DE69826124T3

DE69826124T3 - Verabreichung der nukleinsäure in den quergestreiften muskel

Info

Publication number: DE69826124T3
Application number: DE69826124T
Authority: DE
Inventors: Michel Bureau; Lluis Mit; Daniel Scherman
Original assignee: Institut Gustave Roussy (IGR)
Current assignee: Institut Gustave Roussy (IGR)
Priority date: 1997-06-30
Filing date: 1998-06-30
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2018-07-01
Also published as: NO996542D0; HUP0004589A1; WO1999001158A1; DE69826124T2; EP0991426B2; CN1261807A; ATE275423T1; HUP0004589A3; KR20010020571A; CA2294793A1; AU8444798A; PL337583A1; CZ475599A3; EP0991426A1; DE69826124D1; JP2002507985A; CZ299473B6; NO996542L; US6939862B2; US20030073653A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine sehr bemerkenswerte Verbesserung des in vivo-Transfers von Nukleinsäuren oder von Nukleinsäuren, die mit Produkten assoziiert sind, die erlauben, die Ausbeute von solchen Transfers zu erhöhen, in die Zellen der quergestreiften Muskeln und auf die Kombination einer Nukleinsäure und des Transferverfahrens gemäß der Erfindung für deren Verwendung für die Gentherapie.
Der Transfer von Genen in eine gegebene Zelle ist die Basis der Gentherapie. Indessen besteht eines der Probleme darin, dahin zu gelangen, eine ausreichende Nukleinsäuremenge in Zellen des zu behandelnden Wirts eindringen zu lassen; tatsächlich muss diese Nukleinsäure, im allgemeinen ein Gen von Interesse, in transfizierten Zellen exprimiert werden. Einer der Ansätze, der in dieser Hinsicht herangezogen wird, ist die Integration der Nukleinsäure in virale Vektoren, insbesondere in Retroviren, Adenoviren oder mit Adenoviren assoziierte Viren gewesen. Diese Systeme nutzen die Mechanismen des Eindringens in Zellen, die von den Viren entwickelt worden sind, wie auch deren Schutz gegen den Abbau aus. Indessen weist dieser Ansatz Nachteile auf und insbesondere ein Risiko der Produktion von infektiösen Viruspartikeln, welche in der Lage sind, sich in dem Wirtsorganismus zu verbreiten, und im Falle der retroviralen Vektoren ein Risiko einer Insertionsmutagenese. Außerdem bleibt das Insertionsvermögen eines therapeutischen oder zu Impfzwecken dienenden Gens in ein virales Genom beschränkt.
In jedem fraglichen Fall erfordert die Entwicklung von viralen Vektoren, die im Rahmen einer Gentherapie einsetzbar sind, auf komplexe Techniken von defekten Viren und Komplementationszelllinien zurückzugreifen.
Ein anderer Ansatz (Wolf et al., Science 247, 1465-68, 1990; Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7213-18, 1996) hat folglich darin bestanden, in den Muskel oder in den Kreislauf eine Nukleinsäure von Plasmid-Natur zu verabreichen, welche assoziiert ist oder nicht assoziert ist mit Komponenten, die dazu bestimmt sind, die Transfektion durch diese zu begünstigen, wie Proteinen, Liposomen, geladenen Lipi den oder kationischen Polymeren, wie Polyethylenimin, die in vitro gute Transfektionsmittel sind (Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6, 1989; Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7, 1987; Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7297-301, 1995).
Seit der anfänglichen Veröffentlichung von J.A. Wolff et al., welche die Fähigkeit des Muskelgewebes, in Form von freiem Plasmid injizierte DNA zu inkorporieren (Wolff et al., Science 247, 1465-1468, 1990) haben zahlreiche Autoren versucht, diesen Prozess zu verbessern (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431; Wolff et al., 1991, BioTechniques 11, 474-485). Aus diesen Versuchen treten einige Tendenzen in den Vordergrund, wie insbesondere:

• die Verwendung von mechanischen Lösungen, um den Eintritt der DNA in die Zellen zu erzwingen, indem die DNA auf Kügelchen adsorbiert wird, die dann in die Gewebe beschleunigt oder geschossen werden („gene gun") (Sanders Williams et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2726-2730; Fynan et al, 1993, BioTechniques 11, 474-485). Diese Verfahren haben sich im Rahmen von Impfstrategien als wirksam erwiesen, erreichen aber lediglich die oberflächlichen Schichten der Gewebe. Im Falle des Muskels wird deren Verwendung einen chirurgischen Zugang erfordern, um zu ermöglichen, den Muskel zu erreichen, denn die Partikel durchdringen die kutanen Gewebe nicht;
• die Injektion von DNA, nicht mehr in Form von freiem Plasmid, sondern assoziiert mit Molekülen, die in der Lage sind, als Vehikel zu dienen, welche den Eintritt der Komplexe in die Zellen vereinfachen. Die kationischen Lipide, die in zahlreichen anderen Transfektionsverfahren eingesetzt werden, haben sich, was eine Anwendung im Muskelgewebe angeht, bis heute als enttäuschend erwiesen, denn jene, die getestet wurden, haben sich als Inhibitoren der Transfektion erwiesen (Schwartz et al., 1996, Gene Ther. 3, 405-411). Das gleiche gilt für die kationischen Peptide und Polymere (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431). Der einzige Fall einer günstigen Kombination scheint die Mischung von Polyvinylalkohol oder Polyvinylpyrrolidon mit der DNA zu sein. Die Erhöhung, die aus diesen Kombinationen resultiert, stellt lediglich einen Faktor unter 10 bezogen auf die nackt injizierte DNA dar (Mumper et al., 1996, Pharmaceutical Research 13, 701-709);
• die Vorbehandlung des Muskels, in den die Injektion vorgenommen werden soll, mit Lösungen, die dazu bestimmt sind, die Diffusion und/oder die Stabilität der DNA zu verbessern (Davis et al., 1993, Hum. Gene Ther. 4, 151-159) oder den Eintritt der Nukleinsäuren zu begünstigen, beispielsweise die Induktion von Phänomenen einer Vermehrung oder Regeneration von Zellen. Die Behandlungen haben insbesondere die Verwendung von Lokalanästhetika oder von Cardiotoxin, von Vasokonstriktoren, Endotoxin oder anderen Molekülen betroffen (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431; Danko et al., 1994, Gene Ther. 1, 114-121; Vitadello et al., 1994, Hum. Gene Ther. 5, 11-18). Diese Vorbehandlungsprotokolle sind schwierig auszuführen, wobei insbesondere Bupivacain erforderlich macht, um wirksam zu sein, in Dosen sehr nahe an letalen Dosen injiziert zu werden. Die vorab erfolgende Injektion von hyperosmotischer Saccharose, welche dazu bestimmt ist, die Diffusion zu verbessern, erhöht des Transfektionsniveau im Muskel nicht (Davis et al., 1993).

