DE69632395T2

DE69632395T2 - Cochleat-abgabevehikel für biologisch relevante moleküle

Info

Publication number: DE69632395T2
Application number: DE69632395T
Authority: DE
Inventors: Raphael James Mannino; Susan Gould-Fogerite
Original assignee: University of Medicine and Dentistry of New Jersey; Rutgers State University of New Jersey; Albany Medical College
Current assignee: Rutgers State University of New Jersey; Albany Medical College; Rutgers Health
Priority date: 1995-02-22
Filing date: 1996-02-22
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2016-02-23
Also published as: ATE265859T1; JP4535211B2; EP0812209A4; PT812209E; DE69632395D1; DK0812209T3; CA2212382C; EP0812209A1; US5840707A; CA2212382A1; WO1996025942A1; EP0812209B1; JP2007197465A; JPH11500443A; AU4974896A; ES2220973T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Cochleate und deren Verwendung zur Stabilisierung von biologischen Molekülen wie Kohlenhydrate, Vitamine, Mineralien, Polynucleotide, Polypeptide, Lipide und vergleichbare Substanzen für die Abgabe an ein Tier. Cochleate sind stabile, unlösliche Lipid-zweiwertige Kation-Strukturen, die das biologische Molekül aufgenommen haben. Da Cochleate biologisch verträglich sind, können Cochleate mittels üblicher Applikationsformen am Wirt angewandt werden und das biologische Molekül an den Wirkort im Wirt transportieren.
Hintergrund der Erfindung
Einfache Lipid-Cochleate sind vorbeschrieben (FIG. 1). Protein-Cochleate oder Peptid-Cochleate sind als Zwischenstrukturen, die mittels Zugabe von Calcium-Chelatbildnern (siehe US-Patent Nr. 4663161 und US-Patent Nr. 4871488) in Protein-Lipid-Vesikel (Proteoliposomen) (2) umgewandelt werden können, vordem beschrieben und von den Erfindern patentiert. Elektronenmikroskopische Aufnahmen nach Gefrierbruch von Protein-Cochleaten, die nach dem DC-Verfahren hergestellt wurden und Sendai-Glykoproteine enthalten, zeigen eine aufgerollte flüssige Doppelschichtstruktur mit einer „holprigen" Oberfläche. Einfache nach diesem Verfahren hergestellte Phospholipid-Cochleate haben eine glatte Oberfläche. Die aus den Polypeptid-Cochleaten entstehenden Proteoliposomen haben sich als wirksame Immunogene bei Immunisierungen mittels intraperitonealer und intramuskulärer Verabreichung an Tieren erwiesen (G. Goodman-Snitkoff, et al., J. Immunol., Vol. 147, S. 410 (1991); M. D. Miller, et al., J. Exp. Med., Vol. 176, S. 1739 (1992)). Werden die Sendai-Glykoproteine oder die Glykoproteine des Influenza-Virus durch dieses Verfahren rekonstituiert, stellen die Proteoliposomen außerdem wirksame Zufuhrmittel für verkapselte Proteine und DNA an Tiere oder Zellkulturen dar (R. J. Mannino und S. Gould-Forgerite, Biotechniques, Vol. 6, Nr. 1, S. 682–690 (1998); S. Gould-Fogerite et al., J. Exp. Med., Vol. 176, S. 1739 (1992)).
Von Vorteil wäre die Bereitstellung von Mitteln zur Stabilisierung oder Erhaltung von biologischen Molekülen in einer Form, die bei Raumtemperatur stabil ist, getrocknet werden kann und für eine orale Verabreichung geeignet ist. Zum Beispiel wäre eine Formulierung zur Stabilisierung von Polynucleotiden und geeignet für die Abgabe von Polynucleotiden an eine Zelle von Vorteil.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Mittel zur Stabilisierung biologischer Moleküle bereitzustellen, um derart eine Formulierung zu erhalten, die sich durch eine verlängerte Haltbarkeit auszeichnet, die zu einem pulverartigen Zustand verarbeitet werden kann und die später durch Zugabe von Wasser in einen Zustand rekonstituiert werden kann, die ein biologisch aktives Molekül zur Verfügung stellt.
Es ist darüber hinaus Aufgabe der Erfindung, eine Formulierung bereitzustellen für den Einsatz als Träger für die Verabreichung eines biologisch aktiven Moleküls an einem Wirt. Diese Formulierung kann eingesetzt werden für die Abgabe eines biologischen Moleküls für die Absorption am Darm oder an ein Zielorgan, -gewebe oder -zelle.
Ein geeignetes biologisches Molekül ist ein Polynucleotid. Andere geeignete biologische Moleküle sind Polypeptide wie zum Beispiel Hormone und Cytokine. Weitere andere geeignete biologische Moleküle sind bioaktive Verbindungen wie zum Beispiel Arzneistoffe.
Diese und andere Aufgaben wurden gelöst, indem eine biologisch relevante Molekül-Cochleat-Formulierung bereitgestellt wurde, die fähig ist ein biologisch relevantes Molekül an einen Wirt abzugeben, umfassend:

a) mindestens eine biologisch relevante Molekülkomponente;
b) eine negativ geladene Lipidkomponente; und
c) eine zweiwertige Kationkomponente

Die Erfindung stellt zusätzlich die Verwendung der neuen Formulierung für die Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung eines Tieres bereit.
Vorzugsweise ist das biologisch relevante Molekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vitaminen, Mineralien, Aminosäuren, Toxinen, Mikrobiziden, Mikrobistatika, Cofaktoren, Enzymen, Polypeptiden, Polypeptid-Aggregaten, Polynucleotiden, Lipiden, Kohlenhydraten, Nucleotiden, Stärken, Pigmenten, Fettsäuren, Hormonen, Cytokinen, Viren, Organellen, Steroiden und andere Mehrring-Strukturen, Sacchariden, Metallen, Stoffwechselgiften, Proteinen und Arzneistoffen.
In einer bestimmten Ausführungsform ist das biologisch relevante Molekül ein Polynucleotid. Das Polynucleotid kann eines sein, bei dessen Expression ein biologisch aktives Polypeptid oder Polynucleotid hervorgebracht wird. Das Polypeptid kann daher als Immunogen wirken, oder beispielsweise eine enzymatische Aktivität aufweisen. Das Polynucleotid kann eine katalytische Aktivität entfalten; es kann beispielsweise ein Ribozym sein oder kann als Inhibitor der Transkription beziehungsweise Translation wirken. Unter diesem Gesichtspunkt verhält es sich wie eine Antisense-Molekül. Im Falle einer Expression würde das Polynucleotid die zum Stand der Technik bekannten notwendigen regulatorischen Elemente, wie zum Beispiel einen Promotor, enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform ist das biologisch relevante Molekül ein Polypeptid. Ein spezielles Beispiel ist ein Insulin-Cochleat.
Die Vorteile der Cochleate sind zahlreich. Die Cochleate haben eine wasserfreie Struktur, wobei sie über keinen inneren wasserhaltigen Raum verfügen, weshalb Cochleate:

a) stabiler sind als Liposomen, da die Lipide in den Cochleaten weniger oxidationsanfällig sind;
b) in lyophilisierter Form gelagert werden können, was die Möglichkeit einer langen Lagerung bei Raumtemperatur bereitstellt und somit für die weltweite Verschickung und Lagerung vor der Anwendung von Vorteil ist;
c) ihre Struktur auch nach dem Lyophilisieren beibehalten – im Gegensatz zu Liposomen, deren Struktur durch das Lyophilisieren zerstört wird;
d) eine wirksame Aufnahme biologischer Moleküle zeigen, insbesondere mit hydrophoben Komponenten in die Doppel-Lipidschicht der Cochleat-Struktur;
e) die Fähigkeit haben, das biologische Molekül in vivo langsam oder zeitverzögert abzugeben, indem die Cochleate sich langsam abrollen oder auf eine andere Art und Weise dissoziieren;
f) über eine Matrix aus einer Doppel-Lipidschicht verfügen, die als Träger fungieren kann. Diese Matrix ist zusammengesetzt aus einfachen Lipiden, die in den Zellmembranen von Pflanzen und Tieren vorkommen, so dass die Lipide nicht-toxisch, nicht-immunogen, und nicht-entzündlich wirken;
g) hohe Konzentrationen eines zweiwertigen Kations enthalten, beispielsweise Calcium, ein essentielles Mineral;
h) unbedenklich sind; die Cochleate sind Formulierungen aus unbelebten Untereinheiten, und sie tragen daher keines der Risiken, die bei dem Einsatz von attenuierten Lebendvakzinen oder von Vektoren, die transformierende Sequenzen enthalten, verbunden sind, wie beispielsweise lebensbedrohliche Infektionen in immungeschwächten Menschen oder die Umkehr zur Ansteckungsfähigkeit des Wildtyps, die auch für Gesunde eine Gefahr darstellt;
i) einfach und sicher hergestellt werden können; und
j) als festgelegte Formulierungen hergestellt werden können, die sich aus vorgegebenen Mengen und Anteilen biologisch relevanter Moleküle, einschließlich Polypeptide, Kohlenhydrate und Polynucleotide, wie beispielsweise DNA, zusammensetzen.

