JP2001513776A

JP2001513776A - ＬＰＳ関連障害の処置における非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸の使用

Info

Publication number: JP2001513776A
Application number: JP53781098A
Authority: JP
Inventors: エイ．シュワルツ，デイビッド; エム．クリーグ，アーサー
Original assignee: ユニバーシティオブアイオワリサーチファウンデーション
Priority date: 1997-02-28
Filing date: 1998-02-25
Publication date: 2001-09-04
Also published as: US6214806B1; EP1039935A4; AU738513B2; AU6667498A; WO1998037919A1; EP1039935A1; CA2281838A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、少なくとも１つの非メチル化シトシン-グアニン（CpG）ジヌクレオチドを含む核酸が、被験体における免疫応答に影響を及ぼすという所見に基づく。少なくとも１つの非メチル化シトシン-グアニン（CpG）ジヌクレオチドを含むこれらの核酸は、吸入したリポ多糖に対する応答のような免疫学的成分を有する肺障害を処置するために使用され得る。本発明は、これらの肺障害を有するまたは有する危険のある被験体を処置する方法、および肺障害の免疫学的成分を変化させる方法を提供する。本発明はまた、免疫学的成分を有する肺障害を処置するための薬学的組成物も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 LPS関連障害の処置における非メチル化CpGジヌクレオチドを含む核酸の使用発明の分野本発明は、一般的に、肺障害に関連し、そして詳細には、このような障害の処置における少なくとも１つの非メチル化CpGジヌクレオチド（CpG ODN）を有するオリゴヌクレオチドの使用に関する。発明の背景エンドトキシンは、グラム陰性生物によって放出される炎症の一次メディエーターの１つであり、そしてARDSのような環境的に誘導された気道疾患の重要な原因である。吸入されたエンドトキシンは、それまでに曝露されていない被験体において気流妨害を引き起こし得る。吸入されたエンドトキシンは、綿を扱う労働者、ワイン貯蔵(confinement)作業者、および家禽労働者の間の気流の急性減少の発生に強く関連する。バイオエアロゾル中のエンドトキシンの濃度は、農業従事者における気道疾患の発生および進行に関連する最も重要な職業曝露であるようである（Schwartz，D.A.ら，AM．J．Respir．Crit．Care Med．152:603-8，19 95）。いくつかの職業的肺疾患に関連することの他に、エンドトキシンおよびその精製された誘導体のリポ多糖（LPS）への曝露はまた、重篤な喘息に関連する。家庭環境中のエンドトキシンの濃度は、気流妨害のより大きな程度に関連する周囲のエンドトキシンのより高い濃度で、喘息患者に有害な影響を与える。さらに、喘息個体は、正常コントロールよりも吸入されたエンドトキシンのより低い濃度で気流妨害を発現する。曝露応答研究は、吸入されたリポ多糖（LPS）が、好中球の補充、炎症誘発性サイトカインの産生および放出を伴うマクロファージの活性化、ならびに用量依存的様式での気道上皮への傷害を産生することを示している。これらの研究は、エンドトキシンが、曝露された個体の間の気道疾患の重要な原因であることを示す。急性呼吸困難症候群（ARDS）は、肺浮腫による急性血中酸素減少呼吸不全によって特徴づけられる症状である（Honing，E.G.およびIngram，R.H.，Jr.，Harri son's Principles of Internal Medicine ．第14版，A.S．Fauclら(編)，McGraw- Hill，New York，1483-1486頁，1998；およびGoodman，R.B.ら，Am J．Respir． Crit．Care Med．154:602-11，1996に概説される）。ARDSは、急性肺損傷（ALI ）への応答のスペクトルを示し；これらの応答は、急性炎症または損傷へのより広い全身性応答の合併症として生じる。素因のある症状が全身的炎症応答を引き起こした後すぐにALIが発現し、そして吸気、拡散感染、毒性吸入、肺胞上皮への直接損傷、または敗血症症候群のような、直接的肺胞損傷または肺毛細管床を介する直接的損傷を生じた症状に最も強く関連する。ALIは、感染および／または損傷への通常の全身性炎症応答の調節されていない過剰発現の結果である。損傷は、肺胞上皮および肺毛細管内皮を含み、そして複合事象のカスケードを生じる。損傷は、種々のサイトカインを産生し、次に細胞活性化、化学走性、および接着を生じる、好中球、マクロファージ、単球、およびリンパ球に関連する細胞事象によって生じる。グラム陰性感染は、特に入院および免疫無防備状態の患者における、病的状態および死亡の主要な原因である。(Duma，Am．J．of Med.，78(補遺6A):154-164 ，1985；およびKregerら，Am．J．Med．68:344-355，1980）。利用可能な抗生物質は、一般的に、グラム陰性菌の増殖を阻害することに有効であるが、これらはエンドトキシンに関連する病理生理学的効果を中和しない。エンドトキシンは、溶解時にグラム陰性菌の外膜から放出されるリポ多糖（LPS）から構成される熱安定性細菌毒素であり（Shenepら，J．Infect．Dis.，150(3):380-388，1984）、そして炎症応答の強力な刺激因子である。エンドトキシン血症は、エンドトキシンが血流に入り、劇的な全身性炎症応答を引き起こす場合に生じる。Ｂリンパ球によるオリゴヌクレオチドの取り込みは、LPS誘導された細胞活性化によって調節されることが示されている（Krieg，A.M.ら，Antisense Res．De vel．1:161，1991）。LPSの多くの有害なインビボ効果は、炎症細胞によって放出される可溶性メディエーターから生じることが示されている（Morrisonら，Am ．J．Pathol.，93(2):527-617，1978）。微生物を摂取しそして殺傷する単球および好中球は、このプロセスに重要な役割を果たす。単球および好中球は、殺菌効果、タンパク質溶解効果、オプソニン効果、発熱効果、補体活性化効果、および組織傷害効果を有する可溶性タンパク質を放出することによって、インビボでエンドトキシンに応答する。これらの因子は、エンドトキシンの病理生理学的効果の多くを媒介する。例えば、エンドトキシン刺激した単球によって放出されるサイトカインである腫瘍壊死因子（TNF）は、発熱、ショック、および糖代謝の変化を引き起こし、そして好中球の強力な刺激因子である。IL-1、IL-6、およびIL -8のような他のサイトカインもまた、LPSの病理生理学的効果の多く、ならびに組織因子、キニノーゲン、一酸化窒素、および補体による内皮細胞活性化を含む他の経路を媒介する。エンドトキシン関連障害は、LPSへの胃腸管外曝露、例えば、LPS夾雑した液体の投与、LPSの吸入、またはグラム陰性感染から生じる。エンドトキシン関連障害はまた、天然細胞障壁が損傷しそして正常なグラム陰性菌叢がこの障壁を破る場合に生じ得る。例えば、エンドトキシン関連障害は、(a)胃腸管の虚血がある場合（例えば、出血性ショック後またはある外科的手順中）、または(b)全身または局所的炎症がエンドトキシンまたはグラム陰性生物に対して腸または肺の浸透性を増加させる場合に、生じ得る。エンドトキシンの存在および生じる炎症応答は、エンドトキシン血症、全身的炎症応答症候群（SIRS）、敗血症症候群、敗血症性ショック、汎発性血管内凝固症候群（DIC）、心機能不全、臓器不全、肝不全（肝胆機能不全）、脳不全（CNS機能不全）、腎不全、多臓器不全、およびショックの他に、例えば、成人呼吸促進症候群（ARDS）、塵埃誘導性気道疾患、および喘息の再燃を生じ得る。いくつかの治療化合物は、エンドトキシンの毒性効果を阻害するように開発されており、抗菌LPS結合薬剤および抗LPS抗体を含むが、それぞれは限定を伴って達成されている。例えば、ポリミキシンＢ（PMB）は、エンドトキシンの最も毒性および生物学的に活性な成分であるリピドＡに結合する塩基性ポリペプチド抗生物質である。PMBは、インビトロで好中球顆粒放出のエンドトキシン媒介した活性化を阻害し、そしてグラム陰性感染に対する潜在的治療薬剤である。しかし、その全身性の毒性のため、この抗生物質は、治療用途が限定されており、そして一般的に局所的に使用される。抗生物質および高用量のメチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム（MPSS）を使用する併用治療は、この治療法がグラム陰性敗血症の実験動物モデルにおいて死亡を抑制したので、より有望性を示した。しかし、全身性敗血症の臨床的徴候を有する患者の処置において抗生物質とともにMPSS を使用する臨床研究は、致死率に、処置群とプラセボ群との間に有意差がなかったことを示した（Boneら，N．Engl．J．Med．317:653，1987）。発明の要旨本発明は、少なくとも１つの非メチル化シトシン-グアニン（CpG）ジヌクレオチドを含む核酸が、ナチュラルキラー細胞（NK）を活性化すること、あるいはTh 1サイトカインを産生するために単球および他の細胞を誘導することによってTh2 からの被験体の免疫応答をTh1応答へ向け直すことによって、被験体における免疫応答に影響を及ぼすという所見に基づく。少なくとも１つの非メチル化CpGを含むこれらの核酸は、喘息または環境的に誘導された気道疾患のような免疫学的成分を有する肺障害を処置するために使用され得る。第１の実施態様では、少なくとも１つの非メチル化CpGを含む核酸の治療的有効量を投与することによって、気流の急性減少を有するかまたは有する危険のある被験体を処置する方法が、提供される。別の実施態様では、少なくとも１つの非メチル化CpGを含む核酸の治療的有効量を投与することによって、リポ多糖に対する炎症応答を有するまたは有する危険のある被験体を処置する方法もまた、提供される。本発明はまた、少なくとも１つの非メチル化CpGを含む核酸の治療的有効量を投与することによって、吸入されたリポ多糖を有するまたは有する危険のある被験体においてサイトカインのレベルをする改変する方法も、提供する。別の実施態様では、本発明は、薬学的に受容可能なキャリア中に少なくとも１つの非メチル化CpGを含む核酸配列を含む、吸入されたリポ多糖に対する炎症応答を有するまたは有する危険のある被験体を処置するための薬学的組成物を提供する。