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DE69033311T2 - Nukleotid-Sequenzen des Genoms von Retroviren vom Typ HIV-1, HIV-2 und SIV, ihre Verwendungen zur Amplifikation dieser Genome und in-vitro-Diagnose dieser viralen Infektionen - Google Patents

Nukleotid-Sequenzen des Genoms von Retroviren vom Typ HIV-1, HIV-2 und SIV, ihre Verwendungen zur Amplifikation dieser Genome und in-vitro-Diagnose dieser viralen Infektionen

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Publication number
DE69033311T2
DE69033311T2 DE69033311T DE69033311T DE69033311T2 DE 69033311 T2 DE69033311 T2 DE 69033311T2 DE 69033311 T DE69033311 T DE 69033311T DE 69033311 T DE69033311 T DE 69033311T DE 69033311 T2 DE69033311 T2 DE 69033311T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
hiv
gene
nucleic acid
sequence
virus
Prior art date
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Application number
DE69033311T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69033311D1 (de
Inventor
Maurice Moncany
Luc Montagnier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Pasteur
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Pasteur
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Publication date
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Priority claimed from FR8912371A external-priority patent/FR2652091B1/fr
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    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Oligonucleotidsequenzen, welche zur Durchführung von Techniken zur Amplifikation von Nucleotidsequenzen verwendbar sind, die spezifisch für Immundefizienz-Retroviren vom Typ HIV oder Affen-Immundefizienz-Retroviren vom Typ SIV sind.
  • Die Erfindung betrifft insbesondere die Anwendung dieser Sequenzen für in vitro Diagnostikverfahren am Menschen auf Infektion eines Individuums durch einen Retrovirus vom Typ HIV (tatsächlich HIV- 1 und/oder HIV-2).
  • Die Isolierung und Charakterisierung von Retroviren, die unter der Bezeichnung HN-1 und HIV-2 neu gruppiert sind, wurden in den Europäischen Patentanmeldungen 85 905 513.9 bzw. 87 400 151.4 beschrieben. Diese Retroviren wurden bei verschiedenen Krankheiten isoliert, welche Symptome einer Lymphadenopathie bzw. Lymphknotenschwellung oder eines erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) zeigen.
  • Die Retroviren vom Typ HIV-2 kennzeichnen sich wie die Retroviren vom Typ HIV-1 durch einen Tropismus für die humanen T4-Lymphozyten und durch einen cytopathogenen Effekt hinsichtlich dieser Lymphozyten, wenn sie sich vermehren, um dann unter anderem generalisierte oder persistente Polyadenopathien oder eine AIDS-Erkrankung zu verursachen.
  • Ein weiterer Retrovirus, genannt SIV-1, wobei diese Bezeichnung die bekannte ältere Bezeichnung STLV-III ersetzt, wurde am Rhesus-Makakenaffen isoliert (M. D. DANIEL et al., Science, 228, 1201 (1985); N. L. LETWIN et al., Science, 230, 71 (1985) unter der Bezeichnung "STLV-IIImac").
  • Ein weiterer Retrovirus, bezeichnet "STLV-IIIAGM" (oder SIVAGM) wurde bei wilden Grünaffen isoliert. Aber im Unterschied zu den Viren, die bei den Rhesus-Makakenaffen vorhanden sind, scheint die Gegenwart von STLV-IIIAGM nicht eine Krankheit vom Typ AIDS bei den afrikanischen Grünaffen zu induzieren.
  • Zur Vereinfachung der Sprache werden diese Viren im folgenden nur mehr mit dem Ausdruck SIV bezeichnet (der Ausdruck S1V ist die englische Abkürzung von "Simian Immunodeficency Virus" (Affenimmundefizienzvirus)), gegebenenfalls gefolgt durch eine Abkürzung, welche die Affengattung bezeichnet, von denen sie erhalten werden, beispielsweise "MAC" für den Makaken oder "AGM" für den afrikanischen Grünaffen (Abkürzung von "African Green Monkey").
  • Ein Stamm bzw. eine Linie des Retrovirus SIV-1Mac wurde bei C. N. C. M. am 7. Februar 1986 unter der Nr. I-521 hinterlegt.
  • Die Verfolgung der Studien der Retroviren HIV-1 und HIV-2 haben auch zum Erhalten von komplementären DNA-Sequenzen (cDNA) von RNA ihres Genomes geführt. Die vollständige Nucleotidsequenz einer cDNA eines für die Klasse HIV-2 (HIV-2 ROD) repräsentative Retrovirus wurde am 21. Februar 1986 bei C. N. C. M. unter der Nr. I-522 unter dem Bezugsnamen LAV-2 ROD hinterlegt.
  • Gleichermaßen ist die vollständige Nucleotidsequenz einer cDNA eines für die Klasse HIV-1 repräsentativen Retrovirus durch Wain Hobson, Sonigo, Cole, Danos et Alizon in Cell (Januar 1985) beschrieben.
  • Auch werden zur Vereinfachung der Sprache die Viren vom Typ HIV-1 und HIV-2 manchmal im folgenden durch den Ausdruck HIV bezeichnet werden.
  • Die Verfahren der in vitro Diagnostik von Infektionen durch Viren vom Typ HIV-1 oder HIV-2, welche derzeit bestehen, erfordern das Auffinden von Anti-HIV-1- oder Anti-HIV-2-Antikörpern, welche gegebenenfalls in einer biologischen (Probe-)Entnahme (Biopsie) oder einer biologischen Flüssigkeit, beispielsweise in einem von einem zu untersuchenden Patienten erhaltenen Serum, enthalten sind, indem diese biologische Flüssigkeit mit Extrakten oder Antigenen von HIV-1 oder HIV-2 unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, welche die Produktion einer möglichen immunologischen Reaktion dieser Extrakte oder Antigene mit diesen Antikörpern ermöglichen.
  • Derartige Diagnostikverfahren können falsch negativ sein, insbesondere im Falle einer sich im Anfangsstadium befindlichen Infektion eines Individuums durch Gen-Amplifikationstechniken.
  • Die Gen-Amplifikationstechniken sind ein beträchtlicher Beitrag für das Fokussieren von in vitro Diagnostikverfahren, welche insbesondere empfindlich auf virale Erkrankungen sind. Unter diesen Gen- Amplifikationstechniken kann man die PCR-Technik (Polymerase Chain Reaction), wie sie in den Europäischen Patentanmeldungen 86 302 298.4 vom 27. März 1986 und 87 300 203.4 vom 9. Januar 1987 oder auch die "Qßreplicase" genannte Technik, die in Biotechnology, Bd. 6, Seite 1197 (Oktober 1988) beschrieben ist, und jene, welche mit Hilfe einer RNA-Polymerase verlaufen (T7RNA-Polymerase), beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung WO89/01050, erwähnen. Diese Techniken ermöglichen es, die Nachweisempfindlichkeit von Virus-Nucleinsäuren zu verbessern und erfordern die Verwendung von spezifischen Synthesestartern.
  • Für die Untersuchung von Viren vom Typ HIV ist die Auswahl der Anfangsstücke problematisch. Tatsächlich kann aufgrund der großen Vielfalt von Nucleotidsequenzen des viralen Genoms, ein Anfangsstück, das für die Sequenz übereinstimmt, die von einem gegebenen Isolat eines Virus vom Typ HIV bekannt ist, verschiedene Amplifikationen bestimmter Virusvarianten vom Typ HIV ergeben. Andererseits, selbst wenn ein Anfangsstück in einer konservierten Region des Genomes eines HIV-Virus im Vergleich zu einem anderen ausgewählt ist, ist sein "gutes Funktionieren" keinesfalls sichergestellt und kann zu schlechten Amplifikationsausbeuten führen.
  • Die vorliegende Erfindung liefert genauer gesagt Oligonucleotidanfangsstücke bzw. -starter, welche unter anderem die Amplifikation, insbesondere zur Feindiagnostik des Genomes aller Viren vom Typ HIV und SIV gestattet, mit im Stand der Technik als maximal betrachteten Ausbeuten, und welche vor allen Dingen die Gegenwart zahlreicher und spezifischer Banden vermeidet.
  • Die Anfangsstücke bzw. Starter der vorliegenden Erfindung sind gleichermaßen für Viren der Gruppe HIV-1 und/oder Viren der Gruppe HIV-2 und SIV spezifisch und sind unempfindlich auf Änderungen des Genomes dieser Viren.
  • Die vorliegende Erfindung hat Oligonucleotidanfangsstücke bzw. -starter zum Gegenstand, von etwa 15 bis 30 Nucleotiden, welche zur genomischen Amplifikation von Viren des Typs HIV-1 und/oder des Typs HIV-2 und SIV verwendbar sind.
