DE69621507T2

DE69621507T2 - Verfahren zur molekularen Indexierung von Genen unter Verwendung von Restriktionsenzymen

Info

Publication number: DE69621507T2
Application number: DE69621507T
Authority: DE
Inventors: Kikuya Kato
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1995-03-28
Filing date: 1996-03-26
Publication date: 2003-01-09
Anticipated expiration: 2016-03-27
Also published as: DE69621507D1; US5707807A; AU5031196A; EP0735144A1; AU692685B2; EP0735144B1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur molekularen Indizierung, welches auf die Analyse und Diagnose von Krankheiten wie Krebserkrankungen, die Durchsuchung und Isolierung von Genen physiologisch wirksamer Substanzen, die mögliche Pharmazeutika sind, oder auslösenden Genen von Erbkrankheiten sowie die Isolierung solcher Gene, welche zur Verbesserung von landwirtschaftlichen Produkten nützlich sind, anwendbar ist.

Hinterrund der Erfindung

Zur Untersuchung von Unterschieden bezüglich der Genexpression zwischen zwei Geweben ist ein Verfahren beschrieben worden, bei dem ein Teil (etwa 50-200 Gene) der exprimierten Genpopulation durch PCR (das Polymerasekettenreaktionsverfahren) unter Verwendung von irgendwelchen kurzen Primern amplifiziert und dann durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt wird (Liang P. und Pardee A. B., "Differential Display of Eukaryotic Messenger RNA by Means of the Polymerase Chain Reaction", Science 257 (1992), 967-971). Bei einer solchen differenziellen Darstellung durch PCR wird jedoch im Prinzip nur ein Teil der ganzen Genpopulation amplifiziert und doch wird eine Vielzahl von Banden durch das gleiche Gen erzeugt. Außerdem schließt eine solche Darstellung eine große Zahl von Artefakten ein und ist somit technisch unvollkommen. Daher weist eine solche Darstellung nur Unterschiede bezüglich der Genexpression zwischen zwei voneinander verschiedenen Geweben oder Unterschiede bezüglich der Genexpression bei Zellen nach. Eine solche differenzielle Darstellung weist das Problem auf, daß sie die Expression einzelner Gene nicht aufzeichnen kann.
Es ist auch möglich Variationen in Geweben oder Zellen zu analysieren, indem der Anteil eines bestimmten Gens in solchen Geweben oder Zellen durch Messen seiner mRNA-Menge durch das Northern-Blot-Hybridisierungsverfahren bestimmt wird. Dieses Verfahren ist jedoch nicht anwendbar, wenn das Zielgen nicht cloniert ist oder die Basensequenz hiervon unbekannt ist. Außerdem ist dieses Verfahren nicht zur Analyse einer großen Zahl von Genen geeignet. Da zum Beispiel angenommen wird, daß es sich bei den in einer bestimmten Zelle exprimierten Genen um etwa 10.000 Spezies handelt, dauert die Analyse etwa zwei Jahre, auch wenn die Northem-Blot-Hybridisierung für 100 Gene pro Woche durchgeführt wird. Somit ist dieses Verfahren praktisch nicht anwendbar.
Andererseits handelt es sich bei den Restriktionsenzymen der Klasse-IIS (nachstehend als "Klasse-IIS-Restriktionsenzyme" bezeichnet) um Restriktionsenzyme, welche die Fähigkeit aufweisen, in einem bestimmten Abstand außerhalb ihrer Erkennungsstellen zu schneiden. Die durch ein Klasse-IIS-Restriktionsenzym geschnittenen Fragmente sind dadurch gekennzeichnet, daß sie nicht-identische, kohäsive Enden aufweisen, die aus mehrere Nucleotiden bestehen. Es sind mehr als 30 Klasse-IIS-Restriktionsenzyme bekannt, einschließlich FokI, BsmFI, BsmAI, BbvI, SfaNI und HgaI. Es wird geschätzt, daß die Gene, welche mindestens eine FokI-, BsmFI- oder BsmAI-Spaltstelle aufweisen, 97% der Gene insgesamt ausmachen. Brenner et al. haben ein Verfahren zur Anfertigung einer genaueren Genomkarte unter Verwendung eines 4 nt (Nucleotide)-Sequenzen erzeugenden Klasse-IIS-Restriktionsenzyms anstelle von herkömmlichen Restriktionsenzymen vorgestellt (Brenner 5. und Livak K. J., "DNA Fingerprinting by Sampled Sequencing", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8902-8906). Es ist auch ein Verfahren offenbart worden, bei dem ein Teil der von einem Phagen oder Cosmid abgeleiteten Restriktionsenzymfragmente durch Verwendung von solchen Adaptoren, welche zu allen möglichen der durch Klasse-IIS-Restriktionsenzyme erzeugten kohäsiven Enden aus 4 Nucleotiden komplementär sind, amplifiziert wird (Smith D. R., "Ligation-Mediated PCR or Restriction Fragments From Large DNA Molecules", PCR Methods Appl. 2 (1992), 21-27; Unrau P. und Deugau K. V., Gene 145 (1994), 163-169). Obwohl jedoch sämtliche dieser Verfahren Klasse-IIS-Restriktionsenzyme einsetzen und die durch diese erzeugten überhängenden Enden aus 4 Nucleotiden als Mittel zur strukturellen Analyse von Genomen verwenden, anders als bei der vorliegenden Erfindung, sind sie nicht auf die Aufzeichnung der Expression von Genen in einem bestimmten Gewebe oder in einer Bestimmten Zelle ausgerichtet.
Beim "Human Genome Project" wurde lebhaft über einen Ansatz diskutiert, ein Gewebe-abgeleitetes cDNA-Fragment als Probe zu verwenden und eine partielle Sequenz hiervon sowie deren Lage in einem Chromosom zu bestimmen. Bei herkömmlichen Verfahren werden cDNA-Fragmente zufällig aus einer cDNA-Genbank ausgewählt. Demgemäß ist es möglich, eine wiederholte Entnahme des gleichen Fragments zu vermeiden, und es gibt die Bestrebung, in hohem Grade exprimierte Fragmente selektiv auszuwählen.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, welches den Expressionsstatus von Genen oder eine Deletion infolge gewisser Abnormitäten in einem Gewebe oder einer Zelle innerhalb eines kurzen Zeitraums und dennoch ohne Schwierigkeiten für eine große Zahl von Genen analysieren kann.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, welches auf die schnelle Isolierung der codierenden Region eines Proteins sowie die Amplifikation von Restriktionsfragmenten clonierter DNA oder genomischer DNA anwendbar ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Die hier genannten Erfinder haben umfassende und intensive Untersuchungen zur Lösung der obigen Aufgabe durchgeführt und als Ergebnis festgestellt, daß es durch Verwendung von Klasse-IIS-Restriktionsenzymen oder einer Kombination aus einem Klasse-IIS-Restriktionsenzym und einem Klasse-II-Restriktionsenzym möglich ist, cDNA oder DNA innerhalb eines kurzen Zeitraums und ohne Vervielfältigung in Gruppen einzuteilen (zu indizieren). Auf diese Weise wurde die vorliegende Erfindung vollendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur molekularen Indizierung, umfassend die folgenden Schritte (nachstehend als "Verfahren I" bezeichnet):
(1) Spalten von cDNA, welche aus Gewebe- oder Zellen-abgeleiteter RNA reverse transkribiert wurde, mit einem ersten Restriktionsenzym der Klasse-IIS,
(2) Ligieren eines jeden der resultierenden cDNA-Fragmente mit einem Adaptor aus einem Pool von 64 biotinylierten Adaptoren, welche zu allen möglichen überhängenden Enden kohäsiv sind, wobei die 5'-Enden dieser Adaptoren nicht phosphoryliert sind,
(3) weiteres Spalten der resultierenden cDNA-Fragmente mit einem zweiten und einem dritten Restriktionsenzym der Klasse-IIS, welche von dem ersten Klasse-IIS- Restriktionsenzym, das oben unter (1) verwendet wird, verschieden ist, unter Erhalt einer ersten cDNA-Probe,
(4) Erhalten einer zweiten cDNA-Probe durch Wiederholen der obigen Schritte (1) bis (3), wobei das zweite Klasse-IIS-Restriktionsenzym für die anfängliche Spaltung verwendet wird und das erste und das dritte Klasse-IIS-Restriktionsenzym für die nachfolgende Spaltung verwendet werden,
(5) Erhalten einer dritten cDNA-Probe durch Wiederholen der obigen Schritte (1) bis (3), wobei das dritte Klasse-IIS-Restriktionsenzym für die anfängliche Spaltung verwendet wird und das erste und das zweite Klasse-IIS-Restriktionsenzym für die nachfolgende Spaltung verwendet werden,
(6) Gewinnen der cDNA-Fragmente, welche mit den Adaptoren ligiert sind, aus jeder der cDNA-Proben durch Binden an Streptavidin-beschichtete paramagnetische Kügelchen und dann Entfernen der nicht-biotinylierten Oligonucleotidstränge aus den Proben unter Erhalt einer Einzelstrang-DNA-Probe,
(7) Amplifizieren der resultierenden cDNA-Proben durch PCR unter Verwendung eines Adaptor-Primers und eines verankerten Oligo-dT-Primers,
(8) Trennen der amplifizierten Produkte durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Aufzeichnen der Größe der erhaltenen Fragmente.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur molekularen Indizierung, umfassend die folgenden Schritte (nachstehend als "Verfahren II" bezeichnet):
(1) Spalten von cDNA, welche aus Gewebe- oder Zellen-abgeleiteter RNA reverse transkribiert wurde, oder DNA mit einem Restriktionsenzym der Klasse-II,
(2) Ligieren eines jeden der resultierenden cDNA- oder DNA-Fragmente mit einem Adaptor, welcher zu den durch das Klasse-II-Restriktionsenzym erzeugten Enden kohäsiv ist, wobei die 5'-Enden dieser Adaptoren phosphoryliert sind,
(3) weiteres Spalten der resultierenden cDNA- oder DNA-Fragmente mit einem Restriktionsenzym der Klasse-IIS,
(4) Ligieren eines jeden der resultierenden cDNA- oder DNA-Fragmente mit einem Adaptor aus einem Pool von 64 biotinylierten Adaptoren, welche zu allen möglichen überhängenden Enden kohäsiv sind,
(5) Gewinnen der mit Adaptoren ligierten cDNA-Fragmente aus der Probe durch Binden an Streptavidin-beschichtete paramagnetische Kügelchen und dann Entfernen der nicht-biotinylierten Oligonucleotidstränge aus der Probe unter Erhalt einer Einzelstrang-cDNA-Probe,
(6) Amplifizieren der resultierenden cDNA- oder DNA-Probe durch PCR unter Verwendung von Adaptor-Primern,
(7) Trennen der amplifizierten Produkte durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Aufzeichnen der Größe der erhaltenen Fragmente.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung des Prinzips von Verfahren I.
Fig. 2 zeigt cDNA-Strukturen, welche durch reverse Transkription von RNA unter Verwendung einer Mischung aus drei Oligonucleotiden als Primer synthetisiert worden sind.
Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung des Prinzips von Verfahren II.
Fig. 4 zeigt ein Beispiel für das durch Verfahren I erhaltene Polyacrylamid- Elektrophoresemuster von Maus-Leber-RNA.
Fig. 5 zeigt ein Beispiel für das durch Verfahren II erhaltene Polyacrylamid- Elektrophoresemuster eines amplifizierten Produkts aus Maus-Leber-RNA.

