DE69330758T2

DE69330758T2 - Mutanten von hepatitis a virus stamm hm-175 zur verwendung als hepatitis a virus impfstoffe

Info

Publication number: DE69330758T2
Application number: DE69330758T
Authority: DE
Inventors: Hondt Eric D; Suzanne U Emerson; Ann W Funkhouser; Robert H Purcell
Original assignee: SmithKline Beecham Biologicals SA; US Department of Health and Human Services
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA; US Department of Health and Human Services
Priority date: 1992-09-18
Filing date: 1993-09-17
Publication date: 2002-07-04
Anticipated expiration: 2013-09-18
Also published as: PT666751E; US20020176869A1; EP0666751A4; NZ256278A; SG73999A1; CA2144317C; DK0666751T3; EP0666751B1; US6423318B1; WO1994006446A1; JPH08504094A; US6680060B2; HK1013667A1; DE69330758D1; AU687012B2; US6180110B1; EP0666751A1; CA2144317A1; AU4858593A; JP3523646B2

Description

Diese Erfindung wurde mit Hilfe der Regierung unter bestimmten gemeinsamen Forschungs- und Entwicklungsabkommen gemacht, gewährt vom Department of Health and Human Services.

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet von Vaccine-Zusammensetzungen, die bei der Prophylaxe von Hepatitis A einsetzbar sind. Insbesondere wird erfindungsgemäß ein neues lebensfähiges Hepatitis A-Virus (HAV) und rekombinante und chimäre HAVs bereitgestellt, deren Genome im Vergleich zu dem ihres parentalen Stamms HM-175 modifiziert sind, um ihnen die Fähigkeit zu verleihen, sich in MRC-5-Zeilen vermehren zu können und eine geeignete Attenuierung für eine Verwendung als Lebendvaccinen bei Menschen oder anderen Primaten beizubehalten.

Hintergrund der Erfindung

In den Vereinigten Staaten ist das Hepatitis A-Virus die Ursache von etwa 25% aller klinischer Hepatitis-Fälle, die etwa 150 000 solcher Fälle ausmachen. Die Bevölkerungsteile, die einem hohen Risiko für Hepatitis A in den Industrieländern ausgesetzt sind, umfassen sozial benachteiligte Personen, medizinisches Personal, militärisches Personal, das Personal und Erwachsene, die Kontakt zu Kindern in Kindertagesstätten haben, männliche Homosexuelle, Drogenabhängige und Reisende in endemische Gebiete.
In den Entwicklungsländern ist scheinbar die gesamte Bevölkerung mit Hepatitis A-Virus in einem frühen Alter infiziert. Ein Großteil dieser Infektion führt zu einer subklinischen und inapparenten Infektion. Jedoch tritt, da die Länder ihre Hygienebedingungen verbessern, eine Infektion mit dem Hepatitis A-Virus in einem progressiv höheren Alter auf, was zu einem höheren Anteil klinischer Erkrankungen führt. Somit tritt eine paradoxe Erhöhung der klinischen Hepatitis A auf, während die Gesamtrate an Infektionen zurückgeht. Für eine erfolgreiche Immunisierung gegen Hepatitis A in den Vereinigten Staaten und in anderen Industrieländern sowie in Entwicklungsländern wird eine Impfung der gesamten pädiatrischen Bevölkerung notwendig sein. Der Bedarf für Hepatitis A-Vaccinen in solchen Ländern wird für die nahe Zukunft steigen.
Die Forschung im Bereich der HAV-Vaccinen richtete sich auf inaktivierte oder abgetötete Viren. Jedoch besitzt eine Lebendvaccine bei der Vaccinetherapie mehrere Vorteile gegenüber einer inaktivierten Vaccine. Bei Verwendung einer Lebendvaccine ist eine niedrigere Dosis und eine kleinere Anzahl von Dosen möglich, da eine Lebendvaccine in dem geimpften Lebewesen repliziert und somit mehr Antigen bereitstellt und das Immunsystem des geimpften Lebewesens stimulieren kann, IgA und IgM herzustellen. Inaktivierte Vaccinen wie die Salk-Polio-Vaccine, die nur die Produktion von IgG in geimpften Lebewesen stimuliert, schützen nicht vor einer Infektion durch Ingestionsvirus, sondern nur vor einer Erkrankung.
Ein Haupthindernis bei der Entwicklung einer attenuierten Lebendvaccine war das Problem der Adaption von HAV an eine Zelllinie, die eine rasche Virusvermehrung unterstützt und für die Vaccineproduktion zugelassen ist Wildtyp-Hepatitis A-Virus (HAV) ist nur schlecht in Zellkultur vermehrbar.
Die US-PSen 4,532,215 bzw. 4,636,469 beschreiben einen HAV-Stamm, bezeichnet als HM- 175, der ursprünglich aus menschlichem Feces eines Patienten in Melbourne, Australien, isoliert und für eine Passagierung in vitro in Zellkulturen der Afrikanischen Grünen Meerkatze (AGMK) adaptiert wurde. Ferner beschreiben sie Verfahren zur Gewinnung dieses Stamms durch serielle Passagierung. Die US-PS 4,620,978 beschreibt eine Vaccine unter Einsatz von HAV HM-175, das dreifach in AGMK-Zellkultur kloniert und attenuiert wurde. Die US-PS 4,894,228 beschreibt HM-175 Pass 35, das sich von Wildtyp-HM-175 durch Nukleotid-Austausche in dem Genom unterscheidet, für Schimpansen attenuiert ist, serumneutralisierende Antikörper hervorruft und für eine Verwendung als attenuierte HAV-Vaccine geeignet ist. Es wird die vollständige Nukleotidsequenz des HAV-Stamms HM-175/7 beschrieben; vgl. auch B.C. Ross et al., J. Gen. Virol. 70: 2805-2810 (1989); R.W. Jansen et al., Virol. 163: 299-307 (1988) und Tedeschi et al., J Med. Virol. (in Druck). Die Offenbarung dieser Patentschriften und Artikel ist durch eine Referenz hier umfasst.
N. Fineschi et al., J. Hepatol. 13 (4):5146-S151 (1991) beschreiben das HAV-Isolat LSH/S. das ein Kandidat für eine inaktivierte Vaccine ist. Es wurde an das Wachstum in menschlichen diploiden MRC-5-Zellen, eine bevorzugte zugelassene Zelle für die Vaccineentwicklung, adaptiert. In diesem Dokument wird nur ein kleiner Teil seiner Nukleotidsequenz mit der von Wildtyp-HM-175 verglichen.
Provost et al., J. Med. Virol. 20: 165-175 (1986) beschreiben die F- und F'-Varianten des CR326 Hepatitis A-Virusstamms. Obwohl es als immunogen bei einer Impfung von freiwilligen Personen beschrieben wird, verursachte die F-Variante auch abnormale ALT-Mengen im Serum in einem wesentlichen Teil der Personen.
Eine weitere, jüngere Veröffentlichung dieser Forschergruppe beschrieb die weitere Arbeit mit der F'-Variante [K. Midthun et al., J. Infect. Dis. 163: 735-739 (1991)]. Es wird beschrieben, dass die Immunogenizität des F'-Vaccineprodukts dosisabhängig ist, d. h. 107,3 TCID&sub5;&sub0; riefen eine Antikörperreaktion in 100% der freiwilligen Personen innerhalb von 9 Wochen nach einer Immunisierung hervor, während niedrigere Dosen in einem geringeren Teil der freiwilligen Personen immunogen waren. Anti-HAV wurde 4 bis 6 Monate nach einer Immunisierung beobachtet.
Chinesische Forscher beschrieben in jüngerer Zeit Untersuchungen mit einer möglichen attenuierten Lebendvaccine von Hepatitis A, die aus dem H2-Stamm von HAV hergestellt worden war [J.S. Mao et al., J. Infect. Dis. 159: 621-624 (1989)]. 12 Freiwillige erhielten subkutan die Vaccine.
Eine attenuierte Lebendvaccine von Hepatitis A könnte eine signifikante Bedeutung für die Ausrottung der Erkrankung haben. Voraussichtlich wäre eine attenuierte Lebendvaccine, die eine minimale Aufreinigung und kein Adjuvans erforderlich macht, weniger kostenintensiv als momentan verfügbare inaktivierte Hepatitis A-Vaccinen.
Es besteht der Bedarf für Verfahren und Zusammensetzungen für eine wirksame Vaccinierung von Menschen und Tieren gegen Hepatitis A.

