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BR112014001363B1 - Composições para indução de um linfócito t citotóxico (ctl), para indução de uma célula apresentadora de antígeno (apc) tendo capacidade de indução de ctl, composição farmacêutica, métodos in vitro para indução de apc e de ctl, usos de peptídeos e vetor - Google Patents

Composições para indução de um linfócito t citotóxico (ctl), para indução de uma célula apresentadora de antígeno (apc) tendo capacidade de indução de ctl, composição farmacêutica, métodos in vitro para indução de apc e de ctl, usos de peptídeos e vetor Download PDF

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BR112014001363B1
BR112014001363B1 BR112014001363-2A BR112014001363A BR112014001363B1 BR 112014001363 B1 BR112014001363 B1 BR 112014001363B1 BR 112014001363 A BR112014001363 A BR 112014001363A BR 112014001363 B1 BR112014001363 B1 BR 112014001363B1
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Takuya Tsunoda
Ryuji Osawa
Sachiko Yoshimura
Tomohisa Watanabe
Yusuke Nakamura
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Oncotherapy Science, Inc.
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Publication date
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Abstract

peptídeos mphosph1 com capacidade de indução de linfócito t citotóxico e polinucleotídeo , usos dos mesmos no tratamento de câncer, composições que os compreendem, métodos in vitro para indução de célula apresentadora de antígeno e de linfócito t citotóxico, bem como anticorpo e vetor. a presente invenção refere-se, em âmbito geral, a peptídeos de epitopo derivado de mphosph1 que se ligam a um antígeno hla e induzem linfócitos t citotóxicos (ctl), adequados para uso em imunoterapia de câncer, particularmente vacinas para câncer. particularmente, a presente invenção refere-se a peptídeo capacidade de indução de ctl, em que o peptídeo: compreende uma sequência de aminoácidos s elecionada do grupo consistindo em seq id nos: 120, 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97 e 103 ou compreende uma sequência de aminoácidos em que 1, 2 ou vários aminoácido (s) é/são substituído(s), deletado(s), inserido(s ) e/ou adicionado(s) na sequência de aminoácidos selecionada dos referidos grupos. refere-se ainda a polinucleotídeo, anticorpo, vetor, e a composições para indução de célula apresentadora de antígeno (apc) com capacidade de indução de ctl compreendendo os peptídeos e polinucleotídeos de acordo com a invenção, bem como composições farmacêuticas. ainda, são descrito s usos de peptídeo e polinucleotídeo que o codifica, de exossomas, apc e ctl na indução de uma resposta imune contra câncer, bem como métodos in vitro para indução de apc e ctl em respostas imunes.

Description

Campo da Técnica
[0001] A presente invenção refere-se ao campo de ciência biológi ca, mais especificamente ao campo de terapia de câncer. Em particular, a presente invenção refere-se a peptídeos que são eficazes como vacinas para câncer bem como fármacos ou para um ou ambos o tratamento e a prevenção de tumores.
Prioridade
[0002] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Pa tenteProvisório U.S. No. 61/522.991 depositado em 12 de agosto de 2011, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
Técnica Anterior
[0003] Linfócitos T citotóxicos (CTLs) (Cytotoxic T Lymphocytes) foram mostrados reconhecer peptídeos de epitopo derivados de antí- genos associados a tumor (TAAs) (Tumor-Associated Antigens) encontrados na molécula classe I do complexo principal de histocompati- bilidade (MHC) (Major Histocompatibility Complex), e então matam as células de tumor. Desde o encontro da família de antígeno de melanoma (MAGE) (Melanoma Antigen), muitos outros TAAs foram encontradosatravés de abordagens imunológicas (NPL 1, Boon, T., Int. J. Cancer. 8 de maio de 1993, 54(2): 177-80; NPL 2, Boon, T. & Van der Bruggen, P., J. Exp. Med. 1 de março de 1996, 183(3): 725-9). Alguns desses TAAs estão atualmente sob desenvolvimento clínico como alvosimunoterapêuticos.
[0004] TAAs favoráveis são indispensáveis para a proliferação e a sobrevivência de células de câncer. O uso de tais TAAs como alvos para imunoterapia pode minimizar o risco bem descrito de escape imune de células de câncer atribuível à deleção, mutação ou sub- regulagem de TAAs como uma consequência de seleção imune tera- peuticamente direcionada. Desta maneira, a identificação de novos TAAs capazes de indução de respostas imunes antitumor potentes e específicas garante desenvolvimento adicional e então a aplicação clínica de estratégias de vacinação com peptídeo para vários tipos de câncer está em andamento (NPL 3, Harris, C.C., J. Natl. Cancer Inst. 16 de outubro de 1996, 88(20): 1442-55; NPL 4, Butterfield, L.H. e outros, Cancer Res. 1 de julho de 1999, 59(13): 3134-42; NPL 5, Vissers, J.L. e outros, Cancer Res. 1 de novembro de 1999, 59(21): 5554-9; NPL 6, van der Burg, S.H. e outros, J. Immunol. 1 de maio de 1996, 156(9): 3308-14; NPL 7, Tanaka, F. e outros, Cancer Res, 15 de outubro de 1997, 57(20): 4465-8; NPL 8, Fujie, T. e outros, Int. J. Cancer 18 de janeiro de 1999, 80(2): 169-72; NPL 9, Kikuchi, M. e outros, Int. J. Cancer 5 de maio de 1999, 81(3): 459-66; NPL 10, Oi- so, M. e outros, Int. J Cancer 5 de maior de 1999, 81(3): 387-94). Até agora, vários testes clínicos usando esses peptídeos derivados de antígenos associados a tumor foram descritos. Infelizmente, muitos dos testes de vacina para câncer atuais têm mostrado apenas uma taxa de resposta objetiva baixa (NPL 11, Belli, F. e outros, J. Clin. Oncol. 15 de outubro de 2002, 20(20): 4169-80; NPL 12, Coulie, P.G. e outros, Immunol. Rev. outubro de 2002, 188: 33-42; NPL 13, Rosenberg, S.A. e outros, Nat. Med. Setembro de 2004, 10(9): 909-15). Desta maneira, permanece a necessidade na técnica de novos TAAs como alvos imunoterapêuticos.
[0005] MPHOSPH1 (Fosfoproteína 1 de Fase M (M-phase phos phoprotein 1); Nos. Acesso GenBank NM_016195 e NP_057279, SEQ ID NOs: 125 e 126) foi identificada como uma das proteínas especificamente fosforiladas na transição G2/M e caracterizada como uma proteína relacionada à cinesina direcionada à extremidade plus (NPL 14, Abaza e outros, J. Biol. Chem. 2003, 278: 27844-52). Mais particularmente, MPHOSPH1 foi relatada ser um motor molecular direcionado à extremidade plus que desempenha um papel crucial em citocinese, e se acumula na zona média do da construção de microtúbulos (spindle) durante a anafase para a telófase em células HeLa (NPL 14, Abaza A e outros, J. Biol. Chem. 2003, 278: 27844-52; NPL 15, Kamimoto, T. e outros, J. Biol. Chem. 2001, 276: 37520-8). Durante as análises de perfil de expressão de gene usando uma micromatriz de cDNA de largura de genoma contendo 23.040 genes, MPHOSPH1 foi identificado como uma nova molécula suprarregulada em câncer de bexiga (NPL 16, Kanehira M. e outros, Cancer Res. 1 de abril de 2007;67(7):3276- 85.; PTL 1, WO2006/085684). Ainda, através de análise Northern blot, expressão dos produtos de gene de MPHOSPH1 foi verificada ser limitada aos testículos e ausente dos órgãos vitais normais.
[0006] Alguns fragmentos de peptídeo derivados de MPHOSPH1 tendo capacidade de indução de linfócito T citotóxico (CTL) foram an-teriormente identificados (PTL 2, WO 2008/047473). Esses fragmentos de peptídeo demonstraram a habilidade em induzir CTLs contra células estimuladas com os fragmentos de peptídeo cognato. No entanto, estudos anteriores falharam em confirmar se os fragmentos de peptí- deo tinham a habilidade em induzir CTLs se direcionando a células de tumor expressando o gene MPHOSPH1 e antígeno HLA-A2. Lista de Citação Literatura de Patente [PTL 1] WO2006/085684 [PTL 2] WO2008/047473 Literatura de Não patente [NPL 1] Boon, T. , Int. J. Cancer. 8 de maio de 1993 8, 54(2): 177-80 [NPL 2] Boon, T. & van der Bruggen, P., J. Exp. Med. 1 de março de 1996, 183(3): 725-9 [NPL 3] Harris, C.C., J. Natl. Cancer. Inst. 16 de outubro de 1996, 88(20): 1442-55 [NPL 4] Butterfield, L.H. e outros, Cancer Res. 1 de julho de 999, 59(13): 3134-42 [NPL 5] Vissers, J.L. e outros, Cancer Res. 1 de novembro de 1999, 59(21): 5554-9 [NPL 6] van der Burg, S.H. e outros, J. Immunol. 1 de maio de 1996, 156(9): 3308-14 [NPL 7] Tanaka, F. e outros, Cancer. Res. 15 de outubro de 1997, 57(20): 4465-8 [NPL 8] Fujie, T. e outros, Int. J. Cancer. 18 de janeiro de 1999, 80(2): 169-72 [NPL 9] Kikuchi, M. e outros, Int. J. Cancer, 5 de maio do e 1999, 81(3): 459-66 [NPL 10] Oiso, M. e outros, Int. J. Cancer, 5 de maio de 1999, 81(3): 387-94 [NPL 11] Belli, F. e outros, J. Clin. Oncol., 15 de outubro de 2002, 20(20): 4169-80 [NPL 12] Coulie, P.G. e outros, Immunol. Rev. Outubro de 2002, 188: 33-42 [NPL 13] Rosenberg, S.A. e outros, Nat. Med. Setembro de 2004, 10(9): 909-15 [NPL 14] Abaza, A. e outros, J. Biol. Chem. 2003, 278: 27844-52. [NPL 15] Kamimoto, T. e outros, J. Biol. Chem. 2001, 276: 37520-8 [NPL 16] Kanehira, M. e outros, Cancer Res. 1 de abril de 2007; 67(7):3276-85.
Sumário da Invenção
[0007] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, no encontro de novos peptídeos que podem servir como alvos adequados de imunoterapia. Devido ao fato dos TAAs serem geralmente percebidos pelo sistema imune como "próprios"e então frequentemente não têm nenhuma imunogenicidade, o encontro de alvos apropriados é de extrema importância. Conforme acima mencionado, MPHOSPH1 (por exemplo, SEQ ID NO: 126 codificada pelo gene do No. de Acesso GenBank NM_016195 (SEQ ID NO: 125)) foi identificado como suprar- regulado em cânceres, cujos exemplos incluem, mas não estão limitados a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma colangiocelular, leucemia mieloide crônica (CML) (Chronic Myeloid Leukemia), câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC) (Non-small Cell Lung Cancer), linfoma, osteossarcoma, câncer de próstata, câncer renal e tumor de tecido mole. Desta maneira, a presente invenção foca em MPHOSPH1 como um alvo candidato de imunoterapia para câncer/tumor, mais particularmentepeptídeos de epitopo de MPHOSPH1 que podem servir como alvos imunoterapêuticos adequados.
[0008] Para esta finalidade, a presente invenção refere-se, pelo menos em parte, à identificação de peptídeos de epitopo específicos que possuem a habilidade em induzir CTLs específicos para MPHOSPH1 dentre os peptídeos derivados de MPHOSPH1. Conforme discutido em mais detalhes abaixo, células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) (Peripheral Blood Mononuclear Cells) obtidas de um doador saudável foram estimuladas usando peptídeos candidatos à ligação a HLA-A*0201 derivados de MPHOSPH1. Linhagens de CTL foram então estabelecidas com citotoxidez específica contra as célu- las-alvo positivas para HLA-A2 pulsadas com cada um dos peptídeos candidatos. Os presentes resultados demonstram que esses peptídeos são peptídeos de epitopo restritos a HLA-A2 que podem induzir respostas imunes potentes e específicas contra células expressando MPHOSPH1. Esses resultados indicam ainda que MPHOSPH1 é fortementeimunogênica e os seus epitopos são alvos eficazes para imu- noterapia de câncer/tumor.
[0009] Desta maneira, é um objetivo da presente invenção prover peptídeos isolados que se liguem ao antígeno HLA e induzam CTLs, em que os peptídeos incluem um fragmento imunologicamente ativo de MPHOSPH1 (SEQ ID NO: 126). Tais peptídeos podem ser usados para induzir CTLs in vitro ou ex vivo ou ser administrados diretamente a um indivíduo de maneira a induzir respostas imunes in vivo contra cânceres, cujos quais incluem, mas não estão limitados a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, câncer colorretal, câncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteossar- coma, câncer de próstata, câncer renal e tumor de tecido mole.
[00010] Os peptídeos da presente invenção são geralmente de menos de 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 aminoácidos de comprimento. Peptí- deos preferidos da presente invenção são nonapeptídeos ou decapep- tídeos. Peptídeos particularmente preferidos têm uma sequência de aminoácido selecionada dentre SEQ ID Nos: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120, uma vez que esses peptídeos demonstraram se ligar a an- tígeno HLA-A2 e induzir CTL.
[00011] Desta maneira, em algumas modalidades, os peptídeos da presente invenção são peptídeos de menos de 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 aminoácidos de comprimento que têm uma sequência de aminoá- cido selecionada dentre as SEQ ID Nos: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120. Em modalidades típicas, os peptídeos da presente invenção são nonapeptídeos ou decapeptídeos tendo uma sequência de amino- ácido selecionada dentre as SEQ ID NOs: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120. Ainda, conforme demonstrado aqui, um peptídeo tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120 foi confirmado induzir CTLs se direcionando a células de tumor expressando a MPHOSPH1 e antígeno HLA-A2. Desta maneira, em modalidades preferidas, os peptídeos da presente invenção são peptídeos tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120.
[00012] Quando contatados com células apresentando antígeno (APCs) in vitro, ex vivo ou in vivo, os peptídeos da presente invenção se ligarão a antígenos HLA-A2 sobre APCs e estarão presentes sobre APCs como complexos com antígenos HLA-A2. Alternativamente, os peptídeos da presente invenção podem ser capturados por APCs, processados em fragmentos compostos de uma sequência de aminoácido selecionada dentre as SEQ ID Nos: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120 em APCs e apresentados sobre APCs como complexos com antí- genos HLA-A2. Consequentemente, CTLs específicos para tais peptí- deos são induzidos e tais CTLs são considerados elementos da presente invenção.
[00013] A presente invenção também compreende peptídeos modificados tendo uma sequência de aminoácido em que um, dois ou váriosaminoácidos são substituídos, deletados, inseridos e/ou adicionados na sequência de aminoácido selecionada dentre as SEQ ID Nos: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120, contanto que os peptídeos modificados retenham a capacidade de indução de CTL equivalente àquela do peptídeo não modificado original. Para esta finalidade, a presente invenção provê um peptídeo isolado de menos de 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 aminoácidos de comprimento, o qual tem capacidade de indução de CTL e compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em: (i) uma sequência de aminoácido que 1, 2 ou vários amino- ácidos são substituídos na sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nos: 5, 14 e 64, e (ii) a sequência de aminoácido de (i), em que a sequência de aminoácido tem uma ou ambas das características que seguem: (a) o segundo aminoácido do terminal N da dita SEQ ID NO. é selecionado do grupo consistindo em leucina e metionina; e (b) o aminoácido C-terminal da dita SEQ ID NO. é selecionado do grupo consistindo em valina e leucina.
[00014] Além disso, a presente invenção também provê um peptí- deo isolado de menos de 15, 14, 13, 12 ou 11 aminoácidos de comprimento, o qual tem capacidade de indução de CTL e compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em: (i’) uma sequência de aminoácido em que 1, 2 ou vários aminoácidos são substituídos na sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nos: 73, 77, 79, 97, 103 e 120, e (ii’) a sequência de aminoácido de (i’), em que a sequência de aminoácido tem uma ou ambas as características que seguem: (a) o segundo aminoácido do terminal N da dita SEQ ID NO. é selecionado do grupo consistindo em leucina e metionina; e (b) o aminoácido C-terminal da dita SEQ ID NO. é selecionado do grupo consistindo em valina e leucina.
[00015] Conforme aqui demonstrado, tais peptídeos podem se ligar a antígenos HLA-A2 em APCs e ser apresentados sobre APCs como complexos com antígenos HLA-A2. Alternativamente, tais peptídeos podem ser capturados em APCs, processados em fragmentos compostos de uma sequência de aminoácido selecionada dentre (i), (ii), (i’) e (ii’) em APCs e apresentados sobre APCs como complexos com an- tígenos HLA-A2, quando esses peptídeos são contatados com APCs. Consequentemente, CTLs específicos para tais peptídeos são induzidos e tais CTLs são considerados elementos da presente invenção.
[00016] A presente invenção compreende ainda polinucleotídeos isolados que codificam qualquer um dos peptídeos da presente invenção. Esses polinucleotídeos podem ser usados para induzir ou preparar APCs tendo capacidade de indução de CTL. Da mesma maneira que os peptídeos da presente invenção descritos acima, tais APCs podem ser administradas a um indivíduo para indução de respostas imunes contra cânceres.
[00017] Quando administrados a um indivíduo, os peptídeos da presente invenção são apresentados sobre a superfície de APCs de maneira a induzir CTLs se direcionando aos respectivos peptídeos. Desta maneira, um objetivo da presente invenção é prover agentes ou composições que incluem um ou mais peptídeos ou polinucleotídeos providos pela presente invenção para indução de um ou ambos APCs e CTLs. Tais agentes ou composições podem ser também usados para um ou mais propósitos selecionados dentre o tratamento de câncer, a profilaxia de câncer e a prevenção de recorrência pós-operatória de câncer. Exemplos de cânceres alvo incluem, mas não estão limitados a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma co- langiocelular, CML, câncer colorretal, câncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteossarcoma, câncer de próstata, câncer renal e tumor de tecido mole.
[00018] Desta maneira é outro objetivo da presente invenção prover agentes ou composições farmacêuticos para ou um ou ambos o tratamento de câncer e a profilaxia de câncer, tais como agentes ou composições farmacêuticos formulados para incluir um ou mais peptídeos ou polinucleotídeos da presente invenção. Ao invés de ou em adição aos peptídeos ou polinucleotídeos da presente invenção, os agentes ou composições farmacêuticos da presente invenção podem incluir como ingredientes ativos APCs ou exossomas que apresentam qualquer um dos peptídeos da presente invenção.
[00019] Os peptídeos ou polinucleotídeos da presente invenção podem ser usados para induzir APCs que apresentam na sua superfície um complexo de um antígeno HLA e um peptídeo presente, por exemplo,através de contato de APCs com o peptídeo da presente invenção ou introdução de um polinucleotídeo codificando um peptídeo da presente invenção em APCs. Tais APCs têm a habilidade em induzir CTLs que reconhecem especificamente células que apresentam peptí- deos alvo em sua superfície e encontram uso em imunoterapia de câncer. Desta maneira, a presente invenção compreende os métodos para indução de APCs tendo capacidade de indução de CTL bem como APCs obtidas através de tais métodos.
[00020] Ainda, a presente invenção também compreende os agentes ou as composições para uso na indução de APCs, tais agentes ou composições incluindo quaisquer peptídeos ou polinucleotídeos da presente invenção.
[00021] É um objetivo adicional da presente invenção prover um método para indução de CTLs, tal método incluindo a etapa de cocul- tura de células T positivas para CDE8 com APCs ou exossomas apresentando o peptídeo da presente invenção em sua superfície ou a etapa de introdução de um polinucleotídeo codificando ambas as subuni- dades de receptor de célula T (TCR) (T Cell Receptor) ou polinucleotí- deos codificando cada uma das subunidades de TCR, em que o TCR pode se ligar a um complexo do peptídeo da presente invenção e antí- geno HLA apresentado sobre a superfície celular. CTLs obtidos através de tais métodos podem encontrar uso em um ou ambos o tratamento de câncer e a prevenção de câncer. Exemplos de cânceres in-cluem, mas não estão limitados a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, câncer colorretal, câncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteossarcoma, câncer de próstata, câncer renal e tumor de tecido mole.
[00022] Ainda outro objetivo da presente invenção é prover APCs isoladas que apresentam em sua superfície um complexo de um antí- geno HLA e um peptídeo da presente invenção. A presente invenção provê ainda CTLs isolados que se direcionam a peptídeos da presente invenção. Essas APCs e esses CTLs encontram utilidade no contexto de imunoterapia de câncer. É ainda outro objetivo da presente invenção prover métodos para indução de uma resposta imune contra um câncer em um indivíduo com necessidade do mesmo, tais métodos incluindo a etapa de administração de um agente ou composição que inclui pelo menos um componente selecionado dentre os peptídeos da presente invenção, polinucleotídeos codificando tais peptídeos, exos- somas ou APCs apresentando tais peptídeos e CTLs que reconhecem células apresentando tais peptídeos em sua superfície.
[00023] A aplicabilidade da presente invenção se estende a qualquer uma de várias doenças relacionadas a ou tendo origem na supe- rexpressão de MPHOSPH1, tal como câncer, cujos exemplos incluem, mas não estão limitados a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, câncer colorretal, câncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteossarcoma, câncer de próstata, câncer renal e tumor de tecido mole.
[00024] Mais especificamente, a presente invenção provê o que segue: [1] Um peptídeo isolado de (a) ou (b) abaixo: (a) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120; (b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido em que 1, 2 ou vários aminoácidos são substituídos, dele- tados, inseridos e/ou adicionados na sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120 e em que o peptídeo tem capacidade de indução de linfócito T citotóxico (CTL), [2] O peptídeo isolado de [1], em que o peptídeo tem uma ou ambas as características que seguem: (a) o segundo aminoácido do terminal N da sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120 é selecionado do grupo consistindo em leucina e metionina; e (b) o aminoácido C-terminal da sequência de aminoáci- do selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120 é selecionado do grupo consistindo em valina e leucina, [3] O peptídeo isolado de [1] ou [2], em que o peptídeo é um nonapeptídeo ou decapeptídeo, [4] Um polinucleotídeo isolado codificando o peptídeo de qualquer um de [1] a [3], [5] Uma composição para indução de um CTL, em que a composição compreende um ou mais peptídeos de qualquer um de [1] a [3] ou um ou mais polinucleotídeos de [4], [6] Uma composição para indução de uma APC tendo capacidade de indução de CTL, em que a composição compreende um ou mais peptídeos de qualquer um de [1] a [3] ou um ou mais polinu- cleotídeos de [4], [7] Composição farmacêutica compreendendo pelo menos um ingrediente ativo selecionado do grupo consistindo em: (a) um ou mais peptídeos de qualquer um d e [1] a [3]; (b) um ou mais polinucleotídeos codificando o peptídeo de qualquer um de [1] a [3]; (c) uma ou mais PACs ou exossomas que apresentam um complexo do peptídeo de qualquer um de [1] a [3] e um antígeno HLA sobre sua superfície; e (d) um ou mais CTLs que reconhecem uma célula apre-sentando um complexo do peptídeo de qualquer um de [1] a [3] e um antígeno HLA sobre sua superfície, [8] A composição farmacêutica de [7] para uso em um ou ambos o tratamento e a profilaxia de câncer ou indução de uma resposta imune contra câncer em um indivíduo, [9] A composição farmacêutica de [7] ou [8], em que a composição farmacêutica é formulada para administração a um indivíduo cujo antígeno HLA é HLA-A2, [10] Um método para indução de célula apresentando antí- geno (APC) tendo capacidade de indução de CTL, o dito método compreendendo uma etapa selecionada do grupo consistindo em: (a) contato de uma APC com o peptídeo de qualquer um de [1] a [3] in vivo, ex vivo ou in vivo, e (b) introdução de um polinucleotídeo codificando o pep- tídeo de qualquer um de [1] a [3] em uma APC, [11] Um método para introdução de um CTL, o dito método compreendendo uma etapa selecionada do grupo consistindo em: (a) cocultura de uma célula T positiva para CD8 com uma APC que apresenta em sua superfície um complexo de um antí- geno HLA e o peptídeo de qualquer um de [1] a [3]; (b) cocultura de uma célula T positiva para CD8 com um exossoma aque apresenta em sua superfície um complexo de um an- tígeno HLA e o peptídeo de qualquer um de [1] a [3]; e (c) introdução de um polinucleotídeo codificando ambas as subunidades de receptor de célula T (TCR) ou polinucleotídeos codificando cada uma das subunidades de TCR em uma célula T positiva para CD8, em que o TCR pode se ligar a um complexo de um antíge- no HLA e o peptídeo de qualquer um de [1] a [3] apresentado sobre superfície de uma célula, [12] Uma APC isolada que apresenta em sua superfície um complexo de um antígeno HLA e um peptídeo de qualquer um de [1] a [3]; [13] A APC de [12], a qual é induzida pelo método de [10], [14] Um CTL isolado que reconhece uma célula apresentando em sua superfície um complexo de um antígeno HLA e o peptí- deo de qualquer um de [1] a [3]; [15] O CTL de [14], em que o dito CTL é induzido pelo método de [11], [16] Um método de um ou ambos o tratamento e a profilaxia de câncer de um indivíduo, em que o método compreende a etapa de administração a um indivíduo de (a) quantidade(s) farmaceuticamente aceitável(eis) de: (a) um ou mais peptídeos de qualquer um de [1] a [3]; (b) um ou mais polinucleotídeos codificando o peptídeo de qualquer um de [1] a [3]; (c) um ou mais APCs ou exossomas que apresentam um complexo do peptídeo de qualquer um de [1] a [3] e um antígeno HLA em sua superfície; ou (d) um ou mais CTLs que reconhecem uma célula apre-sentando um complexo do peptídeo de qualquer um de [1] a [3] e um antígeno HLA em sua superfície, [17] Um método de indução de uma resposta imune contra câncer em um indivíduo com necessidade do mesmo, o dito método compreendendo a etapa de administrar ao dito indivíduo uma composição compreendendo um peptídeo de qualquer um de [1] a [3] ou um polinucleotídeo codificando o peptídeo, [18] Um anticorpo ou fragmento imunologicamente ativo do mesmo contra o peptídeo qualquer um de [1] a [3]; [19] Um vetor compreendendo uma sequência de nucleotí- deo codificando o peptídeo de qualquer um de [1] a [3], [20] Uma célula hospedeira transformada ou transfectadas com o vetor de [19], e [21] Um estojo de diagnóstico compreendendo o peptídeo de qualquer um de [1] a [3], o polinucleotídeo de [4] ou o anticorpo de [18].
