DE3784939T2 - Molekulare klonierung und human b lymphotropischer virus klon (hblv). - Google Patents
Molekulare klonierung und human b lymphotropischer virus klon (hblv).Info
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Description
- Ein neuer DNA-Virus, bezeichnet als Human-B-lymphotropischer Virus (HBLV), wurde aus den Blutleukozyten von Patienten mit lymphoproliferativen Leiden isoliert. Obwohl dieser Virus morphologisch zur Herpesfamilie der Viren gehört, HBLV, wie im folgenden gezeigt, wurde dieser Virus zuvor nicht charakterisiert. HBLV ist mit einigen Malignitäten bei Aids- und Nicht- Aids-Patienten verbunden, jedoch ist er deutlich andersartig als Human-T-Zellen lymphotroper Virus Typ III (HTLV-III), das Aids verursachende Agens. HBLV enthält ein großes doppelsträngiges DNA-Genom und infiziert selektiv B-Zellen; HTLV-III enthält andererseits ein einsträngiges RNA-Genom und infiziert selektiv T-Zellen und ist hierfür zytolytisch.
- Das Nucleocapsid des HBLV-Virus ist von isohedrischer Symmetrie mit 162 Capsomeren und ist mit einer Lipidmembran umhüllt. Die äußere Oberfläche der Virusumhüllung ist mit kurzen Spikes bedeckt. Der Durchmesser des umhüllten Virion beträgt annähernd 180 nm; das Nucleocapsid hat annähernd 100 nm Durchmesser. Der Raum zwischen Capsid und Umhüllung, 35-40 nm, ist mit amorphem Material gefüllt. Der Nucleoproteinkern oder das Nucleotid hat annähernd 65 nm Durchmesser und ist gelegentlich stabförmig oder asymmetrisch.
- Infektion von Primärzellen oder von Nabelschnurblutzellen erzeugt charakteristisch große Zellen 4-10 Tage nach Infektion. Diese Zellen haben den 2-4-fachen Durchmesser von kleinen Leukozyten und zeigen zytopathogene und zytolytische Veränderungen nach etwa einer Woche in Kultur. Der Nuclei dieser Zellen ist oft stark zusammengerollt, enthaltend hauptsächlich euchromatisches Chromatin und Nucleoli ohne bemerkenswerte Merkmale. Große Zahlen von Virionen werden von den meisten infizierten Zellen freigesetzt.
- Die vorliegende Erfindung ist die Herstellung eines molekularen Klons von Human-B-lymphrotopischem Virus (HBLV) und die Verwendung dieses Klons in diagnostischen Verfahren.
- Ein neuer Human-B-lymphotropischer Virus (HBLV) wurde aus den periphären Blutleukozyten von sechs Individuen isoliert: drei Human-T-Zellen-Leukämievirustyp III (HTLV-III) seropositiven Patienten mit Acguired Immune Deficiency Syndrome (AIDS)verwandtem Lymphom, zwei HTLV-III seropositiven Patienten mit angio-immunoblastischer Lymphadenopathie und einem Patienten mit akuter lymphoblastischer Leukämie. Alle sechs Isolate sind durch antigene und molekulare Analyse eng miteinander verwandt, und Seren von allen sechs virus-positiven Patienten reagieren immkunologisch mit jedem Virusisolat. Im Gegensatz dazu waren nur vier Seren aus mehr als 200 statistisch ausgewählten Spendern seropositiv. HBLV enthält eine großes doppelsträngiges DNA-Genom und ist morphologisch einigen Mitgliedern der Herpes- Virus-Gruppe ähnlich. HBLV infiziert selektiv frisch isolierte Human-B-Zellen, wo es das Auftreten von charakteristisch großen refraktilen mononucleierten oder binucleierten Zellen, die nucleare und cytoplasmische Einschlußkörper enthalten, induziert. Jedoch ist HBLV von allen bekannten menschlichen Herpesviren und Herpesviren von subhumanen Primaten durch den Wirtsbereich, den biologischen Effekt auf infizierte Zellen und durch das Fehlen von antigener oder genomer Verwandschaft unterscheidbar.
