DE69333636T2

DE69333636T2 - Nukleotid- und Peptidsequenzen des Immunschwächevirus der Katze, Isolat WO und Anwendungen der Sequenzen in der Diagnostik und zur Verhinderung der Infektion

Info

Publication number: DE69333636T2
Application number: DE69333636T
Authority: DE
Inventors: Gianfranco Pancino; Colombe Chappey; Bruno Hurtrel; Anne Moraillon; David Klatzmann; Pierre Sonigo; William Saurin; Alexandre Avrameas; Arthur Donny Strosberg
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1992-06-16
Filing date: 1993-06-16
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2013-06-17
Also published as: EP0577458A1; ATE278018T1; DE69333636D1; EP0577458B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Peptide und ihre Fragmente, die für das Virus der Katzen-Immundefizienz (virus de l'immunodéficience féline (VIF)) spezifisch sind sowie auf die Verwendung der genannten Fragmente als Reagens zur Diagnose und als Agens, das eine Immunantwort (zelluläre und/oder Produktion von Antikörpern) induziert, insbesondere zur Prävention der Katzen-Immundefizienz.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Nukleotidsequenzen, die für die Peptide kodieren.
Katzen-Immundefizienz wird durch ein Lentivirus, das Katzen-Immundefizienz-Virus (VIF) verursacht, das eine genetische Struktur ähnlich der der Lentiviren der Primaten (VIH und VIS) zeigt.
Die Katzen-Immundefizienz stellt ein wichtiges Problem der Tiergesundheit dar, und zwar in dem Maße wie eine bedeutende Anzahl von Katzen, die durch das VIF infiziert waren, in den Vereinigten Staaten, in Japan und in Europa entdeckt wurde (5 bis 25% der Tiere).
Derzeit wird die Katzen-Immundefizienz im Wesentlichen beim Auftreten klinischer Anzeichen (allgemeine Lymphknotenerkrankung und Auftreten opportunistischer Infektionen) diagnostiziert, so dass eine sehr frühe Diagnose sowohl bei der Behandlung als auch bei der Prävention dieser Krankheit Vorteile hätte.
In der ganzen Welt haben mehrere unabhängige virale Isolate Aufmerksamkeit erregt und eine bestimmte Anzahl von Arbeiten, um die Struktur der isolierten Stämme zu beweisen, wurde durchgeführt, insbesondere in Bezug auf den amerikanischen Stamm Petaluma [R. L. Talbott et al. (Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 5743–5747); T. R. Philipps et al. (J. Virol., 1990, 64, 10, 4605–4613)], die japanischen Stämme (Stämme TM1 und TM2) [T. Miyazawa et al. (Arch. Virol., 1989, 108, 59–68)] oder die Schweizer Isolate (FIVZ1 und FIVZ2) [S. Morikawa et al. (Virus Research, 1991, 21, 53–63)].
Die Nukleotidsequenzen von drei proviralen Klonen, die von den amerikanischen Isolaten des VIF stammen (Stamm Petaluma) wurden beschrieben (Klone FIV34TF10, FIV14 und Isolat PPR) [R. A. Olmsted et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 2448–2452); T. R. Philipps et al., 1990; R. L. Talbott et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 5743–5747) und mit zwei Schweizer Isolaten (S. Morikawa et al.) verglichen. Dieser Vergleich hat S. Morikawa et al. dazu geführt, das Vorliegen von bestimmten konservierten Regionen und bestimmten variablen Regionen in Gen env des VIF zu präzisieren.
Es wurden auch französische Stämme isoliert (die Stämme Wo und Me) [A. Moraillon et al., 1992, Vet. Mic., 31, 41–45, In vitro properties and experimental pathogenic effect of three feline immunodeficiency viruses isolated from cats with terminal diseases].
Es wird davon ausgegangen, dass die Hüllproteine des VIF im Mittelpunkt der Beziehung Wirt-Virus stehen; ihre Untersuchung ist demnach essentiell, um die Wechselwirkung des Virus mit dem Immunsystem (Neutralisationsepitope, Epitope B und T) und mit den Zielzellen der Infektion zu verstehen und leistungsfähige Reagenzien zur Diagnose wie auch wirksame Impfstoffe herzustellen, die aus viralen Proteinen mit immunogener und schützender Wirkung gegenüber der Gesamtheit der VIF-Stämme bestehen.
Das env-Protein des VIF kann nach Spaltung zwei Glycoproteinfragmente liefern, die SU (Oberflächenglycoprotein) und TM (Transmembranglycoprotein) genannt werden.
Es wurde gezeigt, dass Peptidfragmente aus dem env-Protein des VIF Hauptdeterminanten des Schutzes enthalten (französische Patentanmeldung Nr. 2 669 338 oder Internationale PCT-Anmeldung WO 92/09632 im Namen der Anmelderin).
Durch ihre Arbeiten hat die Anmelderin gefunden:

– Einerseits ist es im Hinblick auf die Entwicklung von leistungsfähigeren diagnostischen Werkzeugen und Mitteln zur Herstellung von spezifisch schützenden Vakzinen wichtig, ausgehend von diesen Stämmen Sequenzen zu selektionieren, die geeignet sind, um in der frühzeitigen differenziellen Diagnostik der Katzen-Immundefizienz leistungsfähig zu sein, und die fähig sind, Produkte zu produzieren, die durch Gentechnologie abgeleitet sind, mit dem Ziel einer Impfung oder einer an den infizierenden Stamm angepasste Immuntherapie zu wählen;
– andererseits war es zur Optimierung der Diagnose wie auch der Prävention (Impfstoff-Untereinheiten) notwendig, virale Peptide kleiner Größe auszuwählen, die insbesondere an die Diagnose und Prävention angepasst sind und es ermöglichen, einen Pool an Reagenzien zur Detektion der Gruppe (Gesamtheit der VIF-Stämme) und/oder die Typdetektion (selektive Detektion bestimmter Stämme) zu ermöglichen.

Die vorliegende Erfindung hat sich folglich zum Ziel gesetzt, einerseits Sequenzen, die vom VIF stammen, und ihre Fragmente, die insbesondere wegen ihrer Stammspezifität ausgewählt wurden, zur Verfügung zu stellen und andererseits eine Zusammensetzung mit immunogener und/oder schützender Wirkung spezifisch gegen das Virus der Katzenimmundefizienz bereitzustellen, erhalten durch Exprimieren der Fragmente, die wegen ihrer neutralisierenden Fähigkeit und/oder des Vorliegens von Epitopen zur Erkennung der Gruppe und/oder des Typs ausgewählt wurden; den Erhalt durch Gentechnologie oder chemischer Synthese von solchen spezifischen Peptiden hat den Vorteil, dass das Problem der Virusproduktion gelöst wird und die gewünschten Peptide direkt erhalten werden.
Nukleotidsequenzen, die aus der genomischen RNA des Virus der Katzen-Immundefizienz (VIF) stammen, umfassen wenigstens ein Fragment eines Gens, das hypervariable Zonen zeigt und das aus der Gruppe, bestehend aus dem Gen, das für das Protein env des Stamms Wo des VIF kodiert, und dem Gen, das für das Protein gag des Stamms Wo des VIF kodiert, ausgewählt ist.
Was die genannte Sequenz angeht, so umfasst diese die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der folgenden Formel I, die dem Gen env des VIF, Stamm Wo, entspricht:
Eine solche Sequenz entspricht der cDNA der mRNA des Proteins env des Stamms Wo des VIF.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Peptid, das vom Env-Protein des VIF des Stamms Wo stammt, das ein konserviertes Epitop der Proteine des VIF bildet, dadurch gekennzeichnet, dass es aus der Gruppe, bestehend aus

– dem Fragment aus 45 Aminosäuren, das TM3 genannt wird, und den Positionen 744–788 der Sequenz der Formel I entspricht,
– dem Fragment der Sequenz Gln⁷⁶³-Gln-Leu-Gln-Glu-Trp-Glu-Asp⁷⁷⁰ (Peptid, das P241 genannt wird), das den Positionen 763–770 der Sequenz der Formel I entspricht, und
– dem Fragment der Sequenz Val⁷⁷²-Gly-Trp-Ile-Gly-Asn-Ile-Pro⁷⁷⁹ (Peptid, das P242 genannt wird), das den Positionen 772–779 der Sequenz der Formel I entspricht,

