59287. R, das 64067. R, das 71252. Y, das 82225. R, das 84091. R, das 87280. R, das 87306. Y, das 89734. R, das 90535. R, das 94167. C, das 97748. R, das 97796. Y, das 101089. R, das 105169. R, das 105310. R, das 105705. C, das 106710. R, das 107136. C, das 107599. R, das 107797. R, das 108111. C, das 108838. R, das 109137. R, das 109200. R, das 111650. R, das 118247. Y, das 120697. Y, das 120760. Y, das 121059. Y, das 121786. G, das 122100. Y, das 122298. Y, das 122761. G, das 123187. Y, das 124192. G, das 124587. Y und das 124728. Y; wobei die Nucleotidnummern dem Nucleotidnummerierungssystem der Nucleotidsequenz der genomischen DNA des Varicellavirus-Dumas-Stamms der SEQ ID Nr. 1 entsprechen; R für A oder G steht; Y für C oder T steht; und K für G oder T steht.
6. Verfahren gemäß obigem Punkt 5, wobei die Konservierung des 560. C, des 26125. G, des 94167. C, des 105705. C, des 107136. C, des 108111. C, des 121786. G, des 122761. G und des 124192. G unter den 49 Nucleotiden durch eine RFLP-Analyse unter Verwendung der folgenden Primer bestätigt wird: ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 3 und 4 zur Bestätigung des 560. C; ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 7 und 8 zur Bestätigung des 26125. G; ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 9 und 10 zur Bestätigung des 94167. C; ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 13 und 14 zur Bestätigung des 105705. C und des 124192. G; ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 15 und 16 zur Bestätigung des 107136. C und des 122761. G; und ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 17 und 18 zur Bestätigung des 108111. C und des 121786. G.
7. Verfahren gemäß einem der obigen Punkte 1 bis 6, das weiterhin Folgendes umfasst: Bestätigen von Deletionsmutationen in zwei Replikationsstartpunkten der genomischen DNA der Probe des Varicella-Impfstoffvirus; wobei die zwei Replikationsstartpunkte einen Bereich, der dem 110087. bis 110350. Nucleotid des Sense-Strangs der genomischen DNA des Varicellavirus-Dumas-Stamms der SEQ ID Nr. 1 entspricht, bzw. einen Bereich, der dem 119547. bis 119810. Nucleotid der genomischen DNA des Antisense-Strangs des genannten Dumas-Stamms entspricht, bilden; und wobei die Deletionsmutationen in Bezug auf Segmente stattfinden, die jeweils die Nucleotidsequenz ATATATATA aufweisen, die in Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende angeordnet ist, wobei es sich bei den Segmenten um ein Segment, das dem 110219. bis 110227. Nucleotid des Sense-Strangs der genomischen DNA des Dumas-Stamms entspricht, und ein Segment, das dem 119670. bis 119678. Nucleotid des Antisense-Strangs der genomischen DNA des Dumas-Stamms entspricht, handelt.
8. Verfahren gemäß einem der obigen Punkte 1 bis 7, das weiterhin Folgendes umfasst: Bestätigen, dass die repetitive Sequenz eines ganzen R1-Bereichs der genomischen DNA der Probe des Varicella-Impfstoffvirus die Nucleotidsequenz abbabba'bbb'abababx ist, die in Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende angeordnet ist; wobei a der Nucleotidsequenz GGACGCGATCGACGACGA entspricht, a' der Nucleotidsequenz GGACGCGATTGACGACGA entspricht, b der Nucleotidsequenz GGGAGAGGCGGAGGA entspricht, b' der Nucleotidsequenz GGACGCGGCGGAGGA entspricht und x der Nucleotidsequenz GGA entspricht, wobei der ganze R1-Bereich ein Bereich ist, der dem 13937. bis 14242. Nucleotid der genomischen DNA des Varicellavirus-Dumas-Stamms der SEQ ID Nr. 1 entspricht.
9. Verfahren gemäß einem der obigen Punkte 1 bis 8, das weiterhin Folgendes umfasst: Bestätigen, dass die repetitive Sequenz jedes der beiden ganzen R4-Bereiche der genomischen DNA der Probe des Varicella-Impfstoffvirus die Nucleotidsequenz aaaaaaaaaaaax ist, die in Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende angeordnet ist; wobei a der Nucleotidsequenz CCCCGCCGATGGGGAGGGGGCGCGGTA entspricht; und x der Nucleotidsequenz CCCCGCCGATG entspricht; wobei es sich bei den beiden ganzen R4-Bereichen um einen Bereich, der dem 109762. bis 109907. Nucleotid des Sense-Strangs der genomischen DNA des Varicellavirus-Dumas-Stamms der SEQ ID Nr. 1 entspricht, und einen Bereich, der dem 119990. bis 120135. Nucleotid des Antisense-Strangs der genomischen DNA des Dumas-Stamms entspricht, handelt.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlich beschrieben.
Während des Verlaufs von Untersuchungen zur Vervollständigung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung bestimmten die Erfinder der vorliegenden Anmeldung erstmalig die gesamte Nucleotidsequenz der genomischen DNA des abgeschwächten Oka-Stamms (hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer VR-795 am 14. März 1975 bei der ATCC (Amerikanische Kultur-Typ-Sammlung bzw. American Type Culture Collection; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA)). Diese Sequenz wird in SEQ ID Nr. 2 gezeigt. Ferner, unter Verwendung der ermittelten gesamten genomischen DNA-Sequenz des abgeschwächten Oka-Stamms, führten die Erfinder der vorliegenden Anmeldung eine Homologiesuche unter den gesamten genomischen DNA-Sequenzen des Dumas-Stamms, des parentalen Oka-Stamms und des abgeschwächten Oka-Stamms durch. Als ein Ergebnis offenbarten die Erfinder der vorliegenden Anmeldung die Nucleotidmutationen des abgeschwächten Oka-Stamms (d. h. die Nucleotide des abgeschwächten Oka-Stamms, welche zu den Nucleotiden des Dumas-Stamms und/oder des parentalen Oka-Stamms an den entsprechenden Stellen verschieden sind), welche in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt sind. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung nahmen weitere Analysen der Nucleotidmutationen vor und identifizierten die synonymen Substitutionen (keine aus den Nucleotidmutationen resultierende Aminosäureersetzung) und nicht-synonymen Substitutionen (aus den Nucleotidmutationen resultierende Aminosäureersetzungen); Mutatio nen in nicht-codierenden Regionen (ncr-Mutation); Stop-Codon-Mutationen (ochre/amber-Mutation); Anzahl von Repetitionen und die Sequenzgröße der repetitiven Sequenzen und die Unterschiede in der Reihenfolge der Repetitionen; und Mutationen in den Replikationsstartpunkten (invertierte Repetitionen; siehe 1). Wie nachstehend ausführlich erläutert wird, sind die Mutationen des abgeschwächten Oka-Stamms, welche von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung offenbart worden sind, nützlich zum Unterscheiden des abgeschwächten Oka-Stamms von anderen Varicellavirus-Stämmen, insbesondere von den virulenten Stämmen, und deshalb können diese Mutationen für die Qualitätskontrolle des abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs verwendet werden.