さらなる実施態様では、配列番号２、17、18、59〜65に記載の単離された核酸配列が提供される。図面の簡単な説明図１は、敗血症および急性肺損傷への経路を示すフローチャートである。図２は、埋め込まれたCpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドまたはCpGモチーフを含まないオリゴヌクレオチドのいずれかでの静脈内処置の４時間後の血清におけるサイトカイン（TNF-α、MIP-2、IL-10、IL-12、およびIFN-γ）の濃度をプロットするグラフである。血清サンプルを、E．coil LPSでの吸入チャレンジの直後に得た。エラーバーは、標準誤差（SE）を示す。図３は、Escherichia coli LPSでの吸入チャレンジ後の全肺洗浄液中の総細胞およびPMNの濃度をプロットするグラフである。吸入チャレンジの30分、４時間、および12時間前に、マウスを、埋め込まれたCpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドで、またはCpGモチーフを含まないオリゴヌクレオチドのいずれかで処置した。エラーバーはSEを示す。図４は、E．coli LPSでの吸入後の全肺洗浄液中のサイトカイン（TNF-α、MIP -2、およびIL-12）の濃度を示すグラフである。マウスを、LPSでの吸入チャレンジの４時間前に、埋め込まれたCpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドで前処置するか、またはCpGモチーフを含まないオリゴヌクレオチドで前処置した。エラーバーはSEを示す。図５は、吸入によってE．coli LPSに曝露されたマウスの肺から単離された総m RNAのRNase防御アッセイを示すオートラジオグラフである。マウスを、LPSでの吸入チャレンジの４時間前に、埋め込まれたCpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドで前処置するか、またはCpGモチーフを含まないオリゴヌクレオチドで前処置した。L32は、リボソームタンパク質をコードし、そしてゲル上にロードされたRNAの濃度を評価するために使用された。図６は、E．coli LPSの吸入後の全肺洗浄液における総細胞およびPMNの濃度をプロットするグラフである。マウスを、LPSでの吸入チャレンジの４時間前に、埋め込まれたCpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドで前処置するか、またはCpG モチーフを含まないオリゴヌクレオチドで前処置した。エラーバーはSEを示す。図７は、E．coli LPSの吸入後の全肺洗浄液中の総細胞およびPMNの濃度を示すグラフである。C57BL/6マウスおよびIL-10ノックアウトマウス（C57BL/6-IL10^tm ^1Cgn ）を、LPSでの吸入チャレンジの４時間前に、埋め込まれたCpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドで、または静脈内生理食塩水でのいずれかで前処置した。エラーバーはSEを示す。図８は、経時的な肺洗浄細胞数をプロットするグラフである。グラフは、マウスにTh2免疫応答を誘導するSchistosoma mansoni卵「卵」を最初に腹腔内(i．p. )注射し、そして次にSchistosoma mansoni卵抗原「SEA」（白丸）を吸入する場合に、多くの炎症細胞が肺に存在することを示す。しかし、マウスに、最初に卵とともにCpG ODNを与える場合、肺における炎症細胞は、SEAのその後の吸入（白三角）によって増加しない。図９は、経時的な肺洗浄好酸球数をプロットするグラフである。また、グラフは、マウスに、最初に卵を注射し、そして次にSEAを吸入する場合（白丸）に、多くの好酸球が肺に存在することを示す。しかし、マウスに、最初に卵とともに CpG ODNを与える場合、肺中の炎症細胞は、SEAのその後の吸入（白三角）によって増加しない。図10は、生理食塩水単独；卵、次いでSEA；卵およびCpG ODN、次いでSEA；ならびに卵およびコントロールオリゴ、次いでSEAへの曝露によって誘導されるマクロファージ、リンパ球、好中球、および好酸球細胞のパーセントにおける効果をプロットする棒グラフである。マウスを、卵への最初の曝露の時にコントロールオリゴで処置する場合、SEAの吸入後の肺への好中球のその後の流入の効果はほとんどない。したがって、14または21日目にマウスが卵を吸入する場合、マウスは、肺において急性炎症応答を発現する。しかし、０および７日目における最初の抗原曝露の時に卵とともにCpGオリゴを与えると、マウスが14日目に卵抗原を吸入する場合に、好中球の増加をほぼ完全に廃止する。図11は、防御オリゴ配列番号10の種々の量の注射に応じて好酸球数をプロットする棒グラフである。図12は、卵、次いでSEA（白菱形）；卵およびCpG ODN、次いでSEA（白丸）；または生理食塩水、次いで生理食塩水（白四角）の注射に応じて経時的なマウスのインターロイキン４（IL-４）産生（pg/ml）をプロットするグラフである。グラフは、得られる炎症応答が、肺におけるTh2サイトカインIL-4のレベルと相関することを示す。図13は、生理食塩水；卵、次いでSEA；またはCpG ODNおよび卵、次いでSEAの注射に応じて経時的なマウスのインターロイキン12（IL-12）産生（pg/ml）をプロットする棒グラフである。グラフは、非メチル化CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドの投与が、IL-12の産生に対する肺のサイトカイン応答を実際に追発し得ることを示し、これは免疫応答のTh1タイプを示す。図14は、生理食塩水；卵、次いで生理食塩水；またはCpG ODNおよび卵、次いでSEAの注射に応じて経時的なマウスのインターフェロンγ（IFN-γ）産生（pg/ ml）をプロットする棒グラフである。グラフは、非メチル化CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドの投与がまた、IFN-γの産生に対する肺のサイトカイン応答を追発し得ることを示し、これは免疫応答のTh1タイプを示す。好ましい実施態様の説明本発明が、このようなもちろん変化し得ることを記載する特定の方法論、プロトコル、配列、モデル、および試薬に限定されないことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語が、特定の実施態様のみを説明する目的であり、そして添付の請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも、理解されるべきである。本明細書に記載のすべての刊行物は、ここで説明される発明に関連して使用され得る刊行物中で説明されるオリゴヌクレオチドおよび方法論を説明および開示する目的のために、参考として本明細書に援用される。細胞へのDNAの結合は、リガンドレセプター相互作用に類似することが示されており；結合は、飽和性、競合的であり、そしてDNAエンドサイトーシスおよびオリゴヌクレオチドへの分解を導く（Bennet，R.M.ら，J．Clin．Invest．76:21 82，1985）。DNAと同様に、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、配列、温度、およびエネルギー非依存性であるプロセスにおいて細胞に侵入し得る（Jaroszew skiおよびCohen，Ad．Drug Del．Rev．6:235，1991）。本明細書で使用される場合、「オリゴデオキシリボヌクレオチド」は、約３〜50塩基長のデオキシリボ核酸配列である。リンパ球オリゴデオキシリボヌクレオチド取り込みは、細胞活性化によって調節されることが示されている（Krieg，A.M.ら，Antisense Researc h and Development 1:161，1991）。本発明は、少なくとも１つの非メチル化シトシン-グアニン（CpG）ジヌクレオチドを含む特定のオリゴヌクレオチド（ODN ）が、免疫応答を活性化するという所見に基づく。１つの実施態様では、本発明は、少なくとも１つの非メチル化CpGを含む核酸配列の治療的有効量を投与することによって、気流の急性減少を有するまたは有する危険のある被験体を処置するための方法を提供する。用語「核酸」または「オリゴヌクレオチド」とは、少なくとも５塩基長のヌクレオチドのポリマー形態をいう。本発明のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの改変された形態であり得る。一般的に、二本鎖分子は、インビボでより安定であるが、その一方で、一本鎖分子は増加した活性を有する。核酸分子は、分子の骨格内のホスホジエステル結合、またはメチルホスホチオエート末端結合よりもむしろホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートの使用を含み得る（Krieg，A.M.ら，Antisense and Nucl Acid Drug Dev 6:133-9 ，1996；Boggs，R.T.ら，Antisense and Nucl Acid Drug Dev，7:461-71，1997 ）。ホスフェート骨格改変は、核酸の5'末端で、例えば、核酸の5'末端の最初の２つのヌクレオチドで、生じ得る。ホスフェート骨格改変は、核酸の3'末端で、例えば、核酸の3'末端の最後の５ヌクレオチドで、生じ得る。「Immune stimula tion by phosphorothioate oligonucleotide analogs」という題名の国際特許出願WO 95/26204は、ホスホジチオエート改変したオリゴヌクレオチドの非配列特異的免疫刺激効果を報告する。内因性エンドヌクレアーゼによって容易に認識されない、イノシンおよびケオシンのような非伝統的塩基、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミジン、およびウリジンのアセチル-、チオ-、および類似の改変された形態もまた、含まれ得る。他の安定化した核酸分子には、アルキル -およびアリール-ホスホネート（ここでは、荷電した酸素部分がアルキル化される）のような非イオン性DNAアナログが挙げられる。いずれかまたは両方の末端で、テトラエチレングリコール(tetrahyleneglycol)またはヘキサエチレングリコールのような、ジオールを含む核酸分子も含まれる。用語「オリゴヌクレオチド」は、DNAの一本鎖および二本鎖の両方の形態を含む。「CpG」または「CpGモチーフ」は、シトシンの後にリン酸結合によって連結されたグアニンを有する核酸をいう。