Dieses Peptid wird besonders von den Antikörpern erkannt, die gegen wenigstens einen Stamm gerichtet sind, der sich von dem unterscheidet, von dem das Peptid stammt, und/oder durch die Antikörper erkannt, die von infizierten Katzen natürlicherweise produziert werden; außerdem weist es die Fähigkeit zur Induktion einer zellulären Immunantwort und/oder zur Erzeugung von schützenden Antikörpern gegen wenigstens einen VIF-Stamm bei nicht-infizierten Katzen auf.
Das Fragment beinhaltet ein Segment aus 45 Aminosäuren, das TM3 genannt wird, und den Positionen 744–788 der folgenden Sequenz der Formel II entspricht, wobei das Segment ein Epitop enthält, welches die Sequenz Gln⁷⁶⁴-Leu-Gln-Glu-Trp-Glu-Asp-Trp-Val-Gly-Trp-Ile-Gly-Asn-Ile⁷⁷⁸ oder die Sequenz Gln⁷⁶³-Gln-Leu-Gln-Glu-Trp-Glu-Asp⁷⁷⁰ (Peptid, das P241 genannt wird) oder die Sequenz Val⁷⁷²-Gly-Trp-Ile-Gly-Asn-Ile-Pro⁷⁷⁹ (Peptid, das P242 genannt wird) umfasst.
Das Peptid, das dem Env-Protein des VIF, Stamm Wo, entspricht, zeigt die folgende Sequenz:
Unter Epitop versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung die Epitope, die allen VIF-Stämmen gemeinsam sind (konservierte Zonen), die durch die Antikörper erkannt werden, die gegen alle VIF-Stämme gerichtet sind (Gruppenerkennung); darüber hinaus induzieren alle diese Fragmente eine Antikörperproduktion und/oder eine zelluläre Antwort.
Diese Fragmente haben den Vorteil, dass sie bezüglich VIF Selektivität und/oder eine bedeutende Spezifität aufweisen, obgleich sie eine kleine Größe haben [Selbstkostenpreis (prix de revient nettement diminué) verringert].
Diese Peptide werden durch eine Sequenz oder ein Nukleotidsequenzfragment definiert, wie es/sie in der Sequenz der Formel I unten definiert ist.
Diese Peptide TM3 ermöglichen:

– unter diagnostischem Gesichtspunkt: als universelle Fragmente die durch ein VIF, wenn es vorliegt, ganz gleich welcher Stamm, produzierten Antikörper zu erkennen;
– unter einem schützenden Gesichtspunkt (insbesondere als Impfstoff):

Die Fragmente TM3 induzieren spezifischerweise die Produktion an Antikörpern und gegebenenfalls eine zelluläre Antwort; als Folge gewährleistet der Pool aus Peptiden gemäß der Erfindung entweder einen spezifischen Schutz gegenüber dem Ursprungsstamm oder einen weiteren Schutz (mehrere VIF-Stämme).
Im Sinn der vorliegenden Erfindung umfasst der Ausdruck Peptidfragment alle Fragmente, die ein Peptidsegment gemäß der Erfindung enthalten sowie die homologen Peptide; im Allgemeinen versteht man unter homologem Peptid Peptidfragmente, deren Position und Funktion im Inneren des VIF (selbe Lokalisierung wie die oben definierte auf dem Genom des VIF) äquivalent sind; was insbesondere die Fragmente TM3 angeht, so versteht man unter homologen Peptiden die Peptide, die die Eigenschaften zur Erkennung der Antikörper, die gegen das Referenzpeptid gerichtet sind, nicht verlieren.
Die Gesamtheit der genannten Peptide kann vorteilhafterweise durch Klonierung oder durch Synthese, insbesondere durch Merrifield-Synthese erhalten werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein rekombinanter Klonierungs- und/oder Expressionsvektor, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine Nukleotidsequenz umfasst, die für eines der Peptide TM3, die oben definiert wurden, kodiert.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter rekombinantem Vektor sowohl ein Plasmid, ein Cosmid wie auch einen Phagen.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des Vektors besteht dieser aus einem Plasmid, das einen Replikationsursprung, mindestens einen Selektionsmarker und eine Nukleotidsequenz, die für eines der oben definierten Peptide TM3 kodiert, umfasst, wobei der Vektor ein Klonierungsvektor ist.
Nach einer vorteilhaften Anordnung dieser Art der Durchführungsform wird der Klonierungsvektor von einem Plasmid gebildet, das fähig ist, sich in E. coli zu replizieren, in das eine Nukleotidsequenz, die für eines der Peptide TM3, die oben definiert sind, kodiert, insertiert ist.
Wenn man die Sequenz der Formel I in einen Vektor Bluescript^® SK⁺ einführt, wird der Vektor pKSel genannt.
Dieser Vektor wurde bei der Collection Nationale de Microorganismes, die vom Institut Pasteur unterhalten wird, am 12. Juni 1992 unter der Nummer I-1220 hinterlegt.
Wenn die Sequenz in einen Vektor Bluescript^® KS⁺ eingeführt wird, wird der Vektor pKSe genannt.
Nach einer anderen Ausführungsform dieses Vektors wird dieser durch einen rekombinanten Vektor gebildet, umfassend einen Replikationsursprung in einem geeigneten Mikroorganismuswirt, insbesondere einem Bakterium oder einer Eukaryontenzelle, wenigstens ein Gen, dessen Expression die Selektion der Bakterien oder der Eukaryontenzellen, die den Vektor aufgenommen haben, erlaubt, einen Promotor, der die Expression der Gene in den Bakterien oder den Eukaryontenzellen erlaubt und in den eine Nukleotidsequenz insertiert ist, die für eines der oben definierten Peptide TM3 kodiert, wobei der Vektor ein Expressionsvektor für ein Peptid TM3, wie es oben definiert ist, ist.
Vorteilhafterweise wird der Expressionsvektor durch einen Phagen λgt11 gebildet, in den auf dem Niveau seiner EcoRI-Schnittstelle Abbaufragmente des Plasmids pKSel durch DNAse insertiert sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Zusammensetzung mit immunogener Wirkung und/oder Schutzwirkung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein Peptid TM3, wie es oben definiert ist, gegebenenfalls in Verbindung mit mindestens einer anderen immunogenen oder immunstimulierenden Substanz und/oder ein pharmazeutisch annehmbares Vehikel umfasst.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist darüber hinaus ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen VIF, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht, die Antikörper gegen VIF, die gegebenenfalls in einer biologischen Probe vorliegen, mit Hilfe eines Peptids TM3, wie es oben definiert wurde, das gegebenenfalls an einem geeigneten festen Träger fixiert ist, nachzuweisen, wobei die biologische Probe mit dem Peptid/den Peptiden, an das/an die sich die Antikörper gegen VIF binden, wenn solche Antikörper in der zu analysierenden Probe vorliegen, in Kontakt gebracht wird und das Ablesen des Resultats durch ein geeignetes Mittel, insbesondere DIA, RIA, Fluoreszenz, sichtbar gemacht wird.
Dieses Verfahren erlaubt es insbesondere, die Serokonversion der geimpften Tiere zu verifizieren oder serologische Untersuchungen mit epidemiologischem Ziel vorzunehmen.
Mit Hilfe eines Peptids TM3 ermöglicht das Verfahren die Bestimmung einer Infektion durch VIF, ungeachtet des Stamms (universelles Reagens, wie es oben genauer beschrieben wurde).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Kit, der zur Verwendung im Verfahren zum Nachweisen von Antikörpern gegen VIF gebrauchsfertig ist, dadurch gekennzeichnet, dass er außer nützlichen Mengen an Puffern, die zur Durchführung des genannten Nachweises geeignet sind, geeignete Dosen mindestens eines Peptids TM3, wie es oben definiert wurde, umfasst.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Reagens zur Diagnose von Katzen-Immundefizienz, dadurch gekennzeichnet, dass es aus der Gruppe, bestehend aus einem der Peptide TM3, wie sie oben definiert sind, ausgewählt ist und dass es ein universelles Diagnosereagens für einen VIF-Stamm ist.
BEISPIEL 1: Sequenzierung des Gens env des Virus der Katzen-Immundefizienz Wo
a) DNA-Proben
Einkernige Zellen aus peripherem Blut (PBMC), die aus Katzen, die natürlicherweise durch das französische Isolat Wo infiziert worden waren, erhalten wurden, die ein erworbenes Katzen-Immundefizienz-Syndrom zeigten, werden zusammen mit einkernigen Zellen von peripherem Blut, erhalten von Katzen, die als negative Kontrollen bezeichnet werden (SPF-Katzen), in Gegenwart von rekombinantem humanem Interleukin-2 (Genzyme, Boston, USA) und Concanavalin A (Sigma) kultiviert (A. Moraillon et al., 1992, Vet. Mic., 31, 41–45, In vitro properties and experimental pathogenic effect of three feline immunodeficiency viruses isolated from cats with terminal diseases).
Die Aktivität der reversen Transkriptase (RT), die von Mg⁺⁺ abhängig ist, wird ganz speziell überwacht. Nach 15 Tagen wird die Gesamtzell-DNA aus den RT-positiven Kulturen in Phenol extrahiert (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning, a laboratory manual) extrahiert und als Ausgangsmaterial zur Amplifikation der Gene des VIF verwendet. Dadurch können mehrere Passagen in vitro und die Anpassung an CD4-negative Zelllinien vermieden werden.
b) PCR
Die Gene env und gag des Stamms Wo des Virus der Katzen-Immundefizienz werden in drei bzw. zwei überlappenden Fragmenten amplifiziert, wobei synthetische Primer verwendet werden, die den konservierten Regionen in den VIF-Sequenzen, Isolat Petaluma (Talbott et al., 1989) und Isolat PPR (Philipps et al., 1990), entsprechen.
Die Sequenzen der Primer und die Position (entsprechend der für das VIF 34TF10 verwendeten Nummerierung) sind wie folgt:

* env:
– für das erste env-Fragment, E₁ genannt, verwendet man als 5'-Primer das Fragment 5'-GCAACAATAAGAATGGCAGAAGC-3' (6251–6274) und als 3'-Primer das Fragment 5'-GTTTAGGGTGACTAGTTAATATGTAAACC-3' (7236–7263);
– für das zweite env-Fragment, E₂ genannt, verwendet man als 5'-Primer das Fragment 5'-CAAATCCCACTGATCAATTATACATTTGG-3' (7236–7263) und als 3'-Primer das Fragment 5'-CGTAGTTCATGATCATTATCCTAATTTTC-3' (8269–8298);
– was das als E₃ bezeichnete Fragment angeht, so verwendet man als 5'-Primer das Fragment 5'-GCATCAAGTACTAGTAATAGGATTAAAAG-3' (8269–8298) und als 3'-Primer das Fragment 5'-CTTTTTCTCCTCCTTACTACTTC-3' (8809–8833);
* gag:
– für das erste gag-Fragment, G₁ genannt, verwendet man als 5'-Primer das Fragment 5'-GGAGAGATTCTACAGCAACATGGGG-3' (608–632) und als 3'-Primer verwendet man das Fragment 5'-GCCAATTTTCCTAATGCCTCGAGATACCATGC-3' (1398–1429);
– für das zweite gag-Fragment, G₂ genannt, verwendet man als 5'-Primer das Fragment 5'-GCATGGTATCTCGAGGCATTAGGAAAATTGGC63' (1398–1429) und als 3'-Primer verwendet man das Fragment 5'-AATTTACAAATCCAATAGTTTCTCCTCC-3' (1954–2123).

Die Oligonukleotide, die dem 5'-Primer des Fragments E₂ entsprechen, enthalten eine BclI-Restriktionsstelle und das Oligonukleotid, das dem 3'-Primer des Fragments E₂ entspricht, enthält eine SpeI-Stelle, die die Rekonstruktion eines vollständigen env-Klons ermöglicht.
Diese PCR umfasst 38 Zyklen, einschließlich je einer Denaturierung bei 94°C während einer 1 Minute, einer Hybridisierung bei 55°C während einer 1 Minute und einer Verlängerung bei 72°C während 1 Minute mit 1 μg genomischer Gesamt-DNA, 150 pmol jedes Primers und 20 nmol jedes Desoxynukleotidtriphosphats in einem Puffer, der 10 mM Tris, 50 mM KCl und 2 mM MgCl₂ enthält.
c) Klonierung und Sequenzierung
Ein Vektor M13mp8 wird durch das Enzym SmAI derart abgebaut, dass die oben erhaltenen PCR-Fragmente dort insertiert werden können [z. B. für das env-Gen Fragmente der Sequenz der Formel I, E₁ (Nukleotide 1–977), E₂ (978–2016) und E₃ (2017–2562)]. Der erhaltene rekombinante Vektor wird zum Transformieren der kompetenten E. coli-JM101 verwendet.
Die rekombinanten Klone werden durch eine in situ-Hybridisierung mit den entsprechenden PCR-Fragmenten, die mit Phosphor 32 markiert sind, detektiert.
Die Sequenzierung der Einzelstrang-DNA, ausgehend von rekombinanten Phagen, wird durch das enzymatische Verfahren durch Didesoxynukleotide mit einem Sequenzierungskit Séquenase^® 2,0 DNA, durchgeführt, wobei als Primer Oligonukleotide verwendet werden, die zum Vektor (17 mer, universeller Primer) oder zum VIF-Insert komplementär sind.
Um das vollständige Gen env wieder herzustellen, werden die drei Fragmente (E₁, E₂ und E₃), ausgehend vom rekombinanten Vektor M13mp8, wie er oben definiert ist, hergestellt, wobei die Restriktionsstellen, die in der Sequenz der Mehrstellenbindung des M13mp8 oder in den Amplifikationsprimern vorliegen, verwendet werden: E₁, HindIII-BclI; E₂, BclI-SpeI; E₃, SpeI-EcoRI. Die drei Fragmente werden in den Vektor KS⁺ Bluescript^® (Stratagene), verdaut durch die Enzyme HindIII und EcoRI, stromabwärts vom Promotor T3, ligiert. Die erhaltene Konstruktion wird pKSe genannt.
Die Fragmente können auch in den Vektor SK⁺ Bluescript^® (Stratagene), verdaut durch die Enzyme HindIII und EcoRI, stromaufwärts zum Promotor T7, ligiert werden. Diese letztgenannte Konstruktion, als pKSe1 bezeichnet, erlaubt die Transkription des Gens env in Säugerzellen, die das Gen der RNA-Polymerase des Phagen T7 exprimieren, während die Konstruktion pKSe die Transkription des Gens env in Säugerzellen erlaubt, die das Gen der RNA-Polymerase des Phagen T3 exprimieren.
d) Analyse der entsprechenden Aminosäuresequenzen
Die Analyse der Sequenzen wird mittels Computer mit dem Programm "Salsa" durchgeführt.

Die vielen Anordnungen, die die Sequenz VIF Wo mit anderen VIF-Sequenzen und insbesondere VIF34TF10 (USA) (TALBOTT et al., 1989), VIF 14 (USA) (OLMSTED et al., 1989), VIF PPR (USA) (PHILLIPS et al., 1990), VIF TM2/GVEPX (JAPAN) (KIYOMASU et al., 1991; MIYAZAWA et al.), VIF Z1 und VIF Z2 (Schweiz) (MORIKAWA et al., 1991), VIF 19K1 und VIF 19K2 (Niederlande) (K. M. J. SIEBELINK et al., J. Virol., 1992, 66, 1091–1097), erhalten von der Genbank "GenBank", vergleichen, sind in 1a und 1b dargestellt, in denen es scheint, dass die Variationen in der Mehrzahl auf dem Gen env liegen und bezüglich der genannten Aminosäuresequenzen die folgenden sind:

– FIV-Wo-Sequenz/FIVZ2-Sequenz:	8,9%
– FIV-Wo-Sequenz/Isolat Petaluma-Sequenz:	10,2–10,9%
– FIV-Wo-Sequenz/FIV19-Sequenz:	10,8%
– FIV-Wo-Sequenz/FIVZ1-Sequenz:	11%
– FIV-Wo-Sequenz/FIVPPR-Sequenz:	13,6%
– FIV-Wo-Sequenz/FIVGVEPX-Sequenz:	19%