Zusammenfassung der Erfindung

in einem Aspekt wird erfindungsgemäß ein lebensfähiges Hepatitis A-Virus bereitgestellt, das an das Wachstum in MRC-5-Zellen angepasst ist. Dieses Virus zeichnet sich vorzugsweise durch eine Attenuierung aus. Das attenuierte Virus kann rekombinant oder chimär sein. Insbesondere zeichnet sich das HAV durch eine geeignete Attenuierung für eine wirksame Vaccineverabreichung an Primaten, vorzugsweise Menschen, ohne Inaktivierung aus. Das HAV kann dadurch charakterisiert werden, dass es mindestens 4 von 14 spezifischen Nukelotiden enthält, die sich von den Nukleotiden an den gleichen Positionen in dem Genom von HAV HM-175, Pass 35 (SEQ ID NO: 1] unterscheiden, wobei mindestens die Nukleotidpositionen 591 und 687 zu Guanin verändert sind, 646 zu Adenin verändert ist und 669 zu Thymin verändert ist.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß eine Vaccine bereitgestellt, die für einen Schutz von Menschen oder anderen Primaten vor Hepatitis A einsetzbar ist. Die Vaccine enthält mindestens eines der vorstehend beschriebenen HAV, die für ein Wachstum in MRC-5-Zellen angepasst sind. Vorzugsweise ist die Vaccine wirksam bei der Induktion einer protektiven Antikörperreaktion ohne ein Adjuvans.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Schutz von Menschen vor einer Hepatitis A-Virusinfektion bereitgestellt, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Vaccinezusammensetzung an den menschlichen Patienten.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung eines lebensfähigen HAV bereitgestellt, das für ein Wachstum in MRC-5-Zellen durch Einbau von mindestens 4 von 14 spezifischen Nukleotiden in einen ausgewählten Bereich des Genoms eines HAV angepasst ist, wobei mindestens die Nukleotidpositionen 591 und 687 zu Guanin verändert sind, 646 zu Adenin verändert ist und 669 zu Thymin verändert ist. Das derart modifizierte HAV-Genom ist HAV HM-175, Pass 35.
In einer weiteren Ausführungsform kann das HAV durch Verwendung eines weiteren HAVcDNA-Klons und Insertion von geeigneten Nukleotiden in sein Genom hergestellt werden. Gemäß diesem Verfahren wird ein attenuiertes, MRC-5-adaptiertes HAV bereitgestellt, ohne dass eine weitere Passagierung in MRC-5- oder anderen Primaten-Zelllinien erforderlich ist.
In einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß Polynukleotidsequenzen bereitgestellt, die für die vorstehend beschriebenen rekombinanten oder chimären HAVs kodieren. Vorzugsweise sind diese Sequenzen cDNAs, die als Ausgangsprodukte für die Vaccineherstellung verwendbar sind.
Weitere erfindungsgemäße Aspekte und Vorteile werden nachstehend unter Bezugnahme auf die bevorzugten Ausführungsformen weiter beschrieben.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, in der die Produktion von anti-HAV-Antikörper gegenüber der Zeit (Wochen) gegenüber ALT- und ICD-Spiegeln für die Untersuchungen an Schimpansen mit dem Virus 4380 und einer darauffolgenden Kontaktierung mit Wildtyp- HAV, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgetragen ist. Die Ergebnisse wurden mit einem Schimpansen erhalten, der mit dem attenuierten HAV zum Zeitpunkt 0 infiziert und mit virulentem Virus in der 28. Woche in Kontakt gebracht worden war.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, in der die Produktion von anti-HAV-Antikörper gegenüber der Zeit (Wochen) gegenüber ALT- und ICD-Spiegeln für die Untersuchungen an Schimpansen mit dem Virus 4380 und einer darauffolgenden Kontaktierung mit Wildtyp- HAV, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgetragen ist. Die Bedingungen entsprachen denen von Fig. 1.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, in der die Produktion von anti-HAV-Antikörper gegenüber der Zeit (Wochen) gegenüber ALT- und ICD-Spiegeln für die Untersuchungen an Schimpansen mit dem Virus 4380 und einer darauffolgenden Kontaktierung mit Wildtyp- HAV, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgetragen ist. Die Bedingungen entsprachen denen von Fig. 1.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, in der die Produktion von anti-HAV-Antikörper gegenüber der Zeit (Wochen) gegenüber ALT- und ICD-Spiegeln für die Untersuchungen an Schimpansen mit dem Virus 4380 und einer darauffolgenden Kontaktierung mit Wildtyp- HAV, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgetragen ist. Diese Ergebnisse wurden mit dem Schimpansen erhalten, der nicht mit dem attenuierten HAV infiziert worden war und daher nach einer Kontaktierung mit dem virulenten Virus Hepatitis entwickelte. Die Bedingungen entsprachen denjenigen von Fig. 1.
Fig. 5 ist ein Säulendiagramm von Schlusspunkt-Verdünnungen mehrerer der chimären Viren, Viren #2, 3, 4, 5 und 6, die in Tabelle VI aufgeführt sind.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Erfindungsgemäß wird Hepatitis A-Virus (HAV) bereitgestellt, das an das Wachstum in der menschlichen Fibroblasten-Zelllinie MRC-5, ein Zellsubstrat, das für die kommerzielle Herstellung und Zulassung von inaktivierten und lebenden, attenuierten Hepatitis A-Vaccinen geeignet ist, angepasst ist. Zusätzlich zu derartigen angepassten HAVs wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Anpassung eines ausgewählten HAV an das Wachstum in dieser menschlichen Zeltlinie und zur Herstellung eines MRC-5-adaptierten, attenuierten HAV ohne Passagierung in anderen Primatenzellen bereitgestellt. Das erfindungsgemäße HAV und das Herstellungsverfahren stellen vorzugsweise auch das HAV mit einer ausreichenden Attenuierung bereit, um seine Wirksamkeit als Vaccine für Menschen und Tiere zu ermöglichen.
Obwohl der Stand der Technik andere Kandidaten-Vaccinestämme von Hepatitis A-Virus beschreibt, die an das Wachstum in menschlichen diploiden Fibroblasten angepasst worden sind, wurden die genetischen Veränderungen in dem Virusgenom, die für eine solche Anpassung notwendig und ausreichend sind, nicht charakterisiert. Somit können diese Stämme nicht in vitro manipuliert werden, um ein reproduzierbares und vollständig charakterisiertes Vaccineprodukt sicherzustellen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Wildtyp-HAV, Stamm HM-175, das detailliert in dem vorstehend aufgeführten und umfassten Stand der Technik beschrieben ist [Cohen et al., J. Virol. 61: 50-59 (1987); SEQ ID NO: 1 und 2]. Kurz gesagt wurde der infektiöse Wildtyp- HAV HM-175-Virus zuvor an das Wachstum in primären Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze (AGMK) bei 37ºC angepasst. Nach 26 Passagen in AGMK wurde das Virus dreimal in AGMK-Zellen durch serielle Verdünnung kloniert, sodann drei weitere Male passagiert, um die Passage 32 (P-32) bereitzustellen. P-32 war attenuiert wie beschrieben in R.A. Karron et.al.,.J. Infec. Dis. 157: 338-345 (1988).