用語「メチル化CpG」とは、通常ピリミジン環の５位に生じる、ピリミジン環におけるシトシンのメチル化をいう。用語「非メチル化CpG」とは、ピリミジン環におけるシトシンのメチル化の不在をいう。本発明のオリゴヌクレオチドにおける非メチル化CpGモチーフのメチル化、部分的除去、または除去は、その効果を減少させると考えられる。オリゴヌクレオチドにおけるすべての非メチル化CpGモチーフのメチル化または除去は、実質的にその効果を減少させる。CpGモチーフのメチル化または除去の効果は、この効果がCpGモチーフを含まないオリゴヌクレオチドの効果に類似するならば、「実質的」である。好ましくは、CpGオリゴヌクレオチドは、約８〜30塩基のサイズの範囲にある。本発明における使用のために、核酸は、当該技術分野で周知の多くの手順のいずれかを使用して新たに合成され得る。例えば、b-シアノエチルホスホルアミダイト法（Beaucage，S.L.およびCaruthers，M.H.，Tet．Let．22:1859，1981）；ヌクレオシドH-ホスホネート法（Gareggら，Tet．Let．27:4051-4054，1986；Fr oehlerら，Nucl．Acid．Res．14:5399-5407，1986；Gareggら，Tet．Let．27:40 55-4058，1986；Gaffneyら，Tet．Let．29:2619-2622，1988）。これらの化学は、市場で入手可能な種々の自動化オリゴヌクレオチド合成機によって行われ得る。あるいは、CpGジヌクレオチドは、プラスミドにおいて大規模で産生され得（S ambrook，T．ら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbo r laboratory Press，New York，1989を参照のこと）、これは、被験体に投与された後、オリゴヌクレオチドに分解される。オリゴヌクレオチドは、制限酵素、エキソヌクレアーゼ、またはエンドヌクレアーゼを用いるような、公知の技術を使用して、現存する核酸配列（例えば、ゲノムまたはcDNA）から調製され得る。インビボでの使用のために、核酸は、好ましくは、（例えば、エンドおよびエキソヌクレアーゼによる）分解に対して比較的抵抗性である。ステムループのような二次構造は、分解に対して核酸を安定化し得る。あるいは、核酸安定化は、リン酸骨格改変によって行われ得る。好ましい安定化された核酸は、少なくとも部分的にホスホロチオエート改変された骨格を有する。ホスホロチオエートは、ホスホルアミダイトまたはH-ホスホネート化学のいずれかを用いる自動化技術を使用して合成され得る。アリール-およびアルキル-ホスホネートは、例えば、米国特許第4,469,863号に記載のように作製され得；そしてアルキルホスホトリエステル（ここで、荷電した酸素部分は、米国特許第5,023,243号およびヨーロッパ特許第092,574号に記載のようにアルキル化される）は、市販の試薬を使用して自動化固相合成によって調製され得る。他のDNA骨格改変および置換を作製する方法は記載されている（Uhlmann，E.およびPeyman，A.，Chem．Rev．90:544， 1990；Goodchild，J.，Bioconjugate Chem．1:165，1990）。インビボ投与について、核酸は、標的細胞（例えば、Ｂ細胞、単球細胞、およびナチュラルキラー（NK）細胞）表面へのより高い親和性結合を生じる分子と会合され得、および／または「核酸送達複合体」を形成するために標的細胞による細胞取り込みを増加させ得る。核酸は、当該技術分野で周知である技術を使用して、適切な分子とイオン結合または共有結合され得る。種々のカップリングまたは架橋剤、例えば、プロテインＡ、カルボジイミド、およびN-スクシンイミジル -3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）が、使用され得る。あるいは、核酸は、周知の技術を使用してリポソームまたはビロソームにカプセル化され得る。１つの実施態様では、本発明の方法において有用な核酸配列は、以下の式によって表される： 5'N₁X₁CGX₂N₂3'（配列番号１）ここで、少なくとも１つのヌクレオチドが連続するCpGを分離し；X₁は、アデニン、グアニン、またはチミジンであり；X₂は、シトシンまたはチミンであり；N は、任意のヌクレオチドであり、そしてN₁＋N₂は、約０〜26塩基である。好ましい実施態様では、N₁およびN₂は、CCGGクアドマーまたは１つよりも多くのCGGトリマーを含まず；そして核酸配列は、約８〜30塩基長である。しかし、より長い核酸は細胞内でオリゴヌクレオチドに分解されるので、CpGが存在するならば、任意のサイズ（kb長ですらあり得る）の核酸が本発明において使用され得る。好ましい合成オリゴヌクレオチドは、5'もしくは3'末端にまたはその近くにCCGGクアドマーまたは１つより多くのCCGもしくはCGGトリマーを含まず、および／あるいはコンセンサス分裂促進CpGモチーフは、パリンドロームではない。「パリンドローム配列」または「パリンドローム」とは、逆方向反復（すなわち、ABCDEE 'D'C'B'A'のような配列、ここでAおよびA'は通常のワトソン-クリック塩基対を形成し得る塩基である）を意味する。本発明の代表的な核酸配列は： 5'-ATAATCGACGTTCAAGCAAG-3'（配列番号２）である。他の実施態様では、本発明の方法は、以下の式によって表されるCpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドの使用を包含する： 5'N₁X₁X₂CGX₃X₄N₂3'（配列番号３）ここで、少なくとも１つのヌクレオチドが連続するCpGを分離し；X₁X₂は、GpT、 GpG、GpA、ApT、およびApAからなる群より選択され；X₃X₄は、TpTまたはCpTからなる群より選択され；Nは、任意のヌクレオチドであり、そしてN₁＋N₂は、約０〜26塩基である。好ましい実施態様では、N₁およびN₂は、CCGGクアドマーまたは１つより多くのCCGもしくはCGGトリマーを含まない。CpG ODNはまた、好ましくは８〜30塩基長の範囲であるが、十分なモチーフが存在するならば任意のサイズ（さらに多くのkb長）であり得る。なぜならば、このようなより長い核酸は細胞の内部でオリゴヌクレオチドに分解されるからである。この式の好ましい合成オリゴヌクレオチドには、5'および／もしくは3'末端にまたはその近くにCCGGクアドマーまたは１つより多くのCCGもしくはCGGトリマーを含まず、および／あるいはコンセンサス分裂促進CpGモチーフは、パリンドロームではない。他のCpGオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の方法を使用して効力についてアッセイされ得る。長期の効果は、安定化されたオリゴヌクレオチドを使用して得られ得、ここでオリゴヌクレオチドは、リン酸骨格改変（例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート改変）を組み込む。より詳細には、リン酸骨格改変は、核酸の5'末端で、例えば、核酸の5'末端の最初の２つのヌクレオチドで生じる。さらに、リン酸骨格改変は、核酸の3'末端で、例えば、核酸の3'末端の最後の５つのヌクレオチドで生じ得る。非メチル化CpGを含む好ましい核酸は、Ｂ細胞、単球、および／またはナチュラルキラー細胞応答（例えば、とりわけサイトカインの誘導、増殖応答、溶解応答）に関する比較的高い刺激を有する。「刺激指数」は、種々の免疫細胞アッセイで試験され得る免疫応答をもたらすためのCpG ODNの尺度である。免疫応答の刺激は、種々の免疫パラメータを測定すること、例えば、抗体形成能力、リンパ球亜群の数、混合型白血球応答アッセイ、リンパ球増殖アッセイを測定することによって、アッセイされ得る。免疫応答の刺激はまた、感染または腫瘍増殖への抵抗性を決定するアッセイで測定され得る。刺激指数を測定するための方法は、当業者に周知である。例えば、１つのアッセイは、マウスＢ細胞培養物中の³Hウリジンの取り込みであり、これは、37 ℃にて20時間20μMのオリゴヌクレオチドと接触され、そして１μCiの³Hウリジンでパルスされ；そして４時間後に採取されそしてカウントされた。特定のサイトカインの分泌の誘導はまた、刺激指数を評価するために使用され得る。理論によって拘束されることを意味することなく、インビボでの使用については、例えば、エンドトキシンに応じて気流の急性減少を有するまたは有する危険のある被験体を処置するために、CpG ODNが、単球細胞によるサイトカイン分泌および／またはナチュラルキラー（NK）細胞溶解活性を効果的に誘導し得ることが重要である。１つの方法では、Ｂ細胞増殖に関するCpG ODNの刺激指数は、少なくとも約５、好ましくは少なくとも約10、より好ましくは少なくとも約15、および最も好ましくは少なくとも約20であるが、個体間の刺激指数に差があることが認識される。本発明のCpG ODNは、サイトカイン産生（例えば、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF- α、およびGM-CSF）を刺激する。代表的配列は、以下を含む：本発明のCpG ODNはまた、ヒトのような被験体においてナチュラルキラー細胞（NK）溶解活性を刺激するために有用である。このような配列の、特異的であるが限定されない例には、以下が挙げられる：本発明の核酸配列はまた、Ｂ細胞増殖を刺激するために有用である。このような配列の特異的であるが限定されない例には、以下が挙げられる：好ましいCpG ODNは、治療適応に依存して、少なくとも約500pg/mlのTNF-α、1 5pg/ml IFN-γ、70pg/mlのGM-CSF、275pg/mlのIL-6、200pg/ml IL-12をもたらし得る。これらのサイトカインは、当該技術分野で周知のアッセイによって測定され得る。上記のODNまたは他の好ましいCpG ODNは、当該技術分野で周知のアッセイで、少なくとも約10％、より好ましくは少なくとも約15％、および最も好ましくは少なくとも約20％のYAC-1細胞特異的溶解、または少なくとも約30％、より好ましくは少なくとも約35％、および最も好ましくは少なくとも約40％の2C11細胞特異的溶解をもたらし得る（実施例４を参照のこと）。用語「急性」とは、短くおよび比較的重篤な経過を有する状態をいう。「気流の減少」は、肺機能の測定可能なパラメータの減少である。用語「肺(lung)機能」および「肺(pulmonary)機能」は、交換可能に使用され、そして吸気流速、排気流速、および肺容量を含む（しかしこれらに限定されない）物理的に測定可能な作用を意味するように解釈される。肺機能を定量的に決定する方法は、肺機能を測定するために使用される。