DE69717661T2

DE69717661T2 - Liposomenzusammensetzung

Info

Publication number: DE69717661T2
Application number: DE69717661T
Authority: DE
Inventors: Gregory Gregoriadis
Original assignee: Lipoxen Technologies Ltd
Current assignee: Lipoxen Technologies Ltd
Priority date: 1996-09-13
Filing date: 1997-09-15
Publication date: 2003-09-25
Anticipated expiration: 2017-09-16
Also published as: EP0938298B1; EP1254657A3; ATE395904T1; CN1138533C; ES2187812T3; CA2271388C; WO1998010748A1; AU728581B2; ATE228824T1; ES2305157T3; KR100507660B1; AU4215497A; US20080286353A1; DE69717661D1; EP0938298A1; KR20000036088A; CA2271388A1; EP1254657A2; JP2001502299A; CN1237102A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen von Liposomen mit einem eingeschlossenen Polynukleotid, das für ein gewünschtes Polypeptid kodiert. Das Polypeptid kodiert vorzugsweise für ein immunogenes Polypeptid, das zur Induktion einer gewünschten Immunreaktion bei einem Individuum, beispielsweise zur prophylaktischen Immunisierung gegen infektiöse Mikroorganismen oder zur immuntherapeutischen Behandlung, geeignet ist. Die Liposomen schließen vorzugsweise mindestens ein kationisch geladenes Lipid ein und sind vorzugsweise mit einer Dehydratations-Rehydratations-Technik hergestellt.
Es ist bekannt, genetisches Material in den Körper eines menschlichen oder tierischen Individuums für verschiedene Zwecke einzuführen. In der Mitte der 60er Jahre wurde vorgeschlagen, dass die Technik zur Behandlung genetischer Krankheiten durch Einführung einer normalen Gensequenz in Zellen einer Person, die deren defektes Gegenstück trägt, eingesetzt werden könnte. Derzeit sind klinische Versuche für Verfahren im Gange, verschiedene vererbte genetische Störungen durch Gentherapie zu behandeln. Beispielsweise wurde hinsichtlich der Behandlung von zystischer Fibrose durch Einführung von DNA, die für den CF-Transmembran- Leitfähigkeitsregulator kodiert, ein beträchtliches Maß an Forschungsarbeit geleistet. Nachdem das Genprodukt in den Lungen benötigt wird, wurden Versuche unternommen, das Gen direkt in die Lungen oder intranasal abzugeben.
In jüngerer Zeit wurde Gentherapie zur Behandlung von Krebs vorgeschlagen. Beispielsweise wird gehofft, durch Einführung von Genen, die für Tumornekrosefaktor (TNF) oder Interleukin-2 kodieren, in Lymphozyten oder in Tumorzellen eine Immunreaktion zu stimulieren, die zur Tumorzerstörung führt. Darüber hinaus wird gehofft, durch Einführung von Genen, die für ein humanes Klasse 1-Haupthistokompatibilitätsantigen (HLA-B7) kodieren, in Tumorzellen von Patienten, welche dieses Antigen nicht exprimieren, eine Immunreaktion auf das Antigen zu stimulieren, die zur Zerstörung von Tumorzellen führt.
Es wurde eine Vielfalt von Vektoren für den Transport und die Expression von Nukleinsäuren in der Gentherapie vorgeschlagen (Mulligan, 1993). Sie umfassen Viren (z. B. Retroviren und Adenoviren) ebenso wie nicht-virale Vektoren (z. B. kationische Polymere und Vesikel). Es sind jedoch mit jedem dieser Vektoren Nachteile verbunden, beispielsweise mögliche Nebenwirkungen nach einer Integration von Retroviren in das Zellgenom, Stimulierung von Immunreaktionen gegen virale Proteine, wodurch eine Langzeitbehandlung ausgeschlossen wird (Kay et al., 1994), und vorübergehende oder wenig effiziente. Transfektion durch nicht-virale Vektoren (Legendre und Szoka, 1995). Nichtsdestoweniger macht die relative Einfachheit der DNA-Inkorporation in nicht-virale Vektoren, oft unabhängig von der DNA-Größe und -Struktur, und deren nicht-pathogene Natur diese Vektoren zu einer attraktiven Alternative. In der Tat wurden nun Konstrukte (Komplexe von vorgebildeten kationischen Vesikeln und Plasmid-DNA) entwickelt, welche hohe Transfektionsindices in vitro (Felgner, 1991) und eine niedrige bis mäßige Transfektion bei Versuchstieren (Alton et al., 1993; Zhu et al., 1993) zeigen. Andererseits könnte aufgrund der potentiellen Toxizität (Raz et al., 1994) solcher Komplexe und des Unvermögens, andere Agenzien zu inkorporieren, welche die DNA-Transfer-Effizienz fördern könnten, deren Brauchbarkeit in vivo nicht so vielversprechend sein wie wenn Nukleinsäuren in konventionelle Liposomen inkorporiert werden. Diese bleiben bei geeigneter Gestaltung (hinsichtlich Vesikelgröße, Oberflächenladung und Lipidzusammensetzung) im Blutkreislauf stabil (Scherphofet al., 1983; Gregoriadis, 1995) und schützen somit ihren Nukleinsäureinhalt vor Nukleasen im Blutplasma oder erzielen Clearance-Raten, die für eine optimale Anwendung geeignet sind (Gregoriadis, 1995). Darüber hinaus würde das Pfropfen von zellspezifischen Liganden auf die Oberfläche von lange zirkulierenden Liposomen Nukleinsäuren bevorzugt zu Zielzellen dirigieren (Gregoriadis, 1995). Die Inkorporation anderer Agenzien in Nukleinsäure-enthaltende Liposomen kann sie auch fusogen machen, den Austritt ihres Inhalts aus den Endosomen in das Zytoplasma erleichtern oder den DNA-Transport in den Nukleus fördern (Legendre und Szoka, 1995). Jedoch sind die meisten Techniken (Gregoriadis, 1993) für den Einschluss von DNA in Liposomen ineffizient, mit deren Größe inkompatibel oder verwenden Bedingungen (z. B. Beschallung, organische Detergenzien und Lösungsmittel), welche für die Integrität der DNA schädlich sein können.
WO-A-9117424 (Vical, Inc.) beschreibt verschiedene Komplexe von positiv und negativ geladenen Lipid-Spezies und eine aktive Verbindung mit verbessertem intrazellulärem Transport. Es wird vorgeschlagen, dass niedrige Einschlussraten von Polynukleotid in kationische Liposomen durch ein Verfahren behoben werden können, worin ein Komplex mit einer positiven Nettoladung aus vorgebildeten positiv geladenen Liposomen und Polynukleotiden (welche negativ geladen sind) anschließend mit einem Überschuß von vorgebildeten negativ geladenen Liposomen assoziiert wird, von denen angegeben wird, dass sie den positiv geladenen Komplex umhüllen. Nachdem jedoch das Polynukleotid nicht innerhalb irgendeines Vesikels eingeschlossen ist, wird angenommen, dass es für Nukleasen im Plasma zugänglich sein wird.
In US-A-4,897,355 beschreiben Eppstein et al. (Syntex) aus kationischem Lipid gebildete Liposomen zur Verwendung bei dem intrazellulären Transport von aktiven Verbindungen. Ein Beispiel einer aktiven Verbindung ist ein Polynukleotid, beispielsweise kodierend für Enzyme zur Verwendung bei Enzymmangelzuständen, Hormone zur Verwendung bei der Hormonersatztherapie, Blutgerinnungsfaktoren, Neurotransmitter, antivirale Verbindungen und Antitumorverbindungen oder für den Transport von Antisense-RNA zur selektiven Abschaltung der Expression bestimmter Proteine. Die aktiven Verbindungen werden mit vorgebildeten leeren Liposomen gemischt und gegebenenfalls wird das Konjugat anschließend mit weiteren vorgebildeten Liposomen gemischt.
Im Journal of Drug Targeting, 1996, beschrieben Gregoriades et al. die Bildung von Liposomen mit eingeschlossener DNA zur Verwendung in der Gentherapie, welche unter Anwendung einer Dehydratations-Rehydratations-Technik hergestellt wurden.
Auf der Konferenz "Targeting of Drugs: Strategies for Oligonucleotide and Gene Delivery in Therapy", 1995, und in den folgenden Berichten dieser Konferenz, Hrsg.: G. Gregoriadis und B. McCormack (veröffentlicht 1996, Plenum Press, New York), erörtert Davis unerwünschte Immunreaktionen gegen Produkte von Genen, welche für gentherapeutische Verfahren in Zellen eingeführt wurden. Sie weist darauf hin, daß die Untersuchung der Immunreaktion, welche nach intrazellulärer Einführung von Genen induziert wird, zur Optimierung von gentherapeutischen Behandlungen sowie von DNA-Impfanwendungen (DNA-basierte Immunisierung) des Gentransfers von Bedeutung ist. Sie beschreibt viele Vorteile von Genvakzinen gegenüber Vakzinen auf Antigen-Basis und beschreibt einige Ergebnisse der Verwendung von nackter DNA für eine auf DNA basierende Immunisierung gegen das Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg).
Auf derselben Konferenz beschrieb Behr synthetische Träger für Polynukleotidsequenzen für die Gentherapie, bestehend aus Lipopolyaminen, von denen behauptet wird, dass sie sich selbst um DNA herum zusammenfügen, während diese kondensiert wird. Das Polynukleotid soll den Zellkern erreichen. Der Erfinder der vorliegenden Erfindung geht davon aus, dass diese von selbst zusammengefügten Partikel nicht aus einer Doppelschicht aufgebaut sind und somit nicht als Liposomen definiert würden.
Die Information vor der Konferenz bezüglich der zweiten jährlichen IPC- Konferenz "Genetic Vaccines and Immunotherapeutic Strategies", welche am 23. und 24. Oktober 1996 in Washington, D.C., USA, stattfand, wies darauf hin, dass Felgner jüngere Arbeiten beschreiben würde, bei denen kationisches Lipid eingesetzt wurde, um den Transport von Genen, die für Antigene kodieren, zu verbessern. Die Gene werden intranasal und in das Lungengewebe abgegeben, um die Immunität der Schleimhaut zu stimulieren. Auf derselben Konferenz wurde versichert, dass Ledley Gentransport-Systeme beschreiben würde, welche kationische Lipide umfassten, um die Bioverfügbarkeit und den Eintritt von DNA in Schleimhautzellen zu steuern. Das Ziel besteht darin, eine effektive Immunreaktion zu veranlassen. Das Ankündigung vor der Konferenz gibt keine weiteren Informationen wie der Gentransport durchgeführt wurde.
In EP-A-0475178 werden aus Lipiden, einschließlich kationisch geladenen Lipiden, gebildete Liposomen dazu verwendet, Zusammensetzungen auf Liposomen- Basis zu bilden, die Gene enthalten. Die Patentbeschreibung beschreibt kein Verfahren, welches die Dehydratisierung einer Liposomen-Zusammensetzung, gefolgt von Rehydratisierung, umfasst.
In dem Abstract von JP-A-01-047381 wird in einem späten Stadium eines Verfahrens zur Bildung eines Liposoms, das ein Gen einschließt, ein mehrwertiger Alkohol eingeschlossen. Ein Verfahren, bei dem eine wässrige Suspension von Gen und Liposomen dehydratisiert und dann rehydratisiert wird, wird nicht offenbart. Die Art des Gens wird nicht spezifiziert.
In dem Abstract von JP-A-02-135092 werden kationische Lipide dazu verwendet, um Liposomen-Zusammensetzungen zu bilden, die Gene einschließen. Die Art des Gens wird nicht spezifiziert. Ein Verfahren, bei dem eine wässrige Suspension, umfassend Nukleinsäure-Liposomen, dehydratisiert und dann rehydratisiert wird, ist nicht speziell offenbart.
In WO-A-95/04524 werden Liposomen-Zusammensetzungen offenbart, die hohe Beladungsniveaus polymerer Substanzen, z. B. Polynukleotide, enthalten. Es gibt keine Offenbarung von Liposomen-bildenden Zusammensetzungen, welche kationischer Natur sind, noch bezüglich einer Nukleinsäure, die für ein immunogenes Polypeptid kodiert.
In WO-A-95/13796 werden Liposomen-Zusammensetzungen offenbart, welche ein die Freisetzungsrate modifizierendes Agens umfassen. Der aktive Bestandteil kann aus einer langen Liste möglicher Substanzen, einschließlich Nukleinsäuren, ausgewählt werden. Es gibt keine Offenbarung von Nukleinsäuren, die für immunogene Polypeptide kodieren. Die Lipide sollten eine negative Nettoladung aufweisen.