Das vorstehend beschriebene P-32-Virus wurde drei weitere Male in AGMK passagiert und molekular kloniert. Das klonierte Virus wurde P-35 genannt und der vollständige Klon wurde als pHAV/7 bezeichnet. pHAV/7 ist ein infektiöser cDNA-Klon des Virus, der in einem monoklonalen Stadium gehalten und nach Belieben mit einem verringerten Risiko von Spontanmutationen amplifiziert werden kann. Das resultierende P-35-Virus wuchs gut in fötalen Nierenzellen des Rhesusaffen (FRhK) und schlecht in menschlichen fibroblastoiden Lungenzellen (MRC-5).
In der US-PS 4,894,228 und in Cohen et al., Proc. Natt Acad. Sci. USA 84: 2497-2501 (1987) werden die HAV-Nukleotidsequenzen des Wildtyp-HAV-Stamms HM-175 (vgl. Fig. 1 des Patents; SEQ ID NO: 1 und 2) und die Nukleotidunterschiede zwischen HAV HM-175, Pass 35, Klon pHAV/7 und der Wildtypsequenz [SEQ ID NO: 1] bereitgestellt. Somit wird durch diese Unterlagen, die durch eine Referenz umfasst sind, die Sequenz von pHAV/7, P- 35 [SEQ ID NO: 1 und 2] bereitgestellt. Die hier verwendeten Nukleotid-Bezifferungen, denen die Mutationen dieser Erfindung entsprechen (nachstehende Tabellen I und VI), sind die Bezifferungen der Nukleotide, die Positionen der Wildtypsequenz in Fig. 1 [SEQ ID NO: 1 und 2] der US-PS 4,894,228 mit den Mutationen für P-35 zugeteilt wurden. Zu bemerken ist, dass den in P-35 deletierten Nukleotiden die Nukleotidpositionen der Wildtypsequenz [SEQ ID NO: 1] aus zugeteilt wurden. Somit stellt z. B. die Nukleotidposition 131 ein Nukleotid dar, das im Vergleich von Wildtyp und P-35 deletiert wurde. Die P-35-cDNA, d. h. HAV/HM-175/7, wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, unter der Zugangsnummer 67495 am 7. August 1987 hinterlegt. Der Fachmann kann einfach die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von P-35 durch Einsatz des vorstehend aufgeführten Standes der Technik herstellen.
Sodann wurde das AGMK-Zellen-adaptierte und attenuierte P-32-Virus weiter manipuliert, um eine Anpassung für das Wachstum in MRC-5-Zellen zu ermöglichen, so dass es für eine Vaccineherstellung in großem Maßstab verfügbar ist. Die Passage 32 wurde zweifach in MRC-5 für die Herstellung der Passage 37 plaque-kloniert. Die Passage 37 wurde einmal in MRC-5 eines ausgewählten Klons 25-4-21 passagiert. Die resultierende Passage 38 wurde dreimal in MRC-5-Zellen passagiert, was zu Passage 41, dem Ausgangsprodukt, das als 87J19 bezeichnet wird, führte. Diese Ausgangsprodukt-Virusstammlösung wurde auch als Virus 4380 bezeichnet und wird in der gesamten Beschreibung mit dem letzteren Namen bezeichnet.
Lebendes attenuiertes Virus HAV 4380 wurde am 4. April 1990 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724, Paris CEDEX 15, unter der Zugangsnummer I-936 hinterlegt. Diese Hinterlegung erfolgte gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen und wurde nicht öffentlich verbreitet. HAV 4380 ist ein Zellkultur-adaptierter und attenuierter Stamm des Hepatitis A-Virusstamms HM-175, der an das Wachstum in einer menschlichen Fibroblasten-Zelllinie (MRC-5), die für die Vaccineentwicklung geeignet ist, durch Inkubation bei einer verminderten Temperatur von 32-35ºC angepasst wurde. Das Wachstum des Virus wird durch Nachweis von viralem Antigen in einem serologischen Test bestimmt. Das adaptierte Virus wird durch Plaque-Reinigung unter Einsatz eines bekannten Verfahrens (Radioimmunofokus-Test) aufgereinigt.
Nach insgesamt neun Passagen in MRC-5-Zellen bei einer verminderten Temperatur wurde das resultierende Virus in Bezug auf seine biologischen Charakteristika in Zellkultur und in zwei Primatenspezies, die als Modellsysteme für den Menschen betrachtet werden, d. h. Krallenaffen und Schimpansen, charakterisiert; vgl. z. B. nachstehendes Beispiel 1. Das HAV 4380-Virus war temperatursensitiv in MRC-5-Zellen (d. h. es wuchs nur bei verminderten Temperaturen), konnte sich jedoch immer noch bei 37ºC in primären Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze vermehren. Das Virus war bei einem Test in Schimpansen und Krallenaffen weiter in der Virulenz im Vergleich zu dem parentalen Virus HM-175, P-32 attenuiert, wobei das Virus in dieser Spezies nur schwach oder überhaupt nicht replizierte. Diese verringerte Fähigkeit zur Replikation in Primaten wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, weiterhin bei freiwilligen Personen bestätigt.
Eine inaktivierte Kandidaten-Hepatitis A-Vaccine wurde ausgehend von HAV 4380 hergestellt und erwies sich als sicher (d. h. sie erzeugt keine Hepatitis oder andere schwerwiegende Nebenwirkungen) und immunogen beim Menschen. Sie induzierte auch die Antikörperproduktion ohne ein Adjuvans. HAV 4380 in seinem gegenwärtigen Zustand vermehrt sich gut in einem Zellsubstrat, das für eine kommerzielle Vaccineherstellung geeignet ist. Es infiziert den Menschen auch nicht bei einer oralen oder intravenösen Verabreichung in Dosen von bis zu 107 Gewebekultur-infektiösen Dosen, selbst wenn eine Inaktivierung unterbleibt. HAV 4380 ist für eine Verwendung als lebende HAV-Vaccine beim Menschen geeignet. Jedoch wird, wie in Beispiel 2 gezeigt, vermutet, dass die Vaccine 4380 etwas über-attenuiert ist, da sie nicht infektiös ist, und diese Eigenschaft verringet ihre Wirksamkeit bei einer Verwendung als attenuierte Vaccine.
Für eine Herstellung anderer Vaccine-Kandidaten, die in Bezug auf einen gewünschten Grad einer Attenuierung und ein gutes Wachstum in. MRC-5-Zellen maximiert sind, fanden die Erfinder genetische Veränderungen in dem Genom des MRC-5-adaptierten HAV 4380-Virus, die seine Vermehrungseigenschaften veränderten und es für eine Vaccineherstellung geeigneter machten als das verwandte AGMK-adaptierte Virus HM-175, Passage 35. Das Auffinden der nachstehenden Mutationen in den Nukleotidsequenzen von 4380 in einem Vergleich zu HM-175, Pass 35 [Cohen et al., supra; US-PS 4,894,228, Fig. 1; SEQ tD NO: 1 und 2] erlauben die Manipulation des HAV-Genoms durch genetische Veränderung.
Somit erlaubt die Kenntnis der genomischen Unterschiede zwischen den AGMK-adaptierten Passagen von HM-175 und dem stärker attenuierten 4380 die Herstellung chimärer Viren mit den verbesserten Wachstumscharakteristika, d. h. einer schnellen und wirksamen Vermehrung in MRC-5-Zellkultur, jedoch mit einem Attenuierungsgrad der Virulenz für Primatenspezies, einschließlich Mensch, der es dem Virus erlauben wird, wirksam ohne ein Hervorrufen von Hepatitis oder anderen Nebenwirkungen zu replizieren. Die Erfindung ermöglicht die Entwicklung eines chimären HAV, das die optimalen Eigenschaften für eine lebende attenuierte Kandidaten-Hepatitis A-Vaccine erreichen kann. Ein solches Virus wird auch die Entwicklung bevorzugter inaktivierter Vaccine-Kandidaten, falls gewünscht, erlauben. Erfindungsgemäß werden die Mutationen identifiziert, die vermutlich während der Anpassung an das Wachstum des HAV-Stamms HM-175, Passage 32, in MRC-5-Zellen auftraten. Eine Kombination dieser Mutationen ist verantwortlich für eine Anpassung an MRC-5-Zellen und Über-Attenuierung in HAV 4380. Die Nukleotidsequenz des MRC-5-Zell-adaptierten Virus HAV 4380 wurde mit der des AGMK-adaptierten HM-175-Virus, Passage 35, Klon 7, verglichen. Nukleotid-Konsensussequenzen wurden direkt aufgrund von Produkten einer Polymerase-Kettenreaktion bestimmt.