臨床的実施に最も一般的に用いられる肺機能を測定する方法は、特異的パラメータを測定するために吸気および排気手技の時限的測定を包含する。例えば、努力肺活量（FVC）は、最初の深い吸気から強く患者によって排出されたリットルでの総容量を測定する。このパラメータは、１秒における努力排気容量（FEV₁）に関して評価される場合、気管支収縮が定量的に評価される。努力肺活量決定の問題は、努力肺活量手技（すなわち、最大吸気から最大排気までの努力呼気）が、非常に技法依存的であることである。言い換えれば、所定の患者は一連の連続FVC手技の間に異なるFVC値を生成し得る。努力呼気手技の中間部分に関して決定されるFEF 25-75または努力排気流は、FVCよりも技法依存的でない傾向である。同様に、FEV₁は、FVCよりも技法依存的ではない傾向である。肺機能の指数として排出された空気の容量を測定するのに加えて、排気サイクルの異なる部分にわたり測定された１分当たりのリットルでの流量は、患者の肺機能の状態を決定することに有用であり得る。特に、努力最大排気中の１分当たりのリットルでの最高空気流速として採用される、ピーク排気流は、喘息および他の呼吸疾患を有する患者において全体の肺機能と良好に相互関係する。用語「喘息」とは、炎症、気道の狭窄、および吸入薬剤に対する気道の増加した反応性によって特徴づけられる呼吸器系の障害をいう。喘息は、アトピーまたはアレルギー徴候と頻繁であるが、独占的でなく関連する。「治療的有効量」によって、被験体における症状を予防、治癒、または少なくとも部分的に抑止するために必要な本発明に従う化合物の量が意味される。被験体は、任意の哺乳動物、好ましくはヒトである。治療的使用に有効な量は、もちろん、疾患の重篤度、ならびに被験体の体重および全体的な状態に依存する。代表的には、インビトロで使用される投薬は、薬学的組成物のインサイチュ投与に有用な量における有用な指針を提供し得、そして動物モデルは、特定の障害の処置に有効な用量を決定するために使用され得る。種々の考察が、例えば、Gilman ら編，Goodman And Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics，第 8版，Pergamon Press，1990；およびRemington's Pharmaceutical Science，第1 7版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa，1990（それぞれ参考として本明細書に援用される）に記載される。少なくとも１つの非メチル化CpGを含むオリゴヌクレオチドは、免疫応答を活性化するために単独で使用され得るか、あるいは、別の治療様式、すなわち薬物または外科的手順のいずれかと組み合わせて投与され得る。例えば、すくなくとも１つの非メチル化CpGを含むオリゴヌクレオチドが、別の治療様式と組み合わせて投与される場合、オリゴヌクレオチドは、その別の治療様式の前、後、および／または同時に投与され得る。少なくとも１つの非メチル化CpGを含むオリゴヌクレオチドは、その免疫応答を活性化する能力の他に、さらなる効能（例えば、アンチセンスまたは他の手段によって）を有し得る。別の実施態様では、本発明は、さらに、少なくとも１つの非メチル化CpGを含む核酸配列の治療的有効量を被験体に投与することによって、ＬＰＳに対する炎症応答を有するまたは有する危険がある被験体を処置する方法を提供する。グラム陰性菌感染またはエンドトキシン血症と関連し得る疾患の例には、細菌性髄膜炎、新生児敗血症、嚢胞性線維症、炎症性腸性疾患および肝硬変、グラム陰性菌性肺炎、グラム陰性菌性腹部膿瘍、出血性ショック、および汎発性血管内凝固症候群が挙げられる。化学療法で処置された被験体または免疫無防備状態（例えば、AIDSを有する）被験体を含む、白血球減少症または好中球減少症である被験体は、細菌感染およびその後のエンドトキシンの影響を特に受けやすい。「リポ多糖」または「LPS」とは、リン脂質部分（リピドa）に共有結合したヘテロ多糖（体細胞Ｏ抗原を含む）から構成される化合物を意味する。LPSは、グラム陰性菌の細胞壁の主要成分である。「エンドトキシン」とは、腸内細菌、ブルセラ菌、ナイセリア菌、およびビブリオ菌を含む、特定のグラム陰性菌の外膜と結合した熱安定性毒素を意味する。通常、細菌細胞の破壊時に放出されるエンドトキシンは、リポ多糖分子（LPS）および任意の付随タンパク質から構成される。LPSのリン脂質部分であるリピドaは、LPS毒性に関連する。大量に注射された場合、エンドトキシンは、出血性ショックおよび重篤な下痢を生じ；より少量では、発熱、細菌感染への変化した抵抗性、白血球減少症に続く白血球増加症、および多くの他の生物学的影響を引き起こす。エンドトキシンは、「細菌発熱物質」の１つのタイプであり、これは任意の発熱惹起細菌産物である。本明細書で使用される場合、用語「エンドトキシン」、「LPS」、および「リポ多糖」は、本質的に同義である。本発明はさらに、LPSに対する炎症応答を有するまたは有する危険のある被験体を処置する方法を提供する。LPSが、正常および喘息患者において炎症応答を生じることは公知である。「炎症応答」とは、全身的または炎症の部位で局所的のいずれかでの、白血球の蓄積を意味する。炎症応答は、当該技術分野で周知の多くの方法によって測定され得、例えば、白血球（WBC）の数、多形核好中球（P MN）の数、PMN活性化の程度の測定（例えば、ルミナール（luminal）増強した化学発光）または存在するサイトカインの量の測定である。用語「サイトカイン」は、ナノからピコモル濃度で体液性レギュレーターとして作用し、そして正常または病理学的条件下のいずれかで、個々の細胞および組織の機能的活性を調節する、可溶性タンパク質およびペプチドの様々な群についての総称として使用される。これらのタンパク質はまた、細胞間の相互作用を直接媒介し、そして細胞外環境で起こるプロセスを調節する。サイトカインの例には、TNF-α、IL-10、IL- 12、インターフェロン-γが挙げられるが、これらに限定されない。重要なことに、インターフェロン-γは、LPS誘導された炎症を媒介する重要なサイトカインである（例えば、Ozmen，L．ら，J．Exp．Med．180:907-915，1994）。インターフェロン-γの放出は、マクロファージ／単球／樹状細胞に由来するIL-12によって誘導され（例えば、Balanchard，D.K．ら，J．Immunol．136:963-970，1986）、そしてIL-10は、IL-12産生が阻害されるマクロファージ依存的工程を介してインターフェロン-γを阻害する（D'Andrea，a．ら，J．Exp．Med．178:1041-1048 ，1993）。理論に拘束されることを望まないが、非メチル化CpGを含む核酸が、I L-10の産生および応答を増加させることによって、あるいは次にIL-10またはIL- 6の産生および応答を増加させる因子の応答を調節することによって、LPSに対する炎症応答を減少させ得ることが可能である。本発明はさらに、吸入されたLPSに対する応答が変化したサイトカインのレベルを調節する方法を提供する。用語「調節する」とは、過剰発現される場合の特定のサイトカインの発現の抑制、あるいは発現不足の場合の特定のサイトカインの発現の増大を意味する。特定のサイトカインの調節は、局所的または全身的に起こり得る。CpGオリゴヌクレオチドは、精製されたNK細胞を直接活性化せず、むしろ、NK細胞がIL-12に対して応答してIFN-γ産生の顕著な増加を有することを可能にすると考えられている。IL-12産生およびその後のNK細胞による増加したIFN-γ分泌を誘導することによって、免疫刺激性核酸はまた、Th1型免疫応答を促進する。高度に精製されたＴ細胞による増殖またはサイトカイン分泌の直接活性化は、見いだされていない。サイトカインプロフィールは、免疫応答におけるＴ細胞の調節およびエフェクター機能を決定する。サイトカインはまた、Ｔ細胞応答を指示する役割を果たす。ヘルパー（CD4⁺）Ｔ細胞は、他のＴ細胞を含む他の免疫系細胞において作用する可溶性因子の産生によって、哺乳動物の免疫応答を調整する。ほとんどの成熟CD4⁺Ｔヘルパー細胞は、２つのサイトカインプロフィール：Th1またはTh2の１つを発現する。Th1細胞は、IL-2、IL-3、IFN-γ、TNF-β、GM-CSF、および高レベルのTNF-αを分泌する。Th2細胞は、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、GM-CSF、および低レベルのTNF-αを発現する。Th1サブセットは、遅延型過敏症、細胞媒介免疫、およびIgG_2aへの免疫グロブリンクラススイッチングを促進する。Th2サブセットは、Ｂ細胞を活性化すること、抗体産生を促進すること、およびIgG₁および IgEへのクラススイッチングを誘導することによって、体液性免疫を誘導する。いくつかの因子は、Th1またはTh2プロフィールへの拘束に影響を及ぼすことが示されている。最もよく特徴づけられたレギュレーターはサイトカインである。 IL-12およびIFN-γは、ポジティブTh1およびネガティブTh2レギュレーターである。IL-12は、IFN-γ産生を促進し、そしてIFN-γは、IL-12についてのポジティブフィードバックを提供する。IL-4およびIL-10は、TH2サイトカインプロフィールの樹立に必要とされ、そしてTh1サイトカイン産生をダウンレギュレートするようであり；IL-4の効果は、ある場合には、IL-12の効果よりも優性である。IL- 13は、IL-4と類似の方法で、LPS誘導した単球によるIL-12およびTNF-αを含む、炎症性サイトカインの発現を阻害することが示された。IL-12p40ホモダイマーは、IL-12レセプターに結合し、そしてIL-12生物学的活性をアンタゴナイズし；したがって、IL-12のプロTh1効果をブロックする。本発明は、空気流における急性減少を発症する「危険がある」、またはLPS曝露の危険のある個体を処置するために使用され得る。これらの個体は、任意の診断手段によって、または曝露データのような疫学的証拠によって同定され得る。これらの個体は、臨床的出現の実際の開始の前、開始時、または後に、本発明の方法によって処置され得る。「臨床的出現」は、障害の任意の徴候または症候であり得る。本発明はさらに、吸入したLPSに対する炎症応答を有するまたは有する危険のある被験体に、本発明の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物の治療的有効用量を投与することを提供する。本発明の薬学的組成物を「投与すること」は、当業者に公知の任意の手段によって達成され得る。本発明の薬学的組成物は、一般的には、局所的に、静脈内に、経口で、非経口で、または移植物として投与され、そしてさらに直腸使用が理論上は可能である。適切な固体または液体薬学的調製物形態は、例えば、顆粒、粉末、錠剤、コートされた錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、乳剤、懸濁液、クリーム、エアロゾル、アンプル形態での点滴または注射用溶液、およびその上、活性化合物の遅延性放出を有する調製物であり、その調製物において、殺菌剤(disin tegrant)、結合剤、コーティング剤、膨化剤、潤滑剤、香味剤、甘味剤、または溶解剤のような、賦形剤および添加剤、および／または補助剤が、上記のように習慣的に使用される。薬学的組成物は、種々の薬物送達システムにおける使用に適切である。薬物送達のための本発明の方法の簡単な総説については、Langer， Science 249:1527-1533，1990を参照のこと、これは参考として本明細書に援用される。薬学的組成物は、好ましくは、投与単位で調製および投与される。固体投与単位は、錠剤、カプセル、および坐剤である。患者の処置については、化合物の活性、投与の様式、障害の性質および重篤度、患者の年齢および体重に依存して、異なる日用量が必要である。しかし、特定の状況下では、より高いまたは低い日用量は適切であり得る。日用量の投与は、個々の投与単位または他にいくつかのより少量の投与単位の形態での単回投与、およびその上特定の間隔で再分割した用量の複数回の投与の両方によって行われ得る。本発明の薬学的組成物は、局所的または全身的に投与され得る。「治療的有効用量」とは、障害およびその合併症の徴候を予防、治癒、または少なくとも部分的に抑止するために必要な本発明の化合物の量を意味する。この使用に効果的な量は、もちろん、疾患の重篤度ならびに患者の体重および一般的状態に依存する。代表的には、インビトロで使用される投与量は、薬学的組成物のインサイチュ投与に有用な量に有用な指針を提供し得、そして動物モデルは、特定の障害の処置に効果的な投与量を決定するために使用され得る。種々の考察が、例えば、Gl imanら編，Goodman And Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics ，第8版，Pergamon Press，1990；およびRemington's Pharmaceutical Science ，第17版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990（それぞれ参考として本明細書に援用される）に記載される。以下の実施例は、明確にまたは暗黙にのいずれかで、いかなる様式、形状、または形態で本発明を例示するが限定しないことを意図する。これらは、使用され得るものの代表であるが、当業者に公知の他の手順、方法論、または技術が、代わりに使用され得る。実施例１吸入したLPSに対する肺応答の方法実験の最初の一連では、マウスを、CpGモチーフを含む20塩基対（bp）オリゴヌクレオチド（CpGオリゴ）または埋め込まれたCpGモチーフを含まない20bpオリゴヌクレオチド（非CpGオリゴ）で、E．coli LPS(1.5μg/m³)での４時間吸入チャレンジの30分、４時間、もしくは12時間前に、静脈内処置した。非メチル化Cp Gモチーフが保護効果を担うかどうかを決定するために、E．coli LPSでの吸入チャレンジの前に、非メチル化CpGモチーフまたはメチル化CpGモチーフのいずれかを含むオリゴヌクレオチドでマウスを前処置した。最終的に、IL-10の役割を決定するために、CpGオリゴでIL-10ノックアウトマウスを前処置し、次いでE．c oli LPSでの類似の吸入チャレンジを行った。吸入チャレンジの直後に、すべてのマウスを屠殺し、血液サンプルを得、全肺洗浄を行い、そして肺をmRNA分析のために採取した。動物。C3H/HeBFEJ、C57BL/6、およびC57BL/6-I110^tm1Cgn雄マウス（Jackson L aboratories，Bar Harbor，ME）を６週齢で得、そして２週以内に使用した。the National Institutes of Health Commitee on Care and Use of Laboratory An imals of Institute of Laboratory Animal Resourcesに記載のすべての動物の世話および住まいに必要なものは従い、そして動物プロトコルを総説し、そして the Institutional Animal Care and Use Committeeによって許可された。マウスを、適宜供給された食餌（Formulab Chow 5008，PMI，Richmond，IN）および水とともに、ウッドチップ床（Northeastern Product，Warrensberg，NY）中で維持した。オリゴヌクレオチド。20塩基対オリゴヌクレオチドを、埋め込まれたCpGモチーフ（Oligoなど，Wilsonville，OR）とともにおよびなしで合成した。これらのオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性ホスホロチオエート改変した骨格を含み、そして使用前に２ラウンドのエタノール沈殿によって精製した。CpGジヌクレオチドを、２つの5'プリンおよび２つの3'ピリミジンに隣接させて、オリゴヌクレオチドの刺激効果を増強した。「非刺激性」オリゴヌクレオチオは、２つの埋め込まれたCpGモチーフが改変された以外は刺激性オリゴヌクレオチドと同一であり、一方はApGモチーフとして出現し、そして他方はGpCモチーフとして出現した。２つの合成したオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有した： CpGオリゴヌクレオチド：ATAATCGACGTTCAAGCAAG（配列番号17）非CpGオリゴヌクレオチド：ATAATAGAGCTTCAAGCAAG（配列番号18）メチル化プロトコル。DNAを、１μg DNA当たり2U CpGメチラーゼ（New Englan d Biolabs;Beverly，MA）で、37℃にて18時間、本発明者らが既述（Krieg，A.M. ら，Nature 374:546-9，1995）したようにメチル化した。メチル化DNAを試験して、Hpa-IIでの切断に対して完全に保護されたがMsp-Iについては保護されないことを確認した。化学薬品。エンドトキシンは、凍結乾燥した精製したE．coli 0111:B4リポ多糖（LPS）（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO，PN#L2630）として購入し、そして1.3×10⁶ng/mgの比活性および３％未満のタンパク質含量を有した。エンドトキシンアッセイ。LPS溶液、LPSエアロゾル、およびオリゴヌクレオチドのエンドトキシン濃度を、滅菌した発熱物質を含まない実験室製品ならびに温度制御されたマイクロプレートブロックおよびマイクロプレートリーダー(405nm )とともに色素原Limulusアメーバ様細胞溶解産物（LAL）アッセイ（QCL-1000，W hittaker Bioproducts，Inc.，Walkersville，MD）を使用してアッセイした。LP S溶液を、発熱物質を含まない水で連続希釈し、そしてアッセイした。LPSの空気伝搬濃度を、曝露チャンバーから、47mmステンレススチールインライン空気サンプリングフイルターホルダー（Gelman Sciences Inc.，Ann Arbor，MI）内に保持された47mmバインダーのないガラスマイクロファイバーフィルター（EPM-2000 ，Whatman Intl．Ltd.，Maidstone，England）を通して引いた0.30m³の空気をサンプリングすることによって評価した。空気サンプリングフィルターを、１時間穏やかに振盪しながら室温にて10mlのpfwで抽出した。次いで、pfwで連続希釈し、そしてエンドトキシンについてアッセイした。４〜６の空気サンプルを、各曝露についてアッセイした。すべての標準曲線（0.1〜1.0EU/ml）は、ｒ＝0.995 を越える直線回帰係数を得た。スパイクしたサンプルおよびフィルターブランクおよび関与物をルーチンに走査し；実験室間確認(validation)研究もルーチンに行った。曝露プロトコルおよびモニタリング装置。LPSエアロゾルを、シリンジポンプによって抽出物を供給されるPITT#1ネブライザーを使用して、ガラスの20L曝露チャンバー中に生成した。液体送り率は、0.0027〜0.21ml／分の範囲であった。 HEPA濾過した空気を、10〜17L/分の範囲の流速でネブライザーに供給した。チャンバー内で混合することを、磁気的にカップリングしたローターによって補助した。チャンバー雰囲気を、１交換／分で交換した。LPS濃度を、総チャンバー流出をサンプリングすることによって決定した。曝露チャンバー内でサンプリングすることによって、粒子サイズ分布を、Aerodynamic Particle Sizer（TSI．Inc .，St．Paul，MN）で決定し、ならびにMarbleパーソナルカスケードインパクターおよびMylarメディア（Thorne，P.S.，Am．J．Ind．Med．25:109-112，1997）で重量決定した。肺洗浄。吸入チャレンジの直後に、マウスを安楽死させ、開胸し、そして肺を、曝露した気管に挿入したPE-90挿管によってインサイチュで洗浄した。25cm H₂ Oの圧力を使用して、6.0mlの滅菌した発熱物質を含まない生理食塩液で肺を洗浄した。全肺洗浄後、肺を単離し、そして液体窒素で凍結し、そして−70℃にて貯蔵した。気管支肺胞洗浄液の処理。サンプルを加工する標準的方法（Schwartz，D.A.ら，Am．J．Physiol．267:L609-617，1994）は以下の通りであった：洗浄の直後に、容量を書き留め、そして15mlコニカルチューブを、200×gで５分間遠心分離した。上清液をデカントし、そしてその後の使用のために−70℃にて凍結した。細胞の残りのペレットを再懸濁し、そしてHBSS（Ca⁺⁺またはMg⁺⁺を含まない）で２回洗浄した。２回目の洗浄後、サンプルの少量を、血球計を使用して細胞計数のために採取した。次いで、細胞をさらに１回洗浄し、そしてRPMI培地に再懸濁し、その結果、最終濃度を１×10⁶細胞/mlの細胞計数を得た。１×10⁶ml細胞懸濁液の10〜12μlに存在する細胞を、細胞遠心分離機（Cytospin-2：Shanden South ern，Sewickley，PA）を使用してスペシャルフィルターカードを使用してスライドガラス上に５分間回転した。染色を、Diff Quick Stain Set(Harleco，Gibbst own，NY)を使用して行った。