Auswirkung der Erfindung

Anhand von Verfahren I ist es möglich, den Expressionsstatus von Genen mit Klasse-IIS-Restriktionsenzym-Spaltstellen (es wird geschätzt, daß 97% der Gene insgesamt solche Stellen aufweisen, wenn FokI, BsmAI und BsmFI verwendet werden) in einem Gewebe mit einem ein- bis zweiwöchigen Experiment pro einem menschlichen Individuum zu untersuchen, da eine kleine Zahl von DNA-Untergruppen für diese Analyse ausreichend ist. Außerdem erlaubt Verfahren I, daß Gene ohne Redundanz in Untergruppen eingeteilt (indiziert) werden können, da die Anzahl der Fragmente, welche von einem Gen amplifiziert werden, im Prinzip nur ein Fragment beträgt. Durch Vergleichen des analysierten Musters zwischen normalen und abnormen Geweben unter Anwendung von Verfahren I ist es daher möglich, Veränderungen wie Tumore ohne weiteres, genau oder umgehend zu diagnostizieren. Außerdem ist Verfahren I auch auf die Durchsuchung und Isolierung von Genen physiologisch aktiver Substanzen, die mögliche Pharmazeutika sind, oder auslösenden Genen von Erbkrankheiten sowie die Isolierung solcher Gene, die zur Verbesserung von landwirtschaftlichen Produkte nützlich sind, anwendbar.
Andererseits ist das Ziel der Analyse gemäß Verfahren II nicht auf RNA (oder daraus reverse transkribierte cDNA) begrenzt, da keine Oligo-dT-Primer anstelle von Poly-A als Primer verwendet werden. Mit Verfahren II ist es auch möglich, Restriktionsfragmente von Cosmid-DNA oder genomischer DNA zu amplifizieren. Daher ist das Verfahren II auf die Kartierung dieser DNAs anwendbar.
Außerdem sind die durch PCR amplifizierten Regionen nicht auf nicht-codierende Regionen begrenzt, und folglich müssen keine Clone von stromaufwärts angeordneten Regionen erhalten werden, um die Primärstruktur eines Proteins zu kennen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