Es wäre wünschenswert, die Einschlussrate von Polynukleotiden in liposomale Transportsysteme zu erhöhen. Ferner wäre es wünschenswert, das Niveau des Genprodukts im Kreislauf von Lebewesen, denen die Gene verabreicht wurden, zu erhöhen, insbesondere für therapeutische Produkte. Es ist darüber hinaus wünschenswert, die Transportrate des Gens zu Zielzellen zu erhöhen, wenn das Genprodukt ein Antigen ist. Es wäre ferner wünschenswert, für einen verbesserten Transport von Polynukleotiden zu sorgen, welche für immunogene Polypeptide kodieren, die zur Induktion einer gewünschten Immunreaktion geeignet sind.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine neue Zusammensetzung bereit, umfassend Liposomen, die aus Liposomen-bildenden Komponenten gebildet sind, und, in dem intravesikulären Raum der Liposomen eingeschlossen, ein Polynukleotid, das funktionsfähig für ein immunogenes Polypeptid kodiert, das zur Induktion einer gewünschten Immunreaktion bei einem menschlichen oder tierischen Individuum geeignet ist, wobei die Liposomen durch ein Dehydratations- Rehydratations-Verfahren gebildet wurden, bei dem eine wässrige Suspension von Polynukleotid und vorgebildeten Liposomen dehydratisiert wird und dann rehydratisiert, um Dehydratations-Rehydratations-Vesikel zu bilden, in deren Innenraum das Polynukleotid eingeschlossen ist.
In dieser Patentbeschreibung bedeutet der Begriff eingeschlossen, dass das Polynukleotid sich im intravesikulären Raum befindet. Somit wurden die Liposomen in Gegenwart des Polynukleotids gebildet. Dies steht im Gegensatz zu Komplexen des Standes der Technik aus vorgebildeten Liposomen und Polynukleotiden.
Bei diesem Aspekt der Erfindung sollte das Genprodukt ein Antigen sein, gegen das eine Immunreaktion erwünscht ist. Das Peptid umfasst somit eine oder mehrere antigene Determinante(n) von infektiösen Mikroorganismen, wie z. B. Viren, Bakterien oder Pilzen. Das Verfahren ist von besonderem Nutzen bei der Immunisierung gegen Bakterien, Pilze und Viren, insbesondere Influenza, HIV, Hepatitis B und Hepatitis C. Das Genprodukt kann deshalb HBsAg oder Hepatitis-C- Kernprotein oder ein Influenza-Antigen oder ein antigenes HIV-Peptid oder -Fragment sein. Die Erfindung ist auch von Wert, wenn das Genprodukt ein oder mehrere Herpes-Simplex-Virusprotein(e), ein Produkt eines Tumorvirus, z. B. SV40, oder ein Tumor-Antigen, Tuberkulose-Antigene und sogar Antigene von komplexeren Mikroorganismen, z. B. Parasiten wie Malaria, darstellt.
Bei dieser Erfindung kann das Zielgewebe für die Liposomenaufnahme Muskel-, Haut-, Leber-, Milz-Krebszellen, die zerstört werden sollen, Schleimhautzellen, wie z. B. in der Nase oder den Lungen oder dem Darm, und insbesondere Zellen der Lymphknoten sein. Die Zielzellen für Genvakzine sind im allgemeinen Antigen-präsentierende Zellen. Die Zusammensetzung kann systemisch verabreicht werden, beispielsweise durch i.v. Injektion, oder kann direkt dem Zielgewebe verabreicht werden, beispielsweise intranasal, intramuskulär oder intradermal, oder sogar transdermal oder oral. Die vorliegende Erfindung erlaubte zum ersten Mal die erfolgreiche Auslösung einer Immunreaktion, wenn die Liposomen subkutan verabreicht werden. Es ist deshalb ein bevorzugter Aspekt dieser Erfindung, dass die Zusammensetzung subkutan verabreicht wird.
In der vorliegende Patentbeschreibung bezieht sich der Begriff "Liposom" auf Vesikel, die von einer Doppelschicht Umgeben sind, gebildet aus Komponenten, die gewöhnlich Lipide einschließen, gegebenenfalls in Kombination mit Nicht-Lipid- Komponenten.
Es kann wünschenswert sein, die äußere Oberfläche des Liposoms mit einer zielsuchenden Gruppierung zu versehen, z. B. einem Antikörper, der zur Erkennung von Zielgewebe geeignet ist. Wird beispielsweise die Zusammensetzung in den Kreislauf verabreicht, würden zellspezifische Liganden, die mit der äußeren Oberfläche des Liposoms verknüpft sind, die Nukleinsäuren zu den Zielzellen dirigieren (Gregoriadis, 1995).
Das Gen sollte in einer solchen Form vorliegen, dass das gewünschte Produkt in der Zielzelle produziert werden kann, und schließt somit vorzugsweise regulatorische Elemente ein, welche die Expression in den Zielzellen erleichtern. Das Polynukleotid umfasst somit einen Promotor sowie Bereiche zur Vermittlung der Ribosomenbindung und gegebenenfalls auch andere Bereiche, welche die Genexpression erhöhen könnten.
Das Polynukleotid kann RNA sein, ist jedoch vorzugsweise DNA. Es liegt gewöhnlich in der Form eines Plasmids vor, vorzugsweise eines im wesentlichen nicht-replizierenden Plasmids, da für diesen Aspekt der Erfindung eine vorübergehende Aktivität über einen Zeitraum von Wochen oder wenigen Monaten im allgemeinen geeignet ist.
Bei diesem Aspekt der Erfindung können die Liposomen-bildenden Komponenten, die zur Bildung der Liposomen verwendet werden, neutrale, zwitterionische, anionische und/oder kationische Lipid-Gruppierungen einschließen. Sie können in solchen relativen Mengen eingesetzt werden, daß dem Liposom eine Gesamtladung verliehen wird, oder, weniger bevorzugt, können die Liposomen keine Gesamtladung haben. Es wird festgestellt, dass ein solcher Einsatz von Lipid- Komponenten, dass das Liposom eine positive Gesamtladung aufweist, in Hinblick auf die Auslösung einer erhöhten Immunreaktion bei der Verwendung zum Transport eines Antigen-kodierenden Gens bessere Ergebnisse bei diesem Aspekt der Erfindung liefern kann. Zusätzlich zu Komponenten, welche korrekt Lipide genannt werden (einschließlich Glyceride und Cholesterin), können die Liposomen-bildenden Komponenten Nicht-Lipid-Komponenten einschließen (d. h., welche keine natürlich vorkommenden Lipide sind), wie z. B. nicht-ionische oder kationische Tenside.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die neue Zusammensetzung Liposomen, die aus Liposomen-bildenden Komponenten gebildet sind, welche mindestens eine kationisch geladene Komponente in einer solchen Menge einschließen, dass die Liposomen eine positive Gesamtladung aufweisen.
Es wird angenommen, dass dies das erste Mal ist, dass ein Polynukleotid in den intravesikulären Raum eines kationischen Liposoms eingeschlossen wurde. Dementsprechend werden in einem zweiten Aspekt dieser Erfindung Liposomen bereitgestellt, gebildet aus Liposomen-bildenden Komponenten, welche mindestens eine kationisch geladene Komponente in einer solchen Menge einschließen, daß die Liposomen-bildenden Komponenten eine positive Gesamtladung aufweisen, und Polynukleotid, kodierend für ein gewünschtes Polypeptidprodukt, und dieser ist dadurch gekennzeichnet, dass das Polynukleotid innerhalb des intravesikulären Raums der Liposomen durch ein Verfahren eingeschlossen wird, bei dem leere Liposomen aus den Liposomen-bildenden Komponenten gebildet werden, die leeren Liposomen mit Polynukleotid gemischt und dann dehydratisiert werden und dann die dehydratisierte Mischung in wässriger Zusammensetzung rehydratisiert wird, um Dehydratations-Rehydrations-Vesikel zu bilden.
So hat der Erfinder der vorliegenden Erfinder festgestellt, dass in einem in vitro-System der Einschluß von DNA, die für Luciferase-Markerprotein kodiert, erhöhte Niveaus von Luciferase-Expression im Vergleich zu anderen Verfahren unter Verwendung von ungeladenen Liposomen oder anionisch geladenen Liposomen ergibt. Obwohl die Expressionsniveaus niedriger waren als bei Verwendung eines Komplexes vorgebildeter kationisch geladener Liposomen (das im Handel erhältliche LipofectAMINE (Handelsmarke)), steht zu erwarten, dass durch den Einschluss im Vergleich zum Komplex eine Verbesserung der Beständigkeit gegenüber einem Nukleaseangriff in vivo gezeigt werden würde. Darüber hinaus wird festgestellt, dass die Liposomen nicht schnell aggregieren, wohingegen eine solche Aggregation für gemischte vorgebildete-Liposomen-Polynukleotid-Systeme insbesondere in Gegenwart von Serumproteinen stattfinden kann. Der Einschluss von Polynukleotid bietet eine größere Freiheit zur Bereitstellung von zielsuchenden Liganden auf der Liposomenoberfläche oder zur Durchführung anderer Oberflächenbehandlungen auf den Liposomen mit eingeschlossenen Wirkstoffen. Es steht zu erwarten, dass das hohe Expressionsniveau des Modellproteins Luciferase gezeigt werden würde, falls das Genprodukt ein Antigen war, das eine gewünschte Immunreaktion induziert.
Dies wurde durch Experimente bestätigt, welche gezeigt haben, dass die Impfung von Mäusen mit in Liposomen eingeschlossenem pRc/CMV-HBS (kodierend für die S-Region des Hepatitis B-Oberflächenantigens; Subtyp ayw) auf einer Vielfalt von Routen zu humoralen und zellvermittelten Immunreaktionen führt, welche davon, ob die Mäuse das Ergebnis von Inzucht (Balb/c) oder einer Zucht nicht verwandter Tiere (T/o) sind, und von der Injektionsroute (intramuskulär, i.m.; subkutan, s.c.; intravenös, i.v.; und intraperitoneal, i.p.) unabhängig sind. Solche Reaktionen sind in den meisten Fällen signifikant größer als diejenigen, die mit nackter DNA unter identischen Bedingungen beobachtet werden (siehe Beispiel 5 unten).
Bei dieser Ausführungsform der Erfindung kann die in das Liposom inkorporierte kationische Komponente irgendeine von denjenigen sein, welche in Liposomen-Präparationen zur Verbesserung der Transfektionsrate durch Komplexierung mit Polynukleotiden eingesetzt wurden. Die Komponente kann eine Lipid- oder Nicht- Lipid-Komponente sein und kann synthetisch oder natürlich sein. Bevorzugte kationische Lipide sind 1,2-Bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonium)propan (DOTAP), 1,2- Bis(hexadecyloxy)-3-trimethylaminopropan (BisHOP), N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]- N,N,N-triethylammoniumchlorid (DOTMA) und andere Lipide der in US-A-4,897,355 definierten Struktur I oder die Ester-Analoga. Die Struktur ist wie folgt:
oder ein optisches Isomer davon, worin Y¹ und Y² gleich oder verschieden sind und jeweils -O- oder O-C(O)- sind, worin der Carbonylkohlenstoff je nachdem mit R¹ oder R² verknüpft ist, R¹ und R² unabhängig eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 6 bis 24 Kohlenstoffatomen sind, R³, R&sup4; und R&sup5; unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Aryl oder Aralkyl mit 6 bis 11 Kohlenstoffatomen sind; alternativ zwei oder drei von R³, R&sup4; und R&sup5; mit dem positiv geladenen Stickstoffatom kombiniert sind, um eine cyclische Struktur mit 5 bis 8 Atomen zu bilden, wobei neben dem positiv geladenen Stickstoffatom die Atome in der Struktur Kohlenstoffatome sind und ein Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatom einschließen können, n 1 bis 8 ist, und X ein Anion ist.
Bevorzugte Ausführungsformen sind Zusammensetzungen, worin R¹ und R² unabhängig 0 bis 6 ungesättigte Stellen aufweisen und die Struktur
CH&sub3;-(CH&sub2;)-(CH=CH-CH&sub2;)b-(CH&sub2;)c-
aufweisen, worin die Summe von a und c 1 bis 23 beträgt und b 0 bis 6 ist. Am meisten bevorzugt ist jedes von R¹ und R² Oleyl. Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind Zusammensetzungen, worin die langkettigen Alkylketten Fettsäuren sind, d. h., worin Y¹ und Y² gleich und -O-C(O)- sind.