次いで、スライドを乾燥し、光学的に澄明な油浸用油の１滴を、細胞を覆うスライド上に置き、そしてカバースリップを上に置いた。洗浄液および血清のサイトカイン分析。洗浄液を、TNF-α、MIP-2、IL-6、IL- 10、IL-12、およびIFN-γについてアッセイした。すべての場合において、マウス組換えサイトカイン（TNF-α、MIP-2、IL-6、IL-10、IL-12、またはIFN-γ）に特異的なポリクローナル抗体を、標準的な市販のサンドイッチELISA（R & D S ystems:Minneapolis，MN）において捕獲試薬として使用した。TNF-αについての検出限界は5.1pg/mlであり、MIP-2は1.5pg/ml、IL-6は10pg/ml、IL-10は10pg/ml 、IL-12は5pg/ml、そしてIFN-γは10pg/mlである。RNA の調製およびマルチプローブRNase防御アッセイ。総RNAを、単一工程方法（ChomezynskiおよびPandsacchi，Anal Biochem 162:156-9，1987；Kedzlerski ，W.，Biotechniques 10:210-214，1991）を使用して肺標本から抽出し、RNASTA T-60(Tel-Test B;Friendswood，TX)において新鮮な凍結した肺を溶解した。RNA STAT-60の組成物は、単相溶液にフェノールおよびグアニジウムチオシアネートを含む。肺実質を、ポリトロンホモジナイザーを使用してRNA STAT-60中でホモジナイズした。クロロホルムを添加し、総RNAを、イソプロパノールの添加によって水相から沈殿し、そして総RNAをエタノールで洗浄し、そして水に溶解した。真空デシケーター中でペレットを乾燥した後、RNAの収量および純度を、260および280nmの吸光度の比を測定することによって定量した。ミニゲル電気泳動を使用して、28sおよび18s rRNAバンドの完全性を確認した。遺伝子転写物を、既述（Hobbs，J.M.ら，J．Immunol．150:3602，1993）のようにRNase防御アッセイを使用して検出した。各サンプル中の遍在して発現したリボソームサブユニットタンパク質（Rajchel，A．ら，Nucl．Acid．Res．16:2347，1987）をコードする L32の量によって判断したように、RNAの等価量を検査した。市販のプローブを使用して、TNF-α、MIP-2、IL-6、IL-10、IL-12、およびIFN-γを検出した。統計学的分析。３つの比較を、この分析で追求した：1)吸入されたLPSに対する炎症応答を調節することにおける、静脈内CpG含有オリゴヌクレオチド対埋め込まれたCpGモチーフを含まないオリゴヌクレオチドの効果；2)LPSに対する炎症応答を制御することにおける、非メチル化CpGモチーフ対メチル化CpGモチーフの効果；および3)非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドの防御効果を媒介することにおけるIL-10の役割。炎症応答を、洗浄細胞充実性、洗浄液サイトカイン濃度、サイトカインの血清濃度、および肺実質中の特定のサイトカインについての mRNAの相対濃度を使用して評価した。データが正常に分布することを確実にした後、統計学的比較を、スチューデントT-検定を含む母数統計学を使用して行った（Rosner，R.，Fundamentals of Biostatistics（第3版）Boston，MA，PWS-Kent ，1980）。実施例２ CpG ODN は、吸入されたLPSに対する肺応答を減少しそして免疫応答を刺激する CpGオリゴヌクレオチド（ODN）での前処置は、全身的炎症応答を生じた。CpG ODNでの静脈内処置は、末梢白血球の濃度に影響を及ぼさなかったが；非CpG ODN と比較して、LPS吸入の前のCpG ODNでの処置は、注射の30分、４時間、および12 時間後にPMNのより高い濃度を得た。予測どおり、CpGオリゴヌクレオチドでの静脈内処置はまた、血清中のサイトカインの濃度に影響を与えた。非CpG ODNと比較して、CpG ODNは、LPS吸入後のマウスの血清中のMIP-2、IL-1 0、およびIL-12の濃度が上昇した（図１）。これらの差は、静脈内投与後30分および４時間に最も顕著であるが、CpG含有オリゴヌクレオチドへの曝露後12時間にまだ存在した。いずれかのオリゴヌクレオチドで前処置し次いでLPSに曝露したマウスにおいて、どの時点でもTNF-α、IL-6、およびIFN-γの血清濃度について差は観察されなかった（IL-6についてのデータは示さず）。 CpG含有オリゴヌクレオチドでの前処置は、吸入したLPSに対する肺応答を減少させた。0.5、４、および12時間にCpGオリゴヌクレオチドで前処置した動物は、 LPSでの吸入チャレンジ後の洗浄液中の細胞の濃度が減少した（図２）。しかし、0.5および４時間でのオリゴヌクレオチドでの前処置が洗浄液PMNの割合を減少させたが、吸入チャレンジの12時間前のオリゴヌクレオチドでの前処置が洗浄液 PMNの割合に影響を及ぼさなかったので、この効果は時間依存的であるようであった（図２）。CpG含有オリゴヌクレオチドでの前処置は、洗浄液中のサイトカインの濃度の顕著な変化を生じたが、マウスを吸入チャレンジの４時間前にCpG オリゴヌクレオチドで前処置した場合、サイトカイン濃度の変化は、顕著に明らかであった。TNF-αおよびMIP-2の濃度で顕著な減少が観察されたが、IL-12の洗浄液濃度は、吸入チャレンジの４時間前のCpGオリゴヌクレオチドでの処置後に上昇した（図３）。IL-6、IL-10、およびIFN-γは、どの時点でもLPSの吸入後に洗浄液中で測定可能ではなかった。興味深いことに、RNase保護アッセイからの結果は、TNF-α、MIP-2、IL-6、IL-10、およびIFN-γについての総肺mRNA濃度が、CpGおよび非CpG含有オリゴヌクレオチドで前処置したマウスで類似することを示す（図４）。これらの結果はまた、mRNA IL-12が、CpG含有オリゴヌクレオチドで前処置したマウスから肺でのみアップレギュレートされるようであることを示す。吸入されたLPSに対する炎症応答を抑制することにおけるCpGオリゴヌクレオチドの特異性を決定するために、CpGモチーフをメチル化した。２つの同一のオリゴヌクレオチド（一方は非メチル化CpGモチーフを有しそして他方はメチル化CpG モチーフを有する）の免疫抑制効果を比較した。CpGモチーフをメチル化することは、吸入されたLPSに対する細胞性炎症応答を防止することにおけるCpGオリゴヌクレオチドの防御効果を回避した（図５）。さらなる実験を、以下のオリゴヌクレオチドで行った：マウスを、示したオリゴヌクレオチドで前処置し、次いで上記のようにLPSで気道を通してチャレンジした。生理食塩水チャレンジを、コントロールとして使用した。マウスの肺を洗浄し、そして１ml当たりの細胞の数、１ml当たりの多型核細胞（PMN）の数、および気道中の多型核細胞の割合を決定した（表１を参照のこと）。実験１では、オリゴヌクレオチド1760および1826の両方とも効果的なようである。実験２では、オリゴヌクレオチド1760および1585は効果的であった。オリゴヌクレオチド2010もまた、適度な効果を有したようである。実験３では、オリゴヌクレオチド1760は効果的であった。オリゴヌクレオチド2001で適度な効果が見られた。したがって、治療効果を誘導するために最良のオリゴヌクレオチドは、配列番号１および配列番号３に示すモチーフにて適合する。2001および2010のような、CCGG、CCG、およびCGGを有するCpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドはまた、有益な効果を有し得る。結果は、CpG含有オリゴヌクレオチドが、吸入したLPSに対する炎症応答を実質的に減少させ、そして防御効果が、オリゴヌクレオチド内に埋め込まれた非メチル化CpGモチーフに特異的であるようであることを示す。これらの所見は、CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドが、吸入されたLPSおよび他の環境因子に対する炎症応答を制御することに役立つことを証明し得ることを示唆する。実施例３ IL-10 の役割内因性および外因性IL-10は、LPSに対する炎症応答を抑制することが知られているので（Cassatella，M.A.ら，J．Exp．Med．178:2207，1993；Berg，D.J.ら，J．Clin．Invest．96:2339-2347，1995）、IL-10は、CpGオリゴヌクレオチドの免疫抑制効果を媒介することに重要な役割を果たし得る。この仮説を追求するために、IL-10ノックアウト（C57BL/6-II10^tm1Cgn）マウスおよびC57BL/6コントロールマウスを、CpG含有オリゴヌクレオチドで前処置し、次いでE．coli LPSでの吸入チャレンジを行った。静脈内生理食塩水での前処置と比較して、CpG含有オリゴヌクレオチドは、C57BL/6および破壊したIL-10遺伝子を有するマウス（C5 7BL/6−I110^tm1Cgn）の両方における洗浄液中の総細胞充実性およびPMNの濃度を顕著に減少させた（図６）。重要なことには、CpGオリゴヌクレオチドの免疫抑制効果は、野生型マウスと比較して破壊されたIL-10遺伝子を有するマウスでは等しく効果的であった。結果は、非メチル化CpGモチーフの防御効果が、IL-10に依存的でないことを示す。実施例４ NK 活性の誘導ホスホジエステルODNを、Operon Technologies(Alameda，CA)から購入した。ホスホロチオエートODNを、DNA core facility，University of Iowa、またはTh e Midland Certified Reagent Company(Midland TX)から購入した。E．coli（Ｂ株）DNAおよびウシ胸腺DNAを、Sigma(St．Louls，MO)から購入した。すべてのDN AおよびODNを、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１）での抽出および／またはエタノール沈殿によって精製した。ODN中のLPSレベルは、12.5ng/mg以下であり、そしてE．coliおよびウシ胸腺DNAは、カブトガニ(Li mulus)アッセイによって2.5ngのLPS/mgDNA以下を含んだ。ウイルスを含まない、４〜６週齢の、DBA/2、C57BL/6（B6）および先天性無胸腺BALB/Cマウスを、Veterans Affairs from the National Cancer Institute(Be thesda，MD)によって請負で得た。