[I] Nachstehend werden die Schritte, der Hergang und die Effekte von Verfahren I unter Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben.
(1) Zuerst wird die gesamte RNA einer Zelle oder eines Gewebes mit einer reversen Transkriptase in cDNA umgewandelt, und die resultierende cDNA wird mit einem ersten Klasse-IIS-Restriktionsenzym gespalten.
(2) Ein Adaptor aus einem nachstehend beschriebenen Pool von 64 biotinylierten Adaptoren wird mit den resultierenden cDNA-Fragmenten unter Verwendung der E. coli-DNA-Ligase ligiert. Jeder Adaptor weist überhängende 5'-Enden von 4 Nucleotiden auf, worin die äußerste Base eine Mischung von A, C, G und T ist und die innen liegenden drei Basen eine Sequenz aller möglichen Sequenzen aufweist. Diese Adaptoren müssen an ihren 5'-Enden, welche überstehende kohäsive Enden bilden, nicht phosphoryliert sein. Zu diesem Zeitpunkt werden die Restriktionsfragmente in 64 Untergruppen eingeteilt.
(3) Anschließend werden die cDNA-Fragmente mit einem zweiten und einem dritten Klasse-IIS-Restriktionsenzym, welche von dem ersten Klasse-IIS-Restriktionsenzym, das oben unter (1) verwendet wird, verschieden sind, unter Erhalt einer ersten cDNA-Probe weiter gespalten.
Eine zweite cDNA-Probe wird durch Wiederholen der obigen Schritte (1) bis (3) erhalten, wobei das zweite Klasse-IIS-Restriktionsenzym für die anfängliche Spaltung verwendet wird und das erste und das dritte Klasse-IIS-Restriktionsenzym für die nachfolgende Spaltung verwendet werden; und es wird auch eine dritte cDNA-Probe durch Wiederholen der obigen Schritte (1) bis (3) erhalten, wobei das dritte Klasse-IIS- Restriktionsenzym für die anfängliche Spaltung verwendet wird und das erste und das zweite Klasse-IIS-Restriktionsenzym für die nachfolgende Spaltung verwendet werden.
(4) Als Ergebnis der oben beschriebenen Spaltung mit den drei Klasse-IIS-Restriktionsenzymen werden Fragmente, welche den Poly-A-Schwanz verloren haben (vgl. Fig. 1(i)) und Fragmente, welche noch den Poly-A-Schwanz aufweisen (vgl. Fig. 1(ii)), hergestellt. Von diesen Fragmenten werden die ersteren Fragmente, welche den Poly-A-Schwanz verloren haben, in dem nachfolgenden Amplifikationsschritt nicht länger amplifiziert, und es werden nur die letzteren Fragmente mit dem Poly- A-Schwanz amplifiziert. Demgemäß werden die letzteren Fragmente zu diesem Zeitpunkt in Abhängigkeit von der Spaltstelle, welche der Seite des Poly-A-Schwanzes am nächsten ist (d. h. in Abhängigkeit von der Spaltstelle, welche die drei Restriktionsenzyme verwenden) weiter in 64 · 3 = 192 Untergruppen eingeteilt.
(5) Anschließend wird die Ligierungsprobe mit Streptavidin-beschichteten paramagnetischen Kügelchen gewonnen, und die cDNA-Fragmente werden mit einer verdünnten alkalischen Lösung behandelt. Durch diese Arbeitsschritte wird das Oligonucleotid, welches zu einem Adaptor-Primer komplementär ist, welcher in (6) verwendet werden soll, entfernt (das Oligonucleotid würde die PCR-Reaktion hemmen).
(6) Die resultierende cDNA-Probe wird durch PCR unter Verwendung einer Kombination aus einem Adaptor-Primer und einem der Primer d(T)&sub2;&sub5;A, d(T)&sub2;&sub5;C und d(T)&sub2;&sub5;G, welche verankerte Oligo-dT-Primer sind, amplifiziert. In Abhängigkeit von der Base (T, C oder G), welche dem Poly-A-Schwanz benachbart ist, werden die durch die obigen drei Oligo-dT-Primer amplifizierten Fragmente festgelegt. Zu diesem Zeitpunkt werden die cDNA-Fragmente weiter in 192 · 3 = 576 Gruppen eingeteilt.
(7) Die amplifizierten Produkte werden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt, und die Größe der erhaltenen Fragmente wird durch ein Sequenzanalysengerät automatisch aufgezeichnet.
Die vorstehend beschriebenen Verfahren werden mit 64 Adaptoren, 3 Klasse- IIS-Restriktionsenzymen und 3 verankerten Oligo-dT-Primern wiederholt. Folglich wird eine RNA-Population in 576 Gruppen eingeteilt. Im Hinblick auf die Klasse-IIS-Restriktionsenzyme wird geschätzt, daß 97% der Gene mindestens eine FokI-, BsmAI- oder BsmFI-Spaltstelle aufweisen.
Demgemäß ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung dieser drei Restriktionsenzyme theoretisch möglich, praktisch alle RNAs einer Gesamt- RNA-Population ohne Redundanz zu gewinnen und darzustellen.
Weiterhin kann bei dem Verfahren I eine Mischung der folgenden Oligonucleotide als Primer verwendet werden, wenn die gesamte RNA aus einer Zelle oder einem Gewebe mit einer reversen Transkriptase in cDNA umgewandelt wird:
Wenn solche Primer verwendet werden, können cDNA-Moleküle erhalten werden, worin die Base T, G oder C dem Poly-A-Schwanz auf der 5'-Seite benachbart ist und eine 6 Basen-Sequenz an der Außenseite (3'-Seite) des Poly-A-Schwanzes angehängt ist (vgl. Fig. 2).
In diesem Fall wird die Amplifikation unter Verwendung irgendeines der Primer 5'-OH-GGATCCT&sub1;&sub6;A-3' (anstelle des obigen verankerten Oligo-dT-Primers d(T)&sub2;&sub5;A), 5'-OH-CAGCTGT&sub1;&sub6;C-3' 3' (anstelle des obigen Primers d(T)&sub2;&sub5;C) und 5'-OH-CTCGA- GT&sub1;&sub6;G-3' (anstelle des obigen Primers d(T)&sub2;&sub5;G) ausgeführt. Gemäß diesen Verfahren kann die Analyse genauer sein, da zusätzlich zur Spezifität für die cDNA von nur einer Base am 3'-Ende der Primer die Spezifität für die cDNA durch die 6 Basen-Sequenz am 5'-Ende der Primer verwendet wird.
Die Ziel-RNA für das erfindungsgemäße Verfahren I wird zum Beispiel aus Körpergeweben, wie blutbildende Gewebe einschließlich Knochenmark, peripheres Blut, Lymphocyten etc., oder Zellen in einer Körperflüssigkeit durch herkömmliche Verfahren, wie das Guanidinthiocyanatverfahren und das Phenol-Chloroform-Extraktionsverfahren, isoliert und gereinigt und anschließend mit einer reversen Transkriptase und Desoxyribonucleotidtriphosphaten zur reversen Transkription in cDNA inkubiert.
Im Hinblick auf die Klasse-IIS-Restriktionsenzyme, welche bei dem erfindungsgemäßen Verfahren I verwendet werden, gibt es keine besondere Begrenzung, solange das Restriktionsenzym ein 5'-überhängendes kohäsives Ende bildet, welches aus 4 Basen besteht. Spezifische Beispiele schließen das im Handel erhältliche FokI (Takara Shuzo) und BsmAI sowie BsmFI (beide hergestellt durch NEB) ein. Diese drei Restriktionsenzyme können in Kombination miteinander für die anfängliche Spaltung (mit einem Enzym) und die nachfolgende Spaltung (mit zwei Enzymen) verwendet werden. Bei dem modifizierten Verfahren kann eines dieser drei Enzyme verwendet werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren I bezeichnet der Begriff biotinylierter Adaptor einen Adaptor, bestehend aus: i) einem Oligonucleotid von möglicherweise 24-27 Nucleotiden, welches ein 5'-überstehendes kohäsives Ende von 4 Nucleotiden bildet, worin die äußerste Base eine Mischung von A, C, G und T ist und die innen liegenden drei Basen eine Sequenz aller möglichen Sequenzen sind, und ii) einem Oligonucleotid, welches zu dem Oligonucleotid i) komplementär ist, um 4 Basen kürzer als dieses ist und am 5'-Ende biotinyliert ist. Somit gibt es 64 Arten der biotinylierten Adaptoren.
Um zu ermöglichen, daß die E. coli-DNA-Ligase die drei Basen eines cDNA- Fragments erkennt, welche an die Bindungsstelle angrenzen, sind die 5'-Enden der obigen Adaptoren, welche kohäsive Enden bilden, nicht phosphoryliert.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren I ist einer der zwei Primer, welche zur PCR verwendet werden, ein Oligonucleotid mit einer Sequenz, welche mit dem Oligonucleotid übereinstimmt, das den oben beschriebenen Adaptor darstellt, welcher einer Ligierung mit der cDNA am 3'-Ende unterzogen wird (=Adaptor-Primer). Als Marker zum Markieren dieses Adaptor-Primers können solche verwendet werden, welche bei herkömmlichen Analysen verwendet werden. Spezifische Beispiele schließen fluoreszierende Farbstoffe, radioaktive Materialien und Enzyme ein.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren I ist der andere zur PCR verwendete Primer einer der drei Oligo-dT-Primer, worin die Base am 3'-Ende A, C oder G ist. Diese Primer können durch ein herkömmliches Nucleinsäure-Synthesegerät synthetisiert werden.
[II] Nachstehend werden die Schritte, der Hergang und die Effekte von Verfahren II unter Bezugnahme auf Fig. 3 beschrieben.