Aternativen sind kationische Lipide der allgemeinen Struktur I oder der allgemeinen Struktur II, definiert in US-A-5,459,127.
Andere geeignete kationische Verbindungen sind die Nicht-Lipid-Komponenten Stearylamin und 3-β-[N-(N'N'-Dimethylaminoethan)carbamyl]cholesterin (DC- Chol)(eine Lipid-Komponente).
Die Liposomen umfassen im allgemeinen neben den kationischen Komponenten auch nicht-ionische und/oder zwitterionische Komponenten, welche Lipide einschließen, die Phospholipide sein können oder andere Lipide, die keine Phosphorylgruppen einschließen. Vorzugsweise schließen die Lipide Phospholipide ein, z. B. natürliche oder synthetische Phosphatidylcholine, Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylserine, wobei die langkettigen Alkylgruppen (welche über Ester- oder Ether-Verknüpfungen verbunden sein können) in irgendwelchen davon gesättigt oder ungesättigt sein können. Vorzugsweise sind die Acylgruppen von Glycerid- Lipiden ungesättigt. Die Komponenten können Nicht-Lipid-Komponenten umfassen, beispielsweise nicht-ionische Tenside wie Sorbitanmonoester von Fettsäuren und/oder ethoxylierte Fettsäuren oder andere Analoga, wie z. B. ethoxylierte Lanoline.
Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Liposomen fusogene Lipide einschließen, welche gewöhnlich Phosphatidylethanolamine sind, in denen die Acylgruppen ungesättigt sind. Cholesterin kann eingeschlossen sein, obwohl es scheint, dass es die Liposomen zu stabil für eine adäquate Abgabe von Polynukleotid an Zielzellen macht.
Die Menge an kationischer Komponente liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 50% der gesamten Mole an Liposomen-bildenden Komponenten, vorzugsweise im Bereich von 10 bis 25 Mol-%.
Die Liposomen-Zusammensetzung liegt gewöhnlich in Form einer wässrigen Suspension, beispielsweise in einem physiologischen Puffer, vor. Alternativ könnte sie eine getrocknete Zusammensetzung zur Rehydratation sein.
Die Produkt-Liposomen können multilamellare oder unilamellare Vesikel sein und können relativ groß sein (Vesikeldurchmesser im Bereich von 300 nm bis 2.000 nm, vorzugsweise mit mittleren Durchmessern im Bereich von 500-1.000 nm) oder klein (Vesikeldurchmesser im Bereich von 100 nm bis 400 nm, vorzugsweise mit mittleren Durchmessern im Bereich von 200 bis 300 nm). Vorzugsweise haben die Liposomen einen mittleren Durchmesser, der 500 nm nicht übersteigt, und vorzugsweise haben im wesentlichen alle Durchmesser von weniger als 2.000 nm.
Die Liposomen werden durch ein Verfahren gebildet, bei dem die Vesikel gebildet, mit dem einzuschließenden Nukleotid gemischt und dann dehydratisiert werden, vorzugsweise durch Gefriertrocknung, und anschließend in wässriger Zusammensetzung rehydratisiert werden, um Dehydratations-Rehydratations-Vesikel herzustellen, und vorzugsweise anschließend einer Mikrofluidisierung unterworfen werden, um die mittlere Größe zu verringern. Vorzugsweise wird das nicht- eingeschlossene Material nach den Rehydratations- und/oder Mikrofluidisierungsschritten durch Zentrifugation oder Molekularsiebohromatographie von den Liposomen abgetrennt.
Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat festgestellt, dass die Verwendung von DRV's erhöhte Einschlussniveaus für Polynukleotide ergeben kann. Gemäß einem ersten Verfahrensaspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Einschluss von Polynukleotid in Liposomen bereitgestellt, welches die Schritte beinhaltet:
1. Bilden einer wässrigen Suspension, die nacktes Polynukleotid, welches funktionsfähig für ein immunogenes Polypeptid kodiert, das zur Induktion einer gewünschten Immunreaktion beim menschlichen oder tierischen Individuum geeignet ist, und vorgebildete Liposomen umfasst,
2. Gefriertrocknen der Suspension,
3. Rehydratisieren des Produkts von Schritt 2,
4. Unterwerfen der wässrigen Suspension von Dehydratations-Rehydratations- Vesikeln von Schritt 3 einer Mikrofluidisierung, und
5. gegebenenfalls Abtrennen von nicht-eingeschlossenem Polynukleotid von den Liposomen.
Gemäß einem zweiten Verfahrensaspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Einschluss von Polynukleotid in Liposomen bereitgestellt, welches die Schritte beinhaltet:
1. Bilden einer wässrigen Suspension, die das nackte Polynukleotid und vorgebildete kationische Liposomen umfasst,
2. Gefriertrocknen der Suspension,
3. Rehydratisieren des Produkts von Schritt 2,
4. gegebenenfalls Unterwerfen der wässrigen Suspenion von DRV's von Schritt 3 einer Mikrofluidisierung, und
5. Abtrennen von nicht- eingeschlossenem Polynukleotid von den Liposomen.
Die Dehydratation-Rehydratation beider Verfahrensaspekte der Erfindung ist im wesentlichen wie von Kirby und Gregoriadis, 1984, beschrieben. Somit sind die Liposome in Schritt 1 kleine unilamellare Liposomen (SUV) und die in Schritt 3 hergestellten sind vorzugsweise multilamellare Liposomen (MLV). Die Produkt-Liposomen von Schritt 3 werden im allgemeinen Dehydratations-Rehydratations-Vesikel (DRV) genannt. Die Mikrofluidisierung der DRV wird im wesentlichen wie in WO-A- 92/04009 und von Gregoriadis et al., 1990, beschrieben durchgeführt.
Durch Einsatz der DRV-Technik hat der Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass eine Gesamteinschlussausbeute an gelöstem Material von mehr als 10% erzielt werden kann. Der Erfinder hat festgestellt, dass bis zu 90% oder sogar mehr des in der wässrigen Suspension, die dem Gefriertrocknungsschritt unterworfen wird, vorhandenen Polynukleotids in die Liposomen eingeschlossen werden kann. Darüber hinaus erlaubt die Mikrofluidisierung, obwohl sie zu einer Verringerung des Prozentsatzes an inkorporiertem Polynukleotid führt, nichtsdestoweniger die Erzielung von Einschlussraten für das Polynukleotid von mehr als 10%, beispielsweise bis zu 50%. Das Niveau des Polynukleotid-Einschlusses in der Liposomen-Zusammensetzung Liegt vorzugsweise im Bereich von 0,05 bis 5, vorzugsweise 0,1 bis 1,0, bevorzugter 0,2 bis 0,5 ug/uMol Liposomen-bildender Komponenten (oder im Bereich von 0,1 bis 20, vorzugsweise bis 10 ug DNA pro mg Liposomen-bildender Komponenten).
Dieser Aspekt der Erfindung wird vorzugsweise dazu genutzt, die Liposomen- Präparationen der ersten beiden Aspekte herzustellen.
In den zweiten Produkt- und zweiten Verfahrensaspekten der Erfindung kann, obwohl das Polynukleotid vorzugsweise eines ist, welches funktionsfähig für ein immunogenes Polypeptid kodiert, das zur Induktion einer gewünschten Immunreaktion bei einem Individuum geeignet ist, das Polynukleotid auch geeignet sein zum Transport von Genen für andere Anwendungen, wie z. B. bei der Genersatztherapie, Genvermehrungstherapie, Genimmuntherapie (beispielsweise bei der Krebsbehandlung), Einführung von Genen, die für therapeutisch aktive Polypeptide kodieren, und Einführung von Genen, die für Zelltoxine kodieren (d. h., Verbindungen, welche für Zellen toxisch sind, beispielsweise zur Abtötung von Tumorzellen).
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung der neuen Liposomen oder der mit den neuen Verfahren der Erfindung hergestellten Liposomen zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren der Therapie oder Prophylaxe. Beispielsweise kann das Verfahren die Immunisierung (Impfung) eines menschlichen oder tierischen Individuums sein, um es gegen Infektion durch infektiöse Mikroorganismen zu schützen. Alternativ kann durch das Genprodukt eine Immunreaktion hervorgerufen werden, welche für die Immuntherapie von Nutzen ist, beispielsweise zur Behandlung von Krebs. Alternativ kann das Polynukleotid bei einer Genvermehrungs- oder -ersatztherapie von Nutzen sein.
In der vorliegenden Erfindung wird auch eine neue in vitro-Verwendung einer neuen Zusammensetzung gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt oder des Produkts der Verfahrensaspekte der Erfindung bei der Transfektion von menschlichen oder tierischen Zellen bereitgestellt. Die Zellen können anschließend in vitro kultiviert werden und/oder können anschließend dem Patienten implantiert werden, dem sie entnommen wurden. Somit können die transfizierten Zellen bei einem ex vivo-Transplantationsverfahren, beispielsweise des in WO-A-93/14778 beschriebenen Typs, eingesetzt werden.
Es wird auch eine neue pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die eine Liposomen-Zusammensetzung gemäß dem ersten Aspekt oder das Produkt des zweiten Aspekts der Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger einschließt. Die Zusammensetzung kann zur Verabreichung mittels Injektion, beispielsweise intravenös (i.v.), intramuskulär (i.m.), interperitoneal (i.p.), oral oder subkutan (s.c.) geeignet sein. Alternativ ist die Zusammensetzung geeignet zur intranasalen Verabreichung oder zur direkten Abgabe an die Lunge durch Inhalation oder zur transthermalen Verabreichung. Herkömmliche pharmazeutische Träger, die für die liposomale Verabreichung eingesetzt werden, können verwendet werden. Der Erfinder hat festgestellt, dass die Erfindung die Injektion der cDNA unter Anwendung von intramuskulären Techniken erlaubt, wohingegen, wenn nackte DNA in der Vergangenheit als Vakzin eingesetzt wurde, festgestellt wurde, dass spezielle hochkontrollierte Injektionsprotokolle befolgt werden müssen, um jegliche Schädigung des Muskels zu vermeiden und die Injektion in exakt derselben Position durchzuführen, um in der Lage zu sein, verlässliche vergleichbare Ergebnisse zu liefern. Beispielsweise wurde festgestellt, dass zur Verbesserung der Reaktion vorher muskelregenerierende Mittel verabreicht werden müssen.
In der vorliegenden Erfindung wird auch bereitgestellt die Verwendung der Liposomen zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Verwendung in einem Behandlungsverfahren, bei dem die neue pharmazeutische Zusammensetzung einem menschlichen oder tierischen Individuum verabreicht wird. Das Verfahren kann somit ein Verfahren zur Induktion einer Immunreaktion auf ein Antigen sein, das von dem Polynukleotid kodiert wird, welches beispielsweise ein Antigen eines infektiösen mikrobiellen Agens ist. Alternativ kann für die Anwendung des Produktaspekts das Verfahren für die Genersatz- oder Genvermehrungstherapie, für die Immuntherapie, beispielsweise für die Krebsbehandlung oder für die Verabreichung eines Polynukleotids, das für ein pharmakologisch nützliches Polypeptid kodiert, bestimmt sein.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen erläutert. In einigen der Beispiele wird DNA, die für Luciferase kodiert, als Modell-Polynukleotid eingesetzt, wobei Luciferase ein Modell-Genprodukt ist.
Die Zeichnungen repräsentieren die Ergebnisse einiger der Beispiele wie folgt:
Fig. 1 ist eine Reihe von Balkendiagrammen, welche die in Beispiel 2, Tabelle 4, angegebenen Ergebnisse zeigt.
Fig. 2 ist eine Reihe von Balkendiagrammen, welche die Ergebnisse von Beispiel 3 zeigt.
Fig. 3 ist eine Reihe von Balkendiagrammen, welche die Ergebnisse von Beispiel 4 zeigt.
Fig. 4 bis 8 sind eine Reihe von Balkendiagrammen, welche die Ergebnisse von Beispiel 5 zeigen.

