JPH04152899A - ２段階ｐｃｒ法によるｈｉｖ―１ゲノムの検出法およびオリゴヌクレオチド - Google Patents
２段階ｐｃｒ法によるｈｉｖ―１ゲノムの検出法およびオリゴヌクレオチドInfo
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- JPH04152899A JPH04152899A JP2279589A JP27958990A JPH04152899A JP H04152899 A JPH04152899 A JP H04152899A JP 2279589 A JP2279589 A JP 2279589A JP 27958990 A JP27958990 A JP 27958990A JP H04152899 A JPH04152899 A JP H04152899A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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-
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- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
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- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野コ
本発明は、２段階ＰＣＲ法によるＨ Ｉ Ｖ−１ゲ、ツ
ムの高感度で高特異的な検出法、および、それに用いる
ＨＩＶ−１に特異的なオリゴヌクレオチドに関するもの
である。
ムの高感度で高特異的な検出法、および、それに用いる
ＨＩＶ−１に特異的なオリゴヌクレオチドに関するもの
である。
［従来の技術］
ＨＩ Ｖ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎ
ｃｙ ｖｉｒｕｓ）にはＨＩＶ−１とＨＩ Ｖ−２の２
型が知られており、そのうちＨＩ Ｖ−１はＡＩＤＳ（
後天性免疫不全症候群）の病原体として世界的に最も猛
威を振るっている。
ｃｙ ｖｉｒｕｓ）にはＨＩＶ−１とＨＩ Ｖ−２の２
型が知られており、そのうちＨＩ Ｖ−１はＡＩＤＳ（
後天性免疫不全症候群）の病原体として世界的に最も猛
威を振るっている。
現在、ＨＩＶ感染の診断にはＨＩＶに対する抗体の血清
学的検出法が最もよく利用されている。
学的検出法が最もよく利用されている。
しかし、抗体陽性が必ずしもＨＩＶの存在と一致せず、
また、感染初期には感染性ウィルスが存在しているにも
かかわらずまだ抗体価が上昇していないなど、大きな問
題がある。このためＨＩＶ抗原検出やウィルス分離など
の方法も行なわれているが、これらの方法も正確ではな
く問題が残っている。
また、感染初期には感染性ウィルスが存在しているにも
かかわらずまだ抗体価が上昇していないなど、大きな問
題がある。このためＨＩＶ抗原検出やウィルス分離など
の方法も行なわれているが、これらの方法も正確ではな
く問題が残っている。
最近、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ法）の利用により直接、末梢血白血球
中のＨＩＶプロウィルスＤＮＡを増幅し、高感度にＨＩ
Ｖの存在が検出できるようになったため、上記のような
問題は解決されようとしている（Ｋｗｏｋ、 Ｓ、 ａ
ｔａｔ、、 Ｊ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ凱（５）、 １６
９０−１６９４．１９８７． Ｏｕ。
ｒｅａｃｔｉｏｎ法）の利用により直接、末梢血白血球
中のＨＩＶプロウィルスＤＮＡを増幅し、高感度にＨＩ
Ｖの存在が検出できるようになったため、上記のような
問題は解決されようとしている（Ｋｗｏｋ、 Ｓ、 ａ
ｔａｔ、、 Ｊ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ凱（５）、 １６
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Ｃ−Ｙ、 ｅｔ ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２３９．
２９５−２９７．１９８８． Ｂｙ−ｒｎｅ、 Ｂ、
ｅｔ ａｌ、 、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ １６（９）、 ４１６５．１９８８．
Ｈａｒｔ、 Ｃ，ａｔ ａｌ、、 Ｌａｎｃｅｔ ５９
６−５９９、１９８８． Ｒａｙｆｉｅｌｄ、 Ｍ、
ａｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｉｎｆ、 Ｄｉｓ、 ｉ５ｇ（
６）、 １１７０−１１７５．１９８８． Ｓｉｍｍｏ
ｎｄｓ、 Ｐ、 ｅｔ ａｌ、。
２９５−２９７．１９８８． Ｂｙ−ｒｎｅ、 Ｂ、
ｅｔ ａｌ、 、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ １６（９）、 ４１６５．１９８８．
Ｈａｒｔ、 Ｃ，ａｔ ａｌ、、 Ｌａｎｃｅｔ ５９
６−５９９、１９８８． Ｒａｙｆｉｅｌｄ、 Ｍ、
ａｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｉｎｆ、 Ｄｉｓ、 ｉ５ｇ（
６）、 １１７０−１１７５．１９８８． Ｓｉｍｍｏ
ｎｄｓ、 Ｐ、 ｅｔ ａｌ、。
Ｊ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６４（２）、 ８６４−８７
２．１９９０． Ｏｋａ、Ｓ、 ｅｔａｌ、、 ＢＢＲ
Ｃ１６７（１）、 １９９０． Ｐａｎｇ、 Ｓ、 ａ
ｔ ａｌ、、 Ｎａ−ｔｕｒｅ ３４３．８５−８９．
１９９３。
２．１９９０． Ｏｋａ、Ｓ、 ｅｔａｌ、、 ＢＢＲ
Ｃ１６７（１）、 １９９０． Ｐａｎｇ、 Ｓ、 ａ
ｔ ａｌ、、 Ｎａ−ｔｕｒｅ ３４３．８５−８９．
１９９３。
しかし、ＨＩＶの重要な性質としてその遺伝子の高度の
変異性があるため、ＰＣＲに用いるプライマーをＨＩＶ
のどの遺伝子から選定するかが問題である。今までの報
告から見るとＬＴＲ，ｇａｇ、 ａｎＶの３箇所が用い
られてきたが、ｅｎｖは最も変異の激しい領域であるこ
とが判明したため、臨床検体等を検査する目的には不向
きであると考えられる。ＬＴＲ，ｇａｇはＨｒＶでよく
保存された領域であるため、よく使用きれている。