Die Elektroporation oder Verwendung von elektrischen Feldern, um Zellen zu permeabilisieren, wird gleichfalls in vitro eingesetzt, um die Transfektion von Zellen in Kultur mit DNA zu begünstigen. Gleichwohl war bis heute zugestanden worden, dass dieses Phänomen einem Effekt entspricht, welcher von einem Schwellenwert abhängig ist, und dass diese Elektropermeabilisierung lediglich bei elektrischen Feldern von relativ hoher Stärke, in der Größenordnung von 800 bis 1200 Volt/cm für tierische Zellen, beobachtet werden kann. Diese Technik wurde gleichfalls vorgeschlagen, um in vivo die Wirksamkeit von Antitumormitteln, wie Bleomycin, in soliden Tumoren beim Menschen zu verbessern (amerikanisches Patent Nr. 5 468 228, L.M. Mir). Mit Impulsen von sehr kurzer Dauer (100 Mikrosekunden) sind diese elektrischen Bedingungen (800 bis 1200 Volt/cm) sehr gut für den intrazellulären Transfer von kleinen Molekülen angepasst. Diese Bedingungen (Impulse von 100 Mikrosekunden) wurden ohne Verbesserung für den Transfer von Nukleinsäuren in vivo in die Leber angewendet, wo Felder unter 1000 Volt/cm sich als vollständig unwirksam und sogar als inhibitorisch verglichen mit der Injektion von DNA in Abwesenheit von elektrischen Impulsen erwiesen haben (Patent WO 97/07826 und Heller et al., FEBS Letters, 389, 225-8, 1996).
Diese Technik weist außerdem Schwierigkeiten bei einer Anwendung in vivo auf, denn die Verabreichung von Feldern einer solchen Intensität kann mehr oder weniger umfangreiche Gewebeläsionen hervorrufen, die kein Problem für die Behandlung von Tumorgeweben darstellen, aber einen Hauptnachteil für den gesunden Patienten oder für den kranken Patienten darstellen können, wenn die Nukleinsäure in andere Gewebe als Tumorgewebe, insbesondere in den quergestreiften Muskel verabreicht wird.
Die Anmeldung WO 98/43702 beschreibt eine Methode zur Einführung von pharmazeutischen Verbindungen und von Nukleinsäuren in den Skelettmuskel unter Verwendung eines Stroms, der aus zweipoligen Wellen gebildet wird.
Wohingegen alle aufgeführten Untersuchungen die Notwendigkeit von hohen elektrischen Feldern, in der Größenordnung von 1000 Volt/cm, erwähnen, um in vivo wirksam zu sein, haben die Anmelder auf wahrhaft unerwartete und bemerkenswerte Weise jetzt gezeigt, dass der Transfer von Nukleinsäuren in Muskeln in vivo auf sehr bedeutende Weise ohne unerwünschte Wirkungen erhöht werden könnte, indem der Muskel elektrischen Impulsen von einpoligen Wellen von geringer Intensität, beispielsweise von 100 oder 200 Volt/cm, und einer relativ langen Dauer unterworfen wird. Außerdem haben die Anmelder festgestellt, dass die große Variabilität der Expression des Transgens, die im Stand der Technik bezüglich des Transfers von DNA in den Muskel beobachtet worden war, durch das erfindungsgemäße Verfahren bemerkenswert verringert wird.
Aus diesem Grund betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Transfer von Nukleinsäuren in einen oder mehrere quergestreifte Muskeln in vivo, in welchem die Zellen der Muskeln mit der zu transferierenden Nukleinsäure durch direkte Verabreichung in das Gewebe oder durch topische oder systemische Verabreichung in Kontakt gebracht werden und in welchem der Transfer durch Anwendung von einem oder mehreren elektrischen Impulsen von einpoligen Wellen mit einer Intensität zwischen 1 und 800 Volt/cm auf die Muskeln sichergestellt wird.
Die Intensität des Felds liegt vorzugsweise zwischen 4 und 400 Volt/cm und die gesamte Dauer der Anwendung liegt über 10 Millisekunden. Die Anzahl von eingesetzten Impulsen beträgt beispielsweise 1 bis 100000 Impulse und die Frequenz der Impulse liegt zwischen 0,1 und 1000 Hertz. Die Frequenz der Impulse liegt vorzugsweise zwischen 0,2 und 100 Hertz. Die Impulse können auch auf unregelmäßige Weise abgegeben werden und die Funktion, welche die Intensität des Felds in Abhängigkeit von der Zeit beschreibt, kann variabel sein. Als Beispiel kann das abgegebene elektrische Feld aus der Kombination von wenigstens einem Feld mit einer Intensität von > 400 V/cm und vorzugsweise zwischen 500 und 800 Volt/cm mit einer kurzen Einheitsdauer (< 1 ms), gefolgt von einem oder mehreren Impulsen von geringerer Intensität, beispielsweise < 400 Volt/cm und vorzugsweise < 200 Volt/cm und mit einer längeren Einheitsdauer (> 1 ms), resultieren. Das Integral der Funktion, welche die Variation des elektrischen Felds mit der Zeit beschreibt, beträgt über 1 kV × ms/cm. Gemäß einer bevorzugten Weise der Erfindung liegt dieses Integral über oder bei 5 kV × ms/cm.
Gemäß einer bevorzugten Weise der Erfindung liegt die Feldstärke der Impulse zwischen 30 und 300 Volt/cm.
Die elektrischen Impulse, beispielsweise mit Rechteckwellen, sind Impulse von einpoligen oszillierenden Wellen von begrenzter Dauer.
Die Verabreichung von elektrischen Impulsen kann durch eine jegliche Methode, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist, erfolgen, beispielsweise:

• System von äußerlichen Elektroden, welche auf beiden Seiten des zu behandelnden Gewebes plaziert werden, insbesondere nicht-invasive Elektroden, die in Kontakt mit der Haut plaziert sind,
• System von in die Gewebe implantierten Elektroden,
• System von Elektroden/Injektionsgerät, welches die gleichzeitige Verabreichung der Nukleinsäuren und des elektrischen Felds erlaubt.

Im Rahmen der Erfindung müssen die Ausdrücke Transfer von DNA oder von Nukleinsäuren durch Anwendung von einem oder mehreren elektrischen Impulsen wie auch die Ausdrücke Elektrotransfer oder ferner Elektrotransfektion als äquivalent angesehen werden und bezeichnen den Transfer von Nukleinsäuren oder von DNA durch die Anwendung oder in Gegenwart eines elektrischen Felds.
Da die Verabreichung in vivo erfolgt, ist es manchmal erforderlich, auf Zwischenprodukte zurückzugreifen, welche die elektrische Kontinuität mit äußerlichen, nicht invasiven Elektroden sicherstellen. Es wird sich beispielsweise um Elektrolyt in Form eines Gels handeln.
Die Nukleinsäuren können durch ein jegliches geeignetes Mittel verabreicht werden, werden aber vorzugsweise in vivo direkt in den Muskel injiziert oder durch einen anderen Weg, lokal oder systemisch, verabreicht, der diese an dem Anwendungsort des elektrischen Felds verfügbar macht. Die Nukleinsäuren können mit Mitteln verabreicht werden, die den Transfer erlauben oder vereinfachen, wie dies zuvor erwähnt worden ist. Insbesondere können diese Nukleinsäuren frei in Lösung vorliegen oder mit synthetischen Mitteln assoziiert sein oder in viralen Vektoren enthalten sein. Die synthetischen Mittel können Lipide oder Polymere, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, oder ebenso weiterhin Targeting-Elemente, welche die Anheftung an die Membran der Zielgewebe erlauben, sein. Unter diesen Elementen kann man Vektoren, die Zucker, Peptide, Antikörper oder Hormonrezeptoren enthalten, aufführen.
Es versteht sich, dass unter diesen Bedingungen der Erfindung die Verabreichung der Nukleinsäuren der Anwendung der elektrischen Felder vorausgehen, gleichzeitig mit dieser erfolgen oder dieser sogar folgen kann.
Aus diesem Grund hat die Erfindung gleichfalls eine Nukleinsäure und ein elektrisches Feld mit einer Intensität zwischen 1 und 800 Volt/cm als Kombinationsprodukt für deren gleichzeitige, getrennte oder zeitlich gestaffelte Verabreichung an den quergestreiften Muskel in vivo zum Gegenstand. Die Intensität des Felds liegt vorzugsweise zwischen 4 und 400 Volt/cm, noch mehr bevorzugt liegt die Intensität des Felds zwischen 30 und 300 Volt/cm.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in der Gentherapie einsetzbar, d.h. der Therapie, bei welcher die Expression eines transferierten Gens, aber gleichfalls die Modulation oder die Blockierung eines Gens erlaubt, die Behandlung einer speziellen Pathologie sicherzustellen.
Die Muskelzellen werden vorzugsweise mit dem Ziel einer Gentherapie behandelt, welche erlaubt:

• entweder die Korrektur der Dysfunktionen der Muskelzellen selbst (beispielsweise für die Behandlung von Myopathien oder Muskeldystrophien, die mit genetischen Defekten verbunden sind),
• oder den Schutz und/oder die Regeneration der Vaskularisation oder der Innervierung des Muskels oder anderer Muskeln oder Organe durch trophische, neurotrophische und angiogenetische Faktoren, welche durch das Transgen produziert werden,
• oder die Umwandlung des Muskels in ein Organ, welches Produkte sezerniert, die zu einer therapeutischen Wirkung führen, wie das Produkt des Gens selbst (beispielsweise Thrombose und Hämostase regulierende Faktoren, trophische Faktoren, Hormone, wie Insulin, oder andere) oder wie ein aktiver Metabolit, der im Muskel dank der Hinzufügung des therapeutischen Gens synthetisiert wird,
• oder eine Impfanwendung oder immunstimulierende Anwendung.

Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die Kombination der elektrischen Impulse eines Felds mit Zusammensetzungen, die Nukleinsäuren enthalten, die in Hinblick auf eine jegliche Verabreichung, welche erlaubt, Zugang zu einem quergestreiften Muskel zu haben, auf topischem, kutanem, oralem, vaginalem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraokularem, transdermalem u.s.w. Wege formuliert sind. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung enthalten vorzugsweise einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Vehikel, welcher bzw. welches für eine injizierbare Formulierung, insbesondere für eine direkte Injektion auf der Ebene des gewünschten Organs, oder für eine jegliche andere Verabreichung annehmbar ist. Es kann sich insbesondere um sterile, isotonische Lösungen oder um trockene, insbesondere lyophilisierte Zusammensetzungen handeln, die durch Zugabe von sterilisiertem Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung je nach Fall die Konstituierung von injizierbaren Lösungen erlauben. Die Nukleinsäure dosen, die für die Injektion eingesetzt werden, wie auch die Anzahl von Verabreichungen und das Volumen der Injektionen können abhängig von verschiedenen Parametern und insbesondere abhängig von der eingesetzten Verabreichungsweise, der betreffenden Pathologie, des zu exprimierenden Gens oder ferner der Dauer der angestrebten Behandlung angepasst werden.
Die Nukleinsäuren können synthetischen oder biosynthetischen Ursprungs sein oder aus Viren oder prokaryotischen Zellen oder eukaryotischen Zellen, die von einzelligen Organismen (beispielsweise Hefen) oder mehrzelligen Organismen stammen, extrahiert werden. Sie können in Kombination mit der Gesamtheit oder einem Teil der Komponenten des Herkunftsorganismus und/oder des Synthesesystems verabreicht werden.
Die Nukleinsäure kann eine Desoxyribonukleinsäure oder eine Ribonukleinsäure sein. Es kann sich um Sequenzen natürlicher oder künstlicher Herkunft und insbesondere um genomische DNA, cDNA, mRNA, tRNA und rRNA, hybride Sequenzen oder synthetische oder halbsynthetische Sequenzen von modifizierten oder nicht-modifizierten Oligonukleotiden handeln. Diese Nukleinsäuren können durch eine jegliche Technik erhalten werden, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist, und insbesondere durch Screenen von Banken, durch chemische Synthese oder ferner durch gemischte Methoden, welche die chemische oder enzymatische Modifizierung von Sequenzen, die durch Screenen von Banken erhalten worden sind, umfassen. Sie können chemisch modifiziert werden.
Insbesondere kann die Nukleinsäure eine Sinn- oder Antisinn-DNA oder -RNA oder mit katalytischer Aktivität, wie ein Ribozym, sein. Unter „Antisinn" versteht man eine Nukleinsäure mit einer Sequenz, die komplementär zu einer Zielsequenz ist, beispielsweise eine mRNA-Sequenz, deren Expression man durch Hybridisierung an die Zielsequenz blockieren möchte. Unter „Sinn" versteht man eine Nukleinsäure mit einer Sequenz, die homolog oder identisch zu einer Zielsequenz ist, beispielsweise eine Sequenz, die an einen proteinartigen und an der Expression eines gegebenen Gens beteiligten Transkriptionsfaktor bindet. Gemäß einer bevorzugten Ausführungweise umfasst die Nukleinsäure ein Gen von Interesse und Elemente, die die Expression des Gens von Interesse erlauben. Das Nukleinsäurefragment liegt vorteilhafterweise in Form eines Plasmids vor.
Die Desoxyribonukleinsäuren können einzel- oder doppelsträngig sein ebenso wie kurze Oligonukleotide oder längere Sequenzen. Sie können therapeutische Gene, die Transkription oder die Replikation regulierende Sequenzen oder Regionen für eine Bindung an andere Zellbestandteile u.s.w. enthalten. Im Sinne der Erfindung versteht man unter „therapeutischem Gen" insbesondere ein jegliches Gen, welches eine RNA oder ein proteinartiges Produkt mit einer therapeutischen Wirkung kodiert. Das proteinartige Produkt kodiert vielleicht ein Protein, ein Peptid u.s.w. Dieses proteinartige Produkt kann gegenüber der Zielzelle homolog sein (d.h. ein Produkt, das in der Zielzelle normalerweise exprimiert wird, wenn jene keinerlei Pathologie aufweist). In diesem Falle erlaubt die Expression des Transgens beispielsweise, eine unzureichende Expression in der Zelle oder die Expression eines aufgrund einer Modifikation inaktiven oder schwach aktiven Proteins zu beheben oder erlaubt ferner, das Protein überzuexprimieren. Das therapeutische Gen kann auch eine Mutante eines zellulären Proteins mit einer erhöhten Stabilität, einer modifizierten Aktivität u.s.w. kodieren. Das proteinartige Produkt kann gleichfalls gegenüber der Zielzelle heterolog sein. In diesem Falle kann ein exprimiertes Protein beispielsweise eine fehler- oder mangelhafte Aktivität in der Zelle komplettieren oder bereitstellen (Behandlung von Myopathien/Muskeldystrophien oder Enzymdefekten oder -mängeln) oder ermöglichen, gegen eine Pathologie zu kämpfen oder eine Immunantwort zu stimulieren.
Unter den therapeutischen Produkten im Sinne der Erfindung kann man insbesondere die Gene aufführen, die kodieren für

– die Enzyme, wie a-1-Antitrypsin, die Proteinasen (Metalloproteinasen, Urokinase, uPA, tPA, ... Streptokinase), die Proteasen, die Vorstufen spalten, um aktive Produkte (ACE, ICE, ...) oder deren Antagonisten (TIMP-1, Gewebeplasminogenaktivator-Inhibitor PAI, TFPI, freizusetzen,
– die Blutderivate, wie die an der Gerinnung beteiligten Faktoren: Faktoren VII, VIII, IX, die Komplementfaktoren, Thrombin,
– die Hormone oder die Enzyme, die an dem Syntheseweg der Hormone beteiligt sind, oder die Faktoren, die an der Kontrolle der Synthese oder der Exkretion oder der Sekretion der Hormone beteiligt sind, wie Insulin, Insulin nahe stehende Faktoren (IGF), oder Wachstumshormon, ACTH, die Enzyme der Synthese der Sexualhormone,
– die Lymphokine und Zytokine: Interleukine, Chemokine (CXC und CC), Interferone, TNF, TGF, chemotaktische Faktoren oder Aktivatoren, wie MIF, MAF, PAF, MCP-1, Eotaxin, LIF u.s.w. (französisches Patent Nr. 92 03120),
– die Wachstumsfaktoren, beispielsweise die IGF, EGF, FG F, KGF, NGF, PDGF, PIGF, HGF, Proliferin,
– die angiogenetischen Faktoren, wie VEGF oder FG F, Angiopoietin 1 oder 2, Endothelin,
– die Enzyme der Synthese von Neurotransmittern,
– die trophischen, insbesondere neurotrophischen Faktoren für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, von Traumatismen, die dem Nervensystem Schaden zugefügt haben, oder von retinalen Degenerationen, wie die Mitglieder der Familie der Neurotrophine, wie NGF, BDNF, NT3, NT4/5, NT6, deren Derivate und verwandte Gene – die Mitglieder der Familien des CNTF, wie CNTF, Axokin, LIF und dessen Derivate – IL6 und dessen Derivate – Cardiotrophin und dessen Derivate – GDNF und dessen Derivate – die Mitglieder der Familie der IGF, wie IGF-1, IFGF-2 und deren Derivate – die Mitglieder der Familie der FG F, wie FGF 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und deren Derivate, TGFb,
– die Knochenwachstumsfaktoren,
– die hämopoetischen Faktoren, wie Erythropoietin, GM-CSF, M-CSF, LIF u.s.w.,
– die Proteine der zellulären Architektur, wie Dystrophin oder ein Minidystrophin (französisches Patent Nr. 91 11947), die Suizid-Gene (Thymidinkinase, Cytosindesaminase, Enzyme mit Cytochrom P450), die Gene von Hämoglobin und von anderen proteinartigen Transportmolekülen,
– die Gene, welche den Proteinen entsprechen, welche an dem Stoffwechsel der Lipide beteiligt sind, vom Typ Apolipoprotein, ausgewählt unter den Apolipoproteinen A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J und apo(a), die Enzyme des Stoffwechsels, wie beispielsweise die Lipasen, Lipoprotein-Lipase, hepatische Lipase, Lecithin-Cholesterol-Acyltransferase, 7-alpha-Cholesterolhydroxylase, Phosphatidylsäurephosphatase oder ferner Proteine, die für den Transfer von Lipiden zuständig sind, wie das für den Transfer der Cholesterolester zuständige Protein und das für den Transfer der Phospholipide zuständige Protein, ein Bindungsprotein der HDL oder ferner ein Rezeptor, der beispielsweise unter den Rezeptoren für die LDL, den Rezeptoren der Chylomikronen-Überreste („Remnants") und den Scavenger-Rezeptoren u.s.w. ausgewählt wird. Man kann außerdem Leptin für die Behandlung von Obesität zusetzen.
– die Faktoren, welche den Blutdruck regulieren, wie die an dem NO-Stoffwechsel beteiligten Enzyme, Angiotensin, Bradykinin, Vasopressin, ACE, Renin, die Enzyme, die die Mechanismen der Synthese oder des Ausstoßes („relargage") der Prostaglandine, von Thromboxan oder von Adenosin kodieren, die Rezeptoren von Adenosin, die Kallikreine und Kallistatine, ANP, ANF, die diuretischen oder antidiuretischen Faktoren, die an der Synthese, dem Stoffwechsel oder dem Ausstoß der Mediatorsubstanzen, wie Histamin, Serotonin, den Katecholaminen und den Neuropeptiden, beteiligten Faktoren,
– die anti-angiogenetischen Faktoren, wie der Ligand von Tie-1 und von Tie-2, Angiostatin, der Faktor ATF, die Derivate von Plasminogen, Endothelin, die Thrombospondine 1 und 2, PF-4, Interferon a oder b, Interleukin 12, TNFa, der Rezeptor der Urokinase, flt1, KDR, PAI1, PAI2, TIMP1, das Prolactin-Fragment,
– die gegen Apoptose schützenden Faktoren, wie die AKT-Familie,
– die Proteine, die in der Lage sind, einen Zelltod zu induzieren, die entweder durch sich selbst aktiviert werden, wie die Caspasen, oder vom „Pro-Drug"-Typ, welche eine Aktivierung durch andere Faktoren erfordern, oder die Proteine, die Pro-Drugs aktivieren zu einem Mittel, welches einen Zelltod hervorruft, wie die Thymidinkinase des Herpes-Virus, die Desaminasen, welche insbesondere ermöglichen, die Anti-Krebs-Therapien mit in Betracht zu ziehen,
– die an den interzellulären Kontakten und der interzellulären Adhäsion beteiligten Proteine: VCAM, PECAM, ELAM, ICAM, Integrine, Cathenine,
– die Proteine der extrazellulären Matrix,
– die an der Wanderung von Zellen beteiligten Proteine,
– die Proteine vom Signaltransduktionstyp, FAK-Typ, MEKK, p38-Kinase, Tyrosinkinasen, Serin-Threonin-Kinasen,
– die an der Regulation des Zellzyklus beteiligten Proteine (p21, p16, Cycline, ...) wie auch die mutierten oder abgeleiteten dominant negativen Proteine, die den Zellzyklus blockieren und gegebenenfalls die Apoptose induzieren können,
– die Transkriptionsfaktoren: jun, fos, AP1, p53, ... und die Proteine der p53-Signalkaskade,
– die für die Struktur der Zelle verantwortlichen Proteine, wie die intermediären Filamente (Vimentin, Desmin, Keratine), Dystrophin, die an der muskulären Kontraktionsfähigkeit und der Kontrolle der muskulären Kontraktionsfähigkeit beteiligten Proteine, insbesondere die an dem Calciumstoffwechsel und dem Calcium-Fluss in den Zellen beteiilgten Proteine (SERCA, ...).

Im Falle von Proteinen, die durch Ligand-und-Rezeptor-Systeme wirken, kann in Betracht gezogen werden, den Liganden oder den Rezeptor (Bsp. FGF-R, VEGF-R, ...) einzusetzen. Man kann gleichfalls Gene aufführen, die Fragmente oder Mutanten von Proteinen von Liganden oder Rezeptoren, insbesondere der vorerwähnten Proteine, kodieren, die entweder eine höhere Aktivität als das vollständige Protein oder eine Antagonisten-Aktivität, ja sogar vom „dominant negativen" Typ bezogen auf das Ausgangsprotein aufweisen (beispielsweise Fragmente von Rezeptoren, die die Verfügbarkeit von zirkulierenden Proteinen hemmen, die assoziiert sind oder nicht assoziiert sind mit Sequenzen, die eine Sekretion dieser Fragmente gegenüber einer Verankerung in der Zellmembran induzieren, oder von anderen für die Modifikation des intrazellulären Verkehrs von diesen Ligand-Rezeptor-Systemen zuständigen Systemen derart, dass die Verfügbarkeit von einem der Elemente umgeleitet wird), oder sogar eine eigene Aktivität, welche sich von jener des vollständigen Proteins (Bsp. ATF) unterscheidet, aufweist.
Unter den anderen Proteinen oder Peptiden, die durch den Muskel sekretiert werden können, ist es wichtig, die Antikörper, die variablen einzelkettigen Antikörperfragmente (ScFv) oder ein jegliches anderes Antikörperfragment, welches Erkennungsfähigkeiten aufweist für dessen Einsatz in der Immuntherapie, beispielsweise für die Behandlung von Infektionskrankheiten, von Tumoren, von Autoimmunerkrankungen, wie multipler Sklerose (Antiidiotyp-Antikörper), wie auch die ScFv, die sich an die proinflammatorischen Zytokine, wie beispielsweise IL1 und TNFa, binden, für die Behandlung von rheumatoider Arthritis mit Nachdruck aufzuführen. Andere Proteine von Interesse sind, nicht erschöpfend, lösliche Rezeptoren, wie beispielsweise der lösliche CD4-Rezeptor und der lösliche TNF-Rezeptor für die anti-HIV-Therapie, der TNFα-Rezeptor oder der lösliche IL1-Rezeptor für die Behandlung von rheumatoider Arthritis, der lösliche Acetylcholinrezeptor für die Behandlung von Myasthenie; Substrat- oder Inhibitorpeptide von Enzymen oder ebenso Agonisten- oder Antagonistenpeptide von Rezeptoren oder von Adhäsionsproteinen, wie beispielsweise für die Behandlung von Asthma, von Thrombosen, von Restenose, Metastasen oder Entzündungen; künstliche, chimäre oder verkürzte Proteine. Unter den Hormonen von wesentlichem Interesse kann man Insulin im Falle von Diabetes, Wachstumshormon und Calcitonin aufführen. Man kann ferner Proteine aufführen, die in der Lage sind, eine Antitumor-Immunität zu induzieren oder die Immunantwort zu stimulieren (IL2, GM-CSF, IL12 u.s.w.). Schließlich kann man die Zytokine aufführen, die die T_H1-Antwort verringern, wie IL10, IL4 und IL13.
Die zahlreichen Beispiele, die vorausgegangen sind, und jene, die folgen, veranschaulichen den potentiellen Umfang des Anwendungsbereichs der Erfindung.
Die therapeutische Nukleinsäure kann gleichfalls ein Gen oder eine Antisinn-Sequenz sein, dessen bzw. deren Expression in der Zielzelle erlaubt, die Expression von Genen oder die Transkription von zellulären mRNAs zu kontrollieren. Solche Sequenzen können beispielsweise in der Zielzelle in RNA, die zu zellulären mRNAs komplementär ist, transkribiert werden und so deren Translation in Protein gemäß der in dem Europäischen Patent Nr. 140 308 beschriebenen Technik blockieren. Die therapeutischen Gene umfassen gleichfalls die Sequenzen, die Ribozyme kodieren, die in der Lage sind, selektiv Ziel-RNAs zu zerstören (Europäisches Patent Nr. 321 201).
Wie weiter oben angegeben, kann die Nukleinsäure gleichfalls ein oder mehrere Gene umfassen, die ein Antigen-Peptid kodieren, welches in der Lage ist, in dem Menschen oder dem Tier eine Immunantwort zu erzeugen. Bei dieser besonderen Ausführungsweise erlaubt die Erfindung folglich die Realisierung entweder von Impfstoffen oder von immunthe rapeutischen Behandlungen, die auf den Menschen oder das Tier angewendet werden, insbesondere gegen Mikroorganismen, Viren oder Krebserkrankungen. Es kann sich insbesondere um Antigen-Peptide, die für das Epstein-Barr-Virus, das HIV-Virus, das Hepatitis B-Virus (Europäisches Patent Nr. 185 573), das Pseudotollwutvirus, das „syncitia forming virus", andere Viren spezifisch sind, oder ferner um für Tumore spezifische Antigene, wie die Proteine MAGE (Europäisches Patent Nr. 259 212), wie die Proteine MAGE 1, MAGE 2, oder Antigene, die eine Antitumor-Antwort stimulieren können, wie bakterielle Heat-shock-Proteine, handeln.
Die Nukleinsäure umfasst vorzugsweise gleichfalls Sequenzen, die die Expression des therapeutischen Gens und/oder des Gens, welches das Antigen-Peptid kodiert, in dem Muskel erlauben und/oder begünstigen. Es kann sich um Sequenzen handeln, die von Natur aus für die Expression des betreffenden Gens verantwortlich sind, wenn diese Sequenzen in der Lage sind, in der transfizierten Zelle zu funktionieren. Es kann sich gleichfalls um Sequenzen von unterschiedlicher Herkunft handeln (die für die Expression von anderen Proteinen verantwortlich oder sogar synthetisch sind). Es kann sich insbesondere um Promotorsequenzen von eukaryotischen oder viralen Genen handeln. Es kann sich beispielsweise um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom der Zelle, die man zu transfizieren wünscht, stammen. Unter den eukaryotischen Promotoren kann man einen jeglichen Promotor oder eine jegliche abgeleitete Sequenz einsetzen, der bzw. die die Transkription eines Gens auf spezifische oder nicht spezifische Weise, stark oder schwach stimuliert oder unterdrückt. Es kann sich insbesondere um ubiquitäre Promotoren (HPRT; Vimentin, a-Aktin, Tubulin u.s.w.), um Promotoren von therapeutischen Genen (Typ MDR, CFTR u.s.w.), um gewebespezifische Promotoren (Typ Promotoren der Gene von Desmin, den Myosinen, der Kreatinkinase, der Phosphoglyceratkinase) oder ferner um Promotoren, die auf einen Stimulus ansprechen, wie Promotoren, die auf die natürlichen Hormone ansprechen (Steroidhormonrezeptor, Retinsäurerezeptor u.s.w.), oder um einen Promotor, der durch die Antibiotika (Tetracyclin, Rapamycin u.s.w.) reguliert wird, um Promotoren, die auf eine Diät ansprechen, wie die Promotoren, die auf Ballaststoffe ansprechen, oder um andere Promotoren, welche auf andere Moleküle natürlichen oder synthetischen Ursprungs ansprechen, handeln. Es kann sich ebenso um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom eines Virus stammen. In dieser Hinsicht kann man beispielsweise die Promotoren der EIA-Gene des Adenovirus, MLP oder die Promotoren, die aus den Genomen der Viren CMV, RSV, SV40 u.s.w. stammen, aufführen. Es kann sich um induzierbare oder reprimierbare Promotoren handeln. Außerdem können diese Expressionssequenzen durch Hinzufügung von Aktivierungssequenzen und Regulationssequenzen, die eine konditionale, vorübergehende/transitorische Expression, eine gewebespezifische oder hauptsächliche Expression u.s.w. erlauben, modifiziert werden.
Außerdem kann die Nukleinsäure gleichfalls, insbesondere stromaufwärts von dem therapeutischen Gen, eine Signalsequenz umfassen, die das synthetisierte therapeutische Produkt in die Sekretionswege der Zielzelle dirigiert. Diese Signalsequenz kann die natürliche Signalsequenz des therapeutischen Produkts sein, es kann sich aber gleichfalls um eine jegliche andere funktionsfähige Signalsequenz oder um eine künstliche Signalsequenz handeln. Die Nukleinsäure kann gleichfalls eine Signalsequenz umfassen, die das synthetisierte therapeutische Produkt in Richtung eines speziellen Kompartiments der Zelle, wie beispielsweise die Peroxisomen, die Lysosomen und die Mitochondrien für die Behandlung von beispielsweise genetisch bedingten mitochondrialen Erkrankungen, dirigiert.
Andere Gene, für welche ein Interesse besteht, wurden insbesondere durch McKusick, V.R. Mendelian (Inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes. B. Auflage. John Hopkins University Press (1988)), und in Stanbury, J.B., et al. (The metabolic basis of inherited disease, 5. Auflage. McGraw-Hill (1983)) beschrieben. Die Gene von Interesse decken die Proteine, die am Stoffwechsel der Aminosäuren, der Lipide und anderer Bestandteile der Zelle beteiligt sind, mit ab.
Man kann so nicht einschränkend die Gene aufführen, die mit Krankheiten des Stoffwechsels der Kohlenhydrate in Verbindung stehen, wie beispielsweise Fructose-1-phosphataldolase, Fructose-1,6-diphosphatase, Glucose-6-phosphatase, lysosomale a-1,4-Glucosidase, Amylo-1,6-glucosidase, Amylo-(1,4:1,6)-transglucosidase, muskuläre Phosphorylase, muskuläre Phosphofructokinase, Phosphorylase-b-kinase, Galactose-1-phosphaturidyltransferase, alle Enzyme des Pyruvatdehydrogenase-Komplexes, Pyruvatcarboxylase, 2-Oxoglutaratglyoxylasecarboxylase, D-Glyceratdehydrogenase.
Man kann gleichfalls aufführen:

– die mit Krankheiten des Stoffwechsels der Aminosäuren in Verbindung stehenden Gene, wie beispielsweise Phenylalaninhydroxylase, Dihydrobiopterinsynthetase, Tyrosinaminotransferase, Tyrosinase, Histidinase, Fumarylacetoacetase, Glutathionsynthetase, g-Glutamylcysteinsynthetase, Ornithin-d-aminotransferase, Carbamoylphosphatsynthetase, Ornithincarbamoyltransferase, Argininosuccinatsynthetase, Argininosuccinatlyase, Arginase, L-Lysindehydrogenase, L-Lysinketoglutaratreductase, Valintransaminase, Leucin-Isoleucin-Transaminase, Decarboxylase der 2-Ketosäuren mit verzweigter Kette, Isovaleryl-CoA-dehydrogenase, Acyl-CoA-dehydrogenase, 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-lyase, Acetoacetyl-CoA-3-ketothiolase, Propionyl-CoA-carboxylase, Methylmalonyl-CoA-mutase, ATP:Cobalaminadenosyltransferase, Dihydrofolatreductase, Methylentetrahydrofolatreductase, Cystathionin-b-synthetase, der Sarcosindehydrogenase-Komplex, die Proteine, die zu dem System der Spaltung von Glycin gehören, b-Alanintransaminase, Serum-Carnosinase, zerebrale Homocarnosinase;
– die Gene, die mit Krankheiten des Stoffwechsels der Fette und der Fettsäuren in Verbindung stehen, wie beispielsweise Lipoproteinlipase, Apolipoprotein C-II, Apolipoprotein E, andere Apolipoproteine, Lecithin-Cholesterol-Acyltransferase, der Rezeptor der LDL, Sterolhydroxylase aus der Leber, „Phytansäure"-a-hydroxylase;
– die Gene, die mit lysosomalen Defekten in Verbindung stehen, wie beispielsweise lysosomale a-L-Iduronidase, lysosomale Iduronatsulfatase, lysosomale Heparan-N-sulfatase, lysosomale N-Acetyl-a-D-glucosaminidase, lysosomale Acetyl-CoA:a-Glucosamin-N-acetyltransferase, lysosomale N-Acetyl-a-D-glucosamin-6-sulfatase, lysosomale Galactosamin-6-sulfatsulfatase, lysosomale b-Galactosidase, lysosomale Arylsulfatase B, lysosomale b-Glucuronidase, N-Acetylglucosaminylphosphotransferase, lysosomale a-D-Mannosidase, lysosomale a-Neuraminidase, lysosomale Aspartylglycosaminidase, lysosomale a-L-Fucosidase, lysosomale saure Lipase, lysosomale saure Ceramidase, lysosomale Sphingomyelinase, lysosomale Glucocerebrosidase und lysosomale Galactocerebrosidase, lysosomale Galactosylceramidase, lysosomale Arylsulfatase A, a-Galactosidase A, lysosomale saure b-Galactosidase, Kette a von lysosomaler Hexosaminidase A.

Man kann gleichfalls nicht einschränkend die Gene aufführen, die mit den Krankheiten des Stoffwechsels der Steroide und der Lipide in Verbindung stehen, die Gene, die mit Krankheiten des Stoffwechsels der Purine und der Pyrimidine in Verbindung stehen, die Gene, die mit Krankheiten des Stoffwechsels des Porphyrins und des Häms in Verbindung stehen, die Gene, die mit Krankheiten des Stoffwechsels des Bindegewebes, der s und der Knochen in Verbindung stehen, wie auch die Gene, die mit Krankheiten des Bluts und der hämopoetischen Organe, der Muskeln (Myopathie), des Nervensystems (neurodegenerative Erkrankungen) oder des Kreislaufapparats (beispielsweise Behandlung der Ischämien und der Stenose) in Verbindung stehen, und die Gene, die an genetisch bedingten mitochondrialen Erkrankungen beteiligt sind.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Nukleinsäure mit einer jeglichen Art von Vektoren oder einer jeglichen Kombination dieser Vektoren, welche erlauben, den Transfer von Genen zu verbessern, kombiniert werden, beispielsweise, nicht einschränkend, mit Vektoren, wie Viren, synthetischen oder biosynthetischen Agentien (beispielsweise lipidartigen, polypeptidartigen, glycosidischen oder polymeren) oder ferner beschleunigten oder nicht beschleunigten Kugeln. Die Nukleinsäuren können auch in einen Muskel injiziert werden, der einer Behandlung unterzogen worden ist, welche darauf abzielt, den Transfer von Genen zu verbessern, beispielsweise einer Behandlung von pharmakologischer Natur unter lokaler oder systemischer Anwendung oder einer enzymatischen, permeabilisierenden (Verwendung von grenzflächenaktiven Mitteln), chirurgischen, mechanischen, thermischen oder physikalischen Behandlung.
Der Vorteil der Verwendung des Muskels im Rahmen einer Gentherapie beruht auf zahlreichen Faktoren: • der bemerkenswerten Stabilität der Expression der Transgene für mehr als mehrere Monate, welche folglich die stabile und anhaltende Produktion eines intramuskulären oder sezernierten therapeutischen Proteins erlaubt,

• der Leichtigkeit des Zugangs zum Muskelgewebe, welche eine direkte, schnelle und nicht gefährliche Verabreichung in ein nicht-vitales Organ erlaubt,
• dem bedeutenden Volumen der Muskelmasse, welches eine Mehrzahl von Verabreichungsstellen ermöglicht,
• den umfassend nachgewiesenen sekretorischen Fähigkeiten des Muskels.

Zu diesen Vorteilen kommt die Sicherheit hinzu, die durch die lokale Behandlung, welche mit der Verwendung von lokalen und zielgerichteten elektrischen Feldern verbunden ist, beigetragen wird.
Durch die Gesamtheit dieser Vorteile und die mit der Verwendung von schwachen Feldern verbundene Sicherheit könnte die Erfindung auf der Ebene des Herzmuskels für die Behandlung von Cardiopathien, beispielsweise unter Verwendung eines