BEISPIEL 1 - Einschluß und Komplexierung von für Luciferase kodierender DNA und in vitro-Transfektion von Zellen

Materialien

Die Quellen und Reinheitsgrade von Ei-Phosphatidylcholin (PC), Stearylamin (SA) und 1,2-Bis(hexadecyloxy)-3-trimethylaminopropan (BisHOP) wurden an anderer Stelle (Tan und Gregoriadis, 1989) beschrieben. N[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]- N,N,N-trimethylammonium (DOTMA) war eine Gabe von GeneMedicine (Houston, Texas, USA). Phosphatidylserin (PS) und Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) stammten von Sigma Chemical Co. (Poole, Dorset, VK). Der eukaryotische Expressionsvektor pGL2-Kontrolle (~3,99 · 10&sup6; Dalton), welcher das Luciferase-Reportergen von einem SV40-Promotor exprimiert, wurde von Promega (Southampton, VK) bezogen. Das kationische LipofectAMINE, erhalten von Gibco BRL (Paisly, VK) wurde mit pGL2 in serumreduziertem OptiMEM 1-Medium, enthaltend GLUTAMAX 1, (Gibco BRL) in einem Verhältnis von 15 : 1 (Gew.: st.) vor der Verwendung komplexiert. Desoxyribonuklease (Rinderpankreas Typ II, spezifische Aktivität: 2.500 Kunitz-Einheiten mg&supmin;¹ Protein) stammte von Sigma Chemical Co. RQ1-Desoxyribonuklease (1 Einheit ul&supmin;¹) und der Luciferase-Assay-Systemkit wurden von Promega bezogen. Die pGL2-Plasmid-DNA wurde mit ³&sup5;S-dATP (37 kBq; ICN Flow, Thame, VK) nach dem Verfahren von Wheeler und Coutelle (1995) radioaktiv markiert. Alle anderen Reagenzien waren von analytischem Reinheitsgrad.

METHODEN

Inkorporation von Plasmid-DNA in Liposomen

Das Dehydratations-Rehydratations-Verfahren (Kirby und Gregoriadis, 1984) wurde zur Inkorporation von pGL2-Plasmid-DNA in Liposomen verwendet. In Kürze, 2 ml kleiner unilamellarer Vesikel (SUV), aufgebaut aus PC (16 uMol) und DOPE (Molverhältnis 1 : 1); PC (16 uMol), DOPE und PS (Molverhältnisse 1 : 1 : 1.0,5, negativ geladen); PC (16 uMol), DOPE und SA oder BisHOP (Molverhältnisse 1 : 1 : 0,5; positiv geladen); PC (16 uMol), DOPE und DOTMA (Molverhältnisse 1 : 1 : 0,25; positiv geladen) und DOPE (16 uMol) und DOTMA (Molverhältnis 1 : 0,25; positiv geladen) wurden wie beschrieben (Kirby und Gregoriadis, 1984) hergestellt, mit 10-100 ug (10- 100 ul) pGL2, denen ³&sup5;S-markierte Tracer-pGL2-Plasmid-DNA (6 · 10&sup4;-7 · 10&sup4; dpm) zugesetzt worden war, gemischt und über Nacht gefriergetrocknet. Nach einer kontrollierten (Kirby und Gregoriadis, 1984) Rehydratation und der Bildung von multilamellaren (Gregoriadis et al., 1993) Dehydratations-Rehydratations-Vesikeln (DRV) wurden diese 25 Min. lang bei 40.000 · g zentrifugiert, um nicht-inkorporierte DNA zu entfernen. Die liposomalen Pellets wurden in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, ergänzt mit 0,9% NaCl, pH 7,2, (PBS) suspendiert und erneut zentrifugiert. Die gewaschenen Pellets wurden in PBS resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei 4ºC gelagert. In separaten Experimenten wurden DNA- inkorporierende DRV wie oben in Mischung mit freier, nicht-inkorporierter DNA (d. h., vor der Zentrifugation) in einem Mikrofluidizer M110S (Microfluidics, Newton, MA, USA) für drei Zyklen oder für 1, 2, 3, 5 und 10 Zyklen (nur PC:DOPE:DOTMA- Liposomen) mikrofluidisiert. Die Abtrennung von inkorporierter DNA von freier DNA in mikrofluidisierten Liposomen erfolgte durch Zentrifugation wie oben (1, 2, 3 und 5 Zyklen) oder Molekularsiebohromatographie (10 Zyklen) unter Verwendung einer Sepharose 4B-CL-Säule (Pharmacia) (Gregoriadis et al., 1990). In einigen Experimenten wurden vorgebildete (DNA-freie) DRV mit 10 oder 50 ug DNA gemischt und entweder 20 h lang bei 20ºC inkubiert oder drei Zyklen lang mikrofluidisiert. In beiden Fällen wurden die Liposomen wie oben zentrifugiert, um adsorbierte von nicht-adsorbierter DNA zu trennen. Die DNA-Inkorporation in Liposomen oder die Adsorption auf deren Oberfläche wurde auf Grundlage der ³&sup5;S- Radioaktivität abgeschätzt, die in den suspendierten Pellets (nicht-mikrofluidisierte DRV und DRV, die für 1, 2, 3 oder 5 Zyklen mikrofluidisiert worden warn) oder den eluierten Fraktionen nach der Chromatographie (10 Zyklen) rückgewonnen wurde.

Photokorrelationsspektroskopie

Die mittlere z-Mittel-Größe von nicht-mikrofluidisierten und mikrofluidisierten DRV wurde in einem Malvern Autosizer 11c wie an anderer Stelle beschrieben (Gregoriadis et al., 1993; Gregoriadis et al., 1990) gemessen.

Inkubation von Liposomen mit Desoxyribonuklease

Nicht-mikrofluidisierte oder mikrofluidisierte (drei Zyklen) DRV, die pGL2- Plasmid-DNA (0,75-22,5 ug) und ³&sup5;S-markierte Tracer-pGL2-Plasmid-DNA inkorporierten, in 1 ml PBS wurden mit 100 Einheiten Desoxyribonuklease I gemischt und 10 Min. lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde mit 1 ul 0,5 M EDTA (pH 8) gestoppt und die Mischungen wurden zentrifugiert, um verdaute von unverdauter liposomaler DNA zu trennen. Verdaute DNA wurde auf Grundlage der freigesetzten Radioaktivität in den Überständen abgeschätzt. Vorbereitende Arbeiten hatten einen vollständigen Abbau von 100 ug nacktem pGL2 unter identischen Bedingungen festgestellt. In anderen Experimenten wurden Proben ähnlicher Liposomen, die 2 ug DNA enthielten, mit einem Puffer, der 50 mM Dithiothreit und 50 ug/ml Rinderserumalbumin (Fraktion V; Sigma Chemical Co.) enthielt, auf 100 ul verdünnt, mit einer Einheit RQ1-Desoxyribonuklease (Promega) gemischt und 30 Min. lang bei 37ºC inkubiert. Die Verdauung wurde durch die Zugabe von 1 ul 0,5 M EDTA (pH 8,0) beendet.

Agarosegelelektrophorese

Proben von nicht-mikrofluidisierten oder mikrofluidisierten DNA-inkorporierenden DRV wurden wie oben mit oder ohne RQ1-Desoxyribonuklease inkubiert und dann zweimal mit einer Phenol/Chloroform-Mischung extrahiert, um Lipid-Material zu entfernen. DNA in der wässrigen Schicht wurde mit Ethanol präzipitiert, in 20 ul TE- Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, und 1 mM EDTA, pH 8,0) suspendiert und einer Agarosegelelektrophorese unterworfen, um die DNA-Integrität festzustellen.