  • Die Erfindung betrifft jede Nucleotidsequenz, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß ihre Sequenz unter jenen ausgewählt ist,
  • - welche entweder in einer der Nucleotidsequenzen enthalten ist, die in den gag-, vpr- und pol-Genen der HIV- 1 Bru-, HIV-1 Mal-, HIV-I Eli-, HIV-2 ROD- und SIV MAC-Viren umfaßt sind, oder in den nef2-, vif2- und vpx-Genen der HIV-2 ROD- und SIV MAC-Viren oder in den env-, nef1-, vif1- oder vpr-Genen der HIV-1 Bru-, HIV-1 Mal- und HIV-1 Eli-Viren und insbesondere unter jenen, welche in den nachfolgend definierten Nucleotidketten enthalten sind,
  • - oder (insbesondere für die am längsten Sequenzen) in einer der oben genannten Nucleotidsequenzen enthalten sind, die von HIV-1 Bru oder HIV-1 Mal, oder HIV-1 Eli oder HIV-2 ROD oder SIV Mac stammen, oder eine komplementäre Nucleotidsequenz einer dieser letzteren Sequenzen enthalten, wobei festgelegt ist, daß die möglichen ergänzenden Nucleotide, welche an der konservierten, spezifischen Nucleotidsequenz des fraglichen Gens an der 3'- oder 5'-Endung "überstehen", vorzugsweise mit jenen zusammenfallen, welche sich diesseits der 3'- oder 5'-Endungen angeordnet finden, welche dem Inneren selbst der vollständigen Sequenz der Viren vom Typ HIV-1, HIV-2 oder SIV Mac entsprechen,
  • - oder, wenn diese Nucleotidsequenz nicht identisch mit einer der oben genannten Nucleotidsequenzen ist oder nicht komplementär zu einer dieser Sequenzen ist, nichtsdestotrotz sich mit einer Nucleotidsequenz, die von HIV-1 Bru-, HIV-1 Mal-, HIV-1 Eli-Viren und/oder einer von HIV-2 ROD- oder SIV MAC-Viren stammenden Nucleotidsequenz, hybridisieren kann. Die Hybridisierung kann bei einer Temperatur von 60ºC ±1ºC, vorzugsweise 60ºC ±0,5ºC, stattfinden, was für eine optimale Ausbeute bekannt ist.
  • Die Numerierung der unten erwähnten Nucleotide entspricht jener, welche in dem Referenzhandbuch "Human Retrovirus and AIDS-1989", herausgegeben von "Los Alamos National Laboratory - New Mexico - USA", verwendet wird.
  • (Die HIV-1 Mal-, HIV-1 Eli-Virussequenzen wurden von MONTAGNIER, SONIGO, WAIN- HOBSON und ALIZON in der europäischen Patentanmeldung 86 401 380 vom 23. Juni 1986 beschrieben.)
  • Die Sequenzen der Erfindung werden auf herkömmlichen Syntheseapparaturen von Applied Biosystems (Phosphoramiditverfahren) oder anderen Vorrichtungen durchgeführt, welche ein ähnliches Verfahren verwenden.
  • Die Erfindung betrifft insbesondere die Oligonucleotidsequenzen, welche durch die folgenden Nucleotidketten gekennzeichnet sind (dargestellt in 5' → 3'-Richtung; die Initialen "S" und "AS" zeigen an, ob sich das Oligonucleotid in Richtung oder entgegen die Richtung befindet, d. h. ob das Oligonucleotid in Richtung 5'o → 3' oder in Richtung 3'o → 5' gerichtet ist):
  • 1 *) Sequenzen, welche den Genomen der HIV-1-, HIV-2- und SIV-Viren gemeinsam sind (die Reihenfolge der auseinanderliegenden Ziffern eines Striches zeigen die Position der Nucleotide auf den Genomen an, welche jeweils den HIV-1 Bru-, HIV-1 Mal-, HIV- 1 Eli-, HIV-2 ROD- und SIV-Viren entsprechen):
  • - spezifische Sequenzen des gag-Genes des Genomes der oben genannten Viren (Gene, welche für eine Antigengruppe kodieren, die für das Nucleotid dieser Viren spezifisch sind).
  • Bestimmte Abwandlungen können in bestimmten Positionen der unten angegebenen Nucleotidsequenzen eingebracht werden, ohne daß die Hybridisierungseigenschaften dieser Nucleotidsequenzen mit den Genen der Viren vom Typ HIV und/oder SIV beeinflußt werden würden. Die Nucleotidsequenzen, welche diese Abwandlungen umfassen, sind unter den ursprünglichen Nucleotidsequenzen, von welchen sie sich ableiten, durch Ersetzen einer oder mehrerer Basen dargestellt. Die Basen, welche bezüglich jenen der ursprünglichen Nucleotidsequenzen modifiziert sind, sind in Großbuchstaben in senkrechter Richtung der Positionen angezeigt, welche den Basen entsprechen, welche in diesen ursprünglichen Sequenzen ersetzt wurden. Indessen sind die Basen der ursprünglichen Sequenzen, welche nicht in der Sequenz, welche diese Abwandlungen umfaßt, ersetzt worden sind, mit Hilfe einer Punktierung angezeigt.
  • Die Synthese der Anfangsstücke bzw. Starter vollzieht sich unter simultaner Verwendung aller Abänderungen. Das ist die Mischung aller Varianten für eine gegebene Sequenz, welche in den Tests verwendet wird.
  • MMy1: TGG CGC CCG AAC AGG GAC
  • ... ... .T. ... ... ...
  • S, 636-653, 635-652, 636-653, 859-876, 843-851
  • MMy2: GGC CAG GGG GAA AGA AAA A
  • ... .C. .C. ... ... ... .
  • ... ... .A. ... ... ... .
  • S, 854-872, 864-888, 848-872, 1160-1184, 1124-1148
  • MMy3: TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA
  • ... ... C.. T.T ... ... ..
  • AS, 900-881, 916-897, 900-881, 1212-1193, 1176-1157
  • MMy4: TGC ATG GCT GCT TGY TG
  • A.. ... C.. G..
  • AS, 1285-1369, 1419-1403, 1385-1369, 1703-1687, 1667-1651
  • MMy4B: CTT TGC ATG GCT GCT TGA TG
  • ..C ... ..A ... ..C ..G..
  • AS, 1388-1369, 1421-1403, 1388-1369, 1706-1687,
  • 1670-1651,
  • MMy4Bbis: CAT CAA GCA GCC ATG CAA AG
  • ..C ..G ... ..T ... ..G ..
  • S, 1369-1388, 1403-1421, 1369-1388,
  • 1687-1706, 1651.1670,
  • MMy28: AGG GCT GTT GGA AAT GTG G
  • ... ... ... ... ..G ... .
  • S, 2021-2039, 2055-2073, 2024-2042, 2329-2349,
  • 2299-2318,
  • MMy28bis: CCA CAT TTC CAG CAT CCC T
  • ... ... ... ... ..G ... .
  • ... ... ... ... ..C ... .
  • AS, 2039-2021, 2073-2055, 2042-2024, 2349-2329,
  • 2318-2299,
  • · spezifische Sequenzen des vpr-Gens
  • MMy18: GAT AGA TGG AAC AAG CCC CAG
  • S, 5590-5610, 5585-5605, 5554-5574, 6233-6296,
  • 6147-6170,
  • MMy19: TCC ATT TCT TGC TCT CCT CTG T
  • AS, 5870-5849, 5865-5844, 5834-5813,
  • 6551-6531, 6454-6431,
  • · spezifische Sequenzen des pol-Gens
  • MMy29: TAA AGC CAG GAA TGG ATG GCC CAA
  • ... ... ... ... ... ... .A. ...
  • S, 2620-2643, 2615-2638, 2584-2607, 2971-2994,
  • 2887-3010
  • MMy29bis: TTG GGC CAT CCA IFIC CTG GCT TTA
  • ... .T. ... ... ... ... ... ...
  • AS, 2643-2620, 2638-2615, 2607-2584, 2994-2971,
  • 3010-2887,
  • MMy30: TGG ACT GTC AAT GAC ATA CAG AA
  • ... ... ... ... ..T ... ... ..
  • S, 3339-3361, 3334-3356, 3303-3325, 3690-3712,
  • 3606-3628,
  • MMy30bis: TTC TGT ATG TCA TTG ACA GTC CA
  • ... ... ... ... ... ..T ... ..