Die Vorteile einer oralen Anwendung sind ebenfalls zahlreich. In dem Kinderimpfprogramm der WHO wurde die orale Applikation aufgrund der einfachen Verabreichung gewählt. Schluckimpfungen sind preisgünstiger und viel sicherer in der Anwendung als parenteral (intramuskulär oder subkutan) verabreichte Impfstoffe. Die Verwendung von Nadeln schlagen sich einerseits in höheren Kosten nieder und bedauerlicherweise werden sie in der Praxis oft auch wiederverwendet.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
Es zeigen:
1 eine Abbildung eines einfachen Lipid-Cochleats.
2 die Struktur von Polypeptid-Lipid-Vesikeln mit integrierten Membranproteinen.
3 die Zusammenfassung der verschiedenen Alternativ-Verfahren für die Herstellung von Cochleaten.
4(A) und 4(B) die Antikörpertiter in Mäuseserum nach der oralen Gabe von Grippe-Polypeptid-Cochleaten.
5 ein Diagramm, welche die Wirkung der oralen Gabe von Polypeptid-Cochleaten nach einem Provokationsversuch mit aktiven Viren darstellt.
6 eine graphische Darstellung von Antikörpertitern in Mäuseserum nach der oralen Gabe von Sendai-Cochleaten.
7 ein Diagramm, welches die Induktion von antigen-spezifischen, cytotoxischen Splenozyten nach der oralen Gabe von Sendai-Cochleaten beschreibt.
8 eine Serie von Balkendiagramme, welche die Serumglucosespiegel vor und nach oraler Insulingabe beschreiben.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfinder konnten überraschenderweise feststellen und zeigen, dass Cochleate selbst als Mittel für die Stabilisierung und die Abgabe von biologischen Molekülen geeignet sind. Cochleate können den unwirtlichen Bedingungen des Magens widerstehen und somit die eingebetteten empfindlichen biologischen Moleküle wahrscheinlich aufgrund ihrer einzigartigen mehrschichtigen Lagenstruktur schützen. Es ist anzunehmen, dass die Cochleate anschließend von „microfold cells" (M-Zellen) im Dünndarm aufgenommen werden.
Die Erfinder zeigten, dass eine orale Aufnahme durch Trinken von Cochleaten, die Glycoproteine und virale Oberflächenlipide der Grippe- oder Sendaiviren und zusätzlich Phospatidylserin und Cholesterol enthielten, eine Antwort von sowohl der Mucosa wie auch der zirkulierenden Antikörper auslöste. Zusätzlich wurden starke Antworten der Helferzellen (proliferativ) und der Killerzellen (cytotoxisch) erzeugt. Vielleicht am beeindruckendsten war, dass die orale Gabe von Grippe-Cochleate einen Schutz bei einen intranasalen Provokationsversuch mit aktiven Viren bot.
Diese Ergebnisse waren aus mehreren Gründen unenrwartet.
Es war nicht bekannt und es konnte nicht erwartet werden, dass die Cochleate den Bedingungen im Magen standhalten würden und die assoziierten Polypeptide vor dem sauren Umfeld und den Verdauungsenzymen schützen würden. Es ist bekannt, dass ohne die Gegenwart von wenigstens 3 mM Calcium, sich die Cochleate abrollen und Liposomen bilden. Es war daher anzunehmen, wenn nicht sogar wahrscheinlich, dass die Cochleate die Passage vom Mund über die Speiseröhre und durch den Magen nicht überstehen würden. Kämen die Cochleate einzeln an, würden sie wie Nahrungsmittel verdaut werden.
Ebenfalls unbekannt und unerwartet war die Tatsache, dass die Cochleate nach der Passage durch den Magen wirksam mit den Schleimhäuten und den zirkulierenden Bestandteilen des Immunsystem interagieren würden. Jedermann nimmt tagtäglich große Mengen an Proteinen, Fetten und Zucker auf, die einfach verdaut und als Nahrung verwertet werden, ohne dass dies zu einer Reaktion der Schleimhäute oder einer zirkulierenden Immunantwort führt. Folglich geben die Cochleate Moleküle unter Beibehaltung ihrer biologischen Aktivität an Ihrem Wirkort im Wirt ab.
Mit dem vorstehenden Begriff „Immunantwort" sind Antikörper-, zellvermittelte, proliferative oder cytotoxische Aktivitäten oder die Ausscheidung von Cytokinen gemeint.
Mit dem ebenfalls vorstehenden Begriff „Antigen" wird das Polypeptid, gegen die eine Immunantwort gerichtet ist, oder ein exprimierbares Polynucleotid, das dieses Polypeptid kodiert, gemeint.
„Polynucleotid" beinhaltet DNA oder RNA, sowie auch Antisense- und enzymatisch wirksame Moleküle. Folglich kann das biologisch aktive Molekül das Polynucleotid selbst, die Abschrift davon, oder das nach diesem Code erzeugte Polypeptid sein.
Als „Polypeptid" wird jedes beliebige Oligomer oder Aminosäurepolymer bezeichnet. Die Aminosäuren können L-Aminosäuren oder D-Aminosäuren sein.
Als ein „biologisch relevantes Molekül" wird dasjenige Molekül bezeichnet, das eine Rolle in den lebenswichtigen Prozessen eines Lebewesens spielen. Das Molekül kann organischen oder anorganischen Ursprungs, ein Monomer oder ein Polymer, endogen zum Wirt oder nicht, ein Naturstoff oder in vitro hergestellt, und ähnliches sein. Daher schließen Beispiele die folgenden ein: Vitamine, Mineralien, Aminosäuren, Toxine, Mikrobizide, Mikrobistatika, Cofaktoren, Enzyme, Polypeptide, Polypeptidaggregate Polynucleotide, Lipide, Kohlenhydrate, Nucleotide, Stärken, Pigmente, Fettsäuren, Hormone, Cytokine, Viren, Organellen, Steroide und andere Mehrring-Strukturen, Saccharide, Metalle, Stoffwechselgifte, Medikamente und ähnliche.
Die Erfindung kann auch mit ganzen Zellen, die auf anderen subzellulären Replikationsmechanismen basieren, durchgeführt werden, wie zum Beispiel Viren und virenähnliche Einheiten. Daher können auch Bakterien, Hefen, Zelllinien, Viren und ähnliche mit der relevanten Lipidlösung gemischt werden, die eine Fällung auslösen und Strukturen entstehen, bei der die Zellen und ähnliche innerhalb der Cochleat-Struktur fixiert werden.
Polypeptide sind geeignete Moleküle für die Aufnahme in Cochleaten. Das Verfahren für die Herstellung der Cochleate wird ausführlich wie folgt beschrieben. Das Polypeptid wird in einem geeigneten wässrigen Puffer suspendiert. Die Lipide werden getrocknet, um so einen dünnen Film zu bilden. Dann wird der wässrige Puffer auf den Lipidfilm gegeben. Das Gefäß wird gevortext und die Probe gegen einen Kation-haltigen Puffer dialysiert.
Auf diese Art und Weise kann beispielsweise Cochleat-gebundenes Insulin hergestellt werden. Diese Insulin-Cochleate wurden aus einer 1 mg/ml Insulin-Lösung hergestellt, aber es können eine Vielzahl anderer Insulin-Anfangskonzentrationen eingesetzt werden, um eine Anzahl von Cochleaten zu erhalten, die unterschiedliche Mengen Insulin gebunden haben.
Kürzlich durchgeführte Studien zeigen, dass die direkte Injektion der Plasmid-DNA zur Expression der auf diesen Plasmiden kodierten Proteine führen kann und dann zu einer humoralen und zellvermittelten Immunantwort führt (siehe Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 4156–4160 (1993) und Zhu et al.; Science 261: 209–211 (1993)). Die Ergebnisse dieser Studien zeigen, dass DNA-Vakzine eine sichere und wirksame Alternative für Impfungen am Menschen darstellen können. Die Ergebnisse deuten darüber hinaus an, dass die DNA-Vakzine von einem einfachen, effektiveren Verteilungssystem profitieren würde.