変異性があるため、ＰＣＲに用いるプライマーをＨＩＶ
のどの遺伝子から選定するかが問題である。今までの報
告から見るとＬＴＲ，ｇａｇ、 ａｎＶの３箇所が用い
られてきたが、ｅｎｖは最も変異の激しい領域であるこ
とが判明したため、臨床検体等を検査する目的には不向
きであると考えられる。ＬＴＲ，ｇａｇはＨｒＶでよく
保存された領域であるため、よく使用きれている。
［発明が解決しようとする課題］
前述したように、ＨＩＶにはＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の
２型が知られており、ＡＩＤＳの病原体として世界的に
最も猛威を振るっているのはＨＩＶ−１である。従って
、−型を区別して特にＨｒＶ−１を検出することは重要
な意味があるといってよい。
２型が知られており、ＡＩＤＳの病原体として世界的に
最も猛威を振るっているのはＨＩＶ−１である。従って
、−型を区別して特にＨｒＶ−１を検出することは重要
な意味があるといってよい。
そコテ本発明者等は、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２を区別し
てＨＩＶ−１を特異的にＰＣＲ検出する系を確立する目
的で研究を行なった。すなわち、本発明はＨＩ Ｖ−１
の高特異的、高感度な検出法およびそれに用いるＨ Ｉ
Ｖ−１に特異的なオリゴヌクレオチドを提供するもの
である。
てＨＩＶ−１を特異的にＰＣＲ検出する系を確立する目
的で研究を行なった。すなわち、本発明はＨＩ Ｖ−１
の高特異的、高感度な検出法およびそれに用いるＨ Ｉ
Ｖ−１に特異的なオリゴヌクレオチドを提供するもの
である。
［課題を解決するための手段］
本発明者等は、上記の目的を達成すべく種々の研究を重
ねた結果、ＨＩ Ｖ−１とＨＩＶ−２のゲ、ツム解析か
ら根本的に異なる遺伝子領域である叩ｒ−ｔａｔ−ｒｅ
ｖに看目し、その領域からオリゴヌクレオチドを選定、
そのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて本発
明者等が発明した２段階ＰＣＲ法（特願平２−２０６２
９０ ）を行なうことによりＨＩＶ−１の特異的な検出
が可能になることを見出し、さらに研究を重ねて本発明
を完成するに至った。
ねた結果、ＨＩ Ｖ−１とＨＩＶ−２のゲ、ツム解析か
ら根本的に異なる遺伝子領域である叩ｒ−ｔａｔ−ｒｅ
ｖに看目し、その領域からオリゴヌクレオチドを選定、
そのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて本発
明者等が発明した２段階ＰＣＲ法（特願平２−２０６２
９０ ）を行なうことによりＨＩＶ−１の特異的な検出
が可能になることを見出し、さらに研究を重ねて本発明
を完成するに至った。
すなわち本発明は、
（１）２段階ＰＣＲ法ｉ：ヨルＨＩ Ｖ−１’７’ツム
１７）検出法に関し、 ■ ｖｐｒ−ｔａｔ−ｒｅｖ領域から選択きれ、ＨＩＶ
−１ゲノムを特異的に検出し得るプライマーを用いる上
記（１）記載のＨＩＶ−１ゲノムの検出法に間し、 ３ 該プライマーが、それぞれ下記の（ａ）〜（ｄ）配
列で示される遺伝子配列のうちの少なくとも連続した１
５塩基以上の遺伝子配列を有し鎖長が１５〜４０塩基で
あるオリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｄ）であり、第一段
階ＰＣＲにオリゴヌクレ才チド（ａ）とオリゴヌクレオ
チド（ｄ）を用い、第二段階ＰＣＲにオリゴヌクレオチ
ド（ｂ）とオリゴヌクレオチド（ｃ）を用いる上記■記
載のＨＩ Ｖ−１ゲノムの検出法に関し、 （ａ） ５’ＧＧＧＴＧＴＣＧＡＣＡ工ＡＧＣＡＧＡＡ
ＴＡＧＧＣＧｒＴＡＣτ３（ｂ） ５゛ＡＴＧＧＡＧＣ
ＣＡＧＩＡＧＡＩＣＣＩＡＧＡＣ工ＡＧＡＧＣＣＣ３（
ｃ）５°ＣＧＣＴＩＣＴｒＣＣＴＧＣＣＡＩＡＧＧＡＧ
ＡＩＧＣＣＴＡＡＧ３（ｄ） ５’ＡＧＧＡＧＧＴＣＴ
ＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＴｒ３（４）
該２段階ＰＣＲ法において、第一段階ＰＣＲのプライマ
ー濃度がｏ、 ｏｏｓ〜０．０２５μＭである上記（１
）〜（３）のいずれかに記載のＨＩ Ｖ−１ゲノムの検
出法に関し、 （９それぞれ下記の（！Ｌ）〜（ｄ）配列で示される遺
伝子配列のうちの少なくとも連続した１５塩基以上の遺
伝子配列を有し鎖長が１５〜４０塩基であるオリゴヌク
レオチド（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択きれるオリ
ゴヌクレオチドに関するものである。
１７）検出法に関し、 ■ ｖｐｒ−ｔａｔ−ｒｅｖ領域から選択きれ、ＨＩＶ
−１ゲノムを特異的に検出し得るプライマーを用いる上
記（１）記載のＨＩＶ−１ゲノムの検出法に間し、 ３ 該プライマーが、それぞれ下記の（ａ）〜（ｄ）配
列で示される遺伝子配列のうちの少なくとも連続した１
５塩基以上の遺伝子配列を有し鎖長が１５〜４０塩基で
あるオリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｄ）であり、第一段
階ＰＣＲにオリゴヌクレ才チド（ａ）とオリゴヌクレオ
チド（ｄ）を用い、第二段階ＰＣＲにオリゴヌクレオチ
ド（ｂ）とオリゴヌクレオチド（ｃ）を用いる上記■記
載のＨＩ Ｖ−１ゲノムの検出法に関し、 （ａ） ５’ＧＧＧＴＧＴＣＧＡＣＡ工ＡＧＣＡＧＡＡ
ＴＡＧＧＣＧｒＴＡＣτ３（ｂ） ５゛ＡＴＧＧＡＧＣ
ＣＡＧＩＡＧＡＩＣＣＩＡＧＡＣ工ＡＧＡＧＣＣＣ３（
ｃ）５°ＣＧＣＴＩＣＴｒＣＣＴＧＣＣＡＩＡＧＧＡＧ
ＡＩＧＣＣＴＡＡＧ３（ｄ） ５’ＡＧＧＡＧＧＴＣＴ
ＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＴｒ３（４）
該２段階ＰＣＲ法において、第一段階ＰＣＲのプライマ
ー濃度がｏ、 ｏｏｓ〜０．０２５μＭである上記（１
）〜（３）のいずれかに記載のＨＩ Ｖ−１ゲノムの検
出法に関し、 （９それぞれ下記の（！Ｌ）〜（ｄ）配列で示される遺
伝子配列のうちの少なくとも連続した１５塩基以上の遺
伝子配列を有し鎖長が１５〜４０塩基であるオリゴヌク
レオチド（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択きれるオリ
ゴヌクレオチドに関するものである。
（ａ）５’ＧＧＧＴＧＴＣＧＡＣＡＩＡＧＣＡＧＡＡＩ
ＡＧＧＣＧＴＴＡＣτ３（ｂ）５°ＡＩＧＧＡＧＣＣＡ
ＧＴＡＧＡＩＣＣＩＡＧＡＣＩＡＧＡＧＣＣＣ３’（ｃ
） ５°ＣＧＣＴＴＣ工ＴＣＣＴＧＣＣＡＴＡＧＧＡＧ
ＡＴＧＣＣＴＡＡＧ３（ｄ）５’ＡＧＧＡＧＧＴＣＴｒ