  • AS, 3361-3339, 3356-3334, 3325-3303, 3712-3690,
  • 3628-3606,
  • MMy31: CAT GGG TAC CAG CAC ACA AAG G
  • S, 4186-4207, 4181-4202, 4150-4171, 4534-4555,
  • 4450-4471,
  • MMy31bis: CCT TTG TGT GCT GGT ACC CAT G
  • AS, 4207-4186, 4202-4181, 4171-4150, 4555-4534,
  • 4471-4450,
  • MMy32: TGG AAA GGT GAA GGG GCA GT
  • ... ... ... ... ..A ... ..
  • S, 4992-5011, 4987-5006, 4956-4975, 5340-5359,
  • 5256-5275,
  • MMy32bis: ACT GCC CCT TCA CCT TTC CA
  • ... ... ... ..T ... ... ..
  • ... ... ... ..C ... ... ..
  • AS, 5011-4992, 5006-4987, 4975-4956, 5359-5340,
  • 5275-5256
  • 2*) Gemeinsame Sequenzen für die Genome der Viren HIV-2 und SIV (die Reihe von Zahlen, welche durch einen Strich beabstandet sind, zeigen die Position von Nucleotiden auf den Genomen an, welche jeweils den Viren HIV-2 ROD und SW-MAC entsprechen).
  • · spezifische Sequenzen des nef2-Genes (kodierend für einen negativen Faktor von 27 kD)
  • MMy12: AGA GAC TCT TGC GGG CGC GTG
  • S, 9165-9185, 9139-9159
  • MMy13: ATA TAC TTA GAA AAG GAA GAA GG
  • S, 9542-9564, 9516-9538,
  • MMy13bis: CCT TCT TCC TTT TCT AAG TAT AT
  • AS, 9564-9542, 9538-9516
  • MMy14: AGC TGA GAC AGC AGG GAC TTT CCA
  • AS, 9956-9933, 9893-9870,
  • · spezifische Sequenzen des vif2-Gens (kodierend für einen infizierenden Faktor von 23 kD)
  • MMy20: TAT GGA GGA GGA AAA GAG ATG GAT AGT
  • S, 5424-5450, 5340-5366,
  • MMy21: TAG CAC TTA TTT CCC TTG CTT T
  • S, 5754-5775, 5670-5691,
  • MMy21bis: AAA GCA AGG GAA ATA AGT GCT A
  • AS, 5775-5754, 5691-5670,
  • MMy22: CCC TTG TTC ATC ATG CCA GTA T
  • AS, 6082-6061, 5995-5974,
  • · spezifische Sequenzen des vpx-Gens (kodierend für ein Protein von 12 kD)
  • MMy23: ATG TCA GAT CCC AGG GAG A
  • S, 5900-5918, 5813-5831,
  • MMy24: CCT GGA GGG GGA GGA GGA GGA
  • AS, 6228-6208, 6141-6121,
  • 3*) Gemeinsame Sequenzen für die Genome der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal und HIF-1 Eli (die Reihenfolge der durch einen Strich beabstandeten Ziffern zeigt die Position von Nucleotiden auf den Genomen an, welche jeweils den Viren HN-1 Bru, HIV-1 Mal und HIV-1 Eli entsprechen).
  • · spezifische Sequenzen des env-Gens (kodierend für die Hüllenproteine)
  • MMy5: CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT GCC CC
  • S, 6905-6930, 6903-6928, 6860-6885
  • MMySbis: GGG GCA CAA TAA TGT ATG GGA ATT GG
  • S, 6930-6905, 6928-6903, 6885-6860
  • MMy6: AAT GGC AGT CTA GCA GAA GAA GA
  • S, 7055-7077, 7053-7075, 7010-7032
  • MMy7: ATC CTC AGG AGG GGA CCC AGA AAT T
  • S, 7360-7384, 7349-7373, 7306-7330
  • MMy7bis: ATT TTC TGG GTC CCC TCC TGA GGA T
  • AS, 7384-7360, 7373-7349, 7330-7306
  • MMy8: GTG CTT CCT GCT GCT CCC AAG AAC CC
  • AS, 7857-7832, 7846-7821, 7800-7775
  • MMy8bis: GGG TTC TTG GGA GCA GCA GGA AGC AC
  • S, 7832-7857, 7821-7846, 7775-7800,
  • MMy9: ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA AGT AG
  • ... ... ... ..A ... ... ... ... ..
  • S, 8844-8869, 8836-8861, 8787-8812,
  • MMy9bis: CTA CTT TTT GAC CAC TTG CCA CCC AT
  • AS, 8869-8844, 8861-8836, 8812-8787,
  • MMy78: TAT TAA CAA GAG ATG GTG G
  • S, 7629-7647, 7612-7630, 7572-7590,
  • MMy89: CCA GCA AGA AAA GAA TGA A
  • S, 8224-8242, 8213-823 V, 8167-8185,
  • MMy89bis: TTC ATT CTT TTC TTG CTG G
  • AS, 8242-8224, 8231-8213, 8185-8167,
  • · spezifische Sequenzen des nef1-Gens
  • MMy10: AAA AGA AAA GGG GGG ACT GGA
  • S, 9116-9136, 9117-9137, 9062-9082,
  • MMy10bis: TCC AGT CCC CCC ITT TCT TTT
  • AS, 9136-9116, 9137-9117, 9082-9062,
  • MMy11: AAA GTC CCC AGC GGA AAG TCC C
  • AS, 9503-9483, 9505-9484, 9449-9428,
  • · spezifische Sequenzen des vif1-Gens
  • MMy15: GAT TAT GGA AAA CAG ATG GCA GGT GAT
  • S, 5073-5099, 5068-5094, 5037-5063,
  • MMy16: GCA GAC CAA CTA ATT CAT CTG TA
  • S, 5383-5405, 5378-5400, 5347-5369,
  • MMy16bis: TAC AGA TGA ATT AGT TGG TCT GC
  • AS, 5405-5383, 5400-5378, 5369-5347,
  • MMy17: CTT AAG CTC CTC TAA AAG CTC TA
  • AS, 5675-5653, 5670-5648, 5639-5617,
  • · spezifische Sequenzen des vpu-Gens
  • MMy25: GTA AGT AGT ACA TGT AAT GCA ACC T
  • S, 6081-6105, 6076-6100, 6045-6069,
  • MMy26: AGC AGA AGA CAG TGG CCA TGA GAG
  • S, 6240-6263, 6238-6261, 6207-6230,
  • MMy27: ACT ACA GAT CAT CAA TAT CCC AA
  • AS, 6343-6321, 6338-6316, 6307-6285
  • Die Erfindung hat auch die Sequenzen (oder Starter) zum Gegenstand, welche eine Nucleotidstruktur besitzen, die komplementär zu jenen der oben definierten Starter ist.
  • Sie betrifft auch die Nucleotidsequenzen, welche bestimmte Mutationen in Bezug auf jene aufweisen, welche oben definiert sind, ohne daß die Hybridisierungseigenschaften, wie sie oben definiert sind, dieser Sequenzen geändert wären. Der Prozentsatz von Nucleotiden, welche verschieden von jenen sind, welche die Sequenzen bilden, die oben beschrieben sind, ohne die Hybridisierungseigenschaften der erfindungsgemäßen Sequenzen zu beeinflussen, können 40% erreichen.
  • In allgemeiner Weise wird im Falle eines Sens(S)-Starters (Primers) eine größere Anzahl von Mutationen auf der 5'-Seite, als auf der 3'-Seite des Starters toleriert werden, wobei sich die 3-Seite perfekt mit einem für eine Nucleotidsequenz bestimmten Strang hybridisieren kann, um die Amplifikation dieser Sequenz zu ermöglichen. Im Falle eines Anti-Sens(AS)-Starters wird die Toleranz von der 3'-Seite erlaubt.
  • Die Erfindung hat auch die Starter zum Gegenstand, welche oben definiert sind und eine Konservierung von wenigstens 5 Basen jeder Seite umfassen, wobei der Mittelabschnitt Modifikationen umfaßt, ohne daß die obigen Hybridisierungseigenschaften modifiziert wären.
  • Eine der Eigenschaften der Oligonucleotidstarter der Erfindung ist es, eine reine Amplifikationsbande zu ergeben, ohne im allgemeinen unspezifische Banden, wenn die technischen Verwendungsindikationen, welche in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, eingesetzt werden. Das ist der Fall bei der Länge von Startern, welche 27 Basen erreichen können, was die Hybridisierungsspezifität erhöht, sowie die drastischen Verwendungsbedingungen, welche es erlauben, die parasitären Neben-Verbindungen zu eliminieren. Die Spezifität für jeden Virustyp ist eine Funktion, außer dem Homologieprozentsatz mit der Bezugsmatrix, der Länge des Starters, welcher, für eine akzeptable Ausbeute, bis zu 40 Basen erreichen kann.
