DE69128239T2 - DNA SEGMENT DES HERPESVIRUS DER MAREK-KRANKHEIT, WELCHES FÜR DAS GLYKOPROTEIN gE KODIERT - Google Patents
DNA SEGMENT DES HERPESVIRUS DER MAREK-KRANKHEIT, WELCHES FÜR DAS GLYKOPROTEIN gE KODIERTInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Segmente des Genoms des Herpesvirus der Marek- Krankheit, von seinem einzigartigen kurzen (US)-Bereich, der das Glycoprotein gE kodiert, und sie betrifft neue Glycoproteine, die hierdurch erzeugt werden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Segmente, die Gene enthalten, die diese Glycoproteinantigene kodieren und die potentielle Promotorsequenzen mit bis zu 400 Nukleotiden 5' von jedem Gen enthalten, Segmente, die geeignet sind, als Sonden für den Herpesvirus der Marek-Krankheit zu wirken, als mögliche Quelle für Marek-Krankheit-Virus (MDV)-Promotoren, für eine Genexpression, um Glycoproteine zu erzeugen, die dann wiederum zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden können, die die drei Glycoprotein-Antigene erkennen und im Fall der letzteren zwei Gene für potentielle Insertionsstellen für Fremdgene und als mögliche Stellen für eine Geninaktivierung, um MDV-Feldisolate für Impfzwecke abzuschwächen.
- MDV ist ein onkogener Herpesvirus von Hühnern, von dem bekannt ist, daß er T-Zell- Lymphoma und periphere Nerven-Entmyelinisierung erzeugt. Die resultierende Krankheit, Marek-Krankheit (MD), war die erste natürlich auftretende lymphomatöse Störung, die über eine Impfung effektiv kontrolliert werden konnte, unter Verwendung von entweder dem antigen verwandten, jedoch nicht pathogenen Herpesvirus von Truthähnen (HVT) oder abgeschwächten Feldisolaten von MDV.
- Aufgrund von ähnlichen biologischen Eigenschaften, insbesondere aufgrund seiner Lymphotropie wurde MDV als ein Mitglied der Gammaherpesvirus-Unterfamilie klassifiziert (Roizman, B. et al., Intervirology 16:201-217 (1981)). Von den drei Herpesvirus- Unterfamilien zeigen die Gamma-Herpesviren besonders deutliche Unterschiede im Hinblick auf die Genomzusammensetzung und ihre Organisation. Zum Beispiel zeigt das B-lymphotrope Epstein-Barr-Virus (EBV) von Menschen ein 172,3 kbp Genom mit 60% G+C-Gehalt, ist durch terminale 0,5 kbp direkte Sequenzwiederholungen gebunden und enthält einen charakteristischen Teil von internen 3,07 kbp Tandemwiederholungen (Baer, R. et al., Nature (London) 310:207-211 (1984)). Das Herpesvirus Saimiri (HVS), ein T-lymphotropes Herpesvirus von Affen der Neuen Welt und niedrigen Vertebraten weist eine A+T-reiche Kodierungssequenz auf (112 kbp; 36% G+C; d.h., L-DNA) ohne irgendeine größere interne Redundanz, enthält dafür stattdessen mehr als 30 Wiederholungen einer 1,44 kbp Sequenz mit 71% G+C an den Enden des Genoms (H- DNA) (Banker, A. T. et al., J. Virol. 55:133-139 (1985)). Trotz der strukturellen Differenzen zwischen EBV und HVS kodieren die Genome dieser zwei Viren serologisch verwandte Proteine und zeigen eine gemeinsame Organisation von Kodierungssequenzen, die sich von der von neurotropen Alphaherpesviren unterscheidet, beispielhaft dargestellt durch Herpes-Simplex-Virus (HSV) und Varicella-Zoster-Virus (VZV) (Camerion, K. R., et al., J. Virol. 61:2063-2070 (1987); Davison, A. J., et al., J. Gen. Virol. 68:1067- 1079 (1987); Davison, A. J., et al., J. Gen. Virol. 67: 597-611 (1986); Davison, A. J., et al., J. Gen. Virol. 76:1759-1816 (1986); Davison, A. J., et al., J. Gen. Virol. 64:1927- 1942 (1983); Gompels, U. A., J. of Virol. 62:757-767 (1988); und Nichols, J., et al., J. of Virol. 62:3250-3257 (1988)).
- Im Gegensatz zu anderen Gammaherpesviren weist MDV eine Genomstruktur auf, die der von Alphaherpesviren stark ähnelt (Cebrian, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:555-558 (1982); und Fukuchi, K., et al., J. Virol. 51:102-109 (1984)). Mitglieder der letzteren Subfamilie haben ähnliche Genomstrukturen, die aus kovalent verbundenen langen (L) und kurzen (S) Segmenten bestehen. Jedes Segment weist ein einzigartiges (U) Segment (UL, US) auf, flankiert von einem Paar (terminalen und internen) Invertions- Sequenzwiederholungsbereichen (TRL, IRL; bzw. TRS). Alphaherpesviren umfassen menschliches HSV und VZV, Pseudorabiesvirus (PRV) von Schweinen, Rinderherpesvirus (BHV) und Pferdeherpesvirus (EHV). Da MDV ausgedehnte Sequenzwiederholungssequenzen aufweist, die seine UL-Region flankieren, ähnelt seine Genomstruktur am meisten der von HSV (Cebrian, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:555-558 (1982); und Fukuchi, K., et al., J. Virol. 51:102-109 (1984)).
- Studien aus letzter Zeit (Buckmaster, A. E., et al., J. Gen. Virol. 69:2033-2042 (1988)) haben gezeigt, daß die beiden Gammaherpesviren, MDV und HVT, anscheinend eine größere Ähnlichkeit mit den Alphaherpesviren, VZV und HSV, aufweisen, als mit dem Gammaherpesvirus EBV. Dies basierte auf einem Vergleich von vielen, statistisch isolierten MDV- und HVT-Klonen auf dem vorhergesagten Aminosäureniveau; individuelle Sequenzen zeigten nicht nur eine größere Verwandtschaft mit Alphaherpesvirusgenen als mit Gammaherpesvirusgenen, sondern die beiden viralen Genome erwiesen sich auch als allgemein collinear mit VZV, zumindest im Hinblick auf den einzigartigen langen (UL) Bereich. Eine solche Collinearität von UL-Genen erstreckt sich auf andere Alphaherpesviren, wie z.B. HSV-1, HSV-2, EHV-1 und PRV, wie belegt durch Sequenzanalyse (McGeoch, D. J., et al., J. Gen. Virol. 69:1531-1574 (1988)) als auch DNA-Hybridisierungs-Experimente (Davison, A. J., et al., J. Gen. Virol. 64:1927-1942 (1983)). Viele dieser UL-Gene finden sich bei anderen Herpesviren, einschließlich den Beta- und Gammaherpesviren (Davison, A. J., et al., J. Gen. Virol. 68:1067-1079 (1987)). Die Organisation und der Vergleich solcher Gene hat nahegelegt, daß in der Vergangenheit groß angelegte Neu-Anordnungen aufgetreten sind, um die Divergenz der Herpesviren von einem gemeinsamen Vorfahren zu erklären. Unglücklicherweise kann eine solche Hypothese nicht die Gegenwart des Alphaherpesvirus-S-Bestandteils erklären (einzigartig kurz, US, und assoziierte invertierte/terminale Sequenzwiederholungseinheit kurz, IRS, TRS) Gene, die einzigartig für die Mitglieder dieser Subfamilie zu sein scheinen (Davison, A. J., et al., J. Gen. Virol. 68:1067-1079 (1987); Davison, A. J. et al., J. Gen. Virol. 67:597-611 (1986); und McGeoch, D. J., et al, J. Mol. Biol. 181:1-13 (1985)).
- Die DNA-Sequenz und Organisation der Gene in einer 5,5 kbp EcoR1-Fragmentkartierung in dem US-Bereich des MDV-Stammes RBIB wurde von Ross, Binns und Pastorek beschrieben (Ross, L. J. N., et al., Journal of General Virology 72:949-954 (1991)). Die Eigenschaften und die evolutionären Verwandtschaften von vier der vorhergesagten Polypeptide wurde ebenfalls beschrieben (Ross, L. J. N. und M. M. Binns, Journal of General Virology, 72:939-947 (1991)). In diesem Fragment fanden sie Homologe von HSV US2, US3, US6 (gD) und US7 (gI) wie auch ein MDV-spezifisches Gen. Für das letztere war nur ein Teil des Gens vorhanden. Diese Berichte bestätigen die Gegenwart von vier MDV US-Genen und die oben vorgeschlagene evolutionäre Verwandtschaft. Es ist wichtig anzumerken, daß kein Beweis für US8 (gE) oder die Gene auf der linken Seite von US2 beschrieben wurde.
- Zusätzlich zu seiner Einzigartigkeit im Vergleich mit Beta- und Gammaherpesviren ist der Alphaherpesvirus-US-Bereich insbesondere interessant aufgrund seiner deutlichen Unterschiede in Gehalt und genetischer Organisation innerhalb der letzteren Subfamilie (z.B. HSV-1 US=13,0 kbp, 12 Gene, McGeoch, D. J., et al., J. Mol. Biol. 181:1-13 (1985)), VZV US=5,2 kbp, 4 Gene, Davison, A. J. et al., J. Gen. Virol.76:1759-1816 (1986)). In dem Fall von HSV-1 haben sich 11 von 12 US-Genen als entbehrlich für eine Replikation in Zellkultur erwiesen (Longnecker, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4303-4307 (1987)). Dies legt nahe, daß eine potentielle Involvierung dieser Gene in der Pathogenese und/oder Latenz vorlag (Longnecker, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4303-4307 (1987); Meignier, B., et al., Virology 162:251-254 (1988); und Weber, P. C., et al., Science 236:576-579 (1987)). In dem Bericht von Buckmaster et al. (Buckmaster, A. E., et al., J. Gen. Virol. 69:2033-2042 (1988)) wurde außer einer Identifizierung von Teil-MDV-Sequenzen als homolog mit HSV Proteinalpha 22 (US1) der Direktfrühphase und der Serin-Threonin-Proteinkinase (US3), der Gehalt, die Lokalisierung und die Organisation der MDV-S-Bestandteilshomologe nicht bestimmt. Außerdem wurden trotz der Gegenwart von mindestens vier HSV-US-Glycoproteingegen (zwei in VZV) keine solchen Homologe identifiziert.
- In der Anmeldung Nr. 07/229,011, angemeldet am 5. August 1988, mit Leland F. Velicer als einem der gegenwärtigen Erfinder, wurde das DNA-Segment des Herpesvirus der Marek-Krankheit, das vermutlich das Gen enthält, das für den Glycoprotein-B-Antigenkomplex (gp100, gp60, gp49) kodiert, identifiziert, aber nicht sequenziert. Das Antigen B ist ein wichtiger Glycoproteinkomplex, da es mindestens eine teilweise schützende Immunität auslösen kann, und so kann das MDV-DNA-Segment für Sonden verwendet werden, als mögliche Quelle für Promotoren in dem 5'-Regulationsbereich des Gens und für eine Genexpression, um Glycoproteine zu erzeugen, die wiederum verwendet werden können, um Antikörper zu erzeugen, die die Glycoprotein-Antigene erkennen. Jedoch gab es hier keine Diskussion der Glycoproteine gemäß der vorliegenden Erfindung. Diese B-Antigen-Glycoproteine werden nicht durch die US-Region kodiert und stammen daher von einer anderen Region des MDV-Genoms.
- In der Anmeldung Nr. 07/526,790, angemeldet am 17. Mai 1987 von Leland F. Velicer, wird das MDV-Herpesvirus-DNA-Segment beschrieben, das das Gen enthält, das für Glycoprotein-A-Antigen (gp57-65) kodiert, es wird aber nicht sequenziert. Dieses MDV- DNA-Segment ist nützlich für Sonden, als mögliche Quelle für Promotoren in dem 5'- Regulatorbereich des Gens und zur Erzeugung von Antikörpern durch eine Sequenz von Abläufen, wie oben beschrieben. Diese DNA ist ebenfalls wichtig, da vom Antigen A nun bekannt ist, das es homolog mit HSV gC ist, einem Gen, das für eine Replikation in Zellkultur nicht essentiell ist. Da diese Eigenschaft höchstwahrscheinlich auch auf das MDV-Homolog zutrifft, könnte es nützlich als Insertionsstelle für Fremdgene sein. Es gab hier jedoch keine Diskussion der Glycoproteine gemäß der vorliegenden Erfindung. Dieses Glycoprotein wird auch nicht durch die US-Region kodiert und stammt daher von einer unterschiedlichen Region des MDV-Genoms.
- Andere Glycoproteine werden von dem Genom des Herpesvirus der Marek-Krankheit kodiert. In der Anmeldung Nr. 07/572,711, angemeldet am 24. August 1990 durch Leland F. Velicer et al. wird die MDV-DNA beschrieben, die die Gene enthält, die für MDV, gD und gI und einen Teil der gE-Glycoproteine kodieren, wobei die MDV-Nukleotidsequenzen für die vollständigen gD- und gI-Gene und ein Teil von gE beschrieben wird (MDV-Homologe von HSV-Genen US6, US7 bzw. US8). Dieses MDV-DNA-Segment ist geeignet für Sonden, als mögliche Quelle für Promotoren in dem 5'-Regulatorbereich des Gens und zur Herstellung von Antikörpern durch die Abfolge von Schritten wie oben beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist insbesondere auf ein vollständiges Gen (US8) gerichtet, das das Glycoprotein gE kodiert.
- Es ist eine Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung, sequenzierte DNA bereitzustellen, die das Glycoprotein gE kodiert. Es ist eine weitere Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung, DNA-Segmente zur Verfügung zu stellen, die dieses Glycoprotein-Antigen kodieren und die potentielle Promotorsequenzen mit bis zu 400 Nukleotiden 5'vom Gen enthalten; die geeignet sind als DNA-Sonden, als mögliche Quelle für MDV-Promotoren, zur Erzeugung von Antikörpern, die das Antigen erkennen und als Insertionsstellen für Fremdgene und als mögliche Stellen für eine Geninaktivierung, um MDV-Feldisolate zu Impfzwecken abzuschwächen. Diese und andere Aufgaben werden sich deutlicher im Hinblick auf die folgende Beschreibung und die Zeichnungen ergeben.
- Fig. 1A bis C zeigen die Kartierungslokalisierung, die Sequenzierungsstrategie und die Organisation von MDV offenen Leserahmen (ORFs):
- Fig. 1A enthält die MDV-Genomstruktur und Restriktionskarten, die den sequenzierten Bereich umschreiben.
- Fig. 1B enthält die Kartierungslokalisierung und die Sequenzierungsstrategie. Kästen definieren Plasmidklone mit BamHI, EcoRI oder SalI-gebundenen Inserten, die verwendet wurden, um M13mp18- und -19-Matrizen für eine DNA-Sequenzierung zu erzeugen. Rechtsgerichtete und linksgerichtete Pfeile definieren Sequenzen, die von oberen bzw. unteren Strängen abgeleitet wurden. Die Restriktionsenzymstellen werden identifiziert als: B = BamHI, E = EcoRI, Nc = NcoI, Ns = NsiI, S = SalI und P = PstI. Sequenzen, die aus Zufallsbibliotheken abgeleitet sind (Sau3A, TaqI, RsaI), spezifisch klonierte Restriktionsfragmente, BaI 31-verdaute Bibliotheken oder die Verwendung von synthetisch abgeleiteten Oligonukleotiden sind mit a, b, c bzw. d bezeichnet.
- Fig. 1C enthält die Organisation der MDV-US-ORFs. Die Zahlen bezeichnen Homologe, basierend auf der Beziehung mit der HSV-1-US-ORF-Nomenklatur (Mc Geoch, D. J., et al., J. Mol. Biol. 181:1-13 (1985)). Kästen repräsentieren die Stellung von MDV ORFs. Pfeile definieren die Richtung der Transkription/Translation. Die Namen der ORFs sind oberhalb der Kästen angegeben. Potentielle Polyadenylierungssignale auf oberen und unteren Strängen sind durch AATAAA bzw. AAATAA betont. SORF1 und SORF2 sind MDV-spezifische S-Bestandteil-ORFs, denen willkürliche Namen gegeben wurden.
- Fig. 2 zeigt Nukleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenzen. Die Nukleotidsequenz ist nur als rechtsgerichteter 5'T3'-Strang angegeben (numeriert von 1 bis 10350). Rechtsgerichtete und linksgerichtete, vorhergesagte Aminosäuresequenzen sind oberhalb und unterhalb der korrespondierenden Nukleotidsequenzen in einem Einzelbuchstabencode jeweils angegeben. Der Name von jedem ORF ist links von der ersten Zeile der Aminosäuresequenz angegeben. Aminosäuresequenzen sind von dem ersten M (Drei-Buchstaben-Code) (ATG in der DNA) am N-Terminus bis zur letzten Aminosäure am C-Terminus, die vor dem Terminationscodon steht (identifiziert durch ein *) durchnumeriert. Potentielle TATA-Konsensusstellen, die innerhalb von 400 Nukleotiden des ATGs lokalisiert sind, sind unterstrichen und als Stellen definiert, die mindestens sechs von sieben Übereinstimmungen mit den TATA(AT)A(AT)-Konsensussequenzen enthalten, definiert von Corden et al. (Corden, B., et al., Science 209:1406-1414 (1980)). Unterstrichene Bereiche, die länger als sieben Nukleotide sind, bezeichnen Bereiche, die überlappende TATA-Konsensusstellen enthalten.
- Fig. 3A zeigt eine Ausrichtung von S-Bestandteils-Homologen, die ausgewählte Regionen zeigen, die eine maximale Aminosäurekonservierung aufweisen. Es wurden Lücken eingefügt, um die Ausrichtung von identischen Aminosäuren, wie beschrieben in "Methoden" zu maximieren. Die Konsensussequenz (cons) bezeichnet Reste, die von mindestens allen außer einem der Viren geteilt werden, und sie sind durch Großbuchstaben angezeigt. In Ausrichtungen zwischen mehr als zwei Sequenzen zeigen Sternchen (*) Reste an, die bei allen Viren konserviert sind. Aminosäurezahlen (im Hinblick auf 5'-ATG) von korrespondierenden ausgerichteten Regionen sind vor und nach jeder Sequenz aufgelistet.
- Fig. 3B zeigt eine Punktmatrixanalyse, die die Gesamthomologien zwischen ausgewählten MDV-Alphaherpesvirus-S-Segment-Homolog-Vergleichen darstellen. Es wurden Punkte erzeugt, worin mindestens 15 Aminosäuren über eine Gleitfensterlänge von 30 als identisch oder ähnlich gefunden wurden. Die resultierenden Diagonalen illustrieren Regionen, die die größte Konservierung zeigen. Aminosäurezahlen (im Hinblick auf 5'-ATG) von korrespondierenden Sequenzen sind oberhalb und rechts von jedem Auftrag dargestellt.
- Fig. 4 zeigt einen Vergleich einer Gesamtgenomorganisation von verfügbaren S- Bestandteil-ORFs (Audonnet, J.-C., et al., J. Gen. Virol. 71:2969-2978 (1990); McGeoch, D. J., et al., J. Gen. Virol. 68:19-38 (1987); Tikoo, S. K., et al., J. Virol. 64:5132-5142 (1990); Van Zijl, M., et al., J. Gen. Virol. 71:1747-1755 (1990); Zhang, G., et al., J. Gen. Virol. 71:2433-2441 (1990); Cullinane, A. A., et al., J. Gen. Virol. 69:1575-1590 (1988); Davison, A. J., et al., J. Gen. Virol. 76:1759-1816 (1986); McGeoch, D. J., et al., J. Mol. Biol. 181:1-13 (1985); Petrovskis, E. A., et al., Virology 159:193-195 (1987); Petrovskis, E. A., et al., J. Virol. 60:185-193 (1986); und Petrovskis, E. A., et al., J. Virol. 59:216-223 (1986)). Die Zahlen oberhalb von jedem ORF bezeichnen Homologe, basierend auf einer Beziehung zu der HSV-1 US ORF- Nomenklatur (McGeoch, D. J., et al, J. Mol. Biol. 181:1-13 (1985)). Alternative Polypeptidbezeichnungen, die in jedem System übereinstimmen, sind unterhalb dieser ORFs aufgelistet, wo anwendbar. Obere und untere Zonen mit durchgezogenen Strichen bezeichnen nach rechts gerichtete bzw. linksgerichtete ORFs. Pfeile bezeichnen identifizierte IRS-US- und/oder US- TRS-Verbindungsstellen.
- Das PRV-Gen 4 ist homolog mit HSV-2 US4, anstelle von HSV-1 US4.
- Fig. 5 zeigt die Abfolge von Schritten, die notwendig sind, um ein vollständiges Segment der DNA des Herpesvirus der Marek-Krankheit zu erzeugen, das für das Glycoprotein gI kodiert und den Teil von gE, der in der Anmeldung enthalten ist, die am 24. August 1990 eingereicht wurde.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Segment einer DNA, die für den Glycoprotein-gE- Vorläufer kodiert, zwischen einer 8488 und 9978-Nukleotidsequenz der DNA des Herpesvirus der Marek-Krankheit und die potentiellen Promotorsequenzen von bis zu 400 Nukleotiden 5' von jedem Gen, wie dargestellt in Fig. 2, enthält (und identifiziert als Teil der SEQ ID Nr. 1) sowie Subfragmente der DNA, die die DNA erkennen.
- Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung neue Glycoproteinvorläufer, die durch Expression der Gene in den Segmenten der DNA erzeugt werden.
- Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die potentiellen MDV-Genpromotoren, die in den 400 Nukeotiden 5' von jeder Kodierungssequenz lokalisiert sind.
- Die vorliegende Erfindung zeigt eine Sequenzanalyse eines 10.35 kbp-DNA-Abschnitts, der einen Großteil der MDV US-Region enthält. Insgesamt wurden sieben MDV-US-Homologe, einschließlich drei Glycoprotein-Genen und zwei zusätzlichen MDV-spezifischen offenen Leserahmen, identifiziert.
- MDV EcoRI-0 und EcoR1-I des pathogenen GA-Stammes wurden vorher in pBR328 kloniert (Gibbs, C. P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3365-3369 (1984)), (Silva, R. F., et al., J. Virol. 54:690-696 (1985)) und durch R. F. Silva, USDA Avian Disease and Oncology Lab, East Lansing, MI, zur Verfügung gestellt, wo diese Klone erhalten werden. Der GA-Stamm BamHI-A und BamHI-P1 wurden vorher in pACYC184 bzw. pBR322 kloniert (Fukuchi, K., et al., J. Virol. 51:102-109 (1984)) und von M. Nonoyama, Showa University Research Institute, St. Petersburg, FL, freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Der GA-Stammklon GA-02, ein EMBL-3-Klon, der ein teilweise verdautes MDV-SalI-Insert enthalt, das BamHI-A, -P1 und zusatzlich 5'- und 3'-Flankierungssequenzen enthält (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von P. Sondermeier, Intervet Intl. B. V., Boxmeer, Niederlande) wurde verwendet, um die Analyse nach rechts von den obigen EcoR1 und BamH1-Fragmenten zu erstrecken. Dieser Phagenklon wurde verwendet, um pUC18-Subklone mit kleineren Sal-I-gebundenen Inserten zu erzeugen (psP18-A, pSP18-B und pSP18-C), die die 3'-BamHI-P1-Flankierungsregion enthalten. Diese Klone (Fig. 1B) wurden verwendet, um M13mp18- und -19-Subkone zur Verwendung als Matrizen für eine Nukleotidsequenzierung zu erzeugen. Kleine und große Plasmidpräparationen wurden unter Verwendung des alkalischen Lyseverfahrens hergestellt (Maniatis, T., et al., Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)).
- M13mp18- und M13mp19-Phagensubklone, die als Matrizen für eine Sequenzierung verwendet werden sollten, wurden unter Verwendung von spezifischen Restriktionssubfragmenten erzeugt, bestimmt durch eine Restriktionskartierung oder die Verwendung von Sau3A, Taq I oder RsaI-verdauten viralen DNA-Pools, die in die einzigartigen BamHI, AccI bzw. SmaI-Stellen von M13 RF DNA ligiert worden waren. In einigen Fällen wurden überlappende M13-Deletionsklone durch verarbeitende Ba131-Verdauungen durch AccI, NaeI oder NsiI-Restriktionsstellen in EcoR1-0 durch das Verfahren von Poncz et al. erhalten (Poncz, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4298-4302 (1982)). Standardverfahren (Maniatis, T., et al., Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)) wurden für Restriktionsverdauungen, Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten von Agarosegelen, Ligationen und Einfüllung von 5'-Überhängen mit einem Klenow-Fragment verwendet.
- Die ligierten M13-Produkte wurden in CaCl&sub2;-kompetente JM107-Wirtszellen transformiert und zu geschmolzenem B-Topagar hinzugefügt, der 10 l 100 mM IPTG, 50 l 2% Xgal und 200 l einer frischen Übernacht-JM101-Kultur enthielt. Diese Inhalte wurden dann auf B-Agarplatten plattiert und bei 37ºC über Nacht inkubiert. Rekombinante (klare) Plaques wurden dann verwendet, um 5 ml YT-Medium, verdünnt 1:50 mit einer Übernacht-JM101-Kultur zu infizieren und bei 37ºC 6 Stunden rotiert. Die resultierenden Zellen wurden durch Zentrifugation für 5 min bei Raumtemperatur pelletiert und die Überstände wurden entfernt und bei 4ºC aufbewahrt, um ein virales Lager für jeden rekombinanten Klon zu erhalten.
- Unter Verwendung der gewonnenen Überstände wurde einzelsträngige M13-Phagen- DNA, die als Matrize für eine DNA-Sequenzierung durch das Dideoxy-Ketten-Terminationsverfahren verwendet werden sollte, gemäß den Anweisungen in dem M13 Cloning/Dideoxy Sequencing Instruction Manual, zur Verfügung gestellt von Bethesda Research Laboratories isoliert. Rekombinante M13mp-Phagen wurden weiterhin durch Elektrophorese von gereinigter, einzelsträngiger, viraler DNA auf 1%igen Agarose Mini-Gelen ausgewählt und diejenigen Matrizen ausgewählt, die eine reduzierte Mobilität im Vergleich zu einzelsträngiger M13mp 18-Kontroll-DNA zeigten.
- Die DNA-Sequenzierung mit einzelsträngigen M13-Matrizen wurde durch das Dideoxy- Ketten-Terminationsverfahren durchgeführt (Sanger, F. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467 (1977)) unter Verwendung der modifizierten T7-DNA-Polymerase, Sequenase (United Stated Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). Eine Zusammenfassung der Sequenzierungsstrategie ist in Fig. 1B enthalten. Für DNA-Sequenzierungsreaktionen wurden die spezifischen Schritt-für-Schritt-Anweisungen, die mit dem Sequenase -Sequenzierungskit bereitgestellt wurden, angewendet. Kurzgefaßt wurden einzelsträngige M13-Matrizen zunächst mit dem universellen M13 synthetischen Oligo- Nukleotidprimer durch Inkubation bei 65ºC zwei Minuten, gefolgt von langsamer Abkühlung, bis die Inkubationstemperatur unter 30ºC lag, verbunden. Folgend auf die Addition von ordentlichen Mischungen von Deoxy- und Dideoxynukleotid-Triphosphaten (dNTPs bzw. ddNTPs), radioaktiv markierten Deoxyadenosin-5'-(alpha-thio)triphosphat (³&sup5;S- dATP, 1000-1500 Ci/mmol; NEN-DuPont) und dem Sequenase -Enzym wurde die Synthese von radioaktiv markierten, komplementären Strängen aus dem verbundenen Primer initiiert. Vier getrennte Synthesereaktionen wurden jeweils durch Inkorporation des spezifischen ddNTA (ddATP, ddGTP, ddTTP oder ddCTP), das in jedem Röhrchen verwendet wurde, terminiert. Die Reaktionsprodukte wurden durch 7%ige Polyacrylamid/50% Harnstoff/Tris-Borat-EDTA-Gele elektrophoriert und die markierten Ketten wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Beide Stränge wurden mindestens einmal sequenziert. Dieses wurde durch Verwendung von 16 synthetischen 17-mer Oligonukleotiden vereinfacht, die basierend auf vorher bestimmten Sequenzen erzeugt worden waren und für den universellen Primer unter ähnlichen Reaktionsbedingungen oben (0,5 pMol/Reaktion) gemäß dem allgemeinen Ansatz beschrieben von Strauss (Strauss, E. C., et al., Anal. Biochem. 154:353-360 (1986)) substituiert.
- Die Sequenzen wurden gesammelt und auf einem IBM Personal System 2/Model 50 Microcomputer analysiert unter Verwendung von IBI/Pustell (Pustell, J., et al., Nucl. Acids. Res. 14:479-488 (1986)) und Genepro (Version 4.10; Riverside Scientific Enterprises, Seattle, WA) Sequenzanalysesoftwarepakete oder Programme erhältlich von der Universität von Wisconsin Genetics Computer Group (GCG; Devereaux, J., et al., Nucl. Acids. Res. 12:387-395 (1984)) und auf einem VAX-8650-Minicomputer angewendet. Die Datenbanksuche der National Biochemical Research Foundation-Protein (NBRF- Protein, Version 21.0, 6/89) wurde mit dem GCG-Programm FASTA durchgeführt verwendet: (1) eine Modifikation des Algorithmus von Wilbur und Lipman (Wilbur, W. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730 (1983)), um die ähnlichen Regionen zu lokalisieren; (2) ein PAM250-basierendes Übereinstimmungssystem (Dayhoff, M. O., et al., S. 345-352. In M. O. Dayhoff (Hrsg.), Atlas of protein sequence and structure, Bd. 5, Suppl. 3. National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C. (1978)) und (3) das Ausrichtungsverfahren von Smith and Waterman (Smith, T. F., et al., Adv. Appl. Mathematics 2:482489 (1981)), um, wenn möglich die am höchsten übereinstimmenden, nicht überlappenden Regionen zu verbinden, um eine Ausrichtung abzuleiten und die resultierende, optimierte Übereinstimmung. Punktmatrixhomologieplots wurden unter Verwendung des GCG-Programms DOTPLOT mit der Ausgangsdatei von GCGs COMPARE erzeugt. Das letztere erzeugt eine Datei der Ähnlichkeitspunkte zwischen zwei vorhergesagten Aminosäuresequenzen, wofür eine Fensterlänge von 30 und eine Stringenz von 15 ausgewählt wurde (worin konservative Aminosäureersetzungen positiv übereinstimmten). Unter Verwendung des GCG-Programms GAP wurden spezifische Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Algorithmus von Needleman and Wunsch (Needleman, S. B., et al., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)) ausgerichtet; folgend auf eine Insertion von Lücken (um die Anzahl der Übereinstimmungen zu maximieren) wurde die Prozentzahl von identischen und ähnlichen Aminosäureresten bestimmt. Um multiple Ausrichtungen unter Verwendung von GAP zu erzeugen, wurden Ausgangsdateien von mit Lücken versehenen MDV-Sequenzen erzeugt, folgend auf einen aufeinanderfolgenden GAP-Vergleich zwischen der MDV-Sequenz und ihren homologen Sequenzen (in absteigender Reihenfolge der Homologie). Diese Ausgangsdateien wurden verwendet als Eingangssequenzen, für aufeinanderfolgende Läufe von GAP, bis die Ausrichtung dieser mit Lücken versehenen Sequenzen nicht mehr durch Addition von neuen Lücken ausgedehnt werden konnte. Folgend auf die Ausrichtung wurden die mit Lücken versehenen Ausgangsdateien dargestellt und eine Konsensus-Sequenz wurde unter Verwendung des GCG-Programms PRETTTY kalkuliert. Um optimale Ergebnisse zu erreichen, wurde in einigen Fällen eine manuelle Editierung angewendet (Verwendung von GCGs LINEUP).
- Die dargestellte 10.350-Nukleotid-DNA-Sequenz (Fig. 2) scheint einen großen Teil des einzigartigen kurzen (US)-Bereichs des MDV (GA) Genoms zu umfassen. Eine Zusammenfassung der Sequenzierungsstrategie ist in Material und Methoden enthalten und in Fig. 1B dargestellt. Diese Sequenz umfaßt die US-Fragmente, EcoR1-0, EcoR1-I und erstreckt sich auf die SalI-Stelle 1,55 kbp stromabwärts des 3'-Endes von BamHI-P&sub1; (Fig. 1A und 1B). Fukuchi et al. (Fukuchi, K., et al., J. Virol. 51:102-109 (1984)) haben vorher die IRS-US-Verbindung mit einem 1,4 kb Bgl I Fragment kartiert, das im zweiten von fünf EcoR1 Subfragmenten von BamHI-A (Fig. 1B) lokalisiert ist. Auf diese Weise sollte der Sequenz, die hier dargestellt wird, ein Teil zwischen dem 2,6- und 4,0 kb der 5'-nahen US-Region fehlen, angenommen, daß die obige IRS-US-Verbindungslokalisierung unabhängig bestätigt werden kann. Da die sequenzierte Region sich nicht eine ausreichende Distanz stromabwärts von BamHI-P&sub1; erstreckt, konnte die MDV US-TRS- Bindung bis jetzt nicht genau definiert werden (Davison, A. J., et al., J. Gen. Virol. 76:1759-1816 (1986)). Für VZV, EHV-4 und HSV-1 ist diese Grenze lokalisiert bei ungefähr 100 bp stromaufwärts, oder 1,1 bzw. 2,7 kb stromabwärts des Stopcodons ihrer respektiven US8-Homologe (Cullinane, A. A., et al., J. Gen. Virol. 69:1575-1590 (1988); Davison, A. J., et al., J. Gen. Virol. 76:1759-1816 (1986); und Mc Geoch, D. J., et al., J. Gen. Virol. 69:1531-1574 (1988)).
- Der Gesamt-G+C-Gehalt der sequenzierten Region wurde bei 41% gefunden, etwas unterhalb der Genom-MDV-G+C-Werte von 46% (Lee, L. F., et al., J. Virol. 7:289 (1971)). Die beobachteten Häufigkeiten von CpG-Di-Nukleotiden in der gesamten Sequenz oder nur in den Kodierungsregionen unterschieden sich nicht signifikant von denjenigen, die aus ihren MonoNukleotidzusammensetzungen (Daten nicht gezeigt) erwartet wurden. Dieses Ergebnis stimmt mit denjenigen überein, die von Alphaherpesviren enthalten wurden, während es sich von denjenigem unterscheidet, das von Gammaherpesviren erhalten wurde, wie z.B. dem A+T-reichen HVS und dem G+C-reichen EBV, die beide keine CpG-Dinukleotide aufweisen (Honess, R. W., et al., J. Gen. Virol. 70:837-855 (1989)).
- Die sequenzierte Region enthält 9 vollständige ORFs, die vermutlich für Proteine kodieren (Fig. 1C, Basis für die Namen ist unten angegeben). Diese Vorhersage basierte auf dem folgenden: (1) Homoiogie- und Positionsorganisationsvergleiche mit anderen Alphaherpesvirusgenen und (2) Gegenwart von potentiellen TATA und Polyadenylierungs- Konsensussequenzen (Birnstiel, M. L., et al., Cell 41:349-359 (1985); und Corden, B., et al., Science 209:1406-1414 (1980)), und (3) Besitz von bevorzugten Umgebungen für eine Translationsinitiation (Kozak, M., J. Cell Biol. 108:229-241 (1989)). Diese Identifizierung wurde weiter durch die Beobachtung geleitet, daß Alphaherpesviren, wie z.B. HSV und VZV, dazu neigen, relativ dicht gepackte, nicht gespleißte und im allgemeinen nicht überlappende Kodierungsregionen zu enthalten (Davison, A. J. et al., J. Gen. Virol. 76:1759-1816 (1986); Davison, A. J. et al., J. Gen. Virol. 76:1759-1816 (1986); McGeoch, D. J., et al., J. Gen. Virol. 69:1531-1574 (1988); McGeoch, D. J., et al., J. Mol. Biol. 181:1-13 (1985); und McGeoch, D. J., et al., J. Gen. Virol. 68:19-38 (1987)). Solche Gene, insbesondere diejenigen der US-Regionen, teilen sich häufig Polyadenylierungssignale, wodurch sich 3'-koterminale mRNA-Familien ergeben (Rixon, F. J., et al., Nucl. Acids Res. 13:953-973 (1985)). Verfahren zum Nachweis von proteinkodierenden Regionen, basierend auf der Verwendung von MDV-abgeleiteten Codonhäufigkeitstabellen (unter Verwendung von diesen und vorher veröffentlichten MDV-Sequenzen, Binns, M. M., et al., Virus Res. 12:371-382 (1989); Ross, L. J. N., et al., J. Gen. Virol. 70:1789- 1804 (1989); und Scott, S. D, et al., J. Gen. Virol. 70:3055-3065 (1989)) oder Analyse von Präferenzen hinsichtlich der Zusammensetzungen (unter Verwendung der GCG- Programme CODONPREFERENCE und TESTCODE) waren im wesentlichen nicht sehr schlüssig, was nahelegt, daß MDV relativ geringe Präferenzen hinsichtlich Codons und Zusammensetzungen aufweist, verglichen mit denjenigen, die aufgrund der Mono- Nukleotidzusammensetzungen vorhergesagt wurden. Jedoch zeigen unter Verwendung des GCG-Programms FRAMES zusammen mit der MDV-abgeleiteten Codonhäufigkeitstabelle oben die 9 identifizierten ORFs deutlich ein signifikant geringes Muster einer Verwendung von seltenen Codons, was stark mit dem kontrastiert, was bei allen anderen potentiell translatierbaren Regionen beobachtet wird (Daten nicht gezeigt).
- Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen der vorhergesagten ORFs (beginnend mit dem ersten ATG-Codon) werden relativ zu den Nukleotidsequenzen in Fig. 2 dargestellt. Potentielle TATA-Stellen innerhalb von 400 Nukleotiden des Initiationscodons sind unterstrichen. Vorgeschlagene ORF und potentielle Polyadenylierungs-Signal-Lokalisierungen, die Identifikation der -3, +4 ATG-Kontextnukleotide (Kozak, M., J. Cell Biol. 108:229-241 (1989)) wie auch ihre Längen, relativen molekularen Massen und vorhergesagten isoelektrischen Punkte der vorhergesagten Translationsprodukte sind in Tabelle 1 dargestellt.
- Eine Zusammenfassung der MDV-Daten ist in Tabelle 1 gezeigt, mit Lokalisierung von ORFs, vorhergesagten Polyadenylierungssignalen, die verwendet wurden, Translationskontextnukleotiden, Längen, relativen molekularen Größen und isoelektrischen Punkten der vorhergesagten Translationsprodukte. TABELLE 1
- a Nukleotide, aufgelistet relativ zu den -3 bzw. +4-Positionen; die Numerierung beginnt mit dem A des ATG (AUG)-Codon als Position +1; Nukleotide 5' von dieser Stelle werden mit negativen Zahlen bezeichnet.
- b In Abwesenheit von post-translationalen Modifikationen.
- c Kalkuliert unter Verwendung des GCG-Programms, ISOELECTRIC.
- d Basierend auf Sequenzen, die der vorhergesagten Signalpeptid-Spaltstelle folgen.
- In Abwesenheit der vorherigen Information bezüglich dieser MDV ORFs und zur Vereinfachung der Identifizierung wurden sie mit Namen versehen (Fig. 1C, Tabelle 1), basierend auf der homologen Verwandtschaft mit HSV-1-kodierten US ORFs (McGeoch, D. J., et al., J. Mol. Biol. 181-1-13 (1985)). Wenn geeignet, werden die Buchstaben MDV dem Namen des Homologen vorstehen, um den Ursprung des ORF anzuzeigen. Die beiden MDV-spezifischen ORFs wurden zufällig SORF1 und SORF2 genannt, basierend auf ihrer Lokalisierung in dem S-Bestandteil.
- Gemäß dem Scanning-Modell für eine Translation bindet die ribosomale 40S-Untereinheit zunächst an das 5'-Ende der mRNA und wandert dann, mit einem Stop an dem ersten AUG (ATG)-Codon in eine geeignete Umgebung für eine Initiierung der Translation (Kozak, M., J. Cell Biol. 108:229-241 (1989)). In Abwesenheit von S1-Nuclease und/oder einer Primer-Verlängerungsanalyse können jedoch definitive Startstellen für die Translation nicht genau vorhergesagt werden. Nichtsdestotrotz sind die wahrscheinlichen Startstellen in Tabelle 1 aufgeführt; diese bezeichnen die Lokalisierung des ersten ATG-Codons im Rahmen, das in dem offenen Hauptleserahmen gefunden wird. Gemäß Kozak (Kozak, M., J. Cell Biol. 108:229-241 (1989)) beeinträchtigen Abweichungen von dem Rest des Konsensus die Initiation nur nebensächlich, solange ein Purin in Position -3 vorliegt. In Abwesenheit eines solchen Purins ist jedoch ein Guanin an Position +4 essentiell für eine effiziente Translation. Tabelle 1 zeigt, daß alle ORFs, außer SORF2, den wichtigen Purinrest in der -3-Position aufweisen. Nichtsdestotrotz ist im Fall von SORF2 ein kompensierendes Guanin in Position +4 tatsächlich vorhanden.
- Im Fall von MDV US1 wurden zwei transkriptionale cap-Stellen vorsorglich durch 5'-S1- Nukeaseschutzanalyse (Daten nicht gezeigt) identifiziert. Diese Stellen scheinen bei 18 und 25 Nukleotiden stromabwärts einer TATATAA-Sequenz bei Position 200 bzw. 207 (Fig. 2) lokalisiert zu sein. Basierend auf den 3' S1-Daten verwendet dieses Transkript ein Polyadenylierungssignal, das direkt stromabwärts der US10-Kodierungsregion (Tabelle 1, Daten nicht dargestellt) lokalisiert ist. Vergleichende Northern-Blot-Analysen der US-Region zeigen an, daß das MDV-US1-Transkript das wesentliche Transkript zu sein scheint, das zu einem späteren Zeitpunkt (27 Std.) nach der Infektion exprimiert wird, wenn extensive cytopathische Effekte beobachtetet werden (Daten nicht dargestellt). Phosphonoessigsäure-Inhibitionsstudien haben gezeigt, daß MDV US1, im Gegensatz zu seinem HSV1 US1-Gegenstück der Direktfrühphase als Spätklassengen reguliert wird (Daten nicht gezeigt).
- Unter Verwendung des Computerprogramms FASTA (Pearson, W. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 (1988)) mit einem K-Tuple-Wert von 1 wurde jede der 9 vorhergesagten Aminosäuresequenzen gegen die NBRF-Protein-Datenbank (Version 21.0, 6/89) durchgesucht und die kürzlich veröffentlichten EHV-4S-Segmentgensequenzen (11). Optimierte FASTA-Markierungen von mehr als 100 wurden im allgemeinen als eine Indikation eines deutlichen Grads einer Aminosäureähnlichkeit angesehen. Die Resultate dieser Analyse sind in Tabelle 2 dargestellt. TABELLE 2 Paarweiser Vergleich von MDV- und Alphaherpesvirus-S-Bestandteilshomologen
- a Existenz eines Homologen unbestimmt.
- b Im Genom ist kein Homolog vorhanden.
- * Die tatsächliche Länge wird etwas abweichen, da ein mögliches Initiationscodon nicht definiert ist.
- ** Unterschiedliche Übereinstimmungen, wenn die Reihenfolge des Vergleichs umgekehrt wird.
- Während SORF1 und SORF2 anscheinend keine signifikante Homologie mit irgendeiner der Sequenzen in der Datenbank (Daten nicht dargestellt) aufweisen, erwiesen sich die anderen sechs ORFs (MDV US1, 10, 2, 6, 7 und 8; Tabellen 1, 2) außer MDV US3 als ausschließlich homolog mit Alphaherpesvirus S-Segmentgenen (Tabelle 2). Da das US3-ORF ein Mitglied der Serin-Threonin-Proteinkinase-Superfamilie darstellt (Hanks, S. K., et al., Science 241:42 (1988)), wurde eine relativ große Zahl von Übereinstimmungen oberhalb von 150 erhalten. Nichtsdestotrotz waren diese Übereinstimmungen 3- bis 4mal geringer als diejenigen, die im Vergleich mit US3-Homologen vofn HSV, PRV und VZV erhalten wurden. Um mit vorher etablierten Alphaherpesvirus-S- Segmenthomologien zu vergleichen, wurden alle möglichen FASTA-Vergleiche zwischen den sieben Gruppen der Alphaherpesvirus-verwandten Sequenzen eingeschlossen. Das Programm GAP wurde in ähnlichen paarweisen Vergleichen verwendet, um optimale Ausrichtungen zu erzeugen, um die Gesamtprozentzahl von identischen und ähnlichen Aminosäuren zu bestimmen, die in beiden Sequenzen gefunden wurden. Wie dargestellt in Tabelle 2 waren Homologievergiche zwischen den MDV-S-Segment- ORFs und ihren Alphaherpesvirus-Gegenstücken vergleichbar mit denjenigen, die früher zwischen den anderen Alphaherpesvirus-S-Segmenthomologen selbst beobachtet wurden. In einigen Fällen stellte sich für MDV-ORFs heraus, daß sie näher mit Alphaherpesvirus-Homologen verwandt waren als eben diese Homologe mit ihren anderen Alphaherpesvirus-Gegenstücken verwandt waren (vergleiche MDV/EHV-4 gegen HSV- 1/EHV-4 US1 und MDV-EHV-4 gegen HSV-1/EHV-4 US10-Homologien). Außerdem, trotz der Tatsache, daß VZV keine US2- und US6-Homologe aufweist, enthält MDV, obwohl es formell als Gammaherpesvirus betrachtet wird, US2- und US6-Homologe. Diese Ergebnisse von limitierten, multiplen Ausrichtungen für alle sieben Homologe, bei denen Bereiche die beste Konservierung zeigen, sind in Fig. 3A dargestellt.
- Punktmatrixhomologieplots, die Gesamthomologien zwischen ausgewählten MDV-Alphaherpesvirus-S-Segment-Homologvergleichen darstellen, sind in Fig. 3B enthalten. (Unter Verwendung einer Gleitfensterlänge von 30 Aminosäuren, in der Punkte erzeugt werden, wo mindestens 15 Aminosäuren sich als identisch oder ähnlich erweisen). Die resultierenden Diagonalen illustrieren die Bereiche, die die größte Konservierung zeigen. Solche Bereiche enthalten und erstrecken sich in einigen Fällen über diese Regionen hinaus, die in Fig. 3A dargestellt sind.
- Sensitivere Versuche, um andere, verwandte Proteine zu identifizieren, die nicht mit FASTA detektiert wurden, wurden unter Verwendung der GCG-Programme PROFILE und PROFILESEARCH durchgeführt. Die Verwendung dieser Programme ermöglicht einen Datenbankvergleich, der auf Informationen beruht, die aus Strukturstudien erhältlich sind und in diesem Fall aus der Information, die sich aus den Ausrichtungen der verwandten S-Bestandteil-ORFs ergibt (einschließlich MDV-Sequenzen unter Verwendung von GAP) (Gribskov, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358 (1987)); nichtsdestotrotz konnten solche Analysen sich nicht auf die Gruppen von verwandten Proteinen, die hier beschrieben wurden, erstrecken.
- Herpesvirusglycoprotein-Homologe haben im allgemeinen ähnliche Muster von konservierten Cysteinresten. Bei einem Vergleich der gB-Homologe von sieben unterschiedlichen Herpesviren, die in den Alpha-, Beta- und Gammaherpesvirus-Subklassen enthalten sind, besteht eine vollständige Konservierung von 10 Cysteinresten (Ross, L. J. N., et al., J. Gen. Virol. 70:1789-1804 (1989)). HSV-1 US6 (gD) enthält 7 Cysteinreste: 6 scheinen kritisch für eine korrekte Faltung zu sein, für die Antigenstruktur und das Ausmaß der Oligosaccharidverarbeitung (Wilcox, W. C., et al., J. Virol. 62:1941-1947 (1988)). Dieses gleiche, allgemeine Muster von Cysteinen ist nicht nur in den gD-Homologen von HSV-2 konserviert (McGeoch, D. J., et al., J. Gen. Virol. 68:19-38 (1987)) und PRV (Petrovskis, E. A., et al., J. Virol. 59:216-223 (1986)), sondern sie sind auch in den MDV-gD-Homologen konserviert (eine volle Ausrichtung ist nicht dargestellt). Die Fig. 3A stellt Teile der Cysteinkonservierungsmuster dar, die bei den US6 (gD), US7 (gI) und US8 (gE)-Homologen beobachtet wurden (in welchem Fall 4, 3 bzw. 6 konservierte Cysteinreste dargestellt sind). Während die MDV, VZV, PREV und EHV-1 US8-Homologe (Audonnet, J.-C., et al., J. Gen. Virol. 71:2969-2978 (1990); Davison, A. J., et al., J. Gen. Virol. 76:1759-1816 (1986); und Petrovskis, E. A., et al., J. Virol. 60:185-193 (1986)) alle ein ähnliches Muster von vier konservierten Cysteinresten nahe ihren Aminoenden zeigen, tragen ihre HSV-1 und -2-Gegenstücke nur zwei von diesen (McGeoch, D. J., J. Gen. Virol. 71:2361-2367 (1990); Daten nicht gezeigt). Es ist durchaus möglich, daß das einzigartige Muster von vier konservierten Cysteinen die Bildung von unterschiedlichen sekundären und tertiären Strukturen erleichtern könnte, die wichtige funktionale Konsequenzen zur Folge haben könnten. Dies könnte durch Ergebnisse reflektiert werden, die zeigen, daß HSV-1 gE eine Fc-Rezeptoraktivität aufweist (Johnson, D. C., et al., J. Virol. 62:1347-1354 (1988)), während ihre PRV- und VZV-Gegenstücke diese nicht aufweisen (Edson, C. M., et al., Virology, 161:599-602 (1987); und Zuckerman, F.A., et al., J. Virol. 62:4622-4626 (1988)).
- Eine gründliche Untersuchung der N-terminalen Bereiche von MDV gD, gI und gE-Homologen hat ergeben, daß sie die drei grundlegenden Bauabschnitte der Signalpeptidsequenzen enthalten: eine basische, positiv geladene N-terminale Region (n-Region), eine zentrale hydrophobe Region (h-Region) und eine stärker polare terminale Region (c-Region), die die Spaltstelle zu definieren scheint (von Heijne, G. J., Mol. Biol. 184:99- 105 (1985)). Unter Verwendung eines kürzlich verbesserten Verfahrens zur Vorhersage von Signalsequenzspaltstellen (von Heijne, G. Nucl. Acids Res. 14:4683-4690 (1986)) zeigt Tabelle 3 die wahrscheinliche Position dieser Stelien, die Lokalisierung der hydrophoben, transmembranen und geladenen Cytoplasmadomanen nahe dem C-terminalen Ende und die Lokalisierung von potentiellen N-Glycosylierungsstellen.
- Tabelle 3 zeigt MDV US-Glycoproteindaten über vorhergesagte Signalpeptidspaltstellen und Lokalisierungen von Transmembran- und Cytoplasmadomänen und potentiellen N- Glycosylierungsstellen (im Hinblick auf das ATG-Initiationscodon). TABELLE 3
- Wie die anderen gI-Homologe enthält das Gegenstück von MDV eine relativ lange Cytoplasmadomäne. Jedoch im Gegensatz zu anderen gD-Homologen enthält das Signalpeptid von MDV gD eine relativ lange n-Region (18 Reste), die ungewöhnlich hoch geladen ist (+4; Fig. 2), wenn man den gesamten Mittelwert von +1,7 bei Eukaryonten in Betracht zieht, der in der Regel nicht mit der Länge variiert (von Heijne, G., J. Mol. Biol. 184:99-105 (1985)). Obwohl ein distaleres Methionincodon direkt vor dem Startcodon existiert (wie in dem PRV gD-Homolog, Petrovskis, E. A., et al., J. Virol. 59:216-223 (1986)) bevorzugt das Scanning-Modeil für die Translation (Gribskov, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358 (1987)) die Verwendung des mehr 5- proximal gelegenen Startcodons (bei Position 5964, Fig. 2). Weitere Unterstützung für diese Theorie basiert auf einem Gesamttranslationskontext, der mindestens so gut wie derjenige zu sein scheint, der mit dem stromabwärts gelegenen ATG korrespondiert, wenn nicht noch besser. Trotz einer solchen Vorhersage kann eine mögliche mRNA cap-Stellenlokalisierung zwischen den beiden ATG-Stellen an dieser Stelle nicht ausgeschlossen werden, was eine solche Vorhersage ausschließen würde.
- Ein weiterer Punkt, der das MDV gD betrifft, soll erwähnt werden. Unter Verwendung der 10.350-Nukleotid-DNA-Sequenz als Sonde für eine Durchsicht der Genbank (62.0, 12/89) und EMBL (19.0, 5/89)-Nukleinsäuredatenbanken mit dem Computerprogramm FASTA (K-tuple=6) wurden eine optimierte Übereinstimmung von 1027, korrespondierend mit 92,5% Nukleotididentität in einem 342 bp überlappenden Stück zwischen MDV gd-Kodierungssequenzen (6479-6814; aa#173-aa#284; Fig. 2) und ein vorher erwähntes 467 bp MDV-DNA-Segment gefunden (Wen, L.-T., et al., J. Virol. 62:3764-3771 (1988)). Von der letzteren Sequenz wurde berichtet, daß sie ein 60 bp-Segment enthält, das gegen eine DNAse-Verdauung durch Bindung eines 28kD MDV-Nuklearantigens (MDNA) geschützt ist, das nur in "latent" infizierten MDV-transformierten Lymphoblastzellen exprimiert wird. Im Hinblick auf die Ähnlichkeiten zwischen MDV und VZV schlugen diese Autoren vor, daß MDNA in einer Weise funktionieren kann, die analog ist mit der von EBNA-1 in immortalisierten Primatenzellen. In ihrem Bericht kartierten Wen et al. (Wen, L.-T., et al., J. Virol. 62:3764-3771 (1988)) die MDNA-Bindungsstelle an dasselbe EcoRI-Subfragment von BamHI-A, in dem MDV gD lokalisiert ist (EcoRI-I, Fig. 1). Obwohl unsere Sequenz, die diese Region enthält, mit einem vollständigen, nicht unterbrochenen ORF übereinstimmt, das alle charakteristischen Merkmale eines Glycoproteins enthält und eine signifikante Homologie mit HSV gD zeigt, enthält ihre Sequenz ungefähr 140 Basen einer 5'-proximalen Sequenz, die nicht mit irgendeiner bestimmten Sequenz aus unserem 5,3 kbp EcoR1-I-Fragment oder ihren benachbarten 3,5 kb-Sequenzen verwandt ist. Die verbleibende 327 bp-Sequenz (die die vermutliche nukleare Antigen-Bindungsstelle enthält) zeigt nach Computertranslation kein ORF von mehr als 30 aa, obwohl sie unserer gD-Kodierungssequenz deutlich ähnelt.
- Die Daten der letzten Zeit haben gezeigt, daß trotz einer Klassifizierung von MDV als Gammaherpesvirus, basierend auf lymphotropen Eigenschaften, die es mit anderen Mitgliedern dieser Subfamilie teilt, seine Genomstruktur (Cebrian, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:555-558 (1982); und Fukuchi, K, et al., J. Virol. 51:102-109 (1984)) und genetische Organisation von im wesentlichen seiner UL-Region (Buckmaster, A. E., et al., J. Gen. Virol. 69:2033-2042 (1988)) eher den neurotropen Alphaherpesviren ähnelt. Außerdem, in Fällen, in denen Polypeptidsequenzen als konserviert unter den drei Herpesviren-Subfamilien gefunden wurden (z.B. UL-Gene), wurden signifikant höhere Homologieübereinstimmungen ständig gegen die jeweiligen Alpha- anstelle der Beta- oder Gammaherpesviren-Gegenstücke beobachtet (Davison, A. J., et al., J. Gen. Virol. 67:597-611 (1986); Buckmaster, A. E., et al., J. Gen. Virol. 69:2033-2042 (1988); Ross, L. J. N., et al., J. Gen. Virol. 70:1789-1804 (1989); und Scott, S. D., et al., J. Gen. Virol. 70:3055-3065 (1989)). Für Alphaherpesvirus-S-Segmentgene wurde früher festgestellt, daß sie einzigartig für Mitglieder dieser taxonomischen Subfamilie sind (Davison A. J., et al., J. Gen. Virol. 68:1067-1079 (1987); und Davison, A. J., et al., J. Gen. Virol. 67:597-611 (1986)). Die Identifizierung von sieben MDV-Homologen von Alphaherpesvirus-S-Segmentgenen in dieser Studie stimmt mit der Idee überein, daß MDV eine engere evolutionäre Beziehung mit Alphaherpesviren teilt als mit Gammaherpesviren. Dies wird weiterhin durch die DiNukleotidfrequenzanalyse unterstützt, die keinen Mangel an einer CpG-Suppression zeigt, wie beobachtet bei allen Gammaherpesviren, die soweit untersucht wurden (Efstathiou, S., et al., J. Gen. Virol. 71:1365-1372 (1990); und Honess, R. W., et al., J. Gen. Virol. 70:837-855 (1989)). Die oben dargestellte Situation ähnelt einer ähnlichen, die bei menschlichem Herpesvirus-6 (HHV-6) beobachtet wurde, in welchem Fall der T-Lymphotropismus eine vorläufige Klassifizierung als Gammaherpesvirus nahelegte (Lopez, C., et al., J. Infect. Dis. 157:1271-1273 (1988)). Jedoch zeigte eine nachfolgende genetische Analyse eine größere Verwandtschaft zwischen HHV-6 und dem Betaherpesvirus, dem menschlichen Cytomegalievirus (HCMV; Lawrence, G. L., et al., J. Virol. 64:287-299 (1990)).
- Ein Vergleich der genetischen Organisation der Alphaherpesvirus-S-Segmentgene ist in Fig. 4 dargestellt. Die Organisation dieser Gene variiert in einigen Fällen deutlich in der Gesamtlänge, der Organisation und dem Homologiegrad. Nichtsdestotrotz stimmen die Gesamtgendarstellungen, die dargestellt sind, mit einem Modell überein, das für die Divergenz der Alphaherpesviren von einem gemeinsamen Vorfahren durch eine Anzahl von homologen Rekombinationsereignissen spricht, die zu einer Expansion oder Kontraktion der Insertionssequenzwiederholungsregionen und einem damit verbundenen Verlust oder Gewinn an (einem) US-Gen(en) einhergeht. Im Fall von VZV fehlen sechs S-Segmenthomologe im Vergleich mit HSV-1 (US2, US4, US5, US6, US11, US12). Einige Gene, wie z.B. die US1-Homologe, zeigen besondere Sequenz- und Längenabweichungen. Verglichen mit HSV-1 fehlt den MDV-, VZV- und EHV-4-US1- Homologen ungefähr 120 aa der Sequenz, die vergleichbar ist mit dem 5'-proximalen Bereich von HSV-1 US1 (Alpha 22). Basierend auf einer Northern-Blot-Analyse, einer S1-Nuclease-Schutzanalyse und Phosphonoessigsäureinhibitionsstudien scheint das MDV-US1-Gen im Gegensatz zu seinem relativ uncharakterisierten HSV-1-Gegenstück der Direktfrühphase als ein stark exprimiertes Spätphasen-Gen reguliert zu sein (Daten nicht dargestellt). Im Gegensatz zu den anderen Alphaherpesviren enthält MDV zwei anscheinend MDV-spezifische ORFs. Außerdem scheint die MDV-US-Region ungefähr 2,6 bis 4,0 kb von zusätzlichen 5'-proximalen Sequenzen zu enthalten. Basierend auf einem Vergleich von Fig. 4 und einer Betrachtung des Expansions-Kontraktions- Rekombinationsschemas scheint es wahrscheinlich zu sein, daß es zusätzliche MDV- spezifische US-Gene gibt.
- Da MDV lange als Gammaherpesvirus betrachtet wurde, stützte sich ein Großteil der früheren Arbeit, die seine Eigenschaften untersuchte, auf Analogie mit der Assoziation zwischen EBV und B-Zellen (Nonoyama, M., S. 333-341. In B. Roizman (Hrsg.), The herpesviruses, Bd. 1. Plenum Press (1982); und Wilbur, W. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730 (1983)). Aufgrund einer näheren genetischen Verwandtschaft mit den Alphaherpesviren und wenn man sich an die Analyse des obigen HHV-6 erinnert, stimmen wir mit Lawrence et al. überein (Lawrence, G. L., et al., J. Virol. 64:287-299 (1990)), daß die lymphotropen Eigenschaften von MDV und HVT vermutlich nicht von Molekülen bestimmt werden, die homolog mit EBV sind und daß eine Abgrenzung von molekularen Unterschieden zwischen MDV und den neurotropen Alphaherpesviren mehr Ergebnisse bringen würde bei der Erklärung der beobachteten biologischen Unterschiede als die Anwendung von Analogien, basierend auf Eigenschaften von Gammaherpesviren, wie z.B. EBV und HVS.
- Um solche Unterschiede zu erklären, kann die MDV-US-Region besonders wichtig sein. Mit einigen Ausnahmen besitzt jedes HSV-1-L-Bestandteilsgen ein Äquivalent in VZV (McGeoch, D. J., et al., J. Gen. Virol. 69:1531-1574 (1988)); eine bemerkenswerte Anzahl von diesen sind außerdem mit Beta- und Gammaherpesvirusgenen ebenfalls verwandt (29 von 67 EBV-Gegenstücken zu VZV-UL-Genen; Davison, A. J., et al., J. Gen. Virol. 68:1067-1079 (1987)). Demgegenüber unterscheiden sich die S-Segmente von HSV-1 und VZV signifikant in ihrer Größe und scheinen unter den am wenigsten verwandten Teilen der beiden Genome zu sein (Davison, A. J., et al., J. Gen. Virol. 67:597- 611 (1986); und Davison, A. J., et al., J. Gen. Virol. 64:1927-1942 (1983)). Kürzliche Studien haben gezeigt, daß 11 von 12 offenen Leserahmen, die in dem HSV-1-S-Bestandteil enthalten sind, für das Wachstum in Zellkultur vernachlässigbar sind (Longnecker, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4303-4307 (1987); und Weber, P. C., et al., Science 236:576-579 (1987)). Der Erhalt und die Evolution von solchen entbehrlichen Gen-Clustern legt die Gegenwart von Funktionen nahe, die für das Überleben des Virus in seiner spezifischen ökologischen Nische in einem natürlichen oder Labortier-Wirt notwendig sind, anstelle einer Gegenwart von Funktionen, die für eine Replikation notwendig sind (Longnecker, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4303- 4307 (1987); und Weber, P. C., et al., Science 236:576-579 (1987)). Übereinstimmend mit einer solchen Hypothese sind Feststellungen, daß HSV-Mutanten, die unterschiedliche S-Komponenten genspezifischer Deletionen tragen, sehr viel weniger pathogen waren und eine reduzierte Fähigkeit für eine Latenzentstehung in Mäusen zeigten (Meignier, B., et al., Virology 162:251-254 (1988)). Im Hinblick auf das letztere gibt es Beweise, die nahelegen, daß die RNA, die von der HSV-US-Region transkribiert wird, in dem Aufbau und dem Erhalt eines in vitro-Latenzsystems involviert ist, daß menschliche Fötuslungenfibroblastenzellen verwendet (Scheck, A. C., et al., Intervirology 30:121-136 (1989)). Wenn man all dies in Betracht zieht, legen die obigen Beweise nahe, daß die MDV-US-Gene beim Gewebetropismus, der Latenz und/oder der Induktion einer Zelltransformation eine wichtige Rolle/wichtige Rollen spielen.
- Eine Betrachtung der drei gD-, gI- und gE-Homologe, die in dieser Erfindung identifiziert wurden, führt zu zwei anderen relevanten Fragen im Hinblick auf einer späteren Impfstoffentwicklung. Die 11-HSV-1-US-Region-Gene, die für das Wachstum in Gewebekultur wie oben beschrieben nicht notwendig sind, umfassen HS-1 US7 (gI) und US8 (gE) (Longnecker, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4303-4307 (1987); und Weber, P. C., et al., Science 236:576-579 (1987)). Wenn man annimmt, daß die MDV-Homologe dieselben Eigenschaften aufweisen, können diese Gene nützlich als Stellen für eine Insertion von Fremdgenen sein. Außerdem können die zwei selben MDV-Homologe und insbesondere US8 (gE) sehr wahrscheinlich in den oben eingeführten, auf die Pathogenität bezogenen Fragen, involviert sein. Insbesondere das HSV-gE scheint eine Rolle bei der Fähigkeit von HSV-1 zu spielen, letale Infektionen und eine Latenz in Mäusen zu erzeugen (Meignier, B., et al., Virology 162:251-254 (1988)). Weiterhin spielen die gI- und gE-Homologe von PRV bei Schweinen eine deutliche Rolle bei der PRV-Virulenz für 1 Tag alte Hühner und junge Schweine (Mettenleiter, Thomas C., et al., Journal of Virology, S. 4030-4032 (Dez. 1987)). Angenommen, daß dasselbe für die MDV-US7- (gI) und -US8- (gE) Homologe gilt, könnte es möglich sein, eins oder beide dieser Gene aus sehr virulenten MDV-Isolaten zu inaktivieren, die einen Krankheitsausbruch auslösen, der durch zur Zeit bekannte Impfstoffe nicht verhindert werden kann, und dadurch abgeschwächte Impfstoffviren zu erzeugen, die mit den Feldviren näher verwandt sind, die den Ausbruch der Krankheit verursachen.
- Eine weitere Betrachtung der drei (gD, gI und gE) Homologe, die in dieser Erfindung identifiziert wurden, führt zu einer weiteren interessanten Frage. Von vollständig umhüllten, infektiösen MDV-Virionen ist nur bekannt, daß sie in Federfollikel-Epithelialzellen produziert zu werden (Payne, L. N., S. 347-431: In B. Roizman (Hrsg.), The herpesviruses, Bd. 1, Plenum Press (1982)). Aufgrund dieser Tatsache mußten sich MDV-Studien auf limitierte Fibroblastenzellkulturen beziehen, die nur in vitro die Verbreitung von Zell- assoziierten Infektionen unterstützen. In den letzten 20 Jahren verließen sich die Studien, die auf die Identifizierung von immunogenen Oberflächenantigenen gerichtet waren, auf dieses in vitro-Kultursystem und insgesamt wurden nur zwei Glycoprotein-Antigene (A-Antigen/gC-Homolog; B-Antigen) routinemäßig identifiziert und charakterisiert (Binns, M. M., et al., Virus Res. 12:371-382 (1989); Coussens, P. M., et al. J. Virol. 62:2373-2379 (1988); Isfort, R. J., et al., J. Virol. 59:411-419 (1986); Isfort, R. J., et al., J. Virol. 57:464-474 (1986); und Sithole, I., et al., J. Virol. 62:4270-4279 (1988)). Dies ist eine Tatsache trotz der Entdeckungen von drei MDV-gD-, -gI- und -gE-Homologen gemäß der vorliegenden Erfindung und zwei zusätzlichen Glycoprotein-Homologen (gB und gH, Buckmaster, A. E., et al., J. Gen. Virol. 69:2033-2042 (1988); und Ross, L. J. N., et al., J. Gen. Virol. 70:1789-1804 (1989)). Während Immun-Hühnerseren (ICS) von natürlich infizierten Vögeln vermutlich mit vielen, wenn nicht allen, MDV-kodierten Oberflächenantigenen reagieren, würden solche komplexen polyklonalen Seren nur nützlich in einem Ausmaß sein, in dem die Antigenexpression/-verarbeitung in halbproduktiven Zellkulturen derjenigen in Federfollikel-Ephitelialzellen ähnelt. Eine Northern-Blot-Analyse unter Verwendung von MDV-gD-spezifischen Sonden legt nahe, daß MDV-gD- mRNA entweder in DEF-Zellen zu einem Zeitpunkt, wenn extensive cytopathische Effekte beobachtet werden (Daten nicht dargestellt) entweder nicht exprimiert oder nur gering exprimiert wird. Im Lichte der Tatsache, daß VZV kein gD-Homolog aufweist und stark zellassoziiert ist, wird es interessant sein, festzustellen, ob der Block in der MDV- Virionbildung in primären Vogelfibrobastenzellen mit einem Mangel an Expression (in diesen Zellen) eines Glycoproteins, wie z.B. gD, und/oder (irgendeinem) anderen S- Komponenten-Gen(en) korreliert.
- Da der Schutz gegen MD, der durch abgeschwächte MDV-Stämme (Serotyp 2) oder HVT (Serotyp 3) verliehen wird, eine immunologische Basis zu haben scheint, besteht ein deutliches Interesse an der Identifizierung von gemeinsamen Antigenen. Im Hinblick auf diese Erfindung, die sieben MDV-US-Homologe zu US-Genen von HSV identifiziert (wobei der letztere deutlich weniger mit MDV als mit HVT verwandt ist), würde es überraschend sein, wenn sich der vorherige Bericht, der einen Mangel an Homologie zwischen MDV-HVT-US-Regionen zeigt (Igarashi, T., et al., Virology 157:351-358 (1987)), als richtig erweisen würde. Solche negativen Ergebnisse können die Begrenzungen wiederspiegeln in bezug auf Homologieschätzungen, basierend auf Hybridisierung, anstelle von Sequenzanalysestudien.
- Beispiel 2 zeigt die molekulare Klonierung eines Konstrukts, das DNA enthält, die das gesamte MDV-US7- (gI) Gen und einen Teil des MDV-US8- (gE) Gens kodiert. Wie sich zeigen wird, kann dies unter Verwendung von DNA-Segmenten erreicht werden, die das gI und einen Teil der gE-Kodierungsregion enthalten.
- Die Konstruktion eines rekombinanten Klons (pKS-MDgI1.59), das die gesamte MDV- US7-(gI)-Kodierungssequenz und einen Teil der MDV-US8-(gE)-Kodierungssequenz enthält, benötigt zwei bereits existierende MDV-Klone, pKS-MDgD1,75 und p19P1 (Fig. 5). pKS-MDgD1,75 ist ein rekombinantes Plasmid, das das 1,75 kbp NcoI-SstII-Subfragment von MDV EcoRI-I, ligiert in die SmaI-Sst-II-Stelle des Klonierungsvektors, pBluescript KS-, enthält. Dieser Klon enthält die gesamte MDV-US6-(gD)-Kodierungssequenz und zusätzliche Sequenzen am 3'-Ende, die für die ersten 39 Aminosäuren (aa) von MDV-gI kodieren. p19P1 ist ein rekombinantes Plasmid, das das 1,5 kbp BamHI-P&sub1;-Subfragment von MDV, kloniert in die einzigartige BamHI-Stelle von pUC19, enthält. Dieser Klon enthält die gesamte MDV-gI-Kodierungssequenz, außer den ersten 9 aa der Signalsequenz. Zusätzlich enthält p19P1 am 3'-Ende die ersten 104 aa der MDV-US8-(gE)-Kodierungsregion.
- Um pKS-MDgI1,59 zu erzeugen, wird pKS-MgD1,75 zunächst mit HincII geschnitten, das einmal in der multiplen Klonierungsstelle des pBluescript-Vektors schneidet und einmal ungefähr 180 bp stromaufwärts des SstII-Terminus des Inserts. Dies führt zu zwei Fragmenten: ein Fragment (1,6 kbp) besteht hauptsächlich aus den Insertsequenzen, die MDV US6 (gD) kodieren; das größere Fragment (3,1 kbp) besteht aus pBluescript-Vektorsequenzen, zusätzlich zu ungefähr 180 bp, die das N-terminale Ende von MDV gI kodieren. Das 3,1 kbp-Fragment wird mit einem Gel gereinigt und durch die zwei HincII-Enden selbst ligiert. Das resultierende rekombinante Plasmid, pKS-MDgI0,18 wird dann mit SstI geschnitten (an der multiplen Klonierungsstelle, genau stromabwärts von der SstII-Stelle). Vor der folgenden Verdauung mit SstII wird das klebrige SstI-Ende mit T4 DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen. Das resultierende 3,1 kbp SstII-SstI- Fragment (mit glatten Enden) von pMDgI0,18 wird über ein Gel gereinigt und in dem finalen Ligierungsschritt zur Erzeugung von pKS-MDgI1,59 verwendet. Während die enzymatischen Manipulationen von pKS-MDgD1,75 und pKS-MDgI0,18 stattfinden, wird p19P1 mit HindIII geschnitten, das direkt stromabwärts von der Teil-MDV-US8-(gE)-Kodierungssequenz an der multiplen Klonierungsstelle von pUC19 schneidet. Vor einer Verdauung mit SstIId werden die klebrigen HindIII-Ende unter Verwendung des Klenow-Fragments mit glatten Enden versehen. Das kleinere SstII-HindIII-Fragment (1,4 kbp) mit glatten Enden enthält einen Hauptteil der MDV-US7-(gI)-Kodierungssequenz zusätzlich zu 312 Nukleotiden am 3'-Ende, die für das 5'-Ende von MDV gE kodieren. Dieses 1,4 kbp SstII-HindIII-Fragment mit glatten Enden wird über ein Gel gereinigt und mit dem 3,1 kbp SstII-SstI-Fragment mit glatten Enden von pKS-MDgD0,18 ligiert. Das resultierende rekombinante Plasmid pKS-MDgI1,59 enthält die komplette Kodierungssequenz für MDV gI und einen Teil der n-terminalen gE-Kodierungssequenz. Die Verdauung von pKS-MDgI1,59 mit KpnI ergibt zwei Fragmente; das kleinere 1,15 kbp- Fragment enthält die komplette Kodierungssequenz für MDV gI.
- Beispiel 3 zeigt die molekulare Subkonierung eines Konstrukts, das das vollständige MDV-US8-(gE)-Gen enthält.
- Die Konstruktion eines rekombinanten Klons (p18-MDgE2,53), das die gesamte MDV- US8-(gE)-Kodierungssequenz enthält, benötigt einen Clon, der sich von den BamHI- oder EcoR1-Klonen, die vorher verwendet wurden, unterscheidet. Der GA-Stammklon GA-02, ein EMBL-3-Klon, der ein teilweise verdautes MDV SalI-Insert enthält, das BamHI-A, -P1 und zusätzliche 5'- und 3'-Flankierungssequenzen enthält (freundlicherweise von P. Sondermeier zur Verfügung gestellt, Intervet Intl. B. V., Boxmeer, Niederlande), wurde verwendet, um die Analyse 3' von den EcoR1-I- und BamHI-P1-Fragmenten auszudehnen. Kleinere SalI-Subfragmente, die am 3'-Ende dieses Phagenklone-MDV-Inserts lokalisiert waren, wurden mit einem Gel gereinigt und mit pUC18 ligiert, das mit SalI linearisiert worden war (pSP18-A, pSP18-B und pSP18-C, Fig. 1B). Der pUC18-Subklon, pSP18-A, enthält die gesamte MDV-US8-(gE)-Kodierungssequenz und wird als p18-MDgE2,53 für ATCC-Hinterlegungszwecke bezeichnet.
- Tabelle 4 zeigt die Aminosäuren mit sowohl ihren Einzelbuchstaben- als auch ihren Drei-Buchstaben-Symbolen. TABELLE 4
- Wenn die DNA-Segmente, die für die Glycoproteine gI und gE kodieren, durch Insertions-, ortsgerichtete oder Deletions-Mutagenese verändert werden, kann die Pathogenität des MDVs reduziert werden. Auch können die DNA-Segmente, die für die nicht-essentiellen gI und gE kodieren, als Insertionsstellen für Segmente von Fremd-DNA verwendet werden, die Proteine kodieren, die als Antigene aktiv sind zum Zweck einer Produktion von rekombinantem Impfstoff.
- Das Gen für MDV US6 (MDV gD) wurde in einem Plasmid (Phagemid) pKS-MDgD1,75 als ATCC 40855 bei The American Type Culture Collection, Rockville, MD, 20852, USA, hinterlegt.
- Das Gen für MDV US7 (MDV gI) wurde in einem Plasmid (Phagemid) pKS-MDgI1,59 als ATCC 75040 bei The American Type Culture Collection, Rockville, MD, 20852, USA, hinterlegt.
- Das Gen für MDV US8 (MDV gE) wurde in einem Plasmid p18-MDgE 2,53 als ATCC 75039 bei The American Type Culture Collection, Rockville, MD, 20852, USA, hinterlegt.
- Anbei sind Sequenzdaten für die Sequenz-ID-Nummern 1, 2 und 3, wie vorher in der Anmeldung beschrieben, beigefügt.
- (i) Anmelder: Leland F. Velicer, Peter Brunovskis und Paul Coussens
- (ii) Titel der Erfindung: DNA-Segment des Herpesvirus der Marek-Krankheit, welches für die Glycoproteine gD, gI und gE kodiert
- (iii) Anzahl der Sequenzen: 3
- (iv) Korrespondenzadresse:
- (A) Adressat: Ian C. McLeod
- (B) Straße: 2190 Commons Parkway
- (C) Stadt: Okemos
- (D) Bundesstaat: Michigan
- (E) Kreis: Ingham
- (F) Plz: 48864
- (v) Computerlesbare Form:
- (A) Art des Mediums: 3 1/2"-Diskette, 1,44 MB
- (B) Computer: IBM PS2, Modell 50
- (C) Betriebssystem: MS-DOS 5.0
- (D) Software: PC-Write 3,02
- (viii) Information über den Anwalt/Agenten:
- (A) Name: Ian C. McLeod
- (B) Registrationsnr.: 20.931
- (C) Referenz/Docket-Nummer: MSU 4.1-132
- (ix) Telekommunikationsinformation:
- (A) Telefon: (517) 347-4100
- (B) Telefax: (517) 347-4103
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Lange: 10.350 Basenpaare
- (B) Art: Nucleinsäure
- (C) Strangtyp: doppelt
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekulare Art: genomische DNA
- (iii) HYPOTHETISCH: ja
- (v) GEGENSINN: Nein
- (vi) URSPRUNGSQUELLE:
- (A) Organismus: MDV, GA-Stamm
- (vii) DIREKTE QUELLE:
- (A) Bibliothek: genomisch
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 1:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 10.350 Basenpaare
- (B) Art: Nucleinsäure
- (C) Strangtyp: doppelt
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekulare Art
- (A) Beschreibung: genomische DNA
- (iii) HYPOTHETISCH: ja
- (iv) GEGENSINN: ja
- (vi) URSPRUNGSQUELLE:
- (A) Organismus: MDV, GA-Stamm
- (vii) DIREKTE QUELLE:
- (A) Bibliothek: genomisch
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 2:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 497 Aminosäuren
- (B) Art: Peptid
- (C) Strangtyp: einzeln
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekulare Art:
- (A) Beschreibung: Polypeptid
- (vi) URSPRUNGSQUELLE:
- (A) Organismus: MDV, GA-Stamm
- (vii) DIREKTE QUELLE:
- (A) Bibliothek: genomisch
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 3:
Claims (10)
1. DNA-Segment mit einem Gen, das den MDV-Glycoprotein E (gE) Vorläufer
kodiert, lokalisiert zwischen den Nukeotiden 8488 und 9978 der DNA-Sequenz des
Herpes-Virus der Marek-Krankheit und identifiziert als Teil von SEQ ID Nr. 1 und
enthaltend potentielle Promotorsequenzen bis zu 400 Nukeotiden 5' vom Gen
und Subfragmente der DNA, die die DNA selektiv erkennen, wenn sie in Form
einer Sonde vorliegen.
2. Das Segment des Anspruchs 1, worin
das kodierte Glygoprotein 497
Aminosäuren enthält.
3. Glygoprotein gE-Vorläufer, der folgendes umfaßt;
4. Verfahren zur Reduktion der Pathogenität oder Virulenz eines Herpesvirus der
Marek-Krankheit, wodurch ein Gen, welches für das Glycoprotein E kodiert,
verändert wird.
5. Verfahren zur Erzeugung eines Virusvektorimpfstoffes, zur Verwendung in vivo,
oder eines in vitro-Expressionsvektors für ein Protein, das Antikörper gegen die
Marek-Krankheit erzeugt, umfassend den Schritt der Insertion eines
DNA-Segments in den Impfstoff oder den Vektor, das das gesamte oder ein Teil des Gens
enthält, das für das Glycoprotein gE des Herpesvirus der Marek-Krankheit
kodiert.
6. Verfahren, um fremde Gene in einem Herpesvirus der Marek-Krankheit
bereitzustellen, das die Insertion des fremden Gens in eine Region der DNA des
Herpes-Virus umfaßt, die für das nicht essentielle Protein gE kodiert.
7. DNA-Segment mit einem Gen, das für einen Teil des MDV-Glycoprotein E (gE)-
Vorläufers kodiert, der zwischen den Nukeotiden 8488 und 8799 der
DNA-Sequenz des Herpesvirus der Marek-Krankheit lokalisiert ist und als Teil der SEQ ID
Nr. 1 identifiziert ist und der gegebenenfalls einen 5'-Regulatorbereich enthält,
wobei das Gen bis zu 400 bp Länge aufweist, wie dargestellt in Fig. 2 und
Subfragmente der DNA, die die DNA selektiv erkennen, wenn sie in Form einer
Sonde vorliegen.
8. Glycoprotein gE-Vorlaufer, der folgendes umfaßt:
9. 5'-Regulatorbereich für das Glycoprotein gE, das zwischen den Nukleotiden 8088
und 8487 der Sequenz, wie dargestellt in Fig. 2, lokalisiert ist.
10. Sonde, die das DNA-Segment gemäß Anspruch 1 selektiv erkennt.
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