Die variablen Sequenzen gemäß der Erfindung, die ausgewählt wurden (V₁ bis V₉, bezüglich ihrer Aminosäuresequenzen) sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst; vorteilhafterweise erlaubt die Selektion dieser Fragmente durch Ableitung konservierte Zonen bei der Gesamtheit der VIF zu definieren und erlaubt es auch, die variablen Zonen und die konservierten Zonen herauszuarbeiten; dies ermöglicht es, universelle Reagenzien zur Detektion des VIF, selektive Reagenzien zu definieren und den Tieren den bestmöglichen Schutz zukommen zu lassen:
e) Transkription und Translation in vitro
Für die in vitro-Synthese der RNA werden die zwei Konstruktionen pKSe und pKSel verwendet, wobei die Transkription im ersten Fall durch die Polymerase T3 und im zweiten Fall durch die Polymerase T7, wie es oben angegeben wurde, durchgeführt wird.
1 μg DNA der Plasmide pKSel und pKSe wird linearisiert, wobei die Restriktionsstelle EcoRI verwendet wird, die in der Sequenz der Mehrstellenbindung des Vektors stromabwärts zum insertierten Gen vorliegt. Das linearisierte und mit Proteinase K behandelte Plasmid wird transkribiert, wobei die RNA-Polymerase T3 für pKSe und die RNA-Polymerase T7 für pKSel entsprechend dem vom Hersteller (Stratagene) gelieferten Protokoll verwendet wird. Nach Behandlung mit DNase und Extraktion mit Phenol wird das Transkriptionsprodukt in Ethanol in Gegenwart von 5 μg tRNA von E. coli ausgefällt, mit 15 μl Wasser, das mit DEPC behandelt worden war, in Suspension gebracht und bei –70°C gelagert. Die Größe der Transkripte wird durch Elektrophorese an 1% Agarosegel in einem 10 mM Phosphatpuffer, pH 7, nach Denaturierung in Glyoxyl/Dimethylsulfoxid beurteilt.
Etwa 10 ng in vitro-RNA-Transkript werden etwa 30 min bei 30°C in ein Endvolumen von. 12,5 μg übertragen, welches 6 μg Lysat von Kaninchenretikulozyten (RRL) (Promega), 0,25 μl eines Aminosäuregemisches, das an Methionin verarmt ist (Promega) und 1,75 μl Methionin, das mit Schwefel 35 markiert ist, in Abwesenheit (–M) oder in Anwesenheit (+M) mikrosomaler Membranen (1 oder 2 μl) enthält, um die Glycosylierung der Proteine zu ermöglichen (2A). Die 1 oder 2 μl mikrosomaler Pankreasmembranen vom Hund (Promega) werden pro 12,5 μl Reaktionsgemisch zugesetzt. Für die Kinetikassays werden 3 μl-Aliquots zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen (15, 30, 60 und 90 Minuten, 4 Stunden). Die Proben werden bei –70°C gelagert.
Die Inhibierungsstudien in Gegenwart von Castanospermin werden durchgeführt, indem das Translationsgemisch, das die mikrosomalen Membranen enthält (2 μl pro 12,5 μl Gemisch) mit 5 mM Castospermin (Endkonzentration) (Sigma), vor Verwendung in mit DEPC behandeltem Wasser hergestellt, bei 30°C während 15 Minuten vor Zugabe von RNA inkubiert wurde.
Die Translationsprodukte werden durch Aufkochen in Laemmli-Puffer denaturiert und durch Elektrophorese (SDS-PAGE, Gradient 5 bis 10%) beurteilt. Es werden auch Molekulargewichtsmarker verwendet (BIORAD H. M. W. oder Rainbow-Marker). Nach der Elektrophorese werden die Gele fixiert, behandelt und mit einem Kodak XAR-5-Film autoradiographiert.
Unter diesen Bedingungen wandert das in vitro-RNA-Transkript aus dem Plasmid pKSe (enthaltend das vollständige Gen env von VIF-Wo) in Agarosegel unter denaturierenden Bedingungen in einer einzelnen Bande mit etwa 2,5 kb, was der erwarteten Größenordnung entspricht. Nach Übertragung dieses Transkripts in ein Kaninchenretikulozytenlysat (RRL) hat das Produkt, das mit der größten Menge erhalten wird, ein scheinbares Molekulargewicht von 90 kDa (2A), das mit dem Molekulargewicht kompatibel ist, welches für das kodierte Polypeptid errechnet wurde, das aus der Sequenz abgeleitet wurde (98.079 kDa).
Die Translation der RNA in Gegenwart von Hunde-Pankreasmikrosomen, die eine N-Glycosylierung der erhaltenen Polypeptidkette erlaubt, liefert zwei Produkte mit erhöhtem Molekulargewicht, 150 bzw. 130 kDa (2A). Um die Relation zwischen den zwei erhaltenen glycosylierten Produkten zu analysieren, führt man zwei ausgedehnte Experimente durch; wie oben angegeben, führt man die Translation (traduction) ebenfalls in Gegenwart von Castanospermin einem Inhibitor der α-Glucosidase I des rauen endoplasmatischen Retikulums durch, um festzustellen, ob das Produkt zu dem niedrigsten Molekulargewicht sich vom Glycoprotein mit 150 kDa durch Spalten der Zucker während der Glycosylierung ableiten könnte. Die Kinetik der Reifung des Hüllproteins zeigt nach 15 Minuten das Auftreten von zwei glycosylierten Produkten, die sich bis zu 90 Minuten Inkubation quantitativ erhöhen (2B). In Gegenwart von Castanospermin wandern die zwei Moleküle zu einem höheren Molekulargewicht, 160 bzw. 145 kDa und bleiben während der zeitlich ausgedehnten Experimente unmodifiziert (2B).
Diese Experimente zeigen, dass man in Abwesenheit von mikrosomalen Membranen, die die Glycosylierung erlauben, ein Produkt mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 90 kDa beobachtet, das so dem nicht-glycosylierten Hüllvorläufer entspricht. Nach Zugabe von mikrosomalen Membranen beobachtet man zwei glycosylierte Arten mit Molekulargewichten von 150 kDa bzw. 130 kDa, was die bedeutende Glycosylierung dieses Peptids bestätigt. Die Sequenz env von Wo enthält 21 potentielle N-Glycosylierungsstellen, die wahrscheinlich vollständig verwendet werden, was die Molekulargewichte der Translationsprodukte in Gegenwart von mikrosomalen Membranen nahe legen.
f) Immunpräzipitation
VIF-Antiseren werden von zwei SPF-Katzen (Katzen, die frei von spezifischen Pathogenen sind) erhalten, die mit Isolaten von Wo oder Petaluma beimpft worden waren, und auch von zwei Katzen, die natürlich infiziert waren, gegenüber dem Virus der Katzenleukämie, aber seronegativ waren, erhalten. Kontrollseren werden von zwei SPF-Katzen erhalten. Für die Stufe der Präabsorption wird ein Vorrat an SPF-Katzenseren verwendet. Polyklonale Kaninchen-Antikörper, die gegen synthetische Peptide gerichtet sind, wie sie in der französischen Patentanmeldung Nr. 2 669 338 beschrieben werden, werden ebenfalls verwendet, und zwar in Konzentrationen von 20 μg pro ml. Das erste dieser Peptide (P100) mit einer Länge von 21 Aminosäuren liegt am C-terminalen Ende des Oberflächenproteins des VIF und beinhaltet die Spaltungsstelle zwischen dem Oberflächenprotein (SU) und den Transmembranglycoproteinen (TM); das zweite Peptid (P102) mit einer Länge von 25 Aminosäuren entspricht dem C-terminalen Ende des Glycoproteins TM des VIF. Vorimmunisierte Kaninchenseren werden für die Stufe der Vorabsorption und als negative Kontrolle in den Immunpräzipitationsassays eingesetzt.
Aliquots der in vitro-Translationsprodukte (etwa 100.000 cpm, bestimmt nach Präzipitation mit Trichloressigsäure) werden in 200 μl RIPA-Puffer (1% Triton-X-100, 0,5% Natriumdesoxycholat, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) verdünnt. Die Reaktionen werden bei 4°C durchgeführt. Die Proben werden während 30 Minuten mit 4 μl eines Pools aus Seren von SPF-Katzen oder mit einem vorimmunisierten Kaninchenserum vorabsorbiert und mit 50 μl Protein A-Sepharose CL-4B (PrA, Pharmacia) präzipitiert. Die Überstände werden dann während einer Nacht mit 4 μl Serum von infizierten Katzen, Serum von SPF-Katzen oder polyklonalen Kanichenantikörpern gegen synthetisches Peptid, wie es oben definiert wurde, inkubiert. 50 μl PrA werden zugesetzt und 1 Stunde inkubiert. Nach vier Waschgängen in RIPA-Puffer werden die Bodensätze aus Immunkomplexen-PrA durch Kochen für 5 Minuten in 50 μl Laemmli-Puffer eluiert. Die Proben werden durch SDS-PAGE mit einem 5 bis 10%-Gradienten analysiert.
FL-4-Zellen, die von einkernigen Zellen aus peripherem Blut (PBMC), infiziert mit einem Petaluma-Stamm und spontan das VIF produzierend (Yamamoto, 1991), stammten, werden in kaltem PBS gewaschen und in RIPA-Puffer lysiert. Die Zelllysate werden durch 30-minütige Zentrifugation mit 17.000 g geklärt.
Die in vitro erhaltenen Translationsprodukte von reifem env werden mit den vorstehend genannten verschiedenen Tierseren (SPF-Seren, experimentell mit den Isolaten Wo und Petaluma beimpft (Banden 1 und 4), Seren von natürlicherweise infizierten Katzen (Banden 2 und 5), Seren von nicht-infizierten SPF-Katzen als negative Kontrolle (Bande 3)) unterworfen. Diese 3 erläutert die erhaltenen Resultate; die zwei glycosylierten Produkte (150 kDa und 130 kDa) werden durch die Seren von infizierten Katzen immunpräzipitiert, wobei das Produkt mit 130 kDa das Hauptprodukt ist. Die Bande mit 90 kDa stellt wahrscheinlich nicht glycosyliertes Restmaterial dar. Das Produkt mit dem niedrigsten Molekulargewicht kann als ein Transkriptionsprodukt oder ein Produkt einer partiellen Translation angesehen werden. In den Seren von SPF-Katzen, die nicht infiziert sind, wird keine Bande detektiert.
3b veranschaulicht die Immunpräzipitation von VIF-Proteinen, die metabolisch markiert sind und aus den Zellen FL-4 erhalten wurden, im Vergleich. Die Banden a, b und c stellen das Resultat dar, das mit Seren von nicht-infizierten SPF-Katzen, Seren von Katzen, die mit einem Petaluma-Stamm infiziert waren, und Seren von Katzen, die durch VIF-Wo infiziert waren, erhalten wurde. Die Banden d, e und f entsprechen einem Serum eines präimunen Kaninchens, Kaninchenseren mit polyklonalen Antikörpern gegen das C-terminale Peptid des Proteins SU (Aminosäure 6 am Teil TM (P100)) und Kaninchenseren mit polyklonalen Antikörpern gegen das C-terminale Peptid des Proteins TM (P102)). Die Baden b und c erlauben die Detektion von zwei Proteinen (150 kDa und 115–125 kDa), die dem Vorläufer des Hüllproteins bzw. dem Glycoprotein SU entsprechen, wie es durch Immunpräzipitation mit den zwei Kaninchenantikörpern, die gegen die Peptide, die die Spaltungsstelle SU-TM einschließen oder dem C-terminalen Teil des Vorläufers env entsprechen (Banden e und f), gerichtet sind, bestätigt.
BEISPIEL 2: Test auf Erkennung einer Infektion durch VIF
Man hybridisiert in situ die Nucleinsäurefragmente, die von einer zu untersuchenden Probe isoliert wurden und auf ein Nitrocellulosefilter transferiert wurden, mit einem Nucleinsäurefragment gemäß der Erfindung (mit dATP ³²P markierte Sonde) für eine Nacht bei 58°C nach Blockierung der nicht-spezifischen Bindungen mit einer Denhardt-Lösung.
Ein derartiges Verfahren, das mit einem Pool von Fragmenten, Variable (V₁–V₉) genannt, durchgeführt wird, ermöglicht eine spezifische Differenzierung des VIF-Stamms.
BEISPIEL 3: Peptide, die den plus/minus-konservierten Epitopen (TM3) gemäß der Erfindung entsprechen
a) Konstruktion einer Expressionsbank der Peptide gemäß der Erfindung
Die Klonierung des Gens env des VIF-Wo in einem Vektor Bluescript^® KS⁺, was die Konstruktion pKSe liefert, oder in einen Vektor Bluescript^® KS⁺, was die Konstruktion pKSe1 liefert, wurde in Beispiel 1 beschrieben.
Überlappende Fragmente des Plasmids pKSe werden durch Verdau mit DNase I in Gegenwart von Manganionen erzeugt. Die erhaltenen DNA-Fragmente werden nach einer optimalen Inkubationszeit mit der DNase (Zeit, die Fragmente mit einer Länge von etwa 200 bp liefert) mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase von E. coli derart behandelt, dass freie Enden für eine wirksame Bindung mit der Bindungssequenz erhalten werden. Die Markierung der DNA-Fragmente mit Phosphor 32 ermöglicht die Kontrolle der späteren Stufen.
Die Bindungssequenzen aus 10 Basenpaaren (bp), die eine EcoRI-Stelle (Pharmacia) haben, werden für die Ligation mit den erhaltenen pKSe-Fragmenten verwendet. Die Produkte der Ligation werden dann mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und durch Elektrophorese in Agarosegelen LMP NUSieve 2% getrennt, so dass eine Gruppe von Fragmenten zwischen 100 und 200 bp ausgewählt wurde und freie Bindungssequenzen eliminiert wurden.
Die selektionierten Fragmente werden aus Agarose in Phenol extrahiert und mit einem Vektor λgt11, der mit dem Restriktionsenzym EcoRI (Promega) verdaut ist, gebunden.
Die Produkte der Ligation werden unter Verwendung eines Kits Packagene (Promega) eingekapselt und auf einem Stamm von E. coli Y1090 verteilt. Die rekombinanten Phagen werden durch Detektion einer Farbe in Gegenwart von 25 μl 1 M IPTG und 25 μl Xgal, 80 mg/ml, selektioniert. Die Ausbreitung der Bank λgt11 liefert 10⁵ unabhängige Klone. Die Phagen-DNA, die von nicht-gefärbten Plaques erhalten wurde, wird durch PCR analysiert, wobei die Primer λgt11 1218 und 1222, die zum β-Galactosidase-Fragment der Matrix von λgt11 komplementär sind, verwendet werden: 8 von 10 Klonen enthalten Inserts mit einer mittleren Größe von etwa 160 bP. Die Bank wird dann amplifiziert, um einen Titer von 3 × 10⁹/ml zu erhalten.
Eine in situ-Hybridisierung von 37 Phagen mit DNA-Sonden, die mit Phosphor 32 markiert waren, die eine PCR-Amplifikation der drei Regionen E₁, E₂ und E₃ des Gens env-Wo (Fragmente 1–977; 978–2016; 2017–2562) darstellt, zeigt, dass die Bank für das gesamte Gen env repräsentativ ist.
b) Durchmusterung der Bank
Die Bank env λgt11 wird durchgemustert, indem Seren von zwei Katzen verwendet wurden, die experimentell mit dem VIF-Wo-Isolat infiziert worden waren. Die Bank wird in einer Konzentration von etwa 3 × 10⁴ kwE auf E. coli Y1090 verteilt, und die Plaques werden bei 42°C 3 bis 4 Stunden lang inkubiert. Die Plaques werden dann mit Nitrocellulosefilter, die mit 10 mM IPTG gesättigt sind, bedeckt und 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Filter werden zur immunologischen Durchmusterung mit Katzenseren, CTF 191 S und CTF 1916 genannt, die 300-fach verdünnt worden waren, unter Verwendung von Standardverfahren behandelt [Verfahren mit entfetteter Milch (MANIATIS)]. Ziegen-IgG gegen Katzen (H + L), gebunden an Peroxidase (KPL) und 1000-fach verdünnt, werden als zweiter Antikörper verwendet. Eine positive Reaktion wird durch 4-Chlor-1-naphthol (Merck) entwickelt (Hintergrundrauschen wenig bedeutend).
Agarfragmente, die die Phagenpartikel enthalten, die ausgehend von Regionen, die den positiven Signalen auf dem Filter entsprechen, erhalten werden, werden herausgenommen und mit 1 ml SM, der umfasst:

NaCl 2,9 g

MgSO₄ 2 g

1 M Tris, pH 7,5 2,5 ml

Gelatine, 2% 2,5 ml

H₂O 500 ml

inkubiert.
Die ausgewählten Phagen werden für eine zweite Durchmusterung einer erneuten Strichkultur unterzogen. Die Plaque der positiven Phagen werden herausgenommen und mit 1 ml SM inkubiert. Die Reaktivität der ausgewählten Phagen wird schließlich durch ein drittes Durchmusterungsverfahren bestätigt. Die Lysate der Phagen λ, die aus den positiven Phagen erhalten wurden, werden durch ein Standard-Ausstreichverfahren (Protokoll Promega) hergestellt und bei 4°C in Gegenwart von 0,3% Chloroform gelagert. Die anschließende Analyse der env-Inserts erfolgt durch direkte Sequenzierung der PCR-Amplifikationen oder durch in situ-Hybridisierung, wobei mit Phosphor 32 markierte Sonden verwendet werden, wie es in Beispiel 1 genauer beschrieben ist.

– Die immunologische Durchmusterung der Bank wird mit den zwei oben genannten Seren durchgeführt. 170 positive Plaques werden bei der ersten Durchmusterung detektiert, 108 dieser Plaques werden nach der dritten Durchmusterung isoliert, 60 Klone von 108 werden sequenziert und die anderen durch in situ-Hybridisierung mit radioaktiven Sonden, die bereits sequenzierten immunogenen Hauptregionen entsprechen, wie es oben spezifiziert ist, analysiert.

Für die in situ-Hybridisierung wird die Bakteriophagen-DNA auf ein Nitrocellulosefilter transferiert und mit Sonden, die mit Phosphor 32 markiert sind, bei 58°C eine Nacht nach Blockierung der nicht-spezifischen Bindungen mit einer Denhardt-Lösung hybridisiert. Als Sonden verwendet man Produkte der Amplifikation der VIF-Klone 1, 2, 9, 35, 44, 90, 133, 147 und 170, die mit dATP ^[32]P markiert sind, wobei das Verfahren der Spaltungstranslation verwendet wird.
Unter Anwendung dieser doppelten Strategie wurden 85 Inserts selektioniert, die 6 immunologischen Regionen der Hülle entsprechen, wie es in den folgenden Tabellen I und II erkennbar ist, wobei Tabelle I die Sequenzen antigener Peptide zeigt, die durch die rekombinanten Bakteriophagenklone exprimiert werden, und Tabelle II die Verteilung der positiven Klone in den immunogenen Regionen genau angibt.
TABELLE I
Es ist zu betonen, dass das Protein SU (Glycoprotein der äußeren Oberfläche der Hülle) ein Molekulargewicht von 100 bis 120 aufweist und dass das Protein TM (virales Glycoprotein der Transmembranhülle) ein Molekulargewicht zwischen 35 und 45 aufweist.
Die Tabelle I und die 4 geben die Nukleotidsequenzen der verschiedenen Inserts sowie die entsprechenden Peptidsequenzen genauer an.
Die überlappenden Sequenzen heben das Vorliegen von acht immunogenen Domänen (Epitopen) hervor, von denen fünf im Glycoprotein außerhalb der Membran (gp) SU liegen (SU1, Aminosäuren 253–289; SU2, Aminosäuren 388–424; SU3, Aminosäuren 467–492; SU4, Aminosäuren 508–528 und SU5, Aminosäuren 572–606) und drei im Transmembran-gp TM liegen (TM2, Aminosäuren 681–711; TM3, Aminosäuren 744–788 und TM4, Aminosäuren 826–854) (1). Die Peptidsequenz 597–646, die durch die Klone 20 und 124 definiert wird, überlappt das 5. Epitop SU (574–606) und stellt ohne Zweifel ein NH₂-terminales TM-Epitop (TM1) dar. Diese Hypothese wird durch die immunologische Durchmusterung mit den Katzenseren bestätigt, welche die verschiedenen Reaktivitäten zwischen dem Klon 51 (Epitop SU5) und dem Klon 124 (Epitop TM1) zeigt.
Diese 4 stellt die Lokalisierung der Epitopregionen der Hüllglycoproteine (gp) des VIF dar; SU:gp100; TM:gp40. In dieser Figur werden die Spaltungsstellen durch vertikale Pfeile dargestellt; die Hauptklone werden durch verstärkte Linien dargestellt und die verschiedenen Rechtecke zeigen die Epitope an, die überlappenden Minimalsequenzen entsprechen (dunkel gefärbtes Rechteck). Die folgende Tabelle II gibt die Anzahl der Klone an, die die immunogenen Regionen aufweisen, wie sie in der obigen Tabelle I genauer angegeben sind.
TABELLE II
Die Phagen, die dieselbe Sequenz aufweisen, werden einmal gezählt, und die Phagen, die ein Insert oder mehrere Inserts enthalten oder die mit mehr als einer Sonde hybridisierten, werden eliminiert.

– Die serologische Durchmusterung der identifizierten Epitope wird ausgehend von Seren von 24 Katzen, die experimentell mit verschiedenen VIF-Isolaten infiziert waren, und ausgehend von 24 Katzen, die natürlicherweise infziert waren (2 von diesen waren gleichzeitig mit dem Katzenleukämievirus infiziert) durchgeführt (Tabelle III). Alle Seren wurden als mit den viralen Strukturproteinen reaktiv angesehen, als sie durch Western-Blot getestet wurden. Als Kontrolle werden acht Seren von SPF-Katzen verwendet. Die Bakteriophagenklone 54, 133, 154, 44, 51, 124, 157, 9 und 27 der Tabelle I, die die Inserts enthalten, welche den identifizierten epitopischen Domänen entsprechen, wurden ebenfalls durchgemustert, und zwar unter Verwendung eines "Dot-Phage"-Assays (5A und 5B), wie folgt:

Etwa 100 kbE jedes Phagen in 1 μl SM werden auf eine E. coli Y1090-Schicht ausgebreitet und bis zum Auftreten von Plaques kultiviert.
Zur immunologischen Durchmusterung wird ein mit IPTG imprägniertes Nitrocellulosefilter auf die Schicht gelegt und man führt die Stufen durch, wie sie vorstehend für die Durchmusterung der Bank beschrieben wurden.
Die Resultate sind in der folgenden Tabelle III und in den 5 dargestellt.
In 5A entspricht jedes Nitrocellulosefilter einem Serumtest.
Die Tests wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt und die Entwicklung der Reaktion erfolgte mit 4-Chlor-napthol bis der Hintergrund der Kontrollproben sichtbar wurde (Filter λ: nicht-rekombinanter Phage als negative Kontrolle verwendet).
Die Nummern der Klone sind in der Figur oben angegeben (54, 51, 44, 27, 9 und λ, 157, 154, 133, 124).
In dieser Figur (1–5 und 6–10) sind ganz speziell zwei Tests dargestellt, NC₁ und NC₂ sind negative Kontrollen (SPF-Katzen); 1, 7 und 10: Katzen, die mit dem VIF-Villefranche beimpft waren; 2 und 3: Katzen, die natürlicherweise infiziert waren; 4 und 9: Katzen, die mit dem VIF ENVNIP inokuliert waren; 5: Katzen, die durch VIF Petaluma inokuliert waren; 6: Katzen, die durch VIF Me inokuliert waren; 8: Katze, die durch VIF-Wo inokuliert war.
TABELLE III
Die Tabelle III, in der PET = Petaluma; Villefr = Villefranche; NAT. INF. 1st = natürlich infizierte Katzen, die aus der Veterinärschule von Nantes stammen; NAT. INF. 2nd = Katzen, die natürlicherweise infiziert sind und von der Veterinärschule von Maisons-Alfort stammen; IV = intravenöse Inokulierung; IC = intracerebrale Inokulierung, zeigt die Reaktivität der Epitopregionen mit den Seren von SPF-Katzen und infzierten Katzen: Der Klon 133 (Epitop SU2) ist mit allen Seren von Katzen, die experimentell infiziert worden waren, und mit 23/24 Seren von natürlich infizierten Katzen reaktiv. Der Klon 157 (Epitop TM2) wird durch die Gesamtheit der Seren infizierter Katzen erkannt. Für diese zwei Klone ist die Reaktionsintensität sehr wichtig. Der Klon 9 (Epitop TM3) ist mit 100% der Seren von Katzen, die experimentell infiziert sind, und mit 75% der Seren von Katzen, die natürlicherweise infiziert sind, reaktiv; der Klon 27 (TM4) reagiert mit 29% der Seren von Katzen, die experimentell infiziert sind (1 Wo und 4 Me), aber nur mit 12,5% der natürlich infizierten Katzen. Der Klon 44 (SU4) reagiert mit 25% der Seren von experimentell infizierten Katzen und mit 12,5% der natürlicherweise infzierten Katzen.
Die anderen Epitope zeigen eine variable Reaktivität ohne deutliche Differenz zwischen den natürlichen und experimentellen Infektionen: 29% SU1, 39,5% SU5 und 27% TM1. SU3, das durch die zwei Katzenseren, durch Wo infziert, verwendet zur Durchmusterung der Bank, detektiert wird, reagiert nur mit einem der zwei anderen Seren, die untersucht wurden (Katzen, die durch Wo infiziert waren) und reagiert mit den Seren anderen Ursprungs überhaupt nicht. Mit den normalen Seren wird keinerlei Reaktivität detektiert.

– Die Reaktivität beim "Dot-Phage" der Seren von infizierten Katzen mit den Peptiden, die durch die oben genannten Klone exprimiert werden, wird durch Western-Blot (5B) bewiesen, der mit den E. coli-Lysaten durchgeführt wurde, welche die rekombinanten Antigene, exprimiert durch die lysogenen Phagen, enthielten. 5B veranschaulicht diese Reaktivität. Die verwendeten Seren sind dieselben wie die der 5A, Nr. 6 und Nr. 8. Die Nummern der Klone sind oben in der Figur angegeben.

Genauer ausgedrückt, die rekombinanten Klone λgt11 54, 133, 73, 154, 44, 51, 124, 157, 9 und 27 werden als Lysogene in E. coli Y1089 exprimiert, wie es von HUYNH et al. (1985) beschrieben ist. Rohlysat, das die Fusionsproteine enthält, wird ausgehend von einer lysogenen Kultur, die durch IPTG induziert wurde, unter Durchführung von Gefrier-Auftau-Zyklen und Beschallung der Zellanhäufung, erneutes Suspendieren in 200 μl TEP-Puffer (Tris-HCl 100 mM, pH 7,4, EDTA 10 mM, PMSF 1 mM) hergestellt.
Die Extrakte werden in Laemmli-Puffer zum Sieden gebracht und in SDS-Polyacrylamidgelen, 5 bis 10% (40 μg/Vertiefung) in Suspension gebracht, wobei eine Mini PII (BIO RAD)-Apparatur verwendet wurde. Nach Übertragung der Proteine auf ein Nitrocellulosefilter und Blockierung der nicht-spezifischen Stellen durch Inkubation mit entfetteter Milch mit 3% in 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20 (TNT-Puffer) werden die Nitrocellulosebanden mit dem Katzenserum (300-fach verdünnt) während 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die bindenden Antikörper werden durch Inkubation mit Ziegen-IgG, gekoppelt an Peroxidase, gegen Katzen (1000-fache Verdünnung), gefolgt von einer Entwicklung mit 4-Chlor-1-naphthol (Merck) entwickelt. Die Kontrollen werden von einem Lysat von E. coli Y1089, infiziert mit λgt11, und einem Pool aus normalen Seren gebildet.
c) Vergleichsanalyse der Sequenzen:
Die Analyse der Sequenzen wird auf einem Computer mit dem Programm "Salsa" (siehe Beispiel 1, f) mit Vergleichsprozentangaben zwischen verschiedenen Stämmen und mit Hilfe der 1a und 1b durchgeführt.
Im Glycoprotein SU von env betrifft die Hypervariabilität sukzessive die Segmente 361–377, die sich von einem konservierten Cystein in Position 367 aus nach beiden Seiten erstrecken, vier kurze Fragmente 452–455, 466–471, 479–485 und 494–496, das Dipeptid 541–542 und das Segment 553–570, das ein konserviertes Cystein in Position 566 umfasst. Im Protein TM sind auch zwei hypervariable Zonen lokalisiert: Reste 710–718 und 832–842. Variable Regionen befinden sind in der N-terminalen rev-artigen Domäne, im C-terminalen Teil des SU und im C-terminalen Teil der hydrophoben Transmembrandomäne des TM (zwischen den Positionen 220 und 286) und weisen eine Variabilität unterhalb der Schwelle von 10% auf.
Genauer ausgedrückt, solche Peptide umfassen vorteilhafterweise die neun variablen Regionen, wie sie oben definiert sind (hypervariable Regionen + angrenzende variable Regionen), d. h.: V1 (Reste 26–72), V2 (Reste 96–174, 23% Divergenz), V3 (Reste 361–422, die die hypervariable Region 361–391 und die variable Region 392–422 umfassen, 12% Divergenz), V4 (Reste 452–497, 13% Divergenz), VS (Reste 541-570, 30% Divergenz), V6 (Reste 586–612, 10% Divergenz), V7 (Reste 710–718, 26% Divergenz), V8 (Reste 765–778, 12% Divergenz) und V9 (Reste 832–842, 21% Divergenz), wie es 6 zeigt, die die variablen Domänen und konservierten Domänen darstellt: Die konservierten Domänen sind weiß dargestellt, die variablen Regionen sind grau dargestellt und die hypervariablen Regionen sind in schwarz dargestellt.
BEISPIEL 4: Test auf Erkennung einer Infektion durch VIF
Peptide, die den immundominanten Epitopen (SU2, TM2 oder TM3) entsprechen, werden in den Vertiefungen einer ELISA-Platte absorbiert.
Das zu testende Serum wird in einer optimalen Verdünnung (vorbestimmt während der Durchführung des ELISA, wobei eine Reihe von Seren von infizierten Katzen und von SPF-Katzen verwendet wurde) inkubiert. Das Vorliegen von Antikörpern gegen VIF wird durch Antikörper gegen Katzen-Ig, gekoppelt an Meerrettichperoxidase, in Gegenwart eines chromogenen Substrats entwickelt.
1) ARBEITSPROTOKOLL
a) Selektionierte Peptide
Die selektionierten Peptide sind die Peptide P237, P240, P241 und P242; sie entsprechen, wie bereits oben genauer angegeben:

– P237, Fragment, das in TM2 enthalten ist und den Positionen 697–705 der Sequenz der Formel II entspricht,
– P240, Fragment, das in SU2 enthalten ist und den Positionen 398–408 der Sequenz der Formel II entspricht,
– Fragmenten P241 und P242, die in TM3 enthalten sind und den Positionen 763–660 bzw. 772–779 der Sequenz der Formel II entsprechen.

Diese verschiedenen Peptide werden getrennt gegenüber 17 Seren, die von natürlich infizierten Katzen stammen, gegenüber 16 Seren von Katzen, die experimentell mit verschiedenen VIF-Stämmen infiziert wurden und gegenüber Seren von 11 negativen Katzen (SPF-Katzen) getestet.
b) Bedingungen des ELISA-Tests
Die Peptide werden in Konzentrationen zwischen 1 und 10 μg/ml verwendet; um die Beschichtung der Mikrotiterplatten mit den Peptiden durchzuführen, werden 0,1 M Natriumcarbonat, pH 9,6, PBS oder mit Poly-L-lysin voraktivierte Mikroplatten verwendet.
Die Sättigung der freien Stellen wird mit unterschiedlichen Konzentrationen an entfetteter Milch oder an Rinderserumalbumin durchgeführt.
Die verschiedenen Seren werden 1 : 1 bis 1 : 200 verdünnt.
Der Test läuft wie folgt ab: 0,25 μg Peptid in 50 μg 0,1 M Natriumcarbonat, pH 9,6, werden an den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (DYNATECH IMMULON^® 2) während einer Nacht bei 4°C adsorbiert. Die Vertiefungen werden dann 3 Mal mit PBS gewaschen. Die verbleibenden Adsorptionsstellen an den Mikroplatten werden durch Inkubation mit 100 μl PBS, der Milch (1%) und Tween 20 (0,1%) (ELISA-Puffer, EB) enthält, für 2 Stunden gesättigt. 50 μl verdünntes Katzenserum werden 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur in den Vertiefungen inkubiert.
Nach dreimaligem Waschen mit EB-Puffer werden die Immunglobuline-gegen-Katzen, konjugiert mit Peroxidase (0,5 μg/ml) (KIRKEGAARD & PERRY LABORATORIES, INC.) während 1 Stunde bei Umgebungstemperatur zugesetzt. Nach 5 Waschgängen mit PBS wird das adsorbierte Konjugat mit Peroxidase mit 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) (Sigma), 0,2 mg/ml, in 0,6%iger Essigsäure, pH 4,7, und bei einer Endkonzentration (G/V) an H₂O₂ von 0,1% sichtbar gemacht.
2) RESULTATE
Die Assays werden in zweifacher Ausführung durchgeführt.
Um die positiven Reaktionen von den negativen zu unterscheiden, wird ein Grenzwert wie folgt errechnet: P = m_NC + 3 × Sd (mittlere Extinktion für die negativen SPF-Kontrollseren (NC) + 3 Standardabweichungen). Die Extinktionswerte über P werden als Hinweis für das Vorliegen von Antikörpern gegen die Peptide angesehen.
Der ELISA-Test (7a und 7b, ⎕), der das Fragment P240 verwendet, detektiert 100% der Seren von natürlich infizierten Katzen und 87,5% der Seren von experimentell infizierten Katzen. (P = 0,156(0,084 + 3 × 0,024)).
Das Fragment P237 (7a und 7b,
) wird von 100% der Seren von natürlich infizierten und experimentell infizierten Katzen erkannt (P = 0,294(0,138 + 3 × 0,052)).
Das Fragment P241 (7a und 7b,
) ist gegenüber 94% der natürlich infizierten Katzen und gegenüber 75% der experimentell infizierten Katzen reaktiv (P = 0,443(0,209 + 3 × 0,078)).
Das Fragment P242 (7a und 7b,
) ist gegenüber 12% der natürlich infizierten Katzen und gegenüber 17% der experimentell infizierten Katzen reaktiv (P = 0,359(0,149 + 3 × 0,070)).
Alle Seren von SPF-Katzen behalten einen P-Wert unter dem für jedes der vorgenannten Peptide bei.
Diese Resultate, die in 7 (7a: Seren von experimentell mit VIF infizierten Katzen; 7b: Seren von natürlicherweise mit VIF infizierten Katzen) dargestellt sind, und oben genauer beschrieben wurden, zeigen insbesondere, dass ein ELISA-Test, dessen Reagens das Peptid P237 ist, in hohem Maße spezifisch ist (keine falsch-positiven Ergebnisse) und empfindlich ist (alle Seren von Katzen, die verschiedenen Ursprungs infiziert waren, sind reaktiv). Darüber hinaus liefert die Verwendung eines solchen synthetischen Peptids ein reines und kostengünstiges Reagens für die routinemäßige Diagnose der Infektion durch VIF.
Darüber hinaus liegt die mittlere Extinktion M der positiven Seren für P237 über der für andere Peptide (M₂₃₇ = 1,042 +/– 0,110; M₂₄₀ = 0,434 +/– 0,219; M₂₄₁ = 0,660 +/– 0,161; M₂₄₂ = 0,589 +/– 0,136).
Die folgenden Resultate zeigen auch, dass das Peptid P237 als Reagens in einem immundiagnostischen Test interessant ist:
110 Seren von natürlicherweise infizierten Katzen, 61 Seren von Katzen, die experimentell mit verschiedenen VIF-Isolaten infiziert worden waren (Tabelle IV) und 61 Seren von SPF-Katzen wurden durch ELISA getestet.
Der Grenzwert dieses Assays ist 0,346 (P = 0,088 + 3 × 0,086).
Die 171 Seren von Katzen, die durch VIF infiziert waren, zeigen eine positive Reaktion, während keine der SPF-Katzen eine positive Reaktion zeigt.
Die 8 stellt diese Resultate dar (
: SPF-Katzen; ⦁: experimentell infizierte Katzen; ♦: natürlich infizierte Katzen).
TABELLE IV
Was die vorangehenden Ausführungen betrifft, so wird die Erfindung keineswegs auf die durchgeführten Ausführungsformen, die beschriebene Durchführung und Anwendung, die genauer beschrieben wurden, beschränkt; im Gegenteil, sie umfasst alle Varianten, die dem Fachmann einfallen, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.

Claims

Peptid, das vom Env-Protein des VIF des Stamms Wo stammt, das ein konserviertes Epitop der Proteine des VIF bildet, dadurch gekennzeichnet, dass es aus der Gruppe, bestehend aus – dem Fragment aus 45 Aminosäuren, das TM3 genannt wird, und den Positionen 744 bis 788 der Sequenz der Formel I entspricht, – dem Fragment der Sequenz Gln⁷⁶³-Gln-Leu-Gln-Glu-Trp-Glu-Asp⁷⁷⁰ (Peptid, das P241 genannt wird), das den Positionen 763–770 der Sequenz der Formel I entspricht, und – dem Fragment der Sequenz Val⁷⁷²-Gly-Trp-Ile-Gly-Asn-Ile-Pro⁷⁷⁹ (Peptid, das P242 genannt wird), das den Positionen 772–779 der Sequenz der Formel I entspricht, ausgewählt ist.
Rekombinanter Klonierungs- und/oder Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleotidsequenz umfasst, die für das Peptid nach Anspruch 1 kodiert.
Vektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass er aus einem Plasmid, das einen Replikationsursprung, mindestens einen Selektionsmarker und eine Nukleotidsequenz, die für das Peptid nach Anspruch 1 kodiert, gebildet wird, wobei der Vektor ein Klonierungsvektor ist.
Vektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Klonierungsvektor durch ein Plasmid gebildet wird, das fähig ist, sich in E. coli zu replizieren, in den eine Nukleotidsequenz, die für das Peptid nach Anspruch 1 kodiert, insertiert ist.
Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass er durch einen rekombinanten Vektor in einem geeigneten Wirtsmikroorganismus, insbesondere einem Bakterium oder einer Eukaryontenzelle, gebildet wird, umfassend einen Replikationsursprung, mindestens ein Gen, dessen Expression die Selektion der Bakterien oder der Eukaryontenzellen, die den Vektor aufgenommen haben, erlaubt, einen Promotor, der die Expression der Gene in den Bakterien oder Eukaryontenzellen erlaubt, und in den eine Nukleotidsequenz insertiert ist, die für das Peptid nach Anspruch 1 kodiert.
Vektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass er durch einen Phagen λgt11 gebildet wird, in den Abbaufragmente des Plasmids pKSe1 im Leserahmen auf dem Niveau seiner EcoRI-Schnittstelle insertiert sind.
Zusammensetzung mit immunogener Wirkung und/oder Schutzwirkung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein Peptid nach Anspruch 1, gegebenenfalls in Verbindung mit mindestens einer anderen immunogenen oder immunstimulierenden Substanz und/oder ein pharmazeutisch annehmbares Vehikel umfasst.
Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen VIF, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht, Antikörper gegen VIF, die gegebenenfalls in einer biologischen Probe vorliegen, mit Hilfe eines Peptids gemäß Anspruch 1, das gegebenenfalls an einem geeigneten festen Träger fixiert ist, nachzuweisen, wobei die biologische Probe mit dem Peptid/den Peptiden, an das/an die sich die Antikörper gegen VIF binden, wenn solche Antikörper in der zu analysierenden Probe vorliegen, in Kontakt gebracht wird und das Ablesen des Resultats durch ein geeignetes Mittel, insbesondere DIA, RIA, Fluoreszenz, sichtbar gemacht wird.
Kit, der zur Verwendung im Verfahren zum Nachweisen von Antikörpern gegen VIF nach Anspruch 8 gebrauchsfertig ist, dadurch gekennzeichnet, dass er außer nützlichen Mengen an Puffern, die zur Durchführung des genannten Nachweises geeignet sind, geeignete Dosen mindestens eines Peptids nach Anspruch 1 umfasst.
Reagens zur Diagnose von Katzen-Immundefizienz, dadurch gekennzeichnet, dass es aus der Gruppe, bestehend aus einem der Peptide gemäß Anspruch 1 ausgewählt ist, und dass es ein universelles Diagnosereagens für einen VIF-Stamm ist.