Unter den Nucleotidmutationen des abgeschwächten Oka-Stamms, die in der Tabelle 1 gezeigt werden, zeigen die bedeutsamen Mutationen das XXY-Muster oder das XX(X/Y)-Muster. Die Mutation, welche das XXY-Muster zeigt, ist eine Mutation, worin ein Nucleotid des parentalen Oka-Stamms identisch zu einem entsprechenden Nucleotid des Dumas-Stamms ist (d. h. beide Nucleotide sind "X"), aber das entsprechende Nucleotid des abgeschwächten Oka-Stamms ist ein mutiertes Nucleotid (d. h. das Nucleotid ist mutiert zu "Y"). Eine derartige Mutation ist einzigartig für den abgeschwächten Oka-Stamm. Die Mutation, welche das XX(X/Y)-Muster zeigt, ist eine Mutation, worin ein Nucleotid des parentalen Oka-Stamms identisch zu einem entsprechenden Nucleotid des Dumas-Stamms ist (d. h. beide Nucleotide sind "X"), aber ein entsprechendes Nucleotid des abgeschwächten Oka-Stamms ist eine Mischung eines Nucleotids, welches identisch zu demjenigen des Dumas-Stamms ist, und eines mutierten Nucleotids (d. h. die Mischung aus dem identischen Nucleotid "X" und dem mutierten Nucleotid "Y"). In dem Genom des abgeschwächten Oka-Stamms gibt es 18 Nucleotidmutationen, welche das XXY-Muster zeigen, und 40 Nucleotidmutationen, welche das XX(X/Y)-Muster zeigen. Unter der Gesamtheit von 58 Nucleotidmutationen werden 49 Nucleotidmutationen in den codierenden Regionen gefunden, 8 Nucleotidmutationen werden in den nicht-codierenden Regionen gefunden, und 1 Nucleotidmutation wird in einem Stop-Codon gefunden. Ferner sind unter den 49 Nucleotidmutationen in den codierenden Regionen 29 Nucleotidmutationen nicht-synonyme Substitutionen und 20 Nucleotidmutati onen sind synonyme Substitutionen. Weitere detaillierte Analysen zeigten, dass unter den 18 Nucleotidmutationen, welche das XXY-Muster zeigen, 9 Nucleotidmutationen nichtsynonyme Substitutionen sind, 8 Nucleotidmutationen synonyme Substitutionen sind und 1 Nucleotidmutation in einer nichtcodierenden Region gefunden wird. Die folgenden Nucleotidmutationen, welche das XXY-Muster zeigen und nicht-synonyme Substitutionen sind, sind einzigartig für den abgeschwächten Oka-Stamm: das 5745. G von Gen 6; das 105356. C, 105544. G, 106262. C und das 107252. C von Gen 62; und das 122645. G, 123635. G, 124353. C und 124541. G von Gen 71. Diese einzigartigen Nucleotide des abgeschwächten Oka-Stamms werden als eng zusammenhängend mit der Attenuierung und Sicherheit eines Varicellavirus betrachtet, und daher sind diese Nucleotide sehr wichtig. Unter den oben erwähnten 9 Nucleotiden werden 4 Nucleotide in Gen 62 gefunden, und 4 Nucleotide werden im Gen 71 gefunden. Da das Gen 62 und das Gen 71 in den invertierten Repetitionen enthalten sind (siehe 1), wird in der vorliegenden Erfindung die Qualitätskontrolle eines abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs durchgeführt durch Unterziehen der genomischen DNA einer Probe des Varicella-Impfstoffvirus unter eine Sequenzanalyse und Bestätigen, dass das oben erwähnte 1 Nucleotid von Gen 6 und 4 Nucleotide von Gen 62 ohne Mutation konserviert sind. Zur Verbesserung der Exaktheit der Qualitätskontrolle wird es bevorzugt, dass bezüglich des Probenvirus ferner bestätigt wird, dass es die oben erwähnten 4 Nucleotide von Gen 71 ohne Mutation konserviert.
Ferner, in der vorliegenden Erfindung, wird es bevorzugt, zu bestätigen, dass die Probe des Varicella-Impfstoffvirus, ohne Mutation, alle 58 Nucleotide konserviert, welche für den abgeschwächten Oka-Stamm einzigartig sind. Spezifisch gesagt, zusammen mit den oben erwähnten einzigartigen Nucleotiden des abgeschwächten Oka-Stamms, welche das XXY-Muster zeigen und nicht-synonyme Substitutionen sind, wird die Konservierung der folgenden 49 Nucleotide ohne Mutation in der vorliegenden Erfindung bestätigt:
das 560. C, das 703. Y, das 763. Y, das 2515. Y, das 10900. Y, das 12779. Y, das 19431. Y, das 26125. G, das 31732. Y, das 38036. Y, das 39227. K, das 58595. R, das 59287. R, das 64067. R, das 71252. Y, das 82225. R, das 84091. R, das 87280. R, das 87306. Y, das 89734. R, das 90535. R, das 94167. C, das 97748. R, das 97796. Y, das 101089. R, das 105169. R, das 105310. R, das 105705. C, das 106710. R, das 107136. C, das 107599. R, das 107797. R, das 108111. C, das 108838. R, das 109137. R, das 109200. R, das 111650. R, das 118247. Y, das 120697. Y, das 120760. Y, das 121059. Y, das 121786. G, das 122100. Y, das 122298. Y, das 122761. G, das 123187. Y, das 124192. G, das 124587. Y und das 124728. Y,
worin R für A oder G steht, Y für C oder T steht, und K für G oder T steht.
Zusätzlich zu den oben erwähnten 58 Nucleotidmutationen wurden die folgenden einzigartigen Mutationen des abgeschwächten Oka-Stamms durch die Homologiesuche gefunden, durchgeführt unter den gesamten genomischen DNA-Sequenzen des Dumas-Stamms, des parentalen Oka-Stamms und des abgeschwächten Oka-Stamms: eine Deletionsmutation im Replikationsstartpunkt, eine Mutation in der repetitiven Region R1 von Gen 11 und eine Mutation in der repetitiven Region R4 der nicht-codierenden Regionen.
In einem Varicellavirus-Genom gibt es zwei Replikationsstartpunkte, welche in den invertierten Repetitionen enthalten sind (siehe 1). Die Replikationsstartpunkte sind ein Bereich, der dem 110087. bis 110350. Nucleotid des Sense-Strangs der genomischen DNA des Dumas-Stamms entspricht, bzw. ein Bereich, der dem 119547. bis 119810. Nucleotid des Antisense-Strangs der genomischen DNA des Dumas-Stamms entspricht. Die Nucleotidsequenz des Sense-Strangs wird in der Tabelle 4 gezeigt. Wie aus der Tabelle 4 ersichtlich ist, findet die Deletion in den Replikationsstartpunkten des abgeschwächten Oka-Stamms in Bezug auf Segmente statt, die jeweils eine Nucleotidsequenz TATATATATATATA aufweisen, die in Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende angeordnet ist, und bei den Segmenten handelt es sich um ein Segment, das dem 110214. bis 110227. Nucleotid des Sense-Strangs entspricht, und ein Segment, das dem 119670. bis 119683. Nucleotid des Antisense-Strangs entspricht. In der vorliegenden Erfindung wird es bevorzugt, dass die Gegenwart dieser Deletion ferner bestätigt wird. Spezifisch kann diese Deletion bestätigt werden durch Bestimmen der Gegenwart oder Abwesenheit der Segmente, welche jeweils eine Nucleotidsequenz von ATATATATA aufweisen, die dem 110219. bis 110227. Nucleotid des Sense-Strangs und den 119670. bis 119678. Nucleotid des Antisense-Strangs entspricht.
Die repetitive Region R1 von Gen 11 ist eine Region, entsprechend den 13937. bis 14242. Nucleotid der genomischen DNA des Dumas-Stamms, und die Nucleotidsequenz der R1-Region ist in der Tabelle 5 gezeigt. Wie aus der Tabelle 5 offensichtlich ist, ist die Nucleotidsequenz der R1-Region des abgeschwächten Oka-Stamms nicht nur unterschiedlich zu derjenigen des Dumas-Stamms, sondern auch des parentalen Oka-Stamms. Deshalb wird es, für die Qualitätskontrolle des Impfstoffs, bevorzugt, dass von der R1-Region der Probe des Varicella-Impfstoffvirus bestätigt wird, identisch mit der R1-Region des abgeschwächten Oka-Stamms zu sein. Spezifisch wird es bestätigt, dass die repetitive Sequenz einer ganzen R1-Region der genomischen DNA der Probe des Varicella-Impfstoffvirus die Nucleotidsequenz abbabba'bbb'abababx ist, die in Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende angeordnet ist (wobei a der Nucleotidsequenz GGACGATCGACGACGA entspricht; a' der Nucleotidsequenz GGACGCGATTGACGACGA entspricht; b der Nucleotidsequenz GGGAGAGGCGGAGGA entspricht; b' der Nucleotidsequenz GGACGCGGCGGAGGA entspricht; und x der Nucleotidsequenz GGA entspricht).
In einem Varicellavirusgenom werden zwei repetitive Bereiche bzw. Regionen R4, welche in den invertierten Repetitionen enthaften sind, in den nichtcodierenden Regionen gefunden (siehe 1). Die R4-Regionen sind eine Region, entsprechend dem 109762. bis 109907. Nucleotid des. Sense-Strangs der genomischen DNA des Dumas-Stamms, und eine Region, entsprechend dem 119990. bis 120135. Nucleotid des Antisense-Strangs der genomischen DNA des Dumas-Stamms. Die Nucleotidsequenz der R4-Region in der Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende ist in der Tabelle 7 gezeigt. Wie aus der Tabelle 7 offensichtlich ist, ist die repetitive Sequenz der R4-Region des abgeschwächten Oka-Stamms nicht nur unterschiedlich von derjenigen des Dumas-Stamms, sondern auch des parentalen Oka-Stamms. Daher wird es für die Qualitätskontrolle des Impfstoffs bevorzugt, dass von der R4-Region der Probe des Varicella-Impfstoffvirus bestätigt wird, identisch mit der R4-Region des abgeschwächten Oka-Stamms zu sein. In spezifischer Weise wird es bestätigt, dass die repetitive Sequenz von jeder der zwei ganzen R4-Regionen der genomischen DNA der Probe des Varicella-Impfstoffvirus eine Nucleotidsequenz aaaaaaaaaaaax ist, die in Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende angeordnet ist (wobei a der Nucleotidsequenz CCCCGCCGATGGGGAGGGGGCGCGGTA entspricht; und x der Nucleotidsequenz CCCCGCCGATG entspricht).
Darüber hinaus sind die in der Tabelle 6 gezeigten Mutationen in der repetitiven Region R3 von Gen 22 gefunden worden. Allerdings besteht, wie aus der Tabelle 6 offensichtlich ist, eine große Diversität unter den repetitiven Sequenzen der R3-Region des abgeschwächten Oka-Stamms und des parentalen Oka-Stamms.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist vervollständigt worden, basierend auf den oben genannten Nucleotidmutationen, welche einzigartig für den abgeschwächten Oka-Stamm sind. Deshalb können die in den Verfahren für die Qualitätskontrolle der vorliegenden Erfindung angewandten Vorgehensweisen nicht nur für die Qualitätskontrolle eines abgeschwächten Varicellavirus-Lebendimpfstoffes eingesetzt werden (d. h. zur Bestimmung, ob ein Animpfvirus für einen Impfstoff, ein abgeschwächtes Varicellavirus als ein Rohmaterial eines Impfstoffs oder ein Lebendimpfstoff mutiert worden ist oder nicht), sondern auch für die Identifizierung eines Virusstamms, welcher fähig zum Funktionieren als ein abgeschwächtes Varicella-Impfstoffvirus ist (ein Virus, das als ein Wirkstoff eines Varicella-Impfstoffs verwendet werden kann), und zur Analyse eines virulenten Stamms (der parentale Oka-Stamm oder ein natürlicher Wildtyp-Stamm). Weiterhin sieht das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine exakte und vorteilhafte Technik vor, um zur Verfolgung der Effekte der Impfung und für die Forschungen auf dem Gebiet der Epidemiologie von Varicella und Zoster eingesetzt zu werden, und stellt des Weiteren eine exakte Maßnahme zur Prävention von Varicella und Zoster bereit.
Die spezifischen Verfahren zur Durchführung der Qualitätskontrolle der vorlie genden Erfindung werden nachstehend ausführlich beschrieben.
Herstellung einer genomischen DNA einer Probe des Varicellavirus: In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können eine Virussuspension oder eine Massen- bzw. Bulk-Impfstofflösung zur Verwendung als Wirkstoff eines abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs, eine Virussuspension, erhalten durch Propagieren eines gewünschten VZV, und Vesikelfluid und dergleichen, erhalten aus einem natürlich infizierten Varicella-Patienten, als eine Probe des Varicellavirus verwendet werden. Die genomische DNA kann extrahiert und direkt durch ein herkömmliches Verfahren aus den Probenviren gereinigt werden. Alternativ dazu können Zellen mit VZV, welches als das Probenvirus verwendet werden soll, infiziert werden, und die genomische DNA des Virus kann aus den infizierten Zellen durch ein herkömmliches Verfahren extrahiert und gereinigt werden (in Hinsicht auf die Verfahren zum Extrahieren und Reinigen einer DNA kann Bezug genommen werden auf "Current Protocol in Molecular Biology", Band 1, Kapitel 2, 2.0.1–2.6.12, John Wiley & Sons, Inc., 1987–2000 (das Lose-Blatt-System)). Zur Vermehrung des VZV können WI-38-Zellen und MRC-5-Zellen verwendet werden. Es wird bevorzugt, dass das Vesikelfluid, welches als ein Material zum Isolieren, Propagieren und Herstellen eines frischen Wildtypstamms oder eines epidemischen Stamms verwendet wird, aus einem natürlich infizierten Patienten innerhalb von drei Tagen nach dem Ausbruch von Varicella erhalten wird.
Herstellung von PCR-Primern: Eine gewünschte Nucleotidsequenz einer genomischen VZV-DNA kann durch ein PCR-Verfahren amplifiziert werden. Zuerst werden Polynucleotidstränge, bestehend aus zusammenhängenden Sequenzen von etwa 15 bis 30 Nucleotiden, welche der 5'-terminalen Sequenz der Sense- und Antisense-Sequenzen der gewünschten Region entsprechen, durch ein DNA-Synthesegerät hergestellt. Die hergestellten Polynucleotidstränge werden als ein Paar von Primern verwendet. Die ganze genomische DNA-Sequenz des abgeschwächten Oka-Stamms, welche in SEQ ID Nr. 2 und den Patentdokumenten gezeigt ist, welche unter "Stand der Technik" der Patentschrift aufgeführt sind (U.S.-Patent Nr. 6 093 535 und Internationale Anmeldungs-Veröffentlichung WO 00/50603), kann als Referenz beim Entwerfen der PCR-Primer herangezogen werden.
Bestimmung der Nucleotidsequenz der PCR-Produkte: Vom Gesichtspunkt der Einsparung von Arbeitsaufwand zur Durchführung der Experimente wird es bevorzugt, dass die PCR-Produkte durch ein direktes DNA-Sequenzierungsverfahren ohne die Herstellung einer genomischen DNA-Bank analysiert werden (dieses Verfahren ist beschrieben in "Current Protocol in Molecular Biology", Band 3, Kapitel 15, 15.2.1–15.2.11, ditto). In diesem Verfahren kann die Sequenzierung einer Nucleotidsequenz durch herkömmliche Verfahren bestimmt werden, zum Beispiel das Didesoxy-Verfahren, ein Verfahren unter Verwendung des Cycle-Sequence-Kits (hergestellt und vertrieben von TAKARA SHUZO Co. Ltd., Japan), und ein Verfahren unter Verwendung des DNA-Sequenzierungs-Kits (hergestellt und vertrieben von Perkin Elmer Applied Biosystems, USA).
Homologiesuche von DNA-Sequenzen: Die Homologiesuche von DNA-Sequenzen kann durchgeführt werden unter Verwendung von kommerziell verfügbar Computer-Software zur Genanalyse. Zum Beispiel können GENETYX-WIN (Ver. 3.1) (hergestellt und vertrieben von Software Development Co. Ltd., Japan), DNASIS (Ver. 3.7) (hergestellt und vertrieben von Hitachi Software Engineering Co., Ltd., Japan), FASTA (http://www.ddjb.nig.ac.jp/), und BLAST (http://ww.ncbi.nlm.nih.gov/) verwendet werden. Ob ein Proben-Varicella-Impfstoffvirus eine spezifische Nucleotidsequenz des abgeschwächten Varicella-Oka-Stamms, die in der vorliegenden Patentschrift offenbart wird, aufweist, oder nicht, kann durch eine Homologiesuche ermittelt werden.
Bestätigung einer Nucleotidmutation durch eine RFLP-Analyse: Zusätzlich zu der Homologiesuche, die nach Bestimmen der (ganzen oder partiellen) Nucleotidsequenz der genomischen DNA eines Probevirus durchgeführt wird, kann eine RFLP-Analyse (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus) durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass die einzigartigen Nucleotide des abgeschwächten Oka-Stamms von dem Probe-Virus ohne Mutation konserviert werden. Spezifisch werden Polynucleotidstränge, die aus zusammenhängenden Sequenzen von etwa 15 bis 30 Nucleotiden bestehen, welche der 5'-terminalen Sequenz der Sense- und Antisense-Sequenzen der gewünschten Region entsprechen, durch ein DNA-Synthesegerät hergestellt, und die hergestellten Polynucleotidstränge werden als ein Paar von PCR-Primern verwendet. Ein Paar von PCR-Primern wird gleichzeitig zur Amplifizierung der gewünschten Region verwendet, welche als eine Proben-DNA verwendet werden soll. Derartig erhaltene Proben-DNA wird mit einem Restriktionsenzym verdaut und auf eine Gelelektrophorese aufgetragen. Die Gegenwart einer Mutation kann durch den Unterschied in der Größe der detektierten DNA-Fragmente bestimmt werden. Die RFLP-Analyse, welche einfacher durchzuführen ist als die Homologiesuche, wird bevorzugt in dem Verfahren zur Qualitätskontrolle der vorliegenden Erfindung verwendet. In Hinsicht auf die 9 spezifischen Nucleotidmutationen des abgeschwächten Oka-Stamms, welche das XXY-Muster aufzeigen und welche nicht-synonyme Substitutionen sind (das 5745. G, das 105356. C, das 105544. G, das 106262. C, das 107252. C, das 122645. G, das 123635. G, das 124353. C und das 124541. G), und das 560. C, das 26125. G., das 94167. C, das 105705. C, das 107136. C, das 108111. C, das 121786. G, das 122761. G und das 124192. G unter den restlichen 49 Nucleotidmutationen des abgeschwächten Oka-Stamms, kann die Gegenwart oder die Abwesenheit der Mutationen durch die RFLP-Analyse unter Verwendung der acht Primerpaare bestimmt werden, welche in der Tabelle 8 gezeigt sind (SEQ ID Nr. 3 bis 18). Die Restriktionsstellen der PCR-Produkte, welche erhalten wurden durch Verwendung der in Tabelle 8 gezeigten PCR-Primer, sind in der Tabelle 9 zusammengefasst, zusammen mit den Größen der Restriktionsfragmente. Zum Beispiel kann die Mutation von Gen 6 (das 5745. Nucleotid G, das im Gen 6 des abgeschwächten Oka-Stamms gefunden wird) detektiert werden durch die Abwesenheit oder Gegenwart der Stelle für das Restriktionsenzym Alu I. Spezifisch wird ein 763 bp großes DNA-Fragment, entsprechend den 5372. bis 6134. Nucleotiden der genomischen DNA einer Probe des Varicella-Impfstoffvirus, unter Verwendung der Primer 01-N12 und 01-R13 amplifiziert, die in der Tabelle 8 gezeigt sind. Das amplifizierte Fragment wird mit Alu I verdaut und auf eine Agarosegelelektrophorese aufgetragen. Im Fall eines virulenten Stamms wird das PCR-Produkt in drei Fragmente geschnitten (170 bp, 205 bp und 388 bp). Andererseits wird das PCR-Produkt des abgeschwächten Oka-Stamms in zwei Fragmente zerschnitten (170 bp und 593 bp). Deshalb kann aus dem Restriktionsfragmentmuster bestimmt werden, ob eine Probe des Varicella-Impfstoffvirus ein Virus ist, welches zum Funktionieren als ein Impfstoffstamm fähig ist, oder nicht.
In der vorliegenden Erfindung werden die 9 einzigartigen Nucleotidmutationen des abgeschwächten Oka-Stamms, welche das XXY-Muster aufzeigen und nichtsynonyme Substitutionen sind, vorzugsweise mittels der RFLP-Analyse unter Verwendung der folgenden Primer bestätigt: ein Paar von Primern von SEQ ID Nr. 5 und 6 in Hinblick auf die Bestätigung des 5745. G; und ein Paar von Primern von SEQ ID Nr. 11 und 12 in Hinblick auf die Bestätigung des 105356. C, des 105544. G, des 124353. C und des 124541. G; ein Paar von Primern von SEQ ID Nr. 13 und 14 in Hinblick auf die Bestätigung des 106262. C und des 123635. G; und ein Paar von Primern von SEQ ID Nr. 15 und 16 in Hinblick auf die Bestätigung des 107252. C und des 122645. G. Weil Gen 62 und Gen 71 invertierte Repetitionen sind (siehe 1), kann die Qualitätskontrolle eines abgeschwächten Varicella-Lebendvirus durch Bestätigung der Konservierung von mindestens 5 Nucleotiden (nämlich 1 Nucleotid von Gen 6 und 4 Nucleotide von Gen 62) mittels RFLP-Analyse durchgeführt werden.
Wie obenstehend erwähnt, wurden die ganze genomische DNA-Sequenz des abgeschwächten Oka-Stamms (SEQ ID Nr. 2) und die Nucleotidmutationen, welche einzigartig für den abgeschwächten Oka-Stamm sind, erstmalig von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung offenbart. Da die einzigartigen Nucleotidmutationen des abgeschwächten Oka-Stamms als sehr wichtig für die Attenuierung bzw. Abschwächung von Varicellaviren angesehen werden, kann ein abgeschwächter Stamm durch Einführen einer Nucleotidsubstitution in eine genomische DNA eines virulenten Stamms (zum Beispiel eines Wildtyp-VZV-Stamms oder eines epidemischen Stamms) oder durch Induzieren einer Aminosäuremutation in einem virulenten Stamm konstruiert werden. Das in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (15), 7376–7380, 1998, beschriebene Verfahren kann als eine gentechnische Verfahrensweise zum Induzieren einer Nucleotid- oder Aminosäuremutation verwendet werden. Spezifisch können die 58 Nucleotidmutationen, welche für den abgeschwächten Oka-Stamm einzigartig sind, als ein Index zum Induzieren einer Mutation bei einem virulenten Stamm verwendet werden, und die 9 Nucleotidsubstitutionen, welche nicht-synonyme Substitutionen sind, sind besonders nützlich. Unter Berücksichtigung der Tatsache, das Gen 62 und Gen 71 in den invertierten Repetitionen enthalten sind (siehe 1) werden darüber hinaus unter den oben genannten Nucleotidsubstitutionen mindestens 5 Nucleotidmutationen (nämlich eine Mutation, die in Gen 6 gefunden wird, und die Mutationen, welche entweder im Gen 62 oder Gen 71 gefunden werden) als sehr bedeutsam angesehen.
BESTE FORM ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Hierin nachstehend wird die vorliegende Erfindung in weiterer Ausführlichkeit unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben werden, aber diese sollten nicht als den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränkend ausgelegt werden.
Beispiel 1
Der abgeschwächte Oka-Stamm (abgeschwächter Impfstoffstamm) und sein parentaler Stamm (parentaler Oka-Stamm; ein virulenter Stamm, welcher nicht abgeschwächt ist) wurden individuell in MRC-5-Zellen inokuliert, um dadurch infizierte Zellen zu erhalten. Die genomischen DNAs des abgeschwächten Oka-Stamms und des parentalen Oka-Stamms wurden einzeln aus den infizierten Zellen durch Phenolextraktion und Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktion extrahiert und mittels Ethanolfällung gereinigt, wodurch DNA erhalten wurde. PCR-Produkte, welche das gesamte Genom jedes Stamms abdecken, wurden unter Verwendung der erhaltenen DNA als einer Matrize und von 88 synthetischen Primern (44 Primerpaaren) hergestellt. Anschließend wurden die Nucleotidsequenzen der PCR-Produkte durch das direkte DNA-Sequenzierungsverfahren unter Verwendung von 520 synthetischen Primern und des DNA-Sequenzierungs-Kits (hergestellt und vertrieben von Perkin Elmer Applied Biosystems, USA) bestimmt. Unter Verwendung der ganzen genomischen Sequenz des Dumas-Stamms (virulenter Stamm), welche in SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird, als ein Standard wurde die Homologiesuche im Hinblick auf die erhaltenen ganzen genomischen DNA-Sequenzen des abgeschwächten Oka-Stamms und des parentalen Oka-Stamms durchgeführt. DNASIS (Version 3.7) (hergestellt und vertrieben von Hitachi Software Engineering Co., Ltd., Japan) wurde zur Durchführung der Homologiesuche verwendet. Die Charakteristika des abgeschwächten Oka-Stamms, welche aus der Homologiesuche offensichtlich wurden, sind in den Tabellen 1 bis 7 zusammengefasst.
Die Nucleotidmutationen, welche durch Vergleichen der Sequenzen unter den drei Varicella-Stämmen (Dumas-Stamm, parentaler Oka-Stamm und abgeschwächter Oka-Stamm) detektiert wurden, sind in der Tabelle 1 aufgelistet. Spezifisch werden die Nucleotidnummer, die Gen-Nummer, das mutierte Nucleotid und die von der Nucleotidmutation verursachte Aminosäuremutation für jede Nucleotidmutation beschrieben. In der Tabelle 1 entspricht Y einer Pyrimidinbase (d. h. C oder T), R entspricht einer Purinbase (d. h. A oder G), K entspricht G oder T, (ncr) entspricht einer nicht-codierenden Region, ein Alphabet-Buchstabe in Klammern (zum Beispiel "(W)") ist eine Ein-Buchstaben-Abkürzung einer Aminosäure, (och) entspricht dem ochre-Codon, (amb) entspricht dem amber-Codon, (W/R) steht für Tryptophan (W) oder Arginin (R), und (del) steht für Deletion.
Unter den Mutationen, welche in der Tabelle 1 aufgelistet sind, sind die Mutationen, welche durch die Sequenzausrichtung zwischen dem abgeschwächten Oka-Stamm und dem parentalen Oka-Stamm detektiert wurden, in der Tabelle 2 aufgelistet. Spezifisch werden die Nucleotidnummer, die Gen-Nummer, das mutierte Nucleotid und die von der Nucleotidmutation verursachte Aminosäuremutation für jede Nucleotidmutation beschrieben. In der Tabelle 2 steht X/Y für X oder Y, und eine Drei-Buchstaben-Abkürzung einer Aminosäure, die von einem Nucleotid codiert wird, ist in Klammern, nachfolgend zum Nucleotid, gezeigt (wenn ein Nucleotid in einer nicht-codierenden Region lokalisiert ist, folgt dem Nucleotid ein "(ncr)"). Alle anderen in der Tabelle 2 verwendeten Abkürzungen sind die gleichen, wie diejenigen, welche in der Tabelle 1 verwendet werden.
Die in den Tabellen 1 und 2 beschriebenen Nucleotidmutationen sind in der Tabelle 3, basierend auf den Mutationsmustern, zusammengefasst. Die Mutationsmuster und deren Häufigkeit sind gemeinsam mit den Einzelheiten der Mutationsmuster, d. h. den spezifischen Typen der Mutation (eine Stopcodon(och/amb)-Mutation, eine synonyme oder nicht-synonyme Substitution und Deletion (oder Addition)) und der Häufigkeit von jedem Mutationstyp aufgelistet.
Die auf den Tabellen 1 bis 3 basierenden Befunde werden nachstehend ausführlich erläutert.
Unter den hauptsächlichen Nucleotid- und Aminosäuremutationen, welche durch den Vergleich zwischen den ganzen genomischen DNA-Sequenzen des abgeschwächten Oka-Stamms und des parentalen Oka-Stamms bestimmt wurden, wurde von den unter den folgenden Punkten (a) bis (f) beschriebenen Mutationen festgestellt, besonders nützlich und wichtig für die Qualitätskontrolle eines abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs zu sein.

(a) Es gab 58 bedeutsame Nucleotidmutationen des abgeschwächten Oka-Stamms, nämlich 18 Nucleotidmutationen, welche das XXY-Muster zeigten, und 40 Nucleotidmutationen, welche das XX(X/Y)-Muster zeigten.
(b) Unter den oben erwähnten 58 Mutationen wurden 49 Mutationen in den codierenden Regionen gefunden, 8 Mutationen wurden in den nicht-codierenden Regionen gefunden, und 1 Mutation wurde in einem Stop-Codon gefunden.
(c) Unter den 49 Mutationen, welche in den codierenden Regionen gefunden wurden, waren 29 Mutationen nicht-synonyme Substitutionen, und 20 Mutationen waren synonyme Substitutionen.
(d) Unter den 18 Mutationen, welche das XXY-Muster zeigen, waren 9 Mutationen nicht-synonyme Substitutionen, 8 Mutationen waren synonyme Substitutionen, und eine Mutation wurde in einer nicht-codierenden Region gefunden.
(e) Die oben erwähnten 9 Mutationen, welche das XXY-Muster zeigen, welche nicht-synonyme Substitutionen sind (nämlich des 5745. Nucleotids G von Gen 6; des 105356. Nucleotids C, des 105544. Nucleotids G, des 106262. Nucleotids C und des 107252. Nucleotids C von Gen 62; und des 122645. Nucleotids G, des 123635. Nucleotids G, des 124353. Nucleotids C und des 124541. Nucleotids G von Gen 71), können als Marken für die Attenuierung oder Sicherheit eines Virusstamms verwendet werden, der fähig zum Funktionieren als ein Wirkstoff eines Lebendimpfstoffes ist. Deshalb sind diese Nucleotidmutationen nützlich und wichtig für die Qualitätskontrolle eines Impfstoffs. Es sollte bemerkt werden, dass Gen 62 und Gen 71 in den invertierten Repetitionen enthalten sind (siehe 1).
(f) 40 Nucleotide des Impfstoffstamms zeigten das XX(X/Y)-Muster (d. h. ein Mutationsmuster, worin der Virusstamm eine Mischung eines Virus mit Nucleotid X und eines Virus mit Nucleotid Y ist). Als der abgeschwächte Oka-Stamm experimentell subkultiviert wurde (d. h. das Virus wurde 5-mal, 10-mal, 17-mal und dergleichen passagiert), zeigten alle der Nucleotide des XX(X/Y)-Musters, außer das 106710. Nucleotid, die folgende Tendenz. Die Detektionsfrequenz von Nucleotid Y stieg gemäß der Zahl an Passagen (d. h. das Nucleotid wechselte von X/Y zu Y), und das Mutationsmuster des Nucleotids konvergierte zum XXY-Muster. Mit anderen Worten sank das Verhältnis von X zu Y (x/y) gemäß der Anzahl an Passagen. Basierend auf dem oben erwähnten Phänomen wird es in Betracht gezogen, dass die Anzahl von Passagen eines Animpfvirus, das in einem Animpf-Chargen-System verwendet wird, durch Messen des x/y-Wertes abgeschätzt werden kann. Es sollte bemerkt werden, dass unter den oben erwähnten Mutationen 20 Mutationen zu nicht-synonymen Substitutionen konvergierten. Im Hinblick auf den Rest der Mutationen waren 12 Mutationen synonyme Substitutionen, 1 Mutation wurde in einem Stop-Codon gefunden (spezifisch konvergierte eine ochre-Codon/amber-Codon-Mischung zu einer amber-Mutation), und 7 Mutationen wurden in den nicht-codierenden Regionen gefunden.

ncr: Nicht-codierende Region
X/Y: X oder Y
och/amb: Stop-Codon-Mutation eines ochre-Codons oder eines amber-Codons

XXX-Muster: Alle drei Stämme weisen das gleiche Nucleotid an einer Nucleotidnummer auf, welche der gleichen Nucleotidstelle entspricht (d. h. "entsprechende Nucleotidnummer").
XYY-Muster: Lediglich der Dumas-Stamm besitzt ein unterschiedliches Nucleotid an der entsprechenden Nucleotidnummer.
XXY-Muster: Lediglich der abgeschwächte Oka-Stamm besitzt ein unterschiedliches Nucleotid an der entsprechenden Nucleotidnummer.
XX(X/Y)-Muster: Lediglich der abgeschwächte Oka-Stamm besitzt ein Nucleotid X/Y (X oder Y) an der entsprechenden Nucleotidnummer. Deshalb ist der abgeschwächte Oka-Stamm eine Mischung der XXX- und XXY-Muster. Zum Beispiel in Bezug auf die 8 Mutationen, welche das XX(X/Y)-Muster zeigen, welche in Gen 62 lokalisiert sind, verminderte sich das Verhältnis von x zu x (x/y) vo rübergehend, als die Anzahl von Passagen von 5-mal, 10-mal bis 17-mal stieg, und das Mutationsmuster konvergierte zum XXY-Muster. Allerdings blieb lediglich das 106710. Nucleotid A/G unverändert, ohne von A nach G zu konvergieren.
XYX-Muster: Lediglich der parentale Oka-Stamm weist ein unterschiedliches Nucleotid an der entsprechenden Nucleotidnummer auf.
XYZ-Muster: Alle drei Stämme besitzen ein unterschiedliches Nucleotid an der entsprechenden Nucleotidnummer.
XDD-Muster: Das Nucleotid an der entsprechenden Nucleotidnummer ist entweder deletiert (del) sowohl im parentalen Oka-Stamm als auch dem abgeschwächten Oka-Stamm, oder lediglich im Dumas-Stamm hinzugefügt.
DXX-Muster: Das Nucleotid an der entsprechenden Nucleotidnummer ist entweder deletiert (del) nur im Dumas-Stamm, oder sowohl im parentalen Oka-Stamm als auch dem abgeschwächten Oka-Stamm hinzugefügt.
ncr: Nicht-codierender Bereich
och/amb: Stop-Codon-Mutation eines ochre-Codons oder eines amber-Condons

Die Tabelle 4 zeigt die Sequenzausrichtung der Nucleotidsequenzen des Sense-Strangs des Replikationsstartpunkts des Dumas-Stamms, des parentalen Oka-Stamms und des abgeschwächten Oka-Stamms. In dieser Tabelle repräsentiert "-" eine Deletion.
Im abgeschwächten Oka-Stamm treten Deletionen in Bezug auf Segmente auf, welche jeweils eine Nucleotidsequenz TATATATATATATA aufweisen, die in Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende angeordnet ist, welche dem 110214. und 110227. Nucleotid des Sense-Strangs der genomischen DNA des Dumas- Stamms von SEQ ID Nr. 1 entspricht, und in Bezug auf ein Segment, das dem 119670. bis 119683. Nucleotid des Antisense-Strangs der genomischen DNA des Dumas-Stamms entspricht. Deshalb wurde es unter Berücksichtigung des Unterschieds zwischen dem parentalen Oka-Stamm und dem abgeschwächten Oka-Stamm offensichtlich, dass die Deletion in Bezug auf Segmente ATATATATA am 3'-Ende nützlich für die Qualitätskontrolle eines Impfstoffs ist.
Tabelle 4
Die Tabelle 5 zeigt die Sequenzausrichtung der repetitiven Region R1 (in der Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende) von Gen 11 des Dumas-Stamms, des parentalen Oka-Stamms und des abgeschwächten Oka-Stamms.
Die Tabelle 6 zeigt die Sequenzausrichtung der repetitiven Region R3 (in Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende) von Gen 22 des Dumas-Stamms, des parentalen Oka-Stamms und des abgeschwächten Oka-Stamms.
Die Tabelle 7 zeigt die Sequenzausrichtung der repetitiven Region R4 (in Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende) des Dumas-Stamms, des parentalen Oka-Stamms und des abgeschwächten Oka-Stamms.
Wie in der Tabelle 5 gezeigt, sind die repetitiven Sequenzen der gesamten R1-Region von allen drei Stämmen, nämlich dem abgeschwächten Oka-Stamm, dem parentalen Oka-Stamm und dem Dumas-Stamm, voneinander verschieden. In ähnlicher Weise sind die repetitiven Sequenzen der gesamten R4-Region aller dreier Stämme, nämlich des abgeschwächten Oka-Stamms, des parentalen Oka-Stamms und des Dumas-Stamms, voneinander verschieden. Deshalb sind die repetitive Sequenz abbabba'bbb'abababx der R1-Region (worin a für eine Nucleotidsequenz GGACGCGATCGACGACGA steht, a' für eine Nucleotidsequenz GGACGCGATTGACGACGA steht; b für eine Nucleotidsequenz GGGAGAGGCGGAGGA steht; b' für eine Nucleotidsequenz GGACGCGGCGGAGGA steht; und x für eine Nucleotidsequenz GGA steht) und die repetetive Sequenz aaaaaaaaaaaax der R4-Region (worin a der Nucleotidsequenz CCCCGCCGATGGGGAGGGGGCGCGGTA entspricht; und x der Nucleotidsequenz CCCCGCCGATG entspricht) für das abgeschwächte Varicellavirus einzigartig, und diese Sequenzen sind nützlich für die Qualitätskontrolle eines abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs.
In Bezug auf die Sequenzen der repetitiven Region R3 von Gen 22, welche in der Tabelle 6 gezeigt werden, waren die Sequenzen unter den Klonen des abgeschwächten Oka-Stamms und des parentalen Oka-Stamms verschiedenartig. Deshalb wurde keine einzigartige Sequenz in dem abgeschwächten Oka-Stamm gefunden.
Tabelle 5 R1-Region (Gen 11)
Tabelle 7 R4-Region (nicht-codierende Region)
Beispiel 2
Die genomische DNA von jedem des abgeschwächten Oka-Stamms, des parentalen Oka-Stamms und des Kawaguchi-Stamms (Wildtypstamm eines Varicellavirus) wurde einzeln auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.
Unter Verwendung der PCR-Primer 01-N12 (SEQ ID Nr. 5) und 01-R13 (SEQ ID Nr. 6), gezeigt in Tabelle 8, wurde eine Region, entsprechend einem Teil von Gen 6 (eine Region, entsprechend dem 5372. bis 6134. Nucleotid des Dumas-Stamms) mittels PCR amplifiziert, wodurch ein PCR-Produkt erhalten wurde. Das erhaltene PCR-Produkt (763 bp) wurde mit dem Restriktionsenzym Alu I verdaut, um dadurch die DNA zu Fragmenten zu schneiden, und das Restriktionsfragmentmuster wurde mittels einer RFLP-Analyse bestimmt. Spezifisch wurde jedes der PCR-Produkte des abgeschwächten Oka-Stamms, des parentalen Oka-Stamms und des Kawaguchi-Stamms mit dem Restriktionsenzym Alu I verdaut, wodurch eine DNA-Fragment-Mischung erhalten wurde, und die erhaltene DNA-Fragment-Mischung wurde auf eine 4,0%ige (w/v) Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetragen, um die Größe jedes DNA-Fragments zu bestimmen.
Zwei Fragmente, welche individuell eine Größe von 170 bp bzw. 593 bp aufwiesen, wurden für den abgeschwächten Oka-Stamm nachgewiesen. Andererseits wurden drei Fragmente, welche individuell eine Größe von 170 bp, 205 bp und 388 bp aufwiesen, für den parentalen Oka-Stamm und den Kawaguchi-Stamm nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass bei dem parentalen Oka-Stamm und dem Kawaguchi-Stamm die Alu I-Stelle zwischen dem 205-bp-Fragment und dem 388-bp-Fragment lokalisiert ist, aber der abgeschwächte Oka-Stamm diese Restriktionsstelle nicht aufweist. Aus diesen Ergebnissen wurde bestätigt, dass die Mutation des 5745. Nucleotids A im Gen 6 durch Nachweisen der Abwesenheit der Alu I-Stelle bestätigt werden kann.
Beispiel 3
54 epidemische Varicella-Stämme, welche aus den Varicella-Patienten und den Zoster-Patienten abgeleitet waren, wurden individuell einer RFLP-Analyse unterzogen. Spezifisch wurde der Unterschied in einem Restriktionsfragmentmuster, welches erhalten wurde durch Verdauen eines PCR-Produkts mit dem Restriktionsenzym Alu I, durch eine RFLP-Analyse in der gleichen Weise, wie in Beispiel 2 bestimmt. Als ein Ergebnis wurde es festgestellt, dass die PCR-Produkte von allen epidemischen Stämmen in drei Fragmente zerschnitten wurden, welche individuell eine Größe von 170 bp, 205 bp bzw. 388 bp aufwiesen. Ein derartiges Restriktionsfragment-Muster war das gleiche wie dasjenige des parentalen Oka-Stamms, welches im obenstehenden Beispiel 2 erhalten worden war.
Beispiel 4
Die in der Tabelle 8 gezeigten Primer (SEQ ID Nr. 3 bis 6 und 9 bis 18) und die Restriktionsenzyme Nla III, Alu I, BstX I, SfaN I, Acc II, Sac II, Sma I, eine Kombination von BssH II und Nae I, oder Bsr I wurden verwendet, um eine RFLP-Analyse in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 durchzuführen. Spezifisch wurden die genomischen DNAs von jedem des abgeschwächten Oka-Stamms, des parentalen Oka-Stamms und des Kawaguchi-Stamms individuell auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt. Als Nächstes wurde eine spezifische Region der genomischen DNA amplifiziert, wobei die in Tabelle 8 gezeigten PCR-Primer in einer spezifischen Kombination, welche in Tabelle 9 gezeigt wird, verwendet wurden. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit einem Restriktionsenzym verdaut und auf eine Agarose-Gelelektrophorese aufgetragen. Die Ergebnisse sind in der 2 gezeigt. Darüber hinaus sind die für die RFLP-Analyse verwendeten Restriktionsenzyme und die Größen der Restriktionsfragmente in der Tabelle 9 zusammengefasst.