Transfektionsexperimente

Affennieren-COS-7-Epithelzellen, die in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 200 mM FLUTAMAX I (Gibco BRL), enthaltend 10% fötales Kalbsserum, gehalten worden waren, wurden durch Trypsinbehandlung geerntet, in 24-Mulden- Platten (Falcon) ausgesät (5 · 10&sup4; Zellen pro Mulde) und 18 bis 24 h lang inkubiert. Mulden, die adhärente Zellen mit 70-80%iger Konfluenz enthielten, wurden mit Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung (ohne Calcium oder Magnesium), pH 7,2, (Gibco BRL) gewaschen und dann mit 1 ug (6-18 ul) in Liposomen inkorporierter pGL2-DNA oder mit LipofectAMINE (etwa 24 ug Lipid), komplexiert mit 1 ug pGL2-DNA, in einem Volumen von 0,5 ml serumreduziertem OptiMEM 1- Medium, enthaltend GLUTAMAX 1, transfiziert. Nach der Inkubation bei 37ºC für 4 bis 6 h wurde das Transfekfionsmedium entfernt und durch 1 ml DMEM-Vollmedium ersetzt. Die Zellen wurden für insgesamt 48 h inkubiert, durch Abschaben in 200 ug Reporter-Lysispuffer (Promega) (die Zelllysis wurde durch 1 Zyklus von Einfrieren- Auftauen auf Trockeneis erhöht) lysiert und dann 5 Min. lang bei 12.000 · g zentrifugiert, um klare Überstände zu erhalten. Diese wurden in Dreifachansätzen mit dem Luciferase-Assay-Systemkit unter Verwendung eines LKB 1251 Luminometers hinsichtlich Luciferase-Aktivität untersucht, wobei die gesamte Lichtemission über 60 s aufgezeichnet wurde. Die Proteinkonzentration in jedem der Lysate wurde mit dem Verfahren von Bradford (1976) unter Verwendung der Bio-Rad-Proteinassay-Lösung gemessen. Die Luciferase-Aktivität wurde als relative Lichteinheiten pro mg Protein (RLE/mg) ausgedrückt.

ERGEBNISSE

Inkorporation von Plasmid-DNA in Liposomen

Plasmid-DNA wurde in neutrale DRV (710-843 nm Durchmesser; Beispiele 1.1. (1-6)), aufgebaut aus PC und DOPE, einem Phospholipid, von dem angegeben wurde, daß es die Transfektion erleichtert (Legendre und Szoka, 1995), und in ähnliche Liposomen, ergänzt mit negativ (590-871 nm; Beispiele 1.2. (1-5)) oder positiv (647-899 nm; Beispiele 1.3. (1-6), 1.4. (1-4) und 1.5 (1-2)) geladenen Amphiphilen, inkorporiert. Es ist bekannt (Bangham et al., 1974), daß geladene Vesikel-Doppelschicht-Oberflächen zu größeren wässrigen Räumen zwischen den Doppelschichten und somit zu einem größeren Einschluss von gelöstem Material beitragen. Im Falle der negativ geladenen DNA würde eine weitere Verbesserung der Inkorporation in positiv geladenen Liposomen (kationischen DRV) als Ergebnis elektrostatischer Wechselwirkungen erwartet werden. Tabelle 1 zeigt, dass die Inkorporation von DNA für jede der eingesetzten Mengen (10-100 ug) (Beispiele 1.1. (1-6) und 1.2. (1-5)) in neutralen DRV beträchtlich war (44-55%) und in negativ geladenen DRV noch mehr (45-63%). Darüber hinaus wurde die Möglichkeit, dass der größte Teil der DNA auf der Liposomenoberfläche adsorbiert statt in den Vesikeln inkorporiert wurde, für unwahrscheinlich gehalten: die Inkubation von vorgebildeten DRV mit nackter DNA führte dazu, daß nur ein bescheidener Anteil (12 -13%) davon mit den DRV nach Zentrifugation rückgewonnen wurde (Beispiele 1.1.7 und 1.2 (6-7)). Eine Mikrofluidisierung (3 Zyklen) von ähnlichen DNA- inkorporierenden DRV in Gegen wart von nicht-inkorporierter (freier) DNA führte zu kleineren (209-329 nm Durchmesser) Vesikeln mit einem DNA-Gehalt, der im Falle von neutralen DRV beträchtlich (10-20%) und für negativ geladene Liposomen in einem geringeren Ausmaß (37-51%) verringert war (Beispiele 1.1. (1-6) und 1.2. (1- 5)). Wiederum wurde sehr wenig (6 und 10%) DNA mit Liposomen rückgewonnen, wenn vorgebildete DRV in Gegenwart von freier DNA mikrofluidisiert wurden (Beispiele 1.1.7 und 1.2. (6-7)).
Wie erwartet, war die Inkorporation von DNA in kationischen SA-, BisHOP- und DOTMA-DRV sogar noch größer (62-92%), mit Werten, die für mikrofluidisierte DRV (269-383 nm; Beispiele 1.3. (1-6), 1.4. (1-4) und 1.5. (1-2)) hoch blieben (50- 83%). Hier wurde jedoch nach Inkubation oder Mikrofluidisierung von vorgebildeten kationischen DRV (SA) mit nackter DNA bis zu 40-60% des eingesetzten Materials mit den Liposomen rückgewonnen, mutmaßlich als an die Vesikeloberfläche gebunden (Beispiele 1.3 (7-9)).

Inkubation von liposomaler DNA mit Desoxyribonuklease

Tabelle 1 offenbart, dass der größte Teil der DNA, die in neutrale (45-72%), negativ geladene (58-69%) oder kationische (68-86%) Liposomen inkorporiert wurde, durch DNase nicht abgebaut wurde. Im Gegensatz dazu war die Rückgewinnung von DNA, die an die Oberfläche von neutralen oder negativ geladenen Liposomen adsorbiert war, nach Exposition gegenüber dem Enzym niedrig (18%) (Beispiele 1.1.7 und 1.2.6). Bei DNA, die an die Oberfläche von kationischen (SA) Liposomen adsorbiert war, stand jedoch ein beträchtlicher Anteil (41-58%) der letzteren für den Abbau durch DNase nicht zur Verfügung (Beispiele 1.3. (7-8)). Dies könnte einem kondensierten DNA-Zustand zugeschrieben werden, der bekanntermaßen mit kationischen Vesikeln auftritt und gegenüber DNase resistent ist (Legendre und Szoka, 1995). In Anbetracht dieser Befunde ist das Ausmaß an DNA-Inkorporation innerhalb der kationischen Liposomen (im Gegensatz zur der an ihre Oberfläche gebundenen) am Ende der Inkorporationsprozedur schwer genau abzuschätzen.
Die Ergebnisse der Verwundbarkeit von liposomaler DNA gegenüber DNase wurden weitgehend in den Experimenten bestätigt, worin Proben von nackter oder liposomaler DNA RQ1-Desoxyribonuklease ausgesetzt und anschließend einer Agarosegelelektrophorese unterworfen wurden. Auf Grundlage der Intensität der Anfärbung und dem Auftreten von "Schmier" ist ersichtlich, dass, während nackte Plasmid-DNA vollständig verdaut wurde, die in kationischen Liposomen eingeschlossene DNA vollständig geschützt war. DNA in neutralen und negativ geladenen DRV war andererseits weniger gut geschützt, wie anhand der leichteren Banden in den DNase-verdauten Proben im Vergleich zu den unverdauten festgestellt.

Transfektion mit liposomaler pGL2-Plasmid-DNA

In Experimenten, bei denen COS-7-Zellen mit pGL2-Plasmid-DNA, inkorporiert in nicht-mikrofluidisierte DRV-Liposomen oder komplexiert mit LipofectAMINE, transfiziert wurden, wobei die letzteren als Kontrolle dienten, wurden signifikante Niveaus an Luciferase-Aktivität gegenüber dem Hintergrund mit jeder der DRV- Formulierungen beobachtet. Jedoch waren die Aktivitätsniveaus mit kationischen DRV (DOPE:DOTMA, PC:DOPE:DOTMA und PC:DOPE:SA) etwa 10-fach höher als diejenigen, welche mit neutralen (PC:DOPE) und negativ geladenen (PC:DOPE:PS) und auch den kationischen PC:DOPE:BisHOP-Liposomen erzielt wurden (Tabelle 2). Nachdem die Größe von Liposomen zur Effizienz der Transfektion in Beziehung stehen kann, wurden auch diesbezügliche Experimente mit DNA durchgeführt, die in DRV inkorporiert war, welche 1, 2, 3, 5 oder 10 Zyklen lang mikrofluidisiert wurden, um Vesikel von zunehmend kleinerer Größe zu bilden (386, 319, 262, 235 bzw. 123 nm z-Mittel-Durchmesser; nicht gezeigt). Tabelle 2 zeigt an, dass eine Mikrofluidisierung (drei Zyklen) der PC:DOPE:DOTMA-DRV deren Transfektionseffizienz um das 10-fache verbesserte. Jedoch waren Transfektionsexperimente mit PC:DOPE:DOTMA-, DOPE:DOTMA-, PC:DOPE- und PE:DOPE:PS-Liposomen, die 5 oder 10 Zyklen von Mikrofluidisierung unterworfen worden wären, nicht in der Läge, eine signifikante Luciferase-Aktivität zu zeigen (Ergebnisse nicht gezeigt), was durch das durch die Mikrofluidisierung induzierte progressive Verschmieren der DNA erklärt werden könnte.
Es scheint, dass von allen getesteten DRV-Präparationen positiv geladene SA- und DOTMA-DRV effizienter als der Rest waren, wobei die mikrofluidisierte Präparation (DOTMA) die höchsten Transfektionswerte zeigte. Jedoch war selbst diese Präparation 10-15-fach weniger effizient als die Kontrolle LipofectAMINE. TABELLE 1
BH = BisHOP TABELLE 2 Luciferase-Aktivität in transfizierten Zellen
Mf · 3 - mikrofluidisiert, 3 Zyklen

