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TW201313737A - Ｍｐｈｏｓｐｈ１胜肽及含其之疫苗 - Google Patents

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Ryuji Osawa
Sachiko Yoshimura
Tomohisa Watanabe
Yusuke Nakamura
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Oncotherapy Science Inc
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Abstract

如於此所詳細討論，來自MPHOSPH1經分離的胜肽，其與一人類白血球組織抗原結合且誘發細胞毒殺性T淋巴球，且因此適合用於癌症免疫治療，特別是癌症疫苗的背景中。本發明胜肽包括上述MPHOSPH1衍生之胺基酸序列與其經修飾之變體，於經修飾之變體中，一、二或數個胺基酸被取代、刪除、插入或加入，提供維持原始序列必不可缺之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的該經修飾之胜肽。更提供編碼出任何上述胜肽的多核苷酸與包括任何上述胜肽或多核苷酸的藥學試劑或組合物。本發明之胜肽、多核苷酸及藥學試劑或組合物於癌症與腫瘤之治療與避免之任一或兩者中提供特別的效用，癌症與腫瘤包括，例如，膀胱癌、乳癌、子宮頸癌(cervical cancer)、膽管細胞癌(cholangiocellular carcinoma)、慢性骨髓性白血病(chronic myeloid leukemia,CML)、大腸癌(colorectal cancer)、胃癌、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)、淋巴癌、骨肉瘤(osteosarcoma)、攝護腺癌(prostate cancer)、腎癌(renal cancer)與軟組織腫瘤

Description

MPHOSPH1胜肽及含其之疫苗
本發明係關於生物科學領域，更特別對於癌症治療領域。特別是，本發明係關於新穎之胜肽，其當作癌症疫苗及治療與避免腫瘤兩者或之一的藥物為有效。
已證實細胞毒殺性T淋巴球(CTLs)辨認來自建造於主要組織相容性抗原複合體(major histocompatibility complex,MHC)class I分子上之腫瘤相關抗原(tumor-associated antigens,TAAs)的抗原決定位胜肽，且之後殺死腫瘤細胞。自從發現黑色素瘤抗原(melanoma antigen,MAGE)家族，藉由免疫方法，已發現許多其他腫瘤相關抗原(NPL 1,Boon T,Int J Cancer 1993 May 8,54(2)：177-80；NPL 2,Boon T & van der Bruggen P,J Exp Med 1996 Mar 1,183(3)：725-9)。這些腫瘤相關抗原的一些目前正受到臨床發展之過程為免疫治療標的。
合適的腫瘤相關抗原係對於癌症細胞增殖與存活為必須的。使用此類腫瘤相關抗原為免疫治療標的可將廣為敘述之癌細胞免疫逃脫(immune escape)的風險最小化，而癌細胞免疫逃脫為治療性驅使免疫篩選的結果，歸因於腫瘤相關抗原的刪除、突變或向下調控。所以，能誘導有效且專一之抗腫瘤免疫反應的新腫瘤相關抗原的辨認成為更進一步發展的根據，且因此對於多種形式癌症之胜肽疫苗接 種策略(vaccination strategies)的臨床研究為正進行著(NPL 3,Harris CC,J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20)：1442-55；NPL 4,Butterfield LH et al.,Cancer Res 1999 Jul 1,59(13)：3134-42；NPL 5,Vissers JL et al.,Cancer Res 1999 Nov 1,59(21)：5554-9；NPL 6,van der Burg SH et al.,J Immunol 1996 May 1,156(9)：3308-14；NPL 7,Tanaka F et al.,Cancer Res 1997 Oct 15,57(20)：4465-8；NPL 8,Fujie T et al.,Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2)：169-72；NPL 9,Kikuchi M et al.,Int J Cancer 1999 May 5,81(3)：459-66；NPL 10,Oiso M et al.,Int J Cancer 1999 May 5,81(3)：387-94)。迄今已報導，使用這些腫瘤相關抗原衍生胜肽的許多臨床試驗。不幸的是，許多之目前癌症疫苗試驗已顯示低的客觀反應率(objective response rate)(NPL 11,Belli F et al.,J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20)：4169-80；NPL 12,Coulie PG et al.,Immunol Rev 2002 Oct,188：33-42；NPL 13,Rosenberg SA et al.,Nat Med 2004 Sep,10(9)：909-15)。因此維持新穎之腫瘤相關抗原做為免疫治療標的的於本技術領域中的需要。
MPHOSPH1(M相磷酸蛋白質1(M-phase phosphoprotein 1)；GenBank Accession No.NM_016195與NP_057279，序列辨識號：125與126)被定義為被特定磷酸化於G2/M過渡(transition)之蛋白質之一且以正端相關驅動蛋白相關之蛋白質(plus-end-directed kinesin related protein)為特徵(NPL 14,Abaza A et al.,J Biol Chem 2003,278：27844-52.)。更特別的是，MPHOSPH1已被報導為一正端相關分子驅動子(plus-end-directed molecular motor)，其於細胞質分裂(cytokinesis)中扮演一種要角色且在HeLa細胞中於細胞分裂後期(anaphase)至末期(telophase)期間累積於紡錘體之中間區中(NPL 14,Abaza A et al.,J Biol Chem 2003,278：27844-52；NPL 15,Kamimoto T et al.,J Biol Chem 2001,276：37520-8)。在使用包含23,040個基因之基因體寬度(genome-wide)cDNA微陣列的基因表現圖譜分析(gene expression profile analyses)的過程中，確認MPHOSPH1為於膀胱癌中被向上調控之一新穎的分子(NPL 16,Kanehira M et al.,Cancer Res.2007 Apr 1；67(7)：3276-85.；PTL 1,WO2006/085684)。此外，經由北方墨點分析，發現MPHOSPH1基因產物之表現被限定至睪丸且不存在於正常重要組織中。
已先前確認了具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之源自MPHOSPH1的一些片段(PTL 2,WO2008/047473)。這些胜肽片段顯示誘導抗以相近胜肽片段(cognate peptide fragments)刺激之細胞的細胞毒殺性T淋巴球的能力。然而，先前研究無法確認是否胜肽片段具有誘導以表現MPHOSPH1基因與HLA-A2抗原之腫瘤細胞為目標的細胞毒殺性T淋巴球的能力。
【引用文獻】
專利文獻(Patent Literature)
[PTL 1] WO2006/085684
[PTL 2] WO2008/047473
非專利文獻(Non Patent Literature)
[NPL 1] Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80
[NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3)： 725-9
[NPL 3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55
[NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42
[NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9
[NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14
[NPL 7] Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8
[NPL 8] Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72
[NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66
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[NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80
[NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42
[NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15
[NPL 14] Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278: 27844-52.
[NPL 15] Kamimoto T et al., J Biol Chem 2001, 276: 37520-8
[NPL 16] Kanehira M et al., Cancer Res. 2007 Apr 1; 67(7): 3276-85.
本發明部分至少基於發現新穎之胜肽其可作為免疫治療之適合標的。由於腫瘤相關抗原(tumor-associated antigens,TAAs)有時被免疫系統感知為“自身”且因此常不具有免疫抗原性(immunogenicity)，所以適合標的的發現極度重要。如上所提到，MPHOSPH1(例如由GenBank獲得編號NM_016195(序列辨識號：125)之基因所編碼出之序列辨識號：126)已確認為在癌症中為向上調控，癌症之例子包括，但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌(cervical cancer)、膽管細胞癌(cholangiocellular carcinoma)、慢性骨髓性白血病(chronic myeloid leukemia,CML)、大腸癌(colorectal cancer)、胃癌、非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC)、淋巴癌、骨肉瘤(osteosarcoma)、攝護腺癌(prostate cancer)、腎癌(renal cancer)與軟組織腫瘤。因此本發明聚焦於MPHOSPH1為一癌症/腫瘤免疫治療之標的的候選物，更特別是可作為適合之免疫治療標的之新穎MPHOSPH1抗原決定位胜肽。
為此目的，本發明至少部分關於在衍生自MPHOSPH1之胜肽中之具有誘導專一於MPHOSPH1之細胞毒殺性T淋巴球之能力的特定抗原決定位胜肽的確認。更詳細如下所討論，使用與HLA(人類白血球組織抗原)-A＊0201結合之來自MPHOSPH1的候選胜肽來刺激自健康提供者獲得之周邊血液單核球細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。之後以抗(against)經各候選胜肽脈衝(pulsed)之HLA-A2陽性目標細胞的細胞毒性建立細胞毒殺性T淋巴球。此處結果證明這些胜肽為HLA-A2限制的抗原決定位胜肽，其可誘導強而專一之抗表現MPHOSPH1之細胞的免疫反應。這些結果更指出MPHOSPH1為強效致免疫性且其抗原決定位為癌症/腫瘤免疫治療之有效目標。
因此，本發明一目的為提供經分離的胜肽，其與HLA抗原結合且誘導細胞毒殺性T淋巴球，其中此胜肽包括MPHOSPH1(序列辨識號：126)之一免疫活性片段。此類胜肽可被來in vitro或ex vivo誘導細胞毒殺性T淋巴球或可被直接投予一個體以便in vivo誘導抗癌症的免疫反應，癌症的例子包括，但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、 膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、淋巴癌、骨肉瘤、攝護腺癌、腎癌與軟組織腫瘤。
本發明之胜肽長度一般少於15、14、13、12、11或10個胺基酸。本發明之較佳胜肽為九胜肽與十胜肽。特別較佳胜肽具有擇自於序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120中之一胺基酸序列，由於那些胜肽顯示與HLA-A2抗原結合並誘導細胞毒殺性T淋巴球。
因此，在一些實施例中，本發明之胜肽為於長度少於於15、14、13、12、11或10個胺基酸的胜肽，其具有胺基酸序列係擇自序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120中。在典型之實施例中，本發明之胜肽為九胜肽或十胜肽，其具有一胺基酸序列擇自序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120中。此外，如於此所證明，具有序列辨識號：120之胺酸序列的一胜肽被確認誘導以表現MPHOSPH1與HLA-A2抗原之腫瘤細胞為目標的細胞毒殺性T淋巴球。因此，在較佳實施例中，本發明之胜肽為具有序列辨識號：120之胺酸序列的胜肽。
當與抗原呈現細胞in vitro、ex vivo或in vivo接觸時，本發明之胜肽會與於抗原呈現細胞細胞上之HLA-A2抗原上結合並被呈現於抗原呈現細胞上為帶有HLA-A2抗原之複合物。或者，本發明之胜肽可被抗原呈現細胞所帶入，處理成由擇自序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120中之一胺基酸序列所構成的片段於抗原呈現細胞中，並被呈現於抗原呈現細胞上為帶有HLA-A2抗原 之複合物。所以，專一於此類胜肽之細胞毒殺性T淋巴球被誘導且此類細胞毒殺性T淋巴球被視為本發明之要素。
本發明也考慮經修飾之胜肽，其具有一胺基酸序列，於其中一、二或數個胺酸被取代、刪除、插入及/或加入於擇自序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120中的胺基酸序列，只要經修飾之胜肽維持等同於原始未經修飾之胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。為此目的，本發明提供於長度少於15、14、13、12、11或10個胺基酸的一經分離之胜肽，其具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力且包括擇自由下列所組成之群組的胺基酸序列；(i)在擇自由序列辨識號：5、14與64所組成之群組之胺基酸序列中，1、2或數個胺基酸被取代的胺基酸序列，與(ii)(i)之胺基酸序列，其中此胺基酸序列具有下列特徵之一或兩者：(a)來自此序列辨識號之N端之第二個胺基酸為擇自由白胺酸與甲硫丁胺酸所組成之群組；以及(b)此序列辨識號之C端胺基酸為擇自由纈氨酸與白胺酸所組成之群組。
此外，本發明也提供在長度少於15、14、13、12或11個胺基酸的一經分離的胜肽，其具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力且包括擇自由下列所組成之群組的胺基酸序列： (i’)在擇自由序列辨識號：73、77、79、97、103與120所組成之群組之胺基酸序列中，1、2或數個胺基酸被取代的胺基酸序列，與(ii’)(i’)之胺基酸序列，其中此胺基酸序列具有下列特徵之一或兩者：(a)來自此序列辨識號之N端之第二個胺基酸為擇自由白胺酸與甲硫丁胺酸所組成之群組；以及(b)此序列辨識號之C端胺基酸為擇自由纈氨酸與白胺酸所組成之群組。
如於此所證實，此類胜肽可與於抗原呈現細胞上之HLA-A2抗原結合並被呈現於抗原呈現細胞上為帶有HLA-A2抗原之複合物。或者，此類胜肽可被抗原呈現細胞所帶入，處理成由擇自(i)、(ii)、(i’)(ii’)中之一胺基酸序列所構成的片段於抗原呈現細胞中，並被呈現於抗原呈現細胞上為帶有HLA-A2抗原之複合物，當這些胜肽與抗原呈現細胞接觸時。所以，專一於此類胜肽之細胞毒殺性T淋巴球被誘導且此類細胞毒殺性T淋巴球被視為本發明之要素。
本發明更包括編碼出本發明任何胜肽之經分離之多核苷酸。這些多核苷酸可被用來誘導或製備具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的抗原呈現細胞。如同上述本發明胜肽，此類抗原呈現細胞可被投予至一個體以誘導抗癌之免疫反應。
當投予一個體時，本發明之胜肽被表現於抗原呈現細 胞之表面以便誘導將分別之胜肽做為目標之細胞毒殺性T淋巴球。因此，本發明一目標為提供誘導抗原呈現細胞與細胞毒殺性T淋巴球之任一或兩者的試劑或組合物，此種試劑或組合物包括本發明所提供一或多個胜肽或多核苷酸。此試劑或組合物也可用於一或多種目的，擇自癌症之治療、癌症之預防與癌症之手術後復發的避免中。做為目標之癌症之例子，包括，但不限於，膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、淋巴癌、骨肉瘤、攝護腺癌、腎癌與軟組織腫瘤。因此，本發明又另一目標為提供用於癌症之治療及/或預防，及/或其手術後復發的避免的藥學試劑或組合物，此藥物被配製來包括一或多個本發明之胜肽或多核苷酸。代替本發明胜肽或多核苷酸或除了本發明之胜肽或多核苷酸外，本發明藥學試劑或組合物可包括呈現任何之本發明之胜肽的抗原呈現細胞或外吐小體為活性成分。
本發明之胜肽或多核苷酸可被用來誘導於其表面上呈現HLA抗原與本發明胜肽的複合物的抗原呈現細胞，例如，藉由將抗原呈現細胞與本發明之胜肽接觸或將編碼出本發明之一胜肽的多核苷酸引入抗原呈現細胞。此種抗原呈現細胞具有誘導專一辨認呈現本發明目標胜肽於其表面上之細胞之細胞毒殺性T淋巴球的能力，且提供用途於癌症免疫治療。因此，本發明包括誘導具細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的方法與藉由此方法獲得之抗原呈現細胞。此外，本發明也包含用於誘導抗原呈現細胞 中的試劑或組合物，此類試劑或組合物包括本發明之任何胜肽或多核苷酸。
本發明更進一步之一目標為提供誘導細胞毒殺性T淋巴球的一方法，此種方法包括將CD8陽性T細胞與表現本發明胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體共培養之步驟，或引入編碼出T細胞受體(TCR)次單元兩者之多核苷酸或編碼出T細胞受體(TCR)次單元之各個的多核苷酸的步驟，其中此T細胞受體可與本發明之胜肽與呈現於細胞表面上之一HLA抗原的複合物結合。藉由此種方法獲得之細胞毒殺性T淋巴球可在癌症之治療與癌症之避免之任一或兩者中提供用途。癌症之例子包括，但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、淋巴癌、骨肉瘤、攝護腺癌、腎癌與軟組織腫瘤。
本發明又另一目標為提供經分離之抗原呈現細胞，其於表面呈現一HLA抗原與本發明一胜肽的一複合物。本發明更提供經分離之細胞毒殺性T淋巴球，其以本發明之胜肽為目標。這些抗原呈現細胞與細胞毒殺性T淋巴球提供效用於癌症免疫治療之內容。
本發明又另一目標為提供於一需要之個體中誘導抗癌症之免疫反應的方法，此方法包括投予一包含至少一成分擇自本發明之胜肽、編碼出此類胜肽之多核苷酸、呈現此類胜肽之外吐小體或抗原呈現細胞與辨認於它們表面上呈現此類胜肽之細胞之細胞毒殺性T淋巴球的試劑或組合物 的步驟。
本發明之應用性擴展至一些關於或起因於MPHOSPH1過度表現的疾病的任一個，例如癌症，癌症的例子包括，但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、淋巴癌、骨肉瘤、攝護腺癌、腎癌與軟組織腫瘤。
又，本發明提供下列事項：
[1]一種下列(a)或(b)之經分離的胜肽：(a)一胜肽，包括擇自由序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120所組成之群組的胺基酸序列；(b)一胜肽，包括一胺基酸序列，其1、2或數個胺基酸被取代、刪除、插入及/或加入於擇自由序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120所組成之群組的胺基酸序列中，且其中該胜肽具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。
[2]如[1]所述之經分離的胜肽，其中該胜肽具有下列特徵之一或兩者：(a)從擇自由序列辨識號5、14、64、73、77、79、97、103與120所組成之群組之胺基酸序列的N端的第二個胺基酸為擇自由白胺酸與甲硫丁胺酸所組成之群組；以及(b)擇自由序列辨識號5、14、64、73、77、79、97、103與120所組成之群組之胺基酸序列的C端胺基酸為擇自由纈胺酸與白胺酸所組成之群組。
[3]如[1]至[2]所述之經分離的胜肽，其中該胜肽為九 胜肽或十胜肽。
[4]一種經分離之多核苷酸，其編碼出[1]至[3]之任一項所述的胜肽。
[5]一種誘發細胞毒殺性T淋巴球之組合物，其中該組合物包括一或多個如[1]至[3]之任一項所述之胜肽，或一或多個如[4]所述之多核苷酸。
[6]一種用於誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的組合物，其中該組合物包括一或多個如[1]至[3]之任一項所述之胜肽或一或多個如[4]之多核苷酸。
[7]一種藥學組合物，包括擇自由下列所組成之群組的至少一活性成分(a)一或多個如[1]至[3]之任一項所述之胜肽；(b)一或多個編碼出如[1]至[3]之任一項所述之胜肽的多核苷酸；(c)一或多個抗原呈現細胞或外吐小體，其呈現如[1]至[3]之任一項所述之胜肽與一人類白血球組織抗原的一複合物於其表面上；與(d)一或多個細胞毒殺性T淋巴球，其辨認表現如[1]至[3]之任一項所述之胜肽與一人類白血球組織抗原的一複合物於其表面上的一細胞。
[8]如[7]所述之藥學組合物，用於癌症之治療與預防之任一或兩者，或於一個體中誘導抗癌症免疫反應。
[9]如[7]或[8]所述之藥學組合物，其中該藥學組合物被配製來用於投予一個體，其人類白血球組織抗原為人類 白血球組織抗原-A2。
[10]一種誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的方法，該方法包括擇自由下列所組成之群組的一步驟：(a)in vitro、ex vivo或in vivo將一抗原呈現細胞與如[1]至[3]之任一項所述之胜肽接觸，以及(b)將編碼出如[1]至[3]之任一項所述之胜肽的一多核苷酸引入一抗原呈現細胞。
[11]一種誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法，該方法包括擇自由下列所組成之群組的一步驟：(a)將CD8陽性T細胞與抗原呈現細胞共培養，抗原呈現細胞表現一人類白血球組織抗原與如[1]至[3]之任一項所述之胜肽的一複合物於其表面上；(b)將CD8陽性T細胞與外吐小體共培養，外吐小體表現一人類白血球組織抗原與如[1]至[3]之任一項所述之胜肽的一複合物於其表面上，以及(c)將編碼出T細胞受體次單元兩者的一多核苷酸或編碼出T細胞受體次單元之各個的多核苷酸引入一CD8陽性T細胞，其中該T細胞受體可與呈現於一細胞上之一人類白血球組織抗原與[1]至[3]之任一項所述之胜肽的一複合物結合。
[12]一種經分離之抗原呈現細胞，其表現一人類白血球組織抗原與如[1]至[3]之任一項所述之胜肽的一複合物於其表面上。
[13]如[12]所述之抗原呈現細胞，其藉由如[10]所述之方法來誘導。
[14]一種經分離之細胞毒殺性T淋巴球，其辨認於其表面呈現一人類白血球組織抗原與如[1]至[3]之任一項所述之胜肽的一複合物的一細胞。
[15]如[14]所述之細胞毒殺性T淋巴球，其中該細胞毒殺性T淋巴球藉由如[11]所述之方法來誘導。
[16]一種於一個體中之癌症之治療與預防之任一或兩者的方法，其中該方法包括一步驟，其投予該個體(一)藥學有效量之：(a)一或多個如[1]至[3]之任一項所述之胜肽；(b)一或多個編碼出如[1]至[3]之任一項所述之胜肽的多核苷酸；(c)一或多個抗原呈現細胞或外吐小體，其呈現如[1]至[3]之任一項所述之胜肽與一人類白血球組織抗原的一複合物於其表面上；與(d)一或多個細胞毒殺性T淋巴球，其辨認表現如[1]至[3]之任一項所述之胜肽與一人類白血球組織抗原的一複合物於其表面上的一細胞。
[17]一種於一需要個體中誘導一抗癌症之免疫反應的方法，該方法包括投予該個體一組合物的步驟，該組合物包括如[1]至[3]之任一項所述之胜肽或編碼出該胜肽之一多核苷酸。
[18]一種抗體或其免疫活性片段，其抗如[1]至[3]之 任一項所述之胜肽。
[19]一種載體，包括編碼出如[1]至[3]之任一項所述之胜肽的一核苷酸序列。
[20]一種宿主細胞，其被以如[19]所述之載體所轉形或轉染。
[21]一種診斷套組，包括如[1]至[3]之任一項所述之胜肽、如[4]所述之多核苷酸或如[18]所述之抗體。
當以下詳細說明被閱讀並結合伴隨之圖式與實施例，本發明之目的與特徵會變的更完全地明白。可瞭解的是，上面之本發明內容與以下之詳細說明兩者為示範之實施例，並不限制本發明或本發明其他替代實施例。
特別是，當關於一些特定實施例於此敘述之本發明，可以瞭解的是，敘述為本發明之說明，且並不建構為本發明之限制。各種修飾與應用可被熟悉此技藝人士想到，而無背離本發明精神與範圍，如所附申請專利範圍所述。同樣地，本發明之其他目的、特徵、好處與優點自此內容與下述之特定實施例，為清楚的，且對於熟悉此技藝人士而言可立即明白。此種目的、特徵、好處與優點自上述結合伴隨實施例、資料、圖式與所有要被自其單獨或隨著考慮引入於此之參考文獻而描述的所有合理推論為清楚的。
雖然於本發明實施例之實施或測試中可使用相似或等同於在此敘述之那些的任何方法與材料，但是現在敘述較 佳之方法、元件與材料。然而在敘述本發明材料與方法之前，需瞭解的是，說明書僅為說明，且不意指為限制。需瞭解的是，本發明並不限於敘述於此之特定大小、形狀、尺寸、材料、方法學、步驟等，例如按照慣例實驗法及/或最佳化可將其變更。此外，於此敘述中使用之專門用語僅是為了敘述特別之變化形式或實施例，且不傾向限制僅會受限於所附上之申請專利範圍的本發明範圍。
於本說明書中提及之各刊物、專利或專利申請的揭露於此以其內容被具體引入為參考文獻。然而，於此並沒有被解釋為承認本發明由於先前發明之效力不被給予先於這些揭露之權力。
除非特別定義，於此使用屬與本發明之所有技術或科學用語為與熟悉此技藝人士所通常瞭解之意義相同。若發生抵觸，本發明說明書，包括定義將會控制。此外，材料方法與實施例為僅為說明性，且不意味為限制。
I.定義
於此使用之單字“一”與“該”意指“至少一”除非以別的方式明確指出。
使用於與一物質(例如，胜肽、抗體、多核苷酸等)相關之措辭“分離”與“純化”意指此物質其實質上沒有至少一可被另外包含於自然來源中之物質。因此，一經分離或純化之胜肽意指一胜肽其實質上沒有細胞材料，例如碳水化合物、脂質或其他來自胜肽所源自之細胞或組織來源的其他污染蛋白質，或當化學合成時，實質上沒有化學前 驅物或其他化學物。措辭“實質上沒有細胞材料”包括，於其中胜肽從細胞之細胞組成被分離之胜肽的製備，而從此細胞其被分離或重組產生。因此，一胜肽其實質上沒有細胞材料，包括具有小於30%、20%、10%或5%(以乾重)之異源蛋白質(此處也意指為一“污染蛋白質”)的多胜肽的製備。當胜肽被重組產生時，也較佳為實質上沒有培養基，其包括具有少於約20%、10%或5%之胜肽製備體積之培養基的胜肽製備。當胜肽藉由化學合成產生時，較佳為實質上沒有化學前驅物或其他化學物，其包括具有包含於胜肽合成小於約30%、20%、10%或5%(以乾重)之胜肽製備體積的化學前驅物或其他化學物的胜肽製備。可顯示特別之胜肽製備，其包含一經分離或經純化之胜肽，例如，藉由在蛋白質製備之十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(sodium dodecyl sulfate(SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis)與考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)染色後的一單一條帶的出現或膠體的類似物。在較佳實施例中，本發明之胜肽與多核苷酸被分離或純化。
於此可替換使用之用語“多胜肽”、“胜肽”與“蛋白質”意指胺基酸殘基之一聚合物。此用語適用於胺基酸聚合物，於其中一或多個胺基酸殘基為經修飾之殘基或非自然發生之殘基，例如對應自然發生胺基酸之人工化學模仿物，與自然發生胺基酸聚合物。
於本說明書中有時使用之用語“寡胜肽”被用來意指 本發明之胜肽，其為20個殘基或更少，一般為15個殘基或更少，且一般為由介於約8與約11個之間的殘基，通常為9或10個的殘基所組成。於此後者分別意指為“九胜肽”或“十胜肽”。
於此使用之用語“胺基酸”意指自然發生與合成之胺基酸，及胺基酸類似物與胺基酸模仿物，其與自然發生之胺基酸起相似作用。胺基酸可為L-胺基酸或D-胺基酸。自然發生胺基酸為基因密碼所編碼的那些與於細胞中在轉譯後被修飾的那些(例如羥脯胺酸(hydroxyproline)、γ-羧基谷胺酸(gamma-carboxyglutamate)與O-磷絲胺酸(O-phosphoserine))。措辭“胺基酸類似物”意指具有與自然發生胺基酸相同之基礎化學結構(一α碳鍵結至一氫、一羧基、一胺基與一R基)的化合物，但具有一或多個經修飾之R基或經修飾之骨架(例如，同絲胺酸(homoserine)、降亮胺酸(norleucine)、甲硫胺酸(methionine)、亞碸(sulfoxide)、甲基硫氨磺(methionine methyl sulfonium))。措辭“胺基酸模仿物”意指化學化合物其與一般胺基酸具有不同結構，但有相似的功能。
可藉由由IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission所建議之其一般所知的三字母符號或一字母符號來指出於此處之胺基酸。
於此可替換使用用語“基因”、“多核苷酸”與“核酸”，且除非以別的特別方式指出，相似於胺基酸其以它們一般被接受的單一字母編碼來指出。
於此可替換使用用語“試劑”與“組合物”與意指一產物，其包括於特定量中特定成分，與任何產物其直接或間接來自於特定量之特定成分的組合。此用語當被使用與修飾詞語“藥學”(如“藥學試劑”與“藥學組合物”)相關時，意指包括一產物，其包括一活性成分與形成載體的惰性成分，及任何產物其直接或間接來自任兩個或多個成份之組合、複合或聚集，或來自一或多個成分之解離，或來自一或多個成分之反應或相互作用的其他形式。因此，在本發明內容中，用語“藥學試劑”與“藥學組合物”意指藉由混合本發明分子或化合物與藥學上或生理上可接受之載體所製成的任何產物。
如此處所使用之措辭“藥學上可接受之載體”或“生理上可接受之載體”意指藥學上或生理上可接受之材料、組合物、物質或載劑，包括，但不限於一液體或固體填充料、稀釋劑、賦形劑、溶劑或套膜材料。
本發明之藥學試劑或組合物提供特別用途為疫苗。在本發明內容中，措辭“疫苗(也意指唯一致免疫性組合物)”意指一試劑或一組合物，其藉由接種進入動物具有誘導抗腫瘤免疫力的功能。
於此使用之用語“活性成分”意指在一試劑或一組合物中的物質，其為生物或生理活躍的。特別是，在一藥學試劑或組合物的內容中，用語“活性成分”意指一物質其顯示一目標的之藥學作用。例如，若藥學試劑或組合物用於癌症之治療或避免中，在試劑或組合物中的活性成分可 直接或間接引起對癌細胞及/或組織的生物或生理作用。較佳為，此作用可包括減低或抑制癌細胞生長、損傷或殺死癌細胞及/或組織等。一般而言，有效成分的間接作用為誘導細胞毒殺性T細胞辨認或殺死癌細胞。在被配製前，“活性成分”也可意指為“主體(bulk)”、“藥物物質(drug substance)”或“技術產物(technical product)”。
除非以別的方式定義，用語“癌症”意指過度表現MPHOSPH1基因之癌症，其例子包括，但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、淋巴癌、骨肉瘤、攝護腺癌、腎癌與軟組織腫瘤。
除非以別的方式定義，於此可替換使用且以別的方式特別指出用語“細胞毒殺性T淋巴球”、“細胞毒殺性T細胞”與“CTL”以意指T淋巴球之次族群，且除非以別的方式指出，意指T淋巴球之次群組(sub-group)可辨認非自身細胞(例如，腫瘤/癌症細胞、被病毒感染之細胞)，且誘導這些細胞死亡。
除非特別定義，用語“HLA-A2”如此處所使用，代表性意指次型，次型之例子包括，但不限於HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、HLA-A*0205、HLA-A*0206、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0211、HLA-A*0213、HLA-A*0216、HLA-A*0218、HLA-A*0219、HLA-A*0228與HLA-A*0250。
除非特別定義，於此使用之用語“套組”被使用於關 於試劑與其他材料之組合。與此考慮之套組包括微陣列、晶片、標誌等。並無打算使用語“套組”限制於試劑及/或材料之特定組合。
如於此使用，在一個體或病患的背景中，措辭“個體之(或病患之)HLA抗原為HLA-A2”意指此個體或病患同型結合地(homozygously)或異質結合地(heterozygously)具有HLA-A2抗原基因為主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex,MHC)Class I分子，且HLA-A2抗原被表現於此個體或病患的細胞中為一HLA抗原。
本發明之方法與組合物之範圍提供用途於癌症之“治療”之內容中，一治療被視為“有效”，若其導致臨床優點，例如於一個體中癌症之大小、普遍程度(prevalence)或轉移潛力的減少、減緩之癌症的發展、癌症之臨床症狀的緩解、存活時間的延長、手術後復發的抑制等。當治療為預防性(prophylactically)提供時，“有效”意指減緩或避免癌症形成，或避免或減輕癌症之臨床症狀。有效性被確認於相關之診斷或治療特定腫瘤形式的任何已知方法。
本發明之方法與組合物之範圍提供用途於癌症之“避免”與“預防”之內容中，此類用詞為與此交替使用意指任何活性，其減少死亡率之負載或來自疾病之死亡率。避免與預防可發生於“初期、第二期與第三期避免層級”。初期避免與預防避免了疾病之發展，而第二期與第三期層 級之避免與預防包括藉由恢復功能與減少疾病相關併發症，以疾病之發展與症狀之浮現及減少已建立之疾病之負向發展的避免與預防為目的。或者，治療或避免可包括一廣範圍之預防疾病治療，其以減緩特別疾病之嚴重度為目標，例如減少腫瘤之增殖與轉移。
在本發明內容中，癌症之治療及/或預防，及/或其手術後復發的避免包括任何等活動，其導致，例如下列事件，例如似癌細胞之生長抑制、腫瘤之衰退或退化、癌發生之減緩與抑制的誘導、腫瘤退化、轉移之減少與抑制、癌症手術後復發的抑制與存活時間的延長。癌症之有效治療及/或預防減少致死率與改善具有癌症之個體的預後、減低癌症標記於血液中的程度與減緩伴隨著癌症之可偵測症狀。例如，症狀之減輕或改善構成有效治療及/或預防，其包括10%、20%、30%或更加減輕，或穩定疾病。
在本發明內容中，用語“抗體”意指免疫球蛋白與其片段，其專一與選定蛋白質或其胜肽反應。一抗體可包括人類抗體、靈長類抗體、嵌合抗體(chimeric antibody)、雙專一抗體(bispecific antibody)、人源化抗體、與其他蛋白質或放射標誌融合之抗體，與抗體片段。此外，此處之抗體被使用於最大效用且特別包含完整單株抗體、多株抗體、形成自至少兩個完整抗體之多專一抗體(multi-specific antibody)(例如雙專一抗體)與抗體片段，只要其存在所需生物活性。一“抗體”意指所有之種類(例如，IgA、IgD、IgE、IgG與IgM)。
II.胜肽
於下方詳述之本發明胜肽可意指為“MPHOSPH1胜肽”或“MPHOSPH1多胜肽”。
為了證明來自MPHOSPH1之胜肽作用如一被細胞毒殺性T淋巴球(CTLs)所辨認之抗原，分析來自MPHOSPH1之胜肽(序列辨識號：126)以確定是否其為由一般遇到HLA對偶基因(allele)之HLA(人類白血球組織抗原)-A2所限制之抗原決定位(Date Y et al.,Tissue Antigens 47：93-101,1996；Kondo A et al.,J Immunol 155：4307-12,1995；Kubo RT et al.,J Immunol 152：3913-24,1994)。
確認來自MPHOSPH1之HLA-A2結合胜肽的候選物根據它們之對於HLA-A2的結合親合力。
此外，in vitro藉由以這些胜肽脈衝(載有)之樹突細胞(dendritic cell,DC)刺激T細胞後，藉由以下列胜肽之各個刺激來成功建立細胞毒殺性T淋巴球：MPHOSPH1-A2-9-850(序列辨識號：5)、MPHOSPH1-A2-9-129(序列辨識號：14)、MPHOSPH1-A2-9-846(序列辨識號：64)、MPHOSPH1-A2-10-460(序列辨識號：73)、MPHOSPH1-A2-10-770(序列辨識號：77)、MPHOSPH1-A2-10-407(序列辨識號：79)、MPHOSPH1-A2-10-923(序列辨識號：97)、MPHOSPH1-A2-10-1484(序列辨識號：103)與MPHOSPH1-A2-10-282(序列辨識號：120)。
這些被建立的細胞毒殺性T淋巴球顯示強而專一之抗經分別之胜肽脈衝之目標細胞的細胞毒殺性T淋巴球活性。這些結果證明MPHOSPH1為一由細胞毒殺性T淋巴球所辨認之抗原，且測試之胜肽為由HLA-A2限制之MPHOSPH1的抗原決定位胜肽；且因此，胜肽可有效為對於藉由細胞毒殺性T淋巴球之細胞毒殺性的目標抗原。此外，MPHOSPH1-A2-10-282(序列辨識號：120)誘導具有強之抗表現MPHOSPH1與HLA-A2抗原為MHC class I分子之兩者的癌症細胞的細胞毒殺活性的細胞毒殺性T淋巴球。此結果建議MPHOSPH1-A2-10-282胜肽in vivo自然發生被呈現於表現MPHOSPH1之癌症細胞上藉由HLA-A2抗原(例如，HLA-A＊0201或HLA-A＊0206)。根據此發現，一胜肽其包含擇自由序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120所組成之群組的胺基酸序列，或其之衍生物、突變(mutant)、變異(variant)或經修飾之胜肽為在對於治療表現MPHOSPH1與HLA-A2抗原之一癌症的免疫治療的內容中是有效的。在本發明之特定實施例中，由於此揭露之胺基酸序列所構成之胜肽可被用於癌症之免疫治療。要被治療之癌症的例子，包括，例如膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、淋巴癌、骨肉瘤、攝護腺癌、腎癌與軟組織腫瘤。然而，本發明之胜肽可被應用於任何癌症，只要它們表現MPHOSPH1與HLA-A2抗原。
由於MPHOSPH1基因被過度表現於癌症細胞，例如膀胱 癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、淋巴癌、骨肉瘤、攝護腺癌、腎癌與軟組織腫瘤，但不被表現於大部分正常器官，所以其為免疫治療之一良好標的。因此，本發明提供來自MPHOSPH1之細胞毒殺性T淋巴球辨認抗原決定位的九胜肽(胜肽由九個胺基酸殘基所組成)與十胜肽(胜肽由十個胺基酸殘基所組成)。或者，本發明提供經分離之胜肽，其與HLA抗原結合且誘導細胞毒殺性T淋巴球，其中胜肽係由MPHOSPH1(序列辨識號：126)之一免疫活性片段所組成。此外，在一些實施例中，本發明提供胜肽，其包括擇自序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120中之胺基酸序列。在較佳實施例中，本發明胜肽為包括序列辨識號：120之胺基酸序列的胜肽。
通常可使用現今於例如網路可得之軟體程式，例如於Parker KC et al.,J Immunol 1994 Jan 1,152(1)：163-75 and Nielsen M et al.,Protein Sci 2003；12：1007-17中所敘述的那些，來計算in silico介於各種胜肽與HLA抗原間之結合親和力。例如，於概述於例如Lafuente EM et al.,Current Pharmaceutical Design,2009,15,3209-3220中之Parker KC et al.,J Immunol 1994 Jan 1,152(1)：163-75,Kuzushima K et al.,Blood 2001,98(6)：1872-81,Larsen MV et al.BMC Bioinformatics.2007 Oct 31；8：424,Buus S et al.Tissue Antigens.,62：378-84,2003,Nielsen M et al.,Protein Sci 2003；12：1007-17, 與Nielsen M et al.PLoS ONE 2007；2：e796中所述可測量與HLA抗原之結合親和力。測量親和力之方法敘述，例如於Journal of Immunological Methods(1995,185：181-190)與Protein Science(2000,9：1838-1846)中。所以熟悉此技藝人士可利用此種軟體程式來選擇來自MPHOSPH1的那些片段，其具有與HLA抗原之高結合親和力。因此本發明包括由來自MPHOSPH1之任何片段所組成之胜肽，其藉由此類已知程式可確認與HLA抗原之結合。此外，此類胜肽可包括由MPHOSPH1之全長胜肽所組成之胜肽。
本發明胜肽，特別是本發明之九胜肽與十胜肽可於側面具有額外之胺基酸殘基，只要胜肽維持其細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。位於特定之額外胺基酸殘基可由任何種類之胺基酸所組成，只它們不減少原始胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。因此，本發明包括具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之胜肽，其中此胜肽包括來自MPHOSPH1之一胺基酸序列。此種胜肽，例如小於約40個胺基酸，時常小於約20個胺基酸，通常小於約15個胺基酸。
一般已知於一胜肽中一、二、數個或多個胺基酸之修飾，不影響胜肽的功能，或在一些例子中，甚至增強原始胜肽所需之功能。事實上，已知經修飾之胜肽(即，胜肽由藉由取代、插入、刪除及/或加入一二或數個胺基酸殘基至一原始胺基酸序列來修飾之胺基酸序列所組成)維持原始胜肽的生物活性(Mark et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1984,81：5662-6；Zoller and Smith,Nucleic Acids Res 1982,10：6487-500；Dalbadie-McFarland et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79：6409-13)。因此，於本發明一實施例中，本發明具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之胜肽可由具有擇自序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120中之胺基酸序列之胜肽所組成，於其中加入、刪除、插入及/或取代一、二或數個胺基酸。在另一實施例中，本發明胜肽可為包括在擇自序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120中之胺基酸序列中一、二或數個胺基酸被取代刪除插入及/或加入之胺基酸序列的胜肽，提供維持原始胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的經修飾胜肽。在較佳實施例中，本發明之胜肽可為包括於其中一、二或數個胺基酸被取代、刪除、插入及/或加入於序列辨識號：120之胺基酸序列中的一胺基酸序列的胜肽，提供維持原始胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的經修飾胜肽。
熟悉此技藝人士會認定改變所有胺基酸序列之一單一胺基酸或一小百分比的個別修飾(即，加入、插入、刪除及/或取代)至一胺基酸序列傾向產生保存原始胺基酸支鏈的特性。其因此意指為“保守取代(conservative substitutions)”或“保守修飾(conservative modifications)”，其中一蛋白質之改變導致一具有相似功能的蛋白質。提供功能相似胺基酸之保守取代表已為本技術領域所熟知。胺基酸支鏈的特徵的例子為疏水胺基酸 (A,I,L,M,F,P,W,Y,V)、親水胺基酸(R,D,N,C,E,Q,G,H,K,S,T)與具有下列共同官能基或特徵之支鏈：一脂肪族支鏈(G,A,V,L,I,P)；一含羥基支鏈(S,T,Y)；含硫原子支鏈(C,M)；含羧酸與胺基支鏈(D,N,E,Q)；含鹼支鏈(R,K,H)；以及含芳香族支鏈(H,F,Y,W)。此外，下列八個族群各包含為彼此保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天門冬醯胺(N)、麩胺醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫丁胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；以及8)半胱胺酸(C)、甲硫丁胺酸(M)(參見，例如Creighton,Proteins 1984)。
此種經保守修飾胜肽也被視為本發明之胜肽。然而，本發明之胜肽並不限於此，且可包括非保守修飾，只要經修飾之胜肽維持原始未經修飾之胜肽之必不可少的細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。更進一步而言，經修飾之胜肽不排除源自多形變體(polymorphic variants)、種間同質體(interspecies homologues)或MPHOSPH1對偶基因(alleles)之細胞毒殺性T淋巴球誘發的胜肽。
胺基酸殘基可被插入、取代、刪除/及或加入至本發明 之胜肽，或者胺基酸殘基可被從其刪除以達到一較高之結合親和力。為了維持必須之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力，較佳為只修飾(插入、刪除、加入及/或取代)一小數目(例如一、二或數個)或小百分比之胺基酸。此處用語“數個”指5或更少個胺基酸，例如4個或3個或更少。被修飾之胺基酸之百分比可為，例如20%或更少，較佳為，15%或更少，更佳為，10%或更少，甚至更佳為或1至5%。
當使用於文中之癌症免疫治療時，本發明之胜肽可被表現於一細胞或外吐小體之表面上如一伴隨HLA抗原之複合物。因此，其較佳為選擇不只誘導細胞毒殺性T淋巴球且也具有對於HLA抗體之高度親和力的胜肽。為此目的，藉由胺基酸殘基之取代、插入、刪除及/或加入可修飾胜肽已產生具有經改善之結合親和力之經修飾的胜肽。除了自然表現之胜肽外，由於已知藉由結合至HLA抗原來表現之胜肽序列的規則(J Immunol 1994,152：3913；Immunogenetics 1995,41：178；J Immunol 1994,155：4307)，可將基於此規則之修飾引入本發明之致免疫性胜肽。
例如，具有高HLA-A2結合親和力之胜肽傾向具有以白胺酸或甲硫丁胺酸取代之來自N端的第二個胺基酸。同樣地，於其中C端胺基酸被以纈胺酸或白胺酸取代的胜肽也可較喜愛地被使用。因此，具有擇自序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120之胺基酸序列的胜肽，其中序列辨識號之胺基酸序列之來自N端的第二個胺基酸 被以白胺酸或甲硫丁胺酸取代，及/或於其中序列辨識號之胺基酸序列之C端胺基酸被以纈胺酸或白胺酸取代，為被本發明所考慮。在另一實施例中，本發明包括胜肽，其具有擇自序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120中之胺基酸序列之來自N端的第二個胺基酸被以白胺酸或甲硫丁胺酸取代及/或序列辨識號之胺基酸序列之C端胺基酸被以纈胺酸或白胺酸取代的胺基酸序列。在較佳實施例中，本發明胜肽可包括於其中序列辨識號：120之胺基酸序列之來自N端的第二個胺基酸被以白胺酸或甲硫丁胺酸取代及/或序列辨識號之胺基酸序列之C端胺基酸被以纈胺酸或白胺酸取代的胺基酸序列。
在一實施例中，本發明提供具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的胜肽，其中胜肽具有一般公式擇自由如下所示(1)至(9)所組成之群組：(1)-對應於MPHOSPH1-A2-9-850(序列辨識號：5)-F[X1]L T I E N E[X2]、(2)-對應於MPHOSPH1-A2-9-129(序列辨識號：14)-F[X1]G C I M Q P[X2]、(3)-對應於MPHOSPH1-A2-9-846(序列辨識號：64)-G[X1]R A F L L T[X2]、(4)-對應於MPHOSPH1-A2-10-460(序列辨識號：73)-Y[X1]A Y D E T L N[X2]、(5)-對應於MPHOSPH1-A2-10-770(序列辨識號：77)-K[X1]I C N E T V E[X2] (6)-對應於MPHOSPH1-A2-10-407(序列辨識號：79)-L[X1]T L G K C I N[X2](7)-對應於MPHOSPH1-A2-10-923(序列辨識號：97)-K[X1]S N E I E T A[X2](8)-對應於MPHOSPH1-A2-10-1484(序列辨識號：103)-Q[X1]V A A L E I Q[X2]與(9)-對應於MPHOSPH1-A2-10-282(序列辨識號：120)-Y[X1]Y D L F V P V[X2]。
在一般公式(1)-(9)中，[X1]為白胺酸或甲硫丁胺酸，且[X2]為纈胺酸或白胺酸。在本發明之一特別較佳之實施例中，一般式可為(9)，其對應於序列辨識號：120。本發明更提供以上方所定義之一般式(1)-(9)所表示之經分離之胜肽，對其於其N端或C端之一或兩者添加一、二或數個胺基酸。在一替代實施例中，本發明提供以上方所定義之一般式(1)-(9)所表示之經分離之胜肽，對其於其N端或C端之一或兩者刪除一、二或數個胺基酸殘基。本發明也提供以一般式(1)-(9)所表示之經分離之胜肽，對其於序列之任何位置插入或刪除一、二或數個胺基酸。
可將取代引入不止於末端胺基酸，也可於胜肽之潛在TCR位的辨認位置。一些研究已證實一具有胺基酸取代之胜肽可具有等於或比原來更好的功能，例如CAP1、p53(264-272),Her-2/neu(369-377)或gp100(209-217)(Zaremba et al.Cancer Res.57,4570-4577,1997,T.K.Hoffmann et al.J Immunol.(2002)Feb 1；168(3)：1338-47.,S.O.Dionne et al.Cancer Immunol immunother.(2003)52：199-206and S.O.Dionne et al.Cancer Immunology,Immunotherapy(2004)53,307-314)。
本發明也考慮一、二個或數個胺基酸的加入也可被加至本發明之胜肽的N與C端之任一或兩者。本發明也包括具有高HLA抗原結合親和力且維持細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之此種經修飾的胜肽。
然而，當胜肽序列與一具有不同功能之內生或外生蛋白質之胺基酸序列的一部份相同時，可能誘導負面副作用，例如自體免疫疾病及/或抗特定物質之過敏症候群。因此，可能需要使用可得之資料庫來執行同源搜尋以避免胜肽之序列符合其他蛋白質之胺基酸序列的情況。當沒有胜肽其相同於或具有一或兩個胺基酸不同之胜肽於關於目標胜肽存在於自然的同源搜尋變得清楚時，為了增加其與HLA抗原之結合親和力，及/或增加其細胞毒殺性T淋巴球誘發能力而不具副作用之任何危險，可修飾目標胺基酸。
雖然如上述之具有對HLA抗原高結合親和力的胜肽被預期為高效能，但根據作為指示之高親和表現而被選擇之候選胜肽，更進一步被測試細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的表現。此處措辭“細胞毒殺性T淋巴球誘發能力”意指當表現於一抗原呈現細胞上時，一胜肽誘導一細胞毒殺性T淋巴球的能力。此外，“細胞毒殺性T淋巴球誘發能力”包括胜肽誘導細胞毒殺性T淋巴球活化、細胞毒殺性T淋巴球增殖、促進藉由細胞毒殺性T淋巴球之目標細胞的分解與增加藉由細胞毒殺性T淋巴球之IFN-γ產生的能力。
藉由誘導攜帶人類MHC抗原之抗原呈現細胞(例如B-淋巴球、巨噬細胞與樹突細胞)或更專一地來自人類周邊血液單核細胞之樹突細胞，並在以測試胜肽之抗原呈現細胞的刺激之後，混合抗原呈現細胞與CD8陽性T細胞，且之後測量由細胞毒殺性T淋巴球產生並釋放之抗目標細胞的IFN-γ來達成細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的確定。如此反應系統，可使用已被產生來表現人類HLA抗原之基因轉殖動物(例如，於BenMohamed L,Krishnan R,Longmate J,Auge C,Low L,Primus J,Diamond DJ,Hum Immunol 2000 Aug,61(8)：764-79,Related Articles,Books,Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice：dependent on MHC(HLA)class II restricted T(H)response中的描述)。或者，可以51Cr放射標示目標細胞，且可從自目標細胞釋放出的放射活性計算細胞毒殺性T淋巴球之細胞素殺活性。或者，其可在攜帶經固定之胜肽的細胞存在下，藉由測量由細胞毒殺性T淋巴球產生並釋放的IFN-γ，並使用抗IFN-γ單株抗體來使於培養基上之抑制區可見來檢驗。
由於如上述測試胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力，發現擇自具有由序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120所指出的胺基酸序列之那些胜肽中的九胜肽與十胜肽顯示細胞毒殺性T淋巴球誘發能力與對HLA抗原之高結合親和力。因此這些胜肽被示例為本發明之較佳 實施例。
此外，同源分析之結果證明此種胜肽不與來自任何其他已知人類基因產物之胜肽共有顯著之同源性。當用於免疫治療時，此降低了未知或不需要之免疫反應的可能性。因此，也來自此態樣，這些胜肽對於在癌症病患中引起抗MPHOSPH1免疫力為有效的。因此具有擇自序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120中之胺基酸序列的胜肽被本發明所包含。
除了如上所討論之修飾之外，本發明胜肽可連接其他胜肽，只要所產生之經連接的胜肽維持原始胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。適合之“其他”胜肽的例子包括：本發明胜肽或來自其他腫瘤相關抗原之細胞毒殺性T淋巴球誘導胜肽。本發明之胜肽經由一連結器可被直接或間接連結至一“其他”胜肽。胜肽間之連結器為被本技術領域所熟知，例如AAY(P.M.Daftarian et al.,J Trans Med 2007,5：26)、AAA、NKRK(R.P.M.Sutmuller et al.,J Immunol.2000,165：7308-7315)或K(S.Ota et al.,Can Res.62,1471-1476,K.S.Kawamura et al.,J Immunol.2002,168：5709-5715)。
例如，也可使用來自非MPHOSPH1腫瘤相關抗原之胜肽以增加經由HLA class I及/或class II之免疫反應。本技術領域已熟知，癌症細胞表現多於一個腫瘤相關基因。源自此類腫瘤相關抗原的一些細胞毒殺性T淋巴球誘導胜肽已被分離(例如，WO2008/047473、WO2010/047062、 WO2008/102557、WO2009/025116)。因此，與本發明胜肽連結之“其他”胜肽的例子包括，但不限於源自不同於MPHOSPH1之腫瘤相關抗原的細胞毒殺性T淋巴球誘導胜肽。於本發明中，“其他”胜肽不只有MHC Class I限制胜肽，還有MHC Class II限制胜肽。熟悉此技藝人士可使用一般分子生物程序來製備包括一或更多之MPHOSPH1胜肽與一或更多之非MPHOSPH1胜肽的多胜肽，或編碼出此類胜肽的核酸。
上述連結胜肽於此處意指為“多面體(polytope)”即，兩個或多個潛在免疫原性(immunogenic)或免疫反應刺激胜肽的群組，胜肽可互相連接以多種排列(例如，連成一串或部分重疊)。多面體(或編碼出多面體的核酸)可以符合標準免疫步驟被投予，例如至動物，以測試多面體於刺激、增強及/或誘導一免疫反應之功效。
胜肽可被直接連接或經由使用位於側面之序列以形成多面體，且多面體為疫苗之用途為本技術領域所熟知(參見，Thomson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 92(13)：5845-5849,1995；Gilbert et al.,Nature Biotechnol.15(12)：1280-1284,1997；Thomson et al.,J Immunol.157(2)：822-826,1996；Tarn et al.,J Exp.Med.171(1)：299-306,1990)。製備並含有抗原決定位之不同數目與組合的多面體並為了藉由細胞毒殺性T淋巴球的辨認與為了於增加免疫反應中之功效將其進行測試。
本發明胜肽可被進一步被連接至其他物質，只要它們 維持必不可少之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。此種“其他”物質之說明例子包括，但不限於胜肽、脂質、糖與糖鏈、乙醯基，天然與合成之聚合物等。胜肽可包含修飾，例如醣基化、支鏈氧化或磷酸化，只要修飾不損壞如於此所述胜肽之生物活性。這些種類之修飾可被執行以給予額外之功能(例如，目標功能與傳送功能)或穩定多胜肽。
例如，為了in vivo增加多胜肽之穩定度，本技術領域已知引入D-胺基酸、胺基酸模仿物或非天然胺基酸；此內容也適合本發明之多胜肽。可以一些方法分析一多胜肽的穩定度。例如，可使用肽酶與多種生物培養基，例如人類血漿與血清，來測試穩定度(參見，例如Verhoef et al.,Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11：291-302)。
當本發明胜肽包括一半胱胺酸殘基時，胜肽傾向經由在半胱胺酸之SH基之間的雙硫鍵結形成二聚體。因此，本發明胜肽之二聚體也可被包含於本發明胜肽中。
此外，如上所提到，在藉由一、二或數個胺基酸殘基取代、刪除、插入及/或加入之經修飾的胜肽中，可篩選或選擇與原始胜肽相較具有相同或較高之活性的那些。因此本發明也提供一篩選或選擇與原始相較具有相同或較高之活性的經修飾胜肽的方法。例如，方法可包括步驟：a：將少一個本發明胜肽之胺基酸殘基進行修飾(取代、刪除、插入或添加)，b：確定於步驟(a)修飾之胜肽的活性，與c：選擇與原始胜肽相較具有相同或較高之活性的胜 肽。
此處，活性可包括MHC結合活性與抗原呈現細胞或細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。較佳為，胜肽之活性為細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。
III. MPHOSPH1胜肽之製備
使用熟知之技術可製備本發明之胜肽。例如，藉由重組DNA技術或化學合成可以合成方法地製備本發明之胜肽。本發明胜肽可單獨合成或為包括兩或多個胜肽之較長多胜肽。可分離此胜肽，即實質上無其他自然發生之宿主細胞蛋白質與其片段或任何其他化學物質地純化或分離。
本發明胜肽可包含修飾，例如醣基化、支鏈氧化或磷酸化，其提供修飾不損壞原始胜肽之生物活性。其他修飾包括可用來，例如增加胜肽之血清半衰期之D-胺基酸或其他胺基酸模仿物的合併。
藉由根據經選擇之胺基酸序列的化學合成可獲得本發明之胜肽。例如，可被用來合成之一般胜肽合成方法包括：(i)胜肽合成(Peptide Synthesis)Interscience,New York,1966；(ii)蛋白質(The Proteins),Vol.2,Academic Press,New York,1976；(iii)胜肽合成(Peptide Synthesis)(in Japanese),Maruzen Co.,1975；(iv)胜肽合成之基礎與實驗(Basics and Experiment of Peptide Synthesis)(in Japanese),Maruzen Co., 1985；(v)藥學的發展(Development of Pharmaceuticals)(second volume)(in Japanese),Vol.14(peptide synthesis),Hirokawa,1991；(vi)WO99/67288；以及(vii)Barany G.& Merrifield R.B.,Peptides Vol.2,“Solid Phase Peptide Synthesis”,Academic Press,New York,1980,100-118。
或者，藉由適應任何已知產生胜肽之基因工程方法可獲得本發明之胜肽(例如，Morrison J,J Bacteriology 1977,132：349-51；Clark-Curtiss & Curtiss,Methods in Enzymology(eds.Wu et al.)1983,101：347-62)。例如，首先製備一適合之載體，其懷有一多核苷酸其編碼出目標胜肽於一可表達的形式中(例如，對應於啟動子序列之調控序列的下游)，並將載體轉殖進入適合之宿主細胞。本發明也提供此種載體與宿主細胞。之後培養宿主細胞以產生感興趣之胜肽。使用一in vitro轉譯系統可in vitro產生胜肽。
IV.多核苷酸
本發明提供多核苷酸，其編碼出任何本發明上述之胜肽。本發明之多核苷酸包括來自自然發生之MPHOSPH1基因(例如，GenBank Accession No.NM_001031702(序列辨識號：125))的多核苷酸或具有其之保守修飾之核苷酸序列的那些。此處措辭“保守修飾之核苷酸序列”指序列其 編碼出相同或實質上相同之胺基酸序列。由於基因密碼的退化，一大份之功能相同之核酸編碼出任何已知蛋白質。例如，密碼GCA、GCC、GCG與GCU皆編碼出胺基酸丙胺酸。因此，於藉由一密碼具體指定丙胺酸之每個位置，可改變密碼成為任何上述不會改變編碼出之胜肽的對應密碼。此核酸變化為於本技術領域意指為“沈默變化(silent variation)”，表示保守修飾變體的一種。此處敘述為編碼出一胜肽之每個核酸序列也描述核酸之每種可能的沈默變化。熟悉此技藝人士會立即明白於一核酸中各密碼(除了AUG，其原本為甲硫胺酸之唯一密碼、與TGG其原本為色胺酸之唯一密碼)可被修飾以產生一功能相同分子。因此各所揭露之胜肽編碼核苷酸序列表示與其相關之沈默變化的暗示性揭露。
本發明之多核苷酸可由DNA、RNA與其衍生物所組成。如本技術領域所熟知，DNA分子適合地由鹼基所組成，例如自然發生鹼基A、T、C與G，而T於RNA中為U所取代。熟悉此技藝人士可瞭解非自然發生鹼基也被包含於多核苷酸中。
本發明之多核苷酸可編碼出本發明之多個胜肽，具有或不具有介於中間之胺基酸序列。例如，介於中間之胺基酸序列可提供多核苷酸或經轉譯之胜肽一裂解位(例如，酵素辨認序列)。更進一步而言，本發明之多核苷酸可包括任何額外之序列至編碼出本發明胜肽之編碼序列。例如，本發明之多核苷酸可為一重組多核苷酸，其包括胜肽 表現所需之調控序列，或可為一具有標誌基因與此類之表現載體(質體)。一般而言，可製備此重組多核苷酸，藉由經由使用例如聚合酶與內切酶之一般重組技術的多核苷酸操作。
可使用重組與化學合成技術兩者以產生本發明之多核苷酸。例如，藉由將具有本發明胜肽之編碼序列的多核苷酸插入一適合之載體可產生本發明之多核苷酸，當轉染進入一勝任細胞時，其可被表現。或者，使用PCR技術或複製於適合的宿主可將本發明之多核苷酸放大(參見，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989)。或者，使用固態技術如於Beaucage SL & lyer RP,Tetrahedron 1992,48：2223-311；Matthes et al.,EMBO J 1984,3：801-5中所敘述，可合成本發明之多核苷酸。
V.外吐小體(exosomes)
本發明進一步地提供稱為外吐小體的胞間囊泡(intracellular vesicles)，其呈現形成於本發明之胜肽與人類白血球抗原表面之間的複合物。例如，藉由使用於Japanese Patent Application Kohyo Publications No.Hei 11-510507與WO99/03499所詳述的方法以及使用從接受治療和/或避免之病人所得的抗原表現細胞可製備外吐小體。本發明之外吐小體可如疫苗般地接種，相似於本發明的胜肽。
包括在複合物中的人類白血球抗原形式必須與需要治 療及/或預防之個體的人類白血球抗原形式相符。例如，對於日本人而言，HLA-A2，特別是HLA-A＊0201與HLA-A＊0206為時常適合的。高度表現於日本人與高加索人之中的HLA-A2型之使用有助於獲得有效的結果，且次型，例如HLA-A＊0201與HLA-A＊0206提供用途。一般在臨床上，需接受治療之病患的人類白血球抗原形式係進行預先的研究，這可適當地選擇對此抗原具有高度結合親合力的胜肽或經由抗原表現具有細胞毒性T淋巴細胞誘發性的胜肽。此外，為了獲得顯示高度結合親合力與細胞毒性T淋巴細胞誘發性兩者的胜肽，可以天然產生之MPHOSPH1部分胜肽的胺基酸序列為基礎，執行1、2或數個胺基酸的取代、刪除或添加。
當對本發明外吐小體使用HLA抗原之HLA-A2型時，具有序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120之任一個之一胺基酸序列的胜肽具有特別的效用。在一些實施例中，本發明外吐小體為表現以HLA-A2抗原與本發明胜肽之一複合物於它們的表面上的外吐小體。被包含於此類複合物中之HLA-A2抗原的典型例子，包括，但不限於HLA-A*0201與HLA-A*0206。
VI.抗原呈現細胞
本發明也提供抗經分離之原呈現細胞，其表現以HLA抗原與本發明胜肽形成的複合物於其表面上。抗原呈現細胞可來自受到治療及/或避免之病患，且藉由其本身或與包括本發明之胜肽、外吐小體或細胞毒殺性T淋巴球之其他 藥物結合可被投予如一疫苗。
抗原呈現細胞並不限於特定種類之細胞，且包括樹突細胞、蘭格罕細胞(Langerhans cell)、巨嗜細胞、B細胞與活化之T細胞，已知其表現蛋白質(proteinaceous)抗原於其細胞表面以被淋巴球所辨認。由於樹突細胞為一典型抗原呈現細胞，其於抗原呈現細胞中具最強之細胞毒殺性T淋巴球誘導活性，樹突細胞為適合於本發明之抗原呈現細胞。
例如，藉由誘導來自周邊血液單核細胞之樹突細胞與之後in vitro、ex vivo或in vivo以本發明胜肽接觸(刺激)其可獲得一本發明之抗原呈現細胞。當本發明之胜肽投予至一個體，於個體身體內誘導表現本發明胜肽之抗原呈現細胞。因此，藉由在將本發明胜肽投予至一個體後，自此個體收集抗原呈現細胞可獲得本發明之抗原呈現細胞。或者，藉由將自個體收集之抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸可獲得本發明之抗原呈現細胞。
可將本發明之抗原呈現細胞以其本身或結合包括本發明胜肽、外吐小體或細胞毒殺性T淋巴球的其他藥物投予至一個體以誘導於個體中之抗癌免疫反應。例如，ex vivo投予可包括步驟：a：自一第一個體收集抗原呈現細胞，b：將步驟a之抗原呈現細胞與本發明之胜肽接觸，以及c：將步驟b之抗原呈現細胞投予一第二個體。
第一個體與第二個體可為相同個體或可為不同個體。自步驟b獲得之抗原呈現細胞可被投予一為疫苗，用以治療及/或預防癌症，癌症的例子，包括但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、淋巴癌、骨肉瘤、攝護腺癌、腎癌與軟組織腫瘤。
本發明也提供製造包括抗原呈現細胞之藥學組合物的一方法或製程，其中方法包括將本發明胜肽與藥學上可接受之載體一起混合或配製的步驟。
根據本發明一方面，本發明之抗原呈現細胞具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。在抗原呈現細胞之內容中，用語“具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力”意指比起沒有與胜肽接觸之抗原呈現細胞的那些顯示較高之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。藉由包括in vitro將編碼出本發明胜肽之多核苷酸轉移至抗原呈現細胞的步驟的方法與上述之方法，可製備此種具細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞。此經引入之基因可為DNA或RNA形式。引入方法的例子包括，並無特別限制，各種於此領域一般被執行的方法，可使用例如脂質體轉染(lipofection)、電穿孔法(electroporation)或磷酸鈣方法。更特別地，可執行其如Cancer Res 1996,56：5672-7；J Immunol 1998,161：5607-13；J Exp Med 1996,184：465-72；Published Japanese Translation of International Publication No.2000-509281中所述。藉由轉移基因進入抗原呈現細胞， 基因遭遇轉錄、轉譯與此類於細胞中，且之後所獲得之蛋白質藉由MHC Class I或Class II處理，並經由一呈現途徑進行以與呈現部分胜肽。
在一些實施例中，本發明之抗原呈現細胞為抗原呈現細胞，其表現一HLA-A2抗原與本發明之胜肽之複合物於它們的表面上。被包含於此類複合物中之HLA-A2抗原的典型例子，包括，但不限於HLA-A＊0201與HLA-A＊0206。
VII.細胞毒殺性T淋巴球
抗任何本發明胜肽誘導之細胞毒殺性T淋巴球增強in vivo以癌症細胞為標的之免疫反應，且因此可使用為疫苗，相似於胜肽。因此本發明提供經分離之細胞毒殺性T淋巴球其藉由任何之本發明之胜肽專一地被誘導或活化。
可獲得此種細胞毒殺性T淋巴球，藉由(1)將本發明胜肽投予至一個體，(2)將來自個體之抗原呈現細胞與CD8陽性T細胞或周邊血液單核淋巴球與本發明之胜肽in vitro接觸(刺激)，(3)將CD8陽性細胞或周邊血液單核淋巴球in vitro與表現HLA抗原與胜肽之複合物於它們的表面上之抗原呈現細胞或外吐小體接觸或(4)引入編碼出T細胞受體(TCR)次單元之兩者的一多核苷酸或編碼出T細胞受體次單元之各個的多核苷酸，其中T細胞受體可與於一細胞表面上之本發明之胜肽與HLA-A2抗原的一複合物結合。藉由上述方法可製備要被用於細胞毒殺性T淋巴球之製備中的此種抗原呈現細胞或外吐小體。(4)之方法之詳細被敘述於下方“VIII. T細胞受體(TCR)”的段落中。
本發明細胞毒殺性T淋巴球可來自一受到治療及/或避免之病患，且藉由其身或為了調節作用與包括本發明之胜肽、抗原呈現細胞或外吐小體的其他藥物結合可被投予。所獲得之細胞毒殺性T淋巴球起專一抗目標細胞的作用，而目標細胞其表現本發明胜肽，例如用於誘導之相同胜肽。目標細胞可為細胞其內生性表現MPHOSPH1，例如癌細胞，或被以MPHOSPH1基因轉殖之細胞；且由於藉由胜肽刺激表現本發明胜肽於細胞表面之細胞，也可做為經活化之細胞毒殺性T淋巴球攻擊的目標。
在一些實施例中，本發明之細胞毒殺性T淋巴球辨認表現HLA-A2抗原與本發明胜肽之複合物的細胞。在細胞毒殺性T淋巴球的內容中，措辭“辨認一細胞”意指經由其TCR與於細胞表面上之HLA-A2抗原與本發明胜肽之複合物結合，並顯示抗此細胞之特定細胞毒殺性活性。於此“特定細胞毒殺性活性”意指顯示抗表現HLA-A2抗原與本發明胜肽之複合物的細胞，而不對其他細胞。被包含於此類複合物中之HLA-A2抗原的典型例子，包括，但不限於HLA-A＊0201與HLA-A＊0206。
VIII. T細胞受體(TCR)
本發明也用以提供一組合物其包括編碼出T細胞受體次單元之兩者的一多核苷酸或編碼出T細胞受體次單元之各個的多核苷酸，其中T細胞受體可與於一細胞表面上之本發明之胜肽與HLA-A2抗原的一複合物結合，與其使用方法。此類T細胞受體之次單位具有能力形成T細胞受體， 其授與專一性至抗腫瘤細胞的T細胞，腫瘤細胞表現MPHOSPH1。藉由使用本技術領域所知的方法可確認細胞毒殺性T淋巴球之T細胞受體之α-與β-支鏈之各個的多核苷酸，而此細胞毒殺性T淋巴球以本發明之胜肽來誘導WO2007/032255與Morgan et al.,J Immunol,171,3288(2003)。例如，可較喜愛地使用聚合酶鏈鎖反應方法。用於分析之聚合酶鏈鎖反應引子可為，例如5’-R引子(5’-gtctaccaggcattcgcttcat-3’)(序列辨識號：127)為一5’端引子與3-TRa-C引子(5’-tcagctggaccacagccgcagcgt-3’)(序列辨識號：128)專一於T細胞受體alpha鏈C區、3-TRb-C1引子(5’-tcagaaatcctttctcttgac-3’)(序列辨識號：129)專一於T細胞受體beta鏈C1區或3-TRbeta-C2引子(5’-ctagcctctggaatcctttctctt-3’)(序列辨識號：130)專一於T細胞受體beta鏈C2區為3’端引子，但不限於其。引出之T細胞受體可以高親合力結合表現本發明之胜肽的目標細胞，且視需要in vivo與in vitro居中有效殺死表現本發明之胜肽的目標細胞。
編碼出T細胞受體次單元之兩者的多核苷酸或編碼出T細胞受體次單元之各個的的多核苷酸可合併進入適合之載體，例如反轉錄病毒載體。這些載體為本技術領域所熟知。通常包含其之多核苷酸或載體可被轉移至一T細胞(例如CD8陽性T細胞)，例如一來自一病患之T細胞。有用地，本發明提供一現成(off-the-shelf)的組合物允許快速 修飾病人所擁有之T細胞(或其他哺乳動物之那些)以快速簡單產生具有優秀之癌症細胞殺死特性的經修飾T細胞。
抗本發明胜肽之特定的T細胞受體應可專一地辨認本發明之胜肽與HLA抗原之複合物，當T細胞受體於呈現於T細胞表面時，給予T細胞抗表現本發明之胜肽與HLA抗原之複合物之目標細胞的專一活性。必不可少之活性可藉由任何已知方法來確認，其藉由引入編碼出此類T細胞受體次單元的多胜肽所製備之細胞毒殺性T淋巴球可專一地辨認此類目標細胞。此類方法的較佳例子包括，例如使用HLA分子與本發明胜肽之HLA多聚體(multimer)染劑法分析，與ELISPOT分析。藉由執行ELISPOT分析，其可確認藉由上述方法製備之細胞毒殺性T淋巴球可專一地辨認目標細胞，且藉由此辨認產生之訊號可被傳送於細胞內。此外，藉由已知方法也可確認藉由上述方法製備之細胞毒殺性T淋巴球具有抗目標細胞之專一細胞毒殺活性。此類方法的例子，包括，例如使用表現HLA-A2抗原與MPHOSPH1兩者之細胞的Cr釋放分析。
在一方面，本發明提供細胞毒殺性T淋巴球，其藉由以編碼出T細胞受體次單位兩者之多核苷酸或編碼出T細胞受體次單位之各個的多核苷酸轉導來製備，其中T細胞受體可與於一細胞表面上之具有擇自由序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120所組成之群組之一胺基酸序列的胜肽與HLA-A2抗原的複合物結合。
經轉導之細胞毒殺性T淋巴球可in vivo自引導至癌症細胞，且可藉由熟知的培養方法in vitro擴張(例如Kawakami et al.,J Immunol.,142,3452-3461(1989))。本發明細胞毒殺性T淋巴球也可用來形成一免疫組合物，其於一需要治療或保護之病患中之癌症的治療與避免之一或兩者中為有效(WO2006/031221)。
IX.藥學組合物
由於與正常組織相較，MPHOSPH1表現於其例子包括，但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、淋巴癌、骨肉瘤、攝護腺癌、腎癌與軟組織腫瘤的癌症中特別被提高，本發明之胜肽或多核苷酸可用於癌症之治療與預防之任一或兩者。因此，本發明提供一藥學試劑或組合物其配製來癌症之治療與預防之任一或兩者，此類試劑或組合物包括一或多個本發明胜肽或多核苷酸作為活性成分。或者，任何上述之外吐小體或抗原呈現細胞，其呈現本發明之胜肽與HLA抗原之一複合物，可被使用為藥學試劑或組合物之活性成分。此外，上述細胞毒殺性T淋巴球其可辨認可表現本發明胜肽與HLA抗原之一複合物，也可用來作為本發明之藥學試劑或組合物的活性成分。
因此，本發明提供試劑或組合物，其包括至少一活性成分擇自：(a)一或更多之本發明之胜肽；(b)於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜 肽的一或多個多核苷酸；(c)一或更多之本發明之抗原呈現細胞或外吐小體；以及(d)一或更多之本發明之細胞毒殺性T淋巴球。
本發明之藥學試劑與組合物提供使用如一疫苗。在本發明之內容中，措辭“疫苗”(也指一致免疫組合物)意指一組合物，其藉由接種至動物具有改善、增強及/或誘導抗腫瘤免疫力的功能。換句話說，本發明提供用以於一個體中誘導抗癌免疫反應之本發明藥學試劑或組合物。
本發明之藥學試劑或組合物可用於癌症之治療與避免之任一或兩者於一個體或病患中。對其可提供藥學試劑或組合物之此類個體包括人類，與任何其他哺乳動物，其包括，但不限於小鼠、大鼠、天竺鼠、兔子、貓、狗、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴子、狒狒與黑猩猩，特別是一商業上重要動物或被馴養了的動物。在一些實施例中，本發明之藥學試劑或組合物可被配製來投予至一個體，其HLA抗原為HLA-A2。
在另一實施例中，本發明也提供一活性成分在藥學試劑或組合物的製造中的用途，藥學試劑或組合物配製來用於癌症或腫瘤之治療與避免之任一或兩者包括其手術後之復發，此活性成分擇自：(a)本發明胜肽；(b)於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜肽的多核苷酸； (c)表現本發明一胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。
或者，本發明更提供一用於癌症或腫瘤之治療與避免之任一或兩者之的活性成分，活性成分擇自：(a)本發明胜肽；(b)於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜肽的多核苷酸；(c)表現本發明一胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。
或者，本發明更提供一製造用以癌症或腫瘤之治療與避免之任一或兩者之復發之藥學組合物或試劑的方法或製程，其中方法或製程包括將一藥學上或生理上可接受之載體與一活性成分一起配製的步驟，此類活性成分擇自：(a)本發明胜肽；(b)於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜肽的多核苷酸；(c)本發明之抗原呈現細胞或外吐小體；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。
在另一實施例中，本發明也提供一製造用以癌症或腫瘤之治療與避免之任一或兩者之藥學組合物或試劑的方法或製程，其中方法或製程包括將一藥學上或生理上可接受之載體與一活性成分一起混合的步驟，其中活性成分擇自： (a)本發明胜肽；(b)於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜肽的多核苷酸；(c)本發明之抗原呈現細胞或外吐小體；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。
在另一實施例中，本發明也提供癌症或腫瘤之治療與避免之任一或兩者的一方法，其中該方法包括投予一個體至少一擇自下列中之活性成分的步驟：(a)本發明胜肽；(b)於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜肽的多核苷酸；(c)本發明之抗原呈現細胞或外吐小體；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。
根據本發明，已發現具有擇自序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120中之胺基酸序列的胜肽為HLA-A2限制之抗原決定位胜肽，且因此可做為候選物其於一個體中誘導專一之抗表現HLA-A2與MPHOSPH1之癌症的免疫反應。因此包括任一具有序列辨識號5、14、64、73、77、79、97、103與120之胺基酸序列之胜肽的本發明之藥學試劑或組合物特別適合投予HLA抗原為HLA-A2之個體。這些胜肽之特別較佳的例子為具有序列辨識號：120之一胺基酸序列的胜肽，其被確認具有誘導以表現HLA-A2抗原與MPHOSPH1之癌症細胞為目標之細胞毒殺性T淋巴球的能力。因此，在較佳實施例中，本發明之試劑或組合物 可包括具有序列辨識號：120之一胺基酸序列的胜肽或其一修飾版本，或包括編碼此類胜肽的多核苷酸。相同的東西提供至包含編碼出任何這些胜肽之多核苷酸(即，本發明之多核苷酸)的藥學試劑或組合物。
由本發明藥學試劑或組合物治療之癌症包括其中表現MPHOSPH1(例如，為過度表現)之任何癌症，其之例子包括，但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、淋巴癌、骨肉瘤、攝護腺癌、腎癌與軟組織腫瘤。
本發明之藥學試劑或組合物除了上述活性成分外。可包括，例如具有誘導細胞毒殺性T淋巴球抗似癌細胞之能力的其他胜肽、編碼出此其他胜肽之其他多核苷酸、其他表現此其他胜肽之細胞與其類似物。具有誘導細胞毒殺性T淋巴球抗似癌細胞之能力的此類“其他”胜肽的例子，包括，但不限於癌症專一抗原(例如，經確認之腫瘤相關抗原)。
若需要，本發明之藥學試劑或組合物可視需要包括其他治療物質為一額外之活性成分，只要此物質不抑制本發明之活性成分之抗腫瘤功效，活性成分例如本發明胜肽、多核苷酸、外吐小體、抗原呈現細胞、細胞毒殺性T淋巴球。例如，配方可包括抗發炎物質、止痛劑、化學治療與其類似。除了其他治療物質於藥劑其本身中，也可將本發明之藥劑與一或多個其他藥學試劑或組合物相繼或同時投予。藥劑與藥學試劑或組合物的量依照，例如使用何種藥 學試劑或組合物、要治療之疾病與投藥的計畫與方式。
熟悉此技藝人士會容易地認可，除了此處特別提及之成分外，本發明之藥學試劑或組合物可包括本技術領域一般之其他物質，其具有關於討論中之配方形式(例如，填料(filler)、粘結劑(binder)、稀釋劑(diluent)、賦形劑(excipient)等)。
在本發明一實施例中，本發明之藥學試劑或組合物可被包裝於製造之商品，例如套組，其包含對於要被治療之疾病，例如癌症的病理情況有用之材料。製造之商品可包括具有一標籤之任何本發明藥學試劑或組合物的容器。適合的容器包括瓶、小瓶(vial)與試管。容器可形成自各種材料，例如玻璃或塑膠。於容器上之標籤需指出試劑或組合物為用來治療或避免疾病之一或多個情況。標籤也可指出投藥指示等。
除了上述容器外，套組包括本發明藥學試劑或組合物可視需要更進一步包括一第二容器，其儲藏一藥學上可接受之稀釋液。其可更包括商業或使用者觀點需要之其他材料，包括其他緩衝溶液、稀釋液、濾器、針、注射器與具有使用說明之包裝插入物。
本發明之藥學試劑或組合物若需要可被包裝於一包(pack)或一分配器，其可包含含有活性成分之一或多單位劑量形式。包裝可例如包括金屬或塑膠箔，例如一泡棉箱(blister pack)。包裝或分配器可伴隨著投藥指示。
(1)藥學組合物包含胜肽作為活性成分
可直接投予本發明胜肽為一藥學試劑或組合物，若需要的話，其已被一般配方方法所配製。在之後的例子，除了本發明胜肽外、若適合可包括載體、賦形劑與原始做為藥物使用之此類而無特別限制。此類載體的例子包括，但不限於滅菌水、生理食鹽水、磷酸緩衝溶液與培養液體(culture fluid)與此類。更進一步而言，若必須，藥學物質、試劑或組合物可含安定劑、懸液劑、防腐劑、界面活性劑與此類。本發明之藥學試劑或組合物可用來抗癌目的。
可將本發明之胜肽可以組合來製備，其包括兩或更多個本發明之胜肽，以in vivo誘導細胞毒殺性T淋巴球。胜肽組合可為雞尾酒形式或可使用標準技術彼此結合。例如，胜肽可被化學連接或表現如一單一融合多胜肽序列，其可具有一或數個胺基酸為一連結器(例如，Lysine linker：K.S.Kawamura et al.J.Immunol.2002,168：5709-5715)。結合之胜肽可為相同或不同。藉由投予本發明之胜肽，藉由HLA抗原，高密度呈現胜肽於抗原呈現細胞上，之後對形成於呈現胜肽與HLA抗原之間的複合物專一反應的細胞毒殺性T淋巴球被誘導。或者，抗原呈現細胞(例如，樹突細胞)可被從一個體移出且之後以本發明胜肽刺激以獲得呈現本發明任何胜肽於其表面上之抗原呈現細胞。可將這些抗原呈現細胞再投予至個體以誘導在個體中之細胞毒殺性T淋巴球，且因此可增加了朝向腫瘤相關之內皮細胞的侵犯。
包含一本發明任何胜肽為活性成分之本發明藥學試劑 或組合物也可包含一佐劑以有效建立細胞免疫力。或者本發明之藥學試劑或組合物可與其他活性成分一起被投予，或以配製成細粒被投予。佐劑指任何化合物、物質或組合物，當與具有免疫活性之蛋白質一起投予(或依次)時，其增強抗蛋白質之免疫反應。可被應用之佐劑，包括於文獻(Clin Microbiol Rev 1994,7：277-89)中所描述的那些。示例之佐劑包括磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素、佛氏不完全佐劑(Incomplete Freund’s adjuvant,IFA)、佛氏完全佐劑(Complete Freund’s adjuvant,CFA)、ISCOMatrix、GM-CSF、CpG、O/W乳劑與此類，但不限於其。
此外，於微脂體(liposome)配方與細粒配方中，胜肽連結至幾個微米直徑之小珠，且於配方中，可便利地使用連結至胜肽之脂質。
在本發明另一實施例中，本發明胜肽也可以一藥學上可接受之鹽類被投予。鹽類之較佳例子包括具有鹼金屬之鹽、具金屬之鹽、具有機鹼之鹽、具胺之鹽、具有機酸(醋酸、甲酸(formic acid)、丙酸(propionic acid)、富馬酸(fumaric acid)、馬來酸(maleic acid)、琥珀酸(succinic acid)、酒石酸(tartaric acid)、檸檬酸(citric acid)、蘋果酸(malic acid)、草酸(oxalic acid)、苯甲酸(benzoic acid)、甲磺酸(methanesulfonic acid)等)之鹽與具無機酸(鹽酸、磷酸、氫溴酸(hydrobromic acid)、硫酸)之鹽。如此處所使用，“藥學上可接受之鹽類”意指維持化 合物生物有效性與特性且其獲自與無機或有機酸或鹼反應。
在一些實施例中，本發明之藥學試劑或組合物包括一成分其啟動細胞毒殺性T淋巴球。已定義脂質為可in vivo啟動抗病毒抗原之細胞毒殺性T淋巴球的物質。例如，可將棕櫚酸殘基黏附至離胺酸殘基之ε-與α-胺基，且之後連結至本發明之一胜肽。之後脂質胜肽可被直接投予於微胞或顆粒中、併入微脂體或乳化於一佐劑中。如脂質啟動細胞毒殺性T淋巴球反應之另一例子，E.coli脂蛋白，例如三軟脂酸-S甘油半胱氨酰-絲氨酰基絲氨酸(tripalmitoyl-S-glycerylcysternyl-seryl-serine)可使用來啟動細胞毒殺性T淋巴球，當共價附加至一合適之胜肽(參見，例如Deres et al.,Nature 1989,342：561-4)。
適合之投藥的方法的例子，包括，但非必須限於，口服、皮膚內、皮下、肌肉注射、骨內(intraosseous)、腹膜(peritoneal)與靜脈內注射或此類，以及全身投藥或局部投藥至標的位置的鄰近區域(即，直接注射)。可執行單次投藥或藉由多次投藥追加。本發明之胜肽劑量可適合地調整根據要治療之疾病、病患年紀、體重、投藥方法、與此類，且本發明之胜肽劑量一般為0.001 mg至1,000 mg，例如0.01 mg至100 mg，例如0.1 mg至10 mg，且可於數天至數個月投藥一次。熟悉此技藝人士很快地確認合適與最理想的劑量。
(2)藥學組合物包含多核苷酸為活性成分
本發明之藥學試劑或組合物也可包含編碼出此處揭露之胜肽的多核苷酸於一可表達之形式中。此處措辭“於一可表達之形式中”意指多核苷酸，當引入一細胞，in vivo會被表現成一誘導抗腫瘤免疫力之多胜肽。在一說明實施例中，感興趣之多核苷酸的核酸序列包括對於表現多核苷酸而言必須之調控要素。可裝配多核苷酸以達到穩定插入目標細胞之基因體(參見，例如敘述Thomas KR & Capecchi MR,Cell 1987,51：503-12 for a description of homologous recombination cassette vectors。也參見，例如Wolff et al.,Science 1990,247：1465-8；U.S.Patent Nos.5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647；與WO 98/04720)。以DNA為基礎的輸送技術的例子包括“裸DNA”、經促進(bupivacaine、聚合物、胜肽居中之)之輸送、陽離子脂質複合物與顆粒居中之(“基因槍”)或壓力居中之傳送(參見，例如U.S.Patent No.5,922,687)。
本發明之胜肽也可藉由病毒或細菌載體來表現。表現載體的例子包括減弱病毒宿主，例如牛痘或禽痘。此方法包括使用牛痘病毒，例如為一載體以表現編碼胜肽之核苷酸序列。藉由引入一宿主，此重組之牛痘病毒表現致免疫胜肽且因此引起一免疫反應。於免疫步驟中為有效之牛痘載體與方法敘述於，例如U.S.Patent No.4,722,848。另一載體包括BCG(Bacille Calmette Guerin)。BCG載體 敘述於Stover et al.,Nature 1991,351：456-60中。對於治療投藥或免疫有用之其他多種載體，例如腺與腺病毒相關之載體、反轉錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、經解毒之炭疽毒素載體與其類似為明顯的。參見，例如Shata et al.,Mol Med Today 2000,6：66-71；Shedlock et al.,J Leukoc Biol 2000,68：793-806；Hipp et al.,In Vivo 2000,14：571-85。
輸送多核苷酸進入一病患可為直接，於其例子中，病患直接暴露於一攜帶多核苷酸之載體，或為間接，於其例子中，細胞首先in vitro以感興趣之多核苷酸轉形，之後將細胞轉殖進入病患。此兩方法分別為已知，為in vivo與ex vivo基因治療。
基因治療之方法之大體回顧，參見Goldspiel et al.,Clinical Pharmacy 1993,12：488-505；Wu and Wu,Biotherapy 1991,3：87-95；Tolstoshev,Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993,33：573-96；Mulligan,Science 1993,260：926-32；Morgan & Anderson,Ann Rev Biochem 1993,62：191-217；Trends in Biotechnology 1993,11(5)：155-215)。應用於本發明之於重組DNA技術中一般熟知的方法被於編者Ausubel et al.,in Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY,1993；與Krieger,in Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY,1990所述。
如胜肽之投藥、多核苷酸之投藥可被執行藉由口服、 皮膚內、皮下、靜脈內、肌肉、骨內及/或複膜注射或此類，例如全身投藥或局部投藥至標的位置的鄰近區域提供使用。可執行單次投藥或藉由多次投藥追加。於適合載體中或於以編碼出本發明之胜肽的多核苷酸轉形之細胞中的多核苷酸的劑量可適合地調整，根據要治療之疾病、病患年紀、體重、投藥方法、與此類，且本發明之胜肽劑量一般為0.001 mg至1000 mg，例如0.01 mg至100 mg，例如0.1 mg至10 mg，且可於每數天一次至每數個月一次投藥。熟悉此技藝人士可適合地選擇一合適的劑量。
X.使用胜肽、外吐小體、抗原呈現細胞與細胞毒殺性T淋巴球的方法
可使用本發明之胜肽與多核苷酸來製備或誘導抗原呈現細胞與細胞毒殺性T淋巴球。也可使用本發明之外吐小體與抗原呈現細胞來誘導細胞毒殺性T淋巴球。胜肽、多核苷酸、外吐小體與抗原呈現細胞可與任何其他化合物結合使用，只要額外之化合物不抑制細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。因此，任何上述之本發明藥學試劑或組合物可用來誘導細胞毒殺性T淋巴球。除此之外，包括胜肽與多核苷酸的那些也可用來誘導抗原呈現細胞，如下所說明。
(1)誘導抗原呈現細胞的方法
本發明提供使用本發明之胜肽或多核苷酸來誘導具有高細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的方法。
本發明之方法包括in vitro、ex vivo或in vivo將抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸的步驟。例如，包含ex vivo將抗原呈現細胞與本發明之胜肽接觸之步驟的方法可包括步驟：a：自一個體收集抗原呈現細胞；以及b：將步驟a之抗原呈現細胞與本發明之胜肽接觸。
抗原呈現細胞並不限於特定種類之細胞，且包括樹突細胞、蘭格罕細胞(Langerhans cell)、巨嗜細胞、B細胞與活化之T細胞，已知其表現蛋白質(proteinaceous)抗原於其細胞表面以被淋巴球所辨認。較佳為，可使用樹突細胞，由於它們於抗原呈現細胞中最強的細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。本發明任一胜肽可以其本身或與本發明其他胜肽或源自除了MPHOSPH1之腫瘤相關抗原的細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之胜肽結合被使用。
另一方面，當投予本發明胜肽至一個體時，抗原呈現細胞in vivo與胜肽接觸，且因此於個體之體內誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞。因此，本發明之方法包括投予本發明胜肽至一個體以於個體體內誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的抗原呈現細胞的方法。相似地，當以可表達之形式投予本發明多核苷酸至一個體時，本發明胜肽被表現且in vivo與抗原呈現細胞接觸，且因此於個體之體內誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞。因此，本發明之方法也可包括投予本發明多核苷酸至一個體以於個體體內誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的抗原呈現細胞的方法。措辭“可表達之形式”被描述於上述段落“IX.藥學組合物，(2) 藥學組合物包含多核苷酸為活性成分”中。
此外，本發明之方法可包括將本發明之多核苷酸引入一抗原呈現細胞以便誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞。例如，方法可包括步驟：a：自一個體收集抗原呈現細胞；以及b：將編碼出本發明胜肽之一多核苷酸引入一抗原呈現細胞中。
可如前述段落“VI.抗原呈現細胞”中所述來執行步驟b。
或者本發明提供一製備一專一誘導抗MPHOSPH1之細胞毒殺性T淋巴球活性的抗原呈現細胞的方法，其中該方法可包括下列步驟之一：(a)將抗原呈現細胞與本發明一胜肽in vitro、ex vivo或in vivo接觸；以及(b)將編碼出本發明胜肽之一多核苷酸引入抗原呈現細胞。
或者，本發明提供誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的方法，其中此方法包括擇自下列中之步驟：(a)將抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸；(b)將編碼出本發明胜肽之一多核苷酸引入抗原呈現細胞。
本發明方法可於in vitro、ex vivo或in vivo執行。較佳為本發明方法可於in vitro或ex vivo執行。用於具 有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞之誘導的抗原呈現細胞，可較佳為表現HLA-A2抗原之抗原呈現細胞。此類抗原呈現細胞可藉由本技術領域中熟知的方法，從來自其HLA抗原為HLA-A2之個體獲得的周邊血液單核細胞來製備。藉由本發明所誘導之抗原呈現細胞可為表現本發明胜肽與HLA抗原(HLA-A2抗原)之複合物於它們的表面上之抗原呈現細胞。當藉由本發明方法誘導之抗原呈現細胞被投予至一個體以在此個體中誘發抗癌症免疫反應時，個體較佳為其抗原呈現細胞被取得的同一個。然而，個體可與抗原呈現細胞提供者為不同一個，只要個體具有與抗原呈現細胞提供者相同之HLA型。
在另一實施例中，本發明提供用於誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的試劑或組合物，且此類試劑或組合物包括一或多個本發明胜肽或多核苷酸。
在另一實施例中，本發明提供於本發明胜肽或編碼出此胜肽之多核苷酸於製造配製來誘導抗原呈現細胞之試劑或組合物中的用途。
或者，本發明更提供本發明胜肽或編碼出此胜肽之多核苷酸對於在誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞中的用途。
(2)誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法
本發明也提供使用本發明胜肽、多核苷酸、外吐小體或抗原呈現細胞來誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法。
本發明也提供使用編碼出T細胞受體次單元兩者之一 多核苷酸或編碼出T細胞受體次單元各個之一多核苷酸來誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法，其中T細胞受體可辨認(結合)呈現於一細胞表面上之本發明胜肽與一HLA抗原之複合物。較佳為，誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法可包括至少一步驟擇自由下列之中：a)將一CD8陽性T細胞與一抗原呈現細胞及/或一外吐小體接觸，該抗原呈現細胞及/或該外吐小體表現一HLA抗原與本發明胜肽之複合物於其表面，以及b)將編碼出T細胞受體次單元兩者之一多核苷酸或編碼出T細胞受體次單元之各個的多核苷酸引入一CD8陽性T細胞，其中T細胞受體可辨認(結合)呈現於細胞表面上之本發明胜肽與一HLA抗原之複合物。
當本發明之胜肽、多核苷酸、抗原呈現細胞或外吐小體被投予至一個體時，於個體體內誘導細胞毒殺性T淋巴球，且以表現MPHOSPH1之癌細胞為目標之免疫反應增強。因此，本發明之方法可包括將本發明之胜肽、多核苷酸、抗原呈現細胞或外吐小體投予至一個體的步驟。
或者，藉由ex vivo或in vitro使用它們，也可誘導細胞毒殺性T淋巴球，且在誘導細胞毒殺性T淋巴球後，經活化之細胞毒殺性T淋巴球可返回至個體。例如，方法可包括步驟：a：自一個體收集抗原呈現細胞；b：將步驟a之抗原呈現細胞與胜肽接觸；以及c：將步驟b之抗原呈現細胞與CD8陽性T細胞共培養。
於上述步驟c中要與CD8陽性T細胞共培養之抗原呈現細胞也可藉由將一本發明多核苷酸轉移進入抗原呈現細胞，如於前述段落“VI.抗原呈現細胞”中所述來製備，然而，本發明並不限於此，且因此包括任何有效表現一HLA抗原與本發明胜肽之複合物於它們之表面上的抗原呈現細胞。
代替上述抗原呈現細胞，可視需要而定使用呈現一HLA抗原與本發明胜肽之複合物於其表面上的外吐小體。換句話說，本發明可包括將呈現一HLA抗原與本發明胜肽之複合物於其表面的外吐小體與本發明胜肽共培養之步驟。此種外吐小體可藉由前述於段落“V.外吐小體”中之方法來製備。
用於細胞毒殺性T淋巴球之誘導的抗原呈現細胞或外吐小體可較佳為於它們之表面上呈現本發明胜肽與HLA-A2抗原之一複合物。
此外，藉由將編碼出T細胞受體次單元兩者之一多核苷酸或編碼出T細胞受體次單元各個之一多核苷酸引入CD8陽性T細胞也可誘導本細胞毒殺性T淋巴球，其中T細胞受體可與呈現於細胞表面上之本發明胜肽與一HLA抗原之一複合物結合。如於前述段落“VIII. T細胞受體(TCR)”中所述可執行此轉導。
本發明方法可於in vitro、ex vivo或in vivo執行。較佳為本發明方法可於in vitro或ex vivo執行。用於細胞毒殺性T淋巴球之誘導的CD8陽性T細胞，可藉由本技 術領域中熟知的方法，從來自一個體獲得的周邊血液單核細胞來製備。在較佳實施例中，CD8陽性T細胞的一提供者可為其HLA抗原為HLA-A2之個體。藉由本發明方法誘導之細胞毒殺性T淋巴球，其可辨認可表現本發明胜肽與一HLA抗原之一複合物於其表面之細胞。當藉由本發明方法誘導之細胞毒殺性T淋巴球被投予至一個體以在此個體中誘發抗癌症免疫反應時，個體較佳為其CD8陽性T細胞被取得的同一個。然而，個體可與CD8陽性T細胞提供者為不同一個，只要個體具有與CD8陽性T細胞提供者相同之HLA型。
此外，本發明也提供製造一用以誘導細胞毒殺性T淋巴球之藥學試劑或組合物的方法或製程，其中該方法或製程包括將本發明之胜肽與藥學上接受之載體一起混合或配製的步驟。
在另一實施例中，本發明提供用於誘導細胞毒殺性T淋巴球的試劑或組合物，其中試劑或組合物包括本發明一或多個胜肽、本發明一或多個多核苷酸、一或多個抗原呈現細胞或外吐小體。
在另一實施例中，本發明提供本發明胜肽、多核苷酸、抗原呈現細胞或外吐小體於製造配製來誘導細胞毒殺性T淋巴球之試劑或組合物中的用途。
或者，本發明更提供本發明胜肽、多核苷酸、抗原呈現細胞或外吐小體對於在誘導細胞毒殺性T淋巴球中的用途。
(3)誘導免疫反應的方法
又，本發明提供誘導抗MPHOSPH1相關疾病之一免疫反應的方法。預期之疾病包括癌症，其例子包括，但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、淋巴癌、骨肉瘤、攝護腺癌、腎癌與軟組織腫瘤。
本發明方法可包括投予含任何本發明胜肽或編碼出其之多核苷酸的試劑或組合物至一個體的步驟。本發明方法也可包括表現任何之本發明胜肽之外吐小體或抗原呈現細胞的投予。細節參見“IX.藥學組合物”之項目，特別是敘述本發明試劑與組合物為疫苗之用途的部分。此外，可被使用於本發明誘導免疫反應之方法的本發明外吐小體與抗原呈現細胞，被詳細描述在前之於“V.外吐小體”、“VI.抗原呈現細胞”與“X.使用胜肽、外吐小體、抗原呈現細胞與細胞毒殺性T淋巴球的方法”之(1)與(2)的項目。
在較佳實施例中，藉由本發明之方法治療之個體可為一個體，其HLA抗原為HLA-A2。
本發明也提供製造一誘導免疫反應之藥學試劑或組合物的方法或製程，其中該方法可包括將一本發明之多胜肽或多核苷酸與藥學上接受之載體一起混合或配製的步驟。
或者，本發明方法可包括投予本發明一疫苗或藥學組合物的步驟，本發明疫苗或藥學組合物包含：(a)本發明胜肽； (b)於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜肽的核酸(多核苷酸)；(c)表現本發明一胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體；或(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。
在本發明內容中，以這些活性成份可治療一表現MPHOSPH1之癌症。此類癌症的例子包括，但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、淋巴癌、骨肉瘤、攝護腺癌、腎癌與軟組織腫瘤。因此，在包括活性成分之疫苗或藥學組合物的投予前，其較佳為確認與相同器官之正常組織相較，MPHOSPH1之表現程度於要被治療之細胞或組織中是否被提高。因此，在一實施例中，本發明提供治療表現MPHOSPH1之癌症的方法，其方法可包括步驟：i)測定獲得自具有癌症要治療之個體的細胞或組織中的MPHOSPH1表現程度；ii)與正常控制組比較MPHOSPH1表現程度；以及iii)投予擇自由上述步驟(a)至(d)所組成之群組的至少一成份至與正常控制組相較具有過度表現MPHOSPH1之癌症的個體。
或者，本發明也提供包含擇自上述(a)至(d)中之群組的至少一成份的疫苗或藥學組合物，其用於投予至具有過度表現MPHOSPH1之癌症的個體中。換句話說，本發明更提供鑑定要被以本發明MPHOSPH1多胜肽治療之個體的方 法，此類方法包括測定來自個體之細胞或組織中的MPHOSPH1表現程度的步驟，其中與基因之正常控制程度相較，此程度增加指出個體具有可以本發明MPHOSPH1多胜肽治療之癌症。本發明鑑定要被治療癌症之個體的方法於以下更詳細敘述。
可將任何源自個體之細胞或組織用於MPHOSPH1表現之測定，只要其包括MPHOSPH1之目標轉錄或轉譯產物。適合樣本的例子包括，但不限於身體組織或液體、例如血液、唾液與尿液。較佳為，生物樣本包含一細胞族群，其包括一上皮細胞，更佳為源自個體之細胞或組織包含一細胞族群，其包括一上皮細胞，更佳為一癌症上皮細胞或一來自被懷疑癌化之組織的上皮細胞。此外，若需要，細胞可自所獲得之身體組織或液體被純化，且之後使用為源自個體之樣本。
要藉由本發明治療之個體較佳為一哺乳類動物。說明之哺乳類動物包括，但不限於，例如，人類、非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬與牛。
根據本發明，可測定獲得自一個體之細胞或組織中的MPHOSPH1表現程度。使用本技術領域已知方法可於轉錄(核酸)產物程度測定表現程度。例如，藉由雜合方法(例如，北方雜合)使用探針可將MPHOSPH1的mRNA定量。可於一晶片、陣列或此類上執行偵測。陣列之使用較佳可為用於偵測MPHOSPH1表現程度。利用MPHOSPH1的序列資訊，熟悉此技藝人士可製備此種探針。例如，MPHOSPH1的cDNA 可被使用為探針。若需要，可以適合之標誌來標誌探針，例如染劑、螢光物質與同位素，且基因的表現程度可被偵測為雜合標誌的強度。
此外，藉由擴大偵測方法(amplification-based detection method)(例如，RT-PCR)使用引子可將MPHOSPH1(序列辨識號：125)的轉錄產物進行定量。根據基因之可獲得序列資訊可製備此種引子。
特別是，用於本方法之探針或引子於嚴厲(stringent)、適度嚴厲或低嚴厲條件下雜合至MPHOSPH1的mRNA。如此處使用，措辭“嚴厲(雜合)條件”意指在此在條件下探針或引子會雜合至其目標序列，而不是其他序列。嚴厲條件為序列依賴(sequence-dependent)，且在不同環境下會不同。比起較短之序列，於較高溫度下觀察到較長序列之特定雜合。一般而言，在一定義之離子強度與pH下所選擇之嚴格條件的溫度為低於一特定序列之熔點(Tm)約5℃。Tm為溫度(在一定義之離子強度與pH與核酸濃度下)，於其下在平衡下50%之與目標序列互補的探針雜合至目標序列。由於目標序列通常存在過量，所以於Tm，在平衡下50%之探針被佔據。一般而言，嚴苛條件為於其中鹽濃度低於1.0 M鈉離子，一般約0.01至1.0 M鈉離子(或其他鹽)於pH 7.0至8.3，且對於短探針或引子(例如，10至50個核苷酸)而言溫度為至少約30℃，對於較長探針或引子而言溫度為至少約60℃。也可以添加去穩定試劑(destabilizing substances)，例如甲醯胺 (formamide)來達到嚴苛條件。
本發明之探針或引子一般為一實質上經純化之寡核苷酸。寡核苷酸一般包括核苷酸序列之一區域，其在嚴苛條件下雜合至至少約2000、1000、500、400、350、300、250、200、150、100、50或25包括一MPHOSPH1之一核酸之連續意義股(consecutive sense strand)核苷酸序列，或包括一MPHOSPH1之一核酸之反意義股(anti-sense straand)核苷酸序列，或這些序列之自然發生突變體。特別是，例如，在一較佳實施例中，一於長度具有5-50之寡核苷酸可被使用為用來擴大要被偵測之基因的一引子。更佳為，可以於長度具有15-30b之一特定大小寡核苷酸探針或引子來偵測MPHOSPH1基因之mRNA或cDNA。大小的範圍始於至少10個核苷酸、至少12個核苷酸、至少15個核苷酸、至少20個核苷酸、至少25個核苷酸、至少30個核苷酸，且探針與引子延伸大小始於5-10個核苷酸、10-15個核苷酸、15-20個核苷酸、20-25個核苷酸與25-30個核苷酸。在較佳實施例中，寡核苷酸探針或引子的長度可被擇自15-25。藉由使用此種寡核苷酸探針或引子之用於基因偵測的分析程序、裝置或試劑為本技術領域所熟知(例如，寡核苷酸微陣列或PCR)。在這些分析中，探針或引子也可包括標籤(tag)或連結器(linker)序列。此外，可以可偵測之標誌或要被捕捉之親合配體來修飾探針或引子。或者在雜合偵測程序中，於長度具有少數百的鹼基(例如，約100-200)至少數千(kilo)(例如，約1000-2000)之鹼基 的多核苷酸可被用於一探針(例如，北方墨點分析或cDNA微陣列分析)。
或者，為了本發明之診斷可偵測轉譯產物。例如，可偵測MPHOSPH1蛋白質(序列辨識號：126)或其免疫活性片段之量。測定作為轉譯產物之蛋白質的量的方法包括免疫分析方法，其使用一抗體專一辨認此蛋白質。抗體可為單株或多株。此外，抗體之任何片段或修飾(例如嵌合型抗體(chimeric antibody)、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)可被用來偵測，只要片段或經修飾之抗體維持對MPHOSPH1蛋白質的結合能力。本發明也提供抗本發明胜肽與其片段的這類抗體。這些用於蛋白質偵測之這些種類的抗體的製備方法為本技術領域所熟知，且任何方法可被使用於本發明中以製備此種抗體與其等同物(equivalent)。
如根據MPHOSPH1基因轉譯產物偵測MPHOSPH1基因之表現程度的另一方法，使用抗MPHOSPH1蛋白質之抗體經由免疫組織化學(immunohistochemical)分析可測量到染色強度。即，於此測量中，強的染色指出經增加之蛋白質的存在/程度，且同時MPHOSPH1基因之高表現程度。
可確認於癌症細胞中，目標基因，例如MPHOSPH1基因的表現程度之為被提升，若從目標基因之控制組程度(例如，於正常細胞中的程度)增加，例如10%、25%、或50%，或增加大於1.1倍、大於1.5倍、大於2.0倍、大於5.0倍、大於10.0倍或更多。
使用先前自其疾病階段(癌的或非癌的)為已知的個 體收集並儲存的樣本控制組之程度可與癌細胞同時測定。此外，獲得自具有癌症要被治療之一器官的非癌區域的正常細胞被使用為正常控制組。或者，根據獲得自分析先前測定之來自其疾病程度已知之個體之樣本中之MPHOSPH1基因的表現程度的結果，藉由統計方法，可測定控制組之程度。此外，控制組程度可為來自先前測試細胞之表現輪廓的資料庫。並且，根據本發明一方面於一生物樣本中之MPHOSPH1基因的表現程度，可與多個控制組程度比較，其控制組程度被測定自多個參考樣本。較佳為使用一控制組程度測定自一參考樣本，其來自一組織形式相似於源自個體生物樣本之組織形式。此外，較佳為使用具有已知疾病階段之群組中的MPHOSPH1基因的表現程度的標準值(standard value)。標準值可獲得自本技術領域任何已知的方法。例如，平均值+/-2標準差或平均值+/-3標準差，可被使用為標準值。
本發明之內容中，測定自已知為非癌症之生物樣本的控制組程度被意指為一“正常控制組程度”。另一方面，控制組程度測定自一癌的生物組織，其意指為一“癌的控制組程度”。可將介於樣本表現程度與控制組程度間的不同標準化至控制核酸的表現程度，例如管家基因(housekeeping gene)，根據細胞之癌症與非癌程度已知其表現程度並無不同。示範之控制基因包括，但不限於β肌動蛋白(beta-actin)、甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)與核糖蛋 白P1。
當與正常控制組程度相較MPHOSPH1基因的表現程度被增加或相似/等同於癌控制組程度，可診斷個體為具有癌症要被治療。
本發明也提供(i)診斷是否一懷疑之個體具有要被治療之癌症，及/或(ii)選擇癌症治療之個體的方法，其方法可包括步驟：a)測定在細胞或組織中，MPHOSPH1的表現程度，細胞或組織獲得自被懷疑具有要被治療之癌症的個體；b)與正常控制組比較MPHOSPH1之表現程度；c)若MPHOSPH1之表現程度與正常控制組程度相較被增加，則診斷個體為具有要被治療之癌症；以及d)若個體於步驟c)中被診斷為具有要被治療之癌症，則選擇要癌症治療之個體。
或者，此種方法可包括步驟：a)測定在細胞或組織中，MPHOSPH1的表現程度，細胞或組織獲得自被懷疑具有要被治療之癌症的個體；b)與癌症控制組比較MPHOSPH1之表現程度；c)若MPHOSPH1之表現程度相似或等於癌症控制組程度，則診斷個體為具有要被治療之癌症；以及d)若個體於步驟c)中被診斷為具有要被治療之癌症，則選擇癌症治療之個體。
本發明也提供一診斷套組以診斷或測定一個體其為或被懷疑為遭受可被以本發明MPHOSPH1多胜肽治療之癌症 或於此風險，其也在評估癌症之預後及/或監控癌症免疫治療的功效或應用性中提供效用。較佳為，癌症包括，但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、淋巴癌、骨肉瘤、攝護腺癌、腎癌與軟組織腫瘤。更特別的是，套組較佳可包括至少一用以偵測來自個體細胞中之MPHOSPH1基因的表現程度的試劑，此類試劑可被擇自下列群組：(a)一試劑用以偵測MPHOSPH1基因的mRNA；(b)一試劑用以偵測MPHOSPH1蛋白質或其免疫活性片段；以及(c)一試劑用以偵測MPHOSPH1蛋白質的生物活性。
適合用於MPHOSPH1基因之mRNA之偵測的試劑的例子可包括核酸其專一結合或辨認MPHOSPH1 mRNA，例如，具有對於MPHOSPH1 mRNA之一部分互補的序列的寡核苷酸。這些種類之寡核苷酸以專一於MPHOSPH1 mRNA之引子與探針為例子。根據本技術領域所熟知的方法可製備這些種類之寡核苷酸。若需要，用以偵測MPHOSPH1 mRNA之試劑可被固定於固體基質(matrix)上。此外，大於一個之用以偵測MPHOSPH1 mRNA的試劑可被包含於套組中。
另一方面，用於MPHOSPH1蛋白質或其免疫活性片段的偵測之適合試劑的例子可包括對於MPHOSPH1蛋白質或其免疫活性片段的抗體。抗體可為單株或多株。此外，抗體之任何片段或修飾(例如嵌合型抗體(chimeric antibody)、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)可被用來作為 試劑，只要片段或經修飾之抗體維持對MPHOSPH1蛋白質或其免疫活性片段的結合能力。製備用於蛋白質偵測之這些種類之抗體的方法為本技術領域所熟知，且任何方法可被使用於本發明中以製備此種抗體與其等同物(equivalent)。另外，可以訊號產生分子經由直接連接或一間接標誌技術來將抗體進行標誌。標誌與標誌抗體之方法與偵測抗體對其目標的結合為本技術領域所熟知，且任何標誌與方法可被使用於本發明。另外，大於一個之用於偵測MPHOSPH1蛋白質的試劑可被包括於套組中。
套組可包含多於一個之前述試劑。套組更可包括用以結合對於MPHOSPH1基因之探針或對於MPHOSPH1胜肽之抗體的固體基質與試劑、用以培養細胞之培養基與容器、正與負控制組試劑與用以偵測對於MPHOSPH1胜肽之抗體的二次抗體。例如，獲得自沒有癌症或遭受癌症或否之個體的組織樣本可作為有用的控制組試劑。本發明之套組可更包括商業或使用者角度所需之其他材料，包括緩衝溶液、稀釋液、濾器、注射針、注射器與具有使用之操作指南的包裝插入物(例如，書面、磁帶或CD-ROM等)。這些試劑或此類可保持於一具有標誌之容器。適合之容器可包括瓶子、小玻璃瓶(vial)與試驗試管。容器可形成自多樣化之材料，例如玻璃或塑膠。
在本發明一實施例中，當試劑為抗MPHOSPH1 mRNA之探針時，試劑可被固定於一固體基質上，例如一多孔條(porous strip)以形成至少一偵測位。多孔條之測量或偵 測區可包括複數個位置，各含有一核酸(探針)。一測試條也可含有負及/或正控制組的位置。或者，控制組之位置可位於與測試條分離之一條。視需要而定，不同之偵測位可包含不同量之經固定之核酸，即一較高量於第一偵測位中且一較低含量於隨後之位置中。藉由測試樣本的加入，顯示可偵測訊號之一些位置提供一於樣本中MPHOSPH1 mRNA存在之量的定量指示。偵測位可被設置於任何適合之可偵測形狀且一般為在橫跨一測試條之寬度的條狀物或點的形狀中。
本發明之套組可更包括一正控制組樣本或MPHOSPH1標準樣本。藉由收集MPHOSPH1正之樣本可製備本發明之正控制組樣本且之後分析它們的MPHOSPH1程度。或者，可將經純化之MPHOSPH1蛋白質或多核苷酸加至不表現MPHOSPH1之細胞以形成正樣本(positive sample)或MPHOSPH1標準樣本。於本發明內容中，經純化之MPHOSPH1可為重組蛋白質。正控制組樣本之MPHOSPH1程度為，例如，大於臨界值(cut off value)。
在一實施例中，本發明更提供一診斷套組，包括一蛋白質或其一部份蛋白質，具專一辨認本發明抗體或其片段之能力。
本發明之部分胜肽的例子包括多胜肽，其係由在本發明蛋白質之胺基酸序列中之至少8個，較佳15個、更佳20個連續胺基酸所組成。使用本發明之一蛋白質或一胜肽(多胜肽)，藉由偵測於一樣本(例如，血液、組織)中 之一抗體可診斷癌症。製備本發明蛋白質與胜肽的方法如上所述。
本發明之診斷癌症之方法，可如上所述藉由測定介於抗MPHOSPH1抗體與其在對應控制組中之的量的差異來被執行。若個體之細胞或組織含有抗基因之表現產物(MPHOSPH1)抗體且抗MPHOSPH1抗體的量被測定大於在相較於其在正常控制組之程度中的截斷值時，個體被懷疑遭受癌症。
在另一實施例中，本發明之診斷套組可包括本發明之胜肽與結合至其之HLA分子。使用抗原胜肽與HLA分子偵測抗原專一細胞毒殺性T淋巴球的方法已被建立(例如，Altman JD et al.,Science.1996,274(5284)：94-6)。因此，本發明之胜肽與HLA分子的複合物可應用至偵測腫瘤抗原專一細胞毒殺性T淋巴球的偵測方法，藉此使早期偵測癌症之復發及/或轉移為可能。此外，其可被用於適合包含本發明胜肽為一活性成分之藥物的個體的篩選，或藥物治療功效的評估。
特別是，根據已知方法(參見，例如Altman JD et al.,Science.1996,274(5284)：94-6)，可製備放射標誌之HLA分子與本發明胜肽之寡聚複合物，例如四聚體。伴隨使用複合物，可執行診斷，例如藉由將來自被懷疑遭受癌症之個體的周邊血液淋巴球(peripheral blood lymphocytes)中之抗原-胜肽專一細胞毒殺性T淋巴球進行定量。
本發明更提供藉由使用此處敘述之胜肽抗原決定位，用以評估免疫反應之一方法或診斷試劑。在本發明一實施例中，如上述之HLA-A2限制胜肽可被使用為評估或預測一個體之免疫反應的試劑。藉由將免疫抗原(immunogen)與免疫活性細胞(immunocompetent)in vivo或in vitro接觸可誘導要被評估之免疫反應。在特定實施例中，可導致抗原專一細胞毒殺性T淋巴球的產生的任何物質或組合物可使用為試劑，而細胞毒殺性T淋巴球辨認與結合至胜肽抗原決定位。胜肽試劑可不必須被使用為免疫抗原。用於此類分析之分析系統包括相當新近之技術發展，例如四聚體，對細胞內淋巴激素(lymphokines)之染色與干擾素釋放分析或ELISPOT分析。在較佳實施例中，用以評估一免疫反應的免疫活性細胞可選擇自周邊血液、周邊血液淋巴球(PBL)、與周邊血液單核細胞(PBMC)中。收集或分離此類免疫活性細胞的方法為本技術領域所熟知。在一替換實施例中，要被以胜肽試劑接觸之免疫勝任細胞包括抗原呈現細胞，例如樹突細胞。
例如，本發明胜肽可使用於四聚體染色分析以評估為了抗原專一細胞毒殺性T淋巴球存在之周邊血液單核細胞，在暴露至腫瘤抗原或一免疫抗原後。HLA四聚體複合物可被使用來直接顯現抗原專一細胞毒殺性T淋巴球(參見，例如Ogg et al.,Science 279：2103-2106,1998；及Altman et al,Science 174：94-96,1996)，並測定於周邊血液單核細胞之樣本中的抗原專一細胞毒殺性T淋巴 球族群的頻率。使用本發明胜肽之四聚體試劑可如下所述被產生。
在對應之HLA重鏈與β 2-微球蛋白存在下重新折疊結合至HLA之胜肽，以產生三分子複合物。在複合物中，重鏈之羧端為經生物素化於一預先設計進入蛋白質之位置。之後將卵白素加至複合物以形成由三分子複合物與卵白素(streptavidin)所組成之四聚體。藉由以螢光標誌卵白素的方式，可使用四聚體來對抗原呈現細胞染色。之後可鑑定細胞，例如藉由流式細胞技術。此類分析可被用於診斷與預後(prognostic)目的。藉由此程序鑑定之細胞也可被用於治療目的。
本發明也提供評估免疫收回反應(immune recall responses)之試劑(參見，例如Bertoni et al,J.Clin.Invest.100：503-513,1997與Penna et aL,J Exp.Med.174：1565-1570,1991)，其包括本發明之胜肽。例如，為了抗原-專一細胞毒殺性T淋巴球的存在，使用特定專一胜肽，可分析獲自具有要被治療之癌症之個體的病患PBMC樣本。藉由培養PBMC與以本發明胜肽刺激細胞可評估含單核細胞之血液樣本。在適合之培養期間後，例如為了細胞毒殺性T淋巴球活性，分析經擴張之細胞族群。
胜肽也可使用為評估一疫苗功效之試劑。使用例如上述方法可分析獲自一以一免疫抗原接種之病患的PBMC。病患為經HLA分型，且選擇辨認表現於病患中之對偶基因(allele)專一分子的胜肽抗原試劑以分析。藉由於PBMC樣 本中之抗原決定位-專一細胞毒殺性T淋巴球的存在，可指出疫苗之免疫抗原性(immunogenicity)。本發明之胜肽也用來製造抗體，使用本技術領域已熟知的技術(參見，例如，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,Wiley/Greene,NY；與Antibodies A Laboratory Manual,Harlow and Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)，其可提供使用為診斷、偵測或監測癌症之試劑。此類抗體可包括辨認於HLA分子內容中之胜肽的那些，即，結合至胜肽-MHC複合物的抗體。
本發明胜肽或組合物具有一些額外之用途，其中一些為此處所述。例如，本發明提供診斷或偵測以MPHOSPH1免疫活性胜肽之量為特徵的一疾病。這些方法包含測定於一生物樣本中之MPHOSPH1胜肽的量或MPHOSPH1胜肽之一複合物與HLA class I分子。藉由以對於胜肽或複合物之結合伙伴(binding partner)分析可測定或偵測一胜肽之表現或胜肽與HLA class I分子之複合物。在一較佳實施例中，對於胜肽或複合物之結合伙伴可為一抗體其辨認且專一結合至胜肽。藉由使用MPHOSPH1引子之標準PCR放大步驟也可測試於一生物樣本，例如一腫瘤切片中之MPHOSPH1的表現。腫瘤表現之例子於此被呈現且示範之用於MPHOSPH1放大的條件與引子的更進一步揭露可被發現於WO2003/27322中，其內容藉由提及被合併於此。
較佳為，診斷方法包含將分離自一個體的生物樣本與專一於MPHOSPH1胜肽之一試劑接觸以偵測於生物樣本中 之MPHOSPH1胜肽的存在。如此處所使用“接觸”意指以有效接近試劑方式放置生物樣本且在適合之條件下(例如，濃度、溫度、時間、離子強度)，以允許介於試劑與存在生物樣本中之MPHOSPH1胜肽的專一互相作用。一般而言，將試劑接觸生物樣本之條件為熟悉此技藝人士所知之條件以促進介於分子及於生物樣本中之其同類物(cognate)(例如，一蛋白質與其受體同類物、一抗體與其蛋白質抗原同類物、一核酸與其互補序列同類物)之間的專一互相作用。促進介於分子與其同類物之間的專一互相作用的最理想條件敘述於Low et al所提出之美國專利號5,108,921，其內容藉由提及被合併於此。
可在in vivo或in vitro之一或兩者執行本發明之診斷方法。因此，在本發明中生物樣本可位於in vivo或in vitro中。例如，生物樣本可為一in vivo組織且專一於MPHOSPH1免疫活性多胜肽的試劑可被用來偵測於組織中此類分子的存在。或者，可in vitro收集或分離生物樣本(例如血液樣本、腫瘤切片、組織萃取物)。在一特別較佳實施例中，生物樣本可為一含細胞樣本，更佳為一樣本含有收集自要被診斷或測試之個體的腫瘤細胞。
或者，藉由一方法可執行診斷，此方法藉由以螢光素(fluorescein)標誌HLA多聚複合物染色允許抗原-專一T細胞的直接定量(例如，Altman,J.D.et al.,1996,Science 274：94；Altman,J.D.et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10330)。也已提供細胞內淋 巴激素(lymphokines)之染色與干擾素釋放分析或ELISPOT分析。多聚體染色、細胞內淋巴激素染色與ELISPOT分析皆顯露比一般分析靈敏至少多10倍(Murali-Krishna,K.et al.,1998,Immunity 8：177；Lalvani,A.et al.,1997,J.Exp.Med.186：859；Dunbar,P.R.et al.,1998,Curr.Biol.8：413)。也可使用五聚體(例如，美國專利公開號2004-209295A)、右聚體(dextramer)(例如，WO 02/072631)、鏈聚體(streptamer)(例如，Nature medicine 6.631-637(2002))。
因此，在一些實施例中，本發明提供診斷或評估被投予本發明至少一MPHOSPH1胜肽之個體的免疫反應的方法，方法包括步驟：(a)在適合誘導專一於免疫原之細胞毒殺性T淋巴球的條件下，將免疫原與免疫活性細胞接觸；(b)偵測或測定於步驟(a)中所誘導之細胞毒殺性T淋巴球的誘導程度；以及(c)使個體之免疫反應與細胞毒殺性T淋巴球的誘導程度互相關連。
在本發明內容中，免疫原較佳包括(a)擇自序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120中的MPHOSPH1胜肽、(b)具有此種胺基酸序列的胜肽與具有此種胺基酸序列於其中已被以1、2或更多胺基酸取代所修飾的胜肽的至少一個。於期間，適合誘導免疫原專一之細胞毒殺性T淋巴球的條件為本技術領域所熟知。例如，可in vitro培養 免疫活性細胞在免疫存在下以誘導免疫原專一之細胞毒殺性T淋巴球。為了誘導免疫原專一之細胞毒殺性T淋巴球，可加入任何刺激因子於細胞培養物中。例如，IL-2為細胞毒殺性T淋巴球誘導之較佳刺激因子。
在一些實施例中，可在治療前、期間及/或後執行監測或評估要被以胜肽癌症治療之個體的免疫反應的步驟。一般而言，在癌症治療的程序中，一再地將免疫原性胜肽投予至要被治療的個體。例如，可每週投予免疫原性胜肽達3-10週。因此，在癌症治療程序期間，可評估或監測個體之免疫反應。或者，對於癌症治療之評估或監測的步驟可在治療程序完成時。
根據本發明，當與控制組相較時，經增強之免疫原專一之細胞毒殺性T淋巴球的誘導指出要被評估或診斷之個體免疫性地對已被投予之免疫原反應。用以評估免疫反應之適合的控制組包括，例如當免疫活性細胞未與胜肽接觸或與具有除了任何MPHOSPH1胜肽之胺基酸序列的控制組胜肽(例如，隨機胺基酸序列)接觸時的細胞毒殺性T淋巴球的誘導程度。在一較佳實施例中，藉由將介於投予至個體之各個免疫原間的免疫反應進行比較，以序列專一方式來評估個體之免疫反應。特別是，甚至當將MPHOSPH1胜肽之一些種類的混合物投予至個體時，依據胜肽免疫反應可成多樣化。在此例子中，藉由將介於各個胜肽間的免疫反應進行比較，可確認出對於其個體顯示較高反應之胜肽。
XI.抗體
本發更提供抗體其結合至本發明胜肽。較佳抗體專一結合至本發明胜肽且不會結合(或微弱結合)至其他胜肽。或者抗體可結合本發明胜肽與其同源物(homologs)。抗本發明胜肽之抗體可提供用途於癌症診斷與預後分析及成像方法(imaging methodologies)。相似地，對於在癌症病患中也表現或過度表現MPHOSPH1程度而言，此類抗體可提供使用於其他癌症之治療、診斷，及/或預後。此外，細胞內表現之抗體(例如，單鏈抗體)可在治療於其中與MPHOSPH1之表現相關的癌症中提供治療上功效，與MPHOSPH1之表現相關的癌症例子包括，但不限於，膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、淋巴癌、骨肉瘤、攝護腺癌、腎癌與軟組織腫瘤。
本發明也提供MPHOSPH1蛋白質(序列辨識號：126)或其片段之偵測及/或定量的各種免疫活性分析，MPHOSPH1蛋白質(序列辨識號：126)或一其片段包括由擇自由序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120所組成之群組的多胜肽。此類分析可包括一或多個具辨認及結合MPHOSPH1蛋白質或其片段之能力之抗MPHOSPH1抗體為適當的。在本發明之內容中，與MPHOSPH1多胜肽結合之抗MPHOSPH1抗體，會較佳為辨認一多胜肽，此多胜肽為係由擇自序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120中的胺基酸序列所組成以排除其他胜肽。以抑制測試(inhibition test)之方法可確認抗體之結合專一性。其 為，在具有擇自序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120中的胺基酸序列之任何片段多胜肽存在下，當介於要被分析之抗體與全長之MPHOSPH1胜肽之間的結合被抑制時，其顯示此抗體被認為專一結合至片段。在本發明內容中，在包括，但不限於放射免疫分析(radio-immunoassays)、免疫色層分析技術(immuno-chromatgraph technique)、酵素連結免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)、酵素連結免疫螢光分析(enzyme-linked immunofluorescent assays,ELIFA)等之多種本技術領域熟知之免疫分析形式中執行此類免疫分析。
本發明之關於免疫，但非抗體分析也可包括T細胞致免疫性分析(immunogenicity assay)(抑制或刺激)與主要組織相容性複合物(major histocompatibility complex,MHC)結合分析。此外，本發明也包括具偵測表現MPHOSPH1之癌症之能力的免疫成像分析，其包括，但不限於使用本發明之經標誌的抗體的放射顯像成像(radio scintigraphic imaging)方法。此類分析在MPHOSPH1表現之癌症偵測、監控與預後中可臨床上提供用途，MPHOSPH1表現之癌症的例子，包括，但不限於，膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、淋巴癌、骨肉瘤、攝護腺癌、腎癌與軟組織腫瘤。
本發明也提供結合至本發明胜肽的抗體。本發明抗體 可使用於任何形式中，例如單株或多株抗體，且包括獲得自將動物，例如兔子，以本發明胜肽進行免疫之抗血清、所有類型之多株或單株抗體、人類抗體與由基因重組產生之人源化抗體。
使用為一抗原以獲得一抗體之本發明胜肽可來自任何動物種類，但較佳為來自哺乳動物，例如，人類、老鼠或大鼠，更佳為一人類。人類來源胜肽可獲得自此處揭露之核苷酸或胺基酸序列。
根據本發明，一蛋白質之完整與部分之胜肽可做為一免疫抗原。適合之部分胜肽的例子可包括，例如，本發明之一胜肽之胺基(N)端或羧基(C)端片段。
此處，一抗體被定義為一蛋白質其與MPHOSPH1胜肽之全長或片段反應。在一較佳實施例中，本發明之抗體可辨認MPHOSPH1片段胜肽，其具有擇自由序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120中所組成之群組的胺基酸序列。合成寡胜肽的方法為本技術領域所熟知。在合成後，在使用為免疫抗原(immunogen)前，胜肽可視需要被純化。在本發明中，寡胜肽(例如9或10員)可與載體結合或連結以增強致免疫性。鑰孔血藍蛋白(Keyhole-limpet hemocyanin,KLH)被熟知為載體。結合鑰孔血藍蛋白與胜肽的方法為本技術領域所熟知。
或者，可將編碼出本發明一胜肽或其片段的一基因插入一已知的表現載體，其之後被轉形至一宿主細胞，如於此所敘述。藉由任何標準方法，所需之胜肽或其片段可自 宿主細胞之外部或內部被重新獲得，且之後可被使用為一抗原。或者，可將表現胜肽之整個細胞或其細胞萃出物或一化學合成胜肽使用為抗原。
可以抗原將任何哺乳動物進行免疫，然而較佳為考慮與用來細胞融合之親代細胞的相容性。一般而言，可使用囓齒目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或靈長目(Primate)。囓齒目的動物包括，例如小鼠、大鼠與倉鼠。兔形目的動物包括，例如兔子。靈長目的動物包括，例如狹鼻類(舊世界猴)猴子，例如馬來猴(Macaca fascicularis)、獼猴(rhesus monkey)、聖狒狒(sacred baboon)與黑猩猩(chimpanzees)。
以抗原免疫動物之方法為本技術領域所熟知。抗原之腹腔內注射(intraperitoneal injection)或皮下注射(subcutaneous injection)為免疫哺乳動物之一標準方法。更特別地，可將抗原稀釋或懸浮於一適合量的磷酸鹽緩衝溶液、生理食鹽水等。若需要，可將抗原懸浮液與適合量之標準佐劑，例如佛氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)混合，製成乳狀液(emulsion)並且之後投予至哺乳動物。較佳為其之後投予與適合量之佛氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant)混合的抗原，每4至21天。也可使用一適合之載體來免疫。於上述免疫後，藉由為了增加所需之抗體量之標準方法可檢驗血清。
藉由自被檢驗以增加於血清中之所需抗體的經免疫動物收集血液且藉由以任何一般方法自血液分離血清，可製 備抗本發明胜肽之多株抗體。多株抗體可包括含多株抗體的血清，與含自血清分離之多株抗體的部分(fraction)。例如使用與本發明胜肽結合之親合管柱且更進一步使用蛋白質A或蛋白質G管柱純化此部分，可自僅辨認本發明胜肽之部分純化免疫球蛋白G或M。
為了製備單株抗體以用於本發明之內容中之用途，如上所述自經以抗原免疫並確認於血清中所需抗體之增加程度的哺乳動物收集免疫細胞且使免疫細胞遭遇細胞融合。用來細胞融合之免疫細胞，較佳為可獲自脾臟。其他要被與上述免疫細胞融合之親代細胞包括，例如，哺乳動物之骨髓瘤(myeloma)，且較佳為具有以藥物篩選之融合細胞之獲得特性的骨髓瘤細胞。
根據已知方法，例如Milstein et al.(Galfre and Milstein,Methods Enzymol 73：3-46(1981))的方法，可將上述免疫細胞與骨髓瘤細胞融合。
獲自細胞融合之產生的融合瘤，藉由將它們培養於標準篩選培養基，例如HAT培養基(含亞黃嘌呤(hypoxanthine)、氨蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶(thymidine)之培養基)，可被篩選。通常持續細胞培養於HAT培養基數天至數週，時間為允許除了所需融合瘤外之其他細胞(非融合細胞)死亡。之後，可執行標準限制稀釋以篩選並複製產生所需抗體之融合瘤。
除了於其中為了製備融合瘤、以一抗原免疫一非人類動物的上述方法，可以胜肽、表現胜肽之細胞或其細胞萃 取物in vitro免疫人類淋巴細胞，例如被EB病毒感染的那些。之後，可將經免疫之淋巴細胞與具不明確分裂能力之來自人類之骨髓瘤，例如U266融合，以產生一所需人類抗體之融合瘤，所需之人類抗體可與可被獲得之胜肽結合(日本專利公開號Sho 63-17688)。
可將所獲得之融合瘤隨後轉植進入小鼠之腹腔且萃取腹水。可純化所獲得之單株抗體，藉由例如硫酸銨沉澱、一蛋白質A或蛋白質G管柱、DEAE離子交換色層分析或一與本發明胜肽結合之親和管柱。本發明抗體不只可被使用來純化與偵測本發明一胜肽，也可作為本發明胜肽之促進劑與拮抗劑的候選物。
或者，一產生抗體之免疫細胞，例如一經免疫之淋巴細胞可藉由一致癌基因以永生且被使用來製備單株抗體。
也可使用基因工程技術來重組製備因此獲得之單株抗體(參見，例如Borrebaeck and Larrick,Therapeutic Monoclonal Antibodies,published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990))。例如，一編碼出抗體的DNA可自一免疫細胞，例如產生抗體之一融合瘤或一經免疫的淋巴細胞被複製，插入一適合之載體，且引入一宿主細胞以製備重組抗體。本發明也提供如上述製備之重組抗體。
本發明一抗體可為一抗體之片段或經修飾之抗體，只要其結合一或多個本發明之胜肽。例如，抗體片段可為Fab、F(ab’)2、Fv或單鏈Fv(scFv)，於其中來自重與輕 鏈的Fv片段藉由合適的連結器來連接(Huston et al.,Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83(1988))。更特別是，藉由以酵素例如木瓜酵素或胃蛋白酶處理抗體可產生抗體片段。或者，編碼出抗體之基因可被構築、插入一表現載體且表現於一適合的宿主細胞中(參見，例如Co et al.,J Immunol 152：2968-76(1994)；Better and Horwitz,Methods Enzymol 178：476-96(1989)；Pluckthun and Skerra,Methods Enzymol 178：497-515(1989)；Lamoyi,Methods Enzymol 121：652-63(1986)；Rousseaux et al.,Methods Enzymol 121：663-9(1986)；Bird and Walker,Trends Biotechnol 9：132-7(1991))。
藉由與各種分子，例如聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)結合可修飾抗體。本發明提供此類經修飾之抗體。藉由化學修飾一抗體可獲得經修飾之抗體。這些修飾方法為本技術領域中所常見。
或者，本發明之抗體可被獲得為嵌合抗體，介於來自非人抗體之可變區與來自人類抗體之固定區之間，或為人源化抗體，包括來自非人抗體之互補決定區、架構作用區(frame work region,FR)與來自人類抗體之固定區。根據已知方法可製備此類抗體。藉由齧齒類互補決定區之序列取代人類抗體對應之互補序列可執行人源化(參見，例如Verhoeyen et al.,Science 239：1534-1536(1988))。因此，此類人源化抗體為嵌合抗體，其中實質上少於完整之人類可變區已被來自非人種類之對應序列取代。
也可使用包括除了架構作用區與固定區尚有人類可變區的全人類抗體。使用各種本技術領域所知的技術可產生此類抗體。例如，in vitro方法包括呈現於噬菌體上之人類抗體片段的重組資料庫的使用(例如，Hoogenboom & Winter,J.Mol.Biol.227：381(1991))。相似地，藉由將人類免疫球蛋白基因座(loci)引入轉殖動物，例如於其中內生免疫球蛋白基因已被部分或完全去活化的小鼠，可製造人類抗體。此方法被敘述，例如於美國專利號6,150,584,5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016。
獲自上述之抗體可被純化至同質(homogeneity)。例如，根據用於一般蛋白質的分離與純化方法可執行抗體之分離與純化。例如，藉由合適地選擇與結合管柱色層分析，例如親合管柱、過濾、超過濾、鹽析、透析、對鈉十二烷基的硫酸鹽聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis)、等電焦集法(isoelectric focusing)的使用可分開與分離抗體(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但不限於此。蛋白質A管柱與蛋白質G管柱可被使用為親合管柱。要被使用之示範的蛋白質A管柱包括，例如Hyper D、POROS與Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除了親合色層分析，適合之色層分析技術的例子包括，例如離子交換色層分析、疏水色層分析、膠體過濾、 逆向色層分析、吸附色層分析等(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。藉由液相色層分析，例如HPLC與FPLC可執行色層分析步驟。
例如，可使用吸收之測量、酵素連結免疫吸附分析(ELISA)、酵素免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)及/或免疫螢光以測量本發明抗體之抗原結合活性。在酵素連結免疫吸附分析中，本發明抗體為固定於一培養盤上，提供本發明胜肽至一培養盤，且之後提供含所需抗體之樣本，如，產生抗體之細胞的培養懸浮液或經純化的抗體。之後，提供辨認第一抗體且被標誌酵素，例如鹼性磷酸酶之第二抗體，且之後培養培養盤。接著在清洗後，將酵素受質，例如對硝基苯磷酸(p-nitrophenyl phosphate)，加至培養盤，並測量吸收以評估樣本之抗原結合活性。胜肽之片段，例如C端或N端之片段可被使用為抗原以評估抗體結合活性。根據本發明，可使用BIAcore(Pharmacia)來評估抗體的活性。
上述方法允許本發明胜肽之偵測或測量，藉由露出本發明抗體至假定含本發明胜肽之樣本並偵測或測量由抗體與胜肽所形成之免疫複合物。
由於根據本發明之胜肽偵測或測量方法可專一偵測或測量胜肽，方法可提供效用於在使用胜肽之各種實驗中。
XII.載體與宿主細胞
本發明也提供編碼出本發明之胜肽的載體與宿主細胞，於其中將編碼出本發明一胜肽之多核苷酸引入。本發明之載體提供效為一多核苷酸載體，特別是DNA於宿主細胞以表現本發明胜肽，或為基因治療來投予本發明多核苷酸。
當E.coli被選擇為宿主細胞且載體被放大且大量製造於E.coli(例如，JM109、DH5 alpha、HB101或XL1Blue)中時，載體應具有適合放大於E.coli中之一“ori”與適合篩選轉形E.coli之標誌基因(例如，藉由例如安比西林(ampicillin)、四環黴素(tetracycline)、卡那黴素(kanamycin)、氯黴素(chloramphenicol)或類似物之藥物篩選之一抗藥基因)。例如，可使用M13-系列載體、pUC-系列載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。此外，pGEM-T、pDIRECT與pT7也可被用來次複製與萃取cDNA與上述載體。當載體被用來產生本發明蛋白質時，一表現載體可提供效用。例如，要被表現於E.coli中之一表現載體應具有上述特徵以被放大於E.coli中。當使用E.coli，例如JM109、DH5 alpha、HB101或XL1 Blue為宿主細胞時，載體應具有啟動子(promoter)，例如lacZ啟動子(Ward et al.,Nature 341：544-6(1989)；FASEB J 6：2422-7(1992)),araB promoter(Better et al.,Science 240：1041-3(1988))、T7啟動子或類似物，其可有效表現所需基因於E.coli.中。基於那方面，可使用，例如pGEX-5X-1(Pharmacia),"QIAexpress system"(Qiagen)、pEGFP 與pET(於此例子，宿主較佳為BL21，其表現T7 RNA聚合酶)，取代上述載體。另外，載體也可含用於胜肽分泌之訊號序列。一引導要被分泌之胜肽至E.coli的胞膜間區(periplasm)的示範之訊號序列為pelB訊號序列(Lei et al.,J Bacteriol 169：4379(1987))。將載體引入目標宿主細胞的方式包括，例如，氯化鈣方法，與電穿孔(electroporation)方法。
除了E.coli，例如來自哺乳動物之表現載體(例如pcDNA3(Invitrogen)與pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17)：5322(1990)),pEF,pCDM8)、來自昆蟲細胞之表現載體(例如，"Bac-to-BAC桿狀病毒表現系統(baculovirus expression system)"(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、來自植物之表現載體(例如，pMH1、pMH2)、來自動物病毒之表現載體(例如，pHSV、pMV、pAdexLcw)、來自反轉錄病毒之表現載體(例如，pZIpneo)、來自酵母菌之表現載體(例如，"Pichia Expression Kit"(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)與來自枯草桿菌(Bacillus subtilis)之表現載體(例如，pPL608,pKTH50)可被用來產生本發明之多胜肽。
為了在於動物細胞，例如CHO、COS或NIH3T3細胞中表現載體，載體應攜帶表現於此類細胞中所必須的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan et al.,Nature 277：108(1979))、MMLV-LTR啟動子、EF1 alpha啟動子(Mizushima et al.,Nucleic Acids Res 18：5322(1990))、CMV啟 動子等，與篩選轉形物的標誌基因(例如藉由藥物篩選(例如，新黴素(neomycin)、G418之抗藥基因)較佳。具有這些載體特徵之已知載體的例子包括，例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV與pOP13。
於此之後，本發明被詳細描述關於實施例。然而，儘管下述材料方法與例子於製造與使用本發明特定實施例中可用來協助熟悉此技藝人士，然而其僅打算說明本發明之態樣，且因此不限制本發明之範圍。熟悉此技藝人士會容易地認可相似或等同於在此敘述之那些的方法與材料可被使用於本發明之實施或測試中。
【實施例】 材料與方法 細胞株
T2、HLA-A＊0201陽性人類B淋巴母細胞株、HLA-A＊0206陽性人類B淋巴母細胞株、HT1376、J82、COS7與UM-UC3為自ATCC所購得。MKN-45為購自JCRB。
來自MPHOSPH1之胜肽的候選物選擇
使用結合預測軟體“BIMAS”(http：//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind)(Parker et al.,J Immunol 1994,152(1)：163-75；Kuzushima et al.,Blood 2001,98(6)：1872-81)預測來自MPHOSPH1之9員與10員胜肽，其結合至HLA-A＊0201分子。這些胜肽係根據一標準固相合成方法由 Biosynthesis(Lewisville,Texas)來合成且藉由逆相高效能液體層析(reversed phase high performance liquid chromatography,HPLC)來純化。分別藉由分析型HPLC與質譜分析確認這些胜肽之純度(>90%)與身份(identity)。將胜肽溶解於二甲基亞碸(dimethylsulfoxide,DMSO)中於20 mg/ml且儲存於-80℃。
In vitro細胞毒殺性T淋巴球誘導
使用來自單核白血球之樹突細胞做為抗原呈現細胞以誘導抗表現於人類白血球組織抗原(HLA)上之胜肽的細胞毒殺性T淋巴球反應。In vitro產生樹突細胞如別處所述(Nakahara S et al.,Cancer Res 2003 Jul 15,63(14)：4112-8)。特別地，由Ficoll-Paque plus(Pharmacia)溶液分離自一正常自願者(HLA-A＊0201陽性)之周邊血液單核細胞，藉由貼附至一塑膠組織培養盤(Becton Dickinson)來分離以豐富其如一單核白血球部分。將經豐富單核白血球之族群培養在1000 U/ml之人類顆粒-巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)(R&D System)與1000 U/ml之白細胞介素(interleukin,IL)-4(R&D System)存在下於含2%之熱去活性自身取得血清(autologous serum,AS)之AIM-V培養基(Invitrogen)中。培養7天後，於AIM-V培養基中，於3 μg/ml之β-2微球蛋白(beta 2-microglobulin)存在下以20 μg/ml之各合成胜肽脈衝(pulsed)細胞激素 誘導之樹突細胞3小時於37℃。所產生之細胞顯示表現樹突細胞相關分子，例如CD80、CD83、CD86與HLA Class II於其細胞表面(資料未顯示)。之後以X光-射線(20 Gy)將這些胜肽脈衝之樹突細胞去活性且將其以1：20之比例與自身取得CD8陽性T細胞混合，CD8陽性T細胞藉由以CD8 Positive Isolation Kit(Dynal)正選擇獲得。這些培養物設置於48孔盤(Corning)；各孔含1.5 x 104胜肽脈衝之樹突細胞、3 x 105 CD8陽性T細胞與10 ng/ml之IL-7(R&D System)於0.5 ml之AIM-V/2%自身取得血清培養基中。三天之後，以IL-2(CHIRON)添加至培養物至終濃度為20 IU/ml。第7天與第14天更以自身取得胜肽脈衝之樹突細胞進一步刺激T細胞。以與上述相同之方法每次製備樹突細胞。於第21天，第三輪之胜肽刺激後，將細胞毒殺性T淋巴球進行抗胜肽脈衝之T2細胞測試(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1)：94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8)：1052-7；Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24)：8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006 May,97(5)：411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8)：498-506)。
細胞毒殺性T淋巴球擴張步驟
使用與由Riddell et al.(Walter EA et al.,N Engl J Med 1995 Oct 19,333(16)：1038-44；Riddell SR et al.,Nat Med 1996 Feb,2(2)：216-23)所敘述之相似方法於培 養中擴張細胞毒殺性T淋巴球。全部5 x 104細胞毒殺性T淋巴球懸浮於25 ml之含有兩種人類B類淋巴母細胞株之AIM-V/5%自身取得血清培養基，由MMC去活化，在40 ng/ml之抗-CD3單株抗體(Pharmingen)存在下。在開始培養1天後，120 IU/ml之IL-2加入培養中。於第5、8、11天以新鮮之含30 IU/ml之IL-2的AIM-V/5%自身取得血清培養基提供給培養物(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1)：94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8)：1052-7；Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24)：8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006 May,97(5)：411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8)：498-506)。
細胞毒殺性T淋巴球複製(clone)的建立
執行稀釋以具有0.3、1與3細胞毒殺性T淋巴球/孔於96圓底(round-bottomed)微效價盤(Nalge Nunc International)中。細胞毒殺性T淋巴球與1 x 104細胞/孔之兩種人類B類淋巴母細胞株、30 ng/ml之抗-CD3抗體與125 U/ml之IL-2於全部150 μl/孔之含5%自身取得之血清的AIM-V培養基中一起培養。10天後將50 μl/孔之IL-2加入培養基中以達到125 U/ml IL-2之最終濃度。於第14天測試細胞毒殺性T淋巴球之活性，且使用上述相同方法擴張細胞毒殺性T淋巴球複製(Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24)：8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006 May,97(5)：411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8)：498-506)。
專一之細胞毒殺性T淋巴球活性
為了測試專一之細胞毒殺性T淋巴球活性，執行IFN-γ酵素結合免疫斑點(ELISPOT)分析與IFN-γ酵素結合免疫吸附(ELISA)分析。製備胜肽脈衝之T2(1 x 104/孔)為刺激細胞(stimulator cell)。培養之細胞於48孔盤中，細胞毒殺性T淋巴球細胞株與細胞毒殺性T淋巴球複製(clone)做為應答細胞(responder cell)。在製造商步驟下執行IFN-γ酵素結合免疫斑點分析與IFN-γ酵素結合免疫吸附分析。
辨認內生表現MPHOSPH1與HLA-A＊0201之目標細胞株的細胞毒殺性T淋巴球能力
將細胞毒殺性T淋巴球複製檢驗其辨認內生表現MPHOSPH1與HLA-A＊0201之目標細胞株之能力。以目標細胞株(5 x 104細胞/孔)培養所建立之細胞毒殺性T淋巴球細胞株與複製達兩個隔夜。在誘導後藉由ELISA來測量於培養基中之IFN-γ。按照製造商程序執行IFN-γ ELISA。
細胞毒殺活性
將細胞毒殺性T淋巴球檢驗其殺死內生表現MPHOSPH1與HLA-A*0201之腫瘤細胞的能力。於CO2培養箱中以100 μ-Ci之Na251CrO4(Perkin Elmer)標定目標細胞1小時。藉由在標定前將細胞以20 μ/ml之胜肽培養16小時來製備胜肽脈衝目標細胞。將目標細胞以51Cr沖洗並與細胞毒 殺性T淋巴球複製混合於200 μl之一終體積於96孔圓底微效價盤中。將此盤離心(4分鐘於800 rpm)以增加細胞對細胞(cell-to-cell)接觸並置入CO2培養箱中。在4小時培養後，從各孔洞收集50μl之上清液，並以一γ計算器(gamma counter)(PerkinElmer)來測定放射活性。藉由以根據下列公式來計算專一51Cr-釋放的百分比來測定專一細胞毒殺性的百分比：{(測試樣本釋放之cpm-自發(spontaneou)釋放之cpm)/(最大釋放之cpm-自發釋放之cpm}×100。藉由在缺乏作用細胞(effector cells)下單獨培養目標細胞來測定自發性釋放。藉由以1N HCl來培養目標細胞以獲得最大釋放。執行所有測量二重複。
強有力地表現目標基因與HLA-A0206任一或兩者的細胞的建立
藉由PCR將編碼出目標基因之開放讀框或HLA-A＊0206的cDNA放大。將PCR放大產物選殖進一表現載體。使用lipofectamine 2000(Invitrogen)，根據製造商步驟將質體轉染進COS7，其為目標基因與HLA-A＊0206無效細胞株。於自轉染後2天，以versene(Invitrogen)收集經轉染的細胞且使用為細胞毒殺性T淋巴球活性分析之刺激細胞(stimulator cell)(5 x 104細胞/孔)。
辨認內生表現MPHOSPH1與HLA-A＊0206之目標細胞株的細胞毒殺性T淋巴球能力
將細胞毒殺性T淋巴球複製檢驗其辨認內生表現MPHOSPH1與HLA-A＊0206之目標細胞株之能力。以目標細 胞株(5 x 104細胞/孔)培養所建立之細胞毒殺性T淋巴球細胞株與複製達兩個隔夜。在誘導後藉由ELISA來測量於培養基中之IFN-γ。按照製造商程序執行IFN-γ ELISA。
結果 於癌症中增強之MPHOSPH1表現
使用c-DNA微陣列獲得自各種癌症之廣泛基因表現概況(profile)顯示，當與正常對應組織比較時，MPHOSPH1(GenBank Accession No.NM_016195；序列辨識號：125)被專一提升於癌症組織中。膀胱癌31個有30個、乳癌36個有8個、子宮頸癌18個有18個、膽管細胞癌17個有5個、慢性骨髓性白血病31個有25個、大腸癌11個有6個、胃癌14個有6個、非小細胞肺癌5個有5個、淋巴癌7個有7個、骨肉瘤10個有6個、攝護腺癌22個有7個、腎癌18個有10個與軟組織腫瘤21個有15個，有根據地提升MPHOSPH1表現(表1)。
來自MPHOSPH1之HLA-A02結合胜肽的預測
表2a與2b以高結合親和力之順序顯示MPHOSPH1之HLA-A02結合9員與10員胜肽。總共47個具有潛在HLA-A02結合能力之胜肽被選擇且將其試驗以確定抗原決定位胜肽。
起始位置指自MPHOSPH1之N端的胺基酸殘基數目。結合分數源自“BIMAS”。
以HLA-A＊0201限制之來自MPHOSPH1之預測胜肽誘導細胞毒殺性T淋巴球
根據如敘述於“材料與方法”中之步驟產生對於那些源自MPHOSPH1之胜肽的細胞毒殺性T淋巴球。藉由IFN-γ酵素結合免疫斑點分析來偵測胜肽專一細胞毒殺性T淋巴球活性(第1圖)。其顯示與控制組孔洞相較，以MPHOSPH1-A02-9-850(序列辨識號：5)刺激之孔洞編號#7(a)、以MPHOSPH1-A02-9-129(序列辨識號：14)刺激之孔洞編號#5(b)、以MPHOSPH1-A02-9-846(序列辨識號：64)刺激之孔洞編號#5(c)、以MPHOSPH1-A02-10-460(序列辨識號：73)刺激之孔洞編號#2(d)、以MPHOSPH1-A02-10-770(序列辨識號：77)刺激之孔洞編號#1(e)、以MPHOSPH1-A02-10-407(序列辨識號：79)刺激之孔洞編號#1(f)、以MPHOSPH1-A02-10-923(序列辨識號：97)刺激之孔洞編號#4(g)、以MPHOSPH1-A02-10-1484(序列辨識號：103)刺激之孔洞編號#5(h)與以MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號：120)刺激之孔洞編號#8(i)顯示強而有力的IFN-γ產生。另一方面，藉由以顯示於表2a與2b中之其他胜肽刺激，沒有偵測到專一之細胞毒殺性T淋巴球活性，儘管那些胜肽具有與HLA-A＊0201之可能結合活性。如負資料之一典型例子，從以MPHOSPH1-A02-9-575(序列辨識號：1)(j)刺激之細胞毒殺性T淋巴球沒有觀察到專一隻IFN-γ產生。合起來，這些結果建議源自MPHOSPH1之10個選擇的胜肽可誘導強的 細胞毒殺性T淋巴球。
抗MPHOSPH1衍生胜肽之細胞毒殺性T淋巴球細胞株與複製的建立
於IFN-γ酵素結合免疫斑點分析中顯示胜肽-專一細胞毒殺性T淋巴球活性之於以MPHOSPH1-A02-9-850(序列辨識號：5)刺激之孔洞編號#7(a)、以MPHOSPH1-A02-9-129(序列辨識號：14)刺激之孔洞編號#5(b)、以MPHOSPH1-A02-9-846(序列辨識號：64)刺激之孔洞編號#5(c)、以MPHOSPH1-A02-10-460(序列辨識號：73)刺激之孔洞編號#2(d)、以MPHOSPH1-A02-10-770(序列辨識號：77)刺激之孔洞編號#1(e)、以MPHOSPH1-A02-10-407(序列辨識號：79)刺激之孔洞編號#1(f)、以MPHOSPH1-A02-10-923(序列辨識號：97)刺激之孔洞編號#4(g)、以MPHOSPH1-A02-10-1484(序列辨識號：103)刺激之孔洞編號#5(h)與以MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號：120)刺激之孔洞編號#8(i)中的細胞被擴張並建立細胞毒殺性T淋巴球細胞株(第2圖)。藉由IFN-γ酵素結合免疫吸附來測量這些細胞毒殺性T淋巴球細胞株的細胞毒殺性T淋巴球活性。細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示與無胜肽脈衝之T2細胞相較，細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強的抗以對應胜肽脈衝之T2細胞的IFN-γ產生。此外，藉由如於“材料與方法”中所述之來自細胞毒殺性T淋巴球細胞株的限制稀釋建立細胞毒殺性T淋巴球複製， 且藉由IFN-γ酵素結合免疫吸附測量來自抗經對應胜肽脈衝之T2細胞之細胞毒殺性T淋巴球複製的IFN-γ產生。從以MPHOSPH1-A02-9-850(序列辨識號：5)(a)、MPHOSPH1-A02-9-846(序列辨識號：64)(b)、MPHOSPH1-A02-10-460(序列辨識號：73)(c)、MPHOSPH1-A02-10-770(序列辨識號：77)(d)與MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號：120)(e)刺激之細胞毒殺性T淋巴球複製觀察出強的IFN-γ產生(第3圖)。
抗表現MPHOSPH1與HLA-A＊0201之目標細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性
將所建立之細胞毒殺性T淋巴球複製檢驗其辨認表現MPHOSPH1與HLA-A＊0201分子之目標細胞的能力。以MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號120)刺激之細胞毒殺性T淋巴球複製顯示強的抗表現MPHOSPH1與HLA-A＊0201兩者之J82細胞的細胞毒殺性T淋巴球活性。另一方面，沒有顯著專一之細胞毒殺性T淋巴球活性被偵測到為抗表現MPHOSPH1而非HLA-A＊0201之HT1376細胞與抗表現HLA-A＊0201而非MPHOSPH1之T2細胞(第4圖)。因此，此資料清楚顯示MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號120)胜肽被內生地處理並以HLA-A＊0201分子表現於目標細胞上，且被細胞毒殺性T淋巴球所辨認。
抗表現MPHOSPH1與HLA-A＊0201之腫瘤細胞株的細胞毒殺 性T淋巴球活性
將所建立之細胞毒殺性T淋巴球複製檢驗其辨認與殺死表現MPHOSPH1與HLA-A＊0201分子之腫瘤細胞株的能力。以MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號120)刺激之細胞毒殺性T淋巴球複製顯示強的抗表現MPHOSPH1與HLA-A＊0201兩者之UMUC-3細胞的細胞毒殺性T淋巴球活性。另一方面，沒有顯著專一之細胞毒殺性T淋巴球活性被偵測到為抗表現MPHOSPH1而非HLA-A＊0201之MKN45細胞與抗表現HLA-A＊0201而非MPHOSPH1之T2細胞(第5圖)。此結果指出源自MPHOSPH1之MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號120)胜肽可有效應用於對於具有表現MPHOSPH1之腫瘤的病患的癌症疫苗。
抗表現MPHOSPH1與HLA-A＊0206之目標細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性
檢驗經提升抗MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號120)胜肽之所建立的細胞毒殺性T淋巴球細胞株其對於辨認表現MPHOSPH1與HLA-A＊0206分子之目標細胞的能力。以全長之MPHOSPH1與HLA-A＊0206基因兩者轉染之COS7細胞(對於表現MPHOSPH1與HLA-A＊0206基因之目標細胞的特定模式)被製備為刺激細胞(stimulator cell)，而以全長MPHOSPH1或HLA-A＊0206之一轉染之COS7細胞被使用為控制組。於第6圖中，以MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號120)刺激之細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強的抗表現 MPHOSPH1與HLA-A＊0206兩者之COS7細胞的細胞毒殺性T淋巴球活性。另一方面，沒有偵測到抗控制組之顯著專一之細胞毒殺性T淋巴球活性。因此，這些資料清楚證明MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號：120)胜肽被內生地處理且表現於具有HLA-A＊0206分子之目標細胞上且由細胞毒殺性T淋巴球所辨認
抗原胜肽之同源分析
以MPHOSPH1-A02-9-850(序列辨識號：5)、MPHOSPH1-A02-9-129(序列辨識號：14)、MPHOSPH1-A02-9-846(序列辨識號：64)、MPHOSPH1-A02-10-460(序列辨識號：73)、MPHOSPH1-A02-10-770(序列辨識號：77)、MPHOSPH1-A02-10-407(序列辨識號：79)、MPHOSPH1-A02-10-923(序列辨識號：97)、MPHOSPH1-A02-10-1484(序列辨識號：103)與MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號：120)刺激之細胞毒殺性T淋巴球顯示顯著且專一之細胞毒殺性T淋巴球活性。此結果可能起因於MPHOSPH1-A02-9-850(序列辨識號：5)、MPHOSPH1-A02-9-129(序列辨識號：14)、MPHOSPH1-A02-9-846(序列辨識號：64)、MPHOSPH1-A02-10-460(序列辨識號：73)、MPHOSPH1-A02-10-770(序列辨識號：77)、MPHOSPH1-A02-10-407(序列辨識號：79)、 MPHOSPH1-A02-10-923(序列辨識號：97)、MPHOSPH1-A02-10-1484(序列辨識號：103)與MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號：120)之序列為與源自已知使人類免疫系統敏感之其他分子的胜肽同源的事實。為了排除此可能性，對於使用為關鍵字向BLAST演算法(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)查詢之這些胜肽序列執行同源性分析，而BLAST演算法顯示沒有序列顯示顯著之同源性。同源性分析之結果指出MPHOSPH1-A02-9-850(序列辨識號：5)、MPHOSPH1-A02-9-129(序列辨識號：14)、MPHOSPH1-A02-9-846(序列辨識號：64)、MPHOSPH1-A02-10-460(序列辨識號：73)、MPHOSPH1-A02-10-770(序列辨識號：77)、MPHOSPH1-A02-10-407(序列辨識號：79)、MPHOSPH1-A02-10-923(序列辨識號：97)、MPHOSPH1-A02-10-1484(序列辨識號：103)與MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號：120)之序列為獨特的，且因此只有很小可能性，對於我們最佳知識而言，此分子會對於一些非相關分子提高非計畫中之免疫反應。
結論，此處定義之源自MPHOSPH1的HLA-A＊0201抗原決定位胜肽可提供效用於癌症免疫治療的領域中。
產業利用性
本發明提供新的腫瘤相關抗原，特別是來自MPHOSPH1 的那些，其可誘導強且專一的抗腫瘤免疫反應，且對於癌症形式之廣泛多樣化而言具有應用性。此腫瘤相關抗原可提供用途為抗與MPHOSPH1相關之疾病的胜肽疫苗，與MPHOSPH1相關之疾病，例如癌症，更特別是膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、淋巴癌、骨肉瘤、攝護腺癌、腎癌與軟組織腫瘤。
當於此詳述本發明與提及其特定實施例時，需瞭解的是，前述敘述本質為示範與解釋且意為說明本發明與其較佳實施例。於例行實驗之中，熟悉此技藝人士可立即瞭解在不脫離本發明之精神下其可實行各種改變與修飾，其邊界與範圍被所附申請專利範圍所定義。
第1圖由一系列照片(a)至(j)所組成，其顯示在以來自MPHOSPH1之胜肽誘導之細胞毒殺性T淋巴球上之IFN-γ酵素結合免疫斑點分析(ELISPOT)的結果。分別與控制組相較，以MPHOSPH1-A02-9-850(序列辨識號：5)刺激之於孔洞編號#7中(a)、以MPHOSPH1-A02-9-129(序列辨識號：14)刺激之於孔洞編號#5中(b)、以MPHOSPH1-A02-9-846(序列辨識號：64)刺激之於孔洞編號#5中(c)、以MPHOSPH1-A02-10-460(序列辨識號：73)刺激之於孔洞編號#2中(d)、以MPHOSPH1-A02-10-770(序列辨識號：77)刺激之於孔洞編號#1中(e)、以MPHOSPH1-A02-10-407(序 列辨識號：79)刺激之於孔洞編號#1中(f)、以MPHOSPH1-A02-10-923(序列辨識號：97)刺激之於孔洞編號#4中(g)、以MPHOSPH1-A02-10-1484(序列辨識號：103)刺激之於孔洞編號#5中(h)與以MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號：120)刺激之於孔洞編號#8中(i)的細胞毒殺性T淋巴球顯示強的IFN-γ產生。於這些照片之孔洞上的正方形指出來自對應之孔洞的細胞被擴張來建立細胞毒殺性T淋巴球細胞株。相對的，如負資料的典型例子，不顯示從以MPHOSPH1-A02-9-575(序列辨識號：1)(j)刺激的細胞毒殺性T淋巴球之專一的IFN-γ產生。於圖中，“+”指出抗以適合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生，而“-”指出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生。
第2圖由一系列線圖(a)至(i)所組成，其顯示IFN-γ酵素結合免疫吸附分析之結果，IFN-γ酵素結合免疫吸附分析之結果顯示MPHOSPH1-A02-9-850(序列辨識號：5)(a)、MPHOSPH1-A02-9-129(序列辨識號：14)(b)、MPHOSPH1-A02-9-846(序列辨識號：64)(c)、MPHOSPH1-A02-10-460(序列辨識號：73)(d)、MPHOSPH1-A02-10-770(序列辨識號：77)(e)、MPHOSPH1-A02-10-407(序列辨識號：79)(f)、MPHOSPH1-A02-10-923(序列辨識號：97)(g)、MPHOSPH1-A02-10-1484(序列辨識號：103)(h)與MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號：120)(i)刺激之細胞 毒殺性T淋巴球細胞株的IFN-γ產生。藉由IFN-γ酵素連結免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)來測量細胞毒殺性T淋巴球產生之IFN-γ的量。結果顯示與控制組相較，藉由以各胜肽刺激建立之細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強而有力之IFN-γ產生。於圖中，“+”指出抗以適合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生，而“-”指出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生。R/S比意指應答細胞(responder cell)(細胞毒殺性T淋巴球細胞株)與刺激細胞之數目的比。
第3圖由一系列線圖(a)至(e)所組成，其示藉由來自以MPHOSPH1-A02-9-850(序列辨識號：5)(a)、MPHOSPH1-A02-9-846(序列辨識號：64)(b)、MPHOSPH1-A02-10-460(序列辨識號：73)(c)、MPHOSPH1-A02-10-770(序列辨識號：77)(d)與MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號：120)(e)刺激之細胞毒殺性T淋巴球細胞株的限制稀釋所建立之細胞毒殺性T淋巴球複製的IFN-γ產生。結果顯示與控制組相較，藉由以各胜肽刺激所建立之細胞毒殺性T淋巴球複製顯示強而有力之IFN-γ產生。於圖中，“+”指出抗以各胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生，而“-”指出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生。R/S比意指應答細胞(細胞毒殺性T淋巴球複製(clone))與刺激細胞之數目的比。
第4圖為一線圖，其顯示抗腫瘤細胞株之專一細胞毒殺性T淋巴球活性。J82細胞其表現MPHOSPH1與HLA-A＊ 0201兩者、HT1376細胞其表現MPHOSPH1而非HLA-A＊0201及T2細胞其表現HLA-A＊0201而非MPHOSPH1被使用為刺激細胞(stimulator cell)。以MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號：120)建立之細胞毒殺性T淋巴球複製顯示抗J82細胞之專一細胞毒殺性T淋巴球活性。另一方面，沒有顯著之專一細胞毒殺性T淋巴球活性被偵測到抗HT1376與T2細胞。R/S比意指應答細胞(responder cell)(細胞毒殺性T淋巴球複製(clone))與刺激細胞之數目的比。
第5圖為一線圖，其顯示抗腫瘤細胞株之細胞毒殺性T淋巴球的細胞毒殺活性。UMUC-3細胞其表現MPHOSPH1與HLA-A＊0201兩者、MKN45細胞其表現MPHOSPH1而非HLA-A＊0201及T2細胞其表現HLA-A＊0201而非MPHOSPH1被使用為目標細胞。以MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號：120)建立之細胞毒殺性T淋巴球複製顯示強的抗UMUC-3細胞之細胞毒殺活性。另一方面，沒有顯著之專一細胞毒殺性T淋巴球活性被偵測到抗MKN45與T2細胞。E/T比意指作用細胞(effecter cell)(細胞毒殺性T淋巴球複製(clone))與目標細胞之數目的比。
第6圖為一線圖，其顯示抗表現MPHOSPH1與HLA-A＊0206之目標細胞的細胞毒殺性T淋巴球的細胞毒殺活性。將以HLA-A＊0206或全長之MPHOSPH1基因轉染之COS7細胞製備為控制組。以MPHOSPH1-A02-10-282(序列辨識號：120)建立之細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示抗以MPHOSPH1與HLA-A＊0206兩者轉染之COS7細胞的專一細胞毒殺性T 淋巴球活性(黑色菱形)。另一方面，沒有偵測到顯著專一之細胞毒殺性T淋巴球活性，其抗表現HLA-A＊0206(三角形)或MPHOSPH1(圓形)任一的目標細胞。
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<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 69
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 70
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 71
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 72
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 73
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<212> PRT
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<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<220>
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 99
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 101
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 102
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 103
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 104
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 105
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 108
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一肽肽序列
<400> 109
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 110
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 111
<210> 112
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 112
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 113
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 114
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 115
<210> 116
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 116
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 117
<210> 118
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 118
<210> 119
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 119
<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 120
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 121
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 122
<210> 123
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 123
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自MPHOSPH1之一胜肽序列
<400> 124
<210> 125
<211> 6319
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (73)..(5415)
<400> 125
<210> 126
<211> 1780
<212> PRT
<213> 人類
<400> 126
<210> 127
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 127
<210> 128
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 128
<210> 129
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 129
<210> 130
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 130

Claims (21)

  1. 一種下列(a)或(b)之經分離的胜肽：(a)一胜肽，包括擇自由序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120所組成之群組的胺基酸序列；(b)一胜肽，包括一胺基酸序列，其1、2或數個胺基酸被取代、刪除、插入及/或加入於擇自由序列辨識號：5、14、64、73、77、79、97、103與120所組成之群組的胺基酸序列中，且其中該胜肽具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之經分離的胜肽，其中該胜肽具有下列特徵之一或兩者：(a)從擇自由序列辨識號5、14、64、73、77、79、97、103與120所組成之群組之胺基酸序列的N端的第二個胺基酸為擇自由白胺酸與甲硫丁胺酸所組成之群組；以及(b)擇自由序列辨識號5、14、64、73、77、79、97、103與120所組成之群組之胺基酸序列的C端胺基酸為擇自由纈胺酸與白胺酸所組成之群組。
  3. 如申請專利範圍第1至2項所述之經分離的胜肽，其中該胜肽為九胜肽或十胜肽。
  4. 一種經分離之多核苷酸，其編碼出如申請專利範圍第1至3項之任一項所述的胜肽。
  5. 一種誘發細胞毒殺性T淋巴球之組合物，其中該組合物包括一或多個如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽，或一或多個如申請專利範圍第4項所述之多核 苷酸。
  6. 一種用於誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的組合物，其中該組合物包括一或多個如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽或一或多個如申請專利範圍第4項之多核苷酸。
  7. 一種藥學組合物，包括擇自由下列所組成之群組的至少一活性成分：(a)一或多個如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽；(b)一或多個編碼出如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽的多核苷酸；(c)一或多個抗原呈現細胞或外吐小體，其呈現如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽與一人類白血球組織抗原的一複合物於其表面上；與(d)一或多個細胞毒殺性T淋巴球，其辨認表現如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽與一人類白血球組織抗原的一複合物於其表面上的一細胞。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之藥學組合物，用於癌症之治療與預防之任一或兩者，或於一個體中誘導抗癌症免疫反應。
  9. 如申請專利範圍第7或8項所述之藥學組合物，其中該藥學組合物被配製來用於投予一個體，其人類白血球組織抗原為人類白血球組織抗原-A2。
  10. 一種誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗 原呈現細胞的方法，該方法包括擇自由下列所組成之群組的一步驟：(a)in vitro、ex vivo或in vivo將一抗原呈現細胞與如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽接觸，以及(b)將編碼出如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽的一多核苷酸引入一抗原呈現細胞。
  11. 一種誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法，該方法包括擇自由下列所組成之群組的一步驟：(a)將CD8陽性T細胞與抗原呈現細胞共培養，抗原呈現細胞表現一人類白血球組織抗原與如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽的一複合物於其表面上；(b)將CD8陽性T細胞與外吐小體共培養，外吐小體表現一人類白血球組織抗原與如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽的一複合物於其表面上，以及(c)將編碼出T細胞受體次單元兩者的一多核苷酸或編碼出T細胞受體次單元之各個的多核苷酸引入一CD8陽性T細胞，其中該T細胞受體可與呈現於一細胞上之一人類白血球組織抗原與如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽的一複合物結合。
  12. 一種經分離之抗原呈現細胞，其表現一人類白血球組織抗原與如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽的一複合物於其表面上。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之抗原呈現細胞，其 藉由如申請專利範圍第10項所述之方法來誘導。
  14. 一種經分離之細胞毒殺性T淋巴球，其辨認於其表面呈現一人類白血球組織抗原與如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽的一複合物的一細胞。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之細胞毒殺性T淋巴球，其中該細胞毒殺性T淋巴球藉由如申請專利範圍第11項所述之方法來誘導。
  16. 一種於一個體中之癌症之治療與預防之任一或兩者的方法，其中該方法包括一步驟，其投予該個體(一)藥學有效量之：(a)一或多個如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽；(b)一或多個編碼出如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽的多核苷酸；(c)一或多個抗原呈現細胞或外吐小體，其呈現如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽與一人類白血球組織抗原的一複合物於其表面上；與(d)一或多個細胞毒殺性T淋巴球，其辨認表現如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽與一人類白血球組織抗原的一複合物於其表面上的一細胞。
  17. 一種於一需要個體中誘導一抗癌症之免疫反應的方法，該方法包括投予該個體一組合物的步驟，該組合物包括如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽或編碼出該胜肽之一多核苷酸。
  18. 一種抗體或其免疫活性片段，其抗如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽。
  19. 一種載體，包括編碼出如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽的一核苷酸序列。
  20. 一種宿主細胞，其被以如申請專利範圍第19項所述之載體所轉形或轉染。
  21. 一種診斷套組，包括如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽、如申請專利範圍第4項所述之多核苷酸或如申請專利範圍第18項所述之抗體。
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