Die Verwendung von Lipiden zur Vereinfachung der Verteilung, zum Einschluss und zur Expression der DNA in Tierzellen ist gut dokumentiert (siehe z. B. Philip et al., Mol. Cell Biol. 14: 2411–2418 (1994)). In der Tat bilden heutzutage DNA-Lipid-Komplexe die Grundlage für eine Anzahl von Gentherapieprotokollen am Menschen. Da Cochleate über stabile Strukturen verfügen, die eine Anzahl physiologischer Bedingungen widerstehen können, sind Cochleate geeignete Mittel für die Abgabe biologischer Moleküle, wie beispielsweise, Polypeptide oder Polynucleotide an einen gewähltes Ziel im Wirt. Das Polypeptid oder Polynucleotid, welches eventuell noch exprimiert werden muss, wird von abbauenden Proteasen und Nucleasen geschützt.
Die in der Erfindung eingesetzten Cochleate können nach bekannten Verfahren hergestellt werden wie beschrieben in U.S. Patent Nr. 4663161, am 22. April 1985 eingereicht, U.S. Patent Nr. 4871488, am 13. April 1987 eingereicht, S. Gould-Fogerite et al., Analytical Biochemistry, Vol. 148, S. 15–25 (1985); S. Gould-Fogerite et al., Advance in Membrane Biochemistry and Bioenergetics, Kim, C. H., Tedeschi, T., Diwan, J. J. und Salerno, J. C. (Hrsg.), Plenum Press, New York, S. 569–568 (1988); S. Gould-Fogerite et al., Gene, Vol. 84, S. 429–438 (1989); Liposome Technology, 2. Auflage, Vol. 1, Liposome Preparation and Related Techniques, Vol. II, Entrapment of Drugs and Other Materials, und Vol. III, Interactions of Liposomes with the Biological Milieu, alle von Gregory Gregoriadis herausgegeben (CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London Tokio), Kapitel 4, S. 69–80, Kapitel 10, S. 167–184, und Kapitel 17, S. 261–276 (1993); und R. J. Mannino und S. Gould-Fogerite, Liposome Mediated Gene Transfer, Biotechniques, Vol. 6, Nr. 1 (1988), S. 682–690.
Das Polynucleotid kann eines sein, das ein Polypeptid exprimiert, das heißt Polypeptide von pathogenen Membranen, anomale oder atypische Zell-Polypeptide, virale Polypeptide und ähnliche, die bekannt sind oder geeignete Targets für die Erkennung von dem Immunsystem des Wirts im Zuge der Entwicklung der Immunität darstellen.
Das Polynucleotid kann ein Polypeptid exprimieren, das biologisch aktiv ist, wie beispielsweise ein Enzym, ein Struktur- oder Steuerprotein.
Darüber hinaus kann das Polynucleotid eine biologische Wirkung ausüben, auch wenn es nicht notwendigerweise als Polypeptid exprimiert wurde. Beispiele dafür sind Antisense-Moleküle und RNA-Moleküle mit katalytischer Aktivität. Die exprimierte Sequenz kann folglich bei Transkription ein RNA ergeben, die zu einer Botschaft komplementär ist, die – falls diese deaktiviert ist – einen unerwünschten Phänotyp unterdrückt, oder eine RNA erzeugen, die bestimmte Nucleinsäuresequenzen erkennt und dort oder in der Nähe dieser Stelle diese spaltet, was wiederum in der Unterdrückung eines unerwünschten Phänotyps resultiert.
Das Polynucleotid muss nicht exprimiert vorliegen, sondern kann auch so verwendet werden. Daher kann das Polynucleotid ein Antisense-Molekül oder ein Ribozym sein. Darüber hinaus kann das Polynucleotid ein Immunogen sein.
Bei Polynucleotiden ist folglich die relevante kodierende Sequenz einem geeigneten Promotor nachgeordnet, andere regulierende Sequenzen können nach Bedarf in einen Vektor eingebaut werden, der mittels den Materialien und Methoden zum Stand der Technik in einen geeigneten Wirt eingeführt wird.
Zwei Plasmide, pDOLHIVenv (AIDS Research and Reference Program, Jan. 1991 Katalog S. 113; Freed et al., J. Virol. 63: 4670 (1989)) und pCMVHIVLenv (Dr. Eric Freed, Laboratory of Molecular Immunology, NJAID, NIH), sind beispielsweise geeignete Expressionsplasmide für den Einsatz in Polynucleotid-Cochleaten.
Die Plasmide enthalten die offenen Leserahmen für die env-, tat-, und rev-kodierenden Regionen des HIV-1 (LAV-Stamm).
pDOLHIVenv wurde durch Einführen des Sal1-Xho1-Fragments aus dem infektiösen „full length" molekularen Klon pNL4-3 in den Sal1-Abschnitt des Retrovirusvektors pDOL (Korman et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 2150 (1987)) konstruiert. Der Moloney Mausvirus LTR wurde für die Expression benutzt.
pCMVHIVLenv wurde durch das Klonieren des gleichen Sal1-Xho1 Fragments in den Xho1-Abschnitt des vom CMV abgeleitete Expressionsvektor p763 konstruiert.
Das Polynucleotid kann so konfiguriert werden, dass es verschiedene Epitope oder Epitope kodiert, die an ein bekanntes immunogenes Peptid konjugiert sind, um so die Immunerkennung zu verstärken, insbesondere, wenn das Epitop nur wenige Aminosäuren groß ist.
Für die Bildung von Cochleat-Präzipitaten sollte der überwiegende Anteil der vorliegenden Lipide negativ geladen sein. Es kann ein Lipid-Typ oder eine Lipid-Mischung verwendet werden. im Allgemeinen sind Phosphatidylserin oder Phosphatidylglycerol verwendet worden. Phosphatidylinosit bildet auch einen Niederschlag, der sich bei Kontakt mit EDTA zu Liposomen umwandelt. Ein großer Teil der Lipide kann jedoch neutral oder positiv geladen sein. Die Erfinder haben bis zu 40 Mol-% Cholesterol (auf die Gesamtlipide bezogen) eingesetzt und stellen regelmäßig Polypeptid-Lipid- oder Polynucleotid-Lipid-Cochleate her, die 10 Mol-% Cholesterol und 20% virale Membranlipide enthalten. Phosphatidylethanolamin, entweder ungebunden oder mit Polypeptiden vernetzt, kann ebenfalls in Cochleate eingebunden werden.
Obwohl negativ geladene Lipide verwendet werden können, werden negativ geladene Phospholipide bevorzugt, und aus dieser Gruppe sind Phosphatidylserin, Phosphatidylinosit, Phosphatidsäure und Phosphatidylglycerol am meisten bevorzugt.
Der Fachmann kann leicht die Menge der negativ zu ladenden Lipide bestimmen, indem er eine Mischung mit bekannten Konzentrationen negativer und nicht-negativer Lipide mittels der hier beschriebenen Verfahren herstellt und auf die Bildung von Niederschlägen untersucht.
Es gibt verschiedene bekannte Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Cochleate; diese sind in 3 schematisch dargestellt.
Bei einem geeigneten Verfahren für die Herstellung von Cochleaten werden ein negativ geladenes Lipid, beispielsweise Phosphatidylserin, Phosphatidylinosit, Phosphatidsäure oder Phosphatidylglycerol mit oder ohne Cholesterol (bis zu 3 : 1, vorzugsweise 9 : 1 w/w) eingesetzt. Man erzeugt so eine Suspension von mehrschichtigen Lipidvesikeln, die von biologisch relevante Molekülen (Polypeptide, Polysaccharide, oder ein Polynucleotid, beispielsweise DNA) umgeben sind oder diese enthalten, die sich bei Ultraschall unter Stickstoff in kleine einschichtige Protein-Lipidvesikel umwandeln. Wahlweise kann zur Vorbeugung von Beschädigungen das biologisch relevante Molekül nach der Behandlung mit Ultraschall in die Lösung eingetragen werden. Die Vesikel werden bei Raumtemperatur gegen ein gepuffertes zweiwertiges Kation, beispielsweise Calciumchlorid, dialysiert, was zur Bildung eines unlöslichen Niederschlags führt, der in einer Form vorliegen kann, die als zylinderförmiges Cochleat bezeichnet wird. Nach dem Zentrifugieren kann das so gewonnene Pellet wieder im Puffer aufgenommen werden, um so die Cochleat-Lösung der Erfindung zu erzeugen.
In einer anderen und bevorzugten Ausführungsform kann für die Herstellung der Cochleate eine Menge eines negativ geladenen Lipids, beispielsweise Phosphatidylserin und Cholesterol, in dem gleichen Verhältnis wie oben aufgeführt und im ein- bis zehnfachen Gewichtsüberschuss, vorzugsweise im vierfachen Gewichtsüberschuss bezogen auf virale oder andere zusätzliche Lipide, eingesetzt werden. Entweder wird ein Polypeptid, Mineral, Vitamin, Kohlenhydrat, oder ein Polynucleotid, beispielsweise DNA, zu der Lösung hinzugefügt. Diese Lösung wird dann gegen gepuffertes zweiwertiges Kation, beispielsweise Calciumchlorid, dialysiert, um so einen Niederschlag zu ergeben, der DC-Cochleat (DC für direkte Calciumdialyse) genannt werden kann.
Eine zusätzliche, ähnliche Methode ist für das Rekonstituieren der Cochleate entwickelt worden und ist als LC-Methode (Liposomen vor Cochleaten) bekannt. In den ersten Schritten werden analog zur DC-Methode extrahierte Polypeptide, Polysaccharide, Polynucleotide, beispielsweise DNA oder Kombinationen daraus, zu getrockneten, negativ geladenen Lipiden und Cholesterol gegeben. Jedoch wird die Lösung danach gegen Puffer (z. B. 2 mM TES, 2 mM L-Histidin, 100 mM NaCl, pH 7,4) dialysiert, um so kleine Liposome zu bilden, welche die Polypeptide, Polynucleotide, beispielsweise DNA, und/oder Polysaccharide enthalten. Ein zweiwertiges Kation, z. B. Calcium, wird dann entweder direkt oder mittels Dialyse zugegeben, um so einen Niederschlag, der aus Cochleaten bestehen kann, zu bilden.
In den oben aufgeführten Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Cochleate kann das zweiwertige Kation ein beliebiges zweiwertiges Kation sein, das die Bildung eines Cochleats oder anderer unlöslicher Lipid-Antigen-Strukturen hervorrufen kann. Beispiele von geeigneten zweiwertigen Kationen beinhalten Ca²⁺, Mg²⁺, Ba²⁺ und Zn²⁺ oder andere Elemente, die die Fähigkeit besitzen, zweiwertige Ionen oder andere Strukturen zu bilden, die mit einer Anzahl positiver Ladungen negativ geladene Lipide chelatieren oder verknüpfen können.
Cochleate, die mit verschiedenen Kationen hergestellt worden sind, weisen unterschiedliche Strukturen auf und wandeln sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten zu Liposomen um. Aufgrund dieser strukturellen Unterschiede werden die dort enthaltenen biologisch relevanten Moleküle mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten abgegeben. Entsprechend kann man durch Kombinieren von Cochleaten, die mit verschiedenen Kationen hergestellt wurden, Formulierungen herstellen, die das biologisch relevante Molekül über einen langen Zeitraum hinweg abgeben.
Die Menge an biologisch relevanten Molekülen, die in Cochleaten aufgenommen werden können, kann variieren. Wegen der vorteilhaften Eigenschaften der Cochleate im Allgemeinen kann man mit einer geringeren Menge biologisch relevanter Moleküle zum gleichen Ergebnis gelangen wie mit herkömmlichen Verteilverfahren.
Ein Fachmann kann ohne übermäßigen Versuchsaufwand das optimale Verhältnis von Lipid zu biologisch relevanten Molekülen für die Zielanwendung ermitteln. Verschiedene Verhältnisse werden eingestellt und der Fällungsfortschritt einer jeden Probe kann visuell mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops überprüft werden. Niederschläge, die beispielsweise Cochleate bilden, können einfach kontrolliert werden. Dann können die Niederschläge dem gewählten Wirt appliziert werden, um die Art und den Verlauf der biologischen Antwort auf die applizierten Cochleate zu beurteilen.
Es sollte klar sein, dass das optimale Verhältnis für eine jegliche Anwendung sich zwischen einem hohen Verhältnis, um beispielsweise den Einsatz eines wertvollen biologisch relevanten Moleküls möglichst klein zu halten, und einem niedrigen Verhältnis, um eine möglichst hohe Menge an biologisch relevanten Molekül in den Cochleaten zu binden, bewegen kann.
Cochleate können lyophilisiert und unbegrenzt bei Raumtemperatur oder in einem Puffer, der ein zweiwertiges Kation enthält, bei 4°C für mindestens sechs Monate gelagert werden.
Die Cochleat-Formulierungen können sowohl mit als auch ohne fusogene Moleküle, beispielsweise Polypeptide der Sendai-Virushülle, hergestellt werden. Vorausgegangene Untersuchungen mit Proteoliposomen zeigten, dass für die cytoplasmatische Abgabe der Liposomeninhalte eine fusogene Lipid-Doppelschicht benötigt wird. Die genaue Rolle der Polypeptide der Sendai-Virushülle bei der Ermöglichung der Immunantwort auf Polypeptid-Cochleate ist noch ungeklärt.
Bevorzugt wird die Verwendung von Cochleaten ohne fusogene Moleküle gegenüber Cochleaten mit fusogenen Moleküle, da diese über eine einfachere Struktur verfügen und eine leichtere Herstellung den eventuellen Einsatz am Menschen begünstigt.
Da Polynucleotide hydrophile Moleküle und Cochleate hydrophobe Moleküle sind, die nicht über einen inneren wassergefüllten Raum verfügen, ist es erstaunlich, dass Polynucleotide von Cochleaten aufgenommen werden können. Die Polynucleotide sind nicht auf der Cochleatoberfläche exponiert, da die Polynucleotide widerstandsfähig gegenüber Nucleasen sind.
Bei Polynucleotid-Cochleaten sind Überlegungen in Bezug auf die Dosierung – analog zu etablierten Verfahren bei Impfstoffen – bekannt. Darüber hinaus stehen Verfahren für den Einsatz von Polynucleotiden bei Liposomen und der „nackten DNA" zur Verfügung, die als Grundlage zur empirischen Bestimmung mit Hilfe von bekannten Methoden für eine Dosieranwendung dienen können.
Als geeignetes Modell für die Bestimmung einer Dosierung gilt beispielsweise ein Entwurf wie folgt.
Für die Anfangsdosis von Polynucleotiden in einer Cochleat-Formulierung wurden bei Injektion am Tier etwa 50 μg gewählt, obwohl bekannt ist, dass Mengen von bis zu 2 μg eines getesteten Plasmids noch wirksam sind. Diese Dosierung lässt die Wahrscheinlichkeit erhöhen, eine positive Wirkung nach Einzelapplikation eines Cochleats zu beobachten. Jede Formulierung, die in dieser Dosierung keine Wirkung hervorruft, ist als unwirksam einzuschätzen, jedoch für weiterführende Untersuchungen aufzubewahren.
Erwünscht ist die Entwicklung von Formulierungen, die leicht und nicht-invasiv appliziert werden können. Daher wird die perorale Applikation der Cochleate angestrebt und zunächst höhere Dosierungen geprüft (100 μg/Tier und 200 μg/Tier). Für die parenterale Anwendung werden jedoch niedrigere Dosierungen benötigt.
Anschließend werden abgestufte Dosierungen eingesetzt, um eine Dosis-Wirkung-Beziehungskurve für jede Formulierung zu erhalten. Daher werden Tiergruppen von mindestens 10 Tiere pro Gruppe mit Cochleaten, die 50 μg, 10 μg, 2 μg, 0,4 μg und 0 μg Polynucleotide pro Tier enthalten, geimpft.
Immunantworten oder enzymatische Aktivitäten sind Antworten, die sich leicht überwachen lassen, wenn die Expression des Polynucleotids bestimmt werden soll. Die Änderung im Phänotyp ist eine weitere Messgröße für das Verfolgen der Wirksamkeit von Molekülen vom Antisense- oder Ribozymtyp. Im Falle der Immunsystemüberwachung können mit Hilfe bekannter Methoden Proliferation der T-Zellen, CTL (cytotoxic T-Lymphocyte, zytotoxische T-Lymphozyten) und Anwesenheit von Antikörpern an bestimmten Stellen im Körper zur Beurteilung des Status einer spezifischen Immunantwort herangezogen werden.
Für die Bestimmung der Wirkdauer der Cochleat-Formulierungen werden Gruppen, die positiv auf eine einzelne Immunisierung ansprachen, wiederholt bis zu einem Jahr oder länger beobachtet, um so die wirksame Lebensdauer eines Cochleats nach Applikation zu bestimmen.
Tiere, die keine messbare Antwort auf den Erstkontakt mit Cochleaten entwickelten, können nachgeimpft (geboostet) werden um so Einblick auf die Fähigkeit der niedrigdosierten Formulierungen auf das Aktivieren des Immunsystems für spätere Stimulierungen zu verschaffen.
Pharmazeutische Formulierungen können von fester Form sein und Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver in Großgebinden oder in abgewogenen Einheiten, und in Körnchenform einschließen, oder sie können von flüssiger Form sein und Lösungen, flüssige Emulsionen, flüssige Suspensionen, halbfeste oder ähnliche Zustände einschließen. Die Formulierung enthält – zusätzlich zu dem aktiven Wirkstoff – geeignete Verdünnungsmittel nach dem Stand der Technik, Trägerstoffe, Füllstoffe, Bindemittel, Emulgatoren, Tenside, wasserlösliche Transportmittel, Puffer, Lösungsverbesserer und Konservierungsmittel.
Ein Vorteil der Cochleate liegt in der Stabilität der Zusammensetzung. Daher können Cochleate unbedenklich oral, topisch oder mittels Einflößen angewandt werden und ebenso mittels der üblicheren Anwendungswege wie subkutan, intradermal, intramuskulär oder ähnlichen gegeben werden. Die direkte Applikation auf Schleimhautoberflächen stellt ein interessantes Abgabemittel dar, das mit Cochleaten umsetzbar ist.
Der Fachmann kann die wirksamste und therapeutisch effektivste Methode für die Einleitung einer Therapie auf der Grundlage der Erfindung bestimmen. Es kann auf eine Vielzahl von Quellen verwiesen werden, einschließlich beispielsweise „Goodman & Gilman's, The Pharmaceutical Basis for Therapeutics", (6. Ausgabe, Goodman et al. (Hrsg.), MacMillan Publ. Co., New York, 1980).
Mit den erfindungsgemäßen Cochleaten können Zellen effektiver transfektiert werden, als es mit den heute bekannten Transportmitteln, beispielsweise Liposomen, möglich ist. Daher stellen die erfindungsgemäßen Polynucleotid-Cochleate ein überlegenes Transportmittel für die verschiedenen Wege der Gentherapie dar (Mulligan, Science, 260: 926–931 (1993)). Wie von Mulligan beschrieben werden die vielen Behandlungsmöglichkeiten mittels gentechnischer Verfahren durch verbesserte Verfahren des Gentransfers erweitert.
Die erfindungsgemäßen Cochleate sind ausgezeichnete Mittel für den Transfer anderer biologisch relevanter Moleküle zu einem Wirt. Solche biologisch relevanten Moleküle schließen Nährstoffe, Vitamine, Cofaktoren, Enzyme und ähnliches mit ein. Da das biologisch relevante Molekül im Cochleat gebunden ist, wird das biologisch relevante Molekül im nicht-wässrigen Milieu im Wesentlichen stabilisiert und geschützt. Wie oben aufgeführt wird das biologisch relevante Molekül in die Lipidlösung eingetragen und zu einer präzipitierten Substanz weiterverarbeitet, die aus einem Lipid und der biologisch relevanten Substanz besteht. Wie hier gezeigt können hydrophile Moleküle ohne großen Aufwand „cochleatiert", das heißt, in Cochleat-Strukturen eingebunden werden.
Darüber hinaus sind geeignete lipophile biologisch relevante Moleküle, wie beispielsweise Arzneistoffe und andere therapeutisch wirksame Substanzen, für die Einbindung in Cochleate geeignet. Lipophile Medikamente, wie beispielsweise Cyclosporin, Ivermectin und Amphotericin, werden ohne größere Schwierigkeiten in Cochleate eingebunden.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher ausgeführt, ohne jedoch den Schutzumfang der Erfindung zu mindern.
Beispiel 1
Phosphatidylserin aus Rinderhirn, das in Chloroform in Glasampullen geliefert und bei –20°C unter Stickstoff gelagert wurde, wurde von Avanti Polar Lipids, Birmingham, Alabama, USA, gekauft. Cholesterol der Güteklasse I aus Schweineleber, β-D-Octylglucopyranosid (OCG), Fluorosceinisothioycanat (FITC)-Dextran (durchschnittliches Molekulargewicht 67.000), Metrizamid der Güteklasse I, und Chemikalien für Puffer und die Bestimmung von Proteinen und Phosphaten wurden von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA, bezogen. Organische Lösungsmittel wurden von Fisher Scientific Co. Fairlawn, New Jersey, USA, gekauft. Reagenzien für Polyacrylamidgelelektrophorese stammten von BioRad Laboratories, Richmond, California, USA. S1000 Sephacryl Superfine wurde von Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA bezogen. Dickwandige Zentrifugengefäße aus Polycarbonat (10 ml Inhalt), von Beckman Instruments, Palo Alto, California, USA, wurden für die Herstellung der Vesikel, Waschvorschriften und Gradienten eingesetzt. Ein Ultraschallbad vom Typ G112SP1 G von Laboratory Supply Company, Hicksville, New York, USA kam bei Ultraschallvorgängen zum Einsatz.
Das Virus wurde im Wesentlichen wie bei M. C. Hsu et al., Virology, Vol. 95, Seite 476 (1979) hergestellt und aufgereinigt. Sendai-Viren (Parainfluenza Typ I) und Grippe-Viren (A/PR8/34) wurden im Allantoissack von 10- oder 11-Tage alten befruchteten Hühnereiern gezüchtet. Die Eier wurden geimpft mit 1–100 infektiösen Dosen (10³–10⁵ Viruspartikel laut HA-Titerbestimmung) in 1 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (0,2 g/L KCl, 0,2 g/L KH₂PO₄, 8,0 g/L NaCl, 1,14 g/L Na₂HPO₄, 0,1 g/L, CaCl₂, 0,1 g MgCl₂·6H₂O (pH 7,2)). Die Eier wurden 48–72 Stunden bei 37°C inkubiert, gefolgt von einer Inkubation von 24–48 Stunden bei 4°C. Die Allantoisflüssigkeit wurde gesammelt und mittels 20-minütigem Zentrifugieren in einer Damon IEC/PR-J Zentrifuge bei 2.000 UpM und 5°C geklärt. Der Überstand wurde dann bei 13.000 UpM 60 Minuten lang zentrifugiert. Diese und alle folgenden Zentrifugationen wurden in einer Sorvall RC2-B Zentrifuge bei 5°C mit einem Rotor vom Typ GG durchgeführt. Die Pellets wurden mittels Vortexen und Ultraschall in Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,2) resuspendiert, gefolgt von 20-minütigem Zentrifugieren bei 5.000 UpM. Das Pellet wurde mittels Vortexen und Ultraschall resuspendiert, gefolgt von Verdünnen und erneutem 20-minütigem Zentrifugieren bei 5.000 UpM. Die beiden 5.000-UpM-Überstände wurden vereinigt und 60 Minuten bei 13.000 UpM zentrifugiert. Das so gewonnene Pellet wurde in Phosphat-gepufferter Salzlösung mittels Vortexen und Ultraschall resuspendiert, aliquotiert und bei –70°C gelagert. Die Impfung der Viren und deren Isolierung und Aufreinigung wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Das bei –70°C gelagerte Virus wurde aufgetaut und in sterile dickwandige Polycarbonatröhrchen überführt und mit Puffer (2 mM TES, 2 mM L-Histidin, 100 mM NaCl (pH 7,4)) verdünnt. Das Virus wurde eine Stunde bei 30.000 UpM bei 5°C in einem Beckman TY65 Rotor pelletiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet mittels Vortexen und Ultraschall auf eine Konzentration von 2 mg Virenprotein pro ml Extraktionspuffer (EP) (2 M NaCl, 0,02 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4)) resuspendiert. Das anionische Detergenz β-D-Octylglucopyranosid wurde zu einer Endkonzentraion von 2% (w/v) zugegeben. Die Suspension wurde vermischt und 5 Sekunden in das Ultraschallbad getaucht und dann für 45 Minuten in ein 37°C warmes Wasserbad gestellt. Nach 15, 30 und 45 Minuten Inkubation wurde die Suspension kurz herausgenommen und erneut vermischt und in das Ultraschallbad getaucht. Nucleocapside wurden in einem Rotor vom Typ TY65 45 Minuten bei 30.000 UpM pelletiert. Der gewonnene klare Überstand wurde abgezogen und für die Bildung von Cochleat-gebundenen viralen Glykoproteinen eingesetzt. Andere Membranproteine benötigen möglicherweise einige Modifikation des oben erwähnten Verfahrens. Diese Modifikationen sind dem Fachmann als bekannt vorauszusetzen.
Beispiel 2
A. DC-Cochleate
Eine bestimmte Menge Phosphatidylserin und Cholesterol (9 : 1 Gewichtsverhältnis) werden siehe oben im Extraktionspuffer und einem anionischen Tensid und einer gewählten Menge Polynucleotid vermischt und für 5 Minuten gevortext. Die so gewonnene klare farblose Flüssigkeit wurde bei Raumtemperatur gegen viermal gewechseltem Puffer A (mindestens 4 Stunden pro Wechsel) (2 mM TES N-Tris[hydroxymethyl]-methyl-2-aminoethansulfonsäure, 2 mM L-Histidin, 100 mM NaCl, pH 7,4, auch als TES Puffer bezeichnet), der 3 mM CaCl₂ enthält, dialysiert. In der Enddialyse werden im Allgemeinen 6 mM Ca²⁺, eingesetzt obwohl 3 mM Ca²⁺ ausreichend und andere Konzentrationen mit der Bildung von Cochleaten vereinbar sind. Das Mindestverhältnis von Dialysat zum Puffer war 1 : 100 für jeden Wechsel. Die so gewonnenen weißen Calcium-Phospholipid-Niederschläge werden DC-Cochleate genannt. Bei der Untersuchung mittels Lichtmikroskopie (×1000, Phasenkontrast, Öl) wurden in der Suspension zahlreiche Teilchenstrukturen mit Durchmesser von bis zu einigen Mikrometer wie auch nadelähnliche Strukturen gefunden.
B. LC-Cochleate
Eine bestimmte Menge Phosphatidylserin und Cholesterol (9 : 1 Gewichtsverhältnis) werden siehe oben im Extraktionspuffer und einem anionischen Tensid und einer gewählten Menge Polynucleotid vermischt und für 5 Minuten gevortext. Die Lösung wurde zuerst über Nacht bei einem maximalen Verhältnis von 1 : 200 (v/v) zwischen Dialysat und Puffer A – ohne zweiwertige Kationen – dialysiert und anschließend der Puffer dreimal gewechselt. Dies führte zur Bildung von kleinen proteinhaltigen Lipidvesikel. Die Vesikel wurden entweder durch die direkte Zugabe von Ca²⁺-Ionen, oder mittels Dialyse gegen zweimal Puffer A, der 3 mM Ca²⁺-Ionen, und einmal gegen Puffer A, der 6 mM Ca²⁺ enthielt, in einen Cochleat-Niederschlag umgewandelt.
Beispiel 3
Immunantwort auf oral verabreichte Protein-Cochleat-Impfung
Für die Herstellung des Impfstoffes wurde – wie in Beispiel 1 beschrieben – ein Grippevirus gezüchtet, aufgereinigt und die Glykoproteine und Lipide extrahiert und isoliert. Protein-Cochleate wurden nach dem „LC-Cochleat"-Verfahren siehe oben hergestellt.
Cochleat-Impfstoffe, die Glykoproteine und Lipide aus der Hülle des Grippevirus enthalten sowie Phosphatidylserin und Cholesterol wurden Mäusen durch langsames Einlaufen von 0,1 ml Flüssigkeit in den Rachen verabreicht, was den Mäusen bequemes Schlucken gestattete. Die 4(A) (vorn Versuch A) und 4(B) (vom Versuch B) zeigen die Spiegel der Gesamtmenge der zirkulierenden Antikörper, die gegen die Glykoproteine des Grippevirus gerichtet sind, wie per ELISA gezeigt werden konnte. Der Antikörpertiter wurde definiert als die höchste Verdünnung, bei der noch die optimale Dichte der Negativkontrolle gegeben war.
Im Versuch A, bei dem die in 4A gezeigten Daten generiert wurden, wurden Erstimpfdosen von 50, 25, 12,5 oder 6,25 μg Glykoproteine (jeweils Gruppe 1 bis 4) bei Woche 0 und 3 verabreicht.
Bei den Immunisierungen drei und vier (Woche 6 und 19) wurde nur ein Viertel der Dosis der ersten beiden Immunisierungen verwendet. Die Blutentnahmen 1 bis 6 erfolgten bei Woche 0, 3, 6, 9, 19 und 21. Die Daten zeigen, dass man nur durch das Trinken von Cochleat-Impfstoffen, die virale Glykoproteine enthalten, hohe Titer an zirkulierenden Antikörper erhalten kann. Die Antwort spricht auf Boosten an, verstärkt sich bei wiederholten Gaben und ist direkt proportional zur Glycoprotein-Menge im Impfstoff.
Diese Erkenntnisse wurden im Versuch B, der die Daten für 4(B) erzeugte, bestätigt und erweitert. Der Dosierungsbereich wurde um die Initialdosen von 100 μg und 3.1 μg erweitert. Geimpft wurde an Woche 0, 3, und 15, wobei bei der dritten Immunisierung die Dosis bei einem Viertel der Erstimmunisierungen lag. Die Blutabnahmen 1 bis 6 wurden bei Woche 0, 3, 6, 15 und 16 durchgeführt. Eine zirkulierende Grippevirus-Glykoproteinspezifische Antwort konnte bereits nach einer Einzelapplikation der 5 höchsten Dosen und bei allen Gruppen nach zwei Applikationen festgestellt werden. Die gezeigten Daten sind von gepoolten Seren der jeweiligen Gruppe. Alle Mäuse, die die vier höchsten Dosen bekamen, und vier von fünf Mäusen aus der Gruppe fünf und sechs, sprachen auf den Impfstoff mit Antikörpertiter in dem Bereich von 100 bis zu 102.400 an. Alle Mäuse der Gruppe sieben, die keinen Impfstoff erhielten, hatten zu jedem beliebigen Zeitpunkt Titer von unter 50.
Die Antikörperantwort ist langanhaltend. Titer von Blutabnahmen, die 13 Wochen nach der dritten Immunisierung (4(A), Blutabnahme 5) und 12 Wochen nach der zweiten Immunisierung (4(B), Blutabnahme 4) erfolgten, blieben entweder unverändert, oder änderten sich um eine Größenordnung nach oben oder nach unten im Vergleich zur dritten Woche nach dem vorhergegangenen Boost.
Um zu bestimmen, ob eine orale Gabe des in Beispiel 2 beschriebenen Impfstoffes aus Untereinheiten zu einem Immunschutz im Respirationstrakt führt, wurden die im Versuch B bei Beispiel 2 beschriebenen Mäuse bei Woche 0, 3 und 15 mit Cochleaten immunisiert. Die immunisierten Mäuse wurden einer Provokation durch die intranasale Gabe von 2,5 × 10⁹ Grippevirenteilchen bei Woche 16 unterzogen. Drei Tage nach der viralen Provokation wurden die Tiere getötet und die Lungen und die Trachea entnommen. Die gesamte Lunge oder Trachea wurde verrieben und mittels Ultraschall homogenisiert und Aliquots davon in befruchtete Hühnereier injiziert, um eine Amplifikation von vorhandenen Viren zu ermöglichen. Nach drei Tagen bei 37°C wurde Allantoisflüssigkeit aus verschiedenen Eiern gewonnen und Titer mittels Hämagglutination (HA) bestimmt.
Mäuse wurden darüber hinaus nach einer oralen Cochleatgabe – wie in Versuch A in Beispiel 2 beschrieben – einer intranasalen Provokation mit lebenden Grippeviren unterworfen. Die Lungen wurden drei Tage später entnommen und in Kultur genommen, um eine Anwesenheit von Viren nachzuweisen.
Die gesammelten Daten der zwei Versuche sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die grafische Auswertung der Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
Tabelle 1
Die Daten aus Tabelle 1 zeigen, dass alle fünf ungeimpften Mäuse über eine ausreichende Virenmenge in der Trachea verfügten, um die befruchteten Hühnereier zu infizieren (über 10³ Teilchen pro Trachea oder mindestens eine Ei-Infektionsdosis (EID) pro 0,1 ml Suspension). Der orale Impfstoff stellte hingegen einen hohen Schutz vor viraler Replikation in der Trachea dar. Alle Mäuse in den Gruppen 1, 3 und 5 im Versuch B wurden negativ auf den Virus getestet. Zwei Mäuse in Gruppe 2, eine Maus in Gruppe 4 und vier Mäuse in Gruppe 6 (der Gruppe mit der niedrigsten Impfdosis) im Versuch B wiesen eine genügend hohe Virenkonzentration auf, um in diesem sehr empfindlichen Assay für die Anwesenheit von Viren als positiv getestet zu werden.
Der oral verabreichte Protein-Cochleat-Impfstoff stellte auch einen hohen Schutz gegen virale Replikation in der Lunge dar. Die suspendierten Lungen aller zwanzig Mäuse, die die vier höchsten Dosen des Impfstoffes verabreicht bekamen, wurden in befruchteten Eiern kultiviert und wurden negativ auf Viren getestet (Tabelle 1). Alle Mäuse aus den Gruppen, die mit 6,25 μg und 3,1 μg Glycoproteinen immunisiert wurden, und alle Mäuse aus der ungeimpften Kontrollgruppe wurden positiv auf Viren getestet.
Sogar bei den zwei niedrigst-dosierten Impfgruppen fand eine Hemmung der viralen Replikation statt. Wurden Lungensuspensionen auf 1/10 verdünnt und in Eier geimpft, wurde nur ein Tier aus der Gruppe, die mit 6,25 μg immunisiert wurde, positiv getestet. Im Vergleich dazu zeigten drei Tiere aus der Gruppe, die mit 3,12 μg immunisiert wurde, und drei Tiere aus der ungeimpften Kontrollgruppe ein positives Ergebnis. Nach dem Kultivieren der 1/100 Verdünnungen wurde jeweils ein Tier in den Gruppen, die mit 6,25 μg und 3,12 μg immunisiert wurden, positiv getestet; in der ungeimpften Gruppe blieben hingegen 3 von 5 Tieren positiv. Zusätzlich waren in den beiden Tieren aus der Gruppe, die mit 3,12 μg immunisiert wurden, die aber bei der 1/100 Verdünnung negativ befunden worden waren, nur 50% der Eier bei der 1/10 Verdünnung infiziert und hatten darüber hinaus niedrige HA-Titer. In der ungeimpften Gruppe waren im Vergleich alle Eier infiziert und produzierten höchste Virenmengen bei sowohl der 1/10 wie auch bei der 1/100 Verdünnung.
C57BL/6 Mäusen wurden Cochleat-gebundene Glycoproteine vom Sendai-Virus oral bei Woche 0 und 3 verabreicht. Blut wurde abgenommen bei Woche 0 (Blutentnahme 1), 3 (Blutentnahme 2), und 6 (Blutentnahme 3). Gruppe 1 enthielt etwa 50 μg Protein, Gruppe 2 etwa 25 μg, Gruppe 3 etwa 12,5 μg und Gruppe 4 etwa 6,25 μg und Gruppe 5 (Negtivkontrolle) 0 μg Protein. Die Spiegel von Sendai-spezifischen Antikörpern wurden mittels ELISA aus dem gepoolten Serum von jeweils 5 Mäusen aus jeder Dosierungsgruppe bestimmt. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Man sieht, dass starke Antikörperantworten generiert wurden, dass die Stärke der Antwort proportional zu der Immunisierungsdosis ausfiel und dass die Stärke der Antwort nach einer Auffrischimpfung erneut anstieg.
Die Antwort fiel äußerst langanhaltend aus. Die Antwort findet überwiegend in der Form von IgG statt, was auf eine Beteiligung der T-Helferzellen und der Etablierung langfristiger Gedächtniszellen, die eine Rolle bei der sekundären Immunantwort spielen, hinweist. Überraschenderweise wurde jetzt bei den niedrigsten Dosierungen, die am Anfang die schwächsten Antworten hervorriefen, die höchsten Spiegel an zirkulierenden Antikörper gefunden. Dies ist vermutlich auf das Herabregeln der sehr hohen Anfangsantworten durch das Immunsystem und dem langsamen Anstieg der schwachen Antworten zurückzuführen. Diese Beobachtungen können aber auch auf eine langsame Freigabe und eine Persistenz des Antigens hinweisen. Es ist aufschlussreich und folgerichtig, dass beim Einsatz der oralen Immunisierung bedeutende IgA-Titer generiert und aufrecht erhalten werden.
Es wurde eine 50 μg Proteindosis eines Cochleat-gebundenen Sendai Glykoprotein oral verabreicht. Das Tier (BALB/c Maus) wurde zwei Wochen später getötet und die Milzzellen entnommen. Die cytolytische Aktivität der Milzzellen wurden anhand ihrer Fähigkeit bestimmt, Chrom-51 aus Zielzellen, die Sendai-Antigene tragen, freizusetzen. Die nicht-immunisierte Maus konnten Zellen, die mit dem Sendai-Virus (SV) gepulst waren, weder bei Restimulation in Kultur (N/SV/SV) noch bei nicht-Sendai-päsentierenden Zellen (N/N/N) abtöten (7). Mäuse, die – im Gegenzug – mit Sendai-haltigen Cochleaten immunisiert worden waren, konnten SV-gepulste Targets zu einem hohen Anteil und nicht-gepulste Targets zu einem niedrigeren Anteil abtöten. Die cytolytische Aktivität ist ausschlaggebend beim Abbau von Zellen, die von Viren oder intrazellulären Parasiten infiziert worden sind, oder beim Abbau von Krebszellen. Dies zu induzieren wird als eine sehr erwünschte Eigenschaft von Impfstoffen erachtet, ist aber im Allgemeinen bei keiner der meisten Tot-Impfstoffen beobachtet worden. Dieses stellt eine wichtige Eigenschaft von Impfstoffen auf der Grundlage von Protein-Cochleaten dar.
Beispiel 4
Acht-Wochen alte weibliche BALB/c Mäuse wurden je zweimal mit verschiedenen Polynucleotid-Cochleat-Formulierungen (IM), nur Polynucleotiden oder Kontrollen immunisiert. Anschließend wurden die Splenozyten der Mäuse auf die Fähigkeit getestet, als Antwort auf die Gegenwart eines von den Polynucleotiden kodierten Proteins zu proliferieren.
Cochleate mit oder ohne fusogenem Sendai-Virusprotein wurden siehe oben hergestellt. Als Polynucleotid wurde das pCMVHIVLenv-Plasmid eingesetzt. Die Lösung, die Lipide und extrahierte Sendai-Virus-Hüllproteine wie oben beschrieben sowie Polynucleotid enthielt, wurde im Verhältnis 10 : 1 (w/w) und im Verhältnis 50 : 1 (w/w) vermischt. Dieses Protokoll erzeugte vier Gruppen: Cochleat/DNA, 10 : 1; Cochleat/DNA, 50 : 1; SV-Cochleat/DNA 10 : 1 und SV-Cochleat/DNA 50 : 1. Nackte DNA wurde in der Menge von 10 μg/Maus und 50 μg/Maus eingesetzt. Als Kontrolle diente reine Pufferlösung. Die Mäuse wurden zweimal im Abstand von 15 Tagen mit 50 μL/Maus immunisiert.
Die Splenozyten wurden entnommen und in einem T-Zell-Proliferationsassay mit tritiertem Thymidin nach dem Stand der Technik getestet. Die Kontrollkulturen enthielten entweder kein Antigen oder Con A. Als Antigen wurde das p18-Peptid (1 μM, 3 μM und 6 μM) eingesetzt. Die Zellen wurden am Tag 2, 4 und 6 nach dem Ansetzen der Splenozyten-Kulturen entnommen.
Mit der nackten DNA wurde eine vom Background nur marginal abweichende Antwort erhalten. Mit allen vier Cochleat-Zubereitungen wurden p18-spezifische Antworten erzielt, die mit der Zeit anstiegen. Am Tag 6 betrug die Antwort etwa den vierfachen Wert des Backgrounds. Bei dem Verhältnis 10 : 1 (w/w) betrug der DNA-Konzentrationsbereich 120–170 μL. Bei dem Verhältnis 50 : 1 (w/w) betrug die DNA-Konzentration etwa 25–35 μg/ml.
Die Polynucleotid-Cochleate wurden mit Mikrokokken-Nucleasen umgesetzt und kein oder nur ein sehr geringer Abbau der Nucleinsäuren beobachtet.
Der Wirkungsgrad bei der Verkapselung der Polynucleotide wurde nach der Quantifizierung freier DNA aus den im Überstand nach der Fällung verbleibenden Lipiden auf 50% bestimmt. Nach dem Waschen des Niederschlages und dem Aufschließen der Strukturen mittels Entfernen der Kationen konnten etwa 35% der DNA wieder gewonnen werden.
Beispiel 5
Mit einem ähnlichen Verfahren wurden Splenozyten von Tieren, die wie in Beispiel 4 beschrieben immunisiert wurden, auf eine Antigen-spezifische cytotoxische Aktivität getestet. Es kam ein Chrom-Release-Assay zum Einsatz, wobei markierte H-2-kompatible Targetzellen verwendet wurden, die bekanntlich ein HIV-Protein, beispielsweise gp160, exprimieren. Die angesprochenen Zellen können durch eine kurze Exposition mit aufgereinigten HIV-Peptiden stimuliert werden.
Bei einer Vorstimulierung verfügten Tiere, die mit Polynucleotid-Cochleaten behandelt wurden, über cytotoxische Splenozyten, die spezifisch gegen das gp160 Protein gerichtet waren, wobei bei einem Effektor/Target-Verhältnis von 100 eine nahezu 100%ige Cytotoxizität beobachtet wurde.
Beispiel 6
Fünfzehn mg Insulin wurden in einem 50 ml Plastikgefäß zu 15 ml Extraktionspuffer (EP) gegeben. Dann wurden 300 mg OCG in die Mischung eingetragen. Die entstehende Suspension war ein Kolloid und nicht ganz klar bei einem pH von 7,4. Die Lösung wurde mit 1 N NaOH auf den pH 8,5 titriert, wobei eine klare Lösung entstand.
In einem anderen Gefäß wurden 6,8 ml einer 10 mg/ml Lösung von Phosphatidylserin und 1,5 ml einer 5 mg/ml Lösung von Cholesterol vermischt und dann zu einer dünnen Schicht getrocknet. Die Zugabe der Insulinlösung in das Gefäß ergab eine kolloidale Suspension. Die Suspension wurde sieben Minuten gevortext und dann eine Stunde auf Eis gekühlt. Der pH der Lösung wurde mit 1 N NaOH auf 9–9,5 eingestellt. Die Probe wurde steril filtriert und bei einer Konzentration von etwa 2 ml pro Beutel in eine Dialyseapparatur eingestellt.
Es kamen zwei verschiedene Dialyseprozeduren zum Einsatz.
A. DC-Cochleate

1. 100 ml über Nacht, 1 × TES, pH 9,0 mit 3 mM Ca²⁺, Zn²⁺ oder Mg²⁺
2. 250 ml 4 h, 1 × TES, pH 8,5 mit 3 mM Ca²⁺, Zn²⁺ oder Mg²⁺
3. 250 ml 4 h, 1 × TES, pH 8,0 mit 3 mM Ca²⁺, Zn²⁺ oder Mg²⁺
4. 250 ml 4 h, 1 × TES, pH 7,4 mit 6 mM Ca²⁺, Zn²⁺ oder Mg²⁺

B. LC-Cochleate

1. 100 ml über Nacht, 1 × TES, pH 9,0
2. 250 ml 4 h, 1 × TES, pH 9,0
3. 250 ml 4 h, 1 × TES, pH 9,0
4. 100 ml über Nacht, 1 × TES, pH 9,0 mit 3 mM Ca²⁺, Zn²⁺ oder Mg²⁺
5. 250 ml 4 h, 1 × TES, pH 8,5 mit 3 mM Ca²⁺, Zn²⁺ oder Mg²⁺
6. 250 ml 4 h, 1 × TES, pH 7,4 mit 6 mM Ca²⁺, Zn²⁺ oder Mg²⁺

Es konnte gezeigt werden, dass der nach der Dialyse entstehende Niederschlag aus einer Vielzahl an Cochleaten besteht.
Beispiel 7
Mäusen wurden Proben Insulin-haltiger Cochleate oral verabreicht. Die Serum-Glucose-Spiegel wurden mittels üblicher Verfahren am Zeitpunkt 0 (vor der Cochleat-Gabe), 30 Minuten und 60 Minuten nach der Gabe gemessen. Die in Beispiel 6 beschriebenen Cochleat-Formulierungen wurden bei einer Anfangsdosis von 1 mg Insulin/ml Lösungsmittel eingesetzt. Jeder Maus wurden 100 μl oder 200 μl der ausgewiesenen Präparate wie angegeben verabreicht. Zu Vergleichszwecken wurde einer Maus ein kommerzielles humanes Insulinpräparat, Humulin R, intraperitoneal verabreicht.
Beispiel 8
Nach Beispiel 6 hergestellte Insulin-haltige Cochleate wurden oral drei Monate alten weiblichen BALB/c Mäusen gegeben, in denen mittels herkömmlicher Verfahren durch die intraperitoneale Injektion von Streptozotocin Diabetes induziert wurde. Zwei Tage nach der Gabe von Streptozotocin wurden die Mäuse in Gruppen zu fünf Tieren aufgeteilt und mit 200 pl Insulin-haltigem Cochleat pro Maus oral behandelt. Anderen Mäuse wurden 2 IU Humulin R injiziert.
Serumproben wurden zum Zeitpunkt 0, vor der Insulingabe, und zwei Stunden nach der Applikation von Insulin genommen. Die Glucosespiegel wurden mit einem Kit von Sigma (St. Louis, USA) bestimmt. Die Kontroll-Tiere wurden nicht behandelt, das heißt, sie wurden weder mit Streptozotocin noch mit Insulin behandelt. Die charakteristischen Ergebnisse sind in 8 dargestellt. Orales, nur durch Trinken verabreichtes Insulin senkte wirksam den Glucose-Spiegel im Blut. In Kontrolltieren konnte keine Senkung der Glucose-Spiegel im Blut beobachtet werden.
Wurde die Erfindung auch im Einzelnen und anhand bestimmter Ausführungsbeispiele beschrieben, ist für den Fachmann ersichtlich, dass verschiedene Änderungen oder Modifikationen ohne Schmälerung des Schutzumfangs hiervon durchführbar sind.

Claims

Biologisch relevante Molekül-Cochleat-Formulierung, die fähig ist ein biologisch relevantes Molekül an einen Wirt abzugeben, umfassend: a) mindestens eine biologisch relevante Molekülkomponente; b) eine negativ geladene Lipidkomponente; und c) eine zweiwertige Kationkomponente, zur Verwendung bei der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Chirurgie, Therapie oder Diagnose.
Cochleat-Formulierung nach Anspruch 1, wobei die biologisch relevante Molekülkomponente ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Vitaminen, Mineralien, Aminosäuren, Toxinen, Mikrobiziden, Mikrobistatika, Cofaktoren, Enzymen, Polypeptiden, Polypeptid-Aggregaten, Polynucleotiden, Lipiden, Kohlenhydraten, Nucleotiden, Stärken, Pigmenten, Fettsäuren, Hormonen, Cytokinen, Viren, Organellen, Steroiden und anderen Mehrring-Strukturen, Sacchariden, Metallen, Stoffwechselgiften, Proteinen und Arzneistoffen.
Cochleat-Formulierung nach Anspruch 2, wobei die biologisch relevante Molekülkomponente ein Polynucleotid, vorzugsweise eine Desoxyribonucleinsäure ist.
Cochleat-Formulierung nach Anspruch 3, wobei das Polynucleotid Desoxyribonucleinsäure ist, die unter Bildung einer Ribonucleinsäure transcribiert wird.
Cochleat-Formulierung nach Anspruch 4, wobei die Ribonucleinsäure unter Bildung eines Polypeptids transcribiert wird.
Cochleat-Formulierung nach Anspruch 3, wobei das Polynucleotid eine katalytische Ribonucleinsäure ist.
Cochleat-Formulierung nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, wobei die negativ geladene Lipidkomponente ein Phospholipid ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinosit und Phosphatidsäure.
Cochleat-Formulierung nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, wobei die zweiwertige Kationkomponente eine kationische Verbindung ist, die zum Chelatieren und Komplexieren von negativ geladenen Lipiden befähigt ist.
Cochleat-Formulierung nach Anspruch 8, wobei die zweiwertige Kationkomponente ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ca++, Mg++, Ba++ und Zn++, vorzugsweise Ca++.
Cochleat-Formulierung nach Anspruch 2, wobei die biologisch relevante Molekülkomponente eine Polynucleotidkomponente und ein Antisense-Molekül ist.
Cochleat-Formulierung nach Anspruch 3, wobei die Desoxyribonucleinsäure ein Plasmid ist.
Cochleat-Formulierung nach Anspruch 2, wobei das biologisch relevante Molekül ein Hormon ist, vorzugsweise Insulin.
Cochleat-Formulierung nach Anspruch 2, wobei die biologisch relevante Molekülkomponente ein Mineral ist.
Cochleat-Formulierung nach Anspruch 2, wobei die biologisch relevante Molekülkomponente ein lipophiler Arzneistoff ist.
Cochleat-Formulierung nach Anspruch 14, wobei der lipophile Arzneistoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cyclosporin, Ivermectin und Amphotericin.
Verwendung einer Cochleat-Formulierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 bei der Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Chirurgie, Therapie oder Diagnose.
Verwendung nach Anspruch 16, worin die Zusammensetzung an den Menschen oder das Tier topisch zu applizieren ist.
Verwendung nach Anspruch 16, worin die Zusammensetzung dem Menschen oder dem Tier an den Schleimhautoberflächen, vorzugsweise oral, zu applizieren ist.
Verwendung nach Anspruch 16, worin die Zusammensetzung an den Menschen oder das Tier subcutan, intramuskulär und intradermal zu applizieren ist.