Wie gezeigt in 2 und Tabelle 9, wurde es offensichtlich, dass die Anzahlen und Größen der Fragmente, die sich aus dem Verdau eines PCR-Produktes des abgeschwächten Oka-Stamms ergaben, zu denjenigen des parentalen Oka-Stamms und des Kawaguchi-Stamms unter allen für die RFLP-Analyse angewandten spezifischen Bedingungen unterschiedlich waren. Deshalb können, in Hinsicht auf das 560. C, das 5745. G, das 94167. C, das 105356. C (das 124541. G), das 105544. G (das 124353. C), das 105705. C (das 124192. G), das 106262. C (das 123635. G), das 107136. C (das 122761. G), das 107252. C (das 122645. G) und das 108111. C (das 121786. G) die Nucleotidmutationen durch eine RFLP-Analyse bestätigt werden, ohne die Nucleotidsequenz des Genoms zu bestimmen. Tabelle 8
Tabelle 9

V: Abgeschwächter Oka-Stamm
W: Wildtyp-Stamm (Virulenter Stamm)

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Gemäß dem Verfahren zur Qualitätskontrolle der vorliegenden Erfindung, ist es möglich geworden, eine exakte Qualitätskontrolle und Qualitätszusicherung eines abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs durchzuführen, insbesondere in Bezug auf die Sicherheit, Effektivität und Einheitlichkeit des Impfstoffs. Ferner sieht die vorliegende Erfindung exakte und vorteilhafte Techniken vor, welche für die Forschung auf dem Gebiet der Epidemiologie von Varicella und Zoster verwendet werden können, einschließlich des Nachverfolgens der Effekte einer Impfung, und diese Techniken können die Forschung fördern und verbessern. Folglich stellt die vorliegende Erfindung eine exakte und sehr effektive Maßnahme zur Prävention von Varicella und Zoster bereit, welche zur Gesundheit des Menschen beiträgt. SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verfahren zur Qualitätskontrolle eines abgeschwächten Varicella-Lebendimpfstoffs, umfassend das Durchführen einer Sequenzanalyse mit der genomischen DNA einer Probe des Varicella-Impfstoffvirus und Bestätigen, dass die genomische DNA der Probe des Varicella-Impfstoffvirus die folgenden 5 Nucleotide ohne Mutation konserviert: das 5745. G, das 105356. C, das 105544. G, das 106262. C und das 107252. C; wobei die Nucleotidnummern dem Nucleotidnummerierungssystem der Nucleotidsequenz der genomischen DNA des Varicellavirus-Dumas-Stamms der SEQ ID Nr. 1 entsprechen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Konservierung der Kombination von 5 Nucleotiden durch eine RFLP-Analyse unter Verwendung der folgenden Primer bestätigt wird: ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 5 und 6 zur Bestätigung des 5745. G; ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 11 und 12 zur Bestätigung des 105356. C und des 105544. G; ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 13 und 14 zur Bestätigung des 106262. C; und ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 15 und 16 zur Bestätigung des 107252. C.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, das weiterhin Folgendes umfasst: Bestätigen, dass die genomische DNA der Probe des Varicella-Impfstoffvirus die folgenden 4 Nucleotide ohne Mutation konserviert: das 122645. G, das 123635. G, das 124353. C und das 124541. G; wobei die Nucleotidnummern dem Nucleotidnummerierungssystem der Nucleotidsequenz der genomischen DNA des Varicellavirus-Dumas-Stamms der SEQ ID Nr. 1 entsprechen.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Konservierung der 4 Nucleotide durch eine RFLP-Analyse unter Verwendung der folgenden Primer bestätigt wird: ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 11 und 12 zur Bestätigung des 124353. C und des 124541. G; ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 13 und 14 zur Bestätigung des 123635. G; und ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 15 und 16 zur Bestätigung des 122645. G.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, das weiterhin Folgendes umfasst: Bestätigen, dass die genomische DNA der Probe des Varicella-Impfstoffvirus die folgenden 49 Nucleotide ohne Mutation konserviert: das 560. C, das 703. Y, das 763. Y, das 2,515. Y, das 10,900. Y, das 12,779. Y, das 19,431. Y, das 26,125. G, das 31,732. Y, das 38,036. Y, das 39,227. K, das 58,595. R, das 59,287. R, das 64,067. R, das 71,252. Y, das 82,225. R, das 84,091. R, das 87,280. R, das 87,306. Y, das 89,734. R, das 90,535. R, das 94,167. C, das 97,748. R, das 97,796. Y, das 101,089. R, das 105,169. R, das 105,310. R, das 105,705. C, das 106,710. R, das 107,136. C, das 107,599. R, das 107,797. R, das 108,111. C, das 108,838. R, das 109,137. R, das 109,200. R, das 111,650. R, das 118,247. Y, das 120,697. Y, das 120,760. Y, das 121,059. Y, das 121,786. G, das 122,100. Y, das 122,298. Y, das 122,761. G, das 123,187. Y, das 124,192. G, das 124,587. Y und das 124,728. Y; wobei die Nucleotidnummern dem Nucleotidnummerierungssystem der Nucleotidsequenz der genomischen DNA des Varicellavirus-Dumas-Stamms der SEQ ID Nr. 1 entsprechen; R für A oder G steht; Y für C oder T steht; und K für G oder T steht.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Konservierung des 560. C, des 26,125. G, des 94,167. C, des 105,705. C, des 107,136. C, des 108,111. C, des 121,786. G, des 122,761. G und des 124,192. G unter den 49 Nucleotiden durch eine RFLP-Analyse unter Verwendung der folgenden Primer bestätigt wird: ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 3 und 4 zur Bestätigung des 560. C; ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 7 und 8 zur Bestätigung des 26,125. G; ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 9 und 10 zur Bestätigung des 94,167. C; ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 13 und 14 zur Bestätigung des 105,705. C und des 124,192. G; ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 15 und 16 zur Bestätigung des 107,136. C und des 122,761. G; und ein Paar von Primern der SEQ ID Nr. 17 und 18 zur Bestätigung des 108,111. C und des 121,786. G.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, das weiterhin Folgendes umfasst: Bestätigen von Deletionsmutationen in zwei Replikationsstartpunkten der genomischen DNA der Probe des Varicella-Impfstoffvirus; wobei die zwei Replikationsstartpunkte einen Bereich, der dem 110087. bis 110350. Nucleotid des Sense-Strangs der genomischen DNA des Varicellavirus-Dumas-Stamms der SEQ ID Nr. 1 entspricht, bzw. einen Bereich, der dem 119547. bis 119810. Nucleotid der genomischen DNA des Antisense-Strangs des genannten Dumas-Stamms entspricht, bilden; und wobei die Deletionsmutationen in Bezug auf Segmente stattfinden, die jeweils die Nucleotidsequenz ATATATATA aufweisen, die in Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende angeordnet ist, wobei es sich bei den Segmenten um ein Segment, das dem 110219. bis 110227. Nucleotid des Sense-Strangs der genomischen DNA des genannten Dumas-Stamms entspricht, und ein Segment, das dem 119670. bis 119678. Nucleotid des Antisense-Strangs der genomischen DNA des genannten Dumas-Stamms entspricht, handelt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, das weiterhin Folgendes umfasst: Bestätigen, dass die repetitive Sequenz eines ganzen R1-Bereichs der genomischen DNA der Probe des Varicella-Impfstoffvirus die Nucleotidsequenz abbabba'bbb'abababx ist, die in Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende angeordnet ist; wobei a der Nucleotidsequenz GGACGCGATCGACGACGA entspricht, a' der Nucleotidsequenz GGACGCGATTGACGACGA entspricht, b der Nucleotidsequenz GGGAGAGGCGGAGGA entspricht, b' der Nucleotidsequenz GGACGCGGCGGAGGA entspricht und x der Nucleotidsequenz GGA entspricht, wobei der ganze R1-Bereich ein Bereich ist, der dem 13937. bis 14242. Nucleotid der genomischen DNA des Varicellavirus-Dumas-Stamms der SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, das weiterhin Folgendes umfasst: Bestätigen, dass die repetitive Sequenz jedes der beiden ganzen R4-Bereiche der genomischen DNA der Probe des Varicella-Impfstoffvirus die Nucleotidsequenz aaaaaaaaaaaax ist, die in Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende angeordnet ist; wobei a der Nucleotidsequenz CCCCGCCGATGGGGAGGGGGCGCGGTA entspricht und x der Nucleotidsequenz CCCCGCCGATG entspricht; wobei es sich bei den beiden ganzen R4-Bereichen um einen Bereich, der dem 109762. bis 109907. Nucleotid des Sense-Strangs der genomischen DNA des Varicellavirus-Dumas-Stamms der SEQ ID Nr. 1 entspricht, und einen Bereich, der dem 119990. bis 120135. Nucleotid des Antisense-Strangs der genomischen DNA des Varicellavirus-Dumas-Stamms der SEQ ID Nr. 1 entspricht, handelt.