DE69926342T2

DE69926342T2 - Lieferung von immunogenen molekülen unter verwendung von hbsag partikeln

Info

Publication number: DE69926342T2
Application number: DE69926342T
Authority: DE
Inventors: Jorg Reimann; Yechezkel Barenholz; Dvorah Diminsky; Reinhold Schirmbeck
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1998-02-03
Filing date: 1999-01-29
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2019-01-30
Also published as: DK1053018T3; AU755957B2; ES2242376T3; CA2319599A1; WO1999039736A3; ATE300312T1; JP4480267B2; EP1053018B1; JP2002502828A; DE69926342D1; WO1999039736A2; EP1053018A2; AU2297399A; CA2319599C

Description

Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines antigenen Moleküls, wie beispielsweise ein antigenes Peptid oder ein Zytokin, das in einem HBsAg-Partikel enthalten ist, zur Zubereitung von pharmazeutischen Zusammensetzungen insbesondere zur Verstärkung der immunogenen Aktivitäten der Komponenten.
Referenzen

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Grundlagen der Erfindung
Herkömmliche Impfstoffe gegen infektiöse Viren oder Mikroorganismen verwenden häufig inaktivierte oder attenuierte lebende Pathogene. Die Nachteile derartiger Impfstoffpräparate umfassen Schwierigkeiten bei der Produktion im Großmaßstab, Sicherheitsüberlegungen bei der Handhabung und die Risiken, die mit der Immunisierung älterer oder immundefizienter Individuen mit attenuierten Lebendimpfstoffen verbunden sind.
Untereinheiten-Impfstoffe, bei denen isolierte Komponenten eines Viruspartikels verwendet sind, sind sicherere Alternativen zu herkömmlichen Impfstoffen. Diese Komponenten sind typischerweise rekombinante Proteine oder kurze synthetische Peptide. Jedoch lösen die meisten Untereinheiten-Impfstoffe, wie die meisten löslichen Antigene, im allgemeinen nur eine humorale Immunreaktion aus, die die B-Lymphozyten stimuliert Antikörper zu bilden. Eine derartige Reaktion ist wirksam, um Bakterien und Viren in den extrazelluären Medien zu attackieren, aber sie sind nicht wirksam bei der Eliminierung intrazellulärer Bakterien, Parasiten und Virus-infizierter Zellen. Für eine maximale Wirksamkeit sollte ein Impfstoff in der Lage sein, eine CTL (cytotoxische T-Lyrnphozyten)-Reaktion auszulösen. Die CTL-Reaktion stimuliert die Produktion von „Killer" T-Lymphozyten, die Zellen attackieren, die als abnormal, einschließlich Virus-infizierter Zellen, erkannt sind.
Die An der Prozessierung und Präsentation eines Antigens bestimmt, welcher T-Zell-Subtyp (Helfer oder cytotoxischer) während der Immunreaktion aktiviert wird. In dem exogenen (Klasse II) Pfad kommen die exogenen Antigene via Endozytose oder einem verwandten Mechanismus in eine Antigen-präsentierende Zelle (APC). Die Proteine unterliegen dann einer Proteolyse, die daraus resultierenden Peptide besitzen 10–20 Aminosäuren, die an MHC-II-Moleküle binden. Die resultierenden Komplexe stimulieren CD4+ (Helfer) T-Zellen, die die humoralen Immunreaktionen regulieren. In dem endogenen (Klasse-I) Pfad werden im Cytoplasma vorhandene Proteine, wie beispielsweise virale Proteine, zu Peptiden mit einer Länge von 8–10 Aminosäuren, die an MHC-I-Moleküle binden, abgebaut. Die resultierenden Komplexe interagieren mit CD8+ (cytotoxischen) T-Lymphozyten (CTL). Wie oben erwähnt, ist die Reaktion besonders zum Schutz gegen Virusinfizierte Zellen oder intrazelluläre Mikroorganismen wichtig.
Demgemäß ist es wünschenswert, immunogene Zusammensetzungen bereitzustellen, die eine wirksame CTL-Immunreaktion hervorrufen, inbesondere zur Verwendung mit löslichen Antigenen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung eines antigenen Moleküls, wie in Anspruch 1 definiert. Die Immunreaktion ist eine CTL-Reaktion und wird vorzugsweise um Faktor 2 zwei oder mehr verstärkt, bezogen auf die von den Molekülen ausgelöste Reaktion, wenn sie ohne HBsAg verabreicht sind. Die Zusammensetzungen sind ebenfalls wirksam, um eine CTL-Reaktion hervorzurufen, wenn das ohne HBsAg verabreichte antigene Molekül im Wesentlichen unwirksam ist, eine derartige Reaktion hervorzurufen.
Das HBsAg Partikel ist vorzugsweise ein rekombinantes Partikel, entweder von Hefe abstammend oder in einer Säugerzelle gebildet, wie beispielsweise in einer CHO (Chinese Hamster Ovary) Zelle. Das verkapselte Molekül ist vorzugsweise ein antigenes Protein oder Peptid. Spezifische Anwendungsformen umfassen solche, in denen das Molekül Ovalbumin oder HIVenv/V3-Peptid ist. In zusätzlichen Anwendungsformen umfasst die Zusammensetzung ein immunstimulierendes Molekül, wie ein Zytokin, das in dem HBsAg-Partikel enthalten ist.
Vorzugsweise ist das immunstimulierende Molekül ein Zytokin, wie IL-12, IL-10 oder IFN-γ; IL-12 und IFN-γ sind besonders bevorzugt. Andere immunstimulierende Moleküle umfassen Choleratoxin (CT)-Protein und Staphylokokken Enterotoxin B (SEB)-Protein.
Die pharmazeutische Zusammensetzung wird vorzugsweise mittels Inkubation der Partikel in einem wässrigen Medium in Gegenwart des Moleküls zubereitet. In einer bevorzugten Anwendungsform ist das Molekül ein Antigen, z. B. HIVenv/K^d Peptid. In anderen bevorzugten Anwendungsformen ist das Molekül eine immunstimulierende Verbindung oder das Partikel kann sowohl ein Antigen als auch ein immunstimulierendes Molekül enthalten.
Die Zusammensetzung kann ebenfalls ein Glykolipid umfassen, das in die äußere Oberfläche der Lipid-Doppelschicht des HBsAg-Partikels eingebettet ist, wobei das Glykolipid vorzugsweise mindestens einen Mannose-Rest umfasst.
Um ein antigenes Molekül in ein HBsAg-Partikel einzubauen, werden die Partikel in einem wässrigen Medium in Gegenwart des Moleküls inkubiert. Die Inkubationstemperatur liegt vorzugsweise zwischen etwa 35°C und etwa 60°C und bevorzugter zwischen etwa 55°C und etwa 60°C. Das Verfahren kann ebenfalls den Einbau eines Glykolipids in die äußere Oberfläche des HBsAg-Partikels umfassen, wobei vorzugsweise das Glykolipid mit den HBsAg-Partikeln und dem biologisch aktiven Molekül co-inkubiert wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen.
1 zeigt ein Computer-generiertes Bild einer kryotransmissionselektronenmikroskopischen Aufnahme eines HBsAg-Partikels, die die Struktur des porösen Lipid-Vesikels mit definierten Proteinporen zeigt;
2 ist ein topographisches Bild eines HBsAg, das durch Bildanalyse einer kryotransmissionselektronenmikroskopischen Aufnahme des Partikels erhalten wurde;
3 zeigt das Verhältnis von Gesamtproteinfläche zur Fläche von 24kD + 27 kD Proteinen, mittels Gelelektrophorese bestimmt, von nur HBsAg und mit Ovalbumin inkubiertem HBsAg, bei einer Reihe ansteigender Temperaturen;
4A zeigt den Level einer anti-HBsAg CTL-Reaktion, die von Zellen induziert ist, die mit nur HBsAg, mit nur OVA und mit in HBsAg verkapseltem OVA stimuliert sind, gegen HBsAg-spezifische Zellen (P815/S) und unspezifische Zellen (P815);
4B zeigt den Level einer anti-OVA CTL-Reaktion, die von Zellen induziert ist, die wie in 4A stimuliert sind, gegen OVA-spezifische Zellen (EG7) und unspezifische Zellen (EL4);
4C zeigt den Level einer anti-HBsAg Antikörper-Reaktion, die von nur HBsAg, nur OVA und in HBsAg verkapseltem OVA induziert ist;
4D zeigt den Level einer anti-OVA Antikörper-Reaktion, die von den in 4C gezeigten Zusammensetzungen induziert ist;
5A zeigt den Level einer anti-HBsAg CTL-Reaktion, die von Zellen induziert ist, die mit nur HBsAg, mit nur HIV envV3-Peptid und in HBsAg verkapseltem HIV envV3-Peptid stimuliert sind, gegen HBsAg-spezifische Zellen (P815/S) und unspezifische Zellen (P815);
5B zeigt den Level einer anti-HIV envV3-Peptid Reaktion, die von Zellen induziert ist, die wie in 5A stimuliert sind, gegen HIV envV3-Peptid-spezifische Zellen (P815/HIV envV3-Peptid) und unspezifische Zellen (P815); und
6A–H zeigt den Level einer anti-HBsAg CTL-Reaktion, die in Zellen von „nichtreagierenden„ Mäusen (C57BL/6 H2-b) von nur HBsAg (A), von HBsAg, das verschiedene Zytokine (B-F) enthält, und von nur IL-12 (G) und von HBsAg/IL-12 in einem Kontrollexperiment (H) induziert sind, in dem die Effektorzellen mit nicht Antigen tragenden Zellen restimuliert waren.
Genaue Beschreibung der Erfindung
1. Hepatitis B Oberflächen-Antigen (HBsAg)
A. Grundlagen
Das Hepatitis B Virus (HBV) ist eine Hauptursache der akuten und chronischen Hepatitis beim Menschen. Während der HBV-Replikation wird ein großer Überschuss (1000:1) an „leeren" Oberflächenpartikeln produziert, die weder Capside noch virale DNA/RNA enthalten. Diese HBsAg (Hepatitis B Oberflächen-Antigen) Partikel sind in Menschen und vielen Tierspezies potente Immunogene.
Die erste Generation von HBV-Untereinheiten-Impfstoffen umfasste HBsAg-Partikel, die aus dem Plasma chronischer menschlicher Träger aufgereinigt wurden. Aufgrund des begrenzten Angebots an Trägerplasmas und schwerwiegender Sicherheitsprobleme wurden Impfstoffe eingeführt, die auf von Hefe (Saccharomyces cerevisiaes) abstammenden rekombinanten HBsAg-Partikeln basieren. Vor kurzem wurde eine dritte Generation rekombinanter HBsAg-Impfstoffe eingeführt, die den von Menschen abstammenden Partikeln besser ähneln. Diese HBsAg-Partikel stammen von kultivierten Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) ab und sind hier als CHO-HBsAg-Partikel bezeichnet.
B. Struktur
Die Zusammensetzung, Struktur und Immunogenität von Hefe- und CHO- abstammenden HBsAg-Partikeln sind beschrieben worden (Diminsky et al.). Die Partikel haben eine Größe von etwa 20–33 nm und sind aus etwa 60 Gew.-% Protein und 40 Gew.-% Lipid zusammengesetzt. Phospholipide sind die vorherrschenden Lipide. Das CHO- abstammende Partikel unterscheidet sich in erster Linie von dem Hefe-abstammenden Partikel darin, dass es drei HBsAg-Oberflächenproteine (jedes in zwei Glycosilierungsformen) umfasst, als Large (L), Medium (M) und small (S) bezeichnet, wobei letzteres nur das nicht-glycosilierte S-Peptid umfasst.
Biochemische Analysen zeigten, dass fast alle (annähernd 85%) Phospholipide der HBsAg-Partikel von Phospholipasen A2 und C hydrolysiert werden und alle Aminophospholipide mit Trinitrobenzolulfonat reagieren (Diminsky). Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass das Partikel kein geschlossenes Vesikel ist, sondern eher in der Form (a) eines Lipoproteins, das eine Einzelschicht aus polaren Lipiden besitzt, die einen Kern aus neutralen Lipiden und Teil des Proteins bedeckt oder (b) eines porösen Vesikels, dessen Poren für obige Reagenzien permeabel sind, vorliegt. Eine Kryotransmissionselektronenmikroskopie (1) bestätigte die letztere Möglichkeit und zeigt bei einer Auflösung von 1 nm ein poröses Vesikel.
Phospholipide bedecken große Bereiche der äußeren und inneren Protein-Komponente des Partikels, aber einige Proteindomänen bilden Schleifen aus der Lipidschicht heraus und sind für Antikörper oder Proteasen zugänglich. Die Partikel sind hohl und umschließen einen Raum von etwa 900–8200 nm³ pro Partikel. Zugang zum Partikelinneren wird durch die Poren vermittelt, die einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 1–2 nm besitzen.
2A und 2B zeigen topographische Bilder von HBsAg-Partikeln, jedes etwa 22 nm im Durchmesser, die mittels Bildanalyse von kryotransmissionselektronenmikro skopischen Aufnahmen von den Partikeln erhalten wurden. (Für eine Übersicht über TEM-Verfahren siehe Talmon, 1996). Derartige Bildanalysen können mit Hilfe von NIH oder Adobe Systems Inc. bereitgestellter Software durchgeführt werden. Regionen höherer Dichte in dem Bild, wie in den 2A und 2B gezeigt, werden höhere Werte entlang der vertikalen (aus der Ebene heraus) Achse zugewiesen. Wie in den Figuren dargestellt, enthält das Zentrum eines jeden Vesikels eine wässrige Phase (hellere Regionen, besitzen kleine nummerische Werte). Proteine (dunkelste Regionen, besitzen hohe nummerische Werte) sind in der Lipid-Doppelschicht (mittelgefärbte Regionen) eingebettet. Poren in der Doppelschicht können deutlich erkannt werden, wie es mit Pfeilen in den Figuren gezeigt ist.
II. Verkapselung von Antigenen in HBsAg-Partikeln.
Es ist festgestellt worden, dass biologisch aktive Moleküle wie antigene Proteine und Peptide oder Zytokine in den hohlen HBsAg-Partikeln aufgrund der oben beschriebenen Poren verkapselt werden können. Die hier verwendeten Ausdrücke wie „verkapselt in" oder „enthalten in" weisen eher auf ein physikalisches Einschließen oder Einfangen der Moleküle als auf eine kovalente Bindung, wie es bei Fusionsproteinen festgestellt wird, was weiter unten diskutiert wird: Dieses Einschließen bezieht sich sowohl auf ein Molekül, das im Innern eines HBsAg-Partikels verkapselt ist, als auch auf ein eingefangenes Molekül, das auf der Oberfläche des Partikels aufgrund dessen poröser Struktur exponiert oder vorhanden ist.
Die resultierenden Zusammensetzungen rufen eine verstärkte Immunreaktion auf die verkapselten antigenen Moleküle hervor. Insbesondere können die Zusammensetzungen eine CTL-Reaktion stimulieren, die bis um Faktor 5, 10 oder mehr verstärkt ist, bezogen auf die Reaktion, die von antigenen Molekülen ausgelöst wird, wenn sie ohne HBsAg verabreicht sind. Eine derartige Verstärkung kann zum Beispiel mittels prozentualer Lyse spezifischer Zellen verglichen mit unspezifischen Kontrollzellen mit Hilfe von Standarduntersuchungen, wie unten beschrieben, bewertet werden. Die Zusammensetzungen können wirksam sein, um eine CTL-Reaktion hervorzurufen, sogar wenn das Molekül ohne HBsAg im Wesentlichen für eine derartige Reaktion unwirksam ist (d. h. geringe oder keine CTL-Reaktion wird in den Zielzellen verglichen mit den Kontrollzellen festgestellt). Wie unten in Abschnitt III beschrieben, verstärkt die Verkapselung von immunstimulierenden Molekülen, wie Zytokine in HBsAg-Partikel, die Immunogenität der HBsAg-Partikel selbst beträchtlich.
Diese Wirkungen werden in den unten beschriebenen Experimenten für ein Protein mit mehreren hundert verschiedenen Aminosäuren (Ovalbumin), für ein kleines antigenes Peptid (HIV/V3, die dritte variable Domäne des HIV gp 120 Hüllproteins) und für mehrere Immunstimulanzien (Zytokine) demonstriert.
Diese Beispiele sind nicht als Einschränkung zu betrachten und die Erfindung umfasst die Verwendung von HBsAg-Zusammensetzungen, die andere artigen aktive Moleküle eingebaut haben. Besonders zweckdienlich sind, wie hier gezeigt, Zusammensetzungen, die artigere oder immunstimulierende Verbindungen eingebaut haben, um eine verstärkte humorale und zelluläre Immunreaktion auszulösen. Spezifische Beispiele für in den Zusammensetzungen zweckdienliche Moleküle umfassen Zytokine, wie IL-6, II-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, GM-CSF und IFN-γ, gentechnisch modifizierte Toxin-Moleküle von Tetanus, Diphtherie, Pertussis und Enterobakterien, Malaria C8-Protein, HIV reverse Transkriptase, Nukleoprotein und Matrixproteine vieler Viren und onkogene virale Proteine.
Es ist wichtig, die Zusammensetzungen, die in HBsAg-Partikel verkapselte Moleküle umfassen, von denjenigen zu unterscheiden, die HBsAg-Antigenfusionspeptide, wie zuvor beschrieben (z.B. Clarke et al., Francis et al., und Delpeyroux et al.,), enthalten. Derartige Zusammensetzungen werden mittels kovalenter Verknüpfung der Peptide, oder noch typischer, über chimäre DNA-Konstrukte hergestellt. Der letztere Versuchsansatz erfordert die Herstellung einer chimären DNA, die das Antigen und das/die gewünschte(n) HBV-Protein(e) exprimierenden Gene enthält, Einführung des fusionierten Konstrukts in ein geeignetes Expressionsvehikel, Expression des Fusionsproteins und Isolierung des Proteins. Delpeyroux et al. berichteten, dass die Titer, die durch Immunisieren der Mäuse mit HBsAg-Polio-Fusionsprotein erhalten waren „gering nach Poliovirus-Standards" waren. Eine Abnahme der Immunreaktion gegen natives HB wurde ebenfalls beobachtet, was wahrscheinlich aus einer Verdrehung der HBsAg-Epitope im Fusionsprotein resultiert. Clarke et al. berichteten von signifikanten anti-FMDV (Maul- und Klauenseuche) Titern für ein FMDV-HBsAg-Fusionsprotein, berichteten aber nicht von einer CTL-Reaktion.
Im Gegensatz dazu werden die hier verwendeten Zusammensetzungen mittels einfacher Inkubation der Komponenten hergestellt, wobei keine kovalente Modifikationen beteiligt sind. Es wurde festgestellt, dass sie signifikant Antikörper und CTL-Reaktionen stimulieren, wie es unten genauer beschrieben ist.
A. Verkapselung von OVA (Ovalbumin) in HBsAg
HBsAg-Partikel wurden in Gegenwart von OVA-Protein (jeweils 100 μg in 100 μl H₂O) bei 4°C (auf Eis), 37°C und 56°C inkubiert. Nach 10 Minuten wurden die Proben auf 4°C abgekühlt und die Partikel mittels Ultrazentrifugation isoliert. In Kontrollexperimenten wurde OVA unter identischen Bedingungen in PBS-Puffer ohne vorhandene HBsAg-Partikel inkubiert und HBsAg-Partikel wurden unter identischen Bedingungen ohne OVA inkubiert. Die nach der Ultrafiltration gesammelten OVA/HBsAg wurden mittels Gelelektrophorese analysiert und das Protein in jeder Bande wurde quantifiziert (Diminsky, Lowry). Da OVA mit der PRE S1 (großes Protein) Bande von HBsAg überlappt, beide besitzen ein MG von annähernd 42 kD, wurde die Analyse mittels Vergleich der Gesamtdichte (39 kD + 42 kD + 45 kD) mit der Dichte der beiden S-Peptide (24 kD + 27 kD) durchgeführt.
Wie in 3 gezeigt, erhöhte sich das Dichte-Verhältnis und folglich das Vorliegen von OVA mit ansteigender Inkubationstemperatur. Diese Wirkung kann an einer effektiven Erweiterung oder gesteigerten Flexibilität der Poren auf der Oberfläche der Partikel mit steigender Temperatur liegen. Quantitative Analysen zeigten etwa 6% OVA-Verkapselung bei 56°C. Wesentlich höhere Inkubationstemperaturen als diese, z. B. annähernd 80°C, sollten vermieden werden, da die Zusammensetzungen bei diesen Temperaturen instabil sind
B1. Induktion einer CTL-Reaktion auf ein in HBsAg-Partikel verkapseltes Molekül: OVA.
Es wurden wie oben beschrieben hergestellte OVA/HBsAg-Partikel isoliert, gewaschen und auf eine geeignete Konzentration für eine Immunisierung eingestellt. Die folgenden Zusammensetzungen wurden F1 (H-2d/b) Mäusen injiziert, jeweils in 50 μl PBS (Phosphat gepufferte Saline): (a) 1 μg HBsAg-Partikel (ohne Adjuvanzien); (b) 100 μg natives OVA; und (c) 1 μg HBsAg/OVA wie in Abschnitt A beschrieben.
Die 4A und 4B zeigen die humorale (Serum-Antikörper) Reaktion beziehungsweise CTL-Reaktion gegen HBsAg und gegen OVA, die mit jeder dieser Zusammensetzungen ausgelöst wurde. Zur Bewertung der CTL-Reaktion wurden Milz- oder Lymphknotenzellen, die von immunisierten Mäusen sieben Tage bis zu fünf Wochen nach Impfung erhalten wurden, in vitro für fünf Tage mit syngenen, bestrahlten OVA- oder HBsAg-Peptid-gepulsten Tumorzellen spezifisch restimuliert. (Die letzteren Zellen sind in vitro mit den rekombinierten HBsAg-Partikeln 2 Stunden bei 37°C inkubiert worden). Diese Zellen wurden geerntet und in einem 4-Stunden cytolytischen ⁵¹CR-Freisetzungstest gegen Antigen-tragende und nicht Antigen-tragende syngene Ziele getestet. Die Lyse der für das HBsAg-S-Protein (P815/S) oder für OVA (EG7) spezifischen Zellen wurde mit unspezifischen Zellen (P815 beziehungsweise EL4) verglichen. Die EG7-Zellen sind EL4-Zellen, die mit einem OVA codierenden Expressionsplasmid stabil transformiert worden sind.
Wie in den Figuren gezeigt, löste Zusammensetzung (a), HBsAg allein, sowohl eine CTL-Reaktion als auch eine humorale Reaktion gegen HBsAg aus. OVA allein löste eine humorale Reaktion, aber keine CTL-Reaktion aus.
HBsAg-verkapseltes OVA, Zusammensetzung (c), löste eine starke anti-HBsAg humorale und CTL-Reaktion und eine schwache anti-OVA humorale Reaktion aus. Sehr bedeutsam ist, dass die Zusammensetzung ebenfalls eine starke anti-OVA CTL-Reaktion auslöste, während mit OVA allein keine beobachtet worden war.
B2. Induktion einer CTL-Reaktion auf HBsAg verkapselte Moleküle: HIVenv/V3 Peptid
In einer ähnlichen Versuchsreihe wurden BALB/c (H-2d) Mäuse mit den folgenden Zusammensetzungen immunisiert: (a) 1 μg HBsAg-Partikel (ohne Adjuvanzien); (b) 100 μg antigenes HIVenv/V3-Peptid; und (c) 1 μg HBsAg, die antigenes HIVenv/V3-Peptid enthalten. Diese Zusammensetzung wurde mittels Co-Inkubation der Komponenten, wie allgemein für OVA oben beschrieben, gebildet. Es wurde geschätzt, dass annähernd 20 ng Peptid pro μg HBsAg-Partikel eingebaut wurde.
Die CTL-Reaktion wurde in spezifischen Zellen (P815/S, wie oben beschrieben für HBsAg und P815/V3-Peptid für HIVenv/V3 Peptid) im Vergleich zu unspezifischen P815-Zellen gemessen. Die Ergebnisse werden in 5 gezeigt.
Wie in der Figur gezeigt, löst sowohl HBsAg allein als auch HBsAg/HIVenv/V3 eine starke anti-HBsAg CTL-Reaktion aus. Darüber hinaus wurde eine starke anti-HIVenv/V3-CTL-Reaktion auf das in den HBsAg überbrachte Peptid (Zusammensetzung (c)) beobachtet, während HIVenv/V3-Peptid allein (Zusammensetzung (b)) keine spezifische CTL-Reaktion auslöste.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Proteine und Peptide zu Antigen-präsentierenden Zellen (APC) von HBsAg-Partikeln zur Prozessierung und Immunogenpräsentation über den Klasse-I Pfad in vivo befördert werden können und folglich die CTL-Vorläufer stimulieren. Die CTL-Reaktion wird sogar für Antigene ausgelöst, die für CTL nicht immunogen sind, wenn sie als native Proteine injiziert sind.
In einer verwandten Anwendungsform dieses Verfahrens kann eine gemeinsame Beförderung von Antigen und Zytokin in HBsAg eingesetzt sein, um den Typ der Immunreaktion zu modulieren, die mittels einer HBsAg/Antigen Formulierung ausgelöst oder verstärkt wurde. Zum Beispiel steuert IL-12 eine Ausrichtung der CD4+ T-Zell-Reaktion in Richtung des Th1-Phänotyps und supprimiert den Th2-Phänotyp. Im Gegensatz dazu supprimiert IL-10 die Reaktion des Th1-Typs und verstärkt die Reaktion des Th2-Typs. Derartige Zusammensetzungen sind zweckdienlich, wenn es erwünscht ist, den pathogenen Phänotyp einer autoimmunen oder allergenen T-Zell-Reaktion zu modulieren. Zum Beispiel ist es häufig bei der Behandlung einer Autoimmunerkrankung eher erwünscht, den Phänotyp der Immunreaktion zu verschieben als die Reaktion vollständig zu unterdrücken.
III. Modulation der CTL-Reaktion von Immunstimulanzien, die in HBsAg-Partikel verkapselt sind.
HBsAg-Partikel ohne Adjuvanzien induzieren eine CTL-Reaktion in H-2^d/L^d+ (BALB/c, C.B-17) Mäusen. Andere Mäusestämme z.B. H-2^d/L^d– (dm2) und H-2^b (C57BL/6) Mäuse wurden allerdings als Nichtreagierende festgestellt (Schirmbeck et al.). Es ist festgestellt worden, dass eine Verkapselung von immunstimulierenden Molekülen, z.B. Zytokine, in HBsAg-Partikel eine CTL-Reaktion selbst in diesen „nichtreagierenden" Stämmen induzieren kann.
HBsAg-Partikel können ebenfalls für eine Übertragung von immunstimulierenden Oligonukleotiden verwendet werden. Eine derartige Zusammensetzung verstärkt die Immunogenität der HBsAg für B-Zellen (d.h. die Antikörper-Reaktion) wie auch für T-Zellen (CTL-Reaktion). Zum Beispiel wurde festgestellt, dass Oligonukleotide, die bestimmte Palindrom-Sequenzen enthalten, IFN induzieren und die NK-Zellaktivität von Milzzellen der Maus verstärken (Yamamoto et al., 1992, 1994). Andere Oligonukleotide sind als Adjuvanzien bei der Induktion der Produktion von Zytokinen, Aktivierung von B-Zellen, Monozyten, dendritischen Zellen und NK-Zellen wirksam gewesen (Weiner; Woolridge).

Um die in 6 gezeigte Daten zu gewinnen, wurden mehrere Zytokine in HBsAg-Partikel entsprechend des oben skizzierten Protokolls für OVA geladen, wobei die Inkubation bei 45°C durchgeführt wurde. Es wurde geschätzt, dass etwa 10 ng Zytokin pro μg HBsAg-Partikel bei dieser Temperatur eingebaut wurde (etwa 1 % Einbau). Gruppen von „nichtreagierenden" Mäusen (H-2⁶; C57BL/6) wurden mit HBsAg-Partikel, mit oder ohne eingebaute Zytokine oder mit Zytokin allein (6G) in den unten gezeigten Mengen immunisiert:

A:	1 μg „nackte" HBsAg-Partikel
BB-F:	1 μg HBsAg/Zytokin, das Zytokin war: (b) IL-12, (c) IFN-γ, (d) IL-2, (e) IL-4, (f) IL-1 β Peptid
G:	1 μg IL-12 (Kontrolle)
H:	1 μg HBsAg/IL-12

Nach 12 Tagen wurden die Milzzellen der immunisierten Mäusen in vitro 5 Tage mit HBsAg-gepulsten, syngenen bestrahlten RBLS-Lymphomzellen restimuliert. Für einen Kontrollversuch H wurden die Milzzellen mit nicht-gepulsten, syngenen RBLS-Zellen restimuliert. Die Milzzellen (Effektorzellen) wurden mit ⁵¹Cr-markierten Zielzellen cokultiviert und die CTL-Reaktion wurde mit einem ⁵¹Cr-Freisetzungsstandardtest gemessen. Die Zielzellen waren entweder nicht-gepulste EL4-Zellen (weiße Kreise in 6A–G) oder EL4-Zellen, die mit HBsAg gepulst worden waren (schwarze Kreise).
Ergebnisse sind in 6A–G gezeigt. In den Kontrollversuchen (A und G), wo die „nichtreagierenden" Mäuse mit HBsAg allein oder IL-12 allein immunisiert waren, war keine CTL-Reaktion in den HBsAg-spezifischen Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen zu erkennen. Auch war in Versuch H nicht irgendeine Reaktion zu erkennen, in dem die Milzzellen mit nicht Antigen-tragenden RBLS-Zellen restimuliert waren.
Zusammensetzungen D-F zeigten ein ähnliches Ausbleiben der Reaktion. Das Ausbleiben der Reaktion von HBsAg-verkapseltem IL-4 (E) ist nicht unerwartet, da von diesem Zytokin bekannt ist, dass es die CTL-Reaktion supprimiert (siehe zum Besipiel Nguyen, Geister).
Eine starke CTL-Reaktion war allerdings für Zusammensetzungen B und C zu erkennen, wo die Zytokine IL-12 beziehungsweise IFN-γ waren. Diese Daten zeigen, dass eine Verkapselung bestimmter Zytokine in HBsAg-Partikel eine CTL-Reaktion selbst in „nichtreagierenden" Stämmen induzieren kann, d.h. in Individuen, die keine CTL-Reaktion auf HBsAg allein zeigen.
In weiteren Versuchen waren die immunstimulierenden Proteine Choleratoxin (CT) und Staphylokokken Enterotoxin B (SEB), die als Adjuvanzien für eine Stimulierung von CTL und humoralen Immunreaktionen bekannt sind, jeweils in HBsAg-Partikel in einer Menge von etwa 5–20 ng Protein pro μg HBsAg eingebaut. Vorversuche bei denen die Immunogenität dieser Zusammensetzungen getestet wurde, zeigten eine auffallende Verstärkung der CTL und Antikörper-Reaktion von den HBsAg-Partikel.
IV. Einbau von Glykolipiden in die äußere Oberfläche von HBsAg-Partikel
Glykolipide können in die äußere Membran der HBsAg-Partikel mittels Lipid-Austausch unter Verwendung entweder von Micellen oder Liposomen eingeführt werden, wie in Felgner beschrieben. In Felgner führte die Co-Inkubation von Gangliosid-Micellen (enthalten überwiegend Trisialogangliosid GT1b) mit fusionierten Phosphatidylcholin-Vesikeln, etwa 70 nm im Durchmesser, oder SUV, etwa 20 nm im Durchmesser, zum Einbau von Gangliosid in die äußere Oberfläche der Vesikel. Alternativ können die Glykolipide durch Verwendung eines Glykolipid-Austauschproteins, wie von Wong et al. beschrieben, eingeführt werden.
Mit Hilfe eines derartigen Einschlusses von Glykolipiden, besonders Glykolipide, die verfügbare Mannose-Reste enthalten, können die Partikel auf spezifische Antigenpräsentierende Zellen wie dendritische Zellen oder Makrophagen gezielt werden. Siehe zum Beispiel Yachi, wo festgestellt wurde, dass eine Modifikation der Oberfläche der Liposomen mit Fettsäureeseter von Mannobiose beim Zielen der Liposomen auf Kupffer-Zellen und andere Makrophagen zweckdienlich ist. Perin et al. haben ein acyliertes Poly-(1-3)-galactosid für das Zielen auf Makrophagen eingesetzt.
Die Oberflächen-Glykolipide von Mycobakterien sind eingehend charakterisiert worden (siehe z.B. Aspinall, Puzo). Diese Glykolipide, die oftmals artspezifisch sind, sind für eine Identifizierung von verschiedenen Spezies wie M. leprae und M. tuberculosis und zur Kontrolle der Behandlung von Krankheiten, die von diesen Organismen ausgelöst sind, verwendet worden. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können HBsAg mit einem in die Lipid-Einzelschicht eingebauten Glykolipid verbreicht werden, um eine CTL-Reaktion gegen Mycobakterien-infizierte syngene Zellen induzieren.
V. Verabreichung
Für die Verwendung beim Menschen liegt die bevorzugte Dosis an verkapseltem Antigen im Bereich von 0,01 bis 20 μg, bevorzugter 0,02 bis 2 μg, eingebaut in etwa 1 bis 10 Gew.-% Level in HBsAg-Partikel. Verabreichung kann mittels Injektion, z.B. intraperitoneal (ip), subkutan (sc), intravenös (iv) oder intramuskulär (im) erfolgen.
Während diese Erfindung mit Bezug auf spezifische Verfahren und Anwendungsformen beschrieben worden ist, ist es einzusehen, dass verschiedene Modifikationen gemacht werden können, ohne den Rahmen der in den anhängigen Ansprüchen definierten Erfindung zu verlassen.

Claims

Verwendung eines in einem Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg)-Partikel verkapselten antigenen Moleküls für die Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Stimulation oder Modulation einer CTL-Reaktion auf das antigene Molekül, wobei das antigene Molekül an dem HBsAg-Partikel nicht kovalent befestigt ist und das antigene Molekül ein antigenes Peptid oder Protein ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die CTL-Reaktion im Vergleich zu der, die durch das antigene Molekül allein hervorgerufen wird, verstärkt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung weiter ein immunstimulierendes Molekül umfasst, das in dem HBsAg-Partikel verkapselt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei das immunstimulierende Molekül ein Zytokin ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das antigene Protein oder Peptid Ovalbumin oder das env/V3-Peptid von HIV ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das immunstimulierende Molekül das Choleratoxin (CT)-Protein oder Staphylokokken Enterotoxin B (SEB)-Protein ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, weiter umfassend ein Glykolipid, das in die äußere Oberfläche der Lipid-Doppelschicht des HBsAg-Partikels eingebettet ist.