BEISPIEL 2 - Immunreaktion nach einer in vivo-Transfektion

Unter Einsatz der Materialien wie beschrieben und aus den Quellen von Beispiel 1 (und darüber hinaus von 3-β-[N-(N'N'-Dimethylaminoethan)carbamyl]- cholesterin, DC-CHOL, erhalten von Dr. C. Kirby, und DOTAP - 1,2-Dioleoyloxy-3- trimethylammoniumpropan) wurden Experimente durchgeführt, um die Immunreaktion nach einer in vivo-Transfektion festzustellen. Das Polynukleotid ist Plasmid- DNA, welche das Hepatitis B-Oberflächenantigen (S-Region, Plasmid pRc/CMV-HBS des ayw-Typs (Davis, HL, et al.)) exprimiert. Liposomen wurden in jedem Fall unter Verwendung von jeweils 16 uMol PC (12 mg) mit dem in den Tabellen angegebenen kationischen Lipid in den in den Tabellen verwendeten Verhältnissen gebildet. Plasmid-DNA wurde entweder unter Anwendung der Verfahren von Beispiel 1 in die Liposomen eingeschlossen (in der in der Tabelle angegebenen Menge) oder Komplexe von vorgebildeten kationischen Liposomen und DNA wurden hergestellt durch Zusammenmischen dieser Komponenten in wässriger Suspension (unter Anwendung von Techniken, die dem Stand der Technik von Eppstein, oben erwähnt, vergleichbar waren).
Liposomen mit eingeschlossener DNA, die Komplexe und nackte DNA wurden dann Mäusen für die in vivo-Transfektionsexperimente verabreicht. Die Präparationen wurden Balb/c-Mäusen, in Gruppen von drei oder vier, intramuskulär (Hinterbein) in einer solchen Menge injiziert, um das in Tabelle 4 angegebene DNA-Niveau zu verabreichen. Für jeden Test ist die Lipidmenge in der den Mäusen verabreichten Liposomen-Präparation etwa konstant und ein Wert im Bereich von 1-2 mg Gesamt- PC-Lipid.
Anschließend wurde den Mäusen Blut entnommen und die Seren wurden durch ELISA-Techniken getestet, um die Immunreaktion festzustellen. Bei diesen in vivo-Experimenten wird der ELISA-Test durchgeführt wie von Davis et al. (1987) beschrieben unter Verwendung des S-Region-Antigens von Hepatitis B des ayw- Typs. Tests wurden angewandt, um Anti-HBSAg (S-Region, ayw-Typ) - IgG&sub1;, -IgG2a und -IgG2b zu bestimmen. Die erhaltenen Immunreaktionen werden ausgedrückt als log&sub1;&sub0; (Mittelwert + oder - Standardabweichung) der erforderlichen Serumverdünnungen, um eine Extinktionsablesung (in dem Meerrettichperoxidase-ELISA-Test) von etwa 0,200 zu ergeben.
Bei den Experimenten, deren Ergebnisse in Tabelle 4 angegeben sind, erhielten die Mäuse an den Tagen 0, 10, 20, 27 und 37 Injektionen und an den Tagen 26, 34 und 44 wurde ihnen Blut entnommen. Bei den in Tabelle 5 angegebenen Ergebnissen erhielten die Mäuse an den Tagen 0, 7, 14, 21 und 28 Injektionen und an den Tagen 21 und 28 würde ihnen Blut entnommen. ERGEBNISSE UND SCHLUSSFOLGERUNGEN TABELLE 3 Einschluss von Plasmid-DNA (in Liposomen) TABELLE 4 Immunreaktion* (ELISA-Ergebnisse ± SA) von Mäusen, die mit freier oder in Liposomen eingeschlossener DNA immunisiert wurden
NB bedeutet "nicht bestimmt"
* log 10 der erforderlichen Verdünnungen, um eine Ablesung von etwa 0,200 in dem ELISA-Test zu ergeben.
Siehe auch Fig. 1, worin A die Ergebnisse der Liposomen, die DOTAP einschließen, B die Ergebnisse von Liposomen, die DC-Chol einschließen, C die Ergebnisse von Liposomen, die Stearylamin in derselben Menge einschließen (in der Tabelle nicht gezeigt), und D nackte DNA darstellt, jeweils für den Fall, daß 5 ug DNA verabreicht werden. Weiße Balken sind IgG&sub1;-Werte, schwarze Balken sind IgG2a-Werte und gepunktete Balken sind IgG2b-Werte. TABELLE 5 Immunreaktion (ELISA-Ergebnisse ± SA) von Mäusen, die mit nackter, komplexierter und eingeschlossener DNA immunisiert wurden
In den Tabellen zeigen die Spalten P das Ergebnis von Student's gepaartem t-Test, welches das Konfidenzniveau anzeigt, mit dem sich die Ergebnisse wie angegeben voneinander unterscheiden.
Tabelle 3 zeigt, dass der prozentuale Einschluss für Lipid-Zusammensetzungen, die kationische Lipide enthalten, extrem hoch ist. Die Komplexierungsrate von Plasmid-DNA mit vorgebildeten Lipiden ist ebenfalls sehr hoch. In jedem Fall wird die prozentuale Einschluss/Komplexierungsrate durch den Einsatz von 100 ug oder 150 ug DNA wenig beeinflusst.
Tabelle 4 und Fig. 1 zeigen, dass die Immunreaktion nach einer Immunisierung von Mäusen mit eingeschlossener DNA, die für Hepatitis B- Oberflächenantigen kodiert, viel höher ist als nach einer Immunisierung mit nackter DNA. Obwohl dieser Effekt bereits nach 26 Tagen ab Beginn des Experiments sichtbar ist, wird der Effekt noch ausgeprägter, wenn das Experiment fortgesetzt wird. Der Effekt ist besonders ausgeprägt für IgG&sub1;, obwohl die Niveaus von sowohl IgG2a als auch IgG2b ebenfalls in erhöhten Mengen im Vergleich zur Transmission nackter DNA nach allen Blutentnahmen vorliegen.
Die Ergebnisse in Tabelle 5 zeigen, dass für nackte DNA selbst 28 Tage nach der ersten Verabreichung von DNA keine Reaktion zu sehen ist.
Für DNA, die in neutralen Liposomen (PC, DOPE) eingeschlossen ist, gibt es keine Erhöhung der Immunreaktion nach 21 Tagen, obwohl es eine leichte Zunahme der Reaktion für die höhere Menge an injizierter DNA nach 28 Tagen gibt und diese signifikant höher liegt als die Reaktion nach Verabreichung von nackter DNA.
Für den Komplex aus vorgebildeten kationischen Liposomen und DNA scheint sich die Immunreaktion für beide Niveaus der DNA-Verabreichung nach 28 Tagen ab Beginn des Experiments zu entwickeln und sie ist signifikant höher als die Reaktion nach Verabreichung von nackter DNA. Jedoch sind die Immunreaktionen nicht so hoch wie diejenigen, welche für die DNA, die in kationischen Liposomen eingeschlossen ist, erhalten wurden.
Für kationische Liposomen mit eingeschlossener DNA nach 21 Tagen ist die Immunreaktion bereits signifikant höher als diejenige aller anderen Beispiele, wenn die Menge an injizierter DNA 10 ug beträgt; es gibt jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen der Reaktion nach Verabreichung von 1 ug DNA, die in kationischen Liposomen eingeschlossen ist, und irgendeinem der anderen Beispiele, bei denen 1 ug DNA verabreicht wird. Nach 28 Tagen gibt es bei dem niedrigeren Niveau an verabreichter DNA (1 ug) eine signifikant erhöhte Immunreaktion im Vergleich zu hohen oder niedrigen Mengen an nackter DNA. Es gibt jedoch keinen signifikanten Unterschied zu der Reaktion nach Verabreichung der niedrigen Niveaus an DNA, die mit kationischen Liposomen komplexiert oder in neutralen Liposomen eingeschlossen sind. Für das höhere Niveau an verabreichter DNA (10 ug), eingeschlossen in kationischen Liposomen, ist nach 28 Tagen die Immunreaktion signifikant höher als bei allen anderen Tests.

BEISPIEL 3 - Cytokin-Niveaus in den Milzen von Mäusen, die mit nackter, komplexierter oder in Liposomen eingeschlossener Plasmid-DNA immunisiert wurden

Balb/c-Mäuse in Gruppen von vier (dasselbe Protokoll und Experiment wie in Beispiel 2) erhielten intramuskulär an den Tagen 0,7, 14, 21 und 28 Injektionen mit 1 (weiße Balken) oder 10 ug (schwarze Balken) pRc/CMV-HBS, eingeschlossen in positiv geladenen Liposomen, die aus PC, DOPE und DOTAP aufgebaut waren (A), ungeladenen Liposomen, die aus PC und DOPE aufgebaut waren (B), komplexiert mit ähnlichen vorgebildeten kationischen DOTAP-Liposomen (C) oder in nackter Form (D). "Kontrolle" repräsentiert die Cytokin-Niveaus in normalen, nicht- immunisierten Mäusen. 3 Wochen nach der letzten Injektion wurden die Mäuse getötet und deren Milz einer Cytokin-Analyse unterworfen. Endogene Niveaus an IFN-γ und IL-4 in der Milz wurden nach dem Verfahren von Nakane et al., wie bereits von de Souza et al. modifiziert, bestimmt. Individuelle Milzen wurden gewogen, in eiskaltem RPMI, enthaltend 1% 3-[(Cholamidopropyl)dimethylammonium]-1- propansulfonat (CHAPS; Sigma), in einem Dounce-Gewebehomogenisator homogenisiert und 10%ige (Gew.-/Vol.) Homogenate wurden hergestellt. Die Homogenate wurden 1 h lang auf Eis belassen und unlösliche Zelltrümmer wurden dann durch Zentrifugation bei 2.000 · g für 20 Min. entfernt. Die klaren Überstände wurden bei -70ºC gelagert.

Cytokin-Assays

Standard-Einfang-ELISA-Assays wurden mit monoklonalen Antikörperpaaren und Maxisorp-Platten (NUNC, VK) eingesetzt. Primäre monoklonale Antikörper gegen IFN-γ (R46A2) und IL-4 (11811) und sekundäre biotinylierte monoklonale Anti-Maus-IL-4-Antikörper (BVD6-24G2) und Anti-Maus-IFN-γ-Antikörper (XMG1.2) (Pharmingen, USA) wurden mit Streptavidinperoxidase (Dako, Dänemark) und o-Phenylendiamin (Sigma) als Substrat eingesetzt. Rekombinante IFN-γ und IL-4- Standards stammten von Pharmingen. Die Ergebnisse (Mittelwert ± SE) werden als ng/Milz von mindestens 4 Mäusen ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt, worin jeder Balken den Mittelwert ± SE einer Gruppe von 4 Mäusen darstellt (a-d repräsentieren die Liposomen wie oben angegeben).
Die Daten (Fig. 2) zeigen, dass die Aktivierung für beide Subsets Th1 und Th2 mit in Liposomen eingeschlossener DNA im Vergleich zu nackter oder komplexierter DNA größer war. Dieser Befund wurde auch in vorläufigen T-Zellproliferierungs- Assays gegen das HBsAg-Antigen in vitro bestätigt. Es scheint daher so, dass die Immunisierung mit in Liposomen eingeschlossener Plasmid-DNA sowohl die humorale als auch zellvermittelte Immunität induziert.

BEISPIEL 4 - Immunreaktionen in Mäusen nach einer Einzelinjektion von Plasmid-DNA

Die meisten Berichte über eine Impfung mit nackter DNA verwendeten Protokolle mehrfacher Injektionen, jedoch ergibt eine Einzeldosis ebenfalls eine humorale Reaktion auf das kodierte Antigen (Davis et al., Human Gene Therapy, 1993, und Raz et al.; PNAS, 1994). Beispielsweise war eine Gesamt-IgG-Reaktion für das nackte pRc/CMV-HBS (identisch mit dem hier verwendeten Plasmid) 1-2 Wochen nach der Injektion nachweisbar, um maximale Werte nach 4-8 Wochen zu erreichen (Davis et al., 1996).
Balb/c-Mäuse in Gruppen von vier erhielten einmal intramuskulär eine Injektion von 2 (weiße Balken, siehe Fig. 3) oder 10 ug (schwarze Balken) pRc/CMV-HBS; eingeschlossen in positiv geladenen Liposomen, die aus PC, DOPE und DOTAP aufgebaut waren (A), ungeladenen Liposomen, die aus PC und DOPE aufgebaut waren (B), komplexiert mit vorgebildeten ähnlichen DOTAP-Liposomen (C) oder in nackter Form (D). Die Anti-HBsAg-IgG&sub1;-Reaktionen wurden analysiert (ELISA) in Seren, die in Zeitinvervallen nach der Injektion erhalten wurden. Immunreaktionen wurden von allen Mäusen gezeigt, denen liposomale DNA injiziert worden war, sie wurden jedoch erst nach 20-27 Tagen messbar. Die verbleibenden Details waren wie in Beispiel 2. Unterschiede in den log&sub1;&sub0;-Werten (beide Dosen; alle Zeitintervalle) zwischen Mäusen, die mit kationischer liposomaler DNA immunisiert worden waren, und Mäusen, die mit nackter DNA immunisiert worden waren, waren statisch signifikant (P < 0,0001-0,002). In einer fünften Gruppe von vier Mäusen, die einmal wie oben mit 10 ug pRc/CMV-HBS, eingeschlossen in anionischen Liposomen, die aus PC, DOPE und PS aufgebaut waren (hergestellt nach dem Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben), immunisiert worden waren, betrugen die IgG&sub1;-Reaktionen (log&sub1;&sub0;) 2,25 ± 0,0 und 2,73 ± 0,0 an den Tagen 21 bzw. 29.
Unter den vorliegenden Bedingungen einer Einzelimmunisierung (Fig. 3) mit viel niedrigeren Dosen an pRc/CMV-HBS (2 und 10 ug) war die Anti-HBsAg-IgG&sub1;- Reaktion für nackte und komplexierte DNA selbst nach 7 Wochen kaum nachweisbar. Im Gegensatz dazu gab es eine frühe und deutliche IgG&sub1;-Reaktion für DNA, die in kationischen Liposomen eingeschlossen war, und eine verzögerte, jedoch signifikante Reaktion für DNA, die in neutralen oder negativ geladenen Liposomen eingeschlossen war (Fig. 3).