Die Erfinder fancien heraus, dass es mindestens 14 einzigartige Nukleotidunterschiede zwischen dem HM-175/7-Virus, Pass-35 [SEQ ID NO: 1] und dem MRC-5-adaptierten Virus 4380 gibt, von denen mindestens 12 offenbar während der Anpassung des Hepatitis A-Virus (HAV)-Stamms HM-175, Pass 32 [SEQ ID NO: 1] an das Wachstum in MRC-5-Zellen auftraten. fn Tabelle I sind diese 12 Mutationen durch Nukleotidunterschiede und sich daraus ergebende Aminosäure-(As)-Unterschiede, falls vorhanden, aufgeführt, die in dem MRC-5- adaptierten Virus HAV 4380 aufgetreten sind. Die anderen beiden Mutationen scheinen Rück-Mutationen zur Wildtyp-Sequenz zu sein oder sie scheinen, was wahrscheinlicher ist, Mutationen darzustellen, die zwischen den Passagen 32 und 35 in AGMK-Zellen auftraten und die daher Unterschiede zwischen dem biologisch charakterisierten P-32-Virus und dem molekular klonierten P-35-Virus darstellen. Zu bemerken ist, dass die Partialsequenz von LSH/S-HAV aus Fineschi et al., supra, nur mit der Mutation an Position 5145 überlappt.
In der Tabelle stellt A Adenin, G Guanin, C Cytosin und U Uridin oder Thymin dar. Leu stellt Leucin, Phe Phenylalanin, Ile Isoleucin, Val Valin und Ser Serin dar. TABELLE I Nukleotid-Veränderungen, die während der Anpassung von HM-175 in MRC-5-Zellen auftraten: Vergleich mit der Sequenz von HM-175/7 (P-35)
Neue HAV-Vaccine-Kandidaten werden durch Einbringen von mindestens vier dieser Nukleotide in ein HAV bei Nukleotidpositionen entwickelt, die zu den Nukleotidpositionen in der genomischen Sequenz des AGMK-adaptierten Virus HM-175, Pass 35 [SEQ ID NO: 1] homolog sind, wobei zumindest die Nukleotidpositionen 591 und 687 zu Guanin verändert werden, 646 zu Adenin verändert wird und 669 zu Thymin verändert wird. Diese in Tabelle 1 identifizierten Nukleotide können an Nukleotidpositionen, die denjenigen von P-35 analog und/oder homolog sind, in der genomischen Sequenz anderer NAV-Stämme und -Varianten für die Herstellung eines erfindungsgemäßen rekombinanten oder chimären HAV eingebracht werden. "Analoge oder homologe Nukleotidposition" bedeutet ein Nukleotid in einem zu HAV HM-175, Pass 35 [SEQ 1D NO: 1] verschiedenen HAV, das in derselben viralen Region, z. B. 2C, 3D und ähnlichen, an einer Position in dieser Region auftritt, die zu der des Nukleotids aus -Tabelle I ähnlich ist. Anders gesagt kann die Nukleotidposition sich in der Positionsnummer aufgrund von Deletionen in anderen Regionen des Virus unterscheiden. Der Fachmann kann jedoch einfach seine funktionelle Ähnlichkeit zu der Nukleotidposition in HM-175, Pass 35 [SEQ ID NO: 1] bestimmen.
Obwohl solche Nukleotidpositionen nicht die identischen Nukleotid-Positionsnummern, entspechend dem Wildtyp-HM-175 [SEQ ID NO: 1], haben können, können diese analogen und/oder homologen Positionen einfach identifiziert werden, um eine Modifizierung von zu dem Stamm HM-175 unterschiedlichen HAVs für die Herstellung neuer erfindungsgemäßer HAVs zu ermöglichen.
In ähnlicher Weise sind die Erfinder in der Lage, das Genom eines Vorläufers oder Intermediats von HAV 4380 unter Anwendung dieses Wissens zu manipulieren und können dadurch bestimmte Mutationen in 4380 für die Herstellung neuer chimärer HAV-Viren "revertieren". Eines oder mehrere dieser Nukleotide oder verschiedene Kombinationen davon können durch Chimärbildung oder Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese in einen HAV-Stamm, am besten den cDNA-Klon HAV/HM-17517 eingebaut werden, um neue lebensfähige Viren mit der Fähigkeit, sich in MRC-5-Zellen zu vermehren, herzustellen. Andere HM-175 HAV-Derivate sind von der American Type Culture Collection unter den ATCC-Zugangsnummern VR 2089, VR 2090, VR 2091, VR 2092, VR 2093, VR 2097, VR 2098 und VR 2099 verfügbar. Diese und andere HAVs können eingesetzt werden, um gewünschte erfindungsgemäße HAVs abzuleiten. Da es Anzeichen dafür gibt, dass das MRC-5-adaptierte Virus 4380 für den Menschen über-attenuiert sein könnte, ist es wichtig, ausgewählte Mutationen in HM- 175 entfernen oder einbringen zu können. Die Herstellung von neuen beispielhaften chimären Viren mit einer oder mehreren solcher Mutationen ist detailliert in dem nachstehenden Beispiel 3 beschrieben.
Die für die Herstellung von chimären oder rekombinanten HAVs verwendeten Mutageneseverfahren und Verfahren einer genetischen Veränderung, durch die eine oder mehrere dieser Mutationen eingebaut werden, sind herkömmliche Verfahren und sind bekannt [vgl. z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Colcl Spring Harbor, N.Y. (1989)]. Andere herkömmliche Verfahren, einschließlich Polymerase-Kettenreaktion und chemische Syntheseverfahren, können auch für das Entwerfen erfindungsgemäßer HAVs eingesetzt werden. In ähnlicher Weise können homologe Mutationen unter Verwendung anderer HM-175-Passagen gesetzt werden.
Erfindungsgemäße chimäre und rekombinante Viren können auch durch Anwendung ähnlicher Verfahren und Auswahl von einer oder mehreren verschiedenen Kombinationen der Nukleotide (Mutationen), die in den Tabellen I und VI aufgeführt sind, entwickelt werden. Zum Beispiel zeigen die Daten für Wachstumsuntersuchungen der chimären Viren aus Beispiel 3, dass die vier MRC-5-spezifischen Mutationen in der 5'-nicht-kodierenden Region (Mutationen an den Nukleotidpositionen 591, 646, 669 und 687 von HM-17577) und eine oder beide MRC-5-spezifischen Mutationen in der 2C-Region (Mutationen an den Nukleotidpositionen 4418 und 4643 von HM-175/7) für eine optimale Vermehrung des Virus in MRC- 5-Zellen erwünscht sind. Andere Mutationen können auch einbezogen werden. Spezifische beispielhafte erfindungsgemäße chimäre HAVs zeichnen sich durch die Mutationen in dem Genom von HAV HM-175/7 aus, die in Viren, die mit #2 bis #10 in Tabelle VI des nachstehenden Beispiels 3 bezeichnet sind, auftreten.
Erfindungsgemäße HAVs können durch das Auftreten von mindestens vier dieser Nukleotide der Tabellen I oder VI an analogen genomischen Positionen von HAV HM-175-Derivaten charakterisiert werden, wobei mindestens die Nukleotidpositionen 591 und 687 zu Guanin verändert sind, 646 zu Adenin verändert ist und 669 zu Thymin verändert ist.