(1) Zuerst wird die DNA oder cDNA einer Zelle oder eines Gewebes mit einem Klasse- II-Restriktionsenzym gespalten (in Fig. 3 wird EcoRI verwendet).
(2) Ein Adaptor, welcher zu den durch das Klasse-II-Enzym erzeugten Enden kohäsiv ist, wird mit einem jeden der DNA- oder cDNA-Fragmente unter Verwendung der T4-DNA-Ligase ligiert (der Adaptor muß am 5'-Ende, welches kohäsive Enden bildet, phosphoryliert sein).
(3) Die resultierende DNA- oder cDNA-Probe wird mit einem Klasse-IIS-Restriktionsenzym weiter gespalten (in Fig. 3 wird BsmAI verwendet).
(4) Ein Adaptor aus einem nachstehend beschriebenen Pool von 64 biotinylierten Adaptoren wird mit einem jeden der resultierenden cDNA- oder DNA-Fragmente unter Verwendung der E. coli-DNA-Ligase ligiert. Jeder Adaptor weist ein 5'-überhängendes Ende von 4 Nucleotiden auf, worin die äußerste Base eine Mischung von A, C, G und T ist und die innen liegenden drei Basen eine Sequenz aller möglichen Sequenzen ist. (Diese Adaptoren müssen an ihren 5'-Enden, welche kohäsive Enden bilden, nicht phosphoryliert sein.) Zu diesem Zeitpunkt werden die Restriktionsfragmente in 64 Gruppen eingeteilt.
(5) Anschließend wird die Ligierungsprobe mit Streptavidin-beschichteten paramagnetischen Kügelchen gewonnen, und die DNA- oder cDNA-Fragmente werden mit einer verdünnten alkalischen Lösung behandelt. Durch diese Arbeitsschritte werden die zu den Adaptor-Primern komplementären Oligonucleotide entfernt, welche die PCR- Reaktion hemmen würden.
(6) Die Amplifikation durch PCR wird unter Verwendung von zwei Adaptor-Primern ausgeführt. Der eine Primer, welcher abgeleitet ist von dem Adaptor für die Enden, welche durch das Klasse-II-Enzym gebildet werden, wird als "Adaptor-Primer 1" bezeichnet, und der andere Primer, welcher abgeleitet ist von den biotinylierten Adaptoren, wird als "Adaptor-Primer 2" bezeichnet. Die Einzelheiten werden später beschrieben.
(7) Die amplifizierten Produkte werden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt, und die Größe der erhaltenen Fragmente wird durch ein Sequenzanalysengerät automatisch aufgezeichnet.
Durch die Verwendung eines Klasse-II-Restriktionsenzyms, eines Klasse-IIS- Restriktionsenzyms und von 64 biotinylierten Adaptoren in den oben beschriebenen Arbeitsschritten können die DNA- oder cDNA-Fragmente, welche durch die Klasse-II- und Klasse-IIS-Restriktionsenzyme erzeugt werden, getrennt und dargestellt werden.
Wenn eine aus RNA reverse transkribierte cDNA als Zielmolekül der Analyse von Verfahren II verwendet wird, wird eine cDNA-Probe wie folgt hergestellt. RNA wird zum Beispiel aus Körpergeweben, wie blutbildende Gewebe einschließlich Knochenmark, peripheres Blut, Lymphocyten etc., oder Zellen in einer Körperflüssigkeit durch herkömmliche Verfahren, wie das Guanidinthiocyanatverfahren und das Phenol-Chloroform- Extraktionsverfahren, isoliert und gereinigt und dann mit einer reversen Transkriptase und Desoxyribonucleotidtriphosphaten zur reversen Transkription in cDNA inkubiert.
Es ist auch möglich, DNA als Zielmolekül der Analyse von Verfahren II zu verwenden. In diesem Fall wird eine DNA-Probe wie folgt hergestellt. Die aus zum Beispiel Körpergeweben, wie blutbildende Gewebe einschließlich Knochenmark, peripheres Blut, Lymphocyten etc., oder einer Zellsuspension in einer Körperflüssigkeit isolierte DNA wird mit einer Polytron- oder ähnlichen Vorrichtung grob zerkleinert und mit Proteinase K inkubiert, um auf diese Weise Proteine abzubauen. Anschließend wird die Reaktionslösung einer Phenolextraktion unterzogen, und 2 Volumina Ethanol werden zu der wäßrigen Schicht zur Fällung zugegeben. Der Niederschlag wird mit Ribonuclease (RNase) ohne Desoxyribonuclease (DNase)-Aktivität behandelt, um auf diese Weise RNA zu entfernen.
Im Hinblick auf das Klasse-II-Restriktionsenzym, welches bei dem erfindungsgemäßen Verfahren II verwendet wird, gibt es keine besondere Begrenzung, solange das Enzym eine spezifische Basensequenz erkennt, die Stelle spezifisch schneidet und kohäsive Enden erzeugt. Spezifische Beispiele schließen EcoRI, BamHI, HindIII, BclII, BglII, SalI, XhoI, AccI, AvaI, Sau3A, TaqI, NotI (welches 5'-überhängende kohäsive Enden bildet), PstI, SacI, KpnI und HaeII (welches 3'-überhängende Enden bildet) ein.
Insbesondere werden zur Analyse von genomischer DNA vorzugsweise Restriktionsenzyme verwendet, welche eine 8 Basen-Sequenz erkennen (z. B. NotI).
Im Hinblick auf das Klasse-IIS-Restriktionsenzym, welches bei dem erfindungsgemäßen Verfahren II verwendet wird, gibt es keine besondere Begrenzung, solange das Enzym 5'-überhängende kohäsive Enden von 4 Basen erzeugt. Spezifische Beispiele schließen das im Handel erhältliche Fokl (Takara Shuzo) und BsmAI, BsmFI, SfaNI sowie BbvI (alle hergestellt durch NEB) ein.
Es ist auch möglich, zwei oder drei Klasse-IIS-Restriktionsenzyme in Kombination miteinander zu verwenden, um die Anzahl der Gruppen zu erhöhen, wie bei Verfahren I beschrieben wurde.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren II besteht der Adaptor aus: i) einem Oligonucleotid von möglicherweise 20-30 Nucleotiden, welches ein 5' (oder 3')-überhängendes Ende bildet, das zu den Enden der Restriktionsfragmente kohäsiv ist, und ii) einem Oligonucleotid, welches komplementär zu dem obigen Oligonucleotid i) ist und um die Anzahl der Basen, welche das überhängende Ende bilden, verkürzt ist.
Der Adaptor muß an seinem 5'-Ende (welches ein kohäsives Ende bildet) phosphoryliert sein, so daß ein Adaptor-Oligonucleotid an den DNA-Strang gebunden wird, welcher mit Streptavidin-beschichteten Kügelchen gewonnen wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren II bezeichnet der Begriff biotinylierter Adaptor einen Adaptor, bestehend aus: i) einem Oligonucleotid von möglicherweise 24-27 Nucleotiden, welches ein 5'-überhängendes kohäsives Ende von 4 Nucleotiden bildet, worin die äußerste Base eine Mischung von A, C, G und T ist und die innen liegenden drei Basen eine Sequenz aller möglichen Sequenzen sind, und ii) einem Oligonucleotid, welches zu dem Oligonucleotid i) komplementär ist, um 4 Basen kürzer als dieses ist und am 5'-Ende biotinyliert ist. Somit gibt es 64 Arten der biotinylierten Adaptoren.
Um zu ermöglichen, daß die E. coli-DNA-Ligase die drei Basen eines cDNA- Fragments erkennt, welche der Bindungsstelle benachbart sind, wird keine Phosphorylierung des 5'-Endes des obigen biotinylierten Adaptors, welcher ein kohäsives Ende bildet, durchgeführt.
Bei Verfahren II ist einer der Primer, welche bei der PCR verwendet werden, ein Oligonucleotid mit einer Sequenz, welche mit dem Oligonucleotid übereinstimmt, das den oben beschriebenen Adaptor darstellt, welcher einer Ligierung mit cDNA- oder DNA- Fragmenten an seinem 3'-Ende unterzogen wird (Adaptor-Primer 1).
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren II ist der anderen zur PCR verwendete Primer ein Oligonucleotid mit einer Sequenz, die mit dem Oligonucleotid übereinstimmt, welches den oben beschriebenen biotinylierten Adaptor darstellt, welcher einer Ligierung mit cDNA- oder DNA-Fragmenten an seinem 3'-Ende unterzogen wird (Adaptor-Primer 2). Als Marker zum Markieren dieses Adaptor-Primers können solche verwendet werden, welche bei herkömmlichen Analysen verwendet werden. Spezifische Beispiele schließen fluoreszierende Farbstoffe, radioaktive Materialien und Enzyme ein.
Diese Primer können unter Verwendung eines handelsüblichen Nucleinsäure- Synthesegeräts synthetisiert werden.
Mögliche Zielerkrankungen, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren I oder Verfahren II analysiert oder diagnostiziert werden können, schließen maligne Tumore wie Hirntumor, Magenkarzinom, Dickdarmkarzinom, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Hautkrebs, Prostatakrebs und malignes Melanom; Virusinfektionen wie Infektionen der Herpes-Gruppe, chronische Hepatitis, Cytomegalievirus-Infektion und das erworbene Immunschwäche-Syndrom; und multifaktorielle Erbkrankheiten wie Diabetes und Bluthochdruck ein.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf das folgende Referenzbeispiel und die folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben, welche zum Zwecke der Veranschaulichung bereitgestellt werden und nicht als Begrenzung des Schutzumfangs der Erfindung ausgelegt werden sollen.

Referenzbeispiel: Herstellung von cDNA

1. Reinigung von RNA durch Ultrazentrifugation

In Trockeneis oder flüssigem Stickstoff gefriergetrocknete Mäuseleber wurde mit einem Homogenisator grob zerkleinert. Zu dem grob zerkleinerten Material wurden 5 Volumina GuCNS-Lösung bei Raumtemperatur zugegeben und die Mischung wurde mit einem Wirbelmischer gerührt.
In ein 10 ml-Polyallomer-Röhrchen wurden 3,5 ml 5,7 M CsCl/0,1 M EDTA- Lösung gegeben, und 6 ml der resultierenden Probe wurden darüber geschichtet und dann über Nacht bei 15ºC bei 32.000 UpM unter Verwendung einer Beckman L70-Zentrifuge zentrifugiert.

2. Gewinnung der RNA nach Ultrazentrifugation

Das Röhrchen wurde aus dem Rotor entnommen und der gesamte Überstand wurde verworfen. Die Wand des Röhrchens wurde abgewischt und getrocknet. Danach wurde der Niederschlag in 300 ul TE-Puffer gelöst.

3. Ethanolfällung

Zu der wäßrigen Schicht wurde 1/10 Volumen 3 M Kaliumacetat (pH 5,0) zugegeben, vorsichtig gemischt und auf Eis gestellt. Anschließend wurden 2,5 Volumina eisgekühltes Ethanol zu der obigen Mischung zugegeben und vorsichtig eingemischt. Die resultierende Mischung wurde bei -80ºC für mehrere Stunden stehengelassen und bei 4ºC für 5 Minuten zentrifugiert, um die RNA auszufällen. Das Ethanol wurde verworfen. Der RNA-Niederschlag wurde mit eisgekühltem 70%igem Ethanol gewaschen und zentrifugiert, um die RNA auszufällen. Nach Verwerfen des Ethanols wurde der RNA-Niederschlag getrocknet.
Der obige Niederschlag wurde in etwa 100 ul sterilem, destilliertem Wasser pro 1 Gramm der Gewebezellen gelöst, um eine RNA-Lösung zu erhalten (RNA-Konzentration = etwa 5 ug/ul).

4. Herstellung einer cDNA-Matrize

4-1. Herstellung einzelsträngiger cDNA-Moleküle

Zuerst wurden nur die resultierende RNA und Oligo-dT-Primer bei 70ºC für 2-3 Minuten erwärmt. Anschließend wurden die anderen Reagenzien dazu zugegeben, und die Mischung wurde 1 Stunde bei 37ºC gehalten, um cDNA-Moleküle zu synthetisieren.

* Zusammensetzung der Reaktionslösung:

5x Reverse Transkriptase-Puffer (Gibco-BRL) 4 ul
2 mM dNTP (Pharmacia) 4 ul
0,1 M DTT 2 ul
10 umol/ul 5'-Amino-(dT)18 1 ul
Gesamt-RNA (3 ug) und destilliertes Wasser 7,5 ul
RNase-Inhibitor *1) (40 u/ul) (Toyobo) 0,5 ul
200 u/ul M-MLV-Reverse Transkriptase *2) (Gibco-BRL) 1 ul
*1) abgeleitet von menschlichen Plazenten
*2) Muriner Molony-Leukämievirus

4-2. Synthese doppelsträngiger cDNA-Moleküle

Die nachstehend beschriebene Reaktionslösung wurde zu der Einzelstrang- cDNA-Reaktionslösung zugegeben und 2 Stunden bei 16ºC gehalten, um auf diese Weise doppelsträngige cDNA-Moleküle herzustellen. Nach Beendigung der Umsetzung wurden 3 ul 0,25 M EDTA (pH 7,5) und 2 ul 5 M NaCl dazu zugegeben. Anschließend wurden eine Phenolextraktion und eine Ethanolfällung durchgeführt, und der Niederschlag wurde in 240 ul destilliertem Wasser gelöst.

* Zusammensetzung der Reaktionslösung:

10 mM MgCl&sub2; 70 ul
1 M Tris-Cl (pH 7,5) 10 ul
1 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 1,5 ul
RNase H (Toyobo) (1 u/ul) 1,5 ul
E. coli-DNA-Polymerase I (Toyobo) (10 u/ul) 4,5 ul

Beispiel 1: Analyse durch das molekulare DNA-Indizierungsverfahren

1. Spalten mit einem Klasse-IIS-Restriktionsenzym (anfängliche Spaltung)

Die in dem oben beschriebenen Referenzbeispiel hergestellte cDNA wurde mit einem Restriktionsenzym gespalten, indem die cDNA in irgendeiner der folgenden Reaktionslösungen (A) bis (C) bei einer festgelegten Temperatur unter genau angegebenen Bedingungen belassen wurde.

* Zusammensetzung der Reaktionslösung (A) (unter Verwendung von FokI):

10x M-Puffer 10 ul
0,1% BSA (Takara Shuzo) 10 ul
cDNA-Probe 80 ul
FokI (Takara Shuzo) (10 u/ul) 0,5 ul
Die Mischung wird 50 Minuten bis 1 Stunde bei 37ºC gehalten.

* Zusammensetzung der Reaktionslösung (B) (unter Verwendung von BsmAI):

10x Puffer für BsmAI (NEB) 10 ul
0,1% BSA 10 ul
cDNA-Probe 80 ul
BsmAI (NEB) (5 u/ul) 1 ul
Die Mischung wird 50 Minuten bis 1 Stunde bei 55ºC gehalten.

* Zusammensetzung der Reaktionslösung (C) (unter Verwendung von BsmFI):

10x H-Puffer 10 ul
Destilliertes Wasser 10 ul
cDNA-Probe 80 ul
BsmFI (NEB) (5 u/ul) 1 ul
Die Mischung wird 50 Minuten bis 1 Stunde bei 65ºC gehalten.
Nach Beendigung einer jeden der obigen Reaktionen (i), (ii) und (iii) wurden 3 ul 0,25 EDTA (pH 7,5) und 2 ul 5 M NaCl zu einer jeden Reaktionslösung zugegeben. Anschließend wurden eine Phenolextraktion und eine Ethanolfällung durchgeführt, und jeder Niederschlag wurde in 70 ul destilliertem Wasser gelöst.

2. Addition der Adaptoren

Zu den oben unter (1) erhaltenen cDNA-Fragmenten wurde einer der folgenden Adaptoren mit den nachstehend beschriebenen Sequenzen: C1T-Adaptoren:
oder C1G-Adaptoren:
(worin B Biotin darstellt; N irgendeine der vier Basen bedeutet; und XYZ eine der 64 möglichen Sequenzen darstellt. Wenn YZ = AA, AT, TA oder TT ist, wurden C1G- Adaptoren verwendet. Andernfalls wurden C1T-Adaptoren verwendet.) zugegeben und in der folgenden Reaktionslösung über Nacht bei 16ºC gehalten, um auf diese Weise die cDNA-Fragmente mit den Adaptoren zu ligieren.

* Zusammensetzung der Reaktionslösung:

10x E. coli-DNA-Ligase-Puffer 1 ul
100 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 1 ul
1 pmol/ul Adaptor-Lösung 1 ul
cDNA-Probe, gespalten mit einem Klasse-IIS-Restriktionsenzym 1 ul
E. coli-DNA-Ligase 3 Einheiten
Destilliertes Wasser auf 10 ul
Wenn die Sequenz XYZ weder G noch C enthielt, wurden 5 umol/ul Adaptor-Lösung und 30 Einheiten E. coli-DNA-Ligase verwendet.

3. Spalten mit Klasse-IIS-Restriktionsenzymen (die zweite Spaltung)

Die oben unter (2) erhaltenen cDNA-Fragmente wurden mit Klasse-IIS-Restriktionsenzymen weiter gespalten, indem die cDNA-Probe bei einer festgelegten Temperatur unter den nachstehend genau angegebenen Bedingungen gehalten wurde:

(i) Bei Verwendung eines FokI-Spaltprodukts:

40 ul destilliertes Wasser und 5 ul 10x H-Puffer wurden verwendet.
BsmFI (1 Einheit) wurde zugegeben und 50 Minuten bei 65ºC gehalten.
BsamAI (1 Einheit) wurde zugegeben und 50 Minuten bei 55ºC gehalten.

(ii) Bei Verwendung eines BsamAI-Spaltprodukts:

40 ul destilliertes Wasser und 5 ul 10x T-Puffer wurden verwendet.
FokI (1 Einheit) wurde zugegeben und 50 Minuten bei 37ºC gehalten.
BsmFI (1 Einheit) wurde zugegeben und 50 Minuten bei 65ºC gehalten.

(iii) Bei Verwendung eines BsamFI-Spaltprodukts:

40 ul destilliertes Wasser und 5 ul 10x M-Puffer wurden verwendet.
FokI (1 Einheit) wurde zugegeben und 50 Minuten bei 37ºC gehalten.
BsmAI (1 Einheit) und 1 ul 4 M NaCl wurden zugegeben und 50 Minuten bei 55ºC gehalten.

4. Amplifikation durch PCR

4-1. Gewinnung der Adaptormoleküle mit paramagnetischen Kügelchen

Unmittelbar vor der Verwendung wurden die Streptavidin-beschichteten paramagnetischen Kügelchen zweimal mit 0,1% BSA und einmal mit 1x B&W-Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 M NaCl, 1 mM EDTA) gewaschen und dann in einem gleichen Volumen von 1x B&W-Puffer suspendiert.
Zu einer jeden Probe wurden 15 ul 5 M NaCl und 5 ul der paramagnetischen Kügelchen zugegeben, 15 Minuten ohne Bewegen stehengelassen und einmal mit 1x B&W-Puffer gewaschen. Anschließend wurden 10 ul 0,1 M NaOH dazu zugegeben und 5 Minuten ohne Bewegen stehengelassen. Danach wurde die resultierende Mischung einmal mit 50 ul 0,1 M NaOH, einmal mit 1x B&W-Puffer und zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen.

4-2. PCR-Reaktion

Die Reaktionslösungen mit den nachstehend beschriebenen Zusammensetzungen wurden in ein Eppendorf-Röhrchen eingebracht und bei 96ºC für 1 Minute erhitzt, um einen umgehenden Start der Reaktionen zu ermöglichen. Anschließend wurde ein Temperaturwechsel, bestehend aus 30 Sekunden bei 94ºC, 1 Minute bei 50ºC und 1 Minute bei 72ºC, 25- bis 35mal wiederholt. Nach dem Ausführen eines Verlängerungsschritts bei 72ºC für 20 Minuten wurde die Reaktionslösung auf Raumtemperatur gekühlt.

* Zusammensetzung der Reaktionslösungen (pro Probe):

(i) Enzymreaktionslösung

10x PCR-Puffer für das Stoffel-Fragment 1 ul
2 mM dNTP 1 ul
25 mM MgCl&sub2; 1,2 ul
Destilliertes Wasser 4,3 ul
10 u/ul Stoffel-Fragment *1) 0,05 ul
*1) Ein Teil des AmpliTag-DNA-Polymerase-Fragments (Perkin-Elmer)

(ii) Primerreaktionslösung

10 umol/ul fluoreszierender CIT-Primer 0,5 ul
10 umol/ul d(T)&sub2;&sub5;A (oder d(T)&sub2;&sub5;C oder d(T)&sub2;&sub5; G) 2 ul
Die Primer werden in den Kombinationen JOE-C1T und d(T)&sub2;&sub5;A; FAM-C1T und d(T)&sub2;&sub5;C; und TAMRA-C1T und d(T)&sub2;&sub5;G verwendet. (JOE: 2',7-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxyfluorescein; FAM: 5'-Carboxyfluorescein; TAMRA: 6-Carboxytetramethylrhodamin (alle hergestellt durch Perkin-Elmer); Sequenz von C1T: d(GTACATAT- TGTCGTTAGAACGCT).
Alternativ ist die Zusammensetzung der Primerreaktionslösung bei der Verwendung von C1G-Adaptoren wie folgt:
10 pmol/ul fluoreszierender C1G-Primer 0,5 ul
10 pmol/ul d(T)&sub2;&sub5;A (oder d(T)&sub2;&sub5;C oder d(T)&sub2;&sub5;G) 2 ul
Die Primer werden in den Kombinationen JOE-C1G und d(T)&sub2;&sub5;A; FAM-C1G und d(T)&sub2;&sub5;C; und TAMRA-C1G und d(T)&sub2;&sub5;G verwendet. (JOE: 2',7-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxyfluorescein; FAM: 5'-Carboxyfluorescein; TAMRA: 6-Carboxytetramethylrhodamin (alle hergestellt durch Perkin-Elmer); Sequenz von C1G: d(GTACATAT- TGTCGTTAGAACGCG).

4-3. Herstellung von Elektrophoreseproben

Von jedem der Reaktionsprodukte wurde eine Probe wie folgt entnommen: 1 ul der Kombination von FAM-C1 und d(T)&sub2;&sub5;C, 3 ul der Kombination von JOE-C1 und d(T)&sub2;&sub5;A und 3 ul der Kombination von TAMRA-C1 und d(T)&sub2;&sub5;G. Zu einer jeden Probe wurden 5 ul T4-DPase-Lösung mit der folgenden Zusammensetzung zugegeben und bei 37ºC für 40 Minuten umgesetzt.

* Zusammensetzung der T4-DPase-Lösung (pro Probe):

10x M-Puffer 0,5 ul
2 mM dNTP 0,5 ul
Destilliertes Wasser 4 ul
T4-DNA-Polymerase (Toyobo) 1 Einheit
Nach einer Ethanolfällung der Reaktionslösung wurden 3,5 ul eines Puffers (80% Formaldehyd, 10 mM EDTA, 6 mg/ml blaues Dextran) zu der Probe (d. h. dem Niederschlag) zugegeben, bei 95ºC für 4 Minuten erhitzt, dann unmittelbar in die Probenvertiefung einer ABI 373A-Elektrophorese-Vorrichtung (Perkin-Elmer) eingebracht und getrennt (für 13 Stunden bei einer konstanten elektrischen Leistung von 30 W).
Fig. 4 zeigt ein Beispiel der erhaltenen Elektrophoresemuster.

Beispiel 2: Analyse durch das molekulare DNA-Indizierungsverfahren

1. Spalten mit einem Klasse-II-Restriktionsenzym

Die in dem vorstehend beschriebenen Referenzbeispiel hergestellte cDNA wurde mit einem Restriktionsenzym gespalten, indem die cDNA in der folgenden Reaktionslösung bei einer festgelegten Temperatur unter genau angegebenen Bedingungen belassen wurde.

* Zusammensetzung der Reaktionslösung (unter Verwendung von EcoRI):

10x Puffer mit hoher Salzkonzentration (verbunden mit dem Enzym) 5 ul
cDNA-Probe 45 ul
EcoRI (Toyobo oder Takara Shuzo) 5 Einheiten
Die Mischung wurde 1 Stunde bei 37ºC gehalten.
Nach Beendigung der Umsetzung wurden eine Phenolextraktion und eine Ethanolfällung durchgeführt, und der gesamte Niederschlag wurde für die nachfolgende Reaktion verwendet.

2. Addition von Adaptoren

Die folgenden Adaptoren:
wurden mit den oben unter (1) erhaltenen cDNA-Fragmenten ligiert, indem die cDNA- Probe in der folgenden Reaktionslösung 16 Stunden oder mehr bei 16ºC gehalten wurde.

* Zusammensetzung der Reaktionslösung:

10x Ligierungspuffer (ähnlicher dem von Toyobo) 2 ul
2,5 umol/ul EcoRI-Adaptoren 2 ul
T4-DNA-Ligase 150 Einheiten
Gesamtvolumen 20 ul
Nach Beendigung der Umsetzung wurden eine Phenolextraktion und eine Ethanolfällung durchgeführt, und der gesamte Niederschlag wurde für die nachfolgende Reaktion verwendet.

3. Spalten mit einem Klasse-IIS-Restriktionsenzym

Die oben unter (2) behandelte cDNA wurde mit einem Restriktionsenzym weiter gespalten, indem die cDNA-Probe in der folgenden Reaktionslösung bei einer festgelegten Temperatur unter genau angegebenen Bedingungen belassen wurde.

* Zusammensetzung der Reaktionslösung (unter Verwendung von BsmAI):

10x Puffer für BsmAI (NEB) 10 ul
0,1% BSA 10 ul
cDNA-Probe 80 ul
BsmAI (NEB) 0,5 ul
Die Mischung wurde 50 Minuten bis 1 Stunde bei 65ºC gehalten.
Nach Beendigung der Umsetzung wurden eine Phenolextraktion und eine Ethanolfällung durchgeführt, und der Niederschlag wurde in 30 ul gereinigtem Wasser gelöst.

4. Addition von biotinylierten Adaptoren

Die folgenden Adaptoren:
(worin B Biotin darstellt; N irgendeine der vier Basen bedeutet; und XYZ eine der 64 möglichen Sequenzen darstellt. Wenn YZ = AT oder TA ist, wurden CIG-Adaptoren verwendet. Andernfalls wurden C1T-Adaptoren verwendet.) wurden mit den oben unter (3) erhaltenen cDNA-Fragmenten ligiert, indem die cDNA-Probe in der folgenden Reaktionslösung über Nacht bei 16ºC gehalten wurde.

* Zusammensetzung der Reaktionslösung:

10x E. coli-DNA-Ligase-Puffer 1 ul
100 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 1 ul
1 pmol/ul Adaptor-Lösung 1 ul
cDNA-Fragmente, gespalten mit einem Klasse-IIS-Restriktionsenzym 1 ul
E. coli-DNA-Ligase 3 Einheiten
Destilliertes Wasser auf 10 ul
Wenn die Sequenz XYZ weder G noch C enthielt, wurden 5 umol/ul Adaptor-Lösung und 6 Einheiten E. coli-DNA-Ligase verwendet.

5. Amplifikation durch PCR

5-1. Gewinnung der Adaptormoleküle mit paramagnetischen Kügelchen

Unmittelbar vor der Verwendung wurden die Streptavidin-beschichteten paramagnetischen Kügelchen zweimal mit 0,1% BSA und einmal mit 1x B&W-Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 M NaCl, 1 mM EDTA) gewaschen und dann in einem gleichen Volumen von 1x B&W-Puffer suspendiert.
Zu der Probe wurden 15 ul 5 M NaCl und 5 ul der paramagnetischen Kügelchen zugegeben, 15 Minuten ohne Bewegen stehengelassen und einmal mit 1x B&W-Puffer gewaschen. Anschließend wurden 10 ul 0,1 M NaOH dazu zugegeben und 5 Minuten ohne Bewegen stehengelassen. Danach wurde die resultierende Mischung einmal mit 50 ul 0,1 M NaOH, einmal mit 1x B&W-Puffer und zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen.

5-2. PCR-Reaktion

Die Reaktionslösungen mit den nachstehend beschriebenen Zusammensetzungen wurden in ein Eppendorf-Röhrchen eingebracht und bei 96ºC für 1 Minute erhitzt, um den umgehenden Start der Reaktionen zu ermöglichen. Anschließend wurde ein Temperaturwechsel, bestehend aus 30 Sekunden bei 94ºC, 1 Minute bei 50ºC und 1 Minute bei 72ºC, 25- bis 35mal wiederholt. Nach dem Ausführen eines Verlängerungsschritts bei 72ºC für 20 Minuten wurde die Reaktionslösung auf Raumtemperatur gekühlt.

* Zusammensetzung der Reaktionslösungen (pro Probe):

(i) Enzymreaktionslösung

(ii) Primerreaktionslösung

10 pmol/ul fluoreszierender C1S-Primer 0,5 ul
10 pmol/ul λgt10-Vorwärts-Primer 0,5 ul
Die zwei Primer-Typen mit den folgenden Sequenzen werden in Kombination miteinander verwendet.

5-3. Herstellung von Elektrophoreseproben

Von den Reaktionsprodukten wurde eine 3 ul-Probe entnommen und 5 ul T4- DPase-Lösung mit der folgenden Zusammensetzung wurden dazu zugegeben. Die resultierende Mischung wurde bei 37ºC für 40 Minuten umgesetzt.

* Zusammensetzung der T4-DPase-Lösung (pro Probe):

10x M-Puffer 0,5 ul
2 mM dNTP 0,5 ul
Destilliertes Wasser 4 ul
T4-DNA-Polymerase (Toyobo) 1 Einheit
Nach einer Ethanolfällung der Reaktionslösung wurden 3,5 ul eines Puffers (80% Formaldehyd, 10 mM EDTA, 6 mg/ml blaues Dextran) zu der Probe (d. h. dem Niederschlag) zugegeben, bei 95ºC für 4 Minuten erhitzt, dann unmittelbar in die Probenvertiefung einer ABI 373A-Elektrophorese-Vorrichtung (Perkin-Elmer) eingebracht und getrennt (für 13 Stunden bei einer konstanten elektrischen Leistung von 30 W).
Fig. 5 zeigt ein Beispiel der erhaltenen Elektrophoresemuster.

Claims

1. Verfahren zur molekularen Indizierung, umfassend die folgenden Schritte:

(1) Digestion von cDNA, welche aus Gewebe- oder Zellen-abgeleiteter RNA reverstranskribiert wurde, mit einem ersten Restriktionsenzym der Klasse-IIS,

(2) Binden eines jeden resultierenden cDNA-Fragments an einen Adaptor aus einem Pool aus 64 biotinylierten Adaptoren, welche kohäsiv gegenüber allen möglichen Überhängen sind, worin die 5'-Enden dieser Adaptoren nicht phosphoryliert sind,

(3) weitere Digestion der resultierenden cDNA-Fragmente mit einem zweiten und einem dritten Restriktionsenzym der Klasse-IIS, welche von dem ersten Klasse-IIS-Restriktionsenzym, das oben unter (1) verwendet wird, verschieden sind, unter Erhalt einer ersten cDNA-Probe,

(4) Erhalt einer zweiten cDNA-Probe durch Wiederholen der obigen Schritte (1) bis (3), worin das zweite Klasse-IIS-Restriktionsenzym für die anfängliche Digestion und das erste und das dritte Klasse-IIS-Restriktionsenzym für die nachfolgende Digestion verwendet werden,

(5) Erhalt einer dritten cDNA-Probe durch Wiederholen der obigen Schritte (1) bis (3), worin das dritte Klasse-IIS-Restriktionsenzym für die anfängliche Digestion verwendet wird und das erste und das zweite Klasse-IIS-Restriktionsenzym für die nachfolgende Digestion verwendet werden,

(6) Gewinnung der cDNA-Fragmente, welche an die Adaptoren gebunden sind, aus den cDNA-Proben durch Binden an Streptavidin-beschichtete paramagnetische Kügelchen, Entfernung der nicht-biotinylierten Polynucleotid-Stränge aus den gewonnenen cDNA-Fragmenten unter Erhalt einer Einzelstrang-cDNA- Probe,

(7) Vervielfältigung jeder der resultierenden cDNA-Proben durch PCR unter Verwendung eines Adaptor-Primers und eines verankerten Oligo-dT-Primers,

(8) Trennen der vervielfältigten Produkte durch denaturierende Polyacrylamid- Gelelektrophorese und Aufzeichnung der Größe der erhaltenen Fragmente.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die verwendeten Klasse-IIS-Restriktionsenzyme Fok I, Bsm AI und Bsm FI sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die cDNA durch reverse Transkription einer Gewebe- oder Zellen-abgeleiteten RNA unter Verwendung einer Mischung der folgenden Oligonucleotide als Primer hergestellt wurde:

4. Verfahren zur molekularen Indizierung, umfassend die folgenden Schritte:

(1) Digestion von cDNA, welche aus Gewebe- oder Zellen-abgeleiteter RNA oder DNA mit einem Restriktionsenzym der Klasse-II reverstranskribiert wurde,

(2) Binden jedes der resultierenden cDNA- oder DNA-Fragmente an einen Adaptor, welcher gegenüber den durch das Klasse-II-Restriktionsenzym gebildeten Enden kohäsiv ist, worin die 5'-Enden dieser Adaptoren phosphoryliert sind,

(3) weitere Digestion der resultierenden cDNA- oder DNA-Fragmente mit einem Restriktionsenzym der Klasse-IIS,

(4) Binden eines jeden der resultierenden cDNA- oder DNA-Fragmente an einen Adaptor aus einem Pool von 64 biotinylierten Adaptoren, welche gegenüber allen möglichen Überhängen kohäsiv sind,

(5) Gewinnen von cDNA-Fragmenten, welche an Adaptoren gebunden sind, aus jeder der cDNA-Proben durch Binden an Streptavidin-beschichtete paramagnetische Kügelchen, Entfernen von nicht-biotinylierten Polynucleotid-Strängen von den gewonnen cDNA-Fragmenten unter Erhalt einer Einzelstrang-cDNA- Probe,

(6) Vervielfältigen der resultierenden cDNA- oder DNA-Probe durch PCR unter Verwendung von Adaptor-Primern,

(7) Trennen der vervielfältigten Produkte durch denaturierende Polyacrylamid- Gelelektrophorese und Aufzeichnen der Größen der erhaltenen Fragmente.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Klasse-IIS-Restriktionsenzym irgendeines aus Fok I, Bsm AI, Bsm FI, Sfa NI oder Bbv I ist.