BEISPIEL 5 - Humorale und zellvermittelte Reaktion von Inzucht- und Auszuchtmäusen, denen Hep B-Antigen in kationischien Liposomen injiziert worden war

Gruppen von Mäusen (4-5 Tiere pro Gruppe) erhielten zweimal (an den Tagen 0 und 7) Injektionen (i.m., i.p., i.v. oder s.c.) mit 10 ug pRc/CMV-HBS (kodierend für die S-Region von Hepatitis B-Oberflächenantigen; Subtyp ayw), eingeschlossen in kationischen DRV-Liposomen, die aus Ei-Phosphatidylcholin (PC), Dioleoylphosphatidylcholin (DOPE) und 1,2-Dioleoyl-3-(trimethylammonium)propan (DOTAP) (Molverhältnisse 1 : 5,5 : 0,25) aufgebaut waren (hergestellt unter Einsatz der in Beispiel 1 oben beschriebenen allgemeinen Techniken und Materialien) oder mit 10 ug nacktem pRc/CMV-HBS (beide in PBS). Den Tieren wurde in Zeitintervallen Blut entnommen und IgG&sub1;, IgG2a und IgG2b wurden mittels ELISA im Plasma gemessen. Am Ende des Experiments (38 Tage nach der ersten Injektion) wurden die Tiere getötet und die Cytokine IFN-γ und IL-4 in der Milz wie beschrieben gemessen (hinsichtlich weiterer experimenteller Details siehe Gregoriadis et al., 1997). Die Cytokine wurden auch in der Milz von (unversehrten) Kontrollmäusen gemessen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse zeigen, dass die Immunreaktionen (Mittelwert ± SA) für beide Stämme von Mäusen erst nach 21 (IgG&sub1;; Fig. 4) oder 28 Tagen (IgG2a und IgG2b; Fig. 5 bzw. 6) nach der ersten Injektion messbar wurden. Die Reaktionen für liposomale DNA (schwarze Balken) waren im allgemeinen signifikant größer als diejenigen für nackte DNA (gepunktete Balken) (beide Stämme und alle Routen, insbesondere i.m., s.c. und i.v.). Signifikante Niveaus (P < 0,05) nehmen in der Reihenfolge von +, *, **, *** zu.
Die Analyse der Cytokine IFN-γ (Th1-Reaktion) (Fig. 7) und Interleukin-4 (IL-4) (Th2-Reaktion) (Fig. 8) offenbarte signifikant höhere Niveaus für liposomale DNA auf den intramuskulären und subkutanen Routen in beiden Stämmen (und für die intravenöse Route in T/o-Mäusen). Es gab keinen Unterschied bei den Werten zwischen liposomaler und nackter DNA für die intraperitoneale Route (beide Stämme).

BEISPIEL 6 - Einschlusswert für sechs verschiedene Plasmid-DNAs

³&sup5;S-markierte Plasmid-DNA (10-500 ug) wurde in neutrale, anionische oder kationische Dehydratations-Rehydratations-Vesikel (DRV) unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Technik inkorporiert oder damit gemischt. Die eingesetzten Plasmid-DNAs waren die folgenden:
pGL2 - kodierend für Luciferase wie für Beispiel 1
pRc/CMV-HBS - Hepatitis B-Oberflächenantigen-(S)-Region wie in Beispiel 2
pRSVGH - kodierend für Humanwachstumshormon, ein therapeutisches Protein
pCMV4.65 - Mikrobakterium-Lepraprotein, ein Antigen
pCMV4.EGFP - "grünes Fluoreszenzprotein"
VR1020 - Schistosom-Protein, ein Antigen.
Die eingesetzten Lipide umfassten die neutralen Lipide PC und DOPE, in Beispiel 1 oben beschrieben, die anionischen Lipide PS, Phosphatidylserin, beschrieben in Beispiel 1, oder Phosphatidylglycerin (PG) und die kationischen Verbindungen Stearylamin (SA), BisHOP und DOTMA, alle in Beispiel 1 beschrieben, DC-Chol und DOTAP, wie in Beispiel 2 verwendet, und darüber hinaus 1,2-Dioleoyl-3-dimethylammoniumpropan DODAP.
Die folgende Tabelle gibt an, ob die Plasmid-DNA inkorporiert wurde (d. h., in DRV verkapselt (a) oder nur mit dem DRV gemischt (b)). Die Tabelle gibt ferner die Lipid-Komponenten und die Inkorporationswerte für die DNA an. Frühere Tests hatten gezeigt, dass sich die Inkorporationswerte bei Verwendung unterschiedlicher Mengen an DNA für jede der DRV-Formulierungen nicht signifikant unterschieden. Die Ergebnisse wurden deshalb kombiniert und die in der Tabelle gezeigten Werte sind Mittelwerte, erhalten aus 3 bis 5 Experimenten. TABELLE 6 - Inkorporation von Plasmid-DNA in Liposomen
Die Ergebnisse zeigen, dass durch Verkapselung der DNA weit höhere Werte für das Inkorporationsniveau erzielt werden können, wenn das Lipid negativ geladen ist. Wenn kationisches Lipid verwendet wird, scheinen sich die Inkorporationswerte bei Verkapselung und physischer Mischung nicht signifikant zu unterscheiden, obwohl es scheint, dass die Verkapselung höhere Werte ergibt, wenn die kationische Komponente eine Nicht-Lipid-Verbindung ist (Stearylamin).

BEISPIEL 7 - Die Wirkung der Lipid-Zusammensetzung von kationischen Liposomen auf die Immunreaktion gegen das HBsAg-Antigen, das von dem eingeschlossenen pRc/CMV-HBS kodiert wird

Unter Anwendung der oben beschriebenen allgemeinen Techniken wurde Plasmid-DNA in verschiedene kationische Liposomen eingeschlossen. Die verwendeten Lipide und die Molverhältnisse sind in Tabelle 7 unten gezeigt. Die Lipide wurden wie in den vorherigen Beispielen verwendet und zusätzlich ist PE Phosphatidylethanolamin mit Ei-Lipid, und DSPC Distearoylphosphatidylcholin, ein gesättigtes Lipid. Balb/c-Mäusen wurde in Gruppen von 5 intramuskulär 10 ug freies oder in Liposomen eingeschlossenes Plasmid am Tag 0, nach zwei Wochen und fünf Wochen injiziert. Den Tieren wurden nach 8, 10 und 13 Wochen Blut entnommen und die Seren wurden mittels ELISA hinsichtlich Anti-HBsAg-(S-Region)-IgG&sub1;- Antikörper untersucht. Die eingesetzte Technik ist wie allgemein in Beispiel 5 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 unten gezeigt. TABELLE 7
Eine statistische Analyse der Ergebnisse (ungepaarter t-Test) zeigte signifikante Unterschiede zwischen (a) allen liposomalen DNA-Formulierungen und freier DNA (P < 0,0001-0,0441; alle Zeitintervalle), PC:DOPE:DOTAP und PC:DOTAP (P < 0,0036-0,0357; alle Zeitintervalle), PC:PE:DOTAP und PC:DOTAP (P < 0,0095- 0,0385; 10 und 13 Wochen), PC:DOPE:DOTAP und DSPC:DOPE:DOTAP (P < 0,0001-0,0138; 8 und 13 Wochen) und PC:DOPE:DOTAP und PC:CHOL:DOTAP (P < 0,0158; 13 Wochen).
Die Ergebnisse legen nahe, dass hinsichtlich der Liposomen-Wirksamkeit bei der Förderung von Immunreaktionen a) DOPE durch PE ohne Verlust an Liposomen- Wirksamkeit ersetzt werden kann (DOPE und PE sind beides ungesättigte Lipide), b) Phosphatidylethanolamin (PE oder DOPE) Liposomen effizienter macht als Liposomen ohne diesen Lipidtyp, c) Ersatz von PC durch das gesättigte DSPC die Liposomen-Wirksamkeit verringert, d) Liposomen mit Cholesterin jedoch ohne Phosphatidylethanolamin fast genauso effektiv sind wie Liposomen mit Phosphatidylethanolamin, jedoch nur nach 8 und 10 Wochen.

BEISPIEL 8 - Einschluss von pRc/CMV-HBS in Nicht-Phospholipid-Liposomen

In diesem Beispiel wurden verschiedene andere Liposomen-bildende Komponenten als Phospholipide dazu eingesetzt, das in den vorherigen Beispielen verwendete Hepatitis-Antigen einzuschließen. Die Liposomen-bildenden Komponenten umfassten ein Glycerid: MonoPal, 1-Monopalmitoyl-rac-glycerin, und nicht- ionische Tenside, Span 60 (Sorbitanmonostearat) und Solulan 24 (ein mit 24 Mol ethoxylierter Komplex von Lanolinalkoholen und verwandten Fettalkoholen). (Span 60 und Solulan 24 sind Handelsmarken.) Die Molverhältnisse der Liposomenbildenden Komponenten sind in der Tabelle gezeigt. Die anderen Komponenten sind wie in den obigen Beispielen verwendet.
Die Ergebnisse zeigen, dass durch Verwendung von Liposom-bildenden Komponenten, die keine Phospholipide einschliessen, adäquate Einschlussraten erzielt werden können. Nicht-ionische Tenside, gegebenenfalls in Kombination mit anderen Nicht-Phospholipid-Lipidkomponenten wie Cholesterin können adäquate Einschlussraten ergeben. Es wurde festgestellt, dass die in den Beispielen 8.4, 8.5, 8.6 und 8.8 gebildeten Liposomen beim Stehen präzipitierten und somit als Zusammensetzung nicht optimiert waren.
Die Einschlussraten sind in Tabelle 8 unten gezeigt. TABELLE 8