- In einer der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wird der molekulare Klon pZVH14 bei dem Nachweis von früher Virusinfektion von Nabelschnurblutlymphozyten und Milzzellen durch in situ Hybridisierung in Kultur angewandt.
- Es wird angenommen, daß die vorliegende Erfindung in der Lage ist, Gene in Zielzellen des Virus als rekombinante DNA- Virusvektorsysteme einzuführen.
- Die Ultrastrukturcharakteristika des HBLV-Virus wie auch seine Morphogenese ordnen den Virus in die Familie der Herpesviren ein - mit Ähnlichkeiten mit und Unterschieden zu irgendwelchen bekannten Gliedern der Familie. Immun-elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen, daß Patienten, aus denen der Virus isoliert wurde, hochspezifische Antikörper gegenüber sowohl der Virushülle als auch den internen Komponenten des Virus erzeugen. Immunologische, molekulare, biologische Studien und Wirtsbereichsstudien zeigen an, daß der HBLV-Virus zuvor nicht beschrieben wurde.
- Kulturen von mononuclearen Zellen aus infizierten Blutproben entwickeln signifikante Zahlen von charakteristischen großen Zellen 4-10 Tage nach Kultur mit primären Zellen oder Nabelschnurblutzellen. Die elektronenmikroskopische Analyse zeigt, daß HBLV-Virusteilchen in großen Zellen vorliegen, jedoch in kleinen Lymphozyten fehlen. Die infizierten Zellen haben den 2-4-fachen Durchmesser von kleinen Lymphozyten und zeigen überhaupt keine anfänglichen, sichtbaren, zytopathischen Veränderungen. Nach einer Woche in Kultur sind jedoch zytopathische und zytolytische Veränderungen leicht beobachtbar. Spezifisch gesagt, die Nuclei der infizierten Zellen sind oft stark zusammengerollt, Chromatin ist hauptsächlich euchromatisch und enthält Nucleoli ohne merkliche Merkmale. Das Zytoplasma zeigte ziemlich großen Golgischen Apparat, Vesikeln verschiedener Größen, hervorragende Anordnung von rauhem endoplasmischem Retikulum und reichliche Mitochondrien. Die allgemeine Erscheinung dieser Zellen ist diejenige von hoch polymorphen wuchernden Geschwulsten von lymphoidem Ursprung.
- Spezifische Immunomarkierung von extrazellulärem Virus tritt auf bei dem ultrastrukturellen Gehalt unter Verwendung von preabsorbiertem Patientenserum und einem Antiserum gegen menschliches Gammaglobulin, gewachsen in Ziegen, markiert mit entweder Ferritin oder mit Peroxidase. Große Zahlen von Virionen werden von den meisten der infizierten Zellen freigesetzt und erscheinen in dichten Klustern an der Oberfläche der Zellen. Praktisch alle der Virionen sind an ihrer Peripherie markiert. In einigen Fällen dringt die Markierung in das Virion ein, was anzeigt, daß die Hüllen von einigen der Virionen nicht intakt sind und daß einige der Patientenseren Antikörper gegen interne Komponenten des Virus wie auch gegen die Virushülle enthalten.
- Der HBLV-Virus der- vorliegenden Erfindung wird durch Infektion von menschlichen Nabelschnurblutzellen mit HBLV vermehrt, wie dies im Detail in der Spezifischen Beschreibung angegeben ist.