  • Die Erfindung betrifft auch Starter, wie sie oben beschrieben sind, welche an ihrem 5'-Ende mit einem Promotor zur Durchführung eines Gen-Amplifikationsverfahrens durch Synthese von vielfachen DNA- oder RNA-Kopien verbunden sind, wie in der europäischen Patentanmeldung 88 307 102.9 vom 1. August 1988 beschrieben ist.
  • Die Erfindung hat insbesondere die Verwendung von oben beschriebenen Startern für die Durchführung eines Gen-Amplifikationsverfahrens von Nucleinsequenzen des Virus vom Typ HIV-1 und/oder HIV-2 und/oder SIV zum Gegenstand, wobei dieses Verfahren zur in vitro Diagnose von potentiellen Infektionen von Individuen durch Viren vom Typ HIV-1 und/oder HIV-2 oder eines Tieres durch wenigstens einen der drei Viren (HIV-1, HIV-2, SIV) verwendbar ist.
  • Dieses in vitro Diagnoseverfahren der Erfindung wird ausgehend von einer biologischen Probe (beispielsweise einer biologischen Flüssigkeit, wie Serum, Lymphozyten des Blutkreislaufes) durchgeführt, erhalten von einem Versuchspatienten und im wesentlichen umfassend die folgenden Stufen:
  • - eine Stufe der Extraktion der nachzuweisenden Nucleinsäure, welche dem Genom des Virus vom Typ HIV- 1 und/oder HIV-2 und/oder SIV angehört und gegebenenfalls in der oben erwähnten biologischen Probe vorliegt, und gegebenenfalls eine Stufe der Behandlung mittels einer inversen Transcriptase dieser Nucleinsäure, wenn die letztere in RNA-Form vorliegt, um eine doppelsträngige Nucleinsäure zu erhalten (wobei die letzte Stufe unten auch als Retro-Transcription-Stufe der viralen RNA bezeichnet ist),
  • - einen Zyklus, welcher die folgenden Stufen umfaßt:
  • · Denaturieren der nachzuweisenden doppelsträngigen Nucleinsäure, was zur Bildung einer einsträngigen Nucleinsäure führt,
  • · Hybridisieren jedes während der vorhergehenden Stufe der Denaturierung erhaltenen Nucleinsäurestranges mit wenigstens einem als Starter verwendeten Oligonucleotid, durch Inkontaktbringen der oben erwähnten Stränge mit wenigstens einem oben erwähnten Starterpaar gemäß der Erfindung unter unten definierten Hybridisierungsbedingungen,
  • · Bilden, ausgehend von DNS-Anfangsstücken, welche komplementär zu Strängen sind, auf welchen sie in Gegenwart einer DNS-Polymerase und von vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten (dNTP) hybridisiert werden, was zur Bildung einer viel größeren Anzahl nachzuweisender doppelsträngiger Nucleinsäuren führt, wie die vorhergehende Stufe der Denaturierung,
  • wobei dieser Zyklus eine Anzahl Male wiederholt wird, welche zum Erhalten der gegebenenfalls in der biologischen Probe vorliegenden, nachzuweisenden Nucleinsäure in einer zu ihrem Nachweis ausreichenden Menge, bestimmt wurde,
  • eine Stufe des Nachweises der möglichen Gegenwart der Nucleinsäure, welche dem Genom des Virus vom Typ HIV-1 und/oder HIV-2 und/oder SIV in der biologischen Probe angehört.
  • Die oben beschriebene Hybridisierungsstufe wird vorteilhaft bei 60ºC während 1 Minute und 30 Sekunden in dem Puffer "10 · Puffer" durchgeführt, dessen Zusammensetzung (in der verwendeten Endkonzentration) unten angegeben ist.
  • Das in vitro Diagnoseverfahren der Erfindung kann entweder ausgehend von viraler RNA oder ausgehend von komplementärer DNA, episomal oder integriert, durchgeführt werden.
  • Tatsächlich zeigen sich die HIV- und SIV-Viren in Form von RNA oder DNA in Funktion der Lokalisierung des Virus in dem Organismus.
  • Wenn der Virus außerhalb der Zellen des Organismus anlagert, insbesondere außerhalb der Blutzellen, wird seine RNA durch eine inverse Transcriptase in DNA kopiert. Im Gegensatz verharrt das Genom von Viren des Typs HIV im extracellulären Milieu, insbesondere im Blut in RNA-Form.
  • Die Extraktionsstufe gemäß der Erfindung von viraler DNA, die in den Zellen der biologischen Probe enthalten ist, zeigt - außer dem klassischen Phenol-Chloroformverfahren - die folgenden Stufen:
  • - Suspendieren des Zellrückstandes in 0,5 ml pyrolisiertem Wasser in einem Potter mit großem Kolben,
  • - Brechen der Zellen durch "Vor- und Rückgang",
  • - Zugabe von Triton X100 bis auf eine Endkonzentration von 0,1%,
  • - Denaturieren unter Erhitzen während 15 bis 25 Minuten bei 100ºC,
  • - kurzes Zentrifugieren, um nur die Zellabfälle zu entfernen,
  • - Ausfällen von DNA über Nacht bei -20ºC durch Zugabe von 2,5 Volumenteilen absolutem Ethanol auf 10% des Endvolumens von 3-molarem Natriumacetat. Die DNA wird dann gewonnen, dann in pyrolisiertem Wasser erneut suspendiert, nachdem zweimal mit Ethanol bei 70ºC gewaschen wurde. Es ist festzustellen, daß dieses Verfahren die gleichzeitige Ausfällung von DNA und RNA erlaubt, was die Detektion genomischer Botschaft von Viren des Typs HIV oder SIV durch Verwendung der Methode erlaubt, welche "direkte DNA-PCR" oder jene, welche "RNA-PCR" genannt wird.
  • Die Extraktionsstufe von viraler RNA wird im allgemeinen in klassischer Weise, die dem Fachmann bekannt ist, durchgeführt.
  • Nach der Extraktion von RNA ist eine zusätzliche Transformation von RNA, einsträngige in zweisträngige RNA erforderlich durchzuführen, wenn die in vitro Diagnose der Erfindung ausgehend von biologischen Proben durchgeführt wird, welche die Viren vom Typ HIV-1 und/oder HIV-2 und/oder SIV enthalten, deren Genome sich in RNA-Form befinden.
  • Diese Transformation von RNA in DNA wird durch Behandeln der RNA durchgeführt, welche nach Extraktion der biologischen Probe erhalten wird, insbesondere Serum, in einem Milieu, das zur Unterstützung einer inversen Transcriptase geeignet ist.
  • Die Erfindung hat insbesondere unter anderem ein in vitro Diagnoseverfahren zum Gegenstand, wie es oben definiert ist, worin die Stufe der Retrotranscription von viraler RNA in der folgenden Weise durchgeführt wird:
  • - 10 ug in Wasser resuspendierte, extrahierte RNA wird mit dem Starterpaar jeweils in einer Konzentration von 40 uM in Kontakt gebracht, in einem Endvolumen von 40 ul. Die Gesamtheit wird bei 100ºC während 10 Minuten denaturiert und dann in Eiswasser getaucht,
  • - man fügt 10 ul der folgenden Mischung zu: 5 ul Puffer "10 · Puffer", wie unten beschrieben + 1 Einheit reverse Transcriptase (AMV (Avian Myeloblastosis Virus) oder MuMLV (Moloney Leukemia Virus)) + 1 Einheit Taq-Polymerase + 1 ul der Mischung von 4 dNTP, jeweils zu 25 mM + Wasser q. s. p., 10 ul. Das Endvolumen beträgt daher 50 ul.
  • Diese Reaktion vollzieht sich in zwei Stufen:
  • - a) erste Stufe: Herstellung von cDNA durch Wirkung der reversen Transcriptase bei 42ºC während 13 Minuten,
  • - b) zweite Stufe: Klassische Gen-Amplifikation: Man erhitzt auf 95ºC während 3 Minuten, um die reverse Transcriptase zu zerstören und die Stufe der Endhybridisierung/Hybridisierung zu ermöglichen, dann setzt man den Zyklus in Gang, welcher vorher für die Gen-Amplifikation beschrieben ist.