[00025] Objetivos e características da invenção se tornarão mais totalmente aparentes quando a descrição detalhada que segue for lida em conjunto com as figuras e exemplos acompanhantes. Deve ser compreendido que ambos o sumário da presente invenção acima e a descrição detalhada que segue são de modalidades exemplificadas, e não restritivos da presente invenção e outras modalidades alternativas da presente invenção. Em particular, embora a invenção seja descrita aqui com referência a várias modalidades específicas, será compreendido que a descrição é ilustrativa da invenção e não considerada limitante da invenção. Várias modificações e aplicações podem ocorrer àqueles versados na técnica, sem se afastar do espírito e escopo da invenção, conforme descrito pelas reivindicações apensas. Da mesma maneira, outros objetivos, características, benefícios e vantagens da presente invenção serão aparentes a partir do presente sumário e certas modalidades descritas abaixo, e serão prontamente aparentes àqueles versados na técnica. Tais objetivos, características, benefícios e vantagens serão aparentes a partir do acima em conjunto com os exemplos acompanhantes, dados, figuras e todas as inferências aceitáveis obtidas deles, sozinhos ou considerando as referências incorporadas aqui.
Breve Descrição dos Desenhos
[00026] Vários aspectos e aplicações da presente invenção se tornarão aparentes ao versado na técnica quando da consideração da breve descrição das figuras e da descrição detalhada da presente invenção e suas modalidades preferidas que seguem.
[00027] A Figura 1 é composta de uma série de fotografias, (a) a (j), mostrando os resultados de ensaios ELISPOT IFN-gama em CTLs que foram induzidos com peptídeos derivados de MPHOSPH1. Os CTLs na cavidade No. 7 estimulados com MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO:5) (a), na No. 5 estimulados com MPHOSPH1-A02-9-129 (SEQ ID NO:14) (b) na No. 5 estimulados com MPHOSPH1-A02-9-846 (SEQ ID NO:64) (c), na No. 2 estimulados com MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO:73) (d), na No. 1 estimulados com MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO:77) (e), na No. 1 estimulados com MPHOSPH1-A02-10- 407 (SEQ ID NO:79) (f), na No. 4 estimulados com MPHOSPH1-A02- 10-923 (SEQ ID NO:97) (g), na No. 5 estimulados com MPHOSPH1- A02-10-1484 (SEQ ID NO:103) (h) e na No. 8 estimulados com MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO:120) (i) mostraram produção de IFN-gama potente comparado com o controle, respectivamente. O quadrado na cavidade dessas figuras indica que as células de cavidade correspondente foram expandidas para estabelecer linhagens de CTL. Em contraste, como o caso típico de dados negativos, produção de IFN-gama específico a partir de CTL estimulado com MPHOSPH1- A02-9-575 (SEQ ID NO:1) (j) não foi mostrada. Nas figuras, "+" indica a produção de IFN-gama contra células-alvo pulsadas com o peptídeo apropriado, e "-" indica a produção de IFN-gama contra células-alvo não pulsadas com quaisquer peptídeos.
[00028] A Figura 2a-f é composta de uma série de gráficos de linha, (a) a (f), mostrando os resultados de um ensaio ELISA de IFN-gama demonstrando a produção de IFN-gama das linhagens de CTL estimuladas com MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO:5) (a), MPHOSPH1- A02-9-129 (SEQ ID NO:14) (b), MPHOSPH1-A02-9-846 (SEQ ID NO:64) (c), MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73) (d), MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO:77) (e) e MPHOSPH1-A02-10- 407 (SEQ ID NO: 79) (f). A quantidade de IFN-gama que as linhagens de CTL produzem foi medida através de ensaio imunoabsorvente ligadoà enzima de IFN-gama (ELISA). Os resultados demonstram que as linhagens de CTL estabelecidas através da estimulação com cada peptídeo mostraram produção de IFN-gama potente comparado com o controle. Nas figuras, "+" indica a produção de IFN-gama contra células-alvo pulsadas com o peptídeo apropriado e "-" indica a produção de IFN-gama contra células-alvo não pulsadas com quaisquer peptí- deos. A razão RI S indica a razão do número de células respondedo- ras (linhagem CTL) e células estimuladoras.
[00029] A Figura 2g-i é composta de uma série de gráficos de linha, (g) a (i), mostrando os resultados de um ensaio ELISA de IFN-gama demonstrando a produção de IFN-gama de linhagens de CTL estimuladas com MPHOSPH1-A02-10-923 (SEQ ID NO: 97) (g), MPHOSPH1-A02-10-1484 (SEQ ID NO: 103) (h) e MPHOSPH1-A02- 10-282 (SEQ ID NO: 120) (i). A quantidade de IFN-gama que as linhagens de CTL produzem foi medida através de ensaio imunoabsorvente ligado à enzima de IFN-gama (ELISA). Os resultados demonstram que as linhagens de CLT estabelecidas através de estimulação com cada peptídeo mostram produção de IFN-gama potente comparado com o controle. Nas figuras "+" indica a produção de IFN-gama contra células-alvo pulsadas com o peptídeo apropriado e "-" indica a produção de IFN-gama contra células-alvo não pulsadas com quaisquer peptí- deos. A razão RI S indicam a razão do número de células respondedo- ras (linhagem de CTL) e células estimuladoras.
[00030] A Figura 3 é composta de uma série de gráficos em linha, (a) a (e), mostrando a produção de IFN-gama dos clones de CTL estabelecidos pela diluição limitante das linhagens de CTL estimuladas com MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5) (a), MPHOSPH1-A02-9- 846 (SEQ ID NO:64) (b), MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73) (c), MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77) (d) e MPHOSPH1-A02- 10-282 (SEQ ID NO: 120) (e). Os resultados demonstram que os clones de CTL estabelecidos através de estimulação com cada peptídeo mostram produção de IFN-gama potente comparado com o controle. Na figura, "+" indica a produção de IFN-gama contra células-alvo pulsadas com o peptídeo apropriado e "-" indica a produção de IFN-gama contra células-alvo não pulsadas com quaisquer peptídeos. A razão R / S indica a razão do número de células respondedoras (clone de CTL) e células estimuladoras.
[00031] A Figura 4 é um gráfico em linha mostrando a atividade de CTL específica contra as linhagens de célula de tumor. Células J82 que expressam ambos a MPHOSPH1 e o HLA-A*0201, células HT1376 que expressam MPHOSPH1, mas não HLA-A*0201 e células T2 que expressam HLA-A*0201, mas não MPHOSPH1, foram usadas como células estimuladoras. O clone de CTL estabelecido com MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) mostrou atividade de CTL específica contra células J82. Por outro lado, nenhuma atividade de CTL específica significante foi detectada contra células HT1376 e T2. A razão R/ S indica a razão do número das células respondedoras (clone de CTL) e células estimuladoras.
[00032] A Figura 5 é um gráfico de linha mostrando atividade cito- tóxica de CTL contra as linhagens de célula de tumor. Células UMUC-3 que expressam ambos o MPHOSPH1 e a HLA-A*0201, células MKN45 que expressam MPHOSPH1, mas não HLA-A*0201 e T2 que expressam HLA-A*0201, mas não MPHOSPH1 foram usadas como células-alvo. O clone de CTL estabelecido com MPHOSPH1- A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) mostrou atividade citotóxica potente contra células UMUC-3. Por outro lado, nenhuma atividade de CTL específica significante foi detectada contra células MNK45 e T2. A razão E /T indica a razão do número de células efetoras (clone de CTL) e as células-alvo.
[00033] A Figura 6 é um gráfico de linha mostrando atividade citotó- xica de CTL contra as células-alvo que expressam MPHOSPH1 e HLA-A*0206. Células COS7 transfectadas com HLA-A*0206 ou o gene MPHOSPH1 de comprimento integral foram preparadas como os controle. A linhagem de CTL estabelecida com MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) mostrou atividade de CTL específica contra células COS7 transfectadas com ambos a MPHOSPH1 e a HLA-A*-0206 (losango preto). Por outro lado, nenhuma atividade de CTL específica significante foi detectada contra células-alvo expressando ou HLA- A*0206 (triângulo) ou MPHOSPH1 (círculo).
Descrição de Modalidades
[00034] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste de modalidades da presente invenção, os métodos, dispositivos e materiais preferidos são descritos agora. No entanto, antes dos presentes materiais e métodos serem descritos, deve ser compreendido que essasdescrições são apenas meramente ilustrativas e não pretendem ser limitantes. Deve ser também compreendido que a presente invenção não é limitada aos tamanhos, formatos, dimensões, materiais, metodologias, protocolos, etc., particulares descritos aqui, uma vez que esses podem variar de acordo com experimentação e / ou otimização de rotina. Ainda, a terminologia usada no relatório é para o propósito de descrição das versões ou modalidades particulares apenas e não pretende limitar o escopo da presente invenção, que será limitado apenas pelas reivindicações apensas.
[00035] A descrição de cada publicação, patente ou pedido de patente mencionado no presente relatório é especificamente aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. No entanto, nada aqui deve ser considerado como uma admissão que a invenção não é intitulada antedatar tal revelação em virtude de invenção anterior.
[00036] A menos que de outra maneira definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que geralmente compreendido por um versado comum na técnica à qual a presente invenção pertence. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindodefinições, vai prevalecer.
[00037] Ainda, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não pretendem ser limitantes.
I. Definições:
[00038] As palavras "um", "uma" e "o", "a" conforme aqui usado significam "pelo menos um" a menos que de outro modo especificamente indicado.
[00039] Os termos "isolado" e "purificado" usados em relação com uma substância (por exemplo, peptídeo, anticorpo, polinucleotídeo, etc) indicam que a substância é substancialmente livre de pelo menos uma substância que possa estar incluída na fonte natural. Desta maneira, um peptídeo isolado ou purificado se refere a peptídeos que são substancialmente livres de material celular tais como carboidrato, lipídeo ou outras proteínas contaminantes da fonte de célula ou tecido do qual o peptídeo é derivado ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros agentes químicos quando quimicamente sintetizados. O termo "substancialmente livre de material celular" inclui preparações de um peptídeo em que o peptídeo é separado de componentes celulares das células das quais ele é isolado ou recombinantemen- te produzido. Desta maneira, um peptídeo que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de polipeptídeo tendo menos do que cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (em peso seco) de proteína heteróloga (também referida aqui como uma "proteína contaminante"). Quando o peptídeo é recombinantemente produzido, ele é também preferivelmente substancialmente livre de meio de cultura, que inclui preparações de peptídeo com meio de cultura de menos do que 20%, 10% ou 5% do volume da preparação de peptídeo. Quando o peptídeo é produzido através de síntese química, ele é preferivelmente substancialmente livre de precursores químicos ou outros agentes químicos, que inclui preparações de peptídeo com precursores químicos ou outros agentes químicos envolvidos na síntese do peptídeo menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% (em peso seco) do volume da preparação de peptídeo. Que uma preparação de peptídeo particular contém um peptídeo isolado ou purificado pode ser mostrado, por exemplo, pelo aparecimento de uma faixa única seguindo eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS) da preparação de proteína e tingimento com Coomassie Brilliant Blue ou similar do gel. Em uma modalidade preferida, os peptídeos e polinucleotídeos da presente invenção são isolados ou purificados.
[00040] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo"e "proteína" são usados aqui intercomutavelmente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduo(s) de aminoácido pode(m) ser resíduo(s) modificado(s), ou resíduo(s) de ocorrência não natural, tal como mimé- tico(s) químico(s) artificial(ais) de aminoácido(s) de ocorrência natural correspondente(s), bem como a polímeros de aminoácido de ocorrência natural. O termo "oligopeptídeo"algumas vezes usado no presente relatório é usado para se referir a peptídeos da presente invenção que são de 20 resíduos ou menos, tipicamente 15 resíduos ou menos, de comprimento e são tipicamente compostos dentre cerca de 8 e cerca de 11 resíduos, frequentemente 9 ou 10 resíduos.
[00041] Os últimos são aqui referidos como "nonapeptídeos"e "de- capeptídeos", respectivamente.
[00042] O termo "aminoácido"conforme aqui usado se refere a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, bem como a análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funcionam similarmen- te aos aminoácidos de ocorrência natural. O aminoácido pode ser ou L-aminoácidos ou D-aminoácidos. Aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles modificadosapós tradução em células (por exemplo, hidroxiprolina, ga- ma-carboxiglutamato e O-fosfoserina). A expressão "análogo de ami- noácido"refere-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica (um alfa carbono ligado a um hidrogênio, um grupo carbóxi, um grupo amino e um grupo R) que um aminoácido de ocorrência natural, mas têm um ou mais grupos R modificados ou estruturas principais modificadas (por exemplo, homoserina, norleucina, metionina, sulfóxi- do, metionina metil sulfônio). A expressão "mimético de aminoácido"se refere a compostos químicos que têm estruturas diferentes, mas funções similares a aminoácidos gerais.
[00043] Os aminoácidos podem ser referidos aqui pelos seus símbolos de três letras geralmente conhecidos ou os símbolos de uma letra recomendados pela IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission.
[00044] Os termos "gene", "polinucleotídeo"e "ácido nucleico"são usados intercomutavelmente aqui e, a menos que de outra maneira especificamente indicado, são similares aos aminoácidos referidos através de seus códigos de letra única geralmente aceitos.
[00045] Os termos "agente" e "composição" são usados aqui inter- comutavelmente para se referir a um produto que inclui os ingredientes especificados nas quantidades especificadas, bem como qualquer produto que resulte, diretamente ou indiretamente, da combinação dos ingredientes especificados nas quantidades especificadas. Tais termos, quando usados em relação ao modificador "farmacêutico"(como em "agente farmacêutico"e "composição farmacêutica") pretendem compreendendo um produto que inclui o(s) ingrediente(s) ativo(s) e qualquer ingrediente(s) inerte(s) que forme o carreador, bem como qualquer produto que resulte, diretamente ou indiretamente, de combi- nação, complexação ou agregação de quaisquer dois ou mais dos in-gredientes, ou de dissociação de um ou mais dos ingredientes, ou de outros tipos de reações ou interações de um ou mais dos ingredientes. Desta maneira, no contexto da presente invenção, os termos "agente farmacêutico"e "composição farmacêutica"se referem a qualquer produto feito através da mistura de uma molécula ou composto da presente invenção e um carreador farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável.
[00046] A expressão "carreador farmaceuticamente aceitável " ou "carreador fisiologicamente aceitável", conforme aqui usado, significa um material, composição, substância ou veículo farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável incluindo, mas não limitado a, uma carga líquida ou sólida, diluente, excipiente, solvente ou material de encap- sulação. Os agentes ou composições farmacêuticos da presente invenção encontram uso particular como vacinas. No contexto da presente invenção, a expressão "vacina"(também referida como uma "composição imunogênica") se refere a um agente ou composição que tem a função de induzir imunidade antitumor quando da inoculação em animais.
[00047] O termo "ingrediente ativo" aqui se refere a uma substância em um agente ou composição que é biologicamente ou fisiologicamen- te ativa. Particularmente, no contexto de agente ou composição farmacêutica, o termo "ingrediente ativo" se refere a uma substância que mostra um efeito farmacológico objetivo. Por exemplo, no caso de agentes ou composições farmacêuticas para uso no tratamento ou prevenção de câncer, ingredientes ativos nos agentes ou composições podem levar a pelo menos uma ação biológica ou fisiológica sobre células e/ou tecidos de câncer diretamente ou indiretamente. Preferivelmente, tal ação pode incluir redução ou inibição de crescimento de célula de câncer, dano ou morte de células e/ou tecidos de câncer e as- sim por diante. Tipicamente, efeito indireto sobre ingredientes ativos são induções de CTLs reconhecendo ou matando células de câncer. Antes de ser formulado, o "ingrediente ativo" pode ser também referido como "bruto", "substância de fármaco"ou "produto técnico".
[00048] A menos que de outro modo definido, o termo "câncer"se refere a cânceres que expressam excessivamente o gene MPHOSPH1, cujos exemplos incluem, mas não estão limitados a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, câncer colorretal, câncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteossarcoma, câncer de próstata, câncer renal e tumor de tecido mole.
[00049] A menos que de outro modo definido, os termos "linfócito T citotóxico", "célula T citotóxica"e "CTL"são usados intercomutavel- mente aqui e a menos que de outra maneira especificamente indicado, se referem a um subgrupo de linfócitos T que são capazes de reconhecer células não próprias (por exemplo, células de tumor/ câncer, células infectadas com vírus) e indução da morte de tais células.
[00050] A menos que de outra maneira definido, o termo "HLA-A2", conforme aqui usado, se refere representativamente aos subtipos, cujos exemplos incluem, mas não estão limitados a, HLA-A *0201, HLA- A *0202, HLA-A *0203, HLA-A *0204, HLA-A *0205, HLA-A *0206, HLA-A *0207, HLA-A *0210, HLA-A *0211, HLA-A *0213, HLA-A *0216, HLA-A *0218, HLA-A *0219, HLA-A *0228 e HLA-A *0250.
[00051] A menos que de outra maneira definido, o termo "estojo", conforme aqui usado, é usado em referência a uma combinação de reagentes e outros materiais. É compreendido aqui que o estojo pode incluir micromatriz, chip, marcador e outros. Não é pretendido que o termo "estojo" seja limitado a uma combinação particular de reagentes e/ou materiais.
[00052] Conforme aqui usado, no contexto de um indivíduo ou paciente, a expressão "antígeno HLA do indivíduo (ou paciente) é HLA-A2" se refere a que o indivíduo ou paciente possui homoziguamente ou heteroziguamente gene de antígeno HLA-A2 como a molécula Classe I de MHC (complexo de histocompatibilidade principal), e o antígeno HLA-A2 é expresso em células do indivíduo ou paciente como um an- tígeno HLA.
[00053] Até o ponto que os métodos e composições da presente invenção encontrarem utilidade no contexto do "tratamento" de câncer, um tratamento é considerado "eficaz" se ele levar a benefício clínico tal como uma diminuição em tamanho, prevalência ou potencial metas- tático do câncer em um indivíduo, retardo da progressão de câncer, alívio de um sintoma clínico de câncer, prolongamento de tempo de sobrevivência, supressão de recorrência pós-operatória e outros. Quando o tratamento é aplicado profilaticamente, "eficaz" significa que ele retarda ou previne cânceres de se formarem ou previne ou alivia um sintoma clínico de câncer. A eficácia é determinada em associação com qualquer método conhecido para diagnóstico ou tratamento do tipo de tumor particular.
[00054] Até o ponto que os métodos e composições da presente invenção encontrarem utilidade no contexto da "prevenção"e "profilaxia" de câncer, tais termos são intercomutavelmente usados aqui para se referir a qualquer atividade que reduza a carga de mortalidade ou morbidez da doença. Prevenção e profilaxia podem ocorrer em "níveis de prevenção primário, secundário e terciário". Embora prevenção e profilaxia primárias evitem o desenvolvimento de uma doença, níveis secundário e terciário de prevenção e profilaxia compreendem atividades que têm como objetivo a prevenção e a profilaxia da progressão de uma doença e a emergência de sintomas bem como redução do impacto negativo de uma doença já estabelecida através da restauração da função e redução de complicações relacionadas à doença. Al-ternativamente,prevenção e profilaxia podem incluir uma ampla faixa de terapias profiláticas que têm como objetivo alívio da severidade do distúrbio particular, por exemplo, redução da proliferação e metástase de tumores.
[00055] No contexto da presente invenção, o tratamento e/ou profilaxia de câncer e/ou a prevenção de sua recorrência pós-operatória incluem quaisquer atividades que levem, por exemplo, a os eventos que seguem, tal como a inibição do crescimento de células cancerosas, a involução ou regressão de um tumor, a indução de remissão, a supressão de ocorrência de câncer, a regressão de tumor, a redução ou inibição de metástase, a supressão de recorrência pós-operatória de câncer e prolongamento de tempo de sobrevivência. Tratamento e/ou profilaxia eficaz de câncer diminui mortalidade e aperfeiçoa o prognóstico de indivíduos tendo câncer, diminui os níveis de marcadores de tumor no sangue e alivia sintomas detectáveis que acompa-nhamcâncer. Por exemplo, redução ou melhora de sintomas constitui tratar eficazmente e/ou a profilaxia inclui 10%, 20%, 30% ou mais de redução ou doença estável.
[00056] No contexto da presente invenção, o termo "anticorpo" se refere a imunoglobulinas e fragmentos das mesmas que são especificamente reativos a uma proteína designada ou peptídeo da mesma. Um anticorpo pode incluir anticorpos humanos, anticorpos primatiza- dos, anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos humanizados, anticorpos fundidos a outras proteínas ou radiomarcadores e fragmentos de anticorpo. Ainda, um anticorpo aqui é usado no sentido mais amplo e compreende especificamente anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados de pelo menos dois anticorpos intactos, e fragmentos de anticorpo contanto que eles exibam a atividadebiológica desejada. Um "anticorpo" indica todas as classes (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM).
II. Peptídeos
[00057] Os peptídeos da presente invenção descritos em detalhes abaixo podem ser referidos como "peptídeo(s) de MPHOSPH1" ou "polipeptídeo(s) MPHOSPH1". Para demonstrar que peptídeos derivados de MPHOSPH1 funcionam como um antígeno reconhecido por CTLs, peptídeos derivados de MPHOSPH1 (SEQ ID NO:126) foram analisados para determinar se eles eram epitopos de antígeno restritos por HLA-A2 que são alelos de HLA geralmente encontrados (Date, Y. e outros, Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo, A. e outros, J. Immunol. 155:4307-12, 1995; Kubo, R.T. e outros, J. Immunol. 152: 3913-24, 1994).
[00058] Candidatos a peptídeos de ligação a HLA-A2 derivados de MPHOSPH1 foram identificados com base em suas afinidades de ligação a HLA-A2.
[00059] Além disso, após estimulação in vitro de células T por células dendríticas (DCs) pulsadas (carregadas) com esses peptídeos, CTLs foram estabelecidos com sucesso através de estimulação das DCs com cada um dos peptídeos que seguem:
[00060] MPHOSPH1-A2-9-850 (SEQ ID NO: 5), MPHOSPH1-A2-9-129 (SEQ ID NO: 14), MPHOSPH1-A2-9-846 (SEQ ID NO: 64), MPHOSPH1- A2-10-460 (SEQ ID NO: 73), MPHOSPH1-A2-10- 770 (SEQ ID NO: 77), MPHOSPH1-A2-10- 407 (SEQ ID NO: 79), MPHOSPH1-A2-10- 923 (SEQ ID NO: 97), MPHOSPH1- A2-10-1484 (SEQ ID NO: 103) e MPHOSPH1- A2-10-282 (SEQ ID NO: 120).
[00061] Esses CTLs estabelecidos mostraram atividade de CTL específica potente contra células-alvo pulsadas com respectivos peptí- deos. Esses resultados demonstram que MPHOSPH1 é um antígeno reconhecido por CTLs e que os peptídeos testados são peptídeos de epitopo de MPHOSPH1 restritos por HLA-A2; e então, os peptídeos podem ser eficazes como antígenos alvo para citotoxidez por CTLs. Ainda, MPHOSPH1-A2-10-282 (SEQ ID NO: 120) induziu CTLs tendo atividade citotóxica potente contar células de câncer expressando ambos o MPHOSPH1 e antígeno HLA-A2 como a molécula Classe I do MHC. Este resultado sugere que o peptídeo MPHOSPH1-A2-10-282 ocorre naturalmente in vivo para ser apresentado sobre células de câncer expressando MPHOSPH1 por antígeno HLA-A2 (por exemplo, HLA-A*0201 ou HLA-A-0206). De acordo com as constatações, um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120 ou derivados, mutantes, variantes ou peptídeos modificados dos mesmossão úteis no contexto de terapia imunológica para tratamento de um câncer que expressa MPHOSPH1 e antígeno HLA-A2. Em certas modalidades da presente invenção, peptídeo composto de uma sequência de aminoácido revelada aqui pode ser usado para terapia imunológica de câncer. Exemplos de canceres a serem tratados incluem, por exemplo, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, câncer colorretal, câncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteossarcoma, câncer de próstata, câncer renal e tumor de tecido mole. No entanto, os peptídeos da presente invenção podem ser aplicados a quaisquer cânceres, contanto que eles expressem MPHOSPH1 e antígeno HLA-A2.
[00062] Uma vez que o gene MPHOSPH1 é superexpresso em células de câncer tais como câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, câncer colorretal, câncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteossarcoma, câncer de próstata, câncer renal e tumor de tecido mole, mas não é expresso na maioria dos órgãos normais, ele é um bom alvo para imunoterapia. Desta maneira, a presente invenção provê nonapeptídeos (peptídeos compostos de nove resíduos de aminoácido) e decapeptídeos (peptídeos compostos de dez resíduos de aminoácido) de epitopos reconhecidos por CTL de MPHOSPH1. Alternativamente, a presente invenção provê peptídeos isolados que se ligam a antígenos HLA e induzem linfócitos T citotóxi- cos (CTL), em que o peptídeo é composto de um fragmento imunolo- gicamente ativo de MPHOSPH1 (SEQ ID NO: 126). Mais especificamente, em algumas modalidades, a presente invenção provê peptí- deos compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada dentre SEQ ID Nos: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120. Em modalidades preferidas, os peptídeos da presente invenção são peptídeos que compreendem uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120.
[00063] Em geral, programas de software agora disponíveis, por exemplo, na Internet, tais como aqueles descritos em Parker, K. C. e outros, J. Immunol. 1 de janeiro de 1994, 152(1): 163, 75 e Nielsen, M. e outros, Protein Sci. 2003; 12: 1007-17 podem ser usados para calcular as afinidades de ligação entre vários peptídeos e antígenos HLA in silico. Afinidade de ligação com antígenos HLA pode ser medida conforme descrito, por exemplo, em Parker, K.C. e outros, J. Immunol., 1 de janeiro de 1994, 152(1): 163-75, Kuzushima, K. e outros, Blood 2001, 98(6): 1872-81, Larsen, M.V. e outros, BMC Bioinformatics. 31 de outubro de 2007; 8: 424, Bus, S. e outros, Tissue Antigens, 62:37884, 2003, Nielsen, M. e outros, Protein Sci. 2003; 12: 1007-17 e Nielsen, M. e outros. PLoS ONE 2007; 2:e796, que são sumarizados em, por exemplo, Lafuente, E.M. e outros, Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220. Métodos para determinação de afinidade de ligação são descritos, por exemplo, no Journal of Immunological Methods (1995, 185: 181-190) e Protein Science (2000, 9:1838-1846). Desta maneira, tais programas de software podem ser utilizados para selecionar aqueles fragmentos derivados de MPHOSPH1 que têm afi- nidade de ligação alta com antígenos HLA. Desta maneira, a presente invenção compreende peptídeos compostos de quaisquer fragmentos derivados de MOHOSPH1, que seriam determinados se ligar a antíge- nos HLA através de tais programas conhecidos. Ainda, tais peptídeos podem incluir o peptídeo composto da sequência de comprimento integral de MPHOSPH1.
[00064] Os peptídeos da presente invenção, particularmente os no- napeptídeos e decapeptídeos da presente invenção, podem ser flanqueados com resíduos de aminoácido adicionais contanto que os pep- tídeos retenham sua capacidade de indução de CTL. Os resíduos de aminoácido adicionais particulares podem ser compostos de qualquer tipo de aminoácidos contanto que eles não prejudiquem a capacidade de indução de CTL do peptídeo original. Desta maneira, a presente invenção compreende peptídeos tendo capacidade de indução de CTL, em que os peptídeos incluem uma sequência de aminoácido derivada de MPHOSPH1. Tais peptídeos são, por exemplo, de menos do que 40 aminoácidos, frequentemente menos do que cerca de 20 ami- noácidos, geralmente menos do que cerca de 15 aminoácidos.
[00065] É geralmente conhecido que modificações de um, dois, vários ou mais aminoácidos em um peptídeo não influenciam a função do peptídeo ou em alguns casos realçam ainda mais a função desejada do peptídeo original. Na realidade, peptídeos modificados (isto é, peptídeos compostos de uma sequência de aminoácido modificada através de substituição, inserção, deleção e / ou adição de um, dois ou vários resíduos de aminoácido em uma sequência de referência original) são conhecidos reter a atividade biológica do peptídeo original (Mark e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81: 5662-6; Zoller e Smith, Nucleic Acids Res. 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982, 79: 6409-13). Desta maneira, em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo tendo capacidade de indu- ção de CTL da presente invenção pode ser composto de um peptídeo tendo uma sequência de aminoácido selecionada dentre SEQ ID NOs: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120, em que um, dois ou vários aminoá- cidos são adicionados, deletados, inseridos e/ou substituídos.
[00066] Em outra modalidade, os peptídeos da presente invenção podem ser peptídeos compreendendo uma sequência de aminoácido em que um, dois ou vários aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos e /ou adicionados na sequência de aminoácido selecionada dentre as SEQ ID Nos: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120, contanto que o peptídeo modificado retenha a capacidade de indução de CTL do peptídeo original. Em modalidades preferidas, o peptídeo da presente invenção pode ser peptídeos compreendendo uma sequência de aminoácido em em que um, dois ou vários aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos e /ou adicionados na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 120, contanto que o peptídeo modificado retenha a capacidade de indução de CTL do peptídeo original.
[00067] Aqueles versados na técnica vão reconhecer que modificações individuais (isto é, adições, inserções, deleções e /ou substituições) em uma sequência de aminoácido que alteram um aminoácido único ou uma pequena porcentagem da sequência de aminoácido total tendem a resultar na conservação das propriedades da cadeia lateral de aminoácido original; ela é então referida como "substituição conser- vativa" ou "modificação conservativa", em que a alteração de uma proteína resulta em uma proteína com funções similares. Tabelas de substituição conservativa provendo aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Exemplos de propriedades de cadeias laterais de aminoácido são aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) e cadeias laterais tendo os grupos ou características funcionais em comum: uma cadeia lateral alifática (G, A, V, L, I, P); uma cadeia lateral contendo grupo hidroxila (S, T, Y); uma cadeia lateral contendo átomo de enxofre (C, M); uma cadeia lateral contendo ácido carboxí- lico e amida (D, N, E, Q); uma cadeia lateral contendo base (R, K, H); e uma cadeia lateral contendo grupo aromático (H, F, Y, W). Ainda, os oitos grupos que seguem contêm, cada um, aminoácidos que são substituições conservativas um para o outro: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (vide, por exemplo, Creighton, Proteins 1984).
[00068] Tais peptídeos conservativamente modificados são também considerados peptídeos da presente invenção. No entanto, o peptídeo da presente invenção não é restrito a eles e pode incluir modificações não conservativas, contanto que o peptídeo modificado resultante retenha a capacidade de indução de CTL do peptídeo não modificado original. Ainda, os peptídeos modificados não devem excluir peptídeos de indução de CTL derivados de variantes polimórficas, homólogos interespécie ou alelos de MPHOSPH1.
[00069] Resíduos de aminoácido podem ser inseridos, substituídos, deletados eIou adicionados aos peptídeos da presente invenção ou, alternativamente, resíduos de aminoácido podem ser deletados deles para obter uma afinidade de ligação maior. Para reter a capacidade de indução de CTL requisitada, ele pode ser modificado preferivelmente (isto é, inserir, deletar, adicionar e / substituir) em apenas um pequeno número (por exemplo, 1, 2 ou vários) ou uma porcentagem pequena de aminoá- cidos. Aqui, o termo "vários"significa 5 ou menos aminoácidos, por exemplo, 4 ou 3 ou menos. A porcentagem de aminoácidos a ser modificada pode ser 20% ou menos, preferivelmente 15% ou menos, mais preferivelmente 10% ou menos, ainda mais preferivelmente 1 a 5%.
[00070] Quando usados no contexto de imunoterapia de câncer, os peptídeos da presente invenção podem ser apresentados sobre a superfície de uma célula ou exossoma como um complexo com um antí- geno de HLA. Desta maneira, é preferível selecionar peptídeos que não apenas induzem CTLs, mas também possuem afinidade de ligação alta com o antígeno HLA. Para esta finalidade, os peptídeos podem ser modificados através de substituição, inserção, deleção e /ou adição de resíduos de aminoácido para fornecer um peptídeo modificado tendo afinidade de ligado aperfeiçoada. Em adição a peptídeos que são naturalmente exibidos, uma vez que a regularidade das se-quências de peptídeos exibida pela ligação a antígenos de HLA já é bem conhecida (J. Immunol. 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J. Immunol. 1994, 155: 4307), modificações baseadas em tal regularidade podem ser introduzidas nos peptídeos imunogênicos da presente invenção.
[00071] Por exemplo, peptídeos exibindo afinidade de ligação a HLA-A2 tendem a ter o segundo aminoácido do terminal N substituído com leucina ou metionina. Da mesma maneira, peptídeos em que o aminoácido C-terminal é substituído com valina ou leucina podem ser também favoravelmente usados. Desta maneira, peptídeos tendo uma sequência de aminoácido selecionada dentre SEQ ID Nos: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120 em que o segundo aminoácido do terminal N da sequência de aminoácido da SEQ ID NO. é substituído com leucina ou metioniona e / ou em que o terminal C da sequência de aminoácido da SEQ ID NO. é substituído com valina ou leucina são compreendidos pela presente invenção. Em outra modalidade, a presente inven ção compreende peptídeos tendo uma sequência de aminoácido em que o segundo aminoácido do terminal N da sequência de aminoácido selecionada dentre as SEQ ID Nos: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120 é substituído com leucina ou metionina e / ou o terminal C da sequência de aminoácido da SEQ ID NO. é substituído com valina ou leucina. Em modalidades preferidas, os peptídeos da presente invenção podem compreender uma sequência de aminoácido em que o segundo aminoácido do terminal N da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120 é substituído com leucina ou metionina e / ou o terminal C da sequência de aminoácido da SEQ ID NO. é substituído com valina ou leucina.
[00072] Em uma modalidade, a presente invenção provê os peptí- deos tendo capacidade de indução de CTL, em que os peptídeos têm a fórmula geral selecionada do grupo consistindo em (1) a (9) como segue: (1) -correspondendo a MPHOSPH1-A2-9-850 (SEQ ID NO: 5)- F [X1] L T I E N E [X2], (2) -correspondendo a MPHOSPH1-A2-9-129 (SEQ ID NO: 14)- F [X1] G C I M Q P [X2], (3) -correspondendo a MPHOSPH1-A2-9-846 (SEQ ID NO: 64)- G [X1] R A F L L T [X2], (4) -correspondendo a MPHOSPH1- A2-10-460 (SEQ ID NO: 73)- Y [X1] A Y D E T L N [X2], (5) -correspondendo a MPHOSPH1-A2-10- 770 (SEQ ID NO: 77)- K [X1] I C N E T V E [X2] (6) -correspondendo a MPHOSPH1-A2-10- 407 (SEQ ID NO: 79)- L [X1] T L G K C I N [X2] (7) -correspondendo a MPHOSPH1-A2-10- 923 (SEQ ID NO: 97)- K [X1] S N E I E T A [X2] (8) -correspondendo a MPHOSPH1- A2-10-1484 (SEQ ID NO: 103)- Q [X1] V A A L E I Q [X2], e (9) -correspondendo a MPHOSPH1- A2-10-282 (SEQ ID NO: 120)- Y [X1] Y D L F V P V [X2].
[00073] Nas fórmulas gerais (1)-(9), [X1] é leucina ou metionina e [X2] é valina ou leucina. Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, a fórmula geral pode ser (9), que corresponde à SEQ ID NO: 120. A presente invenção provê ainda peptídeo isolado representado pelas fórmulas gerais (1)-(9) definidas acima, ao qual um, dois ou vários aminoácidos são adicionados a um ou ambos o terminal N e terminal C do mesmo. Em uma modalidade alternativa, a presente invenção provê peptídeos isolados representados pelas fórmulas gerais (1)-(9) dos quis um, dois ou vários resíduos de aminoáci- do são deletados em um ou ambos o terminal N e terminal C do mesmo. A presente invenção também provê peptídeo isolado representado pelas fórmulas gerais (1)-(9), ao qual um, dois ou vários aminoácidos são inseridos ou deletados em qualquer ponto da sequência.
[00074] Substituições podem ser introduzidas não apenas nos ami- noácidos terminais, mas também nas posições de sítios de reconhecimento de receptor de célula T (TCR) potenciais de peptídeos. Vários estudos demonstraram que um peptídeo com substituições de amino- ácido pode ter função igual a ou melhor do aquela do original, por exemplo, CAPl, p53(264-272), Her-2/neu(369-377) ou gp100(209-217) (Zaremba e outros, Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T.K. Hoffman e outros, J. Immunol. 1 de fevereiro (2002); 168(3): 1338-47, S.O. Dionne e outros, Cancer Immunol Immunother. (2003) 52: 199-206 e S.O. Dionne e outros,Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).
[00075] A presente invenção compreende também a adição de um, dois ou vários aminoácidos que podem ser adicionados a um ou ambos os terminais N e C dos peptídeos da presente invenção. Tais pep- tídeos modificados retendo a capacidade de indução de CTL estão também incluídos na presente invenção.
[00076] No entanto, quando a sequência de peptídeo é idêntica a uma porção da sequência de aminoácido de uma proteína endógena ou exógena tendo uma função diferente, efeitos colaterais negativos tais como distúrbios autoimunes e sintomas alérgicos contra substânciasespecíficas podem ser induzidos. Desta maneira, pode ser desejável realizar pesquisas de homologia usando bancos de dados disponíveis para evitar situações em que a sequência do peptídeo é compatível com a sequência de aminoácido de outra proteína. Quando se torna claro a partir das pesquisas de homologia que nenhum peptídeo idêntico a ou tendo uma diferença de 1 ou 2 aminoácidos com relação ao peptídeo alvo existe na natureza, o peptídeo alvo pode ser modificado a fim de aumentar a sua afinidade de ligação com antígenos HLA e /Ou aumentar sua capacidade de indução de CTL sem qualquer perigo de tais efeitos colaterais.
[00077] Embora peptídeos tendo afinidade de ligação alta com os antígenos HLA conforme acima descrito sejam esperados ser altamente eficazes, os peptídeos candidatos, que são selecionados de acordo com a presença de afinidade de ligação alta como um indicador, são examinados mais quanto à presença de capacidade de indução de CTL. Aqui, a expressão "capacidade de indução de CTL" indica a habi- lidade de um peptídeo em induzir um CTL quando presente em uma célula apresentando antígeno (APC). "Capacidade de indução de CTL" inclui a habilidade de um peptídeo em induzir ativação de CTL, proliferação de CTL, promover lise de células-alvo por CTL e aumentar produção de IFN-gama por CTL.
[00078] Confirmação de capacidade de indução de CTL é realizada através da indução de APCs carregando antígenos MHC humanos (por exemplo, linfócitos B, macrófagos e células dendríticas (DCs)), ou mais especificamente DCs derivadas de leucócitos mononucleares de sangue periférico humano, e após estimulação de APCs com um pep- tídeo de teste, mistura de APCs com células positivas para CD8 para induzir CTLs, e então medição de IFN-gama contra as células-alvo produzidas e liberadas por CTLs. Como o sistema de reação, animais transgênicos que foram produzidos para expressar um antígeno HLA humano (por exemplo, aqueles descritos em BenMohamed, L., Krishnan, R., Longmate, J., Auge, C., Low, L., Primus, J., Diamond, D.J., Hum. Immunol. Agosto de 2000, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vac-cine in HLA-A*0201/DR1 transgenic mice: dependent MHC (HLA) class II restricted T(H) response) podem ser usados. Alternativamente, as células-alvo podem ser radiomarcadas com 51Cr e similar, e atividade citotóxica de CTLs pode ser calculada a partir de radioatividade liberada das células-alvo. Alternativamente, ela pode ser examinada através da medição de IFN-gama produzido e liberado por CTLs na presença de células que carregam peptídeos imobilizados e visualização da zona de inibição no meio usando anticorpos monoclonais anti-IFN-gama.
[00079] Como um resultado de exame da capacidade de indução de CTL dos peptídeos conforme acima descrito, foi constatado que nonapeptídeos e decapeptídeos selecionados dentre aqueles peptí- deos tendo uma sequência de aminoácido indicada pelas SEQ ID Nos: 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120 mostraram capacidade de indução de CTL bem como afinidade de ligação alta a um antígeno HLA. Desta maneira, esses peptídeos são exemplificados como modalidades preferidas da presente invenção.
[00080] Ainda, resultados de análise de homologia demonstraram que tais peptídeos não compartilham homologia significante com pep- tídeos derivados de quaisquer outros produtos de gene humano conhecidos. Isso diminui a possibilidade de respostas imunes desconhecidas ou indesejadas quando usados para imunoterapia. Desta maneira,também a partir deste aspecto, esses peptídeos são úteis para eli- citar imunidade contra MPHOSPH1 em pacientes com câncer. Deste maneira, peptídeos tendo uma sequência de aminoácido selecionada dentre as SEQ ID Nos: 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120 são compreendidos pela presente invenção.
[00081] Em adição à modificação conforme acima discutido, os peptí- deos da presente invenção podem ser ligados a outros peptídeos, contanto que o peptídeo ligado resultante retenha a capacidade de indução de CTL do peptídeo original. Exemplos de "outros"peptídeos adequados incluem: os peptídeos da presente invenção ou os peptídeos induzíveis por CTL derivados de outros TAAs. O peptídeo da presente invenção pode ser ligado a um "outro"peptídeo diretamente ou indiretamente via um ligante. Os ligantes entre os peptídeos são bem conhecidos na técnica, por exemplo, AAY (P.M. Daftarian e outros, J. Trans. Med. 2007, 5:26), AAA, NKRK (R.P.M. Sutmuller e outros, J. Immunol. 2000, 165: 7308-7315) ou K (S. Ota e outros, Can. Res. 62, 1471-1476, K.S. Kawa- mura e outros, J. Immunol. 2002, 168: 5709-5715).
[00082] Por exemplo, peptídeos derivados de antígenos associados a tumor de MPHOSPH1 podem ser também usados para aumentar resposta imune via Classe I e / ou classe II do HLA. É bem conhecido na técnica que células cancerosas expressam mais de um gene asso- ciado a tumor. Alguns peptídeos induzíveis por CTL derivados de tais TAAs foram isolados (por exemplo, WO2008 / 047473, WO2010/ 047062, WO2008 /102557, WO2009 / 025116). Desta maneira, exemplos de "outros" peptídeos que são ligados ao peptídeo da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, peptídeos induzíveis por CTL derivados de TAAs que não MPHOSPH1. Na presente invenção, "outros" peptídeos podem não ser apenas peptídeos restritos a Classe I do MHC, mas também peptídeo restrito à Classe II do MHC. Um versado comum na técnica pode preparar polipeptídeos incluindo um ou mais peptídeos MPHOSPH1 e um ou mais dos não peptídeos MPHOSPH1 ou ácidos nucleicos codificando tais polipeptídeos, usando procedimentos de biologia molecular convencionais.
[00083] Os peptídeos ligados descritos acima são referidos aqui como "polítopos", isto é, grupos de dois ou mais peptídeos potencialmente imunogênicos ou de estimulação de resposta imune que podem ser unidos em várias disposições (por exemplo, concatenados, sobrepostos). O polítopo (ou ácido nucleico codificando o polítopo) pode ser administrado de acordo com protocolos de imunização padrão, por exemplo, a animais, para testar a eficácia do polítopo em estimulação, aumento e/ou provocação de uma resposta imune.
[00084] Os peptídeos podem ser unidos diretamente ou através do uso de sequências de flanqueamento para formar polítopos, e o uso de polítopos como vacinas é bem conhecido na técnica (vide, por exemplo, Thomson e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(13):5845- 5849, 1995; Gilbert e outros, Nature Biotechnol, 15(12):1280-1284, 1997; Thomson e outros, J. Immunol. 157(2):822-826, 1996; Tarn e outros, J. Exp. Med. 171(1):299-306, 1990). Polítopos contendo vários números e combinações de epitopos podem ser preparados e testados quanto a reconhecimento por CTLs e quanto à eficácia em aumento de uma resposta imune.
[00085] Os peptídeos da presente invenção podem ser ainda ligados a outras substâncias, contanto que eles retenham a capacidade de indução de CTL. Exemplos ilustrativos de tais "outras"substâncias incluem, mas não estão limitados a, peptídeos, lipídeos, açúcares e cadeias de açúcar, grupos acetila, polímeros naturais e sintéticos, etc. Os peptídeos podem conter modificações tais como glicosilação, oxidaçãode cadeia lateral ou fosforilação; contanto que as modificações não destruam a atividade biológica dos peptídeos conforme aqui descrito. Esses tipos de modificações podem ser realizados para conferir funções adicionais (por exemplo, função de direcionamento e função de aplicação) ou para estabilizar o polipeptídeo.
[00086] Por exemplo, para aumentar a estabilidade in vivo de um polipeptídeo, é conhecido na técnica introduzir D-aminoácidos, miméti- cos de aminoácido ou aminoácidos não naturais; este conceito pode também ser adotado para os presentes polipeptídeos. A estabilidade de um polipeptídeo pode ser ensaiada de várias maneiras. Por exemplo, peptidases e vários meios biológicos, tais como plasma e soro humanos, podem ser usados para testar a estabilidade (vide, por exemplo, Verhoef e outros, Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin. 1986, 11: 291-302). Quando os peptídeos da presente invenção incluem um resíduo cisteína, os peptídeos tendem a formar dímeros via uma ligação dissulfeto entre grupos SH dos resíduos cisteína. Desta maneira, dímeros dos peptídeos da presente invenção são também incluídos nos peptídeos da presente invenção.
[00087] Além disso, conforme acima mencionado, dentre os peptí- deos modificados que são substituídos, deletados, inseridos e fou adicionados por um, dois ou vários resíduos de aminoácido, aqueles tendo a mesma atividade ou maior comparado com peptídeos originais podem ser avaliados ou selecionados. A presente invenção, então, também provê o método de avaliação ou seleção de peptídeos modifi- cados tendo a mesma atividade ou maior comparado com originais. Por exemplo, o método pode incluir as etapas de: a: modificação (isto é, substituição, deleção, inserção ou adição) de pelo menos um resíduo de aminoácido de um peptídeo da presente invenção, b: determinação da atividade do peptídeo modificado na etapa (a), e c: seleção do peptídeo tendo a mesma atividade ou maior comparado com o peptídeo original. Aqui, a atividade pode incluir atividade de ligação a MHC e capacidade de indução de ACP ou CTL. Preferivelmente, a atividade do peptídeo é capacidade de indução de CTL.
III. Preparação de peptídeos MPHOSPH1
[00088] Os peptídeos da presente invenção podem ser preparados usando técnicas bem conhecidas. Por exemplo, os peptídeos da presente invenção podem ser preparados sinteticamente, através de tecnologia de DNA recombinante ou síntese química. Os peptídeos da presente invenção podem ser sintetizados individualmente ou como polipeptídeos mais longos incluindo dois ou mais peptídeos. Os peptí- deos podem ser isolados, isto é, purificados ou isolados substancialmente livres de outras proteínas de célula hospedeira de ocorrência natural e seus fragmentos ou quaisquer outras substâncias químicas.
[00089] Os peptídeos da presente invenção podem conter modificações, tais como glicosilação, oxidação de cadeia lateral ou fosforila- ção, contanto que tais modificações não destruam a atividade biológica dos peptídeos originais. Outras modificações ilustrativas incluem incorporação de D-aminoácidos ou outros miméticos de aminoácido que podem ser usados, por exemplo, para aumentar a meia-vida no soro dos peptídeos.
[00090] Um peptídeo da presente invenção pode ser obtido através de síntese química com base na sequência de aminoácido seleciona- da. Por exemplo, métodos de síntese de peptídeo convencionais que podem ser adotados para a síntese incluem: (i) Peptide Synthesis, Interscience, NovaYork, 1966; (ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, Nova York, 1976; (iii) Peptide Synthesis (em Japonês), Maruzen Co., 1975; (iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (em Japonês), Maruzen Co., 1985; (v) Development of Pharmaceuticals (Segundo volume) (em Japonês), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991; (vi) WO99/67288; e (vii) Barany, G. & Merrifield, R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, Nova York, 1980, 100-118.
[00091] Alternativamente, os peptídeos da presente invenção podem ser obtidos adotando quaisquer métodos de engenharia genética conhecidos para produção de peptídeos (por exemplo, Morrison, J.J. Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu e outros) 1983, 101: 347-62). Por exemplo, primeiro, um vetor adequado carregando um polinucleotídeo codificando o peptídeo objeto em uma forma expressável (por exemplo, a jusante de uma sequência reguladora correspondendo a uma sequência promotora)é preparado e transformado em uma célula hospedeira adequada. Tais vetores e células hospedeiras são também providos pela presente invenção. A célula hospedeira é então culturada para produzir o peptídeo de interesse. O peptídeo pode também ser produzido in vitro adotando um sistema de tradução in vitro.
IV. Polinucleotídeos
[00092] A presente invenção provê polinucleotídeos que codificam qualquer um dos peptídeos da presente invenção mencionados acima. Os polinucleotídeos da presente invenção podem incluir polinucleotí- deos derivados do gene MPHOSPH1 de ocorrência natural (por exem- plo, No. Acesso GenBank NM_001031702 (SEQ ID NO: 125)) ou aqueles tendo uma sequência de nucleotídeo conservativamente modificada do mesmo. Aqui, a expressão "sequência de nucleotídeo con- servativamente modificada" se refere a sequências que codificam sequências de aminoácido idênticas ou essencialmente idênticas. Devido à degeneração do código genético, um grande número de ácidos nu- cleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam o ami- noácido alanina. Desta maneira, em cada posição em que uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico, referidas na técnica como "variações silenciosas", representam uma espécie de variante conser- vativamente modificada. Cada sequência de ácido nucleico descrita aqui como codificando um peptídeo também descreve cada possível variação silenciosa do ácido nucleico. Um versado na técnica vai prontamente reconhecer que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é geralmente o único códon para metionina, e TGG, que é geralmente o único códon para triptofano) pode ser modificado para fornecer uma molécula funcionalmente idêntica. Desta maneira, cada sequência de nucleotídeo codificando peptídeo revelada representa uma revelação implícita das variações silenciosas associadas com a mesma.
[00093] O polinucleotídeo da presente invenção pode ser composto de DNA, RNA e derivados dos mesmos. Como é bem conhecido na técnica, uma molécula de DNA é adequadamente composta de bases tais como as bases de ocorrência natural A, T, C e G e T é substituído por U em um RNA. Um versado na técnica vai reconhecer que bases de ocorrência não natural podem ser incluídas em polinucleotídeos, também.
[00094] O polinucleotídeo da presente invenção pode codificar pep- tídeos múltiplos da presente invenção com ou sem sequências de aminoácido de intervenção. Por exemplo, a sequência de aminoácido de intervenção pode prover um sítio de clivagem (por exemplo, sequência de reconhecimento de enzima) do polinucleotídeo ou dos pep- tídeos traduzidos. Ainda, o polinucleotídeo da presente invenção pode incluir quaisquer sequências adicionais para a sequência de codificação codificando o peptídeo da presente invenção. Por exemplo, o poli- nucleotídeo da presente invenção pode ser um polinucleotídeo recom- binante que inclui sequências reguladoras requeridas para a expressão do peptídeo ou pode ser um vetor de expressão (plasmídeo) com genes marcadores e similar. Em geral, tais polinucleotídeos recombi- nantes podem ser preparados através da manipulação de polinucleotí- deos através de técnicas recombinantes convencionais usando, por exemplo, polimerases e endonucleases.
[00095] Ambas as técnicas recombinante e de síntese química podem ser usadas para produzir os polinucleotídeos da presente invenção. Por exemplo, o polinucleotídeo da presente invenção pode ser produzido através de inserção do polinucleotídeo tendo a sequência de codificação do peptídeo da presente invenção em um vetor apropriado, que pode ser expresso quando transfectado em uma célula competente. Alternativamente, o polinucleotídeo da presente invenção pode ser amplificado usando técnicas de PCR ou replicado em um hospedeiro adequado (vide, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York, 1989). Alternativamente, o polinucleotídeo da presente invenção pode ser sintetizado usando as técnicas de fase sólida, conforme descrito em Becauge, S.L. & Iyer, R.P., Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes e outros, EMBO J., 1984, 3: 801-5.
V. Exossomas:
[00096] A presente invenção provê ainda vesículas intracelulares, chamadas exossomas, que apresentam complexos formados entre os peptídeos da presente invenção e antígenos HLA em sua superfície. Exossomas podem ser preparados, por exemplo, usando os métodos detalhados no Pedido de Patente Japonês Kohyo Publications No. Hei 11-510507 e WO99/03499 e podem ser preparados usando APCs obtidas de pacientes que são submetidos a tratamento e/ou prevenção. Os exossomas da presente invenção podem ser inoculados como vacinas, similarmente aos peptídeos da presente invenção.
[00097] O tipo de antígenos HLA incluídos nos complexos deve ser compatível com aquele do indivíduo necessitando de tratamento e/ou prevenção. Por exemplo, para Japoneses, HLA-A2, particularmente HLA- A*0201 e HLA-A*0206 são frequentemente apropriados. O uso de tipo HLA-A2 que é altamente expresso dentre Japoneses e Caucasianos é favorável para obtenção de resultados eficazes, e subtipos tais como HLA-A*0201 e HLA-A*0206 encontram uso. Tipicamente, na clínica, o tipo de antígeno HLA do paciente necessitando tratamento é investigado previamente, o que permite seleção apropriada de peptídeos tendo níveis altos de afinidade de ligação com seu antígeno, ou tendo capacidade de indução de CTL através de apresentação de antígeno. Ainda, a fim de obter peptídeos mostrando afinidade de ligação alta e capacidade de indução de CTL, substituição, deleção ou adição de 1, 2 ou vários aminoá- cidos pode ser realizada com base na sequência de aminoácido do pep- tídeo parcial MPHOSPH1 de ocorrência natural.
[00098] Quando usando o antígeno HLA tipo HLA-A2 para os exos- somas da presente invenção, os peptídeos tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID Nos: 2, 3, 4, 5, 9, 10, 14, 20 e 32 têm utilidade particular. Em algumas modalidades, os exossomas da presente invenção são exossomas que apresentam um complexo do peptídeo da presente invenção e antígeno HLA-A2 em sua superfí- cie. Exemplos típicos do antígeno HLA-A2 contido em tais complexos incluem, mas não estão limitados a, HLA-A*0201 e HLA-A*0206.
VI. Células apresentando antígeno (APCs)
[00099] A presente invenção também provê APCs isoladas que apresentam complexos formados com antígenos HLA e os peptídeos da presente invenção em sua superfície. As APCs podem ser derivadas de pacientes que são submetidos a tratamento e/ou prevenção, e podem ser administradas como vacinas sozinhas ou em combinação com outros fármacos incluindo os peptídeos, exossomas ou CTLs da presente invenção.
[000100] As APCs não são limitadas a um tipo particular de células e incluem células dendríticas (DCs), células Langerhans, macrófagos, células B e células T ativadas, que são conhecidas apresentar antíge- nos proteináceos em sua superfície celular de modo a serem reconhecidas por linfócitos. Uma vez que DCs são APCs representativas tendo a atividade de indução de CTL mais forte dentre APCs, DCs são adequadas para as APCs da presente invenção.
[000101] Por exemplo, as APCs da presente invenção podem ser obtidas induzindo DCs de monócitos de sangue periférico e então contatando-as (estimulando) com os peptídeos da presente invenção in vitro, ex vivo ou in vivo. Quando os peptídeos da presente invenção são administrados a um indivíduo, as APCs que apresentam os peptí- deos da presente invenção são induzidas no corpo do indivíduo. Desta maneira, as APCs da presente invenção podem ser obtidas através de coleta das APCs do indivíduo após administração dos peptídeos da presente invenção ao indivíduo. Alternativamente, as APCs da presente invenção podem ser obtidas através de contato das APCs coletadas de um indivíduo com o peptídeo da presente invenção.
[000102] As APCs da presente invenção podem ser administradas a um indivíduo para indução de resposta imune contra câncer no indiví- duo sozinhas ou em combinação com outras fármacos incluindo os peptídeos, exossomas ou CTLs da presente invenção. Por exemplo, a administração ex vivo pode incluir as etapas de: a: coleta de APCs de um primeiro indivíduo, b: contato com as APCs da etapa a com o peptídeo da presente invenção, e c: administração das APCs da etapa b a um segundo indivíduo.
[000103] O primeiro indivíduo e o segundo indivíduo podem ser o mesmo indivíduo ou podem ser indivíduos diferentes. As APCs obtidas pela etapa b podem ser administradas como uma vacina para tratamento e/ou prevenção de câncer, cujos exemplos incluem, mas não estão limitados a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, câncer colorretal, câncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteossarcoma, câncer de próstata, câncer renal e tumor de tecido mole.
[000104] A presente invenção provê um método ou processo para fabricação de uma composição farmacêutica para indução de APCs, em que o método inclui a etapa de mistura ou formulação do peptídeo da invenção com um carreador farmaceuticamente aceitável.
[000105] De acordo com um aspecto da presente invenção, as APCs da presente invenção têm capacidade de indução de CTL. No contexto das APCs, a expressão "tendo capacidade de indução de CTL" se refere a mostrar capacidade de indução de CTL mais alta do que aquelas de APCs contatadas com quaisquer peptídeos. Tais APCs tendo capacidade de indução de CTL podem ser preparadas através de um método que inclui a etapa de transferência de um polinucleotídeo codificando o peptídeo da presente invenção para APCs in vitro bem como o método mencionado acima. Os genes introduzidos podem estar na forma de DNA ou RNA. Exemplos de métodos para introdução inclu- em, sem limitações particulares, vários métodos convencionalmente realizados neste campo, tais como lipofecção, eletroporação ou método de fosfato de cálcio pode ser usado. Mais especificamente, ele pode ser realizado conforme descrito em Cancer Res. 1996, 56: 5672-7: J. Immunol. 1998, 161: 5607-13; J. Exp. Med. 1996, 184: 465-72; Tradução Japonesa Publicada da Publicação Internacional No. 2000509281. Através da transferência do gene para APCs, o gene sofre transcrição, tradução e similar na célula, e então a proteína obtida é processada por MHC Classe I ou Classe II, e prossegue através de um curso de apresentação para apresentar peptídeos parciais.
[000106] Em algumas modalidades, as APCs da presente invenção são APCs que apresentam complexos de antígeno HLA-A2 e o peptí- deo da presente invenção em sua superfície. Exemplos típicos do an- tígeno HLA-A2 contidos em tais complexos incluem, mas não estão limitados a, HLA-A*0201 e HLA-A*0206.
VII. Linfócitos T Citotóxicos (CTLs):
[000107] Um CTL induzido contra qualquer um dos peptídeos da presente invenção reforça a resposta imune se direcionando a células de câncer in vivo e então pode ser usado como vacinas similar aos peptídeos. Desta maneira, a presente invenção provê CTLs isolados que são especificamente induzidos ou ativados por qualquer um dos presentes peptídeos da presente invenção.
[000108] Tais CTLs podem ser obtidos através de 1) administração do peptídeo(s) da presente invenção a um indivíduo, (2) contato (estimulação) das APCs derivadas do indivíduo, e células T positivas para CD8, ou leucócitos mononucleares de sangue periférico in vitro com o peptí- deo(s) da presente invenção, (3) contato das células T positivas para CD8 ou leucócitos mononucleares de sangue periférico in vitro com as APCs ou exossomas apresentando um complexo de um antígeno HLA e o peptídeo em sua superfície ou (4) introdução de um polinucleotídeo codificando ambas as subunidades de receptor de célula T (TCR) ou polinucleotídeos codificando cada uma das subunidades de TCR, em que o TCR pode se ligar a um complexo do peptídeo da presente invenção e antígeno HLA-A2 sobre a superfície de uma célula. Tais APCs ou exossomas a serem usados na preparação de CTLs podem ser preparados através dos métodos descritos acima. Detalhes do método de (4) são descritos abaixo na seção "VIII. Receptor de Célula T (TCR)".
[000109] Os CTLs da presente invenção podem ser derivados de pacientes que são submetidos a tratamento e/ou prevenção, e podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outros fármacos incluindo os peptídeos, APCs ou exossomas da presente invenção para o propósito de regulagem de efeitos. Os CTLs obtidos agem especificamente contra células-alvo apresentando os peptídeos da presente invenção, por exemplo, os mesmos peptídeos usados para indução. As células-alvo podem ser células que expressam endogenamente MPHOSPH1, tais como células de câncer, ou células que são transfec- tadas com o gene MPHOSPH1; e células que apresentam um peptídeo da presente invenção na superfície celular devido à estimulação pelo peptídeo podem também servir como alvos de ataque de CTL ativado.
[000110] Em algumas modalidades, os CTLs da presente invenção reconhecem células apresentando complexos de antígeno HLA-A2 e o peptídeo da presente invenção. No contexto do CTL, a expressão "reconhece uma célula"se refere à ligação de um complexo de antígeno HLA-A2 e do peptídeo da presente invenção na superfície celular através de seu TCR e mostrando atividade citotóxica específica contra a célula. Aqui, "atividade citotóxica específica"se refere à exibição de atividade citotóxica contra a célula apresentando um complexo de an- tígeno HLA-A2 e o peptídeo da presente invenção, mas não outras células. Exemplos típicos do antígeno HLA-A2 contido em tal complexo incluem, mas não estão limitados a, HLA-A*0201 e HLA-A*0206.
VIII. Receptor de célula T (TCR)
[000111] A presente invenção também provê composições que incluem um polinucleotídeo codificando ambas as subunidades de TCR ou polinucleotídeos codificando cada uma das subunidades de TCR, em que o TCR pode ser ligar a um complexo de antígeno HLA-A2 e o peptídeo da presente invenção sobre a superfície de uma célula e métodos de uso das mesmas. Tais subunidades de TCR têm a habilidade em formar TCRs que conferem especificidade para células T contra células de tumor expressando MPHOSPH1. Ao usar os métodos conhecidos na técnica, os polinucleotídeos codificando cada uma das cadeias alfa- e beta- do TCR do CTL induzido com o peptídeo da presente invenção podem ser identificados (WO2007/032255 e Morgan e outros, J. Immunol. 171, 3288 (2003)). Por exemplo, o método de PCR pode ser preferivelmente usado. Os iniciadores de PCR para a análise podem ser, por exemplo, iniciador 5’-R (5’-gtctaccaggcattcgcttcat-3’) (SEQ ID NO:127) como iniciador lateral 5’ e iniciador 3-TRa-C (5’- tcagctggaccacagccgcagcgt-3’) (SEQ ID NO:128) específicos para região C de cadeia alfa de TCR, iniciador 3-TRb-C1 (5’- tcagaaatcctttctcttgac-3’) (SEQ ID NO:129) específico para região C1 de cadeia beta de TCR ou iniciador 3-TRbeta-C2 (5’- ctagtcctctggaatcctttctctt-3’) (SEQ ID NO:130) específico para região C2 de cadeia beta de TCR como iniciadores laterais 3’, mas não limitados aos mesmos. Os TCRs derivados podem se ligar a células-alvo apresentando o peptídeo MPHOSPH1 da presente invenção com alta avidez, e opcionalmente fazem a mediação de morte eficiente de células- alvo apresentando o peptídeo da presente invenção in vivo e in vitro.
[000112] O polinucleotídeo codificando ambas as subunidades de TCR ou polinucleotídeos codificando cada uma das subunidades de TCR podem ser incorporados a vetores adequados, por exemplo, vetores retrovirais. Esses vetores são bem conhecidos na técnica. Os poli- nucleotídeos ou os vetores incluindo-o geralmente podem ser transferidos para uma célula T (por exemplo, célula T positiva para CD8), por exemplo, uma célula T de um paciente. Vantajosamente, a presente invenção provê uma composição fora-de-prateleira que permite modificação rápida das células T de um próprio paciente (ou aquelas de outromamífero) para rapidamente e facilmente produzir células T modificadas tendo excelentes propriedades de morte de célula de câncer.
[000113] TCRs específicos contra os peptídeos da presente invenção devem ser capazes de reconhecer especificamente um complexo do peptídeo da presente invenção e antígeno HLA, dando uma atividade específica de célula T contra uma célula alvo apresentando um complexo do peptídeo da presente invenção e antígeno HLA quando o TCR é apresentado na superfície da célula T. A atividade necessária pode ser confirmada através de quaisquer métodos conhecidos que CTLs preparados através da introdução do polipeptídeo(s) codificando tais subuni- dades de TCR podem especificamente reconhecer tais células-alvo. Exemplos preferidos de tais métodos incluem, por exemplo, análise de tingimento de multímero de HLA usando moléculas de HLA e os peptí- deos da presente invenção e ensaio ELISPOT. Ao realizar o ensaio ELISPOT, pode ser confirmado que CTLs preparados através dos métodos acima podem reconhecer especificamente as células-alvo e que sinais gerados por tal reconhecimento podem ser transmitidos intracelularmente. Ainda, pode ser também confirmado através de métodos conhecidos que CTLs preparados através dos métodos acima têm atividadecitotóxica específica contra as células-alvo. Exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, ensaio de liberação de Cr usando células expressando ambos o antígeno HLA-A2 e MPHOSPH1.
[000114] Em um aspecto, a presente invenção provê CTLs que são preparados através de transdução com o polinucleotídeo codificando ambas as subunidades de TCR ou polinucleotídeos codificando cada uma das subunidades de TCR, em que o TCR pode se ligar a um complexo do peptídeo tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nos: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120 e antígeno HLA-A2 sobre a superfície de uma célula.
[000115] Os CTLs transduzidos são capazes de retornar para (homing to) células de câncer in vivo, e podem ser expandidos através de métodos de cultura bem conhecidos in vitro (por exemplo, Kawakami e outros, J. Immunol. 142, 3452-3461 (1989)). Os CTLs da presente invenção podem ser usados para formar uma composição imunogênica útil em um ou ambos o tratamento e a prevenção de câncer em um paciente com necessidade de terapia ou proteção (WO2006/031221). IX. Composições farmacêuticas
[000116] Uma vez que expressão de MPHOSPH1 é especificamente elevada em câncer, cujos exemplos incluem, mas não estão necessariamente limitados a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML câncer colorretal, câncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteossarcoma, câncer de próstata, câncer renal e tumor de tecido mole, comparado com tecidos normais, os peptídeos ou polinucleotídeos da presente invenção podem ser usados para um ou ambos o tratamento e a profilaxia de câncer. Desta maneira, a presente invenção provê um agente ou composição farmacêutico formulado para um ou ambos o tratamento e a profilaxia de câncer, tal agente ou composição incluindo um ou mais peptídeos ou polinucleotídeos da presente invenção como ingredientes ativos. Alternativamente, qualquer uma das exossomas ou APCs acima que apresentam um complexo do peptídeo da presente invenção e antígeno HLA pode ser usada como ingredientes ativos para agentes ou composições farma-cêuticos. Ainda, os CTLs mencionados acima que reconhecem uma célula apresentando um complexo do peptídeo da presente invenção e o antígeno HLA podem ser também usados como ingredientes ativos para agentes ou composições farmacêuticos da presente invenção.
[000117] Desta maneira, a presente invenção provê agentes ou composições que incluem pelo menos um ingrediente ativo selecionado dentre: (a) um ou mais peptídeos da presente invenção; (b) um ou mais polinucleotídeos codificando tal peptídeo conforme revelado aqui em uma forma expressável: (c) uma ou mais APCs ou exossomas da presente invenção; e (d) um ou mais CTLs da presente invenção.
[000118] Os agentes ou as composições farmacêuticos da presente invenção encontram uso como uma vacina. No contexto da presente invenção, a expressão "vacina"(também referida como uma composição imunogênica) se refere a uma composição que tem a função de melhorar, aumentar e / ou induzir imunidade antitumor quando da inoculação em animais. Em outras palavras, a presente invenção provê os agentes ou composições farmacêuticos da presente invenção para indução de uma resposta imune contra câncer em um indivíduo.
[000119] Os agentes ou as composições farmacêuticos da presente invenção podem ser usados ou para um ou ambos o tratamento e a prevenção de câncer em um indivíduo. Exemplos de tais indivíduos aos quais os agentes ou composições farmacêuticos podem ser aplicados incluem humanos, bem como outros mamíferos incluindo, mas não limitado a, camundongo, rato, porquinho-da-índia, coelho, gato, cachorro, ovelha, cabra, porco, gado, cavalo, macaco, babuíno e chimpanzé, particularmente um animal comercialmente importante ou um animal domesticado.
[000120] Em algumas modalidades, os agentes ou composições farmacêuticos da presente invenção podem ser formulados para a administração a um indivíduo cujo antígeno HLA é HLA-A2.
[000121] Em outra modalidade, a presente invenção também provê o uso de um ingrediente ativo na fabricação de um agente ou composição farmacêutico formulado ou para um ou ambos o tratamento e a prevenção de câncer ou tumor, incluindo a sua recorrência pós- operatória, tal ingrediente ativo selecionado dentre: (a) um peptídeo da presente invenção; (b) um polinucleotídeo codificando tal peptídeo conforme revelado aqui em uma forma expressável; (c) uma APC ou uma exossoma apresentando um peptídeo da presente invenção sobre sua superfície; e (d) uma célula T citotóxica da presente invenção.
[000122] Alternativamente, a presente invenção provê ainda um ingrediente ativo para uso em um ou ambos o tratamento e a prevenção de um câncer ou tumor, tal ingrediente ativo selecionado dentre: (a) um peptídeo da presente invenção; (b) um polinucleotídeo codificando tal peptídeo conforme aqui revelado em uma forma expressável; (c) uma APC ou um exossoma apresentando um peptídeo da presente invenção em sua superfície; e (d) uma célula T citotóxica da presente invenção.
[000123] Alternativamente, a presente invenção provê ainda um método ou processo para fabricação de uma composição ou agente farmacêutico para ou um ou ambos o tratamento e a prevenção de um câncer ou tumor, em que o método ou processo inclui a etapa de formulação de um carreador farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável com um ingrediente ativo selecionado dentre: (a) um peptídeo da presente invenção; (b) polinucleotídeo codificando tal peptídeo conforme aqui revelado em uma forma expressável; (c) uma APC ou um exossoma da presente invenção; e (d) uma célula T citotóxica da presente invenção.
[000124] Em outra modalidade, a presente invenção também provê um método ou processo para fabricação de uma composição ou agentefarmacêutico para ou um ou ambos o tratamento e a prevenção de um câncer ou tumor, em que o método ou processo inclui as etapas de mistura de um ingrediente ativo com um carreador farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável, em que o ingrediente ativo é selecionado dentre: (a) um peptídeo da presente invenção; (b) polinucleotídeo codificando tal peptídeo conforme aqui revelado em uma forma expressável; (c) uma APC ou um exossoma da presente invenção; e (d) uma célula T citotóxica da presente invenção.
[000125] Em outra modalidade, a presente invenção também provê o método para um ou ambos o tratamento e a prevenção de câncer ou tumor, em que o método compreende a etapa de administrar a um indivíduo pelo menos um ingrediente ativo selecionado dentre: (a) um peptídeo da presente invenção; (b) um polinucleotídeo codificando tal peptídeo conforme revelado aqui em uma forma expressável; (c) uma APC ou um exossoma da presente invenção; e (d) uma célula T citotóxica da presente invenção.
[000126] De acordo com a presente invenção, peptídeos tendo uma sequência de aminoácido selecionada dentre SEQ ID NOs: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120 foram verificados ser peptídeos de epitopo restritos a HLA-A2 e então servem como candidatos que podem induzir resposta imune específica contra câncer expressando HLA-A2 e MPHOSPH1 em um indivíduo. Desta maneira, os agentes ou composições farmacêuticos da presente invenção que incluem qualquer um desses peptídeos, com a sequência de aminoácido de SEQ ID Nos: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 ou 120, são particularmente adequados para a administração a indivíduos cujo antígeno HLA é HLA-A2. Exemplo particularmente preferido desses peptídeos é o peptídeo tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120 que foi confirmado ter a habilidade em induzir CTLs se direcionando a células de câncer expressandoantígeno HLA-A2 e MPHOSPH1. Desta maneira, em modalidades preferidas, os agentes ou composições farmacêuticos da presente invenção incluirão o peptídeo tendo uma sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 120 ou uma versão modificada do mesmo ou incluem um polinucleotídeo codificando tal peptídeo. O mesmo se aplica a agentes ou composições farmacêuticos que incluem polinucleotídeos codificando qualquer um desses peptídeos (isto é, os polinucleotídeos da presente invenção).
[000127] Cânceres a serem tratados pelos agentes ou composições farmacêuticos da presente invenção incluem qualquer câncer em que MPHOSPH1 seja expresso (por exemplo, é superexpresso), cujos exemplo incluem, mas não estão limitados a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, câncer colorretal, câncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteossarcoma, câncer de próstata, câncer renal e tumor de tecido mole.
[000128] Os agentes ou as composições farmacêuticos da presente invenção podem conter em adição aos ingredientes ativos mencionados acima, tais como outros peptídeos que têm a habilidade em induzir CTLs contra células cancerosas, outros polinucleotídeos codificando os outros peptídeos, outras células que apresentam os outros peptídeos e similar. Exemplos de tais "outros"peptídeos tendo a habilidade em induzir CTLs contra células cancerosas incluem, mas não estão limitados a, antígenos específicos de câncer (por exemplo, TAAs identificados).
[000129] Se necessário, os agentes ou composições farmacêuticos da presente invenção podem incluir opcionalmente outras substâncias terapêuticas como um ingrediente ativo adicional, contanto que a substância não iniba o efeito antitumoral do ingrediente ativo da presente invenção (isto é, o peptídeo, polinucleotídeo, exossoma, APC, CTL da presente invenção). Por exemplo, as formulações podem incluir substâncias anti-inflamatórias, analgésicos, quimioterapêuticos e similar. Em adição a outras substâncias terapêuticas no medicamento em si, os medicamentos da presente invenção podem ser também administrados sequencialmente ou concomitantemente com o um ou mais agentes ou composições farmacológicos. As quantidades de medicamento e agente ou composição farmacológico dependem, por exem-plo, de qual tipo de agente(s) ou composição(ões) farmacológico(s) é usado, a doença sendo tratada e o programa e vias de administração.
[000130] Aqueles versados na técnica vão reconhecer prontamente que, em adição aos ingredientes particularmente mencionados aqui, os agentes ou as composições farmacêuticos da presente invenção podem incluir outras substâncias convencionais na técnica com relação ao tipo de formulação em questão (por exemplo, cargas, ligantes, diluentes, excipientes, etc.).
[000131] Em uma modalidade da presente invenção, os agentes ou as composições farmacêuticos da presente invenção podem ser embalados em artigos de fabricação, por exemplo, como estojos contendo materiais úteis para tratamento das condições patológicas da doença a ser tratada, por exemplo, câncer. O artigo de fabricação pode incluir um recipiente de qualquer um dos presentes agentes ou composições farmacêuticos com um rótulo. Recipientes adequados incluem garrafas, frascos e tubos de teste. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais, tal como vidro ou plástico. O rótulo no recipiente deve indicar que o agente ou composição é usado para tratamento ou prevenção de uma ou mais condições da doença. O rótulo pode também indicar orientações para administração e outros.
[000132] Em adição ao recipiente descrito acima, um estojo incluindo um agente ou composição farmacêutico da presente invenção pode incluir ainda opcionalmente um segundo recipiente contendo um dilu- ente farmaceuticamente aceitável. Ele pode ainda incluir outros materiaisdesejáveis de um ponto de vista comercial e de usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para uso. Os agentes ou composições farmacêuticos da presente invenção podem, se desejado, ser embalados em uma embalagem ou dispositivo de aplicação que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária contendo o ingrediente ativo. A embalagem pode, por exemplo, incluir folha de metal ou plástico, tal como uma embalagemblister. A embalagem ou dispositivo de aplicação pode ser acompanhado por instruções para administração. (1) Composições farmacêuticas contendo os peptídeos como o ingrediente ativo:
[000133] Os peptídeos da presente invenção podem ser administrados diretamente como agentes ou composição farmacêuticos ou, se necessário, podem ser formulados através de métodos de formulação convencionais. No último caso, em adição aos peptídeos da presente invenção, carreadores, excipientes e similar que são geralmente usados para fármacos podem ser incluídos conforme apropriado sem limitações particulares. Exemplos de tais carreadores incluem, mas não estão limitados a, água esterilizada, solução salina fisiológica, tampão de fosfato, fluido de cultura e similar. Ainda, as substâncias, agentes ou composições farmacêuticos podem conter, conforme necessário, estabilizadores, suspensões, preservativos, tensoativos e similar. Os agentes ou composições farmacêuticos da presente invenção podem ser usados para propósitos anticâncer.
[000134] Os peptídeos da presente invenção podem ser preparados em combinação, o que inclui dois ou mais peptídeos da presente in- venção, para induzir CTL in vivo. Os peptídeos podem estar em um coquetel ou podem ser conjugados uns com os outros usando técnicas padrão. Por exemplo, os peptídeos podem ser quimicamente ligados ou expressos como uma sequência de polipeptídeo de fusão única que pode ter um ou vários aminoácidos como um ligante (por exemplo, li- gante Lisina: K.S. Kawamura e outros, J. Immunol. 2002, 168: 57095715). Os peptídeos na combinação podem ser iguais ou diferentes. Através da administração dos peptídeos da presente invenção, os pep- tídeos são apresentados em uma alta densidade pelos antígenos HLA em APCs, então CTLs que reagem especificamente com relação ao complexo formado entre o peptídeo exibido e o antígeno HLA são induzidos. Alternativamente, APCs (por exemplo, DCs) podem ser removidas de um indivíduo e então estimuladas pelos peptídeos da presente invenção para obter APCs que apresentam qualquer um dos peptídeos da presente invenção em sua superfície celular. Essas APCs podem ser readministradas ao indivíduo para induzir CTLs nos indivíduos e, como resultado, agressividade com relação a endotélio associado a tumor pode ser aumentada.
[000135] Os agentes ou as composições farmacêuticos da presente invenção que incluem qualquer um dos peptídeos da presente invenção como ingredientes ativos podem também incluir um adjuvante de maneira que a imunidade celular será estabelecida efetivamente. Alternativamente, o agente ou composição farmacêutico da presente invenção pode ser administrado com outros ingredientes ativos ou podem ser administrados através de formulação em grânulos. Um adjuvante se refere a qualquer composto, substância ou composição que aumenta a resposta imune contra a proteína quando administrado junto (ou sucessivamente) com a proteína tendo atividade imunológica. Um adjuvante que pode ser aplicado inclui aqueles descritos na literatura (Clin. Microbiol Rev. 1994, 7: 277-89). Adjuvantes exemplares in- cluem fosfato de amônio, hidróxido de alumínio, alume, toxina do cólera, toxina de salmonella. Adjuvante incompleto de Freund (IFA), adjuvante completo de Freund (CFA), IS-COMatrix, GM-CSF, CpG, emulsão O/A, e similar, mas não são limitados a eles. Ainda, formulações de lipossoma, formulações granulares em que o peptídeo é ligado a contas de diâmetro de alguns micrometros e formulações em que um lipídeo é ligado ao peptídeo podem ser convenientemente usadas.
[000136] Em outra modalidade da presente invenção, os peptídeos da presente invenção podem ser também administrados na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Exemplos preferidos dos sais incluem sais com um metal alcalino, sais com um metal, sais com uma base orgânica, sais com uma amina, sais com um ácido orgânico (ácidoacético, ácido fórmico, ácido propiônico, ácido fumárico, ácido ma- leico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido málico, ácido oxálico, ácido benzoico, ácido metanossulfônico e outros) e sais com um ácido inorgânico (ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico e outros). Conforme aqui usado, a expressão "sal far- maceuticamente aceitável"se refere àqueles sais que retêm a eficácia e as propriedades biológicas do composto e que são obtidos através de reação com ácidos ou bases inorgânicos ou orgânicos.
[000137] Em algumas modalidades, os agentes ou composições far-macêuticos da presente invenção incluem um componente que dá origem a CTL. Lipídeos foram identificados como substâncias capazes de dar origem a CTL in vivo contra antígenos virais. Por exemplo, resíduos de ácido palmítico podem ser ligados aos grupos épsilon- e alfa-amino de um resíduo lisina e então ligados a um peptídeo da presente invenção. O peptídeo lipidado pode ser então administrado ou diretamente em uma micela ou partícula, incorporado a um lipossoma ou emulsifica- do em um adjuvante. Como outro exemplo de origem a partir de lipídeo de respostas de CTL, lipoproteínas de E. coli, tal como tripalmitoil-S- glicerilcisteinil-seril-serina (P3CSS), podem ser usadas para dar origem a CTL quando covalentemente ligadas a um peptídeo apropriado (vide, por exemplo, Deres e outros, Nature 1989, 342: 561-4).
[000138] Exemplos de métodos de administração adequados incluem, mas não estão necessariamente limitados a, injeções oral, intradermal, subcutânea, intramuscular, intraóssea, peritoneal e intravenosa, ou similar, e administração sistêmica ou administração local à vizinhança dos sítios direcionados (isto é, injeção direta). A administração pode ser realizada através de administração única ou reforçada por múltiplas administrações. A dose dos peptídeos da presente invenção pode ser ajustada apropriadamente de acordo com a doença a ser tratada, idade do paciente, peso, método de administração e similar, e é geralmente 0,001 mg a 1.000 mg, por exemplo, 0,01 mg a 100 mg, por exemplo, 0,1 mg a 10 mg, e pode ser administrada uma vez alguns dias a alguns meses. Um versado na técnica determina prontamente dosagens adequadas e ótimas. (2) Composições farmacêuticas contendo polinucleotídeos como ingrediente ativo:
[000139] Os agentes ou as composições farmacêuticos da presente invenção podem também incluir polinucleotídeos codificando o(s) pep- tídeo(s) revelado(s) aqui em uma forma expressável. Aqui, a expressão "em uma forma expressável"significa que o polinucleotídeo, quando introduzido em uma célula, será expresso in vivo como um po- lipeptídeo que induz imunidade antitumor. Em uma modalidade ilustrativa, a sequência de ácido nucleico do polinucleotídeo de interesse inclui elementos reguladores necessários para expressão do polinucleo- tídeo. O polinucleotídeo(s) pode ser equipado de maneira a obter inserção estável no genoma da célula alvo (vide, por exemplo, Thomas, K.R. & Capecchi, M.R., Cell 1987, 51: 503-12 para uma descrição de vetores de cassete de recombinação homólogos. Vide também, por exemplo, Wolff e outros, Science 1990, 247: 1465-8; Patentes U.S. Nos. 5.580.859; 5.589.466; 5.804.566; 5.739.118; 5.736.524; 5.679.647; e WO 98/04720). Exemplos de tecnologias de aplicação à base de DNA incluem "DNA nu", aplicação facilitada (mediada por bu- pivacaina, polímeros, peptídeo), complexos de lipídeo catiônico e aplicação mediada por partícula ("pistola de gene") ou mediada por pressão (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.922.687).
[000140] Os peptídeos da presente invenção podem ser também ex-pressosatravés de vetores virais ou bacterianos. Exemplos de vetores de expressão incluem hospedeiros virais atenuados, tal como vaccínia ou fowlpox. Esta abordagem envolve o uso de vírus vaccínia, por exemplo, como um vetor para expressar sequências de nucleotídeo que codificam o peptídeo. Quando a introdução em um hospedeiro, o vírus vaccínia recombinante expressa o peptídeo imunogênico, e então elicita uma resposta imune. Vetores de vaccínia e métodos úteis em protocolos de imunização são descritos na, por exemplo, Patente U.S. No. 4.722.848. Outro vetor é BCG (Bacille Calmette Guerin). Vetores de BCG são descritos em Stover e outros, Nature 1991, 351: 456-60. Uma ampla variedade de outros vetores úteis para administração ou imunização terapêutica, por exemplo, vetores de vírus adeno e adenoassoci- ado, vetores retrovirais, vetores de Salmonella tiphy, vetores da toxina antrax desintoxicada, e similar, será aparente. Vide, por exemplo, Shata e outros, Mol. Med. Today 2000, 6: 66-71; Shedlock e outros, J. Leukoc. Biol. 2000, 68: 793-806; Hipp e outros, In vivo 2000, 14: 571-85.
[000141] Aplicação de um polinucleotídeo a um paciente pode ser ou direta, caso em que o paciente é diretamente exposto a um vetor car-regandopolinucleotídeo, ou indireta, caso em que células são primeiro transformadas com o polinucleotídeo de interesse in vitro, então as células são transplantadas no paciente. Essas duas abordagens são conhecidas, respectivamente, como terapias de gene in vivo e ex vivo.
[000142] Para revisões gerais dos métodos de terapia de gene vide Goldspiel e outros, Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu e Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol Toxicol. 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann. Rev. Biochem. 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215). Métodos geralmente conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombinante que são aplicáveis à presente invenção são descritos por Ausubel e outros em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1993; e por Krieger em Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990.
[000143] Tal administração de peptídeos, administração de polinu- cleotídeos pode ser realizada através de injeções oral, intradermal, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraóssea e/ou peritoneal, ou similar, e via administração sistêmica ou administração local à vizinhança dos sítios alvos encontra uso. A administração pode ser realizadaatravés de administração única ou reforçada por administrações múltiplas. A dose do polinucleotídeo no carreador adequado ou células transformadas com o polinucleotídeo codificando os peptídeos da invenção pode ser ajustada apropriadamente de acordo com a doença a ser tratada, idade do paciente, peso, método de administração, e similar, e é geralmente 0,00,1 mg a 1000 mg, por exemplo, 0,01 mg a 100 mg, por exemplo, 0,1 mg a 10 mg, e pode ser administrada uma vez em alguns dias ou uma vez em alguns meses. Um versado na técnica pode selecionar apropriadamente a dose adequada.
X. Métodos usando os Peptídeos, Exossomas, APCs e CTLs
[000144] Os peptídeos e polinucleotídeos da presente invenção podem ser usados para preparação ou indução de APCs e CTLs. Os exossomas e as APCs da presente invenção podem ser também usados para indução de CTLs. Os peptídeos, polinucleotídeos, exosso- mas e APCs podem ser usados em combinação com quaisquer outros compostos contanto que os compostos adicionais não inibam capacidade de indução de CTL. Desta maneira, qualquer um dos agentes ou composições farmacêuticos da presente invenção mencionados acima pode ser usado para indução de CTLs. Em adição a esses, aqueles incluindo os peptídeos e polinucleotídeos podem ser também usados para indução de APCs conforme explicado abaixo.
(1) Métodos de indução de células apresentando antígeno (APCs):
[000145] A presente invenção provê métodos de indução de APCs com capacidade de indução de CTL usando os peptídeos ou polinu- cleotídeos da presente invenção.
[000146] Os métodos da presente invenção incluem a etapa de contato de APCs com os peptídeos da presente invenção in vitro, ex vivo ou in vivo. Por exemplo, o método incluindo a etapa de contato de APCs com os peptídeos da presente invenção ex vivo pode incluir as etapas de: a: coleta de APCs de um indivíduo; e b: contato das APCs da etapa a com o peptídeo da presente invenção.
[000147] As APCs não são limitadas a um tipo particular de células e incluem DCs, células Langerhans, macrófagos, células B e células T ativadas, que são conhecidas apresentar antígenos proteináceos em sua superfície celular de maneira a serem reconhecidas por linfócitos. Preferivelmente, DCs podem ser usadas uma vez que elas têm a capacidade de indução de CTL mais forte entre APCs. Qualquer peptí- deo da presente invenção pode ser usado sozinho ou em combinação com outros peptídeos da presente invenção ou peptídeos induzíveis por CTL derivados de TAAs que não MPHOSPH1.
[000148] Por outro lado, quando os peptídeos da presente invenção são administrados a um indivíduo, as APCs são contatadas com os peptídeos in vivo e, consequentemente, as APCs com capacidade de indução de CTL são induzidas no corpo do indivíduo. Desta maneira, o método da presente invenção inclui administração dos peptídeos da presente invenção a um indivíduo para induzir APCs com capacidade de indução de CTL no corpo do indivíduo. Similarmente, quando os polinucleotídeos da presente invenção são administrados a um indivíduo em uma forma expressável, os peptídeos da presente invenção são expressos e contatados com APCs in vivo e, consequentemente, APCs com capacidade de indução de CTL são induzidas no corpo do indivíduo. Desta maneira, o método da presente invenção pode também incluir administração dos polinucleotídeos da presente invenção a um indivíduo para induzir APCs com capacidade de indução de CTL no corpo do indivíduo. A expressão "forma expressável" é descrita acima na seção "IX. Composições Farmacêuticas, (2) Composições farmacêuticas contendo polinucleotídeos como o ingrediente ativo".
[000149] Ainda, o método da presente invenção pode incluir introdução do polinucleotídeo da presente invenção em APCs para induzir APCs com capacidade de indução de CTL. Por exemplo, o método pode incluir as etapas de: a: coleta de APCs de um indivíduo; e b: introdução de um polinucleotídeo codificando o peptídeo da presente invenção em uma APC.
[000150] A etapa b pode ser realizada conforme acima descrito na seção "VI. Células apresentando antígeno".
[000151] Alternativamente, a presente invenção provê um método para preparação de uma célula apresentando antígeno (APC) que induz especificamente atividade de CTL contra MPHOSPH1, em que o método pode incluir uma das etapas que seguem: (a) contato de uma APC com um peptídeo da presente in- venção in vitro, ex vivo ou in vivo; e (b) introdução de um polinucleotídeo codificando um peptí- deo da presente invenção em uma APC.
[000152] Alternativamente, a presente invenção provê métodos para indução de APC tendo capacidade de indução de CTL, em que os métodos incluem a etapa selecionada dentre: (a) contato de uma APC com o peptídeo da presente invenção; (b) introdução do polinucleotídeo codificando o peptídeo da presente invenção em uma APC.
[000153] Os métodos da presente invenção podem ser realizados in vitro, ex vivo ou in vivo. Preferivelmente, os métodos da presente invenção podem ser realizados in vitro ou ex vivo. APCs usadas para indução de APCs tendo capacidade de indução de CTL podem ser preferivelmente APCs expressando antígeno HLA-A2. Tais APCs podem ser preparadas através dos métodos bem conhecidos na técnica a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) obtidas de um indivíduo cujo antígeno HLA é HLA-A2. As APCs induzidas pelo método da presente invenção podem ser APCs que apresentam um complexo do peptídeo da presente invenção e antígeno HLA (antí- geno HLA-A2) em sua superfície. Quando APCs induzidas pelo método da presente invenção são administradas ao indivíduo a fim de induzir respostas imunes contra câncer no indivíduo, o indivíduo é preferivelmente o mesmo que as APCs são derivadas. No entanto, o indivíduo pode ser um diferente do doador de APC contanto que o indivíduo tenha o mesmo tipo de HLA que o doador da APC.
[000154] Em outra modalidade, a presente invenção provê agentes ou composições para uso na indução de uma APC tendo capacidade de indução de CTL, e tais agentes ou composições incluem um ou mais peptídeos ou polinucleotídeos da presente invenção.
[000155] Em outra modalidade, a presente invenção provê o uso do peptídeo da presente invenção ou do polinucleotídeo codificando o pep- tídeo na fabricação de um agente ou composição formulado para indução de APCs. Alternativamente, a presente invenção provê ainda o pep- tídeo da presente invenção ou o polipeptídeo codificando o peptídeo para uso em indução de uma APC tendo capacidade de indução de CTL.
(2) Métodos de indução de CTLs:
[000156] A presente invenção também provê métodos para indução de CTLs usando os peptídeos, polinucleotídeos, exossomas ou APCs da presente invenção. A presente invenção também provê métodos para indução de CTLs usando um polinucleotídeo codificando ambas as subunidades de TCR ou polinucleotídeos codificando cada uma das subunidades de TCR, em que o TCR pode reconhecer (se ligar a) um complexo do peptídeo da presente invenção e antígeno HLA apresentado sobre a superfície de uma célula. Preferivelmente, os métodos para indução de CTLs podem incluir pelo menos uma etapa selecionada dentre: a: contato de uma célula T positiva para CD8 com uma célula apresentando antígeno e/ou um exossoma que apresenta em sua superfície um complexo de um antígeno HLA e um peptídeo da presente invenção; e b: introdução de um polinucleotídeo codificando ambas as subunidades de TCR ou polinucleotídeos codificando cada uma das subunidades de TCR em uma célula T positiva para CD8, em que o TCR pode reconhecer (se ligar a) um complexo de um peptídeo da presente invenção e um antígeno HLA apresentado sobre a superfície de uma célula.
[000157] Quando os peptídeos, os polinucleotídeos, APCs ou exos- somas da presente invenção são administrados a um indivíduo, CTLs são induzido no corpo do indivíduo e a resposta imune se direcionando a células de câncer expressando MPHOSPH1 é aumentada. Desta maneira, os métodos da presente invenção podem incluir a etapa de administração dos peptídeos, dos polinucleotídeos, das APCs ou exossomas da presente invenção a um indivíduo.
[000158] Alternativamente, CTLs podem ser também induzidos usando-os ex vivo ou in vivo e, após indução de CTL, os CTLs ativados podem ser retornados para o indivíduo. Por exemplo, o método pode incluir as etapas de: c: coleta de APCs de um indivíduo; d: contato das APCs da etapa a com o peptídeo; e e: cocultura das APCs da etapa b com células T positivas para CD8.
[000159] As APCs a serem coculturadas com as células T positivas para CD8 na etapa c acima podem ser também preparadas através da transferência de um polinucleotídeo da presente invenção para APCs conforme descrito acima na seção "VI. Células apresentando antíge- no", embora a presente invenção não seja limitada a elas e então compreende quaisquer APCs que apresentem eficazmente em sua superfície um complexo de um antígeno HLA e um peptídeo da presente invenção.
[000160] Poderiam ser utilizados opcionalmente exossomas que apresentam em sua superfície um complexo de um antígeno HLA e o peptídeo da presente invenção ao invés das APCs mencionadas acima. A saber, a presente invenção pode incluir a etapa de cocultura de exos- somas apresentando em sua superfície um complexo de um antígeno HLA e o peptídeo da presente invenção. Tais exossomas podem ser preparados através dos métodos descritos acima na seção "V. Exos- somas". APCs ou exossomas usados para indução de CTLs podem ser preferivelmente APCs ou exossomas que apresentam em sua superfície um complexo do peptídeo da presente invenção e antígeno HLA-A2.
[000161] Ainda, um CTL pode ser induzido através da introdução de um polinucleotídeo codificando ambas as subunidades de TCR ou polinucleotídeos codificando cada uma das subunidades de TCR em uma célula T positiva para CD8, em que o TCR pode se ligar a um complexo do peptídeo da presente invenção e antígeno HLA apresentado sobre a superfície de uma célula. Tal transdução pode ser realizada conforme acima descrito na seção "VIII. Receptor de Célula T".
[000162] Os métodos da presente invenção podem ser realizados in vitro, ex vivo ou in vivo. Preferivelmente, os métodos da presente invenção podem ser realizados in vitro ou ex vivo. Células T positivas para CD8 usadas para indução de CTLs podem ser preparadas através de métodos bem conhecidos na técnica a partir de PBMCs obtidas de um indivíduo. Em modalidades preferidas, um doador das células T positivas para CD8 pode ser um indivíduo cujo antígeno HLA é HLA- A2. Os CTLs induzidos através dos métodos da presente invenção podem ser CTLs que podem reconhecer células apresentando um complexo do peptídeo da presente invenção e um antígeno HLA em sua superfície. Quando CTLs induzidos através do método da presente invenção são administrados a um indivíduo a fim de induzir respostas imunes contra câncer no indivíduo, o indivíduo é preferivelmente o mesmo que as células T positivas para CD8 são derivadas. No entanto, o indivíduo pode ser um diferente do doador de célula T positiva para CD8 contanto que o indivíduo tenha o mesmo tipo de HLA que o doador de célula T positiva para CD8.
[000163] Ainda, a presente invenção provê um método ou processo para fabricação de um agente ou composição farmacêutico para indução de CTLs, em que o método ou processo inclui a etapa de mistura ou formulação do peptídeo da presente invenção com um carreador farmaceuticamente aceitável.
[000164] Em outra modalidade, a presente invenção provê um agente ou composição para indução de CTL, em que o agente ou composição compreende um ou mais peptídeo(s), um ou mais polinucleotí- deo(s) ou uma ou mais APCs ou exossomas da presente invenção. Em outra modalidade, a presente invenção provê o uso do peptídeo, polinucleotídeo ou APC ou exossoma da presente invenção na fabricação de um agente ou composição formulado para indução de um CTL. Alternativamente, a presente invenção provê ainda o peptídeo, o polinucleotídeo ou APC ou exossoma da presente invenção para uso na indução de um CTL.
(3) Métodos de indução de resposta imune
[000165] Além disso, a presente invenção provê métodos de indução de uma resposta imune contra doenças relacionadas a MPHOSPH1. Doenças compreendidas incluem câncer, cujos exemplos incluem, mas não estão limitados a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, câncer colorretal, câncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteossarcoma, câncer de próstata, câncer renal e tumor de tecido mole.
[000166] Os métodos da presente invenção podem incluir a etapa de administração a um indivíduo de agente(s) ou composição(ões) contendo qualquer um dos peptídeos da presente invenção ou polinucleo- tídeos codificando os mesmos. O método da presente invenção também contempla a administração de exossomas ou APCs apresentando qualquer um dos peptídeos da presente invenção. Quanto a detalhes vide o item "IX. Composições farmacêuticas", particularmente a parte descrevendo o uso dos agentes e composições farmacêuticos da presente invenção como vacinas. Ainda, os exossomas e APCs que podem ser empregados para os presentes métodos para indução de resposta imune são descritos em detalhes sob os itens "V. Exossomas", "VI. Células apresentando antígeno (APCs)" e (1) e (2) de "X. Métodos usando Peptídeos, Exossomas, APCs e CTLs", supra. Em modalidades preferidas, os indivíduos tratados através do método da presente invenção podem ser indivíduos cujo antígeno HLA é HLA-A2.
[000167] A presente invenção também provê um método ou um processo para fabricação de um agente ou uma composição farmacêutica de indução de resposta imune, em que o método pode incluir a etapa de mistura ou formulação de um polipeptídeo ou polinucleotídeo da presente invenção com um carreador farmaceuticamente aceitável. Alternativamente, o método da presente invenção pode incluir a etapa de administração de uma vacina ou uma composição farmacêutica da presente invenção que contém: (a) um peptídeo da presente invenção; (b) um ácido nucleico (polinucleotídeo) codificando tal pep- tídeo conforme aqui revelado em uma forma expressável; (c) uma APC ou um exossoma apresentando um peptídeo da presente invenção em sua superfície; ou (d) um CTL da presente invenção.
[000168] No contexto da presente invenção, um câncer expressando MPHOSPH1 pode ser tratado com esses ingredientes ativos. Exemplos de tal câncer incluem, mas não são limitados a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, câncer colorretal, câncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteossarcoma, câncer de próstata, câncer renal e tumor de tecido mole. Desta maneira, antes da administração das vacinas ou composições farmacêuticas incluindo os ingredientes ativos, é preferível confirmar se o nível de expressão de MPHOSPH1 nas células ou tecidos a serem tratados é aumentado comparado com células normais do mesmo órgão. Desta maneira, em uma modalidade, a presente invenção provê um método para tratamento de câncer expressando MPHOSPH1, método que po-de incluir as etapas de: (i) determinação do nível de expressão de MPHOSPH1 em células ou tecido(s) obtidos de um indivíduo com o câncer a ser tratado; (ii) comparação do nível de expressão de MPHOSPH1 com controle normal; e (iii) administração de pelo menos um componente selecionado dentre as etapas (a) e (d) descritas acima a um indivíduo com câncer superexpressando MPHOSPH1 comparado com controle normal.
[000169] Alternativamente, a presente invenção também provê uma vacina ou composição farmacêutica que inclui pelo menos um componente selecionado dentre (a) e (d) descritos acima para uso em administração a um indivíduo tendo câncer superexpressando MPHOSPH1. Em outras palavras, a presente invenção provê ainda um método para identificação de um indivíduo a ser tratado com um polipeptídeo MPHOSPH1 da presente invenção, tal método incluindo a etapa de determinação de um nível de expressão de MPHOSPH1 em células ou tecido(s) derivados do indivíduo, em que um aumento do nível comparado com um nível de controle normal do gene indica que o indivíduo pode ter câncer que pode ser tratado com o polipeptídeo MPHOSPH1 da presente invenção. O método de identificação de um indivíduo a ser tratado com câncer da presente invenção é descrito em mais detalhes abaixo.
[000170] Qualquer célula ou tecido derivado de indivíduo pode ser usado para a determinação da expressão de MPHOSPH1 contanto que ele inclua o produto de transcrição ou tradução objeto de MPHOSPH1. Exemplos de amostras adequadas incluem, mas não estão limitados a, tecidos e fluidos corporais, tais como sangue, esputo e urina. Preferivelmente, a amostra de célula ou tecido derivada do indivíduo contém uma população de célula incluindo uma célula epitelial, mais preferivelmente uma célula epitelial cancerosa ou uma célula epi- telial derivada de tecido suspeito de ser canceroso. Ainda, se necessário, a célula pode ser purificada dos tecidos e fluidos corporais obtidos e então usada como a amostra derivada do indivíduo. Um indivíduo a ser tratado através do presente método é preferivelmente um mamífero.Mamíferos ilustrativos incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, humano, primata não humano, camundongo, rato, cachorro, gato, cavalo e vaca.
[000171] De acordo com a presente invenção, o nível de expressão de MPHOSPH1 em células ou tecidos obtidos de um indivíduo pode determinado. O nível de expressão pode ser determinado no nível de produto de transcrição (ácido nucleico), usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o mRNA de MPHOSPH1 pode ser quantificado usando sondas através de métodos de hibridização (por exemplo,hibridização Northern). A detecção pode ser realizada em um chip, uma matriz ou similar. O uso de uma matriz pode ser preferível para detecção do nível de expressão de MPHOSPH1. Aqueles versados na técnica podem preparar tais sondas utilizando a informação de sequência de MPHOSPH1. Por exemplo, o cDNA de MPHOSPH1 pode ser usado como as sondas. Se necessário, as sondas podem ser marcadas com um marcador adequado, tais como corantes, substâncias fluorescentes e isótopos, e o nível de expressão do gene pode ser detectado como a intensidade dos marcadores hibridizados.
[000172] Ainda, o produto de transcrição de MPHOSPH1 (por exemplo, SEQ ID NO: 125) pode ser quantificado usando iniciadores através de métodos de detecção à base de amplificação (por exemplo, RT-PCR). Tais iniciadores podem ser preparados com base na informação de sequência disponível do gene.
[000173] Especificamente, uma sonda ou um iniciador usado para o presente método hibridiza sob condições adstringentes, moderadamente adstringentes ou de baixa adstringência para o mRNA de MPHOSPH1. Conforme aqui usado, a expressão "condições (de hibridi- zação) adstringentes" se refere a condições sob as quais uma sonda ou um iniciador vai hibridizar para sua sequência alvo, mas não para outras sequências. Condições adstringentes são dependentes da sequência e serão diferentes sob circunstâncias diferentes. Hibridização específica de sequências mais longas é observada em temperaturas mais altas do que as sequências mais curtas. Em geral, a temperatura de uma condição adstringente é selecionada para ser cerca de 5 graus C menor do que o ponto de fusão térmico (Tm) para uma sequência específica em resistência iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob resistência iônica, pH e concentração de ácido nucleico definidas) em que 50% das sondas complementares à sua sequência alvo hibridizam para a sequência alvo em equilíbrio. Uma vez que as sequências alvo estão geralmente presentes em excesso, em Tm, 50% das sondas são ocupadas em equilíbrio. Tipicamente, condições adstringentes serão aquelas em que a concentração de sal é menos do que cerca de 1,0 M de íon de sódio, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de íon de sódio (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30 graus C para sondas ou iniciadores curtos (por exemplo, 10 a 50 nucleotí- deos) e pelo menos cerca de 60 graus C para sondas ou iniciadores mais longos. Condições adstringentes podem também ser obtidas com a adição de substâncias de desestabilização, tal como formamida.
[000174] Uma sonda ou um iniciador da presente invenção é tipicamente um oligonucleotídeo substancialmente purificado. O oligonucle- otídeo inclui tipicamente uma região de sequência de nucleotídeo que hibridiza sob condições adstringentes para pelo menos cerca de 2000, 1000, 500, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 ou 25 sequências de nucleotídeo de filamento de sentido consecutivas de um ácido nucleico incluindo um MPHOSPH1, ou uma sequência de nucleotídeo de filamento antissentido de um ácido nucleico incluindo um MPHOSPH1, ou de um mutante de ocorrência natural dessas sequências. Em particular, por exemplo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo tendo 5-50 de comprimento pode ser usado como um iniciador para amplificação dos genes, a serem detectados. Mais preferivelmente, mRNA ou cDNA de um gene MPHOSPH1 pode ser detectado com sonda ou iniciador de oligonucleotídeo de um tamanho específico, geralmente 15-30 pb de comprimento. O tamanho pode variar de pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 12 nucleotídeos, pelo menos 15 nucleotídeos, pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotí- deos, pelo menos 30 nucleotídeos e as sondas e os iniciadores podem variar em tamanho de 5-10 nucleotídeos, 10-15 nucleotídeos, 15-20 nucleotídeos, 20-25 nucleotídeos e 25-30 nucleotídeos. Em modalidades preferidas, o comprimento da sonda ou do iniciador de oligonucle- otídeo pode ser selecionado a partir de 15-25. Procedimentos de ensaio, dispositivos ou reagentes para a detecção de gene usando tal sonda ou iniciador de oligonucleotídeo são bem conhecidos (por exemplo, micromatriz de oligonucleotídeo ou PCR). Nesses ensaios, sondas ou iniciadores podem também incluir sequências de marcação ou ligantes. Ainda, sondas ou iniciadores podem ser modificados com marcador detectável ou ligante de afinidade a ser capturado. Alternativamente, em procedimentos de detecção baseados em hibridização, um polinucleotídeo tendo algumas centenas (por exemplo, cerca de 100-200) de bases a alguns quilo bases (por exemplo, cerca de 10002000) de comprimento pode ser também usado para uma sonda (por exemplo, ensaio northern blotting ou análise de micromatriz de cDNA).
[000175] Alternativamente, o produto de tradução pode ser detectado para o diagnóstico da presente invenção. Por exemplo, a quantidade de proteína MPHOSPH1 (SEQ ID NO:126) ou do fragmento imunoló- gico da mesma pode ser determinada. Métodos para determinação da quantidade da proteína como o produto de tradução incluem métodos de imunoensaio que usam um anticorpo reconhecendo especificamente a proteína. O anticorpo pode ser monoclonal ou policlonal. Ainda, qualquer fragmento ou modificação (por exemplo, anticorpo quimérico, scFv, Fab, F(ab’)2, Fv, etc) do anticorpo pode ser usado para a detecção, contanto que o fragmento ou anticorpo modificado retenha a habilidade de ligação com a proteína MPHOSPH1. Tais anticorpos contra os peptídeos da presente invenção e fragmentos dos mesmos são também providos pela presente invenção. Métodos para preparar esses tipos de anticorpo para a detecção de proteínas são bem conhecidos na técnica, e qualquer método pode ser empregado na presente invenção para preparar tais anticorpos e equivalentes dos mesmos.
[000176] Como outro método para detectar o nível de expressão de gene MPHOSPH1 com base em seu produto de tradução, a intensidade de tingimento pode ser medida através de análise imunoistoquímica usando um anticorpo contra a proteína MPHOSPH1. Isto é, nesta medição, tingimento forte indica presença/nível alto da proteína e, ao mesmo tempo, nível de expressão alto de gene MPHOSPH1.
[000177] O nível de expressão de um gene alvo, por exemplo, do gene MPHOSPH1, em células de câncer pode ser determinado ser alto se o nível aumentar do nível controle (por exemplo, o nível em células normais) do gene alvo em, por exemplo, 10%, 25% ou 50%; ou aumentar para mais de 1,1 vez, mais de 1,5 vez, mais do que 2,0 vezes, mais do que 5,0 vezes, mais do que 10,0 vezes ou mais.
[000178] O nível de controle pode ser determinado ao mesmo tempo que as células de câncer usando uma amostra(s) previamente coleta- da(s) e armazenada(s) a partir de um indivíduo(s) cujo(s) estado(s) de doença (canceroso e/ou não canceroso) são conhecido(s). Ainda, células normais obtidas de regiões não cancerosas de um órgão que tem o câncer a ser tratado podem ser usadas como controle normal. Alternativamente, o nível controle pode ser determinado através de um método estatístico com base nos resultados obtidos através de análise de nível(eis) de expressão previamente determinado de gene MPHOSPH1 em amos- tras de indivíduos cujos estados de doença são conhecidos. Ainda, o nível controle pode ser derivado de um banco de dados de padrões de expressão de células previamente testadas. Além disso, de acordo com um aspecto da presente invenção, o nível de expressão do gene MPHOSPH1 em uma amostra biológica pode ser comparado com níveis de controle múltiplos, determinados a partir de amostras de referência múltiplas. É preferido usar um nível controle determinado a partir de uma amostra de referência derivada de um tipo de tecido similar àquele da amostra biológica derivada do indivíduo. Além disso, é preferido usar o valor padrão dos níveis de expressão do gene MPHOSPH1 em uma população com um estado de doença conhecido. O valor padrão pode ser obtido através de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, uma faixa de média +/- 2 S.D. ou média +/- 3 S.D. pode ser usada como o valor padrão.
[000179] No contexto da presente invenção, um nível controle determinado a partir de uma amostra biológica que é conhecida ser não cancerosa é referido como "nível controle normal". Por outro lado, se o nível controle for determinado a partir de uma amostra biológica cancerosa, ele é referido como um "nível controle canceroso". Diferenças entre um nível de expressão de amostra e um nível controle podem ser normalizadas para o nível de expressão de ácidos nucleicos controle, por exemplo, genes de manutenção, cujos níveis de expressão são conhecidos não diferir dependendo estado canceroso ou não canceroso da célula. Genes controle exemplares incluem, mas não estão limitados a, beta actina, gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase e proteína ribossomal P1.
[000180] Quando o nível de expressão do gene MPHOSPH1 é aumentado comparado com o nível controle normal, ou é simi- lar/equivalente ao nível controle canceroso, o indivíduo pode ser diagnosticado com câncer a ser tratado.
[000181] A presente invenção também provê um método de (i) diagnóstico se um indivíduo suspeito tem câncer a ser tratado e/ou (ii) seleção de um indivíduo para tratamento de câncer, método que inclui as etapas de: a) determinação do nível de expressão de MPHOSPH1 em células ou tecido(s) obtidos de um indivíduo que é suspeito de ter o câncer a ser tratado; b) comparação do nível de expressão de MPHOSPH1 com um nível controle normal; c) diagnóstico do indivíduo como tendo o câncer a ser tratado, se o nível de expressão de MPHOSPH1 for aumentado comparado com o nível controle normal; e d) seleção do indivíduo para tratamento de câncer, se o indivíduo for diagnosticado com tendo o câncer a ser tratado, na etapa c).
[000182] Alternativamente, tal método pode incluir as etapas de: a) determinação do nível de expressão de MPHOSPH1 em células ou tecido(s) obtidos de um indivíduo que é suspeito ter o câncer a ser tratado; b) comparação do nível de expressão de MPHOSPH1 com o nível de um controle canceroso; c) diagnóstico do indivíduo como tendo o câncer a ser tratado se o nível de expressão de MPHOSPH1 for similar ou equivalente ao nível controle canceroso; e d) seleção do indivíduo para tratamento de câncer, se o indivíduo for diagnosticado como tendo o câncer a ser tratado, na etapa c).
[000183] A presente invenção também provê um estojo de diagnóstico para diagnóstico ou determinação de um indivíduo que sofre ou é suspeito de sofrer de ou sob risco de desenvolver câncer que pode ser tratado com o polipeptídeo MPHOSPH1 da presente invenção, que pode também encontrar uso na avaliação e/ou monitoramento da efi- cácia ou aplicabilidade de uma imunoterapia de câncer. Preferivelmente, o câncer inclui, mas não é limitado a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, câncer color- retal, câncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteossarcoma, câncer de próstata, câncer renal e tumor de tecido mole. Mais particularmente, o estojo pode incluir pelo menos um reagente para detecção da expressão do gene MPHOSPH1 em uma célula derivada de indivíduo, reagente que pode ser selecionado do grupo de: (a) um reagente para detecção de um mRNA do gene MPHOSPH1; (b) um reagente para detecção da proteína MPHOSPH1 ou do fragmento imunológico da mesma; e (c) um reagente para detecção da atividade biológica da proteína MPHOSPH1.
[000184] Exemplos de reagentes adequados para a detecção de mRNA do gene MPHOSPH1 podem incluir ácidos nucleicos que se ligam especificamente a ou identificam o mRNA de MPHOSPH1, tais como oligonucleotídeos que têm uma sequência complementar a uma porção do mRNA de MPHOSPH1. Esses tipos de oligonucleotídeos são exemplificados por iniciadores e sondas que são específicos para o mRNA de MPHOSPH1. Esses tipos de oligonucleotídeos podem ser preparados com base nos métodos bem conhecidos na técnica. Se necessário, o reagente para detecção do mRNA de MPHOSPH1 pode ser imobilizado em uma matriz sólida. Além disso, mais de um reagente para detecção do mRNA de MPHOSPH1 pode ser incluído no estojo.
[000185] Por outro lado, exemplos de reagentes adequados para a detecção da proteína MPHOSPH1 ou do fragmento imunológico da mesma podem incluir anticorpos para a proteína MPHOSPH1 ou o fragmentoimunológico da mesma. O anticorpo pode ser monoclonal ou policlonal. Ainda, qualquer fragmento ou modificação (por exemplo, anticorpo quimérico, scFv, Fab, F(ab’)2, etc) do anticorpo pode ser usado como o reagente, contanto que o fragmento ou anticorpo modificado retenha a habilidade de ligação à proteína MPHOSPH1 ou o fragmento imunológica da mesma. Métodos para preparar esses tipos de anticorpos para a detecção de proteínas são bem conhecidos na técnica e qualquer método pode ser empregado na presente invenção para preparar tais anticorpos e equivalentes dos mesmos. Ainda, o anticorpo pode ser marcado com moléculas de geração de sinal através de ligação direta ou uma técnica de marcação indireta. Marcadores e métodos para marcação de anticorpos e detecção da ligação dos anticorpos aos seus alvos são bem conhecidos na técnica, e quaisquer marcadores e métodos podem ser empregados para a presente invenção. Além disso, mais de um reagente para detecção da proteína MPHOSPH1 pode ser incluído no estojo.
[000186] O estojo pode conter mais de um dos reagentes mencionados acima. O estojo pode incluir ainda uma matriz sólida e reagente para ligação de uma sonda contra um gene MPHOSPH1 ou anticorpo contra um peptídeo MPHOSPH1, um meio e recipiente para cultura de células, reagente de controle positivos e negativos e um anticorpo secundário para detecção de um anticorpo contra um peptídeo MPHOSPH1. Por exemplo, amostras de tecido obtidas de indivíduos sem câncer ou sofrendo de câncer podem servir como reagentes controleúteis. Um estojo da presente invenção pode incluir ainda outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e de usuário, in-cluindotampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas (por exemplo, escrita, fita, CD-ROM, etc) com instruções para uso. Esses reagentes e similar podem ser mantidos em um recipiente com um rótulo. Recipientes adequados podem incluir garrafas, frascos e tubos de teste. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais, tal como vidro ou plástico.
[000187] Em uma modalidade da presente invenção, quando o reagenteé uma sonda contra o mRNA de MPHOSPH1, o reagente pode ser imobilizado em uma matriz sólida, tal como uma tira porosa, para formar pelo menos um sítio de detecção. A região de medição ou detecção da tira porosa pode incluir uma pluralidade de sítios, cada um contendo um ácido nucleico (sonda). Uma tira de teste pode também conter sítios para controles negativos e/ou positivos. Alternativamente, sítios controle podem estar localizados em uma tira separada da tira de teste. Opcionalmente, os sítios de detecção diferentes podem conter quantidades diferentes de ácidos nucleicos imobilizados, isto é, uma quantidade maior no primeiro sítio de detecção e quantidades menores em sítios subsequentes. Quando da adição de uma amostra de teste, o número de sítios exibindo um sinal detectável provê uma indicação quantitativa da quantidade de mRNA de MPHOSPH1 presente na amostra. Os sítios de detecção podem ser configurados em qualquer formato adequadamente detectável e são tipicamente no formato de uma barra ou ponto em toda a largura da tira de teste.
[000188] O estojo da presente invenção pode incluir ainda uma amostra controle positiva ou amostra padrão de MPHOSPH1. A amostra controle positiva da presente invenção pode ser preparada através de coleta de amostras positivas para MPHOSPH1 e então ensaio de seus níveis de MPHOSPH1. Alternativamente, uma proteína ou poli- nucleotídeo MPHOSPH1 purificado pode ser adicionado às células que não expressam MPHOSPH1 para formar a amostra positiva ou a amostra padrão MPHOSPH1. No contexto da presente invenção, MPHOSPH1 purificado pode ser uma proteína recombinante. O nível de MPHOSPH1 da amostra controle positiva é, por exemplo, maior do que o valor de corte.
[000189] Em uma modalidade, a presente invenção provê ainda um estojo de diagnóstico incluindo uma proteína ou uma proteína parcial da mesma especificamente reconhecida pelo anticorpo da presente invenção ou o fragmento do mesmo.
[000190] Exemplos dos peptídeos parciais da presente invenção in-cluempolipeptídeos compostos de pelo menos 8, preferivelmente 15 e mais preferivelmente 20 aminoácidos contíguos na sequência de ami- noácido de uma proteína da presente invenção. Câncer pode ser diagnosticadoatravés da detecção de um anticorpo em uma amostra (por exemplo, sangue, tecido) usando uma proteína ou um peptídeo (poli- peptídeo) da presente invenção. O método para preparação da proteína da presente invenção e peptídeos são conforme acima descrito.
[000191] Os métodos para diagnóstico de câncer da presente invenção podem ser realizados através da determinação da diferença entre a quantidade de anticorpo anti-MPHOSPH1 e aquela na amostra controle correspondente conforme acima descrito. O indivíduo é suspeito sofrer de câncer se células ou tecidos do indivíduo contiverem anticorpos contra os produtos de expressão (MPHOSPH1) do gene e a quantidade do anticorpo anti-MPHOSPH1 for determinada ser mais do que o valor de corte no nível comparado com aquele em controle normal.
[000192] Em outra modalidade, um estojo de diagnóstico da presente invenção pode incluir o peptídeo da presente invenção e uma molécula de HLA se ligando a ele. O método para detecção de CTLs específicos de antígeno usando peptídeos antigênicos e moléculas de HLA já foi estabelecido (por exemplo, Altman, J.D. e outros, Science 1996, 274(5284): 94-6). Desta maneira, o complexo do peptídeo da presente invenção e da molécula de HLA pode ser aplicado ao método de detecção para detectar CTLs específicos de antígeno de tumor, desta maneira permitindo detecção precoce, recorrência e/ou metástase de câncer. Ainda, ele pode ser empregado para a seleção de indivíduos aplicados com os agentes farmacêuticos incluindo o peptídeo da presente invenção como um ingrediente ativo, ou a avaliação do efeito de tratamento dos agentes farmacêuticos.
[000193] Particularmente, de acordo com o método conhecido (vide, por exemplo, Altman, J.D. e outros, Science 1996, 274(5284):94-6), o complexo de oligômero, tal como tetrâmero, da molécula de HLA radi- omarcada e do peptídeo da presente invenção pode ser preparado. Com uso do complexo, o diagnóstico pode ser feito, por exemplo, através da quantificação dos CTLs específicos de antígeno-peptídeo nos linfócitos de sangue periférico derivados do indivíduo suspeito de sofrer de câncer.
[000194] A presente invenção provê ainda métodos e agentes de diagnóstico para avaliação de resposta imunológica de indivíduo através do uso de epitopos de peptídeo conforme aqui descrito. Em uma modalidade da invenção, peptídeos restritos a HLA A-2 conforme aqui descrito podem ser usados como reagentes para avaliação ou previsão de uma resposta imune de um indivíduo. A resposta imune a ser avaliada pode ser induzida através de contato de um imunógeno com células imunocompetentes in vitro ou in vivo. Em modalidades, quaisquersubstâncias ou composições que possam resultar na produção de CTLs específicos de antígeno que reconhecem e se ligam ao(s) epitopo(s) de peptídeo podem ser empregadas como o reagente. Os reagentes de peptídeo podem precisar não ser usados como o imunó- geno. Sistemas de ensaio que são usados para tal análise incluem de-senvolvimentostécnicos relativamente recentes tais como tetrâmeros, tingimento para linfocinas intracelulares e ensaios de liberação de interferon ou ensaios ELISPOT. Em modalidades preferidas, as células imunocompetentes para avaliação de uma resposta imunológica podem ser selecionadas dentre sangue periférico, linfócito de sangue periférico (PBL) e células mononuclear de sangue periférico (PBMC). Métodos para coleta ou isolamento de tais células imunocompetentes são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade preferida alternativa, as células imunocompetentes a serem contatadas com o reagente de peptídeo incluem células apresentando antígeno tais como células dendríticas.
[000195] Por exemplo, os peptídeos da presente invenção podem ser usados em ensaios de tingimento de tetrâmero para avaliar células mononucleares de sangue periférico quanto à presença de CTLs específicos de antígeno seguindo exposição a um antígeno de célula de tumor ou um imunógeno. O complexo tetramérico de HLA pode ser usado para visualizar diretamente CTLs específicos de antígeno (vide, por exemplo, Ogg e outros, Science 279: 2103-2106, 1998; e Altman e outros, Science 174: 94-96, 1996) e determinar a frequência da população de CTL específico de antígeno em uma amostra de células mo- nonucleares de sangue periférico. Um reagente tetrâmero usando um peptídeo da invenção pode ser gerado como descrito abaixo.
[000196] Um peptídeo que se liga a uma molécula de HLA é redobrado na presença da cadeia pesada de HLA correspondente e beta 2- microglobulina para gerar um complexo trimolecular. No complexo, terminal carboxila da cadeia pesada é biotinilado em um sítio que foi anteriormente engenheirado na proteína. Então, estreptavidina é adicionada ao complexo para formar tetrâmero composto do complexo tri- molecular e estreptavidina. Por meio de estreptavidina fluorescentemente marcada, o tetrâmero pode ser usado para tingir células específicas de antígeno. As células podem ser então identificadas, por exemplo, através de citometria de fluxo. Tal análise pode ser usada para propósitos de diagnóstico ou prognóstico. Células identificadas através do procedimento podem também ser usadas para propósitos terapêuticos.
[000197] A presente invenção também provê reagentes para avaliar respostas à convocação imune (vide, por exemplo, Bertoni e outros, J. Clin. Invest. 100:503-513, 1997 e Penna e outros, J. Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991) incluindo peptídeos da presente invenção. Por exemplo, amostras de PBMC de paciente obtidas de indivíduos com um câncer a ser tratado podem ser analisadas quanto à presença de CTLs específicos de antígeno usando peptídeos específicos. Uma amostra de sangue contendo células mononucleares pode ser avaliadaatravés de cultivo das PBMCs e estimulação das células com um peptídeo da invenção. Após um período de cultivo apropriado, a população de célula expandida pode ser analisada, por exemplo, quanto à atividade de CTL.
[000198] Os peptídeos podem ser também usados como reagentes para avaliar a eficácia de uma vacina. PBMCs obtidas de um paciente vacinado com um imunógeno podem ser analisadas usando, por exemplo, qualquer um dos métodos descritos acima. O paciente é tipificado HLA, e reagentes de epitopo de peptídeo que reconhecem as moléculas específicas de alelo presentes no paciente são selecionados para a análise. A imunogenicidade da vacina pode ser indicada pela presença de CTLs específicos de epitopo na amostra de PBMC. Os peptídeos da invenção podem também ser usados para produzir anticorpos, usando técnicas bem conhecidas no campo (vide, por exemplo, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY; e Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), que podem encontrar uso como reagentes para diagnosticar, detectar ou monitorar câncer. Tais anticorpos podem incluir aqueles que reconhecem um peptídeo no contexto de uma molécula de HLA, isto é, anticorpos que se ligam a um complexo de peptídeo-MHC.
[000199] Os peptídeos e as composições da presente invenção têm vários usos adicionais, alguns deles são descritos aqui. Por exemplo, a persente invenção provê um método para diagnóstico ou detecção de um distúrbio caracterizado pela quantidade de um polipeptídeo imuno- gênico de MPHOSPH1. Esses métodos envolvem determinação da quantidade de um peptídeo MPHOSPH1 ou um complexo de um peptí- deo MPHOSPH1 e uma molécula classe I de HLA em uma amostra biológica. A expressão de um peptídeo ou complexo de peptídeo e molécula classe I de HLA pode ser determinada ou detectada através de ensaio com uma contraparte de ligação para o peptídeo ou complexo. Em uma modalidade preferida, uma contraparte de ligação para o peptídeo ou complexo pode ser um anticorpo que reconhece e especificamente se liga ao peptídeo. A expressão de MPHOSPH1 em uma amostra biológica, tal como uma biópsia de tumor, pode ser também testada através de protocolos de amplificação por PCR padrão usando iniciadores de MPHOSPH1. Um exemplo de expressão de tumor é apresentado aqui e revelação adicional de condições e iniciadores exemplares para amplificação de MPHOSPH1 pode ser encontrada no WO2003/27322, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência.
[000200] Preferivelmente, os métodos de diagnóstico envolvem contato de uma amostra biológica isolada de um indivíduo com um agente específico para o peptídeo MPHOSPH1 para detectar a presença do peptídeo MPHOSPH1 na amostra biológica. Conforme aqui usado, "contato" significa colocação da amostra biológica em proximidade suficiente com o agente e sob condições apropriadas de, por exemplo, concentração, temperatura, tempo, resistência iônica, para permitir a interação específica entre o agente e o peptídeo MPHOSPH1 que estão presentes na amostra biológica. Em geral, as condições para contato do agente com a amostra biológica são condições conhecidas daqueles de habilidade comum na técnica para facilitar uma interação específica entre uma molécula e seu cognato (por exemplo, uma proteína e seu receptor cognato, um anticorpo e seu antígeno de proteína cognato, um ácido nucleico e sua sequência complementar cognata) em uma amostra biológica. Condições ótimas para facilitação de uma interação específica entre uma molécula e seu cognato são descritas na Patente U.S. No. 5.108.921 emitida para Low e outros, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência.
[000201] O método de diagnóstico da presente invenção pode ser realizado em um ou ambos in vivo e in vitro. Desta maneira, a amostra biológica pode estar localizada in vivo ou in vitro na presente invenção. Por exemplo, a amostra biológica pode ser um tecido in vivo e o agenteespecífico para o polipeptídeo imunogênico MPHOSPH1 pode ser usado para detectar a presença de tais moléculas no tecido. Alternativamente, a amostra biológica pode ser coletada ou isolada in vitro (por exemplo, uma amostra de sangue, biópsia de tumor, extrato de tecido). Em uma modalidade particularmente preferida, a amostra biológica pode ser uma amostra contendo célula, mais preferivelmente uma amostra contendo células de tumor coletadas de um indivíduo a ser diagnosticado ou tratado.
[000202] Alternativamente, o diagnóstico pode ser feito através de um método que permita quantificação direta de células T específicas de tecido através de tingimento de complexos multiméricos de HLA marcados com fluoresceína (por exemplo, Altman, J.D. e outros, 1996, Science 274: 94; Altman, J.D. e outros, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10330). Tingimento de linfocinas intracelulares e ensaios de liberação de interferon-gama e ensaios ELISPOT foram também providos. Tingimento de multímero, tingimento de linfocina intracelular e ensaios ELISPOT todos parecem ser pelo menos 10 vezes mais sensíveis do que ensaios mais convencionais (Murali-Krishna, K. e outros, 1998, Immunity 8: 177; Lalvani, A. e outros, 1997, J. Exp. Med. 186: 859; Dunbar, P.R. e outros, 1998, Curr. Biol. 8: 413); Pentâmeros (por exemplo, US 2004-209295A), dextrâmeros (por exemplo, WO02/072631) e estreptâmeros (por exemplo, Nature medicine 6, 631-637 (2002)) podem ser também usados.
[000203] Desta maneira, em algumas modalidades, a presente invenção provê um método para diagnóstico ou avaliação de uma respostaimunológica de um indivíduo administrado com pelo menos um de peptídeos MPHOSPH1 da presente invenção, o método incluindo as etapas de: (a) contato de um imunógeno com células imunocompeten- tes sob a condição adequada para indução de CTL específico para o imunógeno; (b) detecção ou determinação de nível de indução do CTL induzido na etapa (a); e (c) correlação da resposta imunológica do indivíduo com o nível de indução de CTL.
[000204] No contexto da presente invenção, o imunógeno inclui pre-ferivelmente pelo menos um de (a) um peptídeo MPHOSPH1 selecionado dentre SEQ ID NOs: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120 e (b) peptídeos tendo tais sequências de aminoácido em que tais sequências de aminoácido foram modificadas com 1, 2 ou mais substituições de aminoácido. Nesse ínterim, condições adequadas de indução de CTL específico de imunógeno são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, células imunocompetentes podem ser culturadas in vitro sob a presença de imunógeno(s) para induzir CTL específico de imunóge- no. A fim de induzir CTLs específicos de imunógeno, quaisquer fatores de estimulação podem ser adicionados à cultura celular. Por exemplo, IL-2 preferivelmente são fatores de estimulação para indução de CTL.
[000205] Em algumas modalidades, a etapa de monitoramento ou avaliação de resposta imunológica de um indivíduo a ser tratado com terapia de câncer com peptídeo pode ser realizada antes, durante e/ou após o tratamento. Em geral, durante um protocolo de terapia de câncer,peptídeos imunogênicos são administrados repetidamente a um indivíduo a ser tratado. Por exemplo, peptídeos imunogênicos podem ser administrados a cada semana por 3-10 semanas. Desta maneira, a resposta imunológica do indivíduo pode ser avaliada ou monitorada durante o protocolo de terapia de câncer. Alternativamente, a etapa de avaliação ou monitoramento de resposta imunológica à terapia para câncer pode ser no final do protocolo de terapia.
[000206] De acordo com a presente invenção, indução aumentada de CTL específico de imunógeno comparado com o controle indica que o indivíduo a ser avaliado ou diagnosticado respondeu imunologi- camente ao imunógeno(s) que foi administrado. Controles adequados para avaliação da resposta imunológica podem incluir, por exemplo, um nível de indução de CTL quando as células imunocompetentes não são contatadas com nenhum peptídeo ou peptídeo(s) controle tendo sequências de aminoácido outras que não quaisquer peptídeos de MPHOSPH1, (por exemplo, sequência de aminoácido aleatória). Em uma modalidade preferida, a resposta imunológica do indivíduo é avaliada de uma maneira específica de sequência, através de comparação com uma resposta imunológica entre cada imunógeno administrado ao indivíduo. Em particular, mesmo quando uma mistura de alguns tipos de peptídeos de MPHOSPH1 é administrada ao indivíduo, respostaimunológica variaria dependendo dos peptídeos. Neste caso, através da comparação da resposta imunológica entre cada peptídeo, peptídeos aos quais o indivíduo mostra resposta maior podem ser identificados.
XI. Anticorpos
[000207] A presente invenção provê ainda anticorpos que se ligam aos peptídeos da presente invenção. Anticorpos preferidos se ligam especificamente a um peptídeo da presente invenção e não vão se ligar (ou vão se ligar fracamente) a outro peptídeo. Alternativamente, anticorpos podem se ligar a peptídeos da invenção bem como aos seus homólogos. Anticorpos contra peptídeos da invenção podem en- contrar uso em ensaios de diagnóstico e prognóstico de câncer, bem como metodologias de imagem. Similarmente, tais anticorpos podem encontrar uso no tratamento, diagnóstico e/ou prognóstico de outros cânceres, até o ponto que MPHOSPH1 é também expresso ou supe- rexpresso em um paciente com câncer. Além disso, anticorpos intracelularmente expressos (por exemplo, anticorpos de cadeia única) podem terapeuticamente encontrar uso no tratamento de cânceres em que a expressão de MPHOSPH1 está envolvida, cujos exemplos incluem, mas não estão limitados a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, câncer colorretal, câncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteossarcoma, câncer de próstata, câncer renal e tumor de tecido mole.
[000208] A presente invenção também provê vários ensaios imuno- lógicos para a detecção e/ou a quantificação da proteína MPHOSPH1 (SEQ ID NO:126) ou um fragmento da mesma incluindo um polipeptí- deo composto de sequências de aminoácido selecionadas dentre as SEQ ID Nos: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120. Tais ensaios podem incluir um ou mais anticorpos anti-MPHOSPH1 capazes de reconhecer e se ligar a uma proteína MPHOSPH1 ou fragmento da mesma, conforme apropriado. No contexto da presente invenção, anticorpos anti- MPHOSPH1 se ligando a um polipeptídeo MPHOSPH1 preferivelmentereconhecerão um polipeptídeo composto de sequências de aminoá- cido selecionadas dentre as SEQ ID Nos: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120 para a exclusão de outros peptídeos. A especificidade de ligação de anticorpo pode ser confirmada por meio de um teste de inibição. Isto é, quando a ligação entre um anticorpo a ser analisado e comprimento integral de polipeptídeo MPHOSPH1 é inibida sob presença de quaisquer polipeptídeos em fragmento tendo uma sequência de aminoácido selecionada dentre as SEQ ID Nos: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120, o anticorpo é considerado se ligar especificamente ao fragmento. No contexto da presente invenção, tais ensaios imuno- lógicos são realizados dentre vários formatos de ensaio imunológicos bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado a, vários tipos de radioimunoensaios, técnica de imunocromatografia, ensaios imuno- absorventes ligados à enzima (ELISA), ensaios imunofluorescentes ligados à enzima (ELIFA) e similar.
[000209] Os ensaios imunológicos relacionados, mas não anticorpo, da invenção podem também incluir ensaios de imunogenicidade de célula T (inibidores ou estimuladores) bem como ensaios de ligação ao MHC. Ainda, métodos de imagem imunológicos capazes de detecção de cânceres expressando MPHOSPH1 são também providos pela invenção, incluindo, mas não limitado a, métodos de imagem radiocinti- gráfica usando anticorpos marcados da presente invenção. Tais ensaios podem clinicamente encontrar uso na detecção, monitoramento e prognóstico de cânceres expressando MPHOSPH1, cujos exemplos incluem, mas não estão limitados a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, câncer colorre- tal, câncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteossarcoma, câncer de próstata,câncer renal e tumor de tecido mole.
[000210] A presente invenção também provê anticorpos que se ligam a um peptídeo da presente invenção. Um anticorpo da presente invenção pode ser usado em qualquer forma, tais como anticorpos mo- noclonais ou policlonais, e incluem antissoro obtido através de imunização de um animal tal como um coelho com o peptídeo da invenção, todas as classes de anticorpos policlonais e monoclonais, anticorpos humanos e anticorpos humanizados produzidos através de recombi- nação genética.
[000211] Um peptídeo da presente invenção usado como um antíge- no para obter um anticorpo pode ser derivado de qualquer espécie animal, mas preferivelmente é derivado de um mamífero tal como um humano, camundongo ou rato, mais preferivelmente de um humano. Um peptídeo derivado de humano pode ser obtido das sequências de nucleotídeo ou aminoácido reveladas aqui.
[000212] De acordo com a presente invenção, peptídeos completos e parciais de uma proteína podem servir como um antígeno de imunização. Exemplos de peptídeos parciais adequados incluem, por exemplo, o fragmento amino (N)-terminal ou carbóxi (C)-terminal de um pep- tídeo da presente invenção. Aqui, um anticorpo é definido como uma proteína que reage ou com o comprimento integral ou um fragmento de um peptídeo MPHOSPH1. Em uma modalidade preferida, um anticorpo da presente invenção vai reconhecer peptídeos em fragmento de MPHOSPH1 que têm uma sequência de aminoácido selecionada dentre as SEQ ID Nos: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 e 120. Métodos para síntese de oligopeptídeo são bem conhecidos na técnica. Após a síntese, os peptídeos podem ser opcionalmente purificados antes do uso como imunógeno. Na presente invenção, o oligopeptídeo (por exemplo, 9 ou 10 mer) pode ser conjugado ou ligado com carreadores para aumentar a imunogenicidade. Hemocianina da lapa californiana (KLH) (Keyhole-limpet hemocyanin) é bem conhecida como o carrea- dor. Método para conjugação de KLH e peptídeo são bem conhecidos na técnica.
[000213] Alternativamente, um gene codificando um peptídeo da presente invenção ou fragmento do mesmo pode ser inserido em um vetor de expressão conhecido, que é então usado para transformar uma célula hospedeira conforme aqui descrito. O peptídeo desejado ou fragmento do mesmo pode ser recuperado do exterior ou interior das células hospedeiras através de qualquer método padrão, e pode ser subsequentemente usado como um antígeno. Alternativamente, células integrais expressando o peptídeo ou seus lisatos ou um peptí- deo quimicamente sintetizado podem ser usadas como o antígeno.
[000214] Qualquer animal mamífero pode ser imunizado com o antí- geno, embora preferivelmente a compatibilidade com células parentais usadas para fusão de célula seja levada em consideração. Em geral, animais da família dos Roedores, Lagomorfos ou Primatas podem ser usados. Animais da família dos Roedores incluem, por exemplo, camundongo, rato e hamster. Animais da família dos Lagomorfos incluem, por exemplo, coelho. Animais da família dos Primatas incluem, por exemplo, um macaco de Catarrhini (macaco do velho mundo) tal como Macaca fascicularis, macaco rhesus, babuíno sagrado e chimpanzés.
[000215] Métodos para imunização de animais com antígenos são conhecidos na técnica. Injeção intraperitoneal ou injeção subcutânea de antígenos é um método padrão para imunização de mamíferos. Mais especificamente, antígenos podem ser diluídos e suspensos em uma quantidade apropriada de solução salina tamponada com fosfato (PBS), solução salina fisiológica, etc. Se desejado, a suspensão de antígeno pode ser misturada com uma quantidade apropriada de um adjuvante padrão, tal como adjuvante completo de Freund, transformada em emulsão e então administrada a animais mamíferos. Preferivelmente, ela é seguida por várias administrações de antígeno misturado com uma quantidade apropriada de adjuvante incompleto de Freund a cada 4 a 21 dias. Um carreador apropriado pode ser também usado para imunização. Após imunização como acima, soro pode ser examinado através de um método padrão quanto a um aumento na quantidade de anticorpos desejados.
[000216] Anticorpos policlonais contra os peptídeos da presente invenção podem ser preparados através de coleta de sangue do mamífero imunizado examinado quanto ao aumento de anticorpos desejados no soro, e separação de soro do sangue através de qualquer método convencional. Anticorpos policlonais incluem soro contendo os anticorpos policlonais, bem como a fração contendo os anticorpos po- liclonais pode ser isolada do soro. Imunoglobulina G ou M pode ser preparada a partir de uma fração que reconhece apenas o peptídeo da presente invenção usando, por exemplo, coluna de afinidade acoplada com o peptídeo da presente invenção, e purificação adicional desta fração usando coluna de proteína A ou proteína G.
[000217] Para preparar anticorpos monoclonais para uso no contexto da presente invenção, células imunes são coletadas do mamífero imunizado com o antígeno e checadas quanto ao nível aumentado de anticorpos desejados no soro conforme acima descrito e são submetidas à fusão celular. As células imunes usadas para fusão celular podem ser preferivelmente obtidas do baço. Outras células parentais preferidas a serem fundidas com o imunócito acima incluem, por exemplo, células de mieloma de mamíferos, e mais preferivelmente células de mieloma tendo uma propriedade adquirida para a seleção de células fundidas por fármacos. O imunócito e as células de mieloma acima podem ser fundidos de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, o método de Milstein e outros (Galfre e Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)).
[000218] Hibridomas resultantes obtidos pela fusão celular podem ser selecionados através de cultivo dos mesmos em um meio de seleção padrão, tal como meio HAT (meio contendo hipoxantina, aminop- terina e timidina). A cultura de célula é tipicamente continuada no meio HAT por vários dias a várias semanas, o tempo sendo suficiente para permitir que todas as outras células, com a exceção do hibridoma desejado(células não fundidas), morram. Então, a diluição limitante padrão pode ser realizada para avaliar e clonar uma célula de hibridoma produzindo o anticorpo desejado.
[000219] Em adição ao método acima, em que um animal não humanoé imunizado com um antígeno para preparação de hibridoma, linfócitos humanos tais como aqueles infectados por vírus EB podem ser imunizados com um peptídeo, células expressando peptídeo ou seus lisatos in vitro. Então, os linfócitos imunizados podem ser fundidos com células de mieloma derivadas de humano que são capazes de se dividir indefinidamente, tal como U266, para fornecer um hibri- doma produzindo um anticorpo humano desejado que é capaz de se ligar ao peptídeo (Pedido de Patente Japonês Publicado Não examinado No. Sho 63-17688).
[000220] Os hibridomas obtidos podem então ser subsequentemente transplantados na cavidade abdominal de um camundongo e os ascites extraídos. Os anticorpos monoclonais obtidos podem ser purificadosatravés de, por exemplo, precipitação com sulfato de amônio, uma coluna de proteína A ou proteína G, cromatografia de troca de íon DEAE ou uma coluna de afinidade à qual o peptídeo da presente invenção é acoplado. Um anticorpo da presente invenção pode ser usadonão apenas para a purificação e detecção de um peptídeo da presente invenção, mas também como um candidato a agonistas e antagonistas de um peptídeo da presente invenção.
[000221] Alternativamente, uma célula imune, tal como um linfócito humanizado, produzindo anticorpos pode ser imortalizada por um oncogene e usada para preparação de anticorpos monoclonais. Anticorpos monoclonais então obtidos podem ser também recombinantemen- te preparados usando técnicas de engenharia genética (vide, por exemplo, Borrebaeck e Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado no Reino Unido pela MacMillan Publishers LTD (1990)). Por exemplo, um DNA codificando um anticorpo pode ser clonado a partir de uma célula imune, tal como um hibridoma ou um linfócito imunizado produzindo o anticorpo, inserido em um vetor apropriado e introduzido em células hospedeiras para preparar um anticorpo recombinante. A presente invenção também provê anticorpos recombinantes preparados conforme acima descrito.
[000222] Um anticorpo da presente invenção pode ser um fragmento de um anticorpo ou anticorpo modificado, contanto que ele se ligue a um ou mais dos peptídeos da invenção. Por exemplo, o fragmento de anticorpo pode ser Fab, F(ab’)2, Fv ou Fv de cadeia simples (scFv), em que fragmentos Fv de cadeias H e L são ligados por um ligante apropriado (Huston e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83 (1988)). Mais especificamente, um fragmento de anticorpo pode ser gerado através de tratamento de um anticorpo com uma enzima, tal como papaína ou pepsina. Alternativamente, um gene codificando o fragmento de anticorpo pode ser construído, inserido em um vetor de expressão e expresso em uma célula hospedeira apropriada (vide, por exemplo, Co e outros, J. Immunol. 152: 2968-76 (1994); Better e Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun e Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux e outros, Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird e Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)).
[000223] Um anticorpo pode ser modificado através de conjugação com uma variedade de moléculas, tal como polietileno glicol (PEG). A presente invenção provê tais anticorpos modificados. O anticorpo modificado pode ser obtido modificando quimicamente um anticorpo. Esses métodos de modificação são convencionais no campo.
[000224] Alternativamente, um anticorpo da presente invenção pode ser obtido como um anticorpo quimérico, entre uma região variável derivada de anticorpo não humano e a região constante derivada de anticorpo humano, ou como um anticorpo humanizado, incluindo a região de determinação de complementaridade (CDR) (Complementarity Determining Region) derivada de anticorpo não humano, a região de estrutura principal (FR) (Framework Region) e a região constante derivadas de anticorpo humano. Tais anticorpos podem ser preparados de acordo com tecnologia conhecida. Humanização pode ser realizada substituindo sequências de um anticorpo humano por sequências de CDRs ou CDR de roedor correspondentes (vide, por exemplo, Verhoeyen e outros, Science 239: 1534-1536 (1988)). Desta maneira, tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos, em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana.
[000225] Anticorpos integralmente humanos incluindo regiões variáveis humanas em adição à estrutura principal e regiões constantes humanas podem ser também usados. Tais anticorpos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas no campo. Por exemplo, métodos in vitro envolvem uso de bibliotecas recombinantes de fragmentos de anticorpo humano exibidos em bacteriófago (por exemplo, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991). Similarmente, anticorpos humanos podem ser produzidos através da introdução de loci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, camundongos em que os genes de imunoglobulina endógena foram parcialmente ou completamente inativados. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 6.150.584, 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016.
[000226] Os anticorpos obtidos como acima podem ser purificados até a homogeneidade. Por exemplo, a separação e a purificação do anticorpo podem ser realizadas de acordo com métodos de separação e purificação usados para proteínas gerais. Por exemplo, o anticorpo pode ser separado e isolado através do uso apropriadamente selecionado e combinado de cromatografias de coluna, tal como cro- matografia por afinidade, filtro, ultrafiltragem, precipitação por sais, diálise, eletroforese em gel de poliacrilamida SDS e foco isoelétrico (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), mas não são limitados a eles. Uma coluna de proteína A e uma coluna de proteína G podem ser usadas como a coluna de afinidade. Colunas de proteína A exemplares a serem usadas incluem, por exemplo, Hyper, D., POROS e Sepharose F.F. (Pharmacia).
[000227] Exemplos de técnicas de cromatografia adequadas, com a exceção de cromatografia por afinidade, incluem, por exemplo, croma- tografia de troca de íon, cromatografia hidrofóbica, filtragem em gel, cromatografia de fase reversa, cromatografia por adsorção e similar (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak e outros, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Os procedimentos cromatográficos podem ser realizados através de cromatografia de fase líquida, tais como HPLC e FPLC.
[000228] Por exemplo, medição de absorbância, ensaio imunoab- sorvente ligado à enzima (ELISA), imunoensaio de enzima (EIA), ra- dioimunoensaio (RIA) e/ou imunofluorescência podem ser usados para medir a atividade de ligação a antígeno do anticorpo da invenção. Em ELISA, o anticorpo da presente invenção é imobilizado em uma placa, um peptídeo da invenção é aplicado à placa, e então uma amostra contendo um anticorpo desejado, tal como sobrenadante de cultura de células de produção de anticorpo ou anticorpos purificados, é aplicada. Então, um anticorpo secundário que reconhece o anticorpoprimário e é marcado com uma enzima, tal como uma fosfatase alcalina, é aplicado, e a placa é incubada. Em seguida, após lava-gem, um substrato de enzima, tal como fosfato de p-nitrofenila, é adicionadoà placa, e a absorbância é medida para avaliar a atividade de ligação a antígeno da amostra. Um fragmento do peptídeo, tal como um fragmento C-terminal ou N-terminal, pode ser usado como o antí- geno para avaliar a atividade de ligação do anticorpo. BIAcore (Pharmacia) pode ser usado para avaliar a atividade do anticorpo de acordo com a presente invenção.
[000229] Os métodos acima permitem a detecção ou medição do peptídeo da invenção através da exposição do anticorpo da invenção a uma amostra suposta conter o peptídeo da invenção e detecção ou medição do complexo imune formado pelo anticorpo e o peptídeo. Devido ao fato do método de detecção ou medição do peptídeo de acordo com a invenção poder especificamente detectar ou medir um peptí- deo, o método pode encontrar uso em uma variedade de experimentos em que o peptídeo é usado.
XII. Vetores e células hospedeiras
[000230] A presente invenção também provê vetores codificando um peptídeo da presente invenção e células hospedeiras em que um poli- nucleotídeo codificando um peptídeo da presente invenção é introduzido. Um vetor da presente invenção encontra utilidade como um car- reador de polinucleotídeo, especialmente um DNA, da presente invenção em célula hospedeira, para expressar o peptídeo da presente invenção, ou administrar o polinucleotídeo da presente invenção para terapia de gene.
[000231] Quando E. coli é selecionado como a célula hospedeira e o vetor é amplificado e produzido em uma grande quantidade em E. coli (por exemplo, JM109, DH5 alfa, HB101 ou XL1Blue), o vetor deve ter um "ori" adequado para amplificação em E. coli e um gene marcador adequado para E. coli transformado selecionado (por exemplo, um gene de resistência a fármaco selecionado por um fármaco tal como ampicilina, tetraciclina, canamicina, cloranfenicol ou similar). Por exemplo, vetores série M13, vetores série pUC, pBR322, pBlues- cript, pCR-Script, etc, podem ser usados. Ainda, pGEM-T, pDIRECT e pT7 podem ser também usados para subclonagem e extração de DNA bem como os vetores descritos acima. Quando um vetor é usado para produzir a proteína da presente invenção, um vetor de expressão pode encontrar uso. Por exemplo, um vetor de expressão a ser expresso em E. coli deve ter as características acima para ser amplificado em E. coli. Quando E. coli, tal como JM109, DH5 alfa, HB101 ou XL1 Blue, é usado como uma célula hospedeira, o vetor deve ter um promotor, por exemplo, promotor lacZ (Ward e outros, Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1992)) e promotor araB (Better e outros, Science 240: 1041-3 (1988)), promotor T7 ou similar, que pode expressar eficientemente o gene desejado em E. coli. Com relação a isso, pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress sys-tem" (Qiagen), pEGFP e pET (neste caso, o hospedeiro é preferivelmente BL21 que expressa polimerase de RNA T7), por exemplo, podem ser usados ao invés dos vetores acima. Ainda, o vetor pode contertambém uma sequência de sinal para secreção de peptídeo. Uma sequência de sinal exemplar que direciona o peptídeo a ser secreta- do para o periplasma do E. colié a sequência de sinal pelB (Lei e outros,J. Bacteriol. 169: 4379 (1987)). Meios para introdução dos vetores nas células hospedeiras alvo incluem, por exemplo, o método de cloreto de cálcio e o método de eletroporação.
[000232] Em adição a E. coli, por exemplo, vetores de expressão derivados de mamíferos (por exemplo, pcDNA3 (Invitrogen) e pEGF-BOS (Nucleic Acids Res. 18(17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8), vetores de expressão derivados de células de inseto (por exemplo, "sistema de expressão de baculovírus Bac-para-Bac" (GIBCO BRL), pBacPAK8), vetores de expressão derivados de planta (por exemplo, pMH1, pMH2), vetores de expressão derivados de vírus animais (por exemplo, pHSV, pMV, pAdexLcw), vetores de expressão derivados de retro- vírus (por exemplo, pZIpneo), vetor de expressão derivado de levedura (por exemplo, "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01) e vetores de expressão derivados de Bacillus subtilis (por exemplo, pPL608, pKTH50) podem ser usados para produção do polipeptídeo da presente invenção.
[000233] A fim de expressar o vetor em células de animal, tais como células CHO, COS ou NIH3T3, o vetor deve carregar um promotor necessário para expressão em tais células, por exemplo, o promotor do SV40 (Mulligan e outros, Nature 277: 108 (1979)), o promotor do MMLV-LTR, o promotor do EF1 alfa (Mizushima e outros, Nucleic Acids Res. 18: 5322 (1990)), o promotor do CMV e similar, e preferivelmente um gene marcador para seleção de transformantes (por exemplo, um gene de resistência a fármaco selecionado por um fár- maco (por exemplo, neomicina, G418)). Exemplos de vetores conhecidos com essas características incluem, por exemplo, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV e pOP13.
[000234] Daqui em diante, a presente invenção é descrita em mais detalhes com referência aos exemplos. No entanto, embora os materiais,métodos e exemplos que seguem possam servir para auxiliar um versado comum na técnica na realização e uso de certas modalidades da presente invenção, eles pretendem apenas ilustrar aspectos da presente invenção e então de modo algum limitar o escopo da presente invenção. Como um versado comum na técnica vai prontamente reconhecer,métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui podem ser usados na prática ou teste da presente invenção.
Exemplos Materiais e Métodos Linhagens de Célula
[000235] T2, linhagem de célula B-linfoblastoide positiva para HLA- A*-0201, linhagem de célula B-linfoblastoide positiva para HLA- A*0206, HT1376, J82, COS7 e UM-UC3 foram compradas da ATCC. MKN-45 foi comprada da JCRB.
Seleção de candidato de peptídeos derivados de MPHOSPH1
[000236] Peptídeos de 9-mer e 10-mer derivados de MPHOSPH1 que se ligam à molécula de HLA-A*0201 foram previstos usando sof- tware de previsão de ligação "BIMAS"(http://wwwbimas.cit.nih.gov/ molbio/hlabind) (Parker e outros, J. Immunol. 1994, 152(1): 163-75; Kuzushima e outros, Blood 2001, 98(6): 1872-81). Esses peptídeos foram sintetizados pela Biosynthesis (Lewisville, Texas) de acordo com um método de síntese de fase sólida padrão e purificados através de cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (HPLC). A pureza (>90%) e a identidade dos peptídeos foram determinadas através de HPLC analítica e análise de espectrometria de massa, respectivamente. Os peptídeos foram dissolvidos em sulfóxido de dimetila a 20 mg/ml e armazenados a -80 graus C.
Indução de CTL in vitro
[000237] Células dendríticas (DCs) derivadas de monócito foram usadas como células apresentando antígeno para induzir linfócito T citotóxico (CTL) (Cytotoxic T lymphocyte) que responde contra peptí- deos apresentados em antígeno de leucócito humano (HLA) (Human Leukocyte Antigen). DCs foram geradas in vitro conforme descrito em outro ponto (Nakahara e outros, Cancer Res., 2003, Jul 15, 63(14): 4112-8). Especificamente, células mononucleares de sangue periférico isoladas de voluntário normal (positivas para HLA-A*0201) por solução Ficoll-Paque (Pharmacia) foram separadas através de aderência a uma prato de cultura de tecido plástico (Becton Dickinson) de maneira a enriquecê-las como a fração de monócito. A população enriquecida em monócito foi culturada na presença de 1000 U/ml de fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (R&D System) e 1000 U/ml de interleucina (IL)-4 (R&D System) em Meio AIM-V (Invitrogen) contendo 2% de soro autólogo (AS) (Autologous Serum) inativado com calor. Depois de 7 dias de cultura, as DCs induzidas por citocina foram pulsadas com 20 micrograma/ml de cada um dos peptídeos sintetizados na presença de 3 micrograma/ml de beta 2-microglobulina por 3 h a 37 graus C em um meio AIM-V. As células geradas pareciam ex- pressar moléculas associadas à DC, tais como CD80, CD83, CD86 e HLA Classe II, em suas superfícies (dados não mostrados). Essas DCs pulsadas com peptídeo foram então inativadas por irradiação de raio X (20 Gy) e misturadas em uma razão de 1:20 com células T CD8+ autólogas, obtidas através de seleção positiva com CD8 Positive Isolation Kit (Dynal). Essas culturas foram ajustadas em placas de 48 cavidades (Corning); cada uma continha 1,5 X 104 de DCs pulsadas com peptídeo, 3 X 105células T CD8+ e 10 ng/mL de IL-7 (R&D System) em 0,5 ml de AIM-V/meio AS 2%. Três dias depois, essas culturas foram suplementadas com IL-2 (CHIRON) para uma concentração final de 20 UI/ml. Nos dias 7 e 14, as células T foram estimuladas mais com as DCs pulsadas com peptídeo autólogas. As DCs foram preparadas cada vez da mesma maneira descrita acima. CTL foi testado contra células T pulsadas com peptídeo após a 3a rodada de estimulação de peptídeo no dia 21 (Tanaka, H. e outros, Br. J. Cancer, 5 de janeiro 2001, 84(1): 94-9; Umano, Y e outros, Br. J. Cancer, 20 de abril 2001, 84(8): 1052-7; Uchida, N. e outros, Clin Cancer Res. 15 de dezembro 2004, 10(24): 8577-86; Suda, T. e outros, Cancer Sci. Maio 2006, 97(5): 411-9; Watanabe, T. e outros, Cancer Sci. Agosto 2005; 96(8): 498-506).
Procedimento de expansão de CTL
[000238] CTLs foram expandidos em cultura usando o método similar a um descrito por Riddell e outros (Walter, E.A. e outros, N. Engl. J. Med. 19 de outubro 1995, 333(16): 1038-44; Riddell, S.R. e outro, Nat. Med. Fevereiro 1996, 2(2): 216-23). Um total de 5 X 104 CTLs foi suspenso em 25 ml de meio AIM-V/AS 5% com 2 tipos de linhagens de célula B-linfoblastoide humanas, inativadas por Mitomicina C, na presença de 40 ng/ml de anticorpo monoclonal anti-CD3 (Pharmingen). Um dia após início das culturas, 120 UI/ml de IL-2 foram adicionados às culturas. As culturas foram alimentadas com AIM-V/AS 5% fresco contendo 30 UI/ml de IL-2 nos dias 5, 8 e 11 (Tanaka, H. e outros, Br. J. Cancer, 5 de janeiro 2001, 84(1): 94-9; Umano, Y. e outros, Br. J. Cancer, 20 de abril 2001, 84(8): 1052-7; Uchida, N. e outros, Clin. Cancer Res., 15 de dezembro 2004, 10(24): 8577-86; Suda, T. e outros,Cancer Sci., maio 2006; 97(5): 411-9; Watanabe, T. e outros, Cancer Sci., agosto 2005; 96(8): 498-506).
Estabelecimento de clones de CTL
[000239] As diluições foram feitas para ter 0,3, 1 e 3 CTLs/cavidade em placa de microtitulação de fundo redondo 96 cavidades (Nalge Nunc International). Os CTLs foram culturados com 1 x 104célu- las/cavidade de 2 tipos de linhagens de célula B-linfoblastoide humana, 30 ng/ml de anticorpo anti-CD3 e 125 U/ml de IL-2 em um total de 150 microlitro/cavidade de Meio AIM-V contendo AS 5%. 50 microli- tro/cavidade de IL-2 foram adicionados ao meio 10 dias depois de maneira a atingir uma concentração final de 125 UI/ml de IL-2. A atividade de CTL foi testada no dia 14 e clones de CTL foram expandidos usando o mesmo método que aquele descrito acima (Uchida, N. e outros, Clin. Cancer Res., 15 e dezembro 2004, 10(24): 8577-86; Suda, T. e outros, Cancer Sci, maio 2006, 97(5): 411-9; Watanable, T. e outros, Cancer Sci., agosto 2005, 96(8): 498-506).
Atividade de CTL específica
[000240] Para examinar atividade de CTL específica, ensaio immunospot ligado à enzima interferon (IFN)-gama (ELISPOT) e ensaio imunoabsorvente ligado à enzima IFN-gama (ELISA) foram realizados. T2 pulsada com peptídeo (1 x 104/cavidade) foi preparada como células estimuladoras. Células de cultura em placa de 48 cavidades, linhagens de CTL e clones de CTL foram usados como células responde- doras. Ensaio ELISPOT de IFN-gama e ensaio ELISA de IFN-gama foram realizados sob procedimento de fabricação.
Habilidade de CTL em reconhecer a linhagem de célula alvo que ex- pressou endogenamente MPHOSPH1 e HLA-A*0201
[000241] O clone de CTL foi examinado quanto à sua habilidade em reconhecer a célula alvo que expressava endogenamente MPHOSPH1 e HLA-A*0201. Clone de CTL estabelecido foi culturado com linhagens de célula alvo (5 X 104 /cavidade) por duas noites. Após incubação, INF-gama no meio de cultura foi medido através de ELISA. ELISA de IFN-gama foi realizado sob o procedimento do fabricante.
Atividade citotóxica
[000242] Os clones de CTL foram examinados quanto à sua habilidade em matar as células de tumor endogenamente expressando MOHOSPH1 e HLA-A0201. Células-alvo (linhagens de célula de tumor) foram marcadas com 100 micro-Ci de Na251CrO4 (Perkin Elmer) por 1 hora em incubadora de CO2. Células-alvo pulsadas com peptí- deo foram preparadas através de incubação das células com 20 mi- crogramas/ml do peptídeo por 16 horas antes da marcação. As células-alvo marcadas com 51Cr foram enxaguadas e misturadas com clones de CTL em um volume final de 200 microlitros em placas de micro- titulação de fundo redondo de 96 cavidades. As placas foram centrifugadas (4 minutos a 800 rpm) para aumentar contato célula-com-célula e postas em incubadora de CO2. Depois de 4 horas de incubação, 50 microlitros do sobrenadante foram coletados de cada cavidade e a ra-dioatividade foi determinada com um contador gama (PerkinElmer). A porcentagem de citotoxidez específica foi determinada através do cálculo da porcentagem de liberação de 51-Cr específica pela fórmula que segue: {(cpm da liberação de amostra de teste - cpm da liberação espontânea) / (cpm da liberação máxima - cpm da liberação espontânea) X 100. Liberação espontânea foi determinada através da incubação das células-alvo sozinhas, na ausência de células efetoras. A liberação máxima foi obtida através de incubação dos alvos com HCl 1N. Todas as medições foram feitas em duplicata.
Estabelecimento das células expressando forçadamente um ou ambos o gene alvo e o HLA-A0206
[000243] O cDNA codificando uma estrutura de leitura aberta de genes alvo ou HLA-A*0206 foi amplificado através de PCR. O produto amplificado por PCR foi clonado em vetor de expressão. Os plasmí- deos foram transfectados em COS7, que é o gene alvo e linhagem de célula nula em HLA-A*0206, usando lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com o procedimento do fabricante. Depois de 2 dias de trans- fecção, as células transfectadas foram coletadas com versene (Invitro- gen) e usadas como as células estimuladoras (5 X 104 célu- las/cavidade) para ensaio de atividade de CTL
Habilidade de CTL em reconhecer a linhagem de célula alvo que expressava endogenamente MPHOSPH1 e HLA-A*0206
[000244] O clone de CTL foi examinado quanto à sua habilidade em reconhecer a célula alvo que expressava endogenamente MPHOSPH1 e HLA-A*0206. Linhagem de CTL estabelecida e clone foram cultura- dos com linhagens de célula alvo (5 X 104/cavidade) por duas noites. Depois da incubação, IFN-gama nos meios de cultura foi medido através de ELISA. ELISA de IFN-gama foi realizado sob o procedimento do fabricante.
Resultados Expressão de MPHOSPH1 aumentada em cânceres
[000245] Os dados de perfil de expressão de gene amplos obtidos de vários cânceres usando micromatriz de cDNA revelaram que expressão de MPHOSPH1 (No. Acesso GenBank NM_016195; SEQ ID NO: 125) era especificamente elevado em tecidos de câncer comparado com tecido normal correspondente. Expressão de MPHOSPH1 era va- lidamente elevada em 30 de 31 Câncer de bexiga, 8 de 36 Cânceres de mama, 18 de 18 Cânceres cervicais, 5 de 17 Carcinoma colangio- celular, 25 de 31 CML, 6 de 11 Cânceres colorretais, 6 de 14 Cânceres gástricos, 5 de 5 NSCLC, 7 de 7 Linfomas, 6 de 10 Osteossarcoma, 7 de 22 Cânceres de próstata, 10 de 18 Cânceres renais e 15 de 21 Tumores de tecido mole (Tabela 1). Tabela 1
[000246] Razão de casos observados com suprarregulagem de MPHOSPH1 em tecido canceroso comparado com tecido correspondente normal:
Figure img0001
Previsão de peptídeos de ligação a HLA-A02 derivados de MPHOSPH1
[000247] As Tabelas 2a e 2b mostram os peptídeos de 9 mer e 10 mer de ligação a HLA-A02 de MPHOSPH1 na ordem de afinidade de ligação alta. Um total de 47 peptídeos tendo habilidade de ligação a HLA-A02 potencial foram selecionados e examinados para determinar os peptídeos de epitopo. Tabela 2a Posição de partida Sequência de aminoácido
Figure img0002
Tabela 2-b Peptídeos de 10 mer de ligação a HLA-A02 derivados de MPHOSPH1 Posição de partida Sequência de aminoácido Resultado
Figure img0003
[000248] A posição de partida indica o número de resíduo de amino- ácido a partir do terminal N de MPHOSPH1. O score de ligação é deri- vado de "BIMAS".
Figure img0004
[000249] A posição de partida indica o número de resíduo de amino- ácido a partir do terminal N de MPHOSPH1. O score de ligação é derivado de "BIMAS".
Indução de CTL com os peptídeos previstos de MPHOSPH1 restrito com HLA-A*0201
[000250] CTLs para aqueles peptídeos derivados de MPHOSH1 fo- ram gerados de acordo com os protocolos conforme descrito em "Materiais e Métodos". Atividade de CTL específica de peptídeo foi detectadaatravés de ensaio ELISPOT de IFN-gama (Figura 1). As cavidades No. 7 estimulada com MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5) (a), No. 5 estimulada com MPHOSPH1-A02-9-129 (SEQ ID NO: 14) (b), No. 5 estimulada com MPHOSPH1-A02-9-846 (SEQ ID NO: 64) (c), No. 2 estimulada com MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73) (d), No. 1 estimulada com MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77) (e), No. 1 estimulada com MPHOSPH1-A02-10-407 (SEQ ID NO: 79) (f), No. 4 estimulada com MPHOSPH1-A02-10-923 (SEQ ID NO: 97) (g), No. 5 estimulada com MPHOSPH1-A02-10-1484 (SEQ ID NO: 103) (h) e No. 8 estimulada com MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) (i) demonstraram produção de IFN-gama potente comparado com as cavidades controle. Por outro lado, nenhuma atividade de CTL específica foi detectada através da estimulação com outros peptídeos mostrados nas Tabelas 2a e b, apesar desses peptídeos terem atividade de ligação possível com HLA-A*0201. Como um caso típico de dados negativos, nenhuma produção de IFN-gama específica foi observada do CTL estimulado com MPHOSPH1-A02-9-575 (SEQ ID NO: 1) (j). Juntos, esses resultados sugerem que 10 peptídeos selecionados derivados de MPHOSPH1 poderiam induzir CTLs potentes.
Estabelecimento de linhagem de CTL e clone contra peptí- deo derivado de MPHOSPH1
[000251] As células nas cavidades No. 7 estimuladas com MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5) (a), No. 5 estimulada com MPHOSPH1-A02-9-129 (SEQ ID NO: 14) (b), No. 5 estimulada com MPHOSPH1-A02-9-846 (SEQ ID NO: 64) (c), No. 2 estimulada com MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73) (d), No. 1 estimulada com MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77) (e), No. 1 estimulada com MPHOSPH1-A02-10-407 (SEQ ID NO: 79) (f), No. 4 estimulada com MPHOSPH1-A02-10-923 (SEQ ID NO: 97) (g), No. 5 estimulada com MPHOSPH1-A02-10-1484 (SEQ ID NO: 103) (h) e No. 8 estimulada com MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) (i), que mostraram atividade de CTL específica de peptídeo em ensaio ELISPOT de IFN- gama foram expandidas e estabeleceram as linhagens CTL (Figura 2). A atividade de CTL dessas linhagens de CTL foi medida através de ELISA de IFN-gama. As linhagens de CTL demonstraram produção de IFN-gama potente contra células T2 pulsadas com o peptídeo correspondendo comparado com células T2 sem pulso de peptídeo. Ainda, os clones de CTL foram estabelecidos por diluição limitante das linhagens de CTL conforme descrito em "Materiais e Métodos"e produção de IFN-gama a partir de clones de CTL contra células T2 pulsadas com peptídeo correspondente foi medida através de ELISA de IFN- gama. Produção de IFN-gama potente foi observada a partir dos clones estimulados com MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5) (a), MPHOSPH1-A02-9-846 (SEQ ID NO: 64) (b), MPHOSPH1-A02-10- 460 (SEQ ID NO: 73) (c), MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77) (d) e MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) (e) (Figura 3).
Atividade de CTL específica contra células-alvo expressando MPHOSPH1 e HLA-A*0201
[000252] O clone de CTL estabelecido foi examinado quanto à habilidade em reconhecer células-alvo que expressam MPHOSPH1 e molécula de HLA-A*0201. O clone de CTL estimulado com MPHOSPH1- A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) mostrou atividade de CTL potente contra células J82 que expressam ambos o MPHOSPH1 e o HLA-A*- 0201. Por outro lado, nenhuma atividade de CTL específica significan- te foi detectada contra células HT1376 que expressam MPHOSPH1, mas não HLA-A*0201 e células T1 que expressam HLA-A*0201, mas não MPHOSPH1 (Figura 4). Desta maneira, esses dados demonstram claramente que peptídeo MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) foi endogenamente processado e expresso nas células-alvo com molécula de HLA-A*0201 e foi reconhecido pelos CTLs.
Atividade citotóxica contra linhagem de célula de tumor expressando MPHOSPH1 e HLA-A*0201
[000253] Os clones de CTL estabelecidos foram examinados quanto à sua habilidade em reconhecer e matar linhagens de célula de tumor que expressam MPHOSPH1 e HLA-A*0201. O clone de CTL estimulado com MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) mostrou atividade citotóxica potente contra células UMUC-3 que expressa ambos o MPHOSPH1 e o HLA-A*0201. Por outro lado, nenhuma atividade cito- tóxica significante foi detectada com ambos os clones de CTL contra células MKN45 que expressam MPHOSPH1, mas não HLA-A*0201 e células T2 que expressam HLA-A*0201, mas não MPHOSPH1 (Figura 5). Esses resultados indicam que peptídeo MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) derivado de MPHOSPH1 pode estar disponível para aplicar as vacinas para câncer a pacientes com tumores expressando MPHOSPH1.
Atividade de CTL específica contra células-alvo expressando MPHOSPH1 e HLA-A*0206
[000254] A linhagem de CTL estabelecida criada contra peptídeo MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) foi examinada quanto à habilidade em reconhecer células-alvo que expressam MPHOSPH1 e molécula de HLA-A*0206, células COS transfectadas com ambos o MPHOSPH1 e o gene HLA-A*0206 (um modelo específico para as células-alvo que expressam o MPHOSPH1 e o gene HLA-A*0206) foram preparadas como células estimuladoras, e células COS7 transfectadas ou com MPHOSPH1 de comprimento integral ou HLA-A*0206 foram usadas como controles. Na Figura 6, o clone de CTL estimulado com MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) mostrou atividade de CTL potente contra células COS7 expressando ambos o MPHOSPH1 e o HLA-A*0206. Por outro lado, nenhuma atividade de CTL específica significante foi detectada contra os controles. Desta maneira, esses dados demonstram claramente que peptídeo MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) é endogenamente processado e expresso nas células-alvo com molécula de HLA-A*0206 e foi reconhecido pelos CTLs.
Análise de homologia de peptídeos de antígeno
[000255] Os CTLs estimulados com MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5), MPHOSPH1-A02-9-129 (SEQ ID NO: 14), MPHOSPH1-A02-9- 846 (SEQ ID NO: 64), MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73), MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77), MPHOSPH1-A02-10-407 (SEQ ID NO: 79), MPHOSPH1-A02-10-923 (SEQ ID NO: 97), MPHOSPH1-A02-10-1484 (SEQ ID NO: 103) e MPHOSPH1-A02-10- 282 (SEQ ID NO: 120) mostraram atividade de CTL significante e específica. Este resultado pode ser devido ao fato que as sequências de MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5), MPHOSPH1-A02-9-129 (SEQ ID NO: 14), MPHOSPH1-A02-9-846 (SEQ ID NO: 64), MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73), MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77), MPHOSPH1-A02-10-407 (SEQ ID NO: 79), MPHOSPH1-A02-10-923 (SEQ ID NO: 97), MPHOSPH1-A02-10-1484 (SEQ ID NO: 103) e MPHOSPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120) são homólogas a peptídeo derivado de outras moléculas que são conhecidas sensibilizar o sistema imune humano. Para excluir esta possibilidade, análises de homologia foram realizadas para essas sequências de peptídeo usando como investigações o algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)que revelou nenhuma sequência com homologia significante. Os resultados de análises de ho- mologia indicam que as sequências de MPHOSPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5), MPHOSPH1-A02-9-129 (SEQ ID NO: 14), MPHOSPH1- A02-9-846 (SEQ ID NO: 64), MPHOSPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73), MPHOSPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77), MPHOSPH1-A02-10- 407 (SEQ ID NO: 79), MPHOSPH1-A02-10-923 (SEQ ID NO: 97), MPHOSPH1-A02-10-1484 (SEQ ID NO: 103) e MPHOSPH1-A02-10- 282 (SEQ ID NO: 120) são únicas e, então, há pouca possibilidade, dentro do conhecimento da requerente, que esta molécula aumente a resposta imunológica não intencionada para alguma molécula não relacionada.
[000256] Concluindo, os novos peptídeos de epitopo HLA-A*0201 derivados de MPHOSPH1 identificados aqui podem encontrar utilidade no campo de imunoterapia de câncer.
Aplicabilidade Industrial
[000257] A presente invenção provê novos TAAs, particularmente aqueles derivados de MPHOSPH1, que podem induzir respostas imunes antitumor potentes e específicas e então têm aplicabilidade para uma ampla variedade de tipos de cânceres. Tais TAAs podem encontrar uso como vacinas de peptídeo contra doenças associadas com MPHOSPH1, por exemplo, câncer, mais particularmente câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, câncer colorretal, câncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteossar- coma, câncer de próstata, câncer renal e tumor de tecido mole.
[000258] Embora a presente invenção seja aqui descrita em detalhes e com referência às suas modalidades específicas, deve ser compreendido que a descrição acima é de natureza exemplar e explicativa e pretende ilustrar a presente invenção e suas modalidades preferidas. Através de experimentação de rotina, um versado na técnica vai reconhecer prontamente que várias mudanças e modificações podem ser feitas nelas sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção, cujos limites são definidos pelas reivindicações apensas.

Claims (10)

1. Composição para indução de um linfócito T citotóxico (CTL), caracterizada pelo fato de que a composição compreende um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 120.
2. Composição para indução de uma célula apresentadora de antígeno (APC) tendo capacidade de indução de CTL, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 120.
3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo consistindo em uma sequência de ami- noácido da SEQ ID NO: 120.
4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que é para uso em um ou ambos o tratamento e a profilaxia de câncer, ou indução de uma resposta imune contra câncer em um indivíduo.
5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é formulada para administração a um indivíduo cujo antígeno HLA é HLA-A2.
6. Método in vitro para indução de uma célula apresentadora de antígeno (APC) tendo capacidade de indução de CTL, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de contatar uma APC com um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 120 in vitro.
7. Método para indução in vitro de um CTL, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de co-cultivar uma célula T positiva para CD8 com uma APC que apresenta em sua superfície um complexo de um antígeno HLA e um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 120.
8. Uso de um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 120, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica para um ou ambos de tratamento e profilaxia de câncer em um indivíduo.
9. Uso de um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 120, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica para indução de uma resposta imune contra câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo.
10. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo codificando um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 120.
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