- Der behandelte Gegenstand dieser Erfindung, molekularer Klon pZVH14, wurde bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, unter ATCC No. 40247, hinterlegt, und nach Erteilung dieser Anmeldung wird sie für eine Zeitspanne von dreißig (30) Jahren oder von fünf (5) Jahren nach der letzten Anfrage nach einer solchen Hinterlegung oder für die effektive Laufzeit des Patentes, das am längsten in Kaft ist, aufrecht erhalten. Die Hinterlegung wird ersetzt, falls die Kultur während der Zeitspanne der Hinterlegung mutiert oder nichtlebensfähig wird.
- Die Figur ist die Southern Blot Analyse von Human-B-lymphotropischem Virus-Genom-DNA.
- Der molekulare Klon der vorliegenden Erfindung ist zur in situ Hybridisierung mit Wirtszellen, die mit HBLV infiziert sind, in der Lage. Dieser Klon ist daher brauchbar als diagnostische Sonde für HBLV-infizierte Zellen, wie auch für den Nachweis von viralen Antigenen oder Antikörpern in Blutproben (unter Anwendung eines Immunofluoreszenzassay oder eines anderen Assay für Antigene oder Antikörper, welche virale Nucleinsäuren benutzen). Molekularer Klon pZHV14 wird ebenfalls beim Nachweis von früher Virusinfektion von Nabelschnurblutlymphozyten und Milzzellen durch in situ-Hybridisierung in Kultur benutzt.
- Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls in der Lage, Gene in Ziel-Zellen des Virus als ein rekombinantes DNA-Virusvektorsystem einzuführen.
- Im allgemeinen schließt eine Methode zur Klonierung des Human-B-lymphotropischem Virus (HBLV) - Genoms die Isolierung von nichtintegrierter viraler DNA nach Infektion von primären Zellen oder Nabelschnurblutzellen mit dem HBLV-Virus ein. Die nichtintegrierte virale DNA wird dann in einer Lambda-Phagen- Bibliothek geklont und mit viraler cDNA gescreent.
- Infizierte primäre Zellen und kultivierte periphäre Nabelschnurblutzellen erzeugen HBLV-Virus und dienen als Haupterzeuger für immunologische Assays, die zum Nachweis von virusspezifischen Antigenen und Antikörpern in menschlichen Seren benutzt werden. Kulturen von infizierten Zellen werden gezüchtet und geerntet, gefolgt von Extraktion von DNA mit niedrigem Molekulargewicht aus frisch infizierten Zellen. Dies erzeugt nichtintegrierte virale DNA. Eine cDNA-Bibliothek wird unter Verwendung von HBLV-cDNA gebildet. Diese cDNA wird dann als Sonde für die Untersuchung (Assay) von nichtintegrierter viraler DNA benutzt. Nichtintegrierte lineare DNA (Provirus- DNA) wird dann erhalten, die das HBLV-Genom der vorliegenden Erfindung enthält. Diese DNA wird dann in einem geeigneten Plasmid unter Bildung von Klon pZHV14 aufgeschlossen.
- Zwei Elemente des zuvor angegebenen Verfahrens sind wohlbekannte rekombinante DNA-Arbeitsweisen: die DNA-Bibliothek und die cDNA-Sonde. Die Bibliothek wird durch Übernahme der Gesamt- DNA aus den infizierten primären oder periphären Blutzellen, Schneiden der DNA in Fragmente mit einem geeigneten Restriktionsenzym, Hybridisierung der Fragmente an eine radioaktiv markierte cDNA-Sonde, Vereinigen der Fragmente zu Plasmidvektoren und dann Einführen der rekombinanten DNA in einen geeigneten Wirt gebildet.
- Die cDNA-Sonde ist eine HBLV-cDNA-Sonde, bestehend aus doppelsträngiger HBLV-mRNA. Eine kurze oligo-dT-Kette wird an den poly-A-Schwanz des mRNA-Stranges hybridisiert. Das oligodT-Segment dient als Primer für die Wirkung von reverser Transkriptase, welche die mRNA als Templat für die Synsthese eines komplementären DNA-Stranges benutzt. Die erhaltene cDNA endet in einer Haarnadelschleife. Sobald der mRNA-Strang durch Behandlung mit NaOH abgebaut ist, wird die Haarnadelschleife ein Primer für DNA-Polymerase I, welche den gepaarten DNA-Strang vervollständigt. Die Schleife wird dann durch S1-Nuclease gespalten, um ein doppelsträngiges cDNA-Molekül zu bilden. Es werden dann Linker unter Anwendung von DNA-Ligase zu der doppelsträngigen cDNA zugesetzt. Die Linker werden mit einem Restriktionsenzym offen geschnitten und die cDNA wird in ein geeignetes Plasmid eingesetzt, das mit demselben Enzym gespalten ist; das Ergebnis ist ein cDNA enthaltendes rekombinantes Plasmid.
- Wie in Beispiel 5 gezeigt, ist der molekulare Klon pZHV14 des HBLV-Genoms als ein Templat für radioaktiv markierte RNA unter Verwendung von T7 RNA-Polymerase ³&sup5;S-markierter dGTP und nichtmarkierten Ribotriphosphaten brauchbar.
- Bei der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird überstehendes Fluid aus HBLV-infizierten Nabelschnurblutzellen auf 20% Glycerinpolster aufgeschichtet und durch Zentrifugieren bei 25.000 Upm für 3 h in einem Beckman SW41 Rotor bei 4ºC pelletiert. Die Pellets werden in TNE-Puffer (10 mM, Tris-Cl, pH 9, 100 mM NaCl; 1 mM EDTA) aufsuspendiert und mit PCI9 (Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol: 50 I(LM Tris-Cl, ph 9:: 100:100:1:10 :: Vol./Vol./Vol./Vol.) gefolgt von Chloroform: Iso-amylalkohol (24:1:Vol.:Vol.) extrahiert. Angereicherte virale DNA wird durch Zugabe von 2 Volumen 95%igem Ethanol ausgefällt. DNA wird mit HindIII aufgeschlossen und in den Bluescrib®-Vektor (im Handel erhältlich von Vector Cloning Systems, CA) geklont. Mehrere Klone, erhalten nach dem Screenen mit markierter, angereicherter DNA wurden auf Spezifität der Hybridisierung an infizierte menschliche Nabelschnurblutzellen- DNA und durch in situ Hybridisierung an infizierte Zellen untersucht. Spezifische Hybridisierung von HBLV-Klon pZVH14 an DNA aus pelletiertem Virus, aufgeschlossen mit HindIII (Fig. 1, Platte A) und EcoRI (Fig. 1, Platte B). Extrazellulärer Virus ist in der Spur 1, virusinfizierte menschliche Nabelschnurblutzellen in Spur 2 und negative Kontroll-DNA, isoliert aus der Haut eines AIDS-Patienten, in Spur 3 gezeigt. Klon ZVH14 hatte positive Treffer in diesen Assays und hybridiserte nicht an nicht-infizierte Kontrollen. Die infizierte Zellen-DNA, dargestellt in Spur 2, wird nach mehreren Runden von zellfreier Virustransmission in menschlichen Nabelschnurblutzellen isoliert.
- Mehrere DNA-Klone, erhalten aus Nucleinsäuren, extrahiert aus gereinigtem Virus, erhalten wie zuvor beschrieben, wurden auf Spezifität und zum Vergleich mit anderen DNA- Viren untersucht. Ein HBLV-Klon, bezeichnet als pZHV14, der ein 9,0 Kb HindIII-Fragment enthielt, wurde für diese Untersuchungen benutzt. Southern Blot-Analyse zeigte die Anwesenheit von viraler spezifischer DNA in HindIII- und EcoRI-Aufschlüssen von DNA aus sowohl gereinigtem Virus als auch aus HBLV-infizierten menschlichen Nabelschnurblutzellen. In situ Hybridisierungsversuche mit derselben Sonde bestätigten ebenfalls, daß diese Sequenzen auf infizierte Zellen beschränkt waren.
- Human-B-lymphotropischer Virus-Klon pZVH14 wurde durch Restriktionsenzym aufgeteilt wie folgt:
- worin B = BamHI; E = EcoRI; Xh = XhoI; H = HindIII; P = PstI und virale Fragmente anzeigt, die mit pZHV14-Insert in infizierten Zellen und viralen DNA-Präparationen unter Verwendung von EcoRI nachgewiesen wurden.
- Molekulare Sonden, spezifisch für HSV-1, CMV und EBV (Herpes simplex Virus Typ 1, Cytomegalovirus bzw. Eppstein- Barr-Virus) wurden zum Vergleich mit HBLV benutzt. Während jede individuelle virale Sonde spezifisch an ihre homologen Nucleinsäuren hybridisierte, war HBLV deutlich verschieden von diesen transformierenden menschlichen DNA-Viren. Weiterhin wurde gezeigt, daß die Größe des HBLV-Genoms eine Minimum-Komplexität von 110kb-Paar enthält, bestimmt durch Analyse von Saccharosegradienten-gereinigter viraler DNA. Diese Genomgröße, wie auch andere Merkmale, unterscheiden HBLV von DNA-Viren der Adenovirus-, Polyomavirus-, Papovavirus- und Papillomavirus-gruppen. Trotz morphologischer und anderer Eigenschaften, die einigen der Herpesviren ähnlich sind, scheint HBLV ein neuer menschlicher DNA-Virus zu sein. Er ist unterscheidbar von anderen Viren durch biologische Eigenschaften und durch ein Fehlen von iitmunologischer und genomer Homologie. HBLV ist in vitro hoch lytisch wie es auch CMV, HSV, Herpesvirus saimich (HVS) und Herpesvirus atteler (HvA) sind, jedoch hat er einen schmaleren Wirtsbereich als diese Viren oder EBV, der auf eine Unterklasse von B-Zellen beschränkt ist.
- Nabelschnurblutlymphozyten wurden gemeinsam mit Blutzellen eines AIDS-Patienten kultiviert. Charakteristisch große refraktile Zellen erschienen in den Nabelschnurblutkulturen. Nach sechs Tagen in Kultur wurden die Zellen pelletiert und die überstehenden Flüssigkeiten wurden über 20% Glycerin geschichtet und in der Zentrifuge (Beckman SW41 oder SW28) für 3 Stunden bei 25.000-30.000 Upm behandelt. Die Pellets enthielten Zelldebris und Virusteilchen. Phenolextraktion des Pellets ergab große Mengen von viraler Nucleinsäure. Ein doppelsträngige DNA-Klon, pZHV14, erhalten aus dieser Nucleinsäurepräparation wurde für spezifischen Hybridisierungsnachweis des Virus in Southern Blot Experimenten und in in situ-Experimenten benutzt.
- In situ-Hybridisierung von HBLV-infizierten menschlichen Nabelschnurblutzellen. Experimente wurden unter Verwendung von ³&sup5;S-markierten RNA-Sonden durchgeführt, wie in der Spezifischen Beschreibung angegeben. Klon pZHV14 des HBLV- Genoms wurde als Templat für radioaktiv markierte RNA unter Anwendung von T7 RNA-Polymerase, ³&sup5;S-markierter dGTP und nichtmarkierten Ribotriphosphaten eingesetzt. Weniger als ein Korn pro Zelle wurde in nichtinfizierten negativen Kontrollkulturen beobachtet. Große refraktile Zellen, charakteristisch für infizierte Kulturen, waren stark markiert, was die Expression von reichlichen viralen Messages anzeigt.
Claims (1)
- Human-B-lymphotropischer Virus, (HBLV), bei welchem der Virus von einem HBLV-Gen, das in einen molekularen Klon, pZVH14, kloniert ist, der die ATCC-Zugangsnummer 40247 besitzt, codiert ist.
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