  • Die Erfindung hat insbesondere ein in vitro Diagnoseverfahren zum Gegenstand, wie es oben beschrieben ist, worin die Stufe der Denaturierung in Gegenwart von Starterpaar(en) (oder Primer(n)) der Erfindung durchgeführt wird. Tatsächlich ist es, wie oben ausgeführt worden ist, eine der Eigenschaften der Oligonucleotide (oder Primer) der Erfindung, eine reine Amplifikationsbande zu liefern, welche im allgemeinen frei von unspezifischen Banden ist, wenn sie unter den folgenden Bedingungen verwendet werden:
  • - Hybridisieren: Die Primer (1 ul einer Lösung zu 40 uMol (40 um) eines jeden Primers) werden in Gegenwart der DNA-Matrix (100 bis 300 ng) für die erste Stufe der Denaturierung-Wiederverbindung in Kontakt gebracht; man erhitzt während 10 Minuten auf 100ºC, dann taucht man die Röhrchen, welche die Mischung von DNA- Matrix und Primern enthalten, in Wasser, das Eis enthält, um die Ausbeute der DNA-Matrix/Primer- Assoziierung zu erhöhen. Die Primer können in einer Endkonzentration in der Amplifikationsstufe verwendet werden, welche jeweils zu 0,8 uM führt.
  • - Amplifikation: Man setzt dem vorhergehenden Milieu die 4 AdNTP zu, wobei jede in einer Endkonzentration von 0,5 uMol (50 ul) verwendet wird, und eine Einheit Taq- Polymerase für ein Reaktionsmilieu von 50 ul; diese Stufe wird in einem Amplifikationspuffer der vorliegenden Erfindung durchgeführt, welcher im allgemeinen unter dem Namen "10 · Puffer" bezeichnet wird, dessen Zusammensetzung (wenn er auf 1/10 verdünnt ist) die folgende ist: Tris-HCl, pH 8,9: 50 mM; (NH&sub4;)&sub2; SO&sub4;: 15 mM; MgCl&sub2;: 5 mM; β-Mercaptoethanol: 10 mM; Gelatine: 0,25 mg/ml). Man fügt 5 ul dieses Puffers und q. s. p. Wasser, 50 ul, zu diesem vorhergehenden Milieu zu.
  • Die Amplifikationszyklen werden in folgender Weise durchgeführt: 30 bis 40 Zyklen, bestehend aus:
  • - 94ºC während 10 Sekunden (Denaturieren),
  • - 60ºC während 1,30 Minuten (Hybridisieren),
  • - 78ºC während 1,30 Minuten (Verlängern).
  • Das alles kann durch einen gemeinsamen Zyklus bei 78ºC während 15 Minuten gefolgt sein.
  • Die Genauigkeit der Temperaturen, welche bei ±0,3ºC sowie ihre Stabilität während der verschiede nen Stufen stellt, wesentliche Bedingungen für das Erhalten maximaler Ausbeuten sowie die Abwesenheit unspezifischer Banden dar.
  • Die optimale Konzentration von DNA beträgt 100 bis 300 ng für genomische DNA, die aus Zellen extrahiert ist (von Patienten oder aus Kultur, von Säugern oder anderen).
  • Daher stellen die vorhergehenden Bedingungen optimale Bedingungen für ein Endreaktionsmilieu von 50 ul dar und diese Bedingungen können in Funktion vom Endvolumen des Reaktionsmilieus modifiziert werden.
  • Die Verwendung mehrerer verschiedener Starterpaare (oder Mischungen (Cocktails) von Paaren) der Erfindung erlauben entweder den Kreuznachweis verschiedener Typen von Viren des Typs HIV und/oder SIV, oder den simultanen Nachweis von mehreren Genen desselben Virus vom Typ HIV und/oder SIV.
  • Beispielhaft für bevorzugte Starterpaare, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, kann man die folgenden Starterpaare nennen:
  • - MMy1-MMy4, MMy2-MMy4, MMy1-MMy3, MMy18-MMy19, MMy4bis-MMy2Bbis, MMy28-MMy29bis, MMy29-MMy30bis, MMy31-MMy32bis, insbesondere für die in vitro Diagnose der Infektion eines Individuums durch HIV-1 und/oder HIV-2,
  • - MMy5-MMy8, MMy6-MMy8, MMy7-MMy8, MMy5-MMy7bis, MMy6-MMy7bis, MMy9-MMy11, MMy10-MMy11, MMy9-MMy10bis, MMy26-MMy5bis, MMy8bis-MMy9bis, MMy8bis-MMy89, MMy89bis-MMy9bis, MMy15-MMy17, MMy15-MMy16bis, MMy16-MMy17, MMy25-MMy27, MMy26- MMy27, insbesondere für die in vitro Diagnose der Infektion eines Individuums durch HIV-1,
  • - MMy20-MMy22, MMy20-MMy21bis, MMy21-MMy22, MMy23-MMy24, MMy12-MMy14, MMy12- MMy13bis, für die in vitro Diagnose der Infektion eines Individuums durch HIV-2.
  • Das Polymerisationsmittel, das in der Verlängerungsstufe des Zyklus verwendet wird, ist eine thermostabile DNA-Polymerase, insbesondere die Taq-Polymerase, amplifiziert von Appligene oder jede thermostabile DNA-Polymesase, welche handelsüblich ist.
  • In allgemeiner Weise wird der Zyklus des in vitro Diagnoseverfahrens der Erfindung zwischen 30 und 40 mal wiederholt.
  • Das in vitro Diagnoseverfahren der Erfindung erlaubt auch, in Funktion der verwendeten nucleotidischen Starterpaare, selektiv die Gene der Viren vom Typ HIV und/oder SIV nachzuweisen, welche in einer biologischen Probe vorliegen.
  • Die verwendbaren Starterpaare sind beispielhaft für das Gen-für-Gen-Diagnoseverfahren, das oben erwähnt ist, der Erfindung, die folgenden:
  • - MMy1-MMy4, MMy2-MMy4, MMy1-MMy3, MMy4bis-MMy28bis für das gag-Gen,
  • - MMy18-MMy19 für das vpr-Gen,
  • - MMy5-MMy8, MMy6-MMy8, MMy7-MMy8, MMy5-MMy7bis, MMy6-MMy7bis, MMy26-MMy5bis, MMy8bis-MMy9bis, MMy8bis-MMy89, MMy89bis-MMy9bis für das env-Gen,
  • - MMy9-MMy11, MMy9-MMy10bis, MMy10-MMy11 für das nef1-Gen,
  • - MMy15-MMy17, MMy15-MMy16bis, MMy16-MMy17 für das vif1-Gen,
  • - MMy20-MMy22, MMy20-MMy21bis, MMy21-MMy22 für vif2,
  • - MMy23-MMy24 für vpx,
  • - MMy12-MMy14, MMy12-MMy13bis, MMy13-MMy14 für nef2,
  • - MMy25-MMy27, MMy26-MMy27 für das vpu-Gen,
  • - MMy28-MMy29bis, MMy29-MMy30bis, MMy30-MMy31bis, MMy31-MMy32bis für das pol-Gen.
  • Jedenfalls sind die Kombinationen zwischen den Primern "S" und "AS", die oben beschrieben sind, nicht beschränkend und können gemäß der Ausführung des Verwenders variiert werden.
  • Die Größen der Nucleotidfragmente, welche mit Hilfe der oben erwähnten Starterpaare synthetisiert werden, sind beispielhaft in in folgenden Tabellen I bis XI gezeigt:
  • (Die in den Tabellen unten angezeigten Zahlen stellen die Anzahl von Nucleotiden von synthetisierten Fragmenten dar und die "Gedankenstriche" zeigen, daß die getesteten Starterpaare es nicht erlauben, die entsprechenden viralen Stämme zu charakterisieren). Tabelle I Tabelle II Tabelle III Tabelle IV Tabelle V Tabelle VI Tabelle VII Tabelle VIII Tabelle IX Tabelle X Tabelle XI
  • Es ist festzuhalten, daß dank ihrer Lage auf dem Genom die Primer, welche zur Amplifikation dienen, in einer solchen Weise kombiniert werden können, daß sie als Sonden verwendet werden können, entweder nach Markierung mit 32P durch Kination oder durch Verwendung der Technik eingefrorener Sonden, um die Spezifität der beobachteten Amplifikationsbande nachzuweisen, welche während einer Analyse durch "Southem transfert" beobachtet wird. Zusätzlich zur klassischen Kombination von Startern, damit jedes dritte Oligonucleotid als spezifische interne Sonde dienen kann, ist festzuhalten der besondere Fall von vif1/vpr- und vif2/vpx-Genen, infolge der Überlappung dieser Gene, was einen Kreuznachweis erlaubt. Des weiteren können während einer Analyse durch Sequenzierung von amplifizierter DNA diese Oligonucleotide als spezifische Starter für die DNA-Polymerase verwendet werden, was eine Doppelsequenzierung in jeder Richtung erlaubt, daher einer Doppelablesung jeder der Sequenzen, was eine mögliche Zweideutigkeit der Interpretation ausschließt.