Referenzen

Alton, E. W. F. W., Middleton, P. G., Caplen, N. J., Smith, S. N., Steel, D. M., Munkonge, F. M., Jeffery, P. K., Geddes, D. M., Hart, S. L., Williamson, R., Fasold, K. I., Miller, A. D., Dickinson, P., Stevenson, B. J., McLachlan, G., Dorin, J. R. und Porteous, D. J. (1993), Non-invasive liposome-mediated gene delivery can correct the ion transport defect in cystic fibrosis mutant mice; Nat. Genet. 5, 135-142
Bangham, A. D., Hill, M. W. und Miller, N. G. A. (1974), Preparation and use of liposomes as models of biological membranes, in: Korn, E. D. (Hrsg.), Methods in Membrane Biology (New York, Plenum), S. 1-68.
Bradford, M. M. (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing fhe principle of protein-dye binding; Anal. Biochem. 72, 248-254.
Davis, D., Davies, A. und Gregoriadis, G. (1987), Immunology Letters, 14, 341-348.
Davis, H. L., Michel, M. L. und Whalen, R. G. (1993), "DNA-based immunisation ...", Human Melecular Genetics 2, 1847-1851.
Davis, H. L., Demeneix, B. A., Quantin, B., Coulembe, J. und Whalen, R. G., Human Gene Therapy, 4, 733-740 (1993).
Davis, H. L., in Targeting of Drugs: Strategies for Oligonucleotide and Gene Delivery in Therapy, (Hrsg. Gregoriadis, G. und McCormack, B.), S. 21-29 (Plenum Press, NY, 1996).
Felgner, P. L. (1991), Gene Therapeutics, Nature 349, 351-352.
Gregoriadis, G. (1993) (Hrsg.), Liposome Technology, 2. Auflage, Bd. 1-3, CRC Press Inc., Boca Raton.
Gregoriadis, G. (1995), Engineering Liposomes: Progress and Problems; Trends in Biotechnology (1995).
Gregoriadis, G., da Silva, H. und Florence, A. T. (1990), A procedure for the efficient entrapment of drugs in dehydration-rehydration liposomes (DRV); Int. J. Pharm. 65, 235-242.
Gregoriadis, G., Garcon, N., da Silva, H. und Sternberg, B. (1993), Coupling of ligands to liposomes independently of solute entrapment: Observations an the formed vesicles; Biochim. Biophys. Acta 1147, 185-193.
Gregoriadis, G., Saffie, R., und Hart, S. L. (1996), J. Drug Targetting 3, 467- 475.
Gregoriadis, G., Saffie, S. und De Souza, J. B. (1997), Liposome-mediated DNA vaccination; FEBS Lett. 402, 107-110.
Kay, M. A., Landen, C. N., Rothenberg, S. R., Taylor, 4 L. A., Leland, F., Wiehle, S., Fang, B., Bellinger, D., Finegold, M., Thompson, A. R., Read, M., Brinkhous, K. M. und Woo, S. L. C. (1994), In vivo hepatic gene therapy: Complete albeit transient correction of factor IX deficiency in haemophilia B dogs; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2353-2357.
Kirby, C. und Gregoriadis, G. (1984), Dehydration-rehydration vesicles (DRV): A new method for high yield drug entrapment in liposomes; Biotechnology 2, 979- 984.
Legendre, Y.-Y. und Szoka Jr., F. C. (1995), Liposomes for gene therapy, in: Liposomes, New Systems and New Trends in their Applications (Puissieux, F., Couvreur, P., Delattre, J. und Devissaugnet, J. P., Hrsg.) (Paris, Editions de Santé), S. 669-692.
Mulligan, R. C. (1993), The basic science of gene therapy; Science 260, 926- 932.
Nakane, A., Numata, A. und Minagawa, T., Infect. Immun., 60, 523-528 (1992).
Raz, E., Carson, D., Rhodes, H. G., Abal, M. A., Tsai, J. Y., Wheeler, J. C., Morrow, J., Felgner, P. L. und Baird, M. S. (1994), in: Vaccines, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor.
Raz, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523 (1994).
Scherphof, G., von Leeuwen, B., Wilschut, J. C. und Damen, J. (1983), Exchange of phosphatidylcholine between small unilamellar liposomes and human plasma high-density lipo-protein involves exclusively the phospholipid in the outer monolayer of the liposomal membrane; Biochim. Biophys. Acta 732, 595-599.
De Souza, J. B., Ling, I. T., Ogun, S. A., Holder, A. A. und Playfair, J. H. L., Infect. Immun., 64, 3532-3536 (1996).
Tan, L. und Gregoriadis, G. (1989), The effect of positive surface charge of liposomes on their clearance from blood and its relation to vesicle lipid composition; Biochem. Soc. Trans. 17, 690-691.
Wheeler, V. C. und Coutelle, C. (1995), Non-degradative in vitro labelling of plasmid DNA; Anal. Biochem. 225, 374-376.
Zhu, N., Liggit, D., Liu, Y. und Debs, R. (1993), Systemic gene expression after intravenous DNA delivery into adult mice; Science, 261, 209-211.

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend Liposomen, die aus Liposomen-bildenden Komponenten gebildet sind, und, in dem intravesikulären Raum der Liposomen eingeschlossen, ein Polynukleotid, das funktionsfähig für ein immunogenes Polypeptid kodiert, das zur Induktion einer gewünschten Immunreaktion bei einem menschlichen oder tierischen Individuum geeignet ist, wobei die Liposomen durch ein Dehydratations-Rehydratations-Verfahren gebildet wurden, bei dem eine wässrige Suspension von Polynukleotid und vorgebildeten Liposomen dehydratisiert wird und dann rehydratisiert, um Dehydratations-Rehydratations-Vesikel zu bilden, in deren Innenraum das Polynukleotid eingeschlossen ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Polynukleotid doppelsträngige DNA ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das Polynukleotid in Form eines Plasmids vorliegt, das Promotorsequenzen und gegebenenfalls Ribosomen- Bindungssequenzen einschließt.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Polynukleotid RNA, vorzugsweise mRNA, ist.

5. Zusammensetzung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin das immunogene Polypeptid ein Antigen oder ein Fragment eines Antigens eines infektiösen Mikroorganismus umfasst.

6. Zusammensetzung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Liposomen-bildenden Komponenten so ausgewählt sind, dass die Liposomen keine Gesamtladung aufweisen.

7. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Liposomen-bildenden Komponenten mindestens eine kationisch geladene Liposomen-bildende Komponente in einer solchen Menge einschließen, dass die Liposomen-bildenden Komponenten eine kationische Gesamtladung aufweisen.

8. Zusammensetzung, welche Liposomen, die aus Liposomen-bildenden Komponenten gebildet sind, die mindestens eine kationisch geladene Komponente in einer Menge einschließen, durch welche die Liposomenbildenden Komponenten eine positive Gesamtladung aufweisen, und ein Polynukleotid, das für ein gewünschtes Polypeptid-Produkt kodiert, umfasst und dadurch gekennzeichnet ist, daß das Polynukleotid innerhalb des intravesikulären Raums der Liposomen durch ein Verfahren eingeschlossen ist, bei dem leere Liposomen aus den Liposomen-bildenden Komponenten gebildet werden, die leeren Liposomen mit Polynukleotid gemischt und dann dehydratisiert werden und dann die dehydratisierte Mischung in wässriger Zusammensetzung rehydratisiert wird, um Dehydratations-Rehydratations- Vesikel zu bilden.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin die Dehydratations-Rehydratations-Vesikel einer Mikrofluidisierung oder Extrusion unterworfen werden.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin die kationische Komponente ein Glycerid mit der allgemeinen Formel

oder ein optisches Isomer davon ist, worin Y¹ und Y² gleich oder verschieden sind und jeweils -O- oder O-C(O)- bedeuten, wobei der Carbonylkohlenstoff je nachdem mit R¹ oder R² verknüpft ist, R¹ und R² unabhängig eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 6 bis 24 Kohlenstoffatomen sind, R³, R&sup4; und R&sup5; unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Aryl oder Aralkyl mit 6 bis 11 Kohlenstoffatomen sind, alternativ zwei oder drei von R³, R&sup4; und R&sup5; mit dem positiv geladenen Stickstoffatom kombiniert sind, um eine cyclische Struktur mit 5 bis 8 Atomen zu bilden, wobei neben dem positiv geladenen Stickstoffatom die Atome in der Struktur Kohlenstoffatome sind und ein Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatom einschließen können, n 1 bis 8 ist, und X ein Anion ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin R¹ und R² unabhängig 0 bis 6 ungesättigte Stellen aufweisen und die Struktur

CH&sub3;-(CH&sub2;)a-(CH=CH-CH&sub2;)b-(CH&sub2;)c-

aufweisen, worin die Summe von a und c 1 bis 23 beträgt und b 0 bis 6 ist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin die kationische Komponente aus 1,2-Bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonium)propan, 1,2-Bis- (hexadecyloxy)-3-trimethylaminopropan, 3-β-[N',N'-Dimethylaminoethan)carbamyl]cholesterin und Stearylamin ausgewählt ist.

13. Zusammensetzung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Liposomen-bildenden Komponenten eine fusogene Komponente einschließen.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin die fusogene Komponente ein Phosphatidylethanolamin ist.

15. Zusammensetzung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin der mittlere Durchmesser der Liposomen im Bereich von 100 bis 1.000 nm liegt.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin der mittlere Durchmesser vorzugsweise im Bereich von 200-500 nm liegt.

17. Zusammensetzung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend 0,1-10 ug Polynukleotid pro mg Liposomen-bildender Komponenten.

18. Verwendung von Liposomen wie in irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche definiert zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren der therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung eines Menschen oder Tiers.

19. Verwendung nach Anspruch 18, worin das Verfähren eine Impfung zur Immunisierung gegen infektiöse Mikroorganismen oder eine Krebszelle ist.

20. Verwendung nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, worin die Zusammensetzung intramuskulär, subkutan, intravenös oder intraperitoneal verabreicht wird.

21. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Liposomen-Präparation nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

22. In vitro-Verfahren der Transfektion von Zellen, die einem menschlichen oder tierischen Individuum entnommen wurden, bei dem die Zellen mit einer liposomalen Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17 in Kontakt gebracht werden und die Zellen kultiviert werden, wodurch die Transfektion der Zellen und die Expression des Polynukleotids und die Synthese des Polypeptid-Produkts des Polynukleotids stattfindet.

23. Verfahren zum Einschluß von Polynukleotid in Liposomen, beinhaltend die Schritte:

1) Bilden einer wässrigen Suspension, die nacktes Polynukleotid, welches funktionsfähig für ein immunogenes Polypeptid kodiert, das zur Induktion einer gewünschten Immunreaktion bei einem menschlichen oder tierischen Individuum geeignet ist, und vorgebildete Liposomen umfasst,

2) Gefriertrocknen der Suspension,

3) Rehydratisieren des Produkts von Schritt 2), um Dehydratations-Rehydratations-Vesikel zu bilden, in deren intravesikulärem Raum das Polynukleotid eingeschlossen ist, und

4) Unterwerfen der wässrigen Suspension von Dehydratations-Rehydratations-Vesikeln von Schritt 3) einer Mikrofluidisierung.

24. Verfahren nach Anspruch 23, worin die Liposomen kationische Liposomen sind.

25. Verfahren zum Einschluß von Polynukleotid in Liposomen, beinhaltend die Schritte:

1) Bilden einer wässrigen Suspension, die das nackte Polynukleotid und vorgebildete kationische Liposomen umfasst,

2) Gefriertrocknen der Suspension, und

26. Verfahren nach Anspruch 23, umfassend den weiteren Schritt des

5) Abtrennens von nicht-eingeschlossenem Polynukleotid von den Liposomen.

27. Verfahren nach Anspruch 23 oder Anspruch 25, worin die Einschlussrate von Polynukleotid in den Dehydratations-Rehydratations-Vesikeln im Bereich von 10 bis 90% des Polynukleotids in der Suspension in Schritt 1) liegt.

28. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 25, worin die Einschlussrate im Bereich von 10 bis 50% des Polynukleotids in der Suspension in Schritt 1) liegt.

29. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 28, worin im Endprodukt das Polynukleotid-Niveau im Bereich von 0,1 bis 20 ug/mg Liposomenbildender Komponenten liegt.