Weitere Mutationen können in wenigen Regionen von HAV auftreten, die noch sequenziert werden müssen. Die in Tabelle I aufgeführten Mutationen können in jeglicher Kombination und/oder zusammen mit anderen Mutationen, die noch zu identifizieren sind, eingebaut werden, um eine Reihe chimärer oder rekombinanter HAVs mit den gewünschten Eigenschaften für eine Verwendung als Lebende HAV-Vaccinen herzustellen.
Weitere chimäre und rekombinante Viren, die durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese hergestellt werden, können entworfen werden und in Bezug auf die einzelnen Wirkungen der Mutationen und Kombinationen davon auf das virale Wachstum in MRC-5-Zellen und auf die Anpassung an das Wachstum in ausgewählten Zellkulturen bewertet werden. Der Attenuierungsphänotyp dieser chimären Viren kann in Krallenaffen oder Schimpansen durch Verfahren, wie nachstehend in Beispiel 1 für HAV 4380 beschrieben, bewertet werden.
Ebenfalls erfindungsgemäß bereitgestellt werden die Polynukleotidsequenzen, die für die erfindungsgemäßen HAVs kodieren. Solche Polynukleotidsequenzen sind vorzugsweise cDNA-Sequenzen, die ein Ausgangsprodukt für die HAV-Vaccine bilden können. Eine erfindungsgemäße cDNA-Sequenz umfasst eine DNA-Sequenz, die für ein ausgewähltes HAV- Genom kodiert, das sich durch das Auftreten von einem oder mehreren der Nukleotide, die als die 12 Mutationen in Tabelle I identifiziert sind, in jeglicher gewünschter Kombination auszeichnet, die dem neuen HAV gewünschte Eigenschaften verleiht. Solche cDNAs können durch bekannte herkömmliche Verfahren erhalten werden; vgl. z. B. Sambrook et al., supra, und US-PS 4,894,228.
Somit wird erfindungsgemäß eine Lebendvaccine-Zusammensetzung bereitgestellt, die für einen Schutz vor einer HAV-Infektion einsetzbar ist. Weiterhin wird ein prophylaktisches Verfahren bereitgestellt, das die Verabreichung einer wirksamen Menge einer solchen Zusammensetzung an einen Primaten, vorzugsweise einen Menschen, erfordert. Diese Vaccine-Zusammensetzung kann ein oder mehrere der erfindungsgemäßen HAVs enthalten, einschließlich HAV 4380 sowie die hier beschriebenen chimären und rekombinanten HAVs. Die Vaccine-Zusammensetzung kann auch Gemische aus zwei oder mehreren der HAVs, falls gewünscht, enthalten.
Eine Vaccine-Zusammensetzung kann derart formuliert sein, das sie einen Träger oder ein Verdünnungsmittefund ein oder mehrere der erfindungsgemäßen HAVs enthält. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger ermöglichen die Verabreichung der Viren, sind jedoch physiologisch inert und/oder unschädlich. Träger können durch den Fachmann ausgewählt werden Beispielhafte Träger umfassen sterile Salzlösungen, Lactose, Sucrose, Calciumphosphat, Gelatine, Dextrin, Agar, Pektin, Erdnussöl, Olivenöl, Sesamöl und Wasser. Ferner kann der Träger oder das Verdünnungsmittel einen Zeitverzögerungsstoff wie Glycerin- Monostearat oder Glycerin-Distearat allein oder zusammen mit einem Wachs umfassen.
Ferner können Polymer-Formulierungen mit verzögerter Freisetzung eingesetzt werden. Gegebenenfalls kann die Vaccine-Zusammensetzung ferner Konservierungsstoffe, chemische Stabilisatoren, andere antigene Proteine und herkömmliche pharmazeutische Bestandteile enthalten. Geeignete Bestandteile, die in einer Vaccine-Zusammensetzung zusammen mit den Viren verwendet werden können, umfassen z. B. Casaminosäuren, Sucrose, Gelatine, Phenolrot, N-Z-Amin, Monokaliumdiphosphat, Lactose, Lactalbumin-Hydrolysat und Trockenmilch. Typischerweise sind Stabilisatoren, Adjuvanzien und Konservierungsstoffe optimiert, um die geeignetste Formuhierung für eine Wirksamkeit im beabsichtigten Menschen oder Tier zu bestimmen. Geeignete Konservierungsstoffe umfassen Chlorbutanol, Kaliumsorbat, Sorbinsäure, Schwefeldioxid, Propylgallat, die Parabene, Ethylvanillin, Glycerin, Phenol und Parachlorphenol.
Eine erfindungsgemäße Vaccine-Zusammensetzung wird am besten ohne ein Adjuvans hergestellt. Jedoch können, falls notwendig, ein oder mehrere der vorstehend beschriebenen Vaccine-Bestandteile mit einem herkömmlichen Adjuvans gemischt oder adsorbiert werden. Das Adjuvans wird als nicht-spezifischer Reizstoff für eine Anlockung von Leukozyten oder für die Verstärkung einer Immunreaktion eingesetzt. Solche Adjuvanzien umfassen unter anderem Mineralöl und Wasser, Aluminiumhydroxid, Amphigen, Avridin, L121/Squalen, D-Lactid-Polylactid/Glycosid, Pluronic-Plyois, Muramyldipeptid, abgetötetes Bordetella, Saponine und Quil A.
Alternativ oder zusätzlich zu dem erfindungsgemäßen HAV sind weitere Wirkstoffe, die bei einer Behandlung einer HAV-Infektion hilfreich sind, wie immunstimulatorische Wirkstoffe, erwartungsgemäß für eine Verringerung oder Beseitigung von Krankheitssymptomen verwendbar. Die Entwicklung von Vaccine-Zusammensetzungen oder therapeutischen Zusammensetzungen mit diesen Wirkstoffen liegt im Hinblick auf die erfindungsgemäße Lehre im Bereich der Möglichkeiten des Fachmanns.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann ein Mensch oder ein Tier gegen eine HAV- Infektion durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer vorstehend beschriebenen Vaccine-Zusammensetzung geimpft werden. Eine wirksame Menge ist als diejenige Menge einer HAV-Vaccine definiert, die einen Schutz in dem geimpften Lebewesen gegen eine HAV-Infektion und/oder gegen Hepatitis induzieren kann. Die Vaccine kann auf irgendeinem geeigneten Weg verabreicht werden. Eine solche Zusammensetzung kann parenteral, vorzugsweise intramuskulär oder subkutan verabreicht werden. Jedoch kann die auch für eine Verabreichung auf irgendeinem anderen geeigneten Weg, einschließlich oral, formuliert werden.
Geeignete wirksame Mengen der erfindungsgemäßen HAVs können durch den Fachmann, basierend auf dem Grad einer gewünschten Immunreaktion bestimmt werden. Eine solche Zusammensetzung kann einmal verabreicht werden und/oder ein Booster kann auch verabreicht werden. Jedoch können geeignete Anpassungen der Dosis durch den behandelnden Arzt oder Veterinärmediziner erfolgen, abhängig vom Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht und dem allgemeinen Gesundheitszustand des menschlichen oder tierischen Patienten.
In ähnlicher Weise können geeignete Dosen der erfindungsgemäßen Vaccine-Zusammensetzung einfach durch den Fachmann bestimmt werden. Die Dosis kann abhängig von dem behandelten menschlichen Patienten oder der Tierspezies, d. h. seinem Gewicht, Alter und allgemeinen Gesundheitszustand, angepasst werden.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die bevorzugten Verfahren zur Gewinnung erfindungsgemäßer HAVs und deren Verwendung als Vaccine-Zusammensetzungen. Diese Beispiele sind nicht beschränkend zu verstehen.