  • Die Erfindung hat auch Starter zum Gegenstand, wie sie oben definiert sind, die markiert sind, insbesondere in radioaktiver oder enzymatischer Weise, sowie ihre Verwendung als Nucleotidsonden, insbesondere im Umfang des wie oben beschriebenen in vitro Diagnoseverfahrens.
  • Die Erfindung hat auch Oligonucleotide zum Gegenstand, wie sie oben beschrieben sind, und Zucker in α-Konformation umfassen. Solche Oligonucleotide zeigen die Eigenschaft, die Richtung der Doppelhelix, welche durch den Matrixstrang (Strang des Genoms des Virus) zu invertieren, wobei diese Doppelhelix so den Zustand "S" zum Zustand "AS" durchläuft.
  • Die Erfindung betrifft auch die obigen Nucleotide, wovon einige Nucleoflde methyliert sind und/oder eines oder mehrere Schwefelatome, insbesondere auf den Adeninen, umfassen. Solche Oligonucleotide zeigen die Eigenschaft, die Stabilität der Doppellielix zu steigern und dementsprechend sich besser mit zu verstärkenden DNA-Strängen zu hybridisieren.
  • Die Erfindung betrifft auch die Oligonucleotide, wie sie oben beschrieben sind und sich in Form einer "modifizierten Base" zeigen, umfassend Nucleotide, auf welchen in kovalenter Weise chromophore Mittel aufgepflanzt sind (aromatische plane Moleküle, wie Acridinorange), insbesondere gemäß dem Verfahren, das in dem Artikel von C. Helme, erschienen in "La Vie des Sciences", Bd. 4, Nr. 1, S. 17-37, beschrieben ist. Solche Oligonucleotide zeigen die Eigenschaft, leicht feststellbar, insbesondere durch Fluoreszenz, zu sein.
  • Die Oligonucleotide der Erfindung sind auch zur Durchführung eines in vitro Diagnoseverfahrens der Infektion von Affen (Makaken, Mangabey Affen oder Grünaffen) durch die Viren vom Typ SIV geeignet, wobei dieses Verfahren die charakteristischen Prinzipien des oben beschriebenen Verfahrens aufnimmt.
  • Die Erfindung hat auch Diagnose-Kits für die Durchführung der oben erwähnten in vitro Diagnoseverfahren zum Gegenstand. Beispielsweise umfaßt ein Diagnosekit der vorliegenden Erfindung:
  • - wenigstens ein Oligonucleotid-Starterpaar gemäß der Erfindung, wobei jedes Paar einen Starter umfaßt, der sich mit einem der Stränge der festzustellenden Nucleinsäuresequenz hybridisiert, und einen Starter, der sich mit dem komplementären Strang des letzteren unter den oben angegebenen Bedingungen hybridisiert,
  • - geeignete Reagenzien zur Durchführung des Amplifikationsoperationszyklus, nämlich DNA-Polymerase und vier verschiedene Nucleotidtriphosphate und das Reaktionsmilieu, bezeichnet "10 · Puffer", wie oben beschrieben,
  • - eine (oder mehrere) Sonde(n), welche markiert sein können, insbesondere durch Radioaktivität oder durch die Technik von eingefrorenen Sonden, welche sich mit der (oder den) Sequenz(en) festzustellender amplifizierter Nucleinsäure(n) hybridisieren können.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von oben angegebenen Startern der Erfindung für die Durchführung eines Verfahrens zur Synthese von Proteinen, kodiert durch die mit Hilfe dieser Starter amplifizierten Nucleotidsequenzen.
  • Veranschaulichend umfaßt dieses Verfahren zur Synthese von Proteinen die Amplifikation von Nucleotidsequenzen der Genome der Viren vom Typ HIV oder SIV (kodierend für ein bestimmtes Protein und gegebenenfalls unterliegend verschiedenen Modifikationen ihrer Nucleotide) durch Inkontaktbringen dieser Sequenzen mit wenigestens einem Starterpaar gemäß der Erfindung unter den oben beschriebenen Bedingungen, gefolgt von der Übersetzung dieser so amplifizierten Sequenzen in Proteine; diese letzte Stufe wird insbesondere durch Transformation von geeigneten Gastzellen mit Hilfe von Vektoren durchgeführt, welche die amplifizierten Zellen enthalten, und Gewinnen der in den Gastzellen erzeugten Proteine.
  • Die Erfindung betrifft auch die Polypeptide, welche aus der Übersetzung der Nucleotidsequenzen (oder Starter) der Erfindung hervorgehen.
  • Die Erfindung hat auch die Antisens-Oligonucleotidstarter als antivirale Mittel im allgemeinen zum Gegenstand, insbesondere im Kampf gegen AIDS sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese Antisens-Starter in Verbindung mit einem annehmbaren pharmazeutischen Träger enthalten.
  • Die Erfindung betrifft auch die immunogenen Zusammensetzungen, welche ein oder mehrere Produkte der Übersetzung der Nucleotidsequenzen gemäß der Erfindung und/oder ein oder mehrere Produkte der Übersetzung der amplifizierten Nucleotidsequenzen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren, ausgehend von gemäß der Erfindung definierten Startern, umfassen, wobei diese Übersetzungsprodukte mit einem annehmbaren pharmazeutischen Träger verbunden sind.
  • Die Erfindung betrifft die Antikörper, welche gegen eines oder mehrere der oben beschriebenen Übesetzungsprodukte gerichtet sind (oder anders ausgedrückt, eine immunologische Reaktion mit einem oder mehreren Übersetzungsprodukten der Nucleotidsequenzen gemäß der Erfindung oder auch einem oder mehreren Übersetzungsprodukten der amplifizierten Nucleotidsequenzen, ausgehend von gemäß der Erfindung definierten Startern, bilden können) und ihre Verwendung zur Durchführung von in vitro Diagnoseverfahren der Infektion eines Individuums durch einen Virus vom Typ HIV-1 und/oder HIV-2 oder eines Tieres durch wenigstens einen der drei Viren (HIV-1, HIV-2, SIV), gemäß den im Stand der Technik bekannten Verfahren.
  • Zur Veranschaulichung umfaßt ein solches in vitro Diagnoseverfahren gemäß der Erfindung das Inkontaktbringen einer biologischen Probe (insbesondere von Serum), das von einem zu untersuchenden Patienten erhalten wird, mit Antikörpern gemäß der Erfindung, und den Nachweis mit Hilfe aller geeigneten Verfahren (insbesondere mit Hilfe von markierten Antiimmunoglobulinen) von immunologischen Komplexen, welche zwischen den Antigenen der Viren vom Typ HIV und SIV, welche gegebenenfalls in der biologischen Probe vorliegen, und den genannten Antikörpern, gebildet werden.
  • Die Erfindung hat auch in vitro Diagnosekits zum Gegenstand, welche Antikörper gemäß der Erfindung umfassen und gegebenenfalls geeignete Reagenzien zum Nachweis der immunologischen Reaktion, welche zwischen den Antikörpern und den Antigenen von HIV- oder SIV-Viren gebildet sind.
  • Die Erfindung zieht auch ein Verfahren zur Herstellung von oben genannten Polypeptiden in Betracht, insbesondere jenen, welche dem für die oben beschriebenen Nucleotidsequenzen (-startern) universellem Code entsprechen, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß es vorzugsweise von C-terminaler Ami nosäure ausgeht, man in Zweierschritten aufeinanderfolgend die aufeinanderfolgenden Aminozyklen in erforderlicher Reihenfolge kondensiert oder Aminozyklen und vorher gebildete Fragmente, welche schon mehrere Aminozyklenreste in geeigneter Reihenfolge enthalten oder auch mehrere vorher so hergestellte Fragmente, wobei festgehalten werden soll, daß man vorher alle reaktiven Funktionen, welche die Aminozyklen umfassen oder Fragmente mit Ausnahme von Aminfunktionen des einen und Carboxyl des anderen oder vice versa schützen muß, was normalerweise ein Eingreifen in die Bildung von Peptidbindungen, insbesondere nach Aktivierung der Carboxylfunktion umfaßt, gemäß den Verfahren, die zur Peptidsynthese und nachfolgend schrittweise bis zur N-terminalen Aminosäure führen, bekannt sind.
  • Beispielsweise kann man sich auf die Technik der Peptidsynthese in homogener Lösung berufen, welche durch Houbenweyl in "Methode der organischen Chemie" (Méthode de la chimie organique), herausgegeben von E. Wiensch, Bd. 15-I und II, THIEME, Stuttgart 1974, oder auf jene der Peptidsynthese in fester Phase, die durch R. D. Merrifield in "Solid phase peptide synthesis" (J. Am. Chem. Soc., 45, 2149-2d54) beschrieben ist.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Nucleotidsequenzen (oder Startern), die oben beschrieben sind, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:
  • - Inkubieren der genomischen DNA, Isolieren, ausgehend von Viren vom Typ HIV oder SIV, oben erwähnt, mit DNAase I, danach Zugabe von EDTA und Reinigen durch Extraktion mit einer Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Mischung (25/24/1), dann durch Ether,
  • - Behandeln der so behandelten DNA durch Eco R1-Methylase in Gegenwart von DTT und Reinigen durch Extraktion, wie oben erwähnt,
  • - Inkubieren der so gereinigten DNA mit 4 Desoxynucleotidtriphosphaten dATP, dCTP, dGTP und dTTP in Gegenwart von T4-DNA-Polymerase und DNA-Ligase von E. coli, dann Reinigen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren,
  • - Klonieren der so erhaltenen Nucleinsäuren in einem geeigneten Vektor und Erhalten der gesuchten Nucleinsäuren mit einer geeigneten Sonde.
  • Ein Verfahren, das insbesondere zur Herstellung der Nucleotidsequenzen der Erfindung vorteilhaft ist, umfaßt die folgenden Stufen:
  • - die Synthese von DNA, unter Verwendung des automatisierten Verfahrens von β-Cyanoethyl-Phosphoramidit, das in Bioorganic Chemistry 4, 274-325 (1986) beschrieben ist,
  • - die Klonierung der so erhaltenen Nucleinsäuren in einem geeigneten Vektor und das Erhalten der durch Hybridisieren mit einer geeigneten Sonde erhaltenen Nucleinsäuren.
  • Ein weiteres Verfahren zur Herstellung der Nucleotidsequenzen gemäß der Erfindung erfaßt die folgenden Stufen:
  • - das Sammeln von chemisch synthetisierten Oligonucleotiden, abgeleitet von ihren verschiedenen Restriktionsendstellen, wovon die Sequenzen mit der Verkettung von Aminosäuren des natürlichen Polypeptids gemäß dem Prinzip kompatibel sind, welche in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7461-7465 (1983) beschrieben sind,
  • - das Klonieren der so erhaltenen Nucleinsäuren in einem geeigneten Vektor und Erhalten der gesuchten Nucleinsäuren durch Hybridisieren mit einer geeigneten Sonde.

Claims (22)

1. Oligonucleotid, verwendbar als Starter (Aktivation) zur Amplifikation von Nucleisäuresequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß seine Sequenz unter den konservierten, spezifischen Sequenzen der Gene nef1, vif1 der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal und HIV-1 Eli ausgewählt wird oder unter den komplementären Sequenzen dieser letzteren.
2. Oligonucleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine konservierte und spezifische Sequenz eines Gens, das unter den Genen nef1, vif1 der Viren HIV-1 Bru oder HIV-1 Mal oder HIV-1 Eli und den ergänzenden Nucleotiden ausgewählt ist, oder eine komplementäre Nucleotidsequenz einer dieser letzteren Sequenzen enthält, wobei festgelegt ist, daß die möglichen ergänzenden Nucleotide, welche an der konservierten, spezifischen Nucleotidsequenz des fraglichen Gens an der 3'- oder 5-Endung "überstehen", vorzugsweise mit jenen zusammenfallen, welche sich diesseits der 3'- oder 5-Endungen angeordnet finden, welche dem Inneren selbst der vollständigen Sequenz der Gene der Viren vom oben erwähnten HIV-Typ entsprechen.
3. Oligonucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß seine Sequenz bezogen auf die Nucleotidsequenz eines Oligonucleotides nach Anspruch 1 oder 2 modifiziert ist und dadurch, daß es bei einer oben erwähnten Temperatur von 60ºC ± 1ºC mit dem Oligonucleotid gemäß Anspruch 1 oder 2 hybridisiert.
4. Oligonucleotid, verwendbar zur Amplifikation von Nucleinsäuresequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß seine Sequenz vom Gen env der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal und HIV-Eli stammt und dadurch, daß es einer der folgenden Nucleotidketten entspricht:
MMy5: CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT GCC CC
S, 6905-6930, 6903-6928, 6860-6885
MMy5bis: GGG GCA CAA TAA TGT ATG GGA ATT GG
S, 6930-6905, 6928-6903, 6885-6860
MMy6: AAT GGC AGT CTA GCA GAA GAA GA
S, 7055-7077, 7053-7075, 7010-7032
MMy7: ATC CTC AGG AGG GGA CCC AGA AAT T
S, 7360-7384, 7349-7373, 7306-7330
MMy7bis: ATT TTC TGG GTC CCC TCC TGA GGA T
AS, 7384-7360, 7373-7349, 7330-7306
MMy8: GTG CTT CCT GCT GCT CCC AAG AAC CC
AS, 7857-7832, 7846-7821, 7800-7775
MMy8bis: GGG TTC TTG GGA GCA GCA GGA AGC AC
S, 7832-7857, 7821-7846, 7775-7800,
MMy9: ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA AGT AG
... ... ... ..A ... ... ... ... ..
S, 8844-8869, 8836-8861, 8787-8812,
MMy9bis: CTA CTT TTT GAC CAC TTG CCA CCC AT
AS, 8869-8844, 8861-8836, 8812-8787,
MMy78: TAT TAA CAA GAG ATG GTG G
S, 7629-7647, 7612-7630, 7572-7590,
MMy89: CCA GCA AGA AAA GAA TGA A
S, 8224-8242, 8213-8231% 8167-8185,
MMy89bis: TTC ATT CTT TTC TTG CTG G
AS, 8242-8224, 8231-8213, 8185-8167,
5. Oligonucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß seine Sequenz bei einer Temperatur von 60ºC ± 1ºC mit einer Sequenz nach Anspruch 4 hybridisiert.
6. Oligonucleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß seine Sequenz vom Gen nef1 der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal und HIV-Eli stammt, entsprechend einer der folgenden Nucleotidketten:
MMy10 AAA AGA AAA GGG GGG ACT GGA
S, 9116-9136, 9117-9137, 9062-9082,
MMy10bis: TCC AGT CCC CCC IFFIT TCT TTT
AS, 9136-9116, 9137-9117, 9082-9062,
MMy11: AAA GTC CCC AGC GGA AAG TCC C
AS, 9503-9483, 9505-9484, 9449-9428,
7. Oligonucleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß seine Sequenz vom Gen vif 1 der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal und HIV-1 Eli stammt, entsprechend einer der folgenden Ketten:
MMy15: GAT TAT GGA AAA CAG ATG GCA GGT GAT
S, 5073-5099, 5068-5094, 5037-5063,
MMy 16: GCA GAC CAA CTA ATT CAT CTG TA
S, 5383-5405, 5378-5400, 5347-5369,
MMy16bis: TAC AGA TGA ATT AGT TGG TCT GC
AS, 5405-5383, 5400-5378, 5369-5347,
MMy17: CTT AAG CTC CTC TAA AAG CTC TA
AS, 5675-5653, 5670-5648, 5639-5617,
8. Starterpaar, dadurch gekennzeichnet, daß es Oligonucleotide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt, welche nach einer der folgenden Möglichkeiten verbunden sind: MMy7-MMy8 oder MMy9-MMy10bis oder MMy15-MMy17 oder MMy8bis-MMy89 oder MMy89bis-MMy9bis.
9. Verfahren zur Genamplifkation von Nucleinsäuresequenzen des Virus vom Typ HIV-1, welches ausgehend von einer biologischen Probe durchgeführt wird, wobei das Verfahren hauptsächlich die folgenden Stufen umfaßt:
- eine Stufe der Extraktion der nachzuweisenden Nucleinsäure, welche dem Genom des Virus vom Typ HIV-1 angehört und gegebenfalls in der erwähnten biologischen Probe vorliegt und ge gebenenfalls eine Stufe der Behandlung mittels einer inversen Transcriptase dieser Nucleinsäure, wenn die letztere in RNS-Form vorliegt,
- einen Zyklus, welcher die folgenden Stufen umfaßt:
· Denaturieren der nachzuweisenden doppelsträngigen Nucleinsäure, was zur Bildung einer einsträngigen Nucleinsäure führt,
· Hybridisieren jedes während der vorhergehenden Stufe der Denaturierung erhaltenen Nucleinsäurestranges mit wenigstens einem als Starter verwendeten Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, durch in Kontakt bringen der oben erwähnten Stränge mit wenigstens einem oben erwähnten Starterpaar,
· Bilden von DNS mit komplementären Strängen, ausgehend von den Startern, auf welchen sie in Gegenwart einer DNS-Polymerase und von vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten (dNTP) hybridisiert werden, was zur Bildung einer viel größeren Anzahl nachzuweisender doppelsträngiger Nucleinsäuren führt wie die vorhergehende Stufe der Denaturierung,
wobei dieser Zyklus eine Anzahl Male wiederholt wird, welche zum Erhalten der gegebenenfalls in der biologischen Probe vorliegenden, nachzuweisenden Nucleinsäure in einer zu ihrem Nachweis ausreichenden Menge, bestimmt wurde,
- eine Stufe des Nachweises der möglichen Gegenwart der Nucleinsäure, welche dem Genom des Virus vom Typ HIV-1 in der biologischen Probe angehört.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe der Extraktion von viraler DNS die folgenden Stufen umfaßt:
. Suspendieren des Zellrückstandes in 0,5 ml pyrolisiertem Wasser in einem Potter mit großem Kolben,
. Brechen der Zellen durch "Vor- und Rückgang",
. Zugabe von Triton X100 bis auf eine Endkonzentration von 0,1%,
. Denaturieren unter Erhitzen während 15 bis 25 min bei 100ºC,
. kurzes Zentrifugieren, um nur die Zellabfälle zu entfernen,
. Ausfällen von DNS über Nacht bei - 20ºC durch Zugabe von 2,5 Volumenteilen absolutem Ethanol und auf 10% des Endvolumens von 3-molarem Natriumacetat.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe der Retro-Transcription der viralen RNS die folgenden Stufen umfaßt:
- 10 ug in Wasser resuspendierte, extrahierte RNS wird mit dem Starter(Aktivator)paar jeweils in der Konzentration von 0,8 um in einem Endvolumen von 40 ul in Kontakt gebracht, alles wird bei 100ºC während 10 min denaturiert und dann in Eiswasser getaucht,
- man fügt 10 ul der folgenden Mischung zu: 5 ul Puffer "10 · Puffer" (welcher, wenn er auf 1/10 verdünnt ist, umfaßt: Tris-HCl, pH = 8,9: 50 mM; (NH4)&sub2;SO&sub4;: 15 mM; MgCl&sub2;: 5 mM; β- Mercaptoethanol: 10 mM; Gelatine: 0,25 mg/ml) + 1 Einheit reverse Transcriptase + 1 Einheit Taq- Polymerase + 1 ul der Mischung der 4 dNTP zu jeweils 25 mM + 10 pl Wasser Q. S. P., die Herstellung der cDNS geschieht durch Wirkung der reversen Transcriptase bei 42ºC während 13 Minuten, dann erhitzt man auf 95ºC während 3 min, um die reserve Transcriptase zu zerstören.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Denaturierungsstufe in Gegenwart von (einem) Starterpaar(en) nach einem der Ansprüche 1 bis 8 durchgeführt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wird:
- für die Stufe der Hybridisierung werden die Starter (1 ul einer Lösung zu 40 uMol jedes Starters) mit der DNS-Matrix (100 bis 300 mg) für die erste Stufe der Denaturierung-Wiederverbindung in Kontakt gebracht, dann erhitzt man für 10 min auf 100ºC, dann taucht man die Röhrchen, welche diese Mischung aus DNS-Matrix und Starter enthalten, in Eis enthaltendes Wasser, wobei die Starter in einer Endkonzentration in der Amplifikationsstufe verwendet werden, welche jeweils 0,8 uM beträgt;
- für die Amplifikationsstufe fügt man dem vorhergehenden Milieu die 4 dNTP, wobei alle zu 0,5 uMol der Endlösung (50 ul) verwendet werden und eine Einheit Taq-Polymerase für ein Reaktionsmilieu von 50 ul zu; diese Stufe wird in als "10 · Puffer" bezeichnetem Amplifikationspuffer durchgeführt, dessen Zusammensetzung in Anspruch 11 angegeben ist.
14. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 9 bis 13 zur in vitro-Diagnose der Infektion einer Person durch einen Virus vom Typ HIV-1 oder eines Tieres durch einen Virus vom Typ HIV-1.
15. Verfahren zur Expression von Proteinen, welche durch die Nucleotidsequenzen des Virus vom Type HIV-1, amplifizierbar mittels der Oligonucleotide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, codiert werden, umfassend die Stufen:
- in Kontakt bringen wenigstens eines Oligonucleotidpaares, das spezifisch für ein Gen ist, das unter den Genen env, nef1, vif1 eines Retrovirus vom Typ HiV-1 ausgewählt ist, wobei diese Oligonucleotide, welche Sequenzen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 entsprechen, mit Nucleotidsequenzen, welche vom Genom eines Virus vom Typ HIV-1 stammen, unter Bedingungen, welche die Hybridisierung dieser Sequenzen mit den Oligonucleotiden erlauben,
- Amplifizieren der in den Genen env, nef1, vif1 des Retrovirus vom Typ HIV-1 enthaltenen Nucleotidsequenzen ausgehend von den oben genannten Oligonucleotiden gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13,
- Gewinnen und Translatieren der so amplifizierten Sequenzen, um Proteinsequenzen zu erhalten.
16. Immunogene Zusammensetzung, umfassend ein (oder mehrere) Produkt(e) der Translation von Oligonucleotiden, entsprechend den Nucleinsäuresequenzen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder ein (oder mehrere) Produkt(e) der Translation der Nucleotidsequenzen, welche in einem der Gene env, nef1 oder vif1 des Retrovirus vom Type HIV-1, amplifiziert durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, enthalten sind, nach Hybridisierung mit einem Oligonucleotidpaar, ausgewählt unter den Oligonucleotiden gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, welche spezifisch für ein Gen eines Virus vom Typ HIV-1, ausgewählt unter den Genen env, nef1 oder vif1 sind und/oder mit einem (oder mehreren) Expressionsrodukt(en), erhalten durch das Verfahren nach Anspruch 15.
17. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 9 bis 13, umfassend:
- klein wenigstens ein Oligonucleotid-Starterpaar gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8,
- wenigstens ein Oligonucleotid-Starterpaar gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8,
- geeignete Reagenzien zur Durchführung des Amplifikationsoperationscyclus, nämlich DNS- Polymerase und 4 verschiedene Nucleotidtriphosphate,
- den Puffer "10XPuffer" wie er in Anspruch 11 beschrieben ist,
- eine (oder mehrere) Sonde(n), welche markiert werden kann bzw. können und mit der bzw. den nachzuweisenden amplifizierten Nucleinsäuresequenz(en) hybridisieren kann bzw. können.
18. Zusammensetzung für zur Behandlung viraler Erkrankungen, insbesondere von Aids, umfassend wenigstens eine Antisens-Nucleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
19. Antikörper, welche dazu geeignet sind, eine immunologische Reaktion mit den Produkten der Translation der Oligonucleotide, welche den Nucleinsäuresequenzen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 entsprechen, und/oder einem (oder mehreren) Produkte(n) der Translation der Nucleotidsequenzen, welche in einem der Gene env, nef1 oder vif1 des Virus vom Typ-HIV-1 enthalten sind, welche durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13 amplifiziert sind, einzugehen, nach Hybridisierung mit einem Oligonucleotid, das aus den Oligonucleotiden gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 ausgewählt ist, die spezifisch für ein Gen eines Virus vom Typ HIV-1 sind, welche aus den Genen env, nef1 oder vif1 ausgewählt sind und/oder mit einem (oder mehreren) Expressionsprodukt(en), erhalten durch das Verfahren nach Anspruch 15.
20. Verfahren zur in vitro-Diagnose der Infektion einer Person oder eines Tieres durch einen Virus vom Typ HIV-1, umfassend das in Kontakt bringen einer biologischen Probe (nämlich Serum), welche einem zu untersuchenden Patienten entnommen wird, mit Antikörpern nach Anspruch 19 und den Nachweis des immunologischen Komplexes, welcher zwischen den Antigenen der Viren vom Typ HIV-1, welche gegebenenfalls in der biologischen Probe vorhanden sind, und den Antikörpern gebildet ist.
21. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 20, umfassend die Antikörper nach Anspruch 19, und gegebenenfalls geeignete Reagenzien zum Nachweis der immunologischen Reaktion, welche zwischen den Antikörpern und den Antigenen der HIV-1 Viren erzeugt wird.
22. Pufferlösung ("10XPuffer"), verwendbar in einem Verfahren zum Amplifizieren von Nucleinsäuresequenzen mit Oligonucleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie, wenn sie auf 1/10 verdünnt ist, umfaßt:
- Tris-HCl, pH 8,9: 50 mM,
- (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;: 15 mM,
- MgCl&sub2;: 5 mM
- β-Mercaptoethanol: 10 mM
- Gelatine: 0,25 mg/ml.
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