ＣＧＴＣＧＣＩＧＴＣＴＣＣＧＣＩＴＣＴＴ３ただし、
オリゴヌクレオチド（ａ）とは上記（ａ）配列で示され
る遺伝子配列のうちの少なくとも連続した１５塩基以上
の遺伝子配列を有し鎖長が１５〜４０塩基であるオリゴ
ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド（ｂ）とは上
記（ｂ）配列で示される遺伝子配列のうちの少なくとも
連続した１５塩基以上の遺伝子配列を有し鎖長が１５〜
４０塩基であるオリゴヌクレオチドであり、オリゴヌク
レオチド（ｃ）とは上記（ｃ）配列で示きれる遺伝子配
列のうちの少なくとも連続した１５塩基以上の遺伝子配
列を有し鎖長が１５〜４０塩基であるオリゴヌクレオチ
ドであり、オリゴヌクレオチド（ｄ）とは上記（ｄ）配
列で示きれる遺伝子配列のうちの少なくとも連続した１
５塩基以上の遺伝子配列を有し鎖長が１５〜４０塩基で
あるオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレ
オチドは１５塩基長程度でも、ＨＩ Ｖ−１ゲノムを特
異的に検出し得るプライマーとして十分に用いることが
でき、４０塩基長程度でも十分可能である。
ＡＧＧＣＧＴＴＡＣτ３（ｂ）５°ＡＩＧＧＡＧＣＣＡ
ＧＴＡＧＡＩＣＣＩＡＧＡＣＩＡＧＡＧＣＣＣ３’（ｃ
） ５°ＣＧＣＴＴＣ工ＴＣＣＴＧＣＣＡＴＡＧＧＡＧ
ＡＴＧＣＣＴＡＡＧ３（ｄ）５’ＡＧＧＡＧＧＴＣＴｒ
ＣＧＴＣＧＣＩＧＴＣＴＣＣＧＣＩＴＣＴＴ３ただし、
オリゴヌクレオチド（ａ）とは上記（ａ）配列で示され
る遺伝子配列のうちの少なくとも連続した１５塩基以上
の遺伝子配列を有し鎖長が１５〜４０塩基であるオリゴ
ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド（ｂ）とは上
記（ｂ）配列で示される遺伝子配列のうちの少なくとも
連続した１５塩基以上の遺伝子配列を有し鎖長が１５〜
４０塩基であるオリゴヌクレオチドであり、オリゴヌク
レオチド（ｃ）とは上記（ｃ）配列で示きれる遺伝子配
列のうちの少なくとも連続した１５塩基以上の遺伝子配
列を有し鎖長が１５〜４０塩基であるオリゴヌクレオチ
ドであり、オリゴヌクレオチド（ｄ）とは上記（ｄ）配
列で示きれる遺伝子配列のうちの少なくとも連続した１
５塩基以上の遺伝子配列を有し鎖長が１５〜４０塩基で
あるオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレ
オチドは１５塩基長程度でも、ＨＩ Ｖ−１ゲノムを特
異的に検出し得るプライマーとして十分に用いることが
でき、４０塩基長程度でも十分可能である。
本発明ではＨＩ Ｖ−１ゲノムＤＮＡを特異的に増幅す
る方法として２段階ＰＣＲ法を用いた。ＰＣＲ法（Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ法）
とは、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを必要とするこ
とを利用した特定ＤＮＡ断片の増幅法である。その原理
は、目標塩基配列部に設定した２つのプライマー（オリ
ゴヌクレオチド）と４つのデオキンリボヌクレオンド三
リン酸［ｄＮＴＰｓ （ｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＧ
ＴＰ、 ｄｒｒＰ）］を用い、二本鎖ＤＮＡの一鎖を鋳
型としてＤＮＡポリメラーゼにより、２つのプライマー
で挾まれた部分の第二鎖が合成きれるというものである
。実際の方法は、各至適温度および時間条件下で、熱変
性によるＤＮＡの一本鎖化（デナチュレーション）、プ
ライマーの鋳型ＤＮＡへのアニーリング、ＤＮＡポリメ
ラーゼにょる相補ＭＤＮＡの合成（エクステンション）
を１サイクルとして、これを必要回数繰り返し特定のＤ
ＮＡ断片を合成する。２段階ＰＣＲ法は、このＰＣＲ法
を２回行なう方法であり、１段階目のプライマー度を通
常用いる１μＭより４０〜２００分の１低くすることを
特徴としている。これにより、従来のＰＣＲ法より高感
度、高特異的に目標ＤＮＡを増幅することができる。
る方法として２段階ＰＣＲ法を用いた。ＰＣＲ法（Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ法）
とは、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを必要とするこ
とを利用した特定ＤＮＡ断片の増幅法である。その原理
は、目標塩基配列部に設定した２つのプライマー（オリ
ゴヌクレオチド）と４つのデオキンリボヌクレオンド三
リン酸［ｄＮＴＰｓ （ｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＧ
ＴＰ、 ｄｒｒＰ）］を用い、二本鎖ＤＮＡの一鎖を鋳
型としてＤＮＡポリメラーゼにより、２つのプライマー
で挾まれた部分の第二鎖が合成きれるというものである
。実際の方法は、各至適温度および時間条件下で、熱変
性によるＤＮＡの一本鎖化（デナチュレーション）、プ
ライマーの鋳型ＤＮＡへのアニーリング、ＤＮＡポリメ
ラーゼにょる相補ＭＤＮＡの合成（エクステンション）
を１サイクルとして、これを必要回数繰り返し特定のＤ
ＮＡ断片を合成する。２段階ＰＣＲ法は、このＰＣＲ法
を２回行なう方法であり、１段階目のプライマー度を通
常用いる１μＭより４０〜２００分の１低くすることを
特徴としている。これにより、従来のＰＣＲ法より高感
度、高特異的に目標ＤＮＡを増幅することができる。
本発明では、鋳型ＤＮＡとして、ＨＩＶ−１感染細胞株
ＤＮＡを５種類、対照検体としてＨＩＶ２クローンプラ
スミドＤＮＡ、ＨＴＬＶ−１感染細胞株ＤＮＡ、ＨＴＬ
Ｖ−２クローンプラスミドＤＮＡを用いる。
ＤＮＡを５種類、対照検体としてＨＩＶ２クローンプラ
スミドＤＮＡ、ＨＴＬＶ−１感染細胞株ＤＮＡ、ＨＴＬ
Ｖ−２クローンプラスミドＤＮＡを用いる。
プライマーとしては、下記の（ａ）配列で示される遺伝
子配列のうち少なくとも連続した１５塩基以上の遺伝子
配列を含む１５〜４０ｍａｒのオリゴヌクレオチド、好
ましくは下記の（ａ）配列で示きれる３ ０ｍｅ ｒの
オリゴヌクレオチド（ｐＨＩＸｌ）、下記の（ｂ）配列
で示される遺伝子配列のうち少なくとも連続した１５塩
基以上の遺伝子配列を含む１５〜４０ｍａｒのオリゴヌ
クレオチド、好ましくは下記の（ｂ）配列で示きれる３
０ｍｅ ｒのオリゴヌクレオチド（ｐＨｌＸ２ ）、
下記の（ｃ）配列で示される遺伝子配列のうち少なくと
も連続した１５塩基以上の遺伝子配列を含む１５〜４０
ｍａ ｒのオリゴヌクレオチド、好ましくは下記の（ｃ
）配列で示される３ ０ｍｅ ｒのすリボヌクレオチド
（ｐＨｌＸ３ ）、下記の（ｄ）配列で示きれる遺伝子
配列のうち少なくとも連続した１５塩基以上の遺伝子配
列を含む１５〜４０ｍａ ｒのオリゴヌクレオチド、好
ましくは下記の（ｄ）配列で示される３０ｍｅｒのオリ
ゴヌクレオチド（ｐＨｌＸ４ ） 、を自動合成機で合
成して用いる。このプライマーは、第一段階ＰＣＲ−１
’はｐＨｌＸ１． ｐＨｌＸ４ヲ、第二段階ＰＣＲでは
ｐＨｌＸ２． ｐＨｌＸ３ヲ用’ｖ’ル、フ５ イアー
濃ｉハ、第一段階ＰＣＲでは０．０１〜０．０２５μＭ
１第二段階では通常の量、例えば０．５〜１μＭを用い
る。
子配列のうち少なくとも連続した１５塩基以上の遺伝子
配列を含む１５〜４０ｍａｒのオリゴヌクレオチド、好
ましくは下記の（ａ）配列で示きれる３ ０ｍｅ ｒの
オリゴヌクレオチド（ｐＨＩＸｌ）、下記の（ｂ）配列
で示される遺伝子配列のうち少なくとも連続した１５塩
基以上の遺伝子配列を含む１５〜４０ｍａｒのオリゴヌ
クレオチド、好ましくは下記の（ｂ）配列で示きれる３
０ｍｅ ｒのオリゴヌクレオチド（ｐＨｌＸ２ ）、
下記の（ｃ）配列で示される遺伝子配列のうち少なくと
も連続した１５塩基以上の遺伝子配列を含む１５〜４０
ｍａ ｒのオリゴヌクレオチド、好ましくは下記の（ｃ
）配列で示される３ ０ｍｅ ｒのすリボヌクレオチド
（ｐＨｌＸ３ ）、下記の（ｄ）配列で示きれる遺伝子
配列のうち少なくとも連続した１５塩基以上の遺伝子配
列を含む１５〜４０ｍａ ｒのオリゴヌクレオチド、好
ましくは下記の（ｄ）配列で示される３０ｍｅｒのオリ
ゴヌクレオチド（ｐＨｌＸ４ ） 、を自動合成機で合
成して用いる。このプライマーは、第一段階ＰＣＲ−１
’はｐＨｌＸ１． ｐＨｌＸ４ヲ、第二段階ＰＣＲでは
ｐＨｌＸ２． ｐＨｌＸ３ヲ用’ｖ’ル、フ５ イアー
濃ｉハ、第一段階ＰＣＲでは０．０１〜０．０２５μＭ
１第二段階では通常の量、例えば０．５〜１μＭを用い
る。
ＰＣＲの条件は、第一段階ＰＣＲでは、デナチュレーシ
ョン工程が９２〜９６℃で０．５〜２分、好ましくは９
４℃で１分、アニーリング工程が５０〜７２℃で０．５
〜２分、好ましくは６０℃で１分、エクステンション工
程が７０〜７４℃で１〜３分、好ましくは、７２℃で２
分の条件であり、これらの工程を１サイクルとして２０
〜３０サイクル、好ましくは２５サイクル行なう。
ョン工程が９２〜９６℃で０．５〜２分、好ましくは９
４℃で１分、アニーリング工程が５０〜７２℃で０．５
〜２分、好ましくは６０℃で１分、エクステンション工
程が７０〜７４℃で１〜３分、好ましくは、７２℃で２
分の条件であり、これらの工程を１サイクルとして２０
〜３０サイクル、好ましくは２５サイクル行なう。
第二段階ＰＣＲでは、デナチュレーシ５ン工程が９２〜
９６℃で０．５〜２分、好ましくは９４℃で１分、アニ
ーリング工程が５０〜７２℃で０．５〜２分、好ましく
は６５℃で１分、エクステンション工程が７０〜７４℃
で１〜３分、好ましくは７２°Ｃで２分の条件であり、
２５〜３５サイクル、好ましくは３０サイクル行なう。
９６℃で０．５〜２分、好ましくは９４℃で１分、アニ
ーリング工程が５０〜７２℃で０．５〜２分、好ましく
は６５℃で１分、エクステンション工程が７０〜７４℃
で１〜３分、好ましくは７２°Ｃで２分の条件であり、
２５〜３５サイクル、好ましくは３０サイクル行なう。
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは第一段階、第二段階共に、
アッセイ当り２〜３単位、好ましくは２．５単位用いる
。
アッセイ当り２〜３単位、好ましくは２．５単位用いる
。
増幅されたＤＮＡ断片は、アガロースとヌシーブ（Ｎｕ
ｓｉｅｖｅ ；商品名、宝酒造）の混合ゲルて分子量マ
ーカーと共に電気泳動を行ない、エチジウムブロマイド
染色した後、紫外線照射により検出する。
ｓｉｅｖｅ ；商品名、宝酒造）の混合ゲルて分子量マ
ーカーと共に電気泳動を行ない、エチジウムブロマイド
染色した後、紫外線照射により検出する。
［実施例コ
以下に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例により同等限定きれるものではない。
明はこれら実施例により同等限定きれるものではない。
施例−１（ＤＮＡの調製
次の各種ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとした。但し、（ｅ）はＤ
ＮＡ濃度を一定にするための希釈液、あるいは陰性対照
として用いた。
ＮＡ濃度を一定にするための希釈液、あるいは陰性対照
として用いた。
（ａ）ＨＩＶ−１感染細胞
■ ＨＴＬＶ−ＩＩＩｂ感染モル） −４１１ＥＪＰｂ
（Ｍ−ａｔｓｕｙａｍａ、τ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３．２５０４−２５０９、１９
８９＞（アメリカの患者から単離）■ ＬＡＶ−１感染
モルトー４細胞（Ｆ、 Ｂａｒ−ｒｅ−５ｉｎｏｕｓｓ
ｉ ｅｔ ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２２０．８６８
−８７０．１９８３）（アメリカの患者から単離） ■ ＨＩＶ−１＃８感染モルトー ４ 細Ｄ（ケニャの
患者から単離） ■ ＨＩＶ−１＃１５感染モルトー４ＪＩＢ１ｍ（ケニ
ャの患者から単離） ■ ＨＩＶ−１＃１７感染モルトー４１１ｉＪ胞（ケニ
ャの患者から単離） ■ ＨＩＶ−１（ＩＭＳ−２）感染モルト−４細胞（日
本の患者から単離） 以上の細砲の高分子ＤＮＡ：１１００ｎ／μ（ｂ） Ｈ
ＩＶ−２りｏ−ンブラスミドＤＮＡ（ＧＨ１） （Ｈａ
ｓｅｇａｗａ、 Ａ、 ｅｔ ａｌ、 、 ＡＩＤＳ
ｒｅｓｅａｒｃｈ ａ−ｎｄ Ｈｕｍａｎ ｒｅｔｒｏ
ｖｉｒｕｓｅｓ ５．５９３−６０４．１９８９＞（ｃ
）ＨＴＬＶ−１感染細胞株（ＴＬ−５ｕ、（Ｓｕｇａｍ
ｕｒａ、 Ｋ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｃ
ａｎｃｅｒ ３４．２２１−２２８、１９８４）の高分
子ＤＮＡ：１１００ｎ／μｍ（ｄ）ＨＴＬＶ−２’７ｏ
−ンブラスミドＤＮＡ（ｐＨ６−８３，５） （Ｓｈｉ
ｍｏｔｏｈｎｏ、 Ｋ、 ａｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔ−１、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８２．
３１０１−３１０５．１９８５）（ｅ）ＨＴＬＶ−１、
ＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２全て陰性の対照
細胞株（ヒト神経膠芽細胸腫細胞株； Ａ１７２． （
Ｉｇａｒａｓｈｉ、 Ｈ，ｅｔ ａ−１、、Ｏｎｃｏｇ
ｅｎｅ Ｌ、 ７９−８５．１９８７））の高分子ＤＮ
Ａ：１１００ｎ／μｌ 施例−２（プライマーの作 ＨＩＶ−１の２段階ＰＣＲ法用プライマーとして、下記
のオリゴヌクレオチドを自動合成機（ｃｙ−ｃｌｏｎｅ
、 Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社）で合成した。以下に、その
塩基配列、位置（ｎｔ）および長きを示した（Ｒａｔｎ
ｅｒ。
（Ｍ−ａｔｓｕｙａｍａ、τ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３．２５０４−２５０９、１９
８９＞（アメリカの患者から単離）■ ＬＡＶ−１感染
モルトー４細胞（Ｆ、 Ｂａｒ−ｒｅ−５ｉｎｏｕｓｓ
ｉ ｅｔ ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２２０．８６８
−８７０．１９８３）（アメリカの患者から単離） ■ ＨＩＶ−１＃８感染モルトー ４ 細Ｄ（ケニャの
患者から単離） ■ ＨＩＶ−１＃１５感染モルトー４ＪＩＢ１ｍ（ケニ
ャの患者から単離） ■ ＨＩＶ−１＃１７感染モルトー４１１ｉＪ胞（ケニ
ャの患者から単離） ■ ＨＩＶ−１（ＩＭＳ−２）感染モルト−４細胞（日
本の患者から単離） 以上の細砲の高分子ＤＮＡ：１１００ｎ／μ（ｂ） Ｈ
ＩＶ−２りｏ−ンブラスミドＤＮＡ（ＧＨ１） （Ｈａ
ｓｅｇａｗａ、 Ａ、 ｅｔ ａｌ、 、 ＡＩＤＳ
ｒｅｓｅａｒｃｈ ａ−ｎｄ Ｈｕｍａｎ ｒｅｔｒｏ
ｖｉｒｕｓｅｓ ５．５９３−６０４．１９８９＞（ｃ
）ＨＴＬＶ−１感染細胞株（ＴＬ−５ｕ、（Ｓｕｇａｍ
ｕｒａ、 Ｋ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｃ
ａｎｃｅｒ ３４．２２１−２２８、１９８４）の高分
子ＤＮＡ：１１００ｎ／μｍ（ｄ）ＨＴＬＶ−２’７ｏ
−ンブラスミドＤＮＡ（ｐＨ６−８３，５） （Ｓｈｉ
ｍｏｔｏｈｎｏ、 Ｋ、 ａｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔ−１、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８２．
３１０１−３１０５．１９８５）（ｅ）ＨＴＬＶ−１、
ＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２全て陰性の対照
細胞株（ヒト神経膠芽細胸腫細胞株； Ａ１７２． （
Ｉｇａｒａｓｈｉ、 Ｈ，ｅｔ ａ−１、、Ｏｎｃｏｇ
ｅｎｅ Ｌ、 ７９−８５．１９８７））の高分子ＤＮ
Ａ：１１００ｎ／μｌ 施例−２（プライマーの作 ＨＩＶ−１の２段階ＰＣＲ法用プライマーとして、下記
のオリゴヌクレオチドを自動合成機（ｃｙ−ｃｌｏｎｅ
、 Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社）で合成した。以下に、その
塩基配列、位置（ｎｔ）および長きを示した（Ｒａｔｎ
ｅｒ。
Ｌ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ３１３．２７７
−２８４．１９８５）＃ｐＨｌＸ１ ： ５’ＧＧＧ
ＴＧＴＣＧＡＣＡ工ＡＧＣＡＧＡＡＴＡＧＧＣＧＴ丁Ａ
ＣＴ３’ｎｔ； ５７８１−５８１０． ３０ｍａｒｐ
）ｔＩＸ２ ： ５ ’ ＡＩＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＧ
ＡＴＣＣＴＡＧＡＣ’ｆＡＧＡＧＣＣＣ３’ｎｔ； ５
８３０−５８５９． ３０ｍａｒｐＨＩＸ３ ： ５°
ＣＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＩＡＧＧＡＧＡ？ＧＣ
ＣＴＡＡＧ３ ’ｎｔ； ５９５５−５９８４． ３０
ｍａｒｐＨＩＸ４ ： ５°ＡＧＧＡＧＧＴＣＴＴＣＧ
ＩＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣτ工３゜ｎｔ； ５
９７７−６００６． ３０ｍ＠ｒこれらプライマーの位
置は第１図に示したように、ｖｐｒ、 ｔａｔ ａｘｏ
ｎ ２． ｒｅｖ ａｘｏｎ ２が含まれる位置にある
。これは、５種のＨＩ Ｖ−１クローン［ｐＮＬ４３２
（Ａｄａｅｈｉ、 Ａ、 ａｔ ａｔ、、 Ｊ、 Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ ５９（２）、２８４−２９１．１９８６
）、 ＨＴＬＶ−３／ＬＡＹ（ムｄａｃｈｉ、 Ａ、
ａｔａｌ、；前掲）、 ＡＲＶ−２（Ｓａｎｃｈｅｚ−
Ｐｅｓｃａｄｏｒ、 Ｒ，ａｔ ａ−１、、５ｃｉｅｎ
ｃ＠２２７．４８４−４９２．１９８５）、 ＢＨｌｏ
（Ｒａｔｎｅ−ｒ、 Ｌ、 ｅｔ ａｌ、 ；前掲）、
ＢＲＵ（Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、 Ｓ、 ａｔａｌ
、、 Ｃａ１ｌ ４０．９−１７．１９８５）コのＤＮ
Ａ配列を比較して、より共通している配列を選定し決定
した。
−２８４．１９８５）＃ｐＨｌＸ１ ： ５’ＧＧＧ
ＴＧＴＣＧＡＣＡ工ＡＧＣＡＧＡＡＴＡＧＧＣＧＴ丁Ａ
ＣＴ３’ｎｔ； ５７８１−５８１０． ３０ｍａｒｐ
）ｔＩＸ２ ： ５ ’ ＡＩＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＧ
ＡＴＣＣＴＡＧＡＣ’ｆＡＧＡＧＣＣＣ３’ｎｔ； ５
８３０−５８５９． ３０ｍａｒｐＨＩＸ３ ： ５°
ＣＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＩＡＧＧＡＧＡ？ＧＣ
ＣＴＡＡＧ３ ’ｎｔ； ５９５５−５９８４． ３０
ｍａｒｐＨＩＸ４ ： ５°ＡＧＧＡＧＧＴＣＴＴＣＧ
ＩＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣτ工３゜ｎｔ； ５
９７７−６００６． ３０ｍ＠ｒこれらプライマーの位
置は第１図に示したように、ｖｐｒ、 ｔａｔ ａｘｏ
ｎ ２． ｒｅｖ ａｘｏｎ ２が含まれる位置にある
。これは、５種のＨＩ Ｖ−１クローン［ｐＮＬ４３２
（Ａｄａｅｈｉ、 Ａ、 ａｔ ａｔ、、 Ｊ、 Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ ５９（２）、２８４−２９１．１９８６
）、 ＨＴＬＶ−３／ＬＡＹ（ムｄａｃｈｉ、 Ａ、
ａｔａｌ、；前掲）、 ＡＲＶ−２（Ｓａｎｃｈｅｚ−
Ｐｅｓｃａｄｏｒ、 Ｒ，ａｔ ａ−１、、５ｃｉｅｎ
ｃ＠２２７．４８４−４９２．１９８５）、 ＢＨｌｏ
（Ｒａｔｎｅ−ｒ、 Ｌ、 ｅｔ ａｌ、 ；前掲）、
ＢＲＵ（Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、 Ｓ、 ａｔａｌ
、、 Ｃａ１ｌ ４０．９−１７．１９８５）コのＤＮ
Ａ配列を比較して、より共通している配列を選定し決定
した。
施例−３（２段 ＰＣＲ法
ＰＣＲにはＧａｎｅＡｍｐ Ｋｉｔ （ＰＥＲＫＩＮ
ＥＬＭＥＲＣＥＴＵＳ；宝酒造）を用い、反応にはＰＥ
ＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲＣＥＴＵＳ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍ
ａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用して行なった。
ＥＬＭＥＲＣＥＴＵＳ；宝酒造）を用い、反応にはＰＥ
ＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲＣＥＴＵＳ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍ
ａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用して行なった。
検体としては、実施例−１の鋳型Ｄ Ｎ Ａ Ｃａ）を
各々（ａ）で１０倍段階希釈＜１０−’ 〜１０−’）
して用いた。また、（ｃ）、 （ａ）は０．５μｇ、
（ｂ）、 （ｄ）は１０ｎｇを用いた。これら（ｂ）、
（ｃ）、 （ｄ）、 （ｅ）は特異性を検討する対照
検体とした。
各々（ａ）で１０倍段階希釈＜１０−’ 〜１０−’）
して用いた。また、（ｃ）、 （ａ）は０．５μｇ、
（ｂ）、 （ｄ）は１０ｎｇを用いた。これら（ｂ）、
（ｃ）、 （ｄ）、 （ｅ）は特異性を検討する対照
検体とした。
実施例−２ので作製した各々のプライマーセットは、第
１図に示したようにｐＨｌＸ１． ｐＨｌＸ４の対でＡ
が、ｐＨｌＸ２． ＰＨＩＸ３（７）対テＢ（７）サイ
ズ（７）ＤＮＡが増幅きれる。 ｐＨｌＸ１〜ｐＨｌＸ
２のプライマーのうち、ｐＨｌＸ１． ｐＨｌＸ２はセ
ンス、ｐＨｌＸ３． ｐＨｌＸ４はアンチセンスである
。
１図に示したようにｐＨｌＸ１． ｐＨｌＸ４の対でＡ
が、ｐＨｌＸ２． ＰＨＩＸ３（７）対テＢ（７）サイ
ズ（７）ＤＮＡが増幅きれる。 ｐＨｌＸ１〜ｐＨｌＸ
２のプライマーのうち、ｐＨｌＸ１． ｐＨｌＸ２はセ
ンス、ｐＨｌＸ３． ｐＨｌＸ４はアンチセンスである
。
（１）第一段階ＰＣＲ
・各段階希釈の鋳型ＤＮＡ ：５μｌ（０，５μｇ
ＤＮＡ相当） ・１０倍反応緩衝液 ＝１０μｌ［：５００ｍＭ
ＫＣｌ、 １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，
３）、 １５ｍＭＭｇｃｉ、、 ０．１Ｘ（ｗ／ｖ）ゼ
ラチン］−ｄＮＴＰｓミックス ；１６μｌ
［１，２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ
、 ｄＧＴＰ、 ｄＩＩＰ）コ・ブライｖ−（ｐＨ
ＩＸｌ、 ｐＨｌＸ４）： ０．０１１１Ｍ・耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ＝２．５単位／アッセイ 以上を混和し、全液量を１００μｌとした。
ＤＮＡ相当） ・１０倍反応緩衝液 ＝１０μｌ［：５００ｍＭ
ＫＣｌ、 １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，
３）、 １５ｍＭＭｇｃｉ、、 ０．１Ｘ（ｗ／ｖ）ゼ
ラチン］−ｄＮＴＰｓミックス ；１６μｌ
［１，２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ
、 ｄＧＴＰ、 ｄＩＩＰ）コ・ブライｖ−（ｐＨ
ＩＸｌ、 ｐＨｌＸ４）： ０．０１１１Ｍ・耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ＝２．５単位／アッセイ 以上を混和し、全液量を１００μｌとした。
ＰＣＲ条件は、
デナチュレーション工程：９４°Ｃ，１分アニーリング
工程 ：６０℃、１分エクステンシ５ン工程 ＝７
２℃、２分以上を１サイクルとして２５サイクル行なっ
た。
工程 ：６０℃、１分エクステンシ５ン工程 ＝７
２℃、２分以上を１サイクルとして２５サイクル行なっ
た。
■ 第二段階ＰＣＲ
・鋳型ＤＮＡ ：１０μｌ（第一段
階ＰＣＲ産物の１０分のｌ量）・１０倍反応緩衝液
：１０μｌ−ｄＮＴＰｓミックス（１，２５ｍ
Ｍ ｄＮＴＰｓ） ： １６１１ トフラ４７−（ｐＨ
ｌＸ２． ｐＨｌＸ３） ： １．ＯＩＩＭ・耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼ ＝２．５単位／アッセイ 以上を混和し、全液量を１００μ！とした。
階ＰＣＲ産物の１０分のｌ量）・１０倍反応緩衝液
：１０μｌ−ｄＮＴＰｓミックス（１，２５ｍ
Ｍ ｄＮＴＰｓ） ： １６１１ トフラ４７−（ｐＨ
ｌＸ２． ｐＨｌＸ３） ： １．ＯＩＩＭ・耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼ ＝２．５単位／アッセイ 以上を混和し、全液量を１００μ！とした。
ＰＣＲ条件は、
デナチュレーシＢン工程：９４℃、１分アニーリング工
程 二６５℃、１分エクステンション工程 ニア２
℃、２分以上を１サイクルとして３０サイクル行なった
。
程 二６５℃、１分エクステンション工程 ニア２
℃、２分以上を１サイクルとして３０サイクル行なった
。
３ゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色による
検出 第二段階ＰＣＲ産物の１０分の１量、１０μ！を２．０
％ヌシーブ（商品名；宝酒造）と１．０％アガロースの
混合ゲルでＤＮＡ分子量マーカーとともに電気泳動した
６次いで、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色像
をＵＶイルミネータ−により得てポラロイド写真撮影後
、検出判定した。第二段階ＰＣＲ産物の理論上の標的サ
イズは１５５ｂｐｓである。
検出 第二段階ＰＣＲ産物の１０分の１量、１０μ！を２．０
％ヌシーブ（商品名；宝酒造）と１．０％アガロースの
混合ゲルでＤＮＡ分子量マーカーとともに電気泳動した
６次いで、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色像
をＵＶイルミネータ−により得てポラロイド写真撮影後
、検出判定した。第二段階ＰＣＲ産物の理論上の標的サ
イズは１５５ｂｐｓである。
■
（１）鋳型ＤＮＡとして、実施例−１に記載の（ａ）Ｈ
Ｉ Ｖ −１感染細胞■のＤＮＡを用いて２段階ＰＣＲ
を行なった結果、１０−１希釈まで特異的なサイズのバ
ンド（１５５ｐｂｓ）が明瞭に検出きれた。
Ｉ Ｖ −１感染細胞■のＤＮＡを用いて２段階ＰＣＲ
を行なった結果、１０−１希釈まで特異的なサイズのバ
ンド（１５５ｐｂｓ）が明瞭に検出きれた。
（２） ＨＩＶ−２，ＨＴＬＶ−１，ＨＴＬＶ−２の
それぞれの鋳型Ｄ Ｎ Ａ （ｂ）、 （ｃ）、 （ｄ
）を鋳型として２段階ＰＣＲを行なった結果、何れも陰
性で、バンドは検出できなかった。
それぞれの鋳型Ｄ Ｎ Ａ （ｂ）、 （ｃ）、 （ｄ
）を鋳型として２段階ＰＣＲを行なった結果、何れも陰
性で、バンドは検出できなかった。
ｃ３）５種＋７）ＨＩ Ｖ−１クローンノ鋳型ＤＮＡ（
ａ）の■、■、■、■、■を鋳型として２段階ＰＣＲを
行なった結果、■は１０１希釈まで、その他は（１）の
結果と同じ＜１０−’希釈まで特異的なサイズのバンド
（１５５ｂｐｓ）が明瞭に検出きれた。
ａ）の■、■、■、■、■を鋳型として２段階ＰＣＲを
行なった結果、■は１０１希釈まで、その他は（１）の
結果と同じ＜１０−’希釈まで特異的なサイズのバンド
（１５５ｂｐｓ）が明瞭に検出きれた。
各鋳型ＤＮＡの由来は、■、■はアメリカ、■、■、■
はアフリカ、■は日本の各患者から分離きれたものであ
る。
はアフリカ、■は日本の各患者から分離きれたものであ
る。
■
結果（１）より、１０−″希釈まで特異的に検出可能で
あった。ここで用いたＨ Ｉ Ｖ−１感染細胞は細胞あ
たりのはっきりしたＨ Ｉ Ｖ−１ゲノム数は不明であ
るが、ヒト細胞１０”個のＤＮＡ量は約１μ２に相当す
ることから、１０１希釈の５μｌ（０，５μｇ）中Ｇｍ
ｆｔＨＩＶ−１感染細胞が０５個と計算される。従って
、感染細胞０，５個以上は検出可能であり十分な検出感
度が得られている。
あった。ここで用いたＨ Ｉ Ｖ−１感染細胞は細胞あ
たりのはっきりしたＨ Ｉ Ｖ−１ゲノム数は不明であ
るが、ヒト細胞１０”個のＤＮＡ量は約１μ２に相当す
ることから、１０１希釈の５μｌ（０，５μｇ）中Ｇｍ
ｆｔＨＩＶ−１感染細胞が０５個と計算される。従って
、感染細胞０，５個以上は検出可能であり十分な検出感
度が得られている。
結果（２）ヨリ、ＨＩＶ−２，ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ
−２の何れのＤＮＡも鋳型としてＰＣＲ＊れなかった。
−２の何れのＤＮＡも鋳型としてＰＣＲ＊れなかった。
ここで用いた何れのＤＮＡも鋳型として十分量を実験に
使用したので、検出感度の問題ではなく、特異性の問題
であると結論される。すなわち、本発明者がここで決定
したプライマーは特異的にＨＩＶ−１のみを鋳型として
ＰＣＲするものである。
使用したので、検出感度の問題ではなく、特異性の問題
であると結論される。すなわち、本発明者がここで決定
したプライマーは特異的にＨＩＶ−１のみを鋳型として
ＰＣＲするものである。
さらに、結果（υと（３）より、アフリカ、アメリカ、
日本といった様々な地域から分離されたＨＩＶ−１クロ
ーンを同感度、同特異性で検出できることが確認きれた
。従って、ここで決定したプライマーはＨＩ Ｖ−１を
ＰＣＲで検出するためのユニバーサルプライマーとして
十分使用可能と考えられる。
日本といった様々な地域から分離されたＨＩＶ−１クロ
ーンを同感度、同特異性で検出できることが確認きれた
。従って、ここで決定したプライマーはＨＩ Ｖ−１を
ＰＣＲで検出するためのユニバーサルプライマーとして
十分使用可能と考えられる。
第１図は、ｖｐｒ、 ｔａｔ ｅｘｏｎ２． ｒｅｖ
ｅｘｏｎ２領域、およびその領域に対応するプライマー
の２段階ＰＣＲ法における相対的配置を示している。
ｅｘｏｎ２領域、およびその領域に対応するプライマー
の２段階ＰＣＲ法における相対的配置を示している。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）２段階ＰＣＲ法によるＨＩＶ−１ゲノムの検出法
。 （２）ｖｐｒ−ｔａｔ−ｒｅｖ領域から選択され、ＨＩ
Ｖ−１ゲノムを特異的に検出し得るプライマーを用いる
請求項（１）記載のＨＩＶ−１ゲノムの検出法。 ３ 該プライマーが、それぞれ下記の（ａ）〜（ｄ）配
列で示される遺伝子配列のうちの少なくとも連続した１
５塩基以上の遺伝子配列を有し鎖長が１５〜４０塩基で
あるオリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｄ）であり、第一段
階ＰＣＲにオリゴヌクレオチド（ａ）とオリゴヌクレオ
チド（ｄ）を用い、第二段階ＰＣＲにオリゴヌクレオチ
ド（ｂ）とオリゴヌクレオチド（ｃ）を用いる請求項２
記載のＨＩＶ−１ゲノムの検出法。 （８）５’ＧＧＧＴＧＴＣＧＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＴ
ＡＧＧＣＧＴＴＡＣＴ３’（ｂ）５’ＡＴＧＧＡＧＣＣ
ＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＧＣＣＣ３’（
ｃ）５’ＣＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＡＧＧＡＧ
ＡＴＧＣＣＴＡＡＧ３’（ｄ）５’ＡＧＧＡＧＧＴＣＴ
ＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴ３’（４
）該２段階ＰＣＲ法において、第一段階ＰＣＲのプライ
マー濃度が０．００５〜０．０２５μＭである請求項（
１）〜（３）のいずれかに記載のＨＩＶ−１ゲノムの検
出法。 （５）それぞれ下記の（ａ）〜（ｄ）配列で示される遺
伝子配列のうちの少なくとも連続した１５塩基以上の遺
伝子配列を有し鎖長が１５〜４０塩基であるオリゴヌク
レオチド（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるオリ
ゴヌクレオチド。 （ａ）５’ＧＧＧＴＧＴＣＧＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＴ
ＡＧＧＣＧＴＴＡＣＴ３’（ｂ）５’ＡＴＧＧＡＧＣＣ
ＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＧＣＣＣ３’（
ｃ）５’ＣＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＡＧＧＡＧ
ＡＴＧＣＣＴＡＡＧ３’（ｄ）５’ＡＧＧＡＧＧＴＣＴ
ＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴ３’
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2279589A JPH04152899A (ja) | 1990-10-17 | 1990-10-17 | ２段階ｐｃｒ法によるｈｉｖ―１ゲノムの検出法およびオリゴヌクレオチド |
| KR1019910010720A KR920008195A (ko) | 1990-10-17 | 1991-06-26 | 2단계 pcr법에 의한 hiv-1게놈의 검출방법 및 그 방법에 사용된 올리고뉴클레오티드 |
| EP91115384A EP0481215A1 (en) | 1990-10-17 | 1991-09-11 | Method for the detection of an HIV-1 genome by a two-step PCR method and oligonucleotide used in the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2279589A JPH04152899A (ja) | 1990-10-17 | 1990-10-17 | ２段階ｐｃｒ法によるｈｉｖ―１ゲノムの検出法およびオリゴヌクレオチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04152899A true JPH04152899A (ja) | 1992-05-26 |
Family
ID=17613096
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2279589A Pending JPH04152899A (ja) | 1990-10-17 | 1990-10-17 | ２段階ｐｃｒ法によるｈｉｖ―１ゲノムの検出法およびオリゴヌクレオチド |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0481215A1 (ja) |
| JP (1) | JPH04152899A (ja) |
| KR (1) | KR920008195A (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6174668B1 (en) | 1993-05-14 | 2001-01-16 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of two or more target DNA's using primers having matched melting temperatures |
| US6709813B1 (en) | 1993-05-14 | 2004-03-23 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of human CMV DNA using primers having matched melting temperatures |
| US5403707A (en) * | 1993-05-14 | 1995-04-04 | Eastman Kodak Company | Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of retroviral DNA using primers having matched melting temperatures |
| DE69620596T2 (de) * | 1995-05-19 | 2002-11-21 | Abbott Laboratories, Abbott Park | Nachweis von nukleinsäuren mit breitem dynamikbereich unter verwendung von aggregat-primer-reihen |
| DE60041489D1 (de) | 1999-07-09 | 2009-03-19 | Gen Probe Inc | Nachweis von hiv-1 durch amplifizierung von nukleinsäuren |
| US6770752B2 (en) * | 2001-01-09 | 2004-08-03 | Becton, Dickinson And Company | Sequences for detection of HIV-1 |
| CN107385116B (zh) * | 2017-09-13 | 2021-02-19 | 北京旌准医疗科技有限公司 | 一种检测1型人类免疫缺陷病毒的方法及其专用成套试剂 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| DE05014676T1 (de) * | 1989-06-02 | 2007-05-10 | Institut Pasteur | Nukleotid-Sequenzen von HIV-1, HIV-2 und SIV Retrovirusgenomen, ihre Verwendung zur Amplifizierung von diesen Retroviren und zur In Vitro Diagnostik von diesen Viren verursachten Infektionen |
-
1990
- 1990-10-17 JP JP2279589A patent/JPH04152899A/ja active Pending
-
1991
- 1991-06-26 KR KR1019910010720A patent/KR920008195A/ko not_active Application Discontinuation
- 1991-09-11 EP EP91115384A patent/EP0481215A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR920008195A (ko) | 1992-05-27 |
| EP0481215A1 (en) | 1992-04-22 |
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