Beispiel 1: Test einer MRC-5-adaptierten HAV 4380-Vaccine in Krallenaffen und Schimpansen

Die Attenuierung des Hepatitis A-Virus (HAV)-Stamms HM-175 durch serielle Passagierung in Zellkultur wurde zuvor gezeigt. Nach 32 Passagen in primären AGMK-Zellen war das Virus vollständig für Schimpansen und nahezu vollständig für Krallenaffen attenuiert. Sodann wurde erfindungsgemäß das Virus an das Wachstum in MRC-5-Zellen adaptiert und durch Plaque-Reinigung rückkloniert.
HAV 4380 wurde aus der Freiwilligen-Probe 87J19, Passagierungsstufe 41 eines HAV des Stamms HM-175, hergestellt, die von zuvor charakterisierten Passagierungsstufen des Virus abgeleitet war, die auch als Freiwilligen-Pools hergestellt worden waren. Es wurde gezeigt, dass zwei solche früheren Passagierungs-Pools für Schimpansen und Krallenaffen attenuiert waren. Jedoch wurde keiner von ihnen an Freiwillige verabreicht, da man erkannte, dass primäre Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze, das Substrat für diese Freiwilligen-Pools, nicht in ausreichenden Mengen für die Herstellung einer eigenwirtschaftlichen Vaccine verfügbar sein würden. Daher wurde das Virus an MRC-5-Zellen angepasst und weiter für die Herstellung der Freiwilligen-Probe 87J19 oder HAV 4380 passagiert.
Der Zweck dieses Experiments ist das Testen des Attenuierungsgrads dieses Virus für Krallenaffen und Schimpansen vor klinischen Versuchen der Phase I mit Freiwilligen. Die Probe 87J19 wurde in Bezug auf die Sicherheit und Immunogenizität in 4 Schimpansen und 4 Krallenaffen (Saquinus mystax) getestet. 2 weitere Krallenaffen dienten als nicht-beimpfte Kontrollen. Die in dieser Untersuchung verwendeten Schimpansen wurden gekreuzt und in Gefangenschaft aufgezogen. Die Krallenaffen waren in der Wildnis gefangene Tiere. Jedes Tier wurde mit 104 TCID&sub5;&sub0; der Kandidaten-Vaccine-Probe 87J19 intravenös geimpft. Das restliche Impfmaterial wurde eingefroren und der Titer sodann in zwei verschiedenen Laboratorien erneut bestätigt.
Gemäß dem experimentellen Protokoll wurden die durch die zufälligen Identifikationsnummern 570, 572, 566 und 575 identifizierten Krallenaffen und die durch die zufälligen Identifikationsnummern 1300, 1333, 1309 und. 1313 identifizierten Schimpansen mit HAV 4380 des Klons 25-4-21, Probe 87 J 19575, 17111187 bei einer Dosis und einem Verabreichungsweg von 103-Verdünnung/1 ml/l.V. geimpft. Die Krallenaffen Nr. 541 und 578 erhielten ein Verdünnungsmittel bei einer Dosis und einem Verabreichungsweg von 1 ml/l.V.
A. Infektion: 3 von 4 Schimpansen und 1 von 4 Krallenaffen wurden infiziert, wie durch die Entwicklung von durch einen käuflichen Radioimmunoassay (HAVAB, Abbott Laboratories, Chicago, IL) nachweisbaren anti-HAV nachgewiesen wurde. Die Schimpansen erfuhren 10 bis 11 Wochen nach der Beimpfung eine Serokonversion. Die einzelne Serokonversion bei den Krallenaffen trat 8 Wochen nach der Beimpfung auf. Dieser Krallenaffe starb sodann in der 11. Woche der Untersuchung und ein weiterer, nicht-infizierter Krallenaffe starb sodann in der 14. Woche. Jedoch war keiner der Todesfälle der Beimpfung zuzuschreiben.
Alle 3 Schimpansen, die eine Serokonversion erfuhren, entwickelten auch IgM-anti-HAV. 2 davon, Chimp 1309 und Chimp 1313, entwickelten IgM gegen HAV in der 10. bzw. 13. Woche in einem Test durch den Standard-HAVAB-M (Abbott Laboratories, Chicago, IL) bei einer Serum-Endverdünnung von 1 : 4000. Falls die Seren bei einer Verdünnung von 1 : 40 getestet wurden, erfuhren Chimp 1313 und Chimp 1333 in der 9. bzw. 5. Woche eine Serokonversion. Der HAVAB-M-Test ist ein Abfangtest, der anti-humanes IgM verwendet, und wurde nicht für die Verwendung mit Seren aus Primaten standardisiert, die weniger nahe zum Menschen als zum Schimpansen verwandt sind. Aus diesem Grund wurden die Krallenaffen nicht in Bezug auf IgM gegen HAV getestet.
B. Biochemie: Biochemische Anzeichen von Hepatitis wurden durch wöchentliche Bestimmung der Alanin-Aminotransferase (ALT) und Isocitronensäure-Dehydrogenase (ICD) im Serum überwacht. Erstere ist die verlässlichste indirekte Möglichkeit einer Diagnose von Hepatitis beim Schimpansen und Letztere ist vergleichbar sensitiv für eine Bewertung von Krallenaffen. Keiner der Schimpansen oder Krallenaffen wies eine Erhöhung der Leberenzyme auf, die dem Impfmaterial zuzuschreiben war. Alle Werte für die Schimpansen waren innerhalb des normalen Rahmens. Der einzige infizierte Krallenaffe, Nr. 582, wies normale Leberenzyme bis zum Todeszeitpunkt auf. Die Krallenaffen 566, 570 und 578 wiesen jeweils einen oder mehrere abnormale Leberenzymwerte auf, jedoch waren die ersten beiden dieser Tiere nicht durch das Impfmaterial infiziert, wie durch eine fehlende Serokonversion ermittelt wurde, und der Dritte war eine nicht-beimpfte Negativkontrolle.
Krallenaffen weisen häufig weniger stabile Leberenzymwerte als Schimpansen auf, zum Teil, weil sie von Natur aus relativ zarte Tiere sind und aus dem Dschungel eingefangen wurden und daher gewöhnlich mit einer Vielzahl von Endo- und Ekto-Parasiten, einschließlich Mikrofilaria, infiziert sind.
C. Histologie: Histologische Schnitte, die aus von den Schimpansen und Krallenaffen gewonnenen seriellen wöchentlichen Leberbiopsien hergestellt worden waren, wurden unter einem Code in Bezug auf histologische Veränderungen bewertet. Obwohl manche Tiere eine hohe Basislinie von histopathologischen Veränderungen aufwiesen, zeigte keines der Tiere Anzeichen von histopathologischen Veränderungen, die schwerwiegender waren als diejenigen bei Biopsien vor einer Beimpfung. Genauso entscheidend war, dass keine histologischen Veränderungen auftraten, die temporär zu einer Serokonversion in infizierten Tieren in Beziehung standen. Die 2 Krallenaffen, die starben, wurden einer ausgedehnteren Bewertung unterzogen. Beide Tiere wiesen Anzeichen einer systemischen Erkrankung auf, die möglicherweise ethiologisch mit ihrem Tod in Beziehung stand. Jedoch waren histologische Veränderungen in der Leber diagnostisch für eine chronische, nicht-akute Erkrankung und standen daher nicht in Beziehung zum Impfmaterial.
Ein Vergleich von histopathologischen Veränderungen, die bei den Schimpansen und Krallenaffen mit diesen verschiedenen Freiwilligen-Pools und Wildtyp-Virus beobachtet wurden, wurde angestellt; vgl. die nachstehenden Tabellen II und IIL. Tabelle II HISTOPATHOLOGIE: SCHIMPANSEN
* Dosis: 10³-10&sup5; ID&sub5;&sub0; IV
** Skala von 0-3+ Tabelle III HISTOPATHOLOGIE: KRALLENAFFEN
* Dosis: 10³-10&sup5; ID&sub5;&sub0; IV
** Skala von 0-3+
Die Probe 87J19 scheint stärker attenuiert zu sein als die anderen Freiwilligen-Pools oder Wildtyp-Virus, basierend auf der Infektiosität und dem Ausmaß der histopathologischen Veränderungen.
D. Immunofluoreszenz: Serielle schockgefrorene Leberbiopsien aus infizierten Tieren wurden in Bezug auf die Expression von viralem Antigen durch Immunofluoreszenz bewertet. Nur ein Tier, Chimp 1313, war definitiv, jedoch schwach positiv in Bezug auf virales Antigen in der Leber. Dieses Tier war nur eine Woche lang positiv. Diese Ergebnisse wurden mit denjenigen aus der vorhergehenden Untersuchung von anderen Freiwilligen-Pools und Wildtyp-Virus verglichen. Wie in den Tabellen IV und V zu erkennen, war die Replikation in der Leber ferner sowohl in Schimpansen wie in Krallenaffen im Vergleich mit dem AGMKvermehrten Virus und Wildtyp-Virus verringert. Tabelle IV VIRALE REPLIKATION IN DER LEBER: KRALLENAFFEN (IMMUNOFLUORESZENZ)
* Dosis: 10³-10&sup5; ID&sub5;&sub0; IV Tabelle V VIRALE REPLIKATLON IN DER LEBER: SCHIMPANSEN (IMMUNOFLUORESZENZ)
* Dosis: 10³-10&sup5; ID&sub5;&sub0; IV
E. Protektion: Obwohl der einzige infizierte Krallenaffe der Untersuchung starb, waren alle 4 Schimpansen für eine Kontaktierung mit parentalem Wildtyp-HAV verfügbar, um zu bestimmen, ob die Spiegel an anti-HAV in infizierten Tieren eine schützende Wirkung aufwiesen. Dementsprechend wurde den 3 infizierten und dem einen nicht-infizierten Tier etwa 10³ infektiöse Dosen für einen Schimpansen des HAV-Wildtyp-Stamms HM-175 (Suspension aus menschlichem Stuhl) intravenös verabreicht (Fig. 1 bis 4).
Alle drei zuvor infizierten Schimpansen wurden vor Typ A-Hepatitis geschützt, wie gemessen durch persistent normale Enzymmengen im Serum (Fig. 1 bis 3). Alle drei geschützten Tiere wiesen eine anamnestische Antikörperreaktion gegenüber dem Virus auf, was nahe legt, dass eine begrenzte Replikation vorhanden war. Im Gegensatz dazu entwickelte der zuvor nicht-infizierte Schimpanse auf eine Exposition mit Wildtyp-Virus hohe Enzymwerte, die für Hepatitis diagnostisch waren (Fig. 4). Somit erzeugte der Freiwilligen-Pool 87J19 eine inapparente Infektion in Schimpansen, die einen Schutz gegenüber einer darauffolgenden Exposition mit virulentem Wildtyp-Virus stimulierte.
Die Ergebnisse dieser experimentellen Teile zeigen, dass der Freiwilligen-Pool 87J19 von HAV 4380, Stamm HM-175 (an MRC-5-Zellen angepasst) bei Schimpansen und Krallenaffen signifikant stärker attenuiert war als der parentale HAV, Stamm HM-175 (AGMK, Pass-32). Aus diesen Unfiersuchungen wird deutlich, dass HAV 4380, Stamm HM-175, Freiwilltigen- Pool 87J19, bei Schimpansen und Krallenaffen stark attenuiert ist, die bekannte Modellsysteme für den Menschen bei der Untersuchung von Hepatitis A-Viren sind.

Beispiel 2: Klinische Untersuchung von Freiwilligen

In dieser klinischen Untersuchung erhielten Freiwilllige steigende Titer der attenuierten Hepatitis A-Lebendvaccine 4380, Freiwilligen-Pool 87J19, die zuvor in Schimpansen und Krallenaffen wie in Beispiel 1 beschrieben getestet worden war. Diese prä-klinischen Studien zeigten, dass die Vaccine sicher, immunogen und wirksam in experimentellen Tiermodellen war.
Den Freiwilligen wurde Zugang zu einer geschlossenen klinischen Abteilung beim United States Army Medical Research Institute of Infecious Diseases, Fort Detrick, Maryland, gewährt. Acht Freiwillige erhielten oral die attenuierte Hepatitis A-Lebendvaccine (1 ml) in der nachstehenden Weise: zwei erhielten eine Dosis von 10&sup4; TCID&sub5;&sub0;, zwei eine Dosis von 10&sup5; TCID&sub5;&sub0;, zwei eine Dosis von 10&sup6; TCID&sub5;&sub0; und zwei eine Dosis von 10&sup7; TCID&sub5;&sub0;. Sechs Freiwillige erhielten die Vaccine intramuskulär in den Deltoideus-Bereich in der nachstehenden Weise: zwei erhielten eine Dosis von 10&sup5; TCID&sub5;&sub0;, zwei eine Dosis von 106 TCID&sub5;&sub0; und zwei eine Dosis von 10&sup7; TCID&sub5;&sub0;.
Jeder Freiwillige blieb 3 Tage nach der Immunisierung in der Abteilung. Lokale oder systemische Nebenwirkungen wurden während des Aufenthalts und 12 Wochen nach der Immunisierung übenrwacht. Die Freiwilligen wurden gebeten, nach 6 und 12 Monaten für eine serologische Verlaufskontrolle zurückzukehren.
Seren wurden vor einer Immunisierung und einmal pro Woche während der nächsten 12 Wochen gewonnen. Bei Freiwilligen, die die geeignete Verlaufskontrolle abschlossen, wurden Seren auch 6 und 12 Monate nach der anfänglichen Vaccine-Verabreichung gewonnen. Serumproben wurden in Bezug auf Alanin-Aminotransferase (ALT) und Antikörper gegen Hepatitis A getestet. ALT wurde mit einem Kodak EKTA Chem 700XR Analysegerät (Rochester, NY) getestet. Normaler Werte betrugen 0 bis 50 IU/ml. Antikörper gegen Hepatitis A wurden durch vier verschiedene Verfahren getestet, einschließlich eines kommerziellen Radioimmunoassays (HAVAB, Abbott Laboratories, N. Chicago, IL). Zum zweiten wurde ein von SmithKline Beecham entwickelter Enzym-gekoppelter Immunoassay (SKB-ELISA) eingesetzt, der sensitiver als der Standard-HAVAB war, bei dem ein Spiegel von 20 milli- Internationalen Einheiten (mlU) als positiv betrachtet wurde Ausgewählte Seren wurden durch den RIFIT (Radioimmunofocus)-Assay in Bezug auf neutralisierende Antikörper gegen Hepatitis A getestet. Bei diesem Test wurde ein Serumtiter von 1 : 10 als positiv betrachtet [S.M. Lemon et al., J. Infect Dis. 148: 1033-1039 (1983)]. Schließlich wurden die Seren in Bezug auf IgM gegen HAV durch einen käuflichen Radioimmunoassay getestet (HAVAB-M, Abbott Laboratories, N. Chicago, IL).
Der Stuhl der Freiwilligen wurde zwei- bis dreimal pro Woche während der ersten 12 Wochen gesammelt und in Bezug auf das Auftreten von Hepatitis A-Virus durch einen Radioimmunoassay [R.H. Purcell et al., J. Immunol. 116: 349-356 (1976)] und molekularbiologische Verfahren [J. Ticehurst et al., J. Clin. Microbiol 25: 1822-1829 (1987)] getestet.
Alle Freiwilligen blieben während der Verlaufskontrolle gesund (14 Wochen bis 1 Jahr). Keine systemischen Beschwerden traten unmittelbar nach der Immunisierung oder während der Langzeit-Verlaufskontrolle auf. Alanin-Aminotransferase-Spiegel im Serum blieben bei allen 14 Personen während der Beobachtungszeit normal.
Antikörper gegen Hepatitis A wurde bei keinem der acht Freiwilligen, die die Vaccine oral erhielten, oder bei den zwei Freiwilligen, die die Dosis von 10&sup5; TCID&sub5;&sub0; intramuskulär erhielten, festgestellt. Die vier Freiwilligen, die höhere Dosen der Vaccine (10&sup6; TCID&sub5;&sub0; oder 10&sup7; TCID&sub5;&sub0;) erhielten, wiesen 3 Wochen nach der Immunisierung alle nachweisbare Antikörper im SKB-ELISA auf. Nachweisbare Spiegel dauerten die 12 Wochen der Überwachung an.
Ausgewählte Seren, die in Bezug auf neutralisierende Antikörper getestet wurden, wiesen Titer in einem Bereich von 1 : 10 bis 1 : 40 bei einem Freiwilligen, der eine Dosis von 106 erhielt, und 1 : 40 bis 1 : 2560 bei einem Freiwilligen, der eine Dosis von 10&sup7; TCID&sub5;&sub0; erhielt, auf. Mit dem käuflichen HAVAB-Assay waren anti-HAV nur bei einem der Freiwilligen, der die Dosis mit 10&sup7; erhielt, nachweisbar. IgM gegen HAV wurde nicht bei einem der Freiwilligen, die die Vaccine oral erhielten, nachgewiesen. Seren von Freiwilligen, die I.M. 10&sup7; TCID60 erhielten, wiesen nachweisbare IgM gegen HAV auf.
Der Stuhl aus allen Freiwilligen, die die orale Vaccine erhielten, war in Bezug auf Hepatitis A- Virus negativ, während der von Freiwilligen, die die Vaccine intramuskulär erhalten hatten, gerade getestet wird.
Obwohl nur eine kleine Anzahl der Freiwilligen die Vaccine oral erhielten, schien sie auf diesem Weg nicht immunogen zu sein. Dies beruht wahrscheinlich auf der Über-Attenuierung des Virus, obwohl andere Ursachen wie eine Inaktivierung im Gastrointestinaltrakt oder ein zu geringes Inokulum in Betracht gezogen werden sollten. Die Vaccine war bei einer intramuskulären Verabreichung in Dosen von 10&sup6; und 10&sup7; TCID&sub5;&sub0; sicher und immunogen. Die Antikörperreaktion war spontan: anti-HAV wurde innerhalb von 3 Wochen einer Immunisierung gemessen, persistierte während des Überwachungszeitraums und verringerte sich nicht im Titer. Eine derartige Reaktion gegenüber einem einzigen Inokulum einer Präparation ohne Adjuvans ist bemerkenswert. Falls anti-HAV tatsächlich für einen langen Zeitraum nach einer Dosis persistiert, wäre die Logistik der Verabreichung dieses Produkts viel einfacher und erfolgreicher als bei gegenwärtigen Hepatitis A-Vaccinen. Das Auftreten von IgM gegen HAV bei Freiwilligen, die 10&sup7; TCID&sub5;&sub0; ohne Anzeichen von Hepatitis erhielten, legt eine asymptomatische Replikation des Virus nahe.

Beispiel 3: Herstellung chimärer Viren

Mehrere beispielhafte chimäre Viren wurden hergestellt, um die Wirkung von mehreren der in Tabelle I gezeigten Mutationen auf den Wirtsbereich und/oder die Attenuierung in Primaten zu bewerten Die Sequenz des MRC-5-adaptierten Virus 4380 wurde unter Einsatz der reversen Transkriptase : Polymerase-Kettenreaktion (RT : PCR) für die Amplifikation von Regionen des Virus als cDNA vor einer Sequenzierung (somit T anstelle von U in der nachstehenden Tabelle Vl) erhalten. Die Nummern 2-10 in Tabelle VI bezeichnen chimäre Viren, die durch Insertion von Mutationen, die in dem MRC-5-adaptierten Virus 4380 vorgefunden wurden, in den cDNA-Klon von pHAV/7, der für das attenuierte HM-175-Virus, Pass 35, von Cohen et al., J. Virol. 61: 3035-3039 (1987) [SEQ ID NO: 1 und 2] kodiert, hergestellt wurden.
Mutationen, die durch "Chimäre" eingebracht wurden, bedeutet, dass ein Teil des 4380- Virusgenoms durch RT : PCR amplifiziert, mit spezifischen Restriktionsenzymen verdaut und das Fragment für einen Austausch des homologen Fragments in dem cDNA-Klon pHAV/7 verwendet wurde. Durch Mutagenese eingebrachte Mutationen wurden durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese des cDNA-Klons pHAV/7 unter Einsatz des Mutageneseprotokolls von Amersham inseriert.
Die chimären cDNAs wurden in vitro in RNA transkribiert und die Nukleinsäuren (RNA und DNA) in FRhK-4-Zellen für die Herstellung chimärer Viren transfiziert. Eine Quantifizierung des Wachstums chimärer Viren erfolgte für die beispielhaften Chimären durch einen Slot- Blot-Assay.
Tabelle VI zeigi: die Ergebnisse der Herstellung und des Testens von 9 chimären Viren. Die folgenden Begriffe sind wie in Tabelle V1 verwendet definiert: Zellkultur betrifft Virus mit angegebenen Mutationen, die durch Wachstum in MRC-5-Zellen selektiert wurden. Mutagenese betrifft die Oligonukleotid-gerichetete Mutagenese von P-35- oder HM-175-cDNA-Klonen. Chimäres Virusgenom betrifft die Herstellung eines chimären Virusgenoms unter Einsatz von Teilen des P-35-cDNA-Kions und von durch PCR hergestellten Fragmenten des MRC-5-Zellen-adaptierten Virus 4380. NB bedeutet, dass diese Untersuchung bisher nicht erfolgte. Das +-Symbol betrifft Virus, das etwas Wachsturn in diesem Zelltyp aufwies. Das - Symbol betrifft Virus, das wenig oder kein Wachstum in diesem Zelltyp aufwies. Die zwei Zelltypen, die für einen Wachstumstest der chimären Viren eingesetzt wurden, sind die menschliche Lungenfibroblasten-ähnliche Zelllinie MRC-5 und die fötale Rhesusaffen-Nierenepithel-ähnliche Zelllinie FRhK-4. Zu bemerken ist, dass das Virus #1 in der Tabelle MRC-5-adaptiertes HAV 4380 betrifft. Die Viren #2-10 sind erfindungsgemäße chimäre Viren. TABELLE VI Unterschiede in der Nukleotidseauenz von MRC-5-adaptierten Hepatitis A-Virus: Vergleich mit P-35 HM-175-Virus
d = Base ist an dieser Position in P-35 im Vergleich zum Wildtyp deletiert TABELLE VI (Fortsetzung) Unterschiede in der Nukleotidsequenz von MRC-5-adaptierten Hepatitis A-Virus: Vergleich mit P-35 HM-175-Virus
d = Base ist an dieser Position in P-35 im Vergleich zum Wildtyp deletiert
Ein Einbringen von vier Mutationen, die in der 5-nicht-kodierenden Region vorgefunden wurden, an den Nukleotidpositionen 591, 646, 669 und 687 des P-35-Genoms, scheinen für den HAV-Wirtsbereich in Zellkultur wichtig zu sein. Sie ermöglichen etwas Wachstum des transfizierten Virus in MRC-5-Zellen, sind jedoch nicht vollständig für eine Anpassung an die MRC-5-Zellkultur verantwortlich Ein Einbringen von zwei Mutationen an den Nukleotiden 4418 und 4643 in der 2C-Region des MRC-5-adaptierten Virus mit den 5-Mutationen erlaubt ein vollständiges Wachstum in MRC-5-Zellen. Somit scheinen die vier Mutationen in der 5'- nicht-kodierenden Region und die zwei Mutationen in der 2C-Region des Genoms des MRC- 5-Zellen-adaptierten Virus synergistisch bei der Anpassung dieses Virus an ein wirksames Wachstum in MRC-5-Zellen zu wirken.

Beispiel 4: Vergleich einer Endpunkt-Verdünnung von chimären Viren in FRhK-4- gegenüber MRC-5-Zelien

Chimäre Viren mit der in Tabelle VI beschriebenen Zusammensetzung wurden seriell in 10- fach-Schritten verdünnt und eine gleiche Menge einer jeden Verdünnung auf FRhK-4- und MRC-5-Zellen ausplattiert. Nach 21-tägiger Inkubation bei 34,5ºC, um eine Virusvermehrung zu ermöglichen, wurden die Zellen durch Zugabe einer Pufferlösung mit Natriumdodecylsulfat lysiert. Die virale RNA wurde mit Phenol extrahiert und durch Slot-Blot-Hybridisierung unter Verwendung einer [³²P]-markierten Ribosonde, die für Hepatitis A-Virus spezifisch ist, quantifiziert. Ein Radioautogramm des Slot-Blots, das von den FRhK-4-Zellen und den MRC- 5-Zellen erhalten wurde, zeigt, dass die Endpunkt-Verdünnung des MRC-5-adaptierten Virus in beiden Zelllinien gleich war, was zeigt, dass dieses Virus in beiden Zelllinien wachsen kann. Im Gegensatz dazu wies das Virus P35 HM-175 eine Endpunkt-Verdünnung von 10&supmin;&sup5; auf FRhK-4-Zellen und < 10&supmin;¹ auf MRC-5-Zellen auf, was zeigt, dass dieses Virus sich nicht auf MRC-5-Zellen vermehren kann. Wie in Fig. 5 gezeigt, entsprach Virus #4 weitestgehend dem MRC-5-adaptierten Virus und die Viren #2, 3 und 5 waren Intermediate. Diese Ergebnisse zeigen, dass bestimmte Mutationen aus dem MRC-5-adaptierten Virus in den pHAV/7- cDNA-Klon eingebracht werden können, um neue Viren herzustellen, die auch die Fähigkeit erworben haben, sich in MRC-5-Zellen zu vermehren.
Unzählige Modifikationen und Veränderungen der vorliegenden Erfindung sind von der vorstehenden Beschreibung umfasst und sind erwartungsgemäß für den Fachmann offensichtlich. Solche Modifikationen und Veränderungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren sollen vom Umfang der beigefügten Ansprüche umfasst sein.

Sequenzprotokoll

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: SmithKline Beecham, Biologicals, s.a.
Government of USA, Dept.
Health & Human Services
Funkhouser, Ann W.
Emerson, Suzanne U.
Purcell, Robert H.
D'Hondt, Eric
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Mutanten von Hepatitis A-Virusstamm
HM-175 zur Verwendung als Hepatitis A-Virus-
Impfstoffe
(iii) A ZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Howson and Howson
(B) STRASSE: PO Box 457 Spring House Corporate Cenore
(C) STADT: Spring House
(D) STAAT: Pennsylvania
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 19477
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patent In Release #1.0, Version #1.25
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: PCT/U593/08610
(B) ANMELDETAG: 17. September 1993
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) DATEN DER VORANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: US 07/947,338
(B) ANMELDETAG: 18. September 1992
(viii) ANGABEN DES VERTRETERS:
(A) NAME: Bak, Mary E.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 31,215
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: SBCP50110
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: 215-540-9206
(B) TELEFAX: 215-540-5818
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
A) LÄNGE: 7493 Basenpaare
B) ART: Nukleinsäure
C) STRANGFORM: Doppelstrang
D) TOPOLOGTE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 735 ..7415 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2227 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: 5EQ ID NO: 2:

Claims

1. Mutante des Hepatitis A-Virusstamms HM-175 mit der DNA von SEQ ID NO: 1, wobei mindestens die Nukleotidpositionen 591 und 687 zu Guanin verändert sind, 646 zu Adenin verändert ist und 669 zu Thymin verändert ist.

2. Mutante gemäß Anspruch 1, wobei zusätzlich die Nukleotide an den Positionen 4418 und 4643 zu Thymin verändert sind.

3. Mutante gemäß Anspruch 1 und 2, wobei mindestens die Nukleotidpositionen 3934 und 5145 zu Guanin verändert sind, 5745 zu Thymin verändert ist und 6908 zu Cytosin verändert ist.

4. Mutante gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 mit den Identifizierungseigenschaften des Stamms HAV 4380, der bei CNCM unter der Zugangsnummer I-936 hinterlegt ist.

5. HAV 4380-Stamm gemäß Anspruch 4, der an ein Wachstum in der menschlichen Fibroblastenzelllinie MRC-5 durch Inkubation bei 32ºC bis 35ºC angepasst ist und der bei 37ºC in primären Nierenzellen der afrikanischen Grünen Meerkatze (AGMK-Zellen) wachsen kann.

6. Hepatitis A-Virus-Vaccine, die eine Mutante gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst.

7. Verfahren zur Herstellung einer Mutante des Hepatitis A-Virusstamms HM-175 mit der DNA von SEQ ID NO: 1, umfassend den Schritt der Modifzierung des Hepatitis A-Virusstamms, wobei mindestens die Nukleotidpositionen 591 und 687 in der DNA von SEQ ID NO: 1 zu Guanin verändert sind, 646 zu Adenin verändert ist und 669 zu Thymin verändert ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei zusätzlich die Nukleotide an den Positionen 4418 und 4643 zu Thymin verändert sind.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei mindestens die Nukleotidpositionen 3934 und 5145 zu Guanin verändert sind, 5745 zu Thymin verändert ist und 6908 zu Cytosin verändert ist.

10. Verwendung einer Mutante des HAV-Virus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Herstellung einer Vaccine zur Immunisierung eines Menschen oder eines Primaten gegen Hepatitis A.

11. Nukleinsäuremolekül, das für die Mutante gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert.