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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von nichtkationischen
Liposomen, die eine Nucleotidsequenz einkapseln, zum Hervorrufen
einer Immunantwort.
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Stand der Technik
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Folgendes
ist eine Liste von Literaturstellen zum besseren Verständnis des
Hintergrunds der vorliegenden Erfindung.
- Gregoriadis,
G., Saffie, R, de Souza, J.B, Liposome-mediated DNA vaccination,
FEBS Letters, 402: 107-110 (1997).
- Huang ZM, Yen TSB. Role of the hepatitis B virus posttranscriptional
regulatory element in export of intronless transcripts. Moll Cell
Biol 1995; 15: 3864-3869.
- Huang Z, Yen TSB. Hepatitis-B virus-RNA element that facilitates
accumulation of surface gene transcripts in the cytoplasm. J Virol
1994; 68: 3193-3199.
- Ishii N., Fukushima, J., Kaneko, T., Okada, E., Tani, K., Tanaka,
SI., Hamajima, K., Xin KQ., Kawamoto, S., Koff, W., Nishioka, K.,
Yasuda, T., and Okuda, K in: Cationic liposomes are a strong adjuvant
for a DNA vaccine of human immunodeficiency virus type 1, AIDS Res.
Hwn. Retroviruses, 13(16): 1421-8, (1997).
- Pavlakis, George, N., and Smyth-Templeton, Nancy, Novel Liposome
Complexes for increased Systemic Delivery, WO 9807408, 1998.
- Zhou, WZ., Kaneda, Y., Huang, S., Morishita, R., Hoon, D. in:
Protective immunization against melanoma by gp 100 DNA-HVJ-liposome
vaccine, Gene Ther., 6(10): 1768-73 (1999).
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Hintergrund der Erfindung
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Es
hat sich gezeigt, dass die Injektion einer DNA-Sequenz, die spezifische
Antigene codiert, in einen Wirt sowohl humorale als auch zellvermittelte
Immunantworten gegen das codierte Peptid induziert. Liposomen wurden
in einem Versuch verwendet, die von antigener codierender DNA hervorgerufene
Immunantwort zu verstärken.
Positiv geladene (kationische) Liposomen, die verschiedene DNA-Konstrukte
einkapseln und einem Wirt intramuskulär, intraperitoneal, subkutan,
intradermal und intranasal verabreicht wurden, induzierten höhere Niveaus
der Antikörperproduktion
und eine Überempfindlichkeit
des verzögerten
Typs (DTH) im Vergleich zu derselben DNA, wenn sie allein verabreicht
wird (Ishii et al., 1997). Die intramuskuläre Immunisierung von Mäusen mit
kationischen Liposomen, die ein DNA-Plasmid einkapseln, das den
S-Bereich von Hepatitis-B-Oberflächenantigen
codiert, führte
bei Mäusen
zu einer verbesserten humoralen und zellvermittelten Immunität (Gregoriadis
et al., 1997). Die systemische Verabreichung von kationischen Liposomen,
die DOTAP (Dioleyltrimethylammoniumpropan) und wenigstens ein Cholesterin
oder Cholesterin-Derivat
umfassen und eine Nucleinsäure
einkapseln, die ein exprimierbares Protein codieren, an Mäuse führte zur
Verstärkung
der Genexpression, wobei sich die höchste Expression in den Lungen
der Tiere findet (Pavlakis et al., 1998). Die intramuskuläre Injektion
von nichtkationischen Liposomen, die aus Virushüllen hergestellt sind und virale
enthalten und eine Plasmid-DNA einkapseln, welche ein melanomspezifisches
Antigen codiert, induzierte in einem Mausmodell Autoimmunität gegen
Melanom (Zhou et al., 1999).
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WO
97/10851 offenbart eine in-vivo-Genübertragung und Expression unter
Verwendung von nichtkationischen Liposomen, die eine Nucleinsäure und
ein Polypeptid umfassen. Diese Veröffentlichung offenbart keine
humorale Immunantwort bei den behandelten Wirten.
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Kurzbeschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf Ergebnissen, die zeigen, dass die
intravenöse
(i.v.) Injektion von nichtkationischen Liposomen, die entweder neutral
sind oder eine negative Ladung aufweisen, keine Peptide enthalten
und eine Nucleotidsequenz (hier zuweilen als "DNA" bezeichnet)
einkapseln, in Mäuse
zur Expression der in dem Liposom eingekapselten DNA-Sequenz führt. Die
Expression findet hauptsächlich
in den Milzen der Mäuse,
die die Injektion erhalten haben, statt. Wenn sie systemisch injiziert
werden, erreichen die Liposomen also die Milz des Wirts effizienter
als irgendein anderes Organ des Wirts, was zu der relativ hohen Expression
der eingekapselten Sequenz in den Milzzellen führt. Überdies führt die Expression der DNA-Sequenz
in der Milz zur Produktion von Antikörpern gegen das exprimierte
Protein. Außerdem
wurde gemäß der Erfindung
gezeigt, dass Milzzellen der Tiere, denen die Liposomen der Erfindung
i.v. injiziert wurden, effizient für die Produktion von monoklonalen
Antikörpern
gegen das exprimierte Antigen verwendet werden können. Die Erfindung hat es
also ermöglicht,
eine gewünschte
Nucleinsäuresequenz
in die Milz eines Wirts zu steuern und in dem Wirt eine Immunantwort
gegen das durch die Sequenz codierte Peptid hervorzurufen, indem
man die gewünschte
Sequenz in nichtkationische Liposomen einkapselt, die dem Wirt i.v.
injiziert werden.
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Außerdem wurde
gemäß der Erfindung
gezeigt, dass die intramuskuläre
(i.m.) Verabreichung von nichtkationischen Liposomen, die entweder
neutral sind oder eine negative Ladung haben und keine viralen Proteine
enthalten und eine Nucleotidsequenz einkapseln, in ein Tier zur
Expression der Nucleinsäuresequenz in
dem Tier, das die Injektion erhielt, führt.
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Durch
ihren ersten Aspekt gibt die vorliegende Erfindung also ein Verfahren
zum Hervorrufen einer humoralen Immunantwort in einem Wirt gegen
ein Peptid, das von einer Nucleotidsequenz codiert wird, an, das das
Verabreichen von nichtkationischen Liposomen, die die Nucleotidsequenz
einkapseln, in den Wirt umfasst.
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Der
Ausdruck "humorale
Immunantwort" betrifft
so, wie der Fachmann ihn versteht, jede Immunantwort, die keine
zelluläre
Immunantwort ist, einschließlich
der Produktion von Antikörpern,
der Produktion verschiedener Wachstumsfaktoren, der Aktivierung
von B-Zellen, der Aktivierung von T-Helferzellen usw.
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Der
Ausdruck "Peptid" soll irgendein Expressionsprodukt
der eingekapselten Nucleinsäure
bedeuten.
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Der
Ausdruck "Nucleinsäuresequenz" bezieht sich auf
jede Nucleotidsequenz, die ein Peptid codiert, einschließlich doppel-
oder einzelsträngiger
DNA, RNA oder eines DNA/RNA-Hybrids, wie es jeweils im Folgenden
ausführlich
dargestellt ist.
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Der
Ausdruck "nichtkationische
Liposomen" betrifft
Liposomen, die entweder neutral sind oder eine negative Ladung haben.
Die Merkmale solcher Liposomen und Beispiele dafür sind im Folgenden beschrieben. In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Liposomen größer als
200 nm. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind diese Liposomen
multilamellare Liposomen.
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Der
Ausdruck "Wirt" gemäß der Erfindung
bezieht sich auf den Empfänger
der ein Nucleotid einkapselnden Liposomenzusammensetzung, bei dem
es sich um einen beliebigen Vertebraten, vorzugsweise einen Säuger, handeln
kann.
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Gemäß diesem
Aspekt der Erfindung können
die nichtkationischen Liposomen, die die Nucleotidsequenz einkapseln,
dem Wirt durch eines der Verfahren verabreicht werden, die in der
Technik bekannt sind, einschließlich
intramuskulärer
(i.m.), subkutaner (s.c.), intradermaler (i.d.), intraperitonealer
(i.p.), intravenöser (i.v.)
Verabreichung usw. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Liposomen,
die die Nucleotidsequenz einkapseln, i.m. oder i.v., am meisten
bevorzugt i.v., injiziert.
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In
einer Ausführungsform
dieses Aspekts gibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Produktion von Antikörpern
in einem Wirt gegen ein von einer Nucleotidsequenz codiertes Peptid
an, das das Verabreichen von nichtkationischen Liposomen, die die
Nucleotidsequenz einkapseln, an den Wirt umfasst.
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In
einer Ausführungsform
dieses Aspekts der Erfindung werden die nichtkationischen Liposomen,
die die Nucleotidsequenz einkapseln, intravenös (i.v.) oder intramuskulär (i.m.),
vorzugsweise i.v., in den Wirt verabreicht.
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Außerdem stellt
die vorliegende Erfindung nichtkationische Liposomen, die eine Nucleotidsequenz einkapseln,
für die
Herstellung einer Zusammensetzung zum Hervorrufen einer humoralen
Immunantwort in einem Wirt bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der humoralen Immunantwort um die Produktion
von Antikörpern,
die gegen ein von der Nucleotidsequenz codiertes Antigen gerichtet
sind.
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Gemäß einem
anderen ihrer Aspekte gibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Zielsteuerung einer einem Wirt verabreichten Nucleinsäuresequenz
zur Milz des Wirts an, das das Einkapseln der Sequenz in einem nichtkationischen
Liposom und das intravenöse
(i.v.) Verabreichen des die Nucleotidsequenz einkapselnden Liposoms
an den Wirt umfasst.
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Der
Ausdruck "Zielsteuerung" gemäß der Erfindung
soll die Lenkung der Liposomen, die die an den Wirt verabreichte
Nucleotidsequenz einkapseln, aus dem Blut zu einem Organ bedeuten,
was zu einer hochspezifischen Aktivität des von der eingekapselten
Sequenz codierten Peptids in dem Organ im Vergleich zu der spezifischen
Aktivität
desselben Peptids in einem anderen Organ des Wirts führt.
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Der
Ausdruck "spezifische
Aktivität" in Bezug auf ein
Peptid soll das Expressionsniveau des Peptids/mg Gesamtproteingehalt
in dem Gewebe bedeuten.
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Die
Erfindung stellt weiterhin nichtkationische Liposomen, die eine
Nucleotidsequenz einkapseln, für die
Herstellung einer i.v. Zusammensetzung zur Zielsteuerung der Nucleinsäure in die
Milz eines Wirts bereit.
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Die
Erfindung stellt auch eine i.v. Zusammensetzung bereit, die nichtkationische
Liposomen, die eine Nucleinsäuresequenz
einkapseln, als Hauptwirkstoff und einen i.v. annehmbaren Träger umfasst.
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Weiterhin
führt die
Zielsteuerung der Liposomen in die Milz des Wirts gemäß der vorliegenden
Erfindung zur Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen ein Peptid, das
von der eingekapselten Sequenz codiert wird, durch die Milzzellen
des Wirts.
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In
einem zusätzlichen
Aspekt gibt die vorliegende Erfindung also ein Verfahren zur Produktion
von monoklonalen Antikörpern
gegen ein gewünschtes
Antigen an, das das intravenöse
Verabreichen einer Zusammensetzung, die nichtkationische Liposomen
umfasst, welche eine das Antigen codierende Nucleotidsequenz einkapseln,
in einen Wirt, das Gewinnen von Milzzellen aus dem Wirt, das Herstellen
einer Zelllinie aus den Milzzellen und das Gewinnen von Antikörpern, die
von der Zelllinie produziert werden, umfasst.
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In
einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung nichtkationische
Liposomen, die eine Nucleotidsequenz einkapseln, für die Herstellung
einer i.v. Zusammensetzung zur Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen
ein von der Nucleotidsequenz codiertes Antigen bereit.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung hat sich gezeigt, dass die Verabreichung von nichtkationischen
Liposomen, die neutral sind oder eine negative Ladung haben und
kein virales Peptid enthalten und eine Nucleotidsequenz einkapseln,
welche ein gewünschtes
Peptid codiert, an einen Wirt zur Expression der Nucleotidsequenz
in dem Wirt, an den verabreicht wurde, führt und schließlich eine
humorale Immunantwort gegen das Expressionsprodukt der Sequenz hervorruft.
Die gemäß der Erfindung
verwendeten nichtkationischen Liposomen können kommerziell hergestellt
und aufgrund ihrer nichttoxischen Natur in relativ hohen Konzentrationen
an den Wirt verabreicht werden.
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Die
Zielsteuerung einer Sequenz oder eines Peptids zu einem spezifischen
Organ erfordert gewöhnlich
die Verwendung einer Zielsteuerungs- oder Lenkungs-Struktureinheit,
die eine hohe Affinität
zu einem Zielorgan hat und somit die Sequenz oder das Peptid an
das spezifische Organ abgibt. Gemäß der Erfindung führt die
Verabreichung von nichtkationischen Liposomen, die eine gewünschte Nucleotidsequenz
umfassen, in einen Wirt zur Expression der codierten Sequenz hauptsächlich in
der Milz des Wirts, ohne dass es notwendig ist, das Liposom an einen
organspezifischen Lenkungs- oder Zielsteuerungsliganden, wie ein
Peptid, einen monoklonalen Antikörper,
Zucker, Glycolipid oder Protein, zu koppeln. Die Zielsteuerung der
gewünschten
Sequenz in die Milz führt
zur Expression des Nucleotids mit einer hohen spezifischen Aktivität des Peptids
in den angesteuerten Milzzellen im Vergleich zur spezifischen Aktivität des codierten
Peptids in den Zellen anderer Wirtsorgane. Außerdem führen diese spezifische Zielsteuerung
der Liposomen in die Milz und die Expression der Nucleinsäuresequenz
innerhalb der Milzzellen zur Produktion von Antikörpern gegen
das von der injizierten Sequenz codierte Peptid. Im Hinblick auf
die Tatsache, dass die nichtkationischen Liposomen nichttoxisch sind,
ist es möglich,
eine große
Menge der DNA-einkapselnden
Liposomen zu injizieren, so dass die Antikörperproduktion gegen Antigene,
die von der injizierten Sequenz codiert werden, in dem Wirt erhöht wird.
Außerdem
können
solche Milzen infolge der Antikörperproduktion
in der Milz gegen das injizierte DNA-Sequenzprodukt bei der Herstellung
von monoklonalen Antikörpern
gegen die injizierte DNA-Sequenz verwendet werden.
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Die
Nucleotidsequenz der Erfindung ist eine antigencodierende Sequenz,
wie ein doppel- oder einzelsträngiges
DNA-Molekül,
das in einen Genexpressionsvektor, vorzugsweise einen viralen oder
bakteriellen Plasmid-Genexpressionsvektor, eingefügt werden
kann, ein RNA-Molekül
oder ein Molekül,
das sowohl aus Ribonucleotiden als auch aus Desoxyribonucleotiden
besteht (RNA/DNA-Hybrid). Die Insertion der Nucleotidsequenz in
den Expressionsvektor kann durch ein beliebiges, in der Technik
bekanntes Verfahren erfolgen. Der Genexpressionsvektor kann auch
irgendwelche zusätzlichen
regulatorischen Sequenzen umfassen, die für die Expression des von der
Nucleotidsequenz codierten Peptids erforderlich sind, wie Promotorsequenzen,
Erkennungssequenzen, Sekretionssequenzen und Enhancer, die alle
leicht vom Fachmann auszuwählen
sind.
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Gemäß der Erfindung
kann die Nucleotidsequenz für
mehr als ein Antigen codieren, gegen das eine Immunreaktion des
Wirts hervorgerufen wird. In einigen Fällen kann das zusätzliche
Antigen eine immunstimulierende Sequenz sein, die die Immunreaktion
gegen das gewünschte
Antigen weiter verstärken
kann.
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Die
Nucleotidsequenz der Erfindung kann durch eines der in der Technik
bekannten Verfahren erhalten werden und kann aus einer beliebigen
Polynucleotidsequenz eines beliebigen Organismus isoliert oder chemisch
synthetisiert werden.
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Die
Polynucleinsäure
ist typischerweise im wässrigen
Innenraum des Liposoms eingekapselt.
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Die
gemäß der Erfindung
verwendeten Liposomen sind nichtkationische Liposomen, die entweder neutral
sind oder eine negative Ladung haben und keine viralen Proteine
enthalten. Obwohl die Liposomen eine Vielzahl von Größen haben
können,
haben sie gemäß der Erfindung
vorzugsweise einen Durchmesser von mehr als 200 nm. Die meisten
Typen von Liposomen gehören
zu einem der folgenden drei Typen: multilamellaren Vesikeln (MLV),
kleinen unilamellaren Vesikeln (SUV) und großen unilamellaren Vesikeln
(LUV). MLVs bilden sich typischerweise spontan bei der Hydratisierung
von getrockneten Phospholipiden. SUVs können durch Ultraschallbehandlung
aus MLVs gebildet werden, und im Unterschied zu der mehrschichtigen, "zwiebelartigen" Struktur von MLVs
sind sie einschichtig. SUVs sind kleine mit einem hohen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen
und haben somit das kleinste Einfangvolumen von wässrigem
Raum pro Gewicht des Lipids.
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Im
Unterschied zu SUVs haben LUVs ein großes wässriges Kompartiment und eine
einzige oder zuweilen wenige Lipidschichten.
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Gemäß der Erfindung
kann jedes der obigen Liposomen verwendet werden, wobei multilamellare
Liposomen bevorzugt sind.
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Die
Liposomen können
aus einer Vielzahl von Lipiden einschließlich Phospholipiden, Glycolipiden, Cholesterin
usw. bestehen. Vorzugsweise bilden die Phospholipide einen Hauptbestandteil
in den Liposomenmembranen. Bevorzugte Phospholipide sind Lecithine
(auch als Phosphatidylcholine bekannt), bei denen es sich um Gemische
von Diglyceriden von Stearin-, Palmitin- und Ölsäure handelt, die mit dem Cholinester
von Phosphorsäure
verknüpft
sind. Lecithine finden sich in Tieren und Pflanzen und sind aus
diesen erhältlich.
Bevorzugte Quellen von Lecithinen sind Eier, Sojabohnen, tierische
Gewebe, wie Hirn, Herz und dergleichen. Lecithine können auch
synthetisch hergestellt werden. Der Fachmann wird sich zweifellos
darüber
im Klaren sein, dass die Quelle des Phospholipids für die vorliegende
Erfindung unwesentlich ist, und jedes Phospholipid ist gleichermaßen geeignet.
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Beispiele
für spezifische
Phosphatide sind Phosphatidylglycerin, Phosphatidylethanolamin,
L-α-(Distearoyl)lecithin,
L-α-(Dipalmitoyl)lecithin,
L-α-Phosphatidsäure, L-α-(Dilauroyl)phosphatidinsäure, L-α-(Dimyristoyl)phosphatidinsäure, L-α-(Dioleoyl)phosphatidinsäure, DL-α-(Dipalmitoyl)phosphatidinsäure, L-α-(Distearoyl)phosphatidinsäure und
die verschiedenen Typen von L-α-Phosphatidylcholinen,
die aus Hirn, Leber, Eidotter, Herz, Sojabohnen und dergleichen
oder synthetisch hergestellt werden, sowie Salze davon. Weitere geeignete
Modifikationen beinhalten die kontrollierte Peroxidierung der Fettacylrest-Vernetzer
in den Phosphatidylcholinen (PC) und die zwitterionischen Amphiphate,
die für
sich, oder wenn sie mit den PCs, wie Alkylanaloga von PC, gemischt
werden, Micellen bilden.
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Außer Phospholipiden
können
die Liposomen auch verschiedene andere lipophile oder amphiphile Moleküle umfassen.
Die Zusammensetzung der Lipidmembran kann für eine Vielzahl von spezifischen
Verwendungen maßgeschneidert
werden, um eine bestimmte Stabilität, Größe, Verteilung usw. zu erhalten.
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Die
Lipide und die anderen lipophilen oder amphiphilen Moleküle bilden
zusammen etwa 1–30%
(w/v) des Volumens der Zusammensetzung, vorzugsweise etwa 10%. Neben
den oben genannten Bestandteilen der Zusammensetzung kann die Zusammensetzung
auch verschiedene Konservierungsmittel und Antioxidantien umfassen.
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Die
Zusammensetzungen sind vorzugsweise dehydratisierte-rehydratisierte
Vesikel (DRV). DRVs werden durch Rehydratisierung einer dehydratisierten
Zusammensetzung hergestellt, die bei Zugabe von Wasser spontan die
Zusammensetzung der Erfindung bildet. DRVs können auf vielerlei Weise hergestellt
werden. Beispielsweise wird zuerst ein Gemisch hergestellt, das
aus SUVs und dem Polynucleinsäuremolekül besteht.
Dann wird das Gemisch auf einen Wassergehalt von weniger als 2%
lyophilisiert. Die Rekonstitution ist typischerweise ein mehrstufiges
Verfahren, wobei der erste Schritt eine Rehydratisierung mit kleinem
Volumen ist, d.h. eine Rehydratisierung mit einem Volumen einer
wässrigen
Lösung
(bei der es sich um Wasser oder vorzugsweise eine wässrige Lösung handeln
kann, die Salze (z.B. NaCl) oder andere gelöste Stoffe (z.B. Zucker) umfasst,
so dass man Isotonie mit Körperflüssigkeiten
erhält,
d.h. eine Osmolarität
von etwa 300 mOsm) von etwa einem Drittel oder weniger des endgültigen Wasservolumens.
Wie oben angemerkt, umfassen die Zusammensetzungen zur Verwendung
in der Erfindung im ersten Hydratisierungsschritt typischerweise
auf einer Gewicht-pro-Volumen-Basis etwa 10% Lipide und ein geringes
Volumen der wässrigen
Lösung.
Der zweite Hydratisierungsschritt ist typischerweise die Zugabe
von Wasser, so dass man eine Konzentration von Lipiden von etwa
30% (w/v) erhält.
Dann wird weiter allmählich
wässrige
Lösung
hinzugefügt,
bis das Endvolumen erreicht ist.
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Die
für die
Verabreichung an einen Wirt hergestellte Liposomenzusammensetzung
wird vorzugsweise auf eine physiologisch annehmbare Salzkonzentration
(wie zum Beispiel 150 mM NaCl) eingestellt.
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Bei
einer anderen beispielhaften Methode können DRVs hergestellt werden,
indem man die Bestandteile der Zusammensetzung mit einer Lösung von tertiärem Alkohol
(z.B. tert-Butanol) in Wasser mischt, wobei die Alkoholkonzentration
im Bereich von etwa 10–30%
liegt. Die Konzentration des Alkohols korreliert typischerweise
mit der Hydrophobie der Lipidbestandteile, wobei eine höhere Hydrophobie
eine höhere
Alkoholkonzentration erfordert. Dann wird das Gemisch lyophilisiert,
und da Alkohol flüchtiger
ist als Wasser, erfolgt die Lyophilisierung schneller als bei einer
Lösung,
die nur Wasser umfasst. Die Rehydratisierung wird in ähnlicher
Weise durchgeführt,
wie es oben beschrieben ist.
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Die
Art der Herstellung von Liposomen und ihre Anpassung an ein spezielles
Bedürfnis
ist dem Fachmann allgemein bekannt und liegt außerhalb des Umfangs der vorliegenden
Schrift. Nichteinschränkende
Beispiele für
Verfahren zur Herstellung von Liposomen, wie die oben genannten,
sind Umkehrphasenverdampfung (RPE) (Kameda et al., loc. cit.) oder
die Protein-Cochleat-Technik (Gould-Fagerite et al., loc. cit.).
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Das
gewünschte
Antigen, das von der eingekapselten Nucleotidsequenz codiert wird
und gegen das eine Immunantwort hervorgerufen wird, kann ein beliebiges
Peptid oder Protein sein, wie zum Beispiel humaner Faktor VIII.
Sofern die humorale Immunantwort zur Produktion von Antikörpern führt (wie
im bevorzugten Fall), können
diese Antikörper,
die gegen das von der eingekapselten Nucleotidsequenz codierte Peptid
erzeugt wurden, zu jeder der Antikörperklassen IgG, IgM, IgA,
IgE oder IgD gehören.
Die gegen das exprimierte Nucleinsäureprodukt hervorgerufene Immunantwort
kann nach einem der in der Technik bekannten Verfahren, wie ELISA,
RIA usw., gemessen werden.
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Die
Dosierung des Expressionsvektors, der die innerhalb des Liposoms
eingekapselte Nucleotidsequenz umfasst, variiert je nach der gewünschten
Antwort des Wirts und dem verwendeten antigenen Nucleotid. Die Dosierung
muss ausreichend sein, um eine Expression des von der Nucleotidsequenz
codierten antigenen Peptids auf einem Niveau zu verursachen, das
ausreicht, um die gewünschte
Immunreaktion zu induzieren.
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Gemäß der Erfindung
können
monoklonale Antikörper
(moAbs) unter Verwendung jeder Technik hergestellt werden, die für die Produktion
von Antikörpermolekülen durch
kontinuierliche Zelllinien in Kultur sorgt. Dazu gehören unter
anderem die Hybridomtechnik, die ursprünglich von Koehler und Milstein
beschrieben wurde (Nature 256: 495–497 (1975)), die Human-B-Zell-Hybridom-Technik
(Kosbor et al., Immunol. Today 4: 72 (1983); Cote et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 80: 2026–2030
(1983)) und die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al., Mol. Cell Biol.
62: 109–120
(1984)). Wie man in den folgenden Beispielen sieht, führt die
Verwendung von Milzzellen aus Milzen von Wirten, denen die Nucleotideinkapselnden
Liposomen der Erfindung i.v. injiziert wurden, zur Produktion von
moAbs gegen das Antigen, das durch die injizierte Nucleotidsequenz
codiert wird.
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Die
Erfindung wird nun anhand der folgenden nichteinschränkenden
Beispiele erläutert.
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Beispiele
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Materialien und Verfahren
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- 1. Die für
die Injektion von Liposomen verwendeten Mäuse waren:
In den Beispielen
1 und 2 wurden hämophile
Mäuse (Bi,
L. et al. (1995), Nature Genetics 10: 119–121) verwendet. In Beispiel
3 wurden BALB/c-Mäuse verwendet.
In Beispiel 4 wurden C57/bl-Mäuse
verwendet.
- 2. Expressionsvektoren:
Faktor-VIII-Expressionsvektor pCI-FVIII-PRE
(Beispiele 1 und 2):
Dieses Plasmid wurde in zwei Stufen aufgebaut:
- 1) pCI-FVIII ist das pCI-Plasmid (Promega), das humane FVIII-cDNA
enthält,
die FVIII-Protein mit einer Deletion von 894 Aminosäuren seiner
B-Domäne (Aminosäuren 746-1639)
codiert.
- 2) pCI-FVIII-PRE wurde durch die Einfügung des posttranscriptionalen
regulatorischen Elements (PRE) des Hepatitis-B-Virus (Huang et al.,
1994, 1995) in die NotI- und SalI-Stelle im pCI-FVIII-Plasmid aufgebaut.
Luciferase-Expressionsvektor
pCI-luc-PRE (Beispiele 3 und 4):
Dieses Plasmid wurde in zwei
Stufen aufgebaut:
- 1) Aufbau von pCI-luc durch die Einfügung des Leuchtkäfer-Luciferase-Gens
(XhoI-XbaI-Fragment von pGL3-basic (Promega, Madison, WI, USA))
in die XhoI- und XbaI-Stelle im pCI-Plasmid (Promega).
- 2) Aufbau von pCI-luc-PRE durch die Einfügung des posttranscriptionalen
regulatorischen Elements (PRE) des Hepatitis-B-Virus (Huang et al.,
1994, 1995) in die NotI- und SalI-Stelle im pCI-luc-Plasmid.
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Das
Plasmid pSec-Tag2 (Invitrogen, USA) enthält den CMV-Promotor, das murine
Ig-Kappa-Kette-V-J2-C-Signalpeptid, eine multiple Klonierungsstelle,
Polyhistidin-tag-cDNA, c-myc-Epitop-cDNA und eine BGH-Polyadenylierungssequenz.
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Das
Plasmid pSATag2 (Invitrogen) enthält den CMV-Promotor, das murine
Ig-Kappa-Kette-V-J2-C-Signalpeptid, Prostata-spezifisches-Antigen(PSA)-cDNA,
Polyhistidin-tag-cDNA, c-myc-Epitop-cDNA und eine BGH-Polyadenylierungssequenz.
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3. Liposomenherstellung (alle Beispiele):
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Liposomen
wurden wie folgt hergestellt: Zur Herstellung von 1 g Liposomen,
die aus EPC (Lipoid KG, Ludwigshafen, Deutschland) und DMPG (Sygena
AG, Liestal, Schweiz) zusammengesetzt sind, wurde eine tert-Butanol-Lösung von
EPC und DMPG hergestellt, indem man 0,9086 g EPC und 0,0914 g DMPG
in 10 ml tert-Butanol
(Riedel-de Haen, Seelze, Deutschland) und 1 ml H2O
löste.
Das Gemisch wurde mit Plasmid-DNA gemischt, in einem Verhältnis von
100:1 (w/w) Lipide zu DNA in H2O gelöst und dann
gefriergetrocknet. Vor der Verwendung wurden die trockenen Lipide
und DNA in zwei Stufen hydratisiert. Zuerst wurde H2O
zu 30% DNA (v/w) [sollte dies w/v heißen?] gegeben, und das Gemisch
wurde geschüttelt,
bis eine homogene Lösung erhalten
wurde. Dann wurde die Lösung
unter Verwendung von 200 mM NaCl auf 150 mM NaCl eingestellt und
durch 15-μm-Filter filtriert,
um große
Aggregate aus der Lösung
zu entfernen. Zur Herstellung von Liposomen, die nur aus EPC bestehen,
wurden ähnliche
Verfahren verwendet, ohne DMPG hinzuzufügen. Liposomen, die EPC:DOPE:DOTAP
[DOTP [sollte dies DOTAP heißen?]
= 1,2-Dioleoyloxy-3-(trimethylammonium)propan (Avanti Polar Lipids
Inc.)] (Stoffmengenverhältnis
4:2:1) umfassen, wurden so hergestellt, wie es oben beschrieben
ist.
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[Diese Abkürzungen sollten definiert werden].
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Um
Liposomen reduzierter Größe zu erhalten,
wurde die Liposomenlösung
in einer LipoFast-Large-Apparatur (Avestin Inc., Ottawa, ON, Kanada)
durch 0,2- und 0,1-μm-Polycarbonatfilter
filtriert, wobei Liposomen von 150–200 μm entstanden.
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4. Messung von Anti-FVIII-Antikörpern (Beispiel
1):
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Die
Messung von Anti-FVIII-Antikörpern
in Mausplasma wurde mit Hilfe des Bethesda-Assay durchgeführt, wie
er in Practical Haematology, Sir John V. Dacie und S.M. Lewis, siebte
Auflage (1991), S. 312–313, beschrieben
ist. Der Titer der Antikörper
ist in Bethesda-Einheiten (BU) angegeben.
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5. Messung der Luciferase-Aktivität (Beispiele
3 und 4):
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Die
Extraktion von Luciferase aus Organen wurde wie folgt durchgeführt: Die
gesammelten Organe wurden in flüssigem
Stickstoff schnell eingefroren und zu einem feinen Pulver pulverisiert.
100 mg Gewebepulver wurden mit Zellkulturlysereagens (jeweils 500 μl, Promega)
homogenisiert. Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden
die Proben dreimal gefrieren gelassen und wieder aufgetaut und dann
kurz zentrifugiert, um Zelltrümmer
zu entfernen. Der Überstand
wurde aufgefangen und bis zur Verwendung bei –78 °C aufbewahrt. Die Luciferase-Aktivität in 20 μl Lysat wurde
durch die Zugabe von 100 μl
Luciferase-Assay-Reagens (Promega)
mit Hilfe eines Luminometers (TD-20/20, Turner Designs, USA) bestimmt.
Relative Lichteinheiten wurden gemäß einer Eichkurve, die auf
rekombinanter Luciferase (Promega) als Standard beruht, in Picogramm
Luciferase umgerechnet. Die Proteinkonzentration des Lysats wurde
mit dem BCA-Protein-Assay-Kit (Pierce,
Rockfords, IL, USA) ebenfalls bestimmt.
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Messung
des Titers von Maus-Anti-PSA- und -Anti-6x-Histidin-Antikörpern: Der
Titer von Maus-Anti-PSA- und Anti-6x-Histidin-Antikörpern wurde
durch spezifischen ELISA (enzyme-linked immunoabsorbent assay) gemessen.
PSA-Protein oder 6x-Histidinpeptid (synthetisiert von Sigma, UK)
wurden verwendet, um hochbindende Platten (Corning, USA) zu beschichten.
Dann wurden Maus-Serumproben
hinzugefügt
und 1 Stunde lang bei 22–25 °C inkubiert.
Gebundene Maus-Antikörper
wurden mit an Alkalische Phosphatase konjugiertem monoklonalem Anti-Maus-IgG-Antikörper (Sigma,
USA) und p-Nitrophenylphosphat (Sigma, USA) nachgewiesen. Kommerzielle
monoklonale Antikörper
gegen 6x-Histidin
(Invitrogen, USA) und PSA (Santa Cruz Biotechnology, USA) wurden
verwendet, um eine Eichkurve aufzutragen.
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Beispiel 1
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BALB/c-
und hämophilen
Mäusen
wurden 500 μl
Liposomen injiziert, die den Human-Faktor-VIII-Expressionsvektor
pCI-FVIII-PRE enthielten. Einer zweiten Gruppe von Mäusen wurden
10 Einheiten rekombinanter FVIII (rFVIII) (Kogenate-FS, Bager) injiziert,
und 500 μl
Liposomen, die nur den Luciferase-Expressionsvektor enthielten, wurden
einer Gruppe von Mäusen
als Kontrolle injiziert. Den Mäusen
wurde zweiundzwanzig Tage nach der Injektion Blut entnommen, und
der Titer der Antikörper
gegen humanes FVIII wurde gemessen. Die Ergebnisse zeigten an, dass
in den Mäusen,
die das eingekapselte FVIII erhielten, ein hoher Titer (200–500 BU/ml)
von Anti-Human-FVIII-Antikörpern
produziert wurde. Eine zweite Injektion von Liposomen, die FVIII enthielten.
Kontrollgruppen von Mäusen,
die Injektionen von nicht eingekapseltem rFVIII-Protein oder Liposomen-eingekapseltem
Luciferase-Expressionsvektor erhielten, produzierten keine Anti-Human-FVIII-Antikörper. Eine
zweite Injektion von Liposomen, die FVIII-Expressionsvektor enthielten,
erhöhten
den Antikörpertiter.
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Wie
unten in Tabelle 1 zu sehen ist, war die Produktion von Anti-FVIII-Antikörpern nach
der i.v. Injektion von Liposomen-eingekapselter DNA hoch im Vergleich
zur nicht nachweisbaren Produktion von Anti-FVIII-Antikörpern in
Mäusen,
denen rekombinanter humaner Faktor VIII allein oder mit Kontrollliposomen,
die den Luciferase-Expressionsvektor einkapseln, injiziert wurde.
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Tabelle
1 Produktion
von Anti-FVIII-Antikörpern
nach der Injektion von Liposomen-eingekapselter DNA in Mäuse
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Beispiel 2: Produktion von monoklonalen
Antikörpern
gegen humanen FVIII
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Faktor-VIII-Expressionsvektor
(pCI-FVIII-PRE) wurde so, wie es oben beschrieben ist, in EPC-DMPG-Liposomen
(700 nm) eingekapselt und intravenös in hämophile Mäuse injiziert (500 μl). Einundzwanzig
Tage später
erhielten die Mäuse
eine zweite Injektion von in EPC-DMPG-Liposomen eingekapseltem pCI-FVIII-PRE. Zweiundvierzig
Tage nach der ersten Injektion wurde den Mäusen Blut entnommen, und der Titer
von Anti-FVIII-Antikörpern
wurde mit einem Bethesda-Assay und ELISA gemessen. Mäuse mit
einem hohen Titer von Anti-FVIII-Antikörpern (> 100 Bethesda-Einheiten)
wurden für
die Isolierung von Milzzellen und Fusionieren zu einem Hybridom
ausgewählt.
Fünfzig
Kolonien von Hybridomzellen wurden isoliert. Ein ELISA-Assay zeigte
an, dass jede der Kolonien gegen humanes FVIII gerichtete monoklonale
Antikörper
sezernierte.
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Beispiel 3
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EPC-DMPG-Liposomen
mit einem Durchmesser von 800 oder 160 nm, die den Luciferase-Expressionsvektor
einkapselten, wurden Mäusen,
die gefüttert
oder hungern gelassen wurden, verabreicht. Die Luciferase-Aktivität wurde
so, wie es oben beschrieben ist, in verschiedenen Organen bestimmt,
die von den Mäusen
einen Tag nach der Verabreichung der Luciferase-einkapselnden Liposomen
erhalten wurden.
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Wie
man in Tabelle 2 erkennt, befand sich das höchste beobachtete Expressionsniveau,
das anhand der Luciferase-Aktivität nachgewiesen wurde, in der
Milz von gefütterten
Mäusen
nach der Verabreichung der großen
EPC-DPMG-Liposomen.
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Beispiel 4
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Verschiedene
Arten von Liposomen, die den Luciferase-Expressionsvektor einkapseln
und die wie oben hergestellt wurden, wurden Mäusen intramuskulär (i.m.)
injiziert. Einen Tag nach der Injektion der Liposomen wurde die
Luciferase-Aktivität
bestimmt und mit der Luciferase-Aktivität bei Mäusen verglichen, den nur der
nackte Luciferase-DNA-Vektor injiziert wurde.
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Wie
man unten in Tabelle 3 erkennt, wurde eine hohe Luciferase-Aktivität bei Mäusen beobachtet,
denen der in nichtkationischen EPC- und DMPG-Liposomen eingekapselte
Luciferase-Expressionsvektor gemäß der Erfindung
injiziert wurde, im Vergleich zu einer sehr geringen Luciferase-Aktivität bei Mäusen, denen
die kationischen EPC:DOPE:DOTAP-Liposomen oder nackte DNA Injiziert
wurde.
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Beispiel 5
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Titer
von Antikörpern
nach der Injektion von Liposomen-eingekapselten Expressionsvektoren
oder nackten Expressionsvektoren in Mäuse: Vier Gruppen von 5 Mäusen (Bal/c)
wurde i.m. oder i.v. die nackten oder Liposomen-eingekapselten Expressionsvektoren
pSecTag oder pPSATag injiziert, und einer fünften Kontrollgruppe wurde
PBS injiziert. Eine zweite Dosis wurde 25 Tage nach der Injektion
und 51 Tage nach der Injektion injiziert. Den Mäusen wurde Blut entnommen,
und die Titer der Antikörper
gegen PSA und 6x-Histidin wurden gemäß einer Eichkurve von kommerziellen
monoklonalen Antikörpern
gemessen.
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Wie
in Tabelle 4 gezeigt ist, war der Titer der Antikörper gegen
PSA bei Mäusen,
denen die Liposomen-eingekapselten Expressionsvektoren injiziert
wurden, etwa 110-mal so groß wie
bei den Mäusen,
denen die nackten Expressionsvektoren i.m. injiziert wurden. Außerdem waren
die Titer der Antikörper
gegen 6x-Histidin bei Mäusen,
denen Liposomen-eingekapselte Expressionsvektoren beider Typen (PSecTags
und pPSATags) injiziert wurden, signifikant höher als bei Mäusen, denen
die nackten Expressionsvektoren injiziert wurden. Da der Unterschied
im Antikörpertiter
unter Verwendung von zwei Expressionsvektoren und zwei verschiedenen
Antigenen nachgewiesen wurde, kann geschlossen werden, dass die
Impfung von Mäusen
mit der Liposomen-eingekapselten DNA der Erfindung erheblich effizienter
ist als die Impfung durch Injektion nackter DNA.
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Außerdem weisen
die Ergebnisse darauf hin, dass Mäuse, denen Liposomen-eingekapseltes pSecTags
injiziert wurde, Antikörper
gegen 6x-Histidin produzierten. Mäuse, denen der Liposomen-eingekapselte pPSATags-Expressionsvektor
injiziert wurde, produzierten Antikörper gegen PSA und auch Antikörper gegen 6x-Histidin.
Dies weist darauf hin, dass die Anwesenheit der Tags am C-Terminus eines Fusionsproteins
die Produktion von Antikörpern
gegen das Protein am N-Terminus nicht stört. Daher zeigt die Anwesenheit
von Anti-Tag-Antikörpern eine
Induktion einer humoralen Immunantwort gegen das fusionierte Protein
und eine hohe Wahrscheinlichkeit einer Antikörperproduktion gegen das N-terminale
Protein an. Dieses Ergebnis kann als Verfahren zum Identifizieren
von Mäusen
verwendet werden, die Antikörper
gegen irgendein unbekanntes Protein produzieren, dessen cDNA in
einem geeigneten Expressionsvektor, der in Liposomen eingekapselt
ist und in Mäuse
injiziert wird, stromaufwärts
der cDNA von Tags kloniert ist.
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- * in gepoolten Serumproben von 5 Mäusen
