DE69533863T2

DE69533863T2 - MSRV1 Virus der mit Multipler Sklerose verbunden ist, seine nukleären Bestandteile und Verwendungen

Info

Publication number: DE69533863T2
Application number: DE69533863T
Authority: DE
Inventors: Bernard Mandrand; Herve Perron; François Mallet; Frederic Bedin; Frederic Beseme
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1994-02-04
Filing date: 1995-02-06
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2015-02-07
Also published as: US5800980A; US6184025B1; AU1711495A; AU704440B2; DE674004T1; US5871745A; NZ279855A; JPH08511170A; FI954699A0; DE69533863D1; US6342383B1; US5871996A; FI954699L; WO1995021256A1; EP0674004A1; NO953925L; EP0674004B1; JP3611856B2; US5962217A; NO953925D0

Description

Multiple Sklerose (MS) ist eine Demyelinisierungskrankheit des zentralen Nervensystems (ZNS), deren Ursache immer noch ungewiss bleibt.
Zahlreiche Studien haben die Hypothese einer viralen Ätiologie der Krankheit unterstützt, jedoch erwies sich keiner der bekannten und bisher getesteten Viren als das gesuchte kausale Agens: Eine Übersicht der Viren, die bei MS mehrere Jahre lang untersucht wurden, wurde von E. Norrby (1) und R. T. Johnson (2) erstellt.
Gleichzeitig wurde die Möglichkeit eines exogenen und/oder infektiösen Faktors auf Grund des Vorliegens von örtlichen Epidemien oder „Cluster" von MS vorgeschlagen, wie auf den Faröer Inseln zwischen 1943 und 1960 (3) beobachtet wurde, ferner in Sardinien (4), in Norwegen (5) sowie durch Studien über migrierende Populationen (6). Unter alle vorgeschlagenen exogenen Faktoren wurden Viren am häufigsten untersucht, und eine virale Ätiologie wird klassischerweise in Erinnerung gerufen.
Die Beobachtung von Phänomenen bei MS, die im Zusammenhang mit einer Autoimmunreaktion stehen, führte zu einer Hypothese der „essenziellen" Autoimmun-Ätiologie (7 und 8). Dennoch stellte sich heraus, dass diese Autoimmunität, die gegen bestimmte Komponenten des ZNS gerichtet ist, nicht für MS spezifisch ist und bei einer Entzündung des ZNS vielmehr üblich ist, egal, ob diese mit einer Infektion verbunden ist (9, 10, 11 und 12). Ferner konnte keine der immunsuppressiven Therapien entscheidende Ergebnisse gegen MS erzielen (13). Es scheint heute vielmehr so zu sein, dass die Erscheinungsformen der „Autoimmunität" durch einen Mechanismus viralen Ursprungs induziert werden: Co-Sensibilisierung gegenüber viralen Determinanten, die mit Molekülen zellulären Ursprungs assoziiert sind, Phänomene der molekularen Mimikry (14) oder durch Expression retro-viraler Superantigene (15).
In einigen Untersuchungen wird eine Hypothese unterstützt, nach welcher ein Retrovirus den Ursprung der Krankheit darstellt: Die kürzliche Entdeckung (16) von neurologischen Syndromen, die mit dem HTLV-I-Virus, ursprünglich bekannt als ein T-Zell-Leukämieagens von Erwachsenen, assoziiert sind, brachte viele Autoren (17, 18, 19, 20, 21, 22, 23) dazu, nach einer Beteiligung dieses humanen Retrovirus bei MS zu forschen, jedoch ohne Erfolg oder mit Ergebnissen, die Kreuzreaktionen nahelegen.
Kürzlich wurde ein Retrovirus, der sich von den bekannten humanen Retroviren unterscheidet, in Patienten isoliert, die an MS leiden (24, 25 und 26). Die Autoren konnten auch zeigen, dass dieses Retrovirus in vitro übertragen werden konnte, dass Patienten, die an MS leiden, Antikörper produzierten, die dazu in der Lage sind, Proteine, die mit der Infektion von Zellen der Pia mater durch dieses Retrovirus verbunden sind, zu erkennen, und dass ferner die Expression letzterer durch „immediate-early"-Gene einiger Herpesviren stark stimuliert werden konnten (27).
All diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass bei MS zumindest ein unbekannter Retrovirus oder ein Virus eine Rolle spielt, das reverse Transkriptaseaktivität aufweist, welche gemäß dem Verfahren nachzuweisen ist, welches von H. Perron (24) veröffentlicht wurde, und welche als „LM7-ähnliche RT" bezüglich der Aktivität eingeordnet wird. Der Inhalt dieser Veröffentlichung, mit (24) identifiziert, ist hiermit in der vorliegenden Beschreibung durch Bezugnahme mit eingenommen.
Kürzlich konnten durch Versuche des Anmelders zwei kontinuierliche Zelllinien etabliert werden, die mit natürlichen Isolaten infiziert sind, die von zwei unterschiedlichen an MS leidenden Patienten herrühren und welche durch ein Kultivierungsverfahren gewonnen werden können, wie in der Druckschrift WO-A-9320188 beschrieben ist, deren Inhalt in der vorliegenden Beschreibung durch Bezugnahme mit eingenommen ist. Diese zwei Linien, die von humanen Aderhaut-Plexus-Zellen stammen und mit LM7PC und PLI-2 bezeichnet werden, wurden bei der ECACC jeweils am 22. Juli 1992 und am 8. Januar 1993 unter den Nummern 92072201 und 93010817 gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt. Darüber hinaus wurden die viralen Isolate, die eine LM7-ähnliche RT-Aktivität aufweisen, bei der ECACC unter der allgemeinen Bezeichnung der „Stämme" hinterlegt. Der „Stamm" oder das Isolat, welches in der PLI-2-Linie enthalten ist und als POL-2 bezeichnet ist, wurde am 22. Juli 1992 unter der Nummer V92072202 hinterlegt. Der „Stamm" oder das Isolat, welches in der LM7PC-Linie enthalten ist und als MS7PG bezeichnet ist, wurde am 8. Januar 1993 unter der Nummer V93010816 hinterlegt.
Ausgehend von den oben erwähnten Kulturen und Isolaten, die durch biologische und morphologische Kriterien charakterisiert sind, bemühte man sich in einem nächsten Schritt, das Nucleinsäurematerial, welches mit den viralen Partikeln assoziiert ist und in diesen Kulturen produziert wird, zu charakterisieren.
Die unterschiedlichen Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind in den Ansprüchen 1 bis 11 des Anhangs definiert.
Bevor die Erfindung detaillierter beschrieben wird, werden verschiedene Ausdrücke, die in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet werden, im Folgenden definiert:

– Unter einem Stamm oder Isolat ist jede infektiöse und/oder pathogene biologische Fraktion zu verstehen, die bspw. Viren und/oder Bakterien und/oder Parasiten enthält, und die pathogene und/oder antigene Aktivität hervorruft, und welche in einer Kultur oder einem lebenden Wirt enthalten ist; als Beispiel kann ein viraler Stamm gemäß der oben stehenden Definition ein co-infektiöses Agens, bspw. einen pathogenen Einzeller, aufweisen,
– der Ausdruck „MSRV", der in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezeichnet jedes pathogene und/oder infektiöse Agens, welches mit der Multiple Sklerose assoziiert ist, insbesondere ein virales Spezies, die abgeschwächten Stämme dieser viralen Spezies oder die fehlerhaft interferierenden Partikel, die von dieser Spezies abstammen. Viren und insbesondere Viren, die RNA enthalten, besitzen bekanntermaßen eine Variabilität, die insbesondere das Ergebnis einer relativ hohen spontanen Mutationsrate ist (28), was bei der Definition des Begriffs der Äquivalenz berücksichtigt werden wird,
– unter einem humanen Virus versteht man einen Virus, der dazu in der Lage ist, Menschen zu infizieren,
– in Anbetracht jeglicher natürlichen oder induzierten Variationen, die bei Umsetzung der vorliegenden Erfindung auftreten, wurden die Gegenstände der Erfindung, wie oben und in den Ansprüchen definiert, einschließlich der Äquivalente oder Derivate unterschiedlicher biologischer, unten definierter Materialien exprimiert, insbesondere homologe Nucleotide oder Peptidsequenzen,
– die Variante eines Virus gemäß der Erfindung umfasst zumindest ein Antigen, welches durch zumindest einen Antikörper erkannt wird, welcher gegen zumindest ein korrespondierendes Antigen dieses Virus gerichtet ist, und/oder ein Genom, wovon irgendein Anteil durch zumindest eine Hybridisierungs-Sonde und/oder zumindest einen Nucleotid-Amplifizierungsprimer detektiert wird, der für das Virus spezifisch ist, wie bspw. die Primer mit der Nucleotidsequenz, die ausgewählt sind aus den Sequenzen SEQ ID Nr. 16 bis SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 31 bis SEQ ID Nr. 33 und deren komplementäre Sequenzen unter besonderen Hybridisierungsbedingungen, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind,
– gemäß der Erfindung ist ein Nucleotidfragment oder ein Oligonucleotid oder Polynucleotid eine Anordnung von Monomeren oder ein Biopolymer, welches durch die informationsenthaltende Sequenz der natürlichen Nucleinsäuren charakterisiert ist, welche dazu in der Lage sind, mit jedem anderen Nucleotidfragment unter vorbestimmten Bedingungen zu hybridisieren, wobei die Anordnung Monomere unterschiedlicher chemischer Strukturen enthalten kann und wobei die Anordnung aus einem Molekül einer natürlichen Nucleinsäure und/oder durch genetische Rekombination und/oder durch chemische Synthese gewonnen werden kann,
– daher kann das Monomer ein natürliches Nucleotid von Nucleinsäuren sein, dessen zusammengesetzte Elemente ein Zucker, eine Phosphatgruppe und eine stickstoffhaltige Base sind; in der RNA ist der Zucker Ribose, in der DNA ist der Zucker 2-Desoxyribose; je nach dem, ob die Nucleinsäure DNA oder RNA ist, ist die stickstoffhaltige Base ausgewählt aus Adenin, Guanin, Uracil, Cytosin und Thymin; oder das Nucleotid kann in zumindest einem der drei zusammengesetzten Elemente modifiziert sein; z.B. kann die Modifizierung in den Basen liegen, wodurch modifizierte Basen wie Inosin, 5-Methyldesoxy-cytidin, Desoxyuridin, 5-(Dimethylamino)desoxyuridin, 2,6-Diaminopurin, 5-Bromdesoxyuridin und jede andere modifizierte Base generiert werden, die eine Hybridisierung vermitteln; im Zucker kann die Modifizierung aus dem Ersatz von zumindest einer Desoxyribose durch ein Polyamid bestehen (29), und in der Phosphatgruppe kann die Modifizierung aus dessen Ersatz durch ausgewählte Ester bestehen, insbesondere aus Diphosphat, Alkyl- und Arylphosphonat- und aus Phosphothioatestern,
– unter einer „informationsenthaltenden Sequenz" wird jede geordnete Aufeinanderfolge von Monomeren verstanden, mit einer chemischen Natur und Anordnung in einer Präferenzrichtung, welche wahlweise aus einer funktionellen Funktion besteht oder nicht, und zwar von der gleichen Qualität wie natürliche Nucleinsäuren,
– unter Hybridisierung wird der Prozess verstanden, während dessen – unter geeigneten Arbeitsbedingungen – zwei Nucleotidfragmente mit hinreichend komplementären Sequenzen eine komplexe Struktur bilden, insbesondere zweifach oder dreifach, vorzugsweise in der Form einer Helix,
– die Sonde umfasst ein Nucleotidfragment, welches chemisch synthetisiert wurde oder welches durch einen Verdau oder enzymatische Spaltung eines längeren Nucleotidfragments gewonnen wird, welches zumindest sechs Monomere umfasst, vorteilhafterweise von 10 bis 100 Monomere, und vorzugsweise von 10 bis 30 Monomere, und welches eine Hybridisierungs-Spezifität unter besonderen Bedingungen besitzt; vorzugsweise wird eine Sonde mit weniger als 10 Monomeren nicht alleine verwendet, sondern in Gegenwart anderer Sonden mit gleich kurzer Länge oder auch andere; unter bestimmten speziellen Bedingungen kann es nützlich sein, Sonden mit einer Länge von größer als 100 Monomeren zu verwenden; eine Sonde kann insbesondere für diagnostische Zwecke verwendet werden, wobei solche Moleküle bspw. Fänger- und/oder Detektionssonden sind,
– die Fängersonde kann an einem festen Träger durch jedes geeignete Mittel immobilisiert sein, also direkt oder indirekt, bspw. durch kovalente Bindung oder passive Absorption,
– die Detektionssonde kann durch eine Markierung markiert sein, die ausgewählt ist, insbesondere aus radioaktiven Isotopen, Enzymen, die wiederum insbesondere aus Peroxydase und alkalischer Phosphatase ausgewählt sind, und aus solchen, die dazu in der Lage sind, ein chromogenes, fluorogenes oder lumineszierendes Substrat zu hydrolysieren, chromophore chemische Verbindungen, chromogene, fluorogene oder lumineszierende Verbindungen, Nucleotidbasenanaloga und Biotin,
– die Sonde, welche für diagnostische Zwecke der Erfindung eingesetzt wird, kann bei allen bekannten Hybridisierungstechniken eingesetzt werden, und insbesondere die Technik, welche als „Dot-Blot" (30), „Southern-Blot" (31), „Northern-Blot", eine Technik, die identisch zu der Southern-Blot"-Technik ist, die jedoch RNA als Ziel verwendet, und die „Sandwich"-Technik (32); bei der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise die Sandwich-Technik angewendet, welche eine spezifische Fängersonde und/oder eine spezifische Detektionssonde umfasst, mit der Voraussetzung, dass die Fängersonde und die Detektionssonde eine zumindest teilweise unterschiedliche Nucleotidsequenz besitzen,
– die Erfindung betrifft auch eine Sonde, die in vivo oder in vitro mit RNA und/oder mit DNA hybridisieren kann, um das Phänomen der Replikation zu blockieren, insbesondere die Translation und/oder Transkription, und/oder um diese DNA und/oder RNA abzubauen,
– ein Primer ist eine Sonde mit mindestens sechs Monomeren und vorteilhafterweise von 10 bis 30 Monomeren, mit einer Hybridisierung-Spezifität unter bestimmten Bedingungen für die Initiierung einer enzymatischen Polymerisation, bspw. in einer Amplifizierungstechnik wie PCR (Polymerasekettenreaktion), in einem Elongations-Prozess, wie Sequenzierung, in einem Verfahren der reversen Transkription oder Ähnlichem,
– zwei Nucleotid- oder Peptidsequenzen werden als Äquivalente bezeichnet oder als mit Bezug aufeinander abgeleitet, oder mit Bezug auf eine Präferenzsequenz, wenn die korrespondierenden Biopolymere im Wesentlichen die gleiche Rolle funktionell erfüllen, ohne jedoch identisch zu sein, mit Bezug auf die Anmeldung oder der fraglichen Verwendung, oder in der Technik, an welcher sie teilnehmen; zwei Sequenzen sind insbesondere dann äquivalent, wenn sie als Ergebnis natürlicher Variabilität erhalten werden, insbesondere als spontane Mutation der Spezies, aus welcher sie identifiziert wurden, oder induzierte Variabilität, wie es homologe Sequenzen sind, wobei Homologie wie nachstehend definiert wird,
– unter Variabilität wird jede spontane oder induzierte Modifizierung einer Sequenz verstanden, insbesondere durch Substitution und/oder Insertion und/oder Deletion von Nucleotiden und/oder von Nucleotidfragmenten, und/oder Verlängerung und/oder Verkürzung der Sequenz an einem oder beiden Enden; eine unnatürliche Variabilität kann das Ergebnis von gentechnologischen Techniken sein, bspw. die Auswahl der Syntheseprimer, die wahlweise degeneriert oder auch nicht sein können, ausgewählt für die Amplifizierung einer Nucleinsäure; diese Variabilität kann sich in Modifizierungen jeder Startsequenz äußern, welche als Referenz betrachtet wird, und kann dazu in der Lage sein, mit einem Homologiegrad exprimiert zu werden, der relativ zu der Referenzsequenz ist,
– die Homologie charakterisiert den Identitätsgrad zweier zu vergleichenden Nucleotid- oder Peptidfragmente; sie wird durch den Prozentsatz der Identität gemessen, der insbesondere durch direkten Vergleich der Nucleotid- oder Peptidfragmente bestimmt wird, und zwar relativ zu Referenz-Nucleotid- oder -Peptidsequenzen,
– diese Identität in Prozenten wurde spezifisch für die Nucleotidfragmente bestimmt, welche in der vorliegenden Erfindung behandelt werden, und die mit den Fragmenten homolog sind, die als SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9 (MSRV-1) bezeichnet werden, und auch für die Sonden und Primer, welche zu den Sonden und Primern homolog sind, die durch die SEQ ID Nr. 16 bis Nr. 26 und SEQ ID Nr. 31 bis Nr. 33 definiert sind; bspw. ist die geringste Identität im Prozentsatz, welche zwischen den unterschiedlichen allgemeinen Konsensussequenzen der Nucleinsäuren beobachtet wurde, die aus Fragmenten der MSRV-1-viralen RNA gewonnen wurde, welche aus den LM7PC- und PLI-2-Linien gemäß einem später detailliert beschriebenen Protokoll gewonnen wurden, 67% in der Region, welche in 2 beschrieben ist,
– jedes Nucleotidfragment wird als Äquivalent bezeichnet oder als von einem Referenzfragment abgeleitet, wenn es eine Nucleotidsequenz besitzt, die äquivalent zu der Referenzsequenz ist; nach der oben stehenden Definition sind insbesondere die folgenden äquivalent zu einem Referenz-Nucleotidfragment:
a) jedes Fragment, das dazu in der Lage ist, zumindest teilweise mit dem Gegenstück des Referenzfragments zu hybridisieren
b) jedes Fragment, dessen Ausrichtung mit dem Referenzfragment in das Aufzeigen einer größeren Nummer identischer zusammenhängender Basen resultiert als mit jedem anderen Fragment, welches von einer anderen taxonomischen Gruppe stammt
c) jedes Fragment, das aus der natürlichen Variabilität der Spezies, aus welcher es gewonnen wird, resultiert oder resultieren kann
d) jedes Fragment, das aus gentechnologischen Verfahren gewonnen werden kann, welches auf das Referenzfragment angewandt wird
e) jedes Fragment, welches zumindest acht zusammenhängende Nucleotide enthält, die für ein Peptid kodieren, welches homolog ist zu oder identisch ist mit dem Peptid, welches durch das Referenzfragment kodiert wird,
f) jedes Fragment, das von dem Referenzfragment durch Insertion, Deletion oder Substitution mit zumindest einem Monomer unterscheidet, oder durch Verlängerung oder Verkürzung an einem oder beiden seiner Enden; bspw. jedes Fragment, welches dem Referenzfragment entspricht, das an einem oder beiden seiner Enden von einer Nucleotidsequenz flankiert ist, die nicht für ein Polypeptid kodiert,
– unter Polypeptid wird insbesondere ein Peptid mit zumindest zwei Aminosäuren verstanden, insbesondere ein Oligopeptid oder Protein, das extrahiert, aufgetrennt oder im Wesentlichen isoliert oder synthetisiert wird durch menschliche Zwischenschritte, insbesondere diejenigen, die durch chemische Synthese oder durch Expression in einen rekombinanten Organismus gewonnen werden,
– unter einem Polypeptid, welches teilweise durch ein Nucleotidfragment kodiert wird, wird ein Polypeptid verstanden, welches zumindest 10 Aminosäuren besitzt, welche von zumindest 30 zusammenhängenden Monomeren kodiert werden, die in dem Nucleotidfragment vorliegen,
– eine Aminosäure wird als analog zu einer anderen Aminosäure bezeichnet, wenn deren jeweilige physiochemischen Eigenschaften wie Polarität, Hydrophobizität und/oder Basizität und/oder Acidität und/oder Neutralität im Wesentlichen die Gleichen sind; daher ist ein Leucin analog zu einem Isoleucin.
– jedes Polypeptid wird als Äquivalent bezeichnet oder als von einem Referenzpolypeptid abgeleitet, wenn die zu vergleichenden Polypeptide im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften aufweisen, und insbesondere die gleichen antigenen, immunologischen, enzymologischen und/oder molekulare Erkennungs-Eigenschaften; insbesondere sind die Folgenden äquivalent zu einem Referenzpolypeptid:
a) jedes Polypeptid mit einer Sequenz, in welcher zumindest eine Aminosäure durch eine analoge Aminosäure ersetzt wurde,
b) jedes Polypeptid mit einer äquivalenten Peptidsequenz, welche durch natürliche oder induzierte Variation des Referenzpolypeptids und/oder des für das Polypeptid kodierende Nucleotidfragment gewonnen wurde,
c) ein Mimotop des Referenzpolypeptids,
d) jedes Polypeptid, in dessen Sequenz eine oder mehrere Aminosäuren der L-Reihe durch eine Aminosäure der D-Reihe ersetzt wurden, und umgekehrt,
e) jedes Polypeptid, in dessen Sequenz eine Modifizierung der Seitenketten der Aminosäuren eingeführt wurde, wie bspw. eine Acetylierung der Amin-Funktion, eine Carboxylierung der Thiol-Funktion, eine Veresterung der Carboxyl-Funktion,
f) jedes Polypeptid, in dessen Sequenz eine oder mehrere Peptidbindungen modifiziert wurden, wie bspw. Carba-, Retro-, Inverso-, Retro-Inverso-, reduzierte und Methylenoxy-Bindungen.
(g) jedes Polypeptid, von welchem zumindest ein Antigen durch ein Antigen des Referenzpolypeptids erkannt wird,
– der Prozentsatz der Identität, der die Homologie der zwei Peptidfragmente miteinander vergleicht, ist, gemäß der vorliegenden Erfindung, mindestens 50% und vorzugsweise mindestens 70%.

In Anbetracht der Tatsache, dass ein Virus, der eine enzymatische reverse Transkriptaseaktivität besitzt, sowohl in RNA- als auch in DNA-Form gleich gut genetisch charakterisiert werden kann, wird sowohl auf virale DNA als auch RNA Bezug genommen, zur Charakterisierung der Sequenzen, die sich auf ein Virus beziehen, das eine solche reverse Transkriptaseaktivität besitzt (MSRV-1).
Die Ausdrücke der Reihenfolge, die in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet werden, wie bspw. „erste Nucleotidsequenz", wurden nicht dazu eingesetzt, eine besondere Reihenfolge auszudrücken, sondern um die Erfindung deutlicher zu definieren.
Die Erfindung wird durch Lesen der nachstehenden detaillierten Beschreibung besser verstanden werden, welche mit Bezug zu den beigefügten Figuren abgefasst wurde, in welchen:
1 allgemein Konsensussequenzen der Nucleinsäuren der MSRV-1B-Sequenzen zeigt, die durch die PCR-Technik in der „pol"-Region amplifiziert wurden, und zwar aus viraler DNA, welche den LM7PC- und PLI-2-Linien entstammt, und welche durch die Referenzen SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 identifiziert sind, und die allgemeine Konsensussequenz mit Amplifizierungsprimern der Referenzsequenz SEQ ID Nr. 7,
2 einen phylogenetischen Baum der Sequenzen vom MSRV-1B-Typ zeigt, welche durch PCR in der „pol"-Region – wie durch Shih definiert – erhalten wurden (33),
3 eine Definition eines funktionellen Leserahmens für jede MSRV-1B/"PCR pol"-Familienart zeigt, wobei die Familien A bis D jeweils durch die Nucleotidsequenzen SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6 – wie in 2 beschrieben – definiert sind,
4 eine Darstellung der reversen Transkriptase(RT)-Aktivität in dpm (disintegrations per minute) zeigt, und zwar in den Saccharosefraktionen, die aus den Reinigungsgradienten der Virionen erhalten wurden, die von den B-Lymphocyten eines Patienten, der an MS leidet, in Kultur produziert wurden,
5 das Assay der reversen Transkriptaseaktivität unter den gleichen Bedingungen wie in 4 zeigt, in der Kultur einer B-Lymphocytenlinie, die aus einer Kontrolle gewonnen wurde, die keine Multiple Sklerose zeigt,
6 eine Nucleotidsequenz des Klons PSJ17 (SEQ ID Nr. 9) zeigt,
7 die Nucleotidsequenz ID Nr. 8 vom Klon mit der Bezeichnung M003-P004 zeigt,
8 die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 des Klons F11-1 zeigt; der Teil, der zwischen zwei Zeilen in Region des Primers liegt, entspricht einer Variabilität, die durch die Auswahl des Primers hervorgerufen wurde, welcher zur Klonierung von F11-1 verwendet wurde; in der gleichen Figur ist die Translation in Aminosäuren gezeigt,
9 die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 zeigt, und ein möglicher funktionaler Leserahmen der SEQ ID Nr. 1 in Form von Aminosäuren; in dieser Sequenz sind die Consensus-Sequenzen der retroviralen reversen Transkriptasen unterstrichen,
die 10 und 11 die Ergebnisse einer PCR zeigen, und zwar in Form eines Fotos unter ultraviolettem Licht eines Ethidium-Bromid-gefärbten Agarosegels der Amplifizierungsprodukte, die mit den Primern, bezeichnet mit SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 18 und SEQ ID Nr. 19, erhalten wurden.
12 eine Matrix-Darstellung der Homologie zwischen SEQ ID Nr. 1 von MSRV-1 und der Sequenz eines endogenen Retrovirus mit der Bezeichnung HSERV9 zeigt; diese Homologie von mindestens 65% wird durch eine kontinuierliche Linie angezeigt, die Abwesenheit einer Linie bedeutet eine Homologie von weniger als 65%.
BEISPIEL 1: GEWINNUNG VON KLONEN MIT DER BEZEICHNUNG MSRV-1B, DIE EINEN RETROVIRUS MSRV-1 DEFINIEREN, DURCH EINE „NESTED" PCR-AMPLIFIZIERUNG DER KONSERVIERTEN POL-REGIONEN DES RETROVIRUS AUS DEN VIRION-PRÄPARATIONEN, ERHALTEN AUS DEN LINIEN LM7PC UND PLI-2
Eingesetzt wurde eine PCR-Technik, die von der von Shih (33) veröffentlichten Technik abgeleitet ist. Diese Technik ermöglicht es, alle Spuren kontaminierender DNA durch Behandlung aller Komponenten des Reaktionsmediums mit DNase zu entfernen. Gleichzeitig wird es durch die Verwendung von unterschiedlichen, jedoch überlappenden Primern in zwei aufeinander folgenden PCR-Amplifizierungs-Zyklen ermöglicht, die Chance der Amplifizierung einer cDNA zu erhöhen, die ausgehend von einer Menge an RNA synthetisiert wird, die anfänglich klein ist und in der Probe durch störende Wirkungen der DNase auf die RNA weiter reduziert wird. Als Ergebnis wird die DNase im Überschuss bei Aktivitäts-Bedingungen eingesetzt, bei welchen alle Spuren kontaminierender DNA entfernt werden können, und zwar vor der Inaktivierung dieses in der Probe verbleibenden Enzyms durch Erhitzung auf 85°C für zehn Minuten. Diese Variante der PCR-Technik, wie sie von Shih (33) beschrieben wurde, wurde bei einer cDNA eingesetzt, die ausgehend von Nucleinsäuren von Fraktionen infektiöser Partikel synthetisiert wurde, welche auf einem Saccharose-Gradienten gemäß der Technik, wie sie von H. Perron (34) gereinigt wurden, und zwar einerseits ausgehend von dem „POL-2"-Isolat (ECACC Nr. V92072202), produziert von der PLI-2-Linie (ECACC Nr. 92072201), und andererseits ausgehend von dem MS7PG-Isolat (ECACC Nr. V93010816), produziert von der LM7PC-Linie (ECACC Nr. 93010817). Diese Kulturen wurden gemäß den Verfahren gewonnen, welche den Gegenstand der Patentanmeldungen, die unter den Nummern WO93/20188 und WO93/20189 veröffentlicht wurden, bilden.
Nach Klonierung der durch diese Technik amplifizierten Produkte mit dem TA Cloning Kit^® und nach Analyse der Sequenz unter Verwendung eines automatischen Sequenzierers, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden die Sequenzen unter Verwendung der Geneworks^®-Software mit der neuesten verfügbaren Version der Genebank^®-Datenbank analysiert.
Die aus diesen Proben klonierten und sequenzierten Sequenzen entsprechen insbesondere einer Sequenzart, die sich in der Mehrheit der Klone findet (55% der Klone, die von den POL-2-Isolaten der PLI-2-Kultur stammen, und 67% der Klone, die von den MS7PG-Isolaten der LM7PC-Kulturen stammen), welche einer Familie von „pol"-Sequenzen entspricht, die dem endogenen humanen Retrovirus mit der Bezeichnung ERV-9 oder HSERV-9 stark ähneln, jedoch unterschiedlich davon sind.
Die erste Sequenzart, die die Mehrheit der Klone darstellt, besteht aus Sequenzen, deren Variabilität es ermög licht, vier Sub-Familien an Sequenzen zu definieren. Diese Sub-Familien sind hinreichend ähnlich miteinander, um sie als Quasi-Spezies betrachten zu können, welche vom gleichen Retrovirus abstammen, wie es für das HIV-1 Retrovirus bekannt ist (37), oder um das Ergebnis einer Interferenz mit mehreren endogenen Proviren sein zu können, welche in den produzierenden Zellen co-reguliert werden. Diese mehr oder weniger fehlerhaften endogenen Elemente sind gegenüber den gleichen regulatorischen Signalen sensitiv, welche möglicherweise durch ein replikatives Provirus hervorgerufen werden, da sie zu der gleichen Familie endogener Retroviren gehören (38). Diese neue Familie endogener Retroviren, oder, alternativ, diese neue retrovirale Spezies, von welcher die Generation der Quasi-Spezies in Kultur erhalten wurde, und welche eine Consensus-Sequenz der nachstehend beschriebenen Sequenzen enthält, wird als MSRV-1B bezeichnet.
In 1 sind die allgemeinen Consensus-Sequenzen der Sequenzen der unterschiedlichen MSRV-1B-Klone dargestellt, welche in diesem Versuch sequenziert wurden, wobei diese Sequenzen jeweils mit SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 bezeichnet wurden. Diese Sequenzen weisen mit Bezug auf die Nucleinsäuren eine Homologie im Bereich von 70% bis 88% bezüglich der HSERV9-Sequenz mit der Referenz X57147 und M37638 in der Genebank^®-Datenbank auf. Der phylogenetische Baum dieser Sequenzen ist in 2 dargestellt. In dieser Figur stellen die Sub-Familien A, B, C und D die Sequenzen dar, welche in nachfolgend wiederholten, ähnlichen Versuchen überwiegend erschienen, und zwar in den Proben reiner RNA von Virionen, die aus den MS7PG und POL-2-Isolaten gereinigt wurden. Ausgehend von diesen Sequenzfamilien wurden vier „Consensus"-Nucleinsäuresequenzen definiert, welche für unterschiedliche Quasi-Spezies eines möglichen exogenen Retrovirus MSRV-1B oder für unterschiedliche Sub-Familien eines endogenen Retrovirus MSRV-1B repräsentativ sind. Diese repräsentativen Consensus-Sequenzen sind in 3 gezeigt, mit der Translation in Aminosäuren. Für jede Sub-Familie dieser MSRV-1B-Sequenzen existiert ein funktioneller Leserahmen, und es ist ersichtlich, dass der funktionelle Leserahmen in jedem Beispiel der Aminosäuresequenz entspricht, welche auf der zweiten Linie unterhalb der Nucleinsäuresequenz aufgeführt ist. Die allgemeine Consensus-Sequenz der MSRV-1B-Sequenz, welche mit der SEQ ID Nr. 7 bezeichnet ist und durch diese PCR-Technik in der „pol"-Region erhalten wurde, ist in 1 dargestellt.
BEISPIEL 2: GEWINNUNG VON KLONEN MIT DEN BEZEICHNUNGEN MSRV-1B, DIE EINE MSRV-I-FAMILIE DEFINIEREN, DURCH „NESTED" PCR-AMPLIFIKATION DER KONSERVIERTEN POL-REGIONEN VON RETROVIREN, AUS PRÄPARATIONEN VON B-LYMPHOCYTEN EINES NEUEN MS-FALLS
Die gleiche PCR-Technik, modifiziert gemäß der Technik nach Shih (33), wurde verwendet, um das RNA-Nucleinsäurematerial zu amplifizieren und sequenzieren, welches in einer gereinigten Vitrionfraktion am Peak der „LM7-ähnlichen" reversen Transkriptaseaktivität auf einem Saccharose-Gradienten gemäß der Technik, wie von H. Perron (34) beschrieben, vorlag und gemäß den Protokollen, wie in Beispiel 1 erwähnt, und zwar ausgehend von einer spontanen lymphoblastoiden Linie, welche durch Immortalisierung von B-Lymphocyten eines MS-Patienten in Kultur erhalten wurde, der für das Epstein-Barr-Virus (EBV) seropositiv war, nachdem die lymphoiden Zellen in ein geeignetes Kulturmedium mit geeigneten Konzentrationen von Cyclosporin A in Kultur angesetzt wurden. Eine Darstellung der reversen Transkriptaseaktivität in den Saccharosefraktionen, die aus einem Reinigungsgradienten der von dieser Linie produzierten Virionen erhalten wurde, ist in 4 dargestellt. Auf ähnliche Weise wurden die Kulturüberstände einer B-Linie, die unter den gleichen Bedingungen aus einer Kontrolle erhalten wurde, die Multiple-Sklerose-frei war, unter den gleichen Bedingungen behandelt, und das Assay der reversen Transkriptaseaktivität in den Saccharose-Gradientenfraktionen erwies sich als durchgehend negativ (Hintergrund) und ist in der 5 dargestellt. Die Fraktion 3 des Gradienten, welcher der MS-B-Linie entspricht, und die gleiche Fraktion ohne reverse Transkriptaseaktivität des Nicht-MS-Kontrollgradienten wurden durch die gleiche RT-PCR-Technik wie zuvor analysiert, die von Shih (33) abgeleitet ist, gefolgt von den gleichen Klonierungs- und Sequenzierungsschritten, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Es ist insbesondere bemerkenswert, dass die MSRV-1-Sequenzart nur in dem Material gefunden werden konnte, welches mit einem Peak der „LM7-ähnlichen" reversen Transkriptaseaktivität assoziiert ist, welches von der MS-B-lymphoblastoiden Linie abstammt. Diese Sequenzen konnten nicht bei dem Material der Kontroll-B-Lymphoplastoiden-Linie (nicht MS) in 26 zufällig ausgewählten, rekombinanten Klonen gefunden werden. Nur kontaminierende Sequenzen vom Mo-MuLV-Typ, welche von der kommerziellen reversen Transkriptase herrühren, die für den cDNA-Syntheseschritt verwendet wurde, und Sequenzen ohne jegliche besondere retrovirale Analogie konnten in dieser Kontrolle gefunden werden, und zwar als Ergebnis der „Consensus"-Amplifizierung homologer Polymerasesequenzen, welche durch diese PCR-Technik produziert werden. Darüber hinaus ermöglicht es die Abwesenheit eines konzentrierten Ziels, welches in der Kontrollprobe um die Amplifikationsreaktion kompetitiert, die Amplifizierung von verdünnten Kontaminanten. Der Unterschied in den Ergebnissen wird als hoch signifikant festgelegt (chi-2, p < 0,001).
BEISPIEL 3: GEWINNUNG EINES KLONS PSJ17, EIN RETROVIRUS MSRV-1 DEFINIEREND, DURCH REAKTION ENDOGENER REVERSEN TRANSKRIPTASE MIT EINER VIRIONPRÄPARATION, DIE VON DER PLI-2-LINIE STAMMT
Dieser Ansatz ist darauf gerichtet, reverse transkribierte DNA-Sequenzen von der vermutlich retroviralen RNA in Isolat zu gewinnen, und zwar unter Verwendung der reversen Transkriptaseaktivität, die in dem gleichen Isolat vorliegt. Diese reverse Transkriptaseaktivität kann theoretisch nur in Gegenwart einer retroviralen RNA funktionieren, die mit einer Primer-tRNA verbunden ist oder mit kurzen DNA-Strängen hybridisiert ist, die bereits in den retroviralen Partikeln revers transkribiert wurde (39). Daher wurde die Gewinnung von spezifischen retroviralen Sequenzen in einem mit zellulären Nucleinsäuren kontaminierten Material gemäß diesen Autoren optimiert, und zwar mittels der spezifischen enzymatischen Amplifizierung der viralen RNA-Teile mit viraler reverser Transkriptaseaktivität. Bisher haben die Autoren die besonderen physiochemischen Bedingungen bestimmt, unter welchen diese enzymatische Aktivität der reversen Transkription auf RNAs, die in Virionen enthalten ist, in vitro effektiv sein könnte. Diese Bedingungen entsprechen der technischen Beschreibung der nachstehend aufgeführten Protokolle (endogene RT-Reaktion, Reinigung, Klonierung und Sequenzierung).
Der molekulare Ansatz bestand darin, eine Präparation konzentrierter, aber ungereinigter Virionen zu verwenden, welche von den Kulturüberständen der PLI-2-Linie gewonnen wurden, und welche gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt wurde: Die Kulturüberstände wurden zweimal wöchentlich gesammelt, bei 10.000 rpm für 30 Minuten vorzentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, und anschließend bei –80°C eingefroren oder so wie sie waren für die folgenden Schritte verwendet. Die frischen oder aufgetauten Überstände wurden auf einem 30%igen Glycerol-PBS-Kissen bei 100.000 g (oder 30.000 rpm in einem 45 T LKB-Hitachi-Rotor) für 2 Stunden bei 4°C zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstands wurde das sedimentierte Pellet in einem kleinen Volumen PBS aufgenommen und enthielt die Fraktion des konzentrierten, aber ungereinigten Virions. Diese konzentrierte, aber ungereinigte virale Probe wurde dazu verwendet, um eine sog. endogene reverse Transkriptionsreaktion durchzuführen, wie nachfolgend beschrieben wird: ein Volumen von 200 μl Virion, gereinigt gemäß dem oben beschriebenen Protokoll, mit einer reversen Transkriptaseaktivität von ungefähr 1 bis 5 Mio. dpm wird bei 37°C aufgetaut, bis eine flüssige Phase entsteht, und anschließend auf Eis platziert. Ein fünffach konzentrierter Puffer wurde mit den folgenden Komponenten hergestellt: 500 mM Tris-HCl, pH 8,2; 75 mM NaCl, 25 mM MgCl₂; 75 mM DTT und 0,10% NP40. 100 μl des 5 × -Puffer + 25 μl einer 100 mM-Lösung von dATP + 25 μl einer 100 mM-Lösung von dTTP + 25 μl einer 100 mM-Lösung an dGTP + 25 μl einer 100 mM-Lösung an cCTP + 100 μl an sterilem destilliertem Wasser + 200 μl der Virion-Suspension (RT-Aktivität von 5 Mio. DPM) wurden in PBS gemischt und bei 42°C für drei Stunden inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde die Reaktionsmischung direkt zu einer gepufferten Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkoholmischung hinzugefügt (Sigma-Refe renz P 3803); die wässrige Phase wurde gesammelt und ein Volumen an sterilem destillierten Wasser wurde zu der organischen Phase hinzugefügt, um das restliche Nucleinsäurematerial zu reextrahieren. Die gesammelten wässrigen Phasen wurden kombiniert und die darin enthaltenen Nucleinsäuren durch Hinzufügen von 3 M Natriumacetat pH 5,2 zu 1/10 Volumen + 2 Volumen an Ethanol + 1 μl Glycogen (Boehringer-Mannheim-Referenznummer 901 393) gefällt und die Probe bei –20°C für 4 Stunden oder über Nacht bei 4°C aufbewahrt. Das nach Zentrifugation erhaltene Präzipitat wurde dann mit 70%igem Ethanol gewaschen und in 60 ml destilliertem Wasser resuspendiert. Die Reaktionsprodukte wurden dann gereinigt, kloniert und sequenziert gemäß dem Protokoll, welches nachfolgend beschrieben wird: DNA mit glatten Enden mit ungepaarten Adeninen an den Enden wurden folgendermaßen hergestellt: eine „Auffüll"-Reaktion wurde zunächst durchgeführt: 25 μl der zuvor gereinigten DNA-Lösung wurden mit 2 μl einer 2,5 mM-Lösung gemischt, welche in äquimolaren Mengen dATP + dGTP + dTTP + dCTP/1 μl T4 DNA-Polymerase (Boehringer-Mannheim-Referenznummer 1004 786)/5 μl 10 × „Inkubationspuffer für Restriktionsenzyme (Boehringer-Mannheim-Referenznummer 1417 975)/1 μl einer 1%igen BSA(bovine serum albumin)-Lösung/16 μl steriles destilliertes Wasser enthielt. Diese Mischung wurde für 20 Minuten bei 11°C inkubiert. 50 μl TE-Puffer und 1 μl Glycogen (Boehringer-Mannheim-Referenznummer 901 393) wurden anschließend hinzugefügt, bevor die Nucleinsäuren mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Sigma-Referenznummer P 3803) und die Fällung mit Natriumcitrat, wie oben beschrieben, durchgeführt wurde. Die nach Zentrifugation präzipitierte DNA wird in 10 μl 10 mM Trispuffer pH 7,5 resuspendiert. Anschließend wurden 5 μl dieser Suspension mit 20 μl 5 × Taq-Puffer, 20 μl 5 mM dATP, 1 μl (5 U) Taq-DNA-Polymerase (Amplitaq^TM) und 54 μl ste rilem destilliertem Wasser gemischt. Diese Mischung wurde für 2 Stunden bei 75°C mit einem Ölfilm auf der Oberfläche der Lösung inkubiert. Die in der wässrigen Lösung suspendierte DNA, die unterhalb des Ölfilms nach der Inkubation abgenommen wurde, wird wie oben beschrieben gefällt und in 2 μl sterilem destilliertem Wasser resuspendiert. Die erhaltene DNA wurde unter Verwendung des TA Cloning Kit^TM in ein Plasmid eingefügt. 2 μl der DNA-Lösung wurden mit 5 μl sterilem destilliertem Wasser, 1 μl eines 10fach konzentrierten Ligationspuffers „10 × Ligationspuffer", 2 μl des „pCR^TM-Vektor" (25 ng/ml) und 1 μl „TA DNA Ligase" gemischt. Diese Mischung wurde über Nacht bei 12°C inkubiert. Die folgenden Schritte wurden gemäß den Anleitungen des TA Cloning^® Kits (British Biotechnology) durchgeführt. Am Ende des Verfahrens wurden die weißen Kolonien der rekombinanten (white) Bakterien „gepickt", um sie anschließend zu kultivieren und um die eingebauten Plasmide gemäß dem sog. „Miniprep"-Verfahren extrahieren zu können (36). Die Plasmidpräparation jeder rekombinanten Kolonie wurde mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten und auf einem Agarosegel analysiert. Plasmide mit Insert, welche unter UV-Licht nach Färbung des Gels mit Ethidiumbromid detektiert wurden, wurden zur Sequenzierung des Inserts selektiert, nach Hybridisierung mit einem zu dem Sp6-Promoter komplementären Primer, welcher auf dem Klonierungsplasmid des TA Cloning Kits^® vorliegt. Die Reaktion vor der Sequenzierung wurde dann gemäß dem Verfahren durchgeführt, welches für die Verwendung des Sequenzierungs-Kits „Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, Referenznummer 401384) empfohlen wird, und eine automatische Sequenzierung wurde mit einem Applied Biosystems „Model 373A automatic sequencer"-Gerät gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt.
Eine differenzierende Analyse der ausgehend von den DNA-Fragmenten klonierten Sequenzen, welche in der Reaktionsmischung vorlagen, mit Computer-Datenbanken ermöglichte die Aufdeckung einer Sequenz vom retroviralen Typ. Der entsprechende Klon PSJ17 wurde vollständig sequenziert und die erhaltene Sequenz, die in 6 dargestellt und mit der Sequenz ID Nr. 9 benannt ist, wurde unter Verwendung der Geneworks^®-Software mit den neuesten Genebank^®-Datenbanken analysiert. Es konnte keine identische, bereits beschriebene Sequenz durch die Analyse der Datenbanken gefunden werden. Lediglich eine teilweise Homologie mit einigen bekannten retroviralen Elementen wurde gefunden. Die interessanteste relative Homologie betrifft einen endogenen Retrovirus mit der Bezeichnung ERV-9 oder HSERV-9, je nach Referenz (40).
BEISPIEL 4: PCR-AMPLIFIZIERUNG DER NUCLEINSÄURESEQUENZ, ENTHALTEN ZWISCHEN DER 5'-REGION, DEFINIERT DURCH DEN KLON „POL MFRV-1B", UND DER 3'-REGION, DEFINIERT DURCH DEN KLON PSJ17
Fünf Oligonucleotide, M001, M002-A, M003-BCD, P004 und P005, wurden definiert, um die RNA, welche von gereinigten POL-2-Virionen stammt, zu amplifizieren. Kontrollreaktionen wurden ausgeführt, um das Vorliegen von Kontaminanten zu kontrollieren (Reaktion mit Wasser). Die Amplifizierung besteht aus einem RT-PCR-Schritt gemäß dem Protokoll, wie in Beispiel 1 beschrieben, gefolgt von einer „nested" PCR gemäß dem PCR-Protokoll, das in der Druckschrift EP-A-0569272 beschrieben ist. Im ersten RT-PCR-Zyklus wurden die Primer M001 und P004 oder P005 verwendet. Im zweiten PCR-Zyklus wurden die Primer M002-A oder M003-BCD und der Primer P004 verwendet. Die Primer werden wie folgt positioniert:
Deren Zusammensetzung ist folgendermaßen:
Das erhaltene „nested" Amplifizierungsprodukt, das als M003-P004 bezeichnet wurde, ist in 7 dargestellt und entspricht der Sequenz mit der SEQ ID Nr. 8.
BEISPIEL 5: AMPLIFIZIERUNG UND KLONIERUNG EINES TEILS DES RETROVIRALEN GENOMS VON MSRV-1 UNTER VERWENDUNG EINER BEREITS IDENTIFIZIERTEN SEQUENZ IN EINER PROBE MIT GEREINIGTEM VIRUS AM PEAK DER REVERSEN TRANSKRIPTASEAKTIVITÄT
Es wurde eine PCR-Technik verwendet, die von der Technik abgeleitet ist, die von Frohman (41) veröffentlicht wurde. Die abgeleitete Technik ermöglicht es, unter Verwendung eines spezifischen Primers am 3'-Ende des zu amplifizierenden Genoms die Sequenz in Richtung der 5'-Region des zu analysierenden Genoms zu verlängern. Diese Technikvariante ist in der Unterlagen der Firma „Clontech Laboratories Inc., (Palo-Alto, Kalifornien, USA) beschrieben und mit deren Produkt „5'-AmpliFINDER^TM RACE Kit" ergänzt, das bei der Virion-Fraktion verwendet wurde, die wie oben beschrieben gereinigt wurde. Die spezifischen 3'-Primer, die in dem Protokoll des Kits für die Synthese der cDNA und für die PCR-Amplifizierung verwendet wurden, sind jeweils zu den folgenden MSRV-1-Sequenzen komplementär:
Die aus der PCR erhaltenen Produkte wurden nach Reinigung auf einem Agarosegel mit herkömmlichen Verfahren (36) gereinigt und anschließend in 10 ml destilliertem Wasser resuspendiert. Da eine der Eigenschaften der Taq-Polymerase darin besteht, dass am 3'-Ende jeder der beiden DNA-Stränge ein Adenin hinzugefügt wird, wurde die erhaltene DNA unter Verwendung des TA Cloning Kits^TM (British Biotechnology) direkt in ein Plasmid eingebaut. Die 2 μl einer DNA-Lösung wurden mit 5 μl sterilem destilliertem Wasser, 1 μl einem 10fach konzentrierten Ligationspuffer „10 × -Ligationspuffer", 2 μl des „pCR^TM-Vektor" (25 ng/ml) und 1 μl der „TA DNA-Ligase" gemischt. Diese Mischung wurde über Nacht bei 12°C inkubiert. Die folgenden Schritte wurden gemäß den Anleitungen des TA Cloning^® Kit (Britisch Biotechnology) durchgeführt. Am Ende des Verfahrens wurden die weißen Kolonien der rekombinanten (white) Bakterien „gepickt", um sie anschließend zu kultivieren und um die eingebauten Plasmide gemäß dem sog. „Miniprep"-Verfahren extrahieren zu können (36). Die Plasmidpräparation jeder rekombinanten Kolonie wurde mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten und auf einem Agarosegel analysiert. Plasmide mit dem Insert, die unter UV-Licht nach Färbung des Gels mit Ethidiumbromid detektiert wurden, wurden für die Sequenzierung des Inserts ausgewählt, nach Hybridisierung mit einem zu den Sp6-Promoter komplementären Primer, der im Klonierungsplasmid des TA Cloning^® Kits vorliegt. Die Reaktion vor der Sequenzierung wurde dann gemäß dem Verfahren durchgeführt, welches für die Verwendung des Sequenzierungskits „Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, Referenznummer 401384) empfohlen wird, und die automatische Sequenzierung wurde mit einem Gerät von Applied Biosystems („Model 373A automatic sequencer") nach den Anleitungen des Herstellers durchgeführt.
Diese Technik wurde zunächst auf zwei Virion-Fraktionen angewandt, die wie nachstehend auf Saccharose auf dem „POL-2"-Isolat, generiert durch die PLI-2-Linie einerseits, gereinigt wurde und auf dem MS7PG-Isolat, generiert von der LM7PC-Linie andererseits: Die Kulturüberstände wurden zweimal wöchentlich gesammelt, bei 10.000 rpm für 30 Minuten vorzentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, und anschließend bei –80°C eingefroren oder so wie sie waren für die folgenden Schritte verwendet. Die frischen oder aufgetauten Überstände wurden auf einem Kissen mit 30% Glycerol-PBS bei 100.000 g (oder 30.000 rpm in einem 45T LKB-Hitachi-Rotor) für 2 Stunden bei 4°C zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstandes wurde das sedimentierte Pellet in einem kleinen Volumen PBS aufgenommen, es enthält die Fraktionen der konzentrierten, jedoch ungereinigten Virionen. Das konzentrierte Virus wird dann auf einen Sucrose-Gradienten im sterilen PBS-Puffer (15 bis 50% Gewicht/Gewicht) aufgetragen und bei 35.000 rpm (100.000 g) für 12 Stunden bei 4°C in einer Ultrazentrifuge mit einem Ausschwingrotor zentrifugiert. Es wurden zehn Fraktionen gesammelt und nach Homogenisierung wurden 20 μl von jeder Fraktion entnommen, um die darin vorliegende reverse Transkriptaseaktivität mit der Technik, wie von H. Perron (24) beschrieben, zu analysieren. Die Fraktionen, welche den Peak der „LM7-ähnlichen" RT-Aktivität enthalten, wurden dann in sterilem PBS-Puffer verdünnt und für 1 Stunde bei 35.000 rpm (100.000 g) in einer Ultrazentrifuge zentrifugiert, um virale Partikel zu sedimentieren. Das Pellet der dadurch erhaltenen gereinigten Virionen wurde in einem kleinen Puffervolumen aufgenommen, welches für die RNA-Extraktion geeignet ist. Die oben erwähnte cDNA-Synthesereaktion wird mit dieser RNA durchgeführt, die aus dem gereinigten extrazellulären Virion extrahiert wurde. Die PCR-Amplifizierung gemäß der oben erwähnten Technik ermöglicht die Gewinnung eines Klons F1-11, dessen Sequenz, mit SEQ ID Nr. 2 bezeichnet, in 8 dargestellt ist.
Durch diesen Klon ist es möglich, mit den zuvor sequenzierten unterschiedlichen Klonen eine Region zu definieren, die bezüglich des „POL"-Gens des MSRV-1-Retrovirus repräsentativ ist, wie in 9 dargestellt. Diese Sequenz, mit der SEQ ID Nr. 1 bezeichnet, ist aus unterschiedlichen Klonen, die sich an ihren Enden überlappen, rekonstituiert, wobei die mit den Primern und mit den Amplifizierungs- oder Klonierungstechniken assoziierten Artefakte, die den Leserahmen des Gesamten künstlich unterbrechen würden, korrigiert werden.
In 9 ist der mögliche Leserahmen mit dessen Translation in Aminosäuren unterhalb der Nucleinsäuresequenz gezeigt.
BEISPIEL 8: DETEKTION SPEZIFISCHER MSRV-1-SEQUENZEN IN UNTERSCHIEDLICHEN PLASMAPROBEN, VON MS-PATIENTEN ODER VON KONTROLLEN STAMMEND
Für die Detektion des MSRV-1-Genoms in Plasmaproben, die nach Entnahme von Blutproben von MS-Patienten und von Kontroll-nicht-MS-Patienten aus EDTA erhalten wurden, wurde eine PCR-Technik eingesetzt, die ähnlich ist zu derjenigen, die in Beispiel 7 beschrieben ist.
Die Extraktion der RNAs aus dem Plasma wurde gemäß einer Technik durchgeführt, wie sie von P. Chomzynski (35) beschrieben wurde, nachdem ein Volumen Guanidiniumthiocyanat enthaltender Puffer zu 1 ml Plasma hinzugefügt wurde, das bei –80°C nach der Gewinnung eingefroren gelagert wurde.
Bezüglich MSRV-1 wurde die Amplifizierung in zwei Schritten durchgeführt. Darüber hinaus wurde die Nucleinsäureprobe zuvor mit DNase behandelt und eine Kontroll-PCR ohne RT (AMV reverse Transkriptase) wurde auf die zwei Amplifizierungsschritte durchgeführt, um sicherzustellen, dass die RT-PCR-Amplifizierungsprodukte ausschließlich von der MSRV-1-RNA herrühren. Im Falle einer positiven Kontrolle ohne RT wurde die ursprünglichen Aliquot-Probe der RNA nochmals mit DNase behandelt und wieder amplifiziert.
Das Protokoll zur Behandlung mit DNase ohne RNase Aktivität lautet wie folgt: die extrahierte RNA wird in Gegenwart des „RNAse-Inhibitors" (Boehringer-Mannheim) in DEPC behandeltes Wasser aufgeteilt mit einer Endkonzentration von 1 μg in 10 μl; zu diesen 10 μl wurden 1 μl „RNAse-freie DNAse" (Boehringer-Mannheim) und 1,2 μl eines Puffers hinzugefügt, welcher 0,1 M Natriumacetat und 5 mM MgSO₄ enthielt; die Mischung wurde dann 15 Minuten lang bei 20°C inkubiert und in einem „Thermocycler" für 1,5 Minuten auf 95°C gebracht.
Der erste MSRV-1-RT-PCR-Schritt wird gemäß einer Variante des RNA-Amplifizierungs-Verfahrens durchgeführt, wie es in der Patentanmeldung mit der Nummer EP 0 569 272 A1 beschrieben ist. Insbesondere wird der cDNA-Syntheseschritt bei 42°C für eine Stunde durchgeführt; die PCR-Amplifizierung findet über 40 Zyklen statt, mit einer Primer-Hybridisierungs(„annealing")-Temperatur von 53°C. Das Reaktionsvolumen beträgt 100 μl.
Die für den ersten Schritt verwendeten Primer lauten wie folgt:
5'-Primer, bezeichnet durch die SEQ ID Nr. 16:
3'-Primer, bezeichnet durch die SEQ ID Nr. 17:
Nach diesem Schritt wurden 10 μl des Amplifizierungsprodukts entnommen und für eine zweite, sog. „nested" PCR-Amplifizierung eingesetzt, mit Primern, die innerhalb der bereits amplifizierten Region liegen. Dieser zweite Schritt wurde mit 35 Zyklen durchgeführt, mit einer Primer-Hybridisierungs temperatur („annealing") von 53°C. Das Reaktionsvolumen beträgt 100 μl.
Die für den zweiten Schritt verwendeten Primer lauten wie folgt
5'-Primer, bezeichnet durch die SEQ ID Nr. 18:
3'-Primer, bezeichnet durch die SEQ ID Nr. 19:
In 10 sind die Ergebnisse der PCR in Form von Fotos gezeigt, welche unter ultraviolettem Licht eines mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegels aufgenommen wurden, in welchem eine Elektrophorese der PCR-Amplifizierungsprodukte durchgeführt wurde, die jeweils getrennt auf die unterschiedlichen Spuren aufgetragen wurden.
Spur Nr. 8 enthält eine Mischung aus DNA-Molekulargewichtsmarker und die Spuren 1 bis 7 stellen – der Reihe nach – die Produkte dar, welche aus der Gesamt-RNA der Plasmaproben amplifiziert wurden, welche von vier gesunden Kontrollen ohne MS stammen (Spuren 1 bis 4) und von drei Patienten mit MS in unterschiedlichen Phasen der Krankheit (Spuren 5 bis 7).
11 zeigt das spezifische Amplifikationsergebnis mit MSRV-1 „nested" RT-PCR:
Spur Nr. 1 enthält das PCR-Produkt, das mit Wasser alleine produziert wurde, ohne Hinzufügung von reverser AMV-Transkriptase; Spur Nr. 2 enthält das PCR-Produkt, welches mit Wasser alleine produziert wurde, unter Hinzufügung der reversen AMV-Transkriptase; Spur Nr. 3 enthält eine Mischung eines DNA-Molekulargewichtsmarkers; Spuren Nr. 4 bis 13 enthalten – der Reihe nach – die Produkte, welche aus den Gesamt-RNAs amplifiziert wurden, welche aus den Saccharose-Gradientenfraktionen extrahiert wurden (gesammelt in einer nach unten gerichteten Richtung), wobei auf den Gradienten ein Pellet des Virions bis zum Gleichgewicht zentrifugiert wurde, welches aus einem Überstand einer Kultur stammt, welche mit MSRV-1 infiziert wurde, und zwar nach dem von Perron beschriebenen Protokoll (34); in Spur 14 wurde nichts aufgetragen; in die Spuren 15 bis 17 wurden die Amplifikationsprodukte der RNA aufgetragen, welche von Plasmaproben extrahiert wurde, die von drei unterschiedlichen Patienten mit MS in unterschiedlichen Phasen der Krankheit stammten.
Das retrovirale MSRV-1-Genom konnte tatsächlich in der Saccharose-Gradientenfraktion mit dem Peak der reversen Transkriptaseaktivität gefunden werden, welche gemäß der von H. Perron (24) beschriebenen Technik gemessen wurde, mit einer sehr starken Intensität (Fraktion 5 des Gradienten, aufgetragen in Spur Nr. 8). Eine leichte Amplifizierung hat in der ersten Fraktion stattgefunden (Spur Nr. 4), welche wahrscheinlich der RNA entspricht, die durch lysierte Partikel freigesetzt wurde, welche auf der Oberfläche des Gradienten schwimmen; Ähnliches gilt für aggregierte Zelltrümmer, welche in der letzten Fraktion sedimentierten (Röhrchenboden), in welcher sich einige wenige Kopien des MSRV-1-Genoms befanden, welche eine Amplifizierung geringer Intensität verursachten.
Von den in dieser Reihe getesteten drei MS-Plasmaproben zeigte ein Fall MSRV-1-RNA, mit der Produktion einer sehr starken Amplifizierung (Spur Nr. 17).
In dieser Reihe wurde das retrovirale MSRV-1-RNA-Genom, das vermutlich den Partikeln extrazellulärer Viren entspricht, die in extrem kleinen Zahlen im Plasma vorliegen, in einem von drei getesteten MS-Fällen durch „nested" RT-PCR detektiert. Andere erhaltene Ergebnisse mit ausführlicheren Reihen bestätigen diese Ergebnisse.
Darüber hinaus kann die Spezifität der durch diese PCR-Techniken amplifizierten Sequenzen durch die „ELOSA"-Technik verifiziert und evaluiert werden, wie von F. Mallet (42) und wie in der Druckschrift FR-2 663 040 beschrieben ist.
Bezüglich MSRV-1 können die Produkte der oben beschriebenen „nested" PCR in zwei ELOSA-Systemen getested werden, wodurch eine Consensus-Sequenz A und eine Consensus-Sequenz B + C + D von MSRV-1 jeweils getrennt detektiert werden können, welche den im Beispiel 1 und in den 1, 2 und 3 beschriebenen Sub-Familien entsprechen. Als Ergebnis können die Sequenzen, die den Consensus-Sequenzen B + C + D sehr stark ähneln, im Wesentlichen in den RNA-Proben gefunden werden, die von MSRV-1-Virionen stammen, welche aus Kulturen gereinigt oder in extrazellulären biologischen Fluiden von MS-Patienten amplifiziert wurden, wohingegen die Sequenzen, die der Consensus-Sequenz A stark ähneln im Wesentlichen in normaler, humaner, zellulärer DNA gefunden werden.
Das ELOSA/MSRV-1-System zum Auffinden und zur spezifischen Hybridisierung der PCR-Produkte der Sub-Familie A setzt ein Fängeroligonucleotid cpV1A mit einer Aminbindung am 5'-Ende ein und ein biotinyliertes Detektionsoligonucleotid dpV1A, welche jeweils die folgende Sequenz besitzen:

– cpV1A, bezeichnet mit der SEQ ID Nr. 31: 5' GATCTAGGCCACTTCTCAGGTCCAGS 3', welche dem ELOSA-Fängeroligonucleotid für die Produkte der MSRV-1 „nested" PCR entspricht, welche mit den Primern durchgeführt wurde, die mit der SEQ ID Nr. 16 und der SEQ ID Nr. 17 bezeichnet werden, ggf. gefolgt von einer Amplifizierung mit den Primern, die mit der SEQ ID Nr. 18 und der SEQ ID Nr. 19 bezeichnet werden, auf Patientenproben.
– dpV1A, bezeichnet mit der SEQ ID Nr. 32: 5' CATCTITTTGGICAGGCAITAGC 3'; welches dem ELOSA-Fängeroligonucleotid der Sub-Familie A der Produkte der MSRV-1 nested PCR entspricht, die mit den Primern durchgeführt wurde, die durch die SEQ ID Nr. 16 und SEQ ID Nr. 17 bezeichnet werden, ggf. gefolgt durch eine Amplifizierung mit den Primern, die durch die SEQ ID Nr. 18 und SEQ ID Nr. 19 bezeichnet werden, auf Patientenproben.

Das ELOSA/MSRV-1-System für das Einfangen und die spezifische Hybridisierung der PCR-Produkte der Sub-Familie B + C + D verwendet das gleiche biotinylierte Detektionsoligonucleotid dpV1A und ein Fängeroligonucleotid cpV1B, mit einer Aminbindung am 5'-Ende und mit der folgenden Sequenz:

– dpV1B, bezeichnet mit der SEQ ID Nr. 33: 5' CTTGRGCCAGTTCTCATACCTGGA 3', welches dem ELOSA-Fängeroligonucleotid für die Sub-Familie B + C + D der Produkte der MSRV-1 nested PCR entspricht, welche mit den Primern durchgeführt wurde, die mit der SEQ ID Nr. 16 und der SEQ ID Nr. 17 bezeichnet werden, ggf. gefolgt durch eine Amplifizierung mit den Primern, die durch die SEQ ID Nr. 18 und die SEQ ID Nr. 19 bezeichnet werden, auf Patientenproben.

Dieses ELOSA-Detektionssystem ermöglichte es zu verifizieren, dass keines der PCR-Produkte, welche auf diese Weise von DNase-behandelten Plasmaproben von MS-Patienten amplifiziert wurden, eine Sequenz der Sub-Familie A enthielten, und dass bezüglich der Consensus-Sequenz der Sub-Familien B, C und D alle positiv waren.
Schließlich zeigen unsere ersten Ergebnisse der PCR-Detektion des Genoms von pathogenen und/oder infektiösen Agenzien, dass es möglich ist, dass ein freier „Virus" im Blutstrom vom Patienten in einer akuten, virulenten Phase außerhalb des Nervensystems zirkulieren kann. Dies ist vergleichbar mit dem quasi-systematischen Vorliegen von „Lücken" in der Blut-Hirn-Schranke von Patienten in einer aktiven Phase von MS.
Es ist daher denkbar, als ein Ergebnis der gemachten Entdeckungen und der durch die Erfinder entwickelten Verfahren, eine Diagnose einer MSRV-1-Infektion und/oder -Reaktivierung durchzuführen und eine Therapie für MS zu bestimmen, und zwar auf der Basis dessen Effizienz, die Detektion dieser Agenzien in den biologischen Fluiden von Patienten zu „negativieren". Darüber hinaus könnte bei Patienten, die noch keine neurologischen Anzeichen von MS zeigen, eine frühe Detektion es ermögli chen, eine Behandlung zu initiieren, die mit Bezug auf den nachfolgenden klinischen Verlauf um so effektiver wäre, auf Grund der Tatsache, dass sie der Läsionsphase vorangeht, welche dem Ausbruch neurologischer Krankheiten entspricht. Zum Gegenwärtigen Zeitpunkt kann eine MS-Diagnose nicht festgestellt werden, bevor eine Symptomatologie der neurologischen Läsionen eingesetzt hat, weshalb vor dem Entstehen eines klinischen Bildes keine Behandlung eingesetzt werden kann, welches Läsionen des zentralen Nervensystems nahelegt, die bereits signifikant sind. Die Diagnose einer MSRV-1-Infektion und/oder -Reaktivierung im Menschen ist daher von äußerster Wichtigkeit und die vorliegende Erfindung stellt die Mittel hierfür bereit.
Es ist daher möglich, abgesehen vom Durchführen einer Diagnose einer MSRV-1-Infektion und/oder -Reaktivierung eine Therapie für MS zu bestimmen, und zwar auf der Basis dessen Effizienz, die Detektion dieser Agenzien in den biologischen Fluiden der Patienten zu „negativieren".
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(42) F. Mallet et al., Journal of Clinical Microbiology 1993; 31, 1444–1449

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nucleotidfragment, dessen Nucleotidsequenz eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus den Sequenzen SEQ ID Nr.: 1 bis SEQ ID Nr.: 9 sowie aus deren komplementären Sequenzen.
Verwendung eines Polynucleotidfragments mit der SEQ ID Nr.: 1 bis SEQ ID Nr.: 9 und deren komplementären Sequenzen zur Herstellung einer Sonde oder eines Primers zur Detektion von viralem Material, das im Zusammenhang mit der Multiplen Sklerose steht.
Sonde, die dazu geeignet ist, mit einer RNA oder einer DNA eines viralen Materials, das im Zusammenhang mit Multipler Sklerose steht, spezifisch zu hybridisieren, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nucleotidsequenz aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID Nr.: 3, SEQ ID Nr.: 4, SEQ ID Nr.: 5, SEQ ID Nr.: 6, SEQ ID Nr.: 7, SEQ ID Nr.: 16, SEQ ID Nr.: 17, SEQ ID Nr.: 18, SEQ ID Nr.: 19, SEQ ID Nr.: 20, SEQ ID Nr.: 21, SEQ ID Nr.: 22, SEQ ID Nr.: 23, SEQ ID Nr.: 24, SEQ ID Nr.: 25, SEQ ID Nr.: 26, SEQ ID Nr.: 31, SEQ ID Nr.: 32, SEQ ID Nr.: 33 sowie aus deren komplementären Sequenzen.
Primer zur Amplifizierung einer RNA oder einer DNA eines viralen Materials, welches mit der Multiplen Sklerose in Zusammenhang steht, dadurch gekennzeichnet, dass der Primer eine Nucleotidsequenz aufweist, die ausgewählt ist aus den Sequenzen mit der SEQ ID Nr.: 16, SEQ ID Nr.: 17, SEQ ID Nr.: 18, SEQ ID Nr.: 19, SEQ ID Nr.: 20, SEQ ID Nr.: 21, SEQ ID Nr.: 22, SEQ ID Nr.: 23, SEQ ID Nr.: 24, SEQ ID Nr.: 25, SEQ ID Nr.: 26, SEQ ID Nr.: 31, SEQ ID Nr.: 32, SEQ ID Nr.: 33, sowie aus deren komplementären Sequenzen.
Diagnostische, prophylaktische oder therapeutische Zusammensetzung zur Detektion, Prävention oder zur Behandlung eines viralen Agens, das im Zusammenhang mit der Multiplen Sklerose steht, dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest ein Nucleotidfragment aufweist, dessen Nucleotidsequenz aus einer Sequenz besteht, die ausgewählt ist aus den Sequenzen SEQ ID Nr.: 1 bis SEQ ID Nr.: 9 und deren komplementären Sequenzen, oder welche aus einer Nucleotidsequenz besteht, die für jede Folge von 100 zusammenhängenden Monomeren eine zumindest 50%ige, vorzugsweise eine zumindest 70%ige Identität mit einer Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus den SEQ ID Nr.: 1 bis SEQ ID Nr.: Nr. 9 und deren komplementären Sequenzen.
Verfahren zum Detektieren und/oder Identifizieren eines mit der Multiplen Sklerose in Zusammenhang stehenden viralen Agens in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man zumindest eine Nucleinsäure dieser Probe oder deren komplementäre Sequenz mit einer Zusammensetzung in Kontakt bringt, wie sie in Anspruch 5 definiert ist.
Verfahren zum Detektieren und/oder Identifizieren und/oder Trennen und/oder Quantifizieren eines mit der Multiplen Sklerose in Zusammenhang stehenden viralen Agens in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man zumindest eine Nucleinsäure dieser Probe oder deren komplementären Sequenz mit zumindest einer Sonde in Kontakt bringt, wie sie gemäß Anspruch 3 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man vor dem Inkontaktbringen der Nucleinsäure mit zumindest einer Sonde die Nucleinsäure oder deren komplementäre Sequenz mit zumindest einem Primer amplifiziert, wie er gemäß Anspruch 4 definiert ist.
Diagnostische, prophylaktische oder therapeutische Zusammensetzung zur Detektion, Prävention oder Behandlung eines viralen Agens, das mit der Multiplen Sklerose im Zusammenhang steht, dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest ein Polypeptid mit zumindest zehn Aminosäuren aufweist, welches durch ein Nucleotidfragment kodiert ist, dessen Nucleotidsequenz aus einer Nucleotidsequenz besteht, die ausgewählt ist aus den Nucleotidsequenzen SEQ ID Nr.: 1 bis SEQ ID Nr.: 9.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest ein Polypeptid aufweist, welches durch ein Nucleotidfragment kodiert ist, dessen Nucleotidsequenz aus einer Nucleotidsequenz besteht, die ausgewählt ist aus einer der Nucleotidsequenzen mit der SEQ ID Nr.: 1 bis SEQ ID Nr.: 9.
Verfahren zum Detektieren und/oder Identifizieren eines mit der Multiplen Sklerose in Zusammenhang stehenden viralen Agens in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man die biologische Probe mit einer Zusammensetzung in Kontakt bringt, wie sie gemäß Anspruch 9 oder Anspruch 10 definiert ist.