C57BL/6 SCIDマウスを、SPF barrier facilit y at the University of Iowa Animal Care Unit中で飼育した。ヒト末梢血単核白血球（PBMC）を、既述のように得た（例えば、Ballas，Z.K ．ら，J．Allergy Clin．Immunol．85:453，1990）。ヒトまたはマウス細胞を、培地を含む24ウェルプレート中で、５％CO₂湿潤雰囲気下で37℃にて５×10⁶/ウェルで、単独で、または所定の濃度でのCpGもしくは非CpG ODNとともに、または E.coliもしくはウシ胸腺（50μg/ml）とともに37℃にて24時間培養した。すべての培養物を18時間で採取し、そして細胞を、既述のようにK562（ヒト）またはYA C-1（マウス）標的細胞に対する標準４時間⁵¹Cr-放出アッセイでのエフェクターとして使用した。溶解単位（LU）の算出については、１LUを、30％特異的溶解をもたらすために必要とされる細胞の数として定義した。指示された場合、IFN-γ （Lee Biomolecular，San Diego，CA）またはIL-12（Pharmingen）に対する中和抗体あるいはそのイソタイプコントロールを、10μg/mlの濃度まで培養の開始時に添加した。抗IL-12添加については、４つのMAB（またはイソタイプコントロール）のそれぞれの10μgを同時に添加した。組換えヒトIL-2を、100U/mlの濃度で使用した。 CpG含有オリゴヌクレオチドがＢ細胞の他にナチュラルキラー（NK）細胞の活性を刺激するかどうかを決定するために、実験を行った。表２に示すように、Cp G ODN１:GCTAGACGTTAGCGT（配列番号19）および3Dd:GAGAAXGCTGGACCTTCCAT （配列番号20）（ここでX＝５メチルシトシン）と培養したマウス脾臓細胞中のN K活性の顕著な誘導を観察した。逆に、非CpGコントロールODNで処置したエフェクターでは比較的誘導がなかった。 CpG モチーフを含むDNAによるが非CpG DNAによらないNK活性の誘導細菌DNAを、37℃にて18時間培養し、次いでＢ細胞が枯渇したマウス脾臓細胞およびヒトPBMCの両方におけるNK溶解活性を誘導したK562（ヒト）またはYac-1 （マウス）標的細胞の殺傷についてアッセイしたが、脊椎動物DNAはアッセイしなかった（表３）。細菌DNAの刺激活性が非メチル化CpGジヌクレオチドの増加したレベルの結果であり得るかどうかを決定するために、非メチル化CpG、メチル化CpGを含む、またはCpGジヌクレオチドを含まない、50以上の合成ODNの活性化特性を試験した。表３にまとめた結果は、合成ODNが、少なくとも１つの非メチル化CpGジヌクレオチドを含む限り、顕著なNK活性を刺激し得ることを示す（Bal las，Z．ら，J．Immunol 157:1840-1845，1996）。CpGがパリンドローム内（例えば、ODN 1585、パリンドロームAACGTTを含む）であるODNの刺激効果では、パリンドローム外のODN（例えば、1613または1619）との差は観察されず、最適刺激が、一般的に、CpGが２つの5'プリンまたは5'GpTジヌクレオチドおよび２つの 3'ピリミジンに隣接したODNに見られたという警告があった。速度論的実験は、O DNの添加の約18時間後にNK活性がピークになったことを示した。データは、マウスNK応答が、CpG DNAによる単球の活性化前に依存的であることを示し、IL-12、 TN F-α、およびIFNの産生を導いた。 ODN配列中のCpGジヌクレオチドを、下線を引くことによって示す；Xはメチルシトシンを示す。小文字は、滴定実験において、隣接する塩基に依存して、非改変ODNの20倍以上強力であるヌクレオチド間結合を改変したヌクレアーゼ抵抗性ホスホロチオエートを示す。ポリＧ末端(g)は、ODN取り込みのレベルを顕著に増加させるので、いくつかのODNで使用された。破線は、指示された変化を除いて、いくつかの塩基が、直前の配列中の塩基と同一であることを示す。 CpGモチーフによる免疫活性化は、CpGに隣接する塩基、ならびにODN内に存在するCpGの数および間隔に依存し得る。理想的塩基環境の単一CpGは、非常に強力かつ有用な免疫アクチベーターであり得るが、より優れた効果が、適切な間隔および隣接する塩基とともにいくつかのCpGを含むODNで見られ得る。マウスＢ細胞の活性化については、最適CpGモチーフは、TGACGTTである。 CpGジヌクレオチドの数、間隔、および隣接塩基を変化する効果を検査させることによって、ヒト細胞の刺激に最適なODN配列を同定するために、以下の研究を行った。ヒトNK細胞の活性化に最適なCpGモチーフを有するホスホロチオエートODNの同定臨床的有用性を有するために、ODNは、ヌクレアーゼ分解に対して防御する形態で被験体に投与されなければならない。ホスホジエステルODNとともにこれを達成するための方法は、当該技術分野で周知であり、そしてナノパーティクルのような脂質または送達システム中のカプセル化を包含する。この防御はまた、ヌクレオチド間結合がヌクレアーゼ抵抗性であるものを含む改変されたDNA骨格のようなDNAへの化学的置換を使用して達成され得る。いくつかの改変は、細胞取り込みを増加させるような追加の所望の特性を与え得る。例えば、ホスホジエステル結合は、硫黄との非架橋酸素原子の１つの置換によって改変され得、これはホスホロチオエートDNAを構成する。ホスホロチオエートODNは、これがまたCpG モチーフを有するならば、細胞取り込みを増強し（Kriegら，Antisense Res．De v．6:133,1996）そしてＢ細胞剌激を改善した。NK活性化は、インビボアジュバント効果と強く相互関係するので、ヒトNK細胞を活性化するホスホロチオエート ODNの同定は非常に重要である。ヒトNK活性化における、種々の塩基環境でCpGジヌクレオチドを含む異なるホスホロチオエートODNの効果を検査した（表４）。TGTCGTTモチーフの２コピーを含むODN 1840は、顕著なNK溶解活性を有した（表４）。NK活性化に最適な追加の ODNをさらに同定するために、CpGモチーフの異なる数および間隔を含む約100ODN を、コントロールとして用いるODN 1982とともに試験した。サンプル結果を、表５に示す。効果的なODNは、一般的に、5'末端でTCまたはTGで始まるが、この必要性は必須ではなかった。内部CpGモチーフを有するODN（例えば、0DN 1840）は、一般的に、GTCGCTモチーフが5'TCの直後に続くODN（例えば、ODN 1967および1968）よりも強力な刺激剤ではない。その3'側の半分に第２のGTCGTTモチーフを有するOD N 1968は、この第２のモチーフを欠くODN 1967よりも一貫して刺激が強かった。しかし、ODN 1967は、実験１および３においてODN 1968よりもわずかに強力であったが、実験２では強力でなかった。第３のGTCGTTモチーフを有するODN 2005は、1968よりも平均してわずかにより高いNK活性を誘導した。しかし、GTCGTTモチーフ間の間隔が、各モチーフ間の２つのTの添加によって増加したODN 2006は、モチーフの１つのみが２つのTの間隔の添加を有するODN 2005およびODN 2007よりもわずかに優れていた。ＣｐＧモチーフ間の最小の受容可能な間隔は、ODNが3 '末端に２つのピリミジン（好ましくはT）を有する限り（例えば、ODN 2015）、１つのヌクレオチドである。驚くべきことに、5'Tと末端どうしで２つのGTCGTT モチーフを連結することはまた、NK活性の合理的な強力なインデューサーを生じた（例えば、ODN 2016）。ODN 2002は、アデニン(a)がそのCpGを分離する（すなわち、CGACGTT）という事実にもかかわらず適切なNK活性化を誘導したので、連続するCpGジヌクレオチドを分離するチミジン(T)の選択は、絶対的ではない。Cp Gのない（例えば、ODN 1982）、一連（run）のCpG、または悪い配列環境中のCpG （例えば、ODN 2010）を含むODNが、NK活性化において刺激効果がほとんどまたは全くなかったことにも留意すべきである。 ¹溶解単位（LU）を、記載のように測定した(8)。簡単にいえば、PBMCを正常ドナーから収集し、そしてFicoll上で回転させ、次いで所定のODN（６μg/mlで培養物に添加した）とともにまたはなしで24時間培養した。次いで、⁵¹Cr標識したK5 62細胞を溶解する能力を決定した。示した結果は、数名の異なる正常ヒトドナーで得られた結果の代表例である。² このオリゴ混合物は、各位置で４つのすべての塩基のランダム選択を含んだ。 ¹PBMCは本質的には本明細書に記載のとおりである。結果は、６つの別々の実験の代表例である；各実験は異なるドナーを示す。² これは、ODN 1840のメチル化型である；Z＝5-メチルシトシン。LUは、溶解単位である；ND＝行わず；CpGジヌクレオチドは、明確化のため下線を引く。実施例５ヒトＢ細胞増殖の活性化に最適なCpGモチーフを有するホスホロチオエートODNの同定 CpG ODNがＢ細胞増殖を誘導する能力は、アジュバント可能性の良好な尺度である。実際、マウスの研究において強力なアジュバント効果を有するODNもまた、Ｂ細胞増殖を誘導する。Ｂ細胞増殖を誘導するために最適なCpG ODNが、NK細胞活性を誘導するものと同じであるかどうかを決定するために、ODNの類似のパネル（表６）を試験した。多くのCpG ODNが剌激性であった。ODN 2006は、最も一貫した刺激を生じた（表６）。実施例６ヒトIL-12分泌を誘導するホスホロチオエートODNの同定 CpG ODNがIL-12分泌を誘導する能力は、特に、IL-12に非常に依存的であるＴｈ１免疫応答を誘導する能力に関して、アジュバント可能性の良好な尺度である。したがって、ホスホロチオエートODNのパネルがインビトロでヒトPBMCからIL- 12分泌を誘導する能力を検査した（表７）。これらの実験は、いくつかのヒトPB MCにおいて、ほとんどのCpG ODNがIL-12分泌を誘導し得ることを示した（例えば、実験１）。しかし、他のドナーは、少数のCpG ODNにのみ応答した（例えば、実験２）。ODN 2006は、ほとんどの被験体からのIL-12分泌の一貫したインデューサーであった（表７）。 ¹PBMCを、正常ドナーから収集し、そしてFicoll上で回転させ、次いで、６μg/m lで培養物に添加した所定のODNを含むまたは含まない96ウェルマイクロタイタープレート中で10⁶細胞/ウェルで培養した。上清を、24時間収集し、そして方法に記載のようにELISAによってIL-12レベルについて試験した。各実験の標準曲線を引き、これは異なるドナーを表す。実施例７Ｂ細胞および単球／NK細胞特異的オリゴヌクレオチドの同定 CpG DNAは、高度に精製されたＢ細胞および単球細胞を直接活性化し得る。CpG DNAがこれらの細胞タイプを活性化するメカニズムには多くの類似性がある。例えば、両方とも、さらに以下に説明するようにNFkB活性化を必要とする。 CpG DNAの異なる免疫効果のさらなる研究において、１つより多くのCpGモチーフがあることを見いだした。詳細には、最良のマウスＢ細胞モチーフを有するオリゴ1668は、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（NK）細胞の両方の活性化の強力なインデューサーであり、一方オリゴ1758は、弱いＢ細胞アクチベーターであるが、なお優れたNK応答を誘導する（表８）。 CpGジヌクレオチドに下線を引く：オリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼ抵抗性を改良するためにホスホロチオエート改変した骨格とともに合成した。¹ 実施例１に記載のように200nM濃度でのオリゴデオキシヌクレオチドとの48時間培養後に³Hチミジン組込みによって測定した。² 溶解単位で測定した。実施例８喘息のマウスモデルにおいて炎症性細胞浸潤および好酸球増多症の発達の抑制６〜８週齢のC56BL/6マウス（The Jackson Laboratory，Bar Harbor，MEから）を、０および７日目に腹腔内（i.p.）注入によって5,000 Schistosoma mans oni卵で免疫した。Schistosoma mansoni卵は、Th2免疫応答（例えば、IgE抗体の産生）を誘導する抗原（Schistosoma mansoni卵抗原（SEA））を含む。IgE抗体産生は、喘息の重要な原因であることが公知である。次いで、免疫したマウスを、オリゴヌクレオチド（i.p.注射によって200μl生理食塩液中に30μg）で処置し、これは、非メチル化CpGモチーフ（すなわち、TC CATGACGTTCCTGACGTT（配列番号39））を含むか、あるいは、含まない（すなわち、コントロール、TCCATGAGCTTCCTGAGTCT（配列番号58））かのいずれかであった。可溶性SEA（25μlの生理食塩液中の10μg）を、14および21日目に鼻内点液によって投与した。生理食塩液を、コントロールとして使用した。マウスを、気道チャレンジ後の種々の時間に屠殺した。全肺洗浄を行って、気道および肺胞炎症細胞を採取した。サイトカインレベルを、ELISAによって洗浄液から測定した。RNAを、CsCl勾配を使用してノーザン分析およびRT-PCR研究のために全肺から単離した。肺を膨張し、そして組織学的検査について４％パラホルムアルデヒドで潅流した。図７は、卵のi.p.によりマウスに最初に注入し、次いで卵抗原を吸入する場合（白丸）、多くの炎症細胞は肺に存在することを示す。しかし、マウスに、最初に、卵とともに非メチル化CpGモチーフを含む核酸を与える場合、肺中の炎症細胞は、卵抗原のその後の吸入によって増加しない（白三角）。図８は、肺洗浄液に存在する好酸球のみが測定される場合、同じ結果が得られることを示す。好酸球は、喘息に最も密接に関連する炎症細胞のタイプである。図９は、マウスを、卵への最初の曝露時にコントロールオリゴで処置する場合、SEAの吸入後の肺への好酸球のその後の流入にほとんど影響がないことを示す。したがって、マウスが14または21日目に卵を吸入する場合、肺において急性炎症応答を発現する。しかし、０および７日目に最初の抗原曝露の時に卵とともに CpGオリゴを与えると、マウスが14日目に卵抗原を吸入する場合に、好酸球の増加をほぼ完全に廃止する。図10は、非常に低用量のオリゴヌクレオチド（＜10μg）がこの防御を与え得ることを示す。図11は、得られる炎症応答が、肺におけるTh2サイトカインIL-4のレベルと相互関係することを示す。図12は、非メチル化CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドの投与が、実際に、IL-12の産生に対する肺のサイトカイン応答を向け直し得ることを示し、これはTh1タイプの免疫応答を示す。図13は、非メチル化CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドの投与がまた、IFN -ガンマの産生に対する肺のサイトカイン応答を向け直し得ることを示し、これはTh1タイプの免疫応答を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１．気流の急性減少を有するまたは有する危険のある被験体を処置する方法であって、少なくとも１つの非メチル化CpGを含む核酸配列の治療的有効量を、気流の急性減少を有するかまたは有する危険のある被験体に投与する工程であって、ここで、該核酸が、少なくとも以下の式を含み、 5'N₁X₁CGX₂N₂3'（配列番号１）ここで、少なくとも１つのヌクレオチドが、連続するCpGを分離し；X₁が、アデニン、グアニン、またはチミジンであり；X₂が、シトシンまたはチミンであり； Nが、任意のヌクレオチドであり、そしてN₁＋N₂が、約２〜26塩基である、工程、を包含する、方法。２．前記核酸配列が、８〜30塩基長である、請求項１に記載の方法。３．前記被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。４．前記気流の急性減少が、リポ多糖（LPS）曝露から生じる、請求項１に記載の方法。５．前記気流の急性減少が、エンドトキシン曝露から生じる、請求項１に記載の方法。６．N₁およびN₂が、CCGGクアドマーまたは１つより多くのCGGトリマーを含み；そして前記核酸配列が、約８〜30塩基長である、請求項５に記載の方法。７．前記核酸配列が、配列番号２である、請求項５に記載の方法。８．請求項１に記載の方法であって、前記核酸配列が以下の式を有し： 5'N₁X₁X₂CGX₃X₄N₂3'（配列番号３）ここで、少なくとも１つのヌクレオチドが、連続するCpGを分離し；X₁X₂が、GpT 、GpG、GpA、ApT、およびApAからなる群より選択され；X₃X₄が、TpTまたはCpTからなる群より選択され；Nが、任意のヌクレオチドであり、そしてN₁＋N₂が、約０〜26塩基である、方法。９．N₁およびN₂が、CCGGクアドマーまたは１つより多くのCCGもしくはCGGトリマーを含み；そして前記核酸配列が、約８〜30塩基長である、請求項８に記載の方法。１０．リポ多糖（LPS）を吸入したかまたは吸入した危険のある被験体において炎症応答を阻害する方法であって、少なくとも１つの非メチル化CpGを含む核酸配列の炎症応答を阻害するために有効な量を、リポ多糖（LPS）を吸入したまたは吸入した危険のある被験体に投与する工程であって、ここで、該核酸が、少なくとも以下の式を含み、 5'N₁X₁CGX₂N₂3'（配列番号１）ここで、少なくとも１つのヌクレオチドが、連続するCpGを分離し；X₁が、アデニン、グアニン、またはチミジンであり；X₂が、シトシンまたはチミンであり； Nが、任意のヌクレオチドであり、そしてN₁＋N₂が、約２〜26塩基である、工程、を包含する、方法。１１．前記核酸配列が、８〜30塩基長である、請求項１０に記載の方法。１２．前記被験体がヒトである、請求項１０に記載の方法。１３．前記被験体がLPSを吸入した、請求項１０に記載の方法。１４．N₁およびN₂が、CCGGクアドマーまたは１つより多くのCGGトリマーを含み；そして前記核酸配列が、約８〜30塩基長である、請求項１３に記載の方法。１５．前記核酸配列が、配列番号２である、請求項１３に記載の方法。１６．請求項１０に記載の方法であって、前記核酸配列が以下の式を有し： 5'N₁X₁X₂CGX₃X₄N₂3'（配列番号３）ここで、少なくとも１つのヌクレオチドが、連続するCpGを分離し；X₁X₂が、GpT 、GpG、GpA、ApT、およびApAからなる群より選択され；X₃X₄が、TpTまたはCpTからなる群より選択され；Nが、任意のヌクレオチドであり、そしてN₁＋N₂が、約０〜26塩基である、方法。１７．N₁およびN₂が、CCGGクアドマーまたは１つより多くのCCGもしくはCGGトリマーを含み；そして前記核酸配列が、約８〜30塩基長である、請求項１６に記載の方法。１８．リポ多糖（LPS）を吸入したまたは吸入した危険のある被験体においてサイトカインのレベルを改変する方法であって、少なくとも１つの非メチル化CpGを含む核酸配列の治療的有効量を、被験体に投与する工程であって、ここで、該核酸が、少なくとも以下の式を含み、 5'N₁X₁CGX₂N₂3'（配列番号１）ここで、少なくとも１つのヌクレオチドが、連続するCpGを分離し；X₁が、アデニン、グアニン、またはチミジンであり；X₂が、シトシンまたはチミンであり； Nが、任意のヌクレオチドであり、そしてN₁＋N₂が、約２〜26塩基である、工程、を包含する、方法。１９．前記核酸配列が、約８〜30塩基長である、請求項１８に記載の方法。２０．前記被験体がヒトである、請求項１８に記載の方法。２１．前記被験体がLPSを吸入した、請求項１８に記載の方法。２２．請求項１８に記載の方法であって、前記核酸配列が以下の式を有し： 5'N₁X₁CGX₂N₂3'（配列番号１）ここで、少なくとも１つのヌクレオチドが、連続するCpGを分離し；X₁が、アデニン、グアニン、またはチミジンであり；X₂が、シトシンまたはチミンであり； Nが、任意のヌクレオチドであり、そしてN₁＋N₂が、約０〜26塩基である、方法。２３．N₁およびN₂が、CCGGクアドマーまたは１つより多くのCGGトリマーを含まず；そして前記核酸配列が、約８〜30塩基長である、請求項２２に記載の方法。２４．請求項１８に記載の方法であって、前記核酸配列が以下の式を有し： 5'N₁X₁X₂CGX₃X₄N₂3'（配列番号３）ここで、少なくとも１つのヌクレオチドが、連続するCpGを分離し；X₁X₂が、GpT 、GpG、GpA、ApT、およびApAからなる群より選択され；X₃X₄が、TpTまたはCpTからなる群より選択され；Nが、任意のヌクレオチドであり、そしてN₁＋N₂が、約０〜26塩基長である、方法。２５．N₁およびN₂が、CCGGクアドマーまたは１つより多くのCCGトリマーもしくはCGGトリマーを含み；そして前記核酸配列が、約８〜30塩基長である、請求項２４に記載の方法。２６．前記改変が、前記サイトカインのレベルの減少である、請求項１８に記載の方法。２７．前記改変が、前記サイトカインのレベルの増加であり、そして該サイトカインが、MIP-2、IL-10、およびIL-12からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。２８．前記サイトカインが、TNF-α、MIP-2、IL-10、IL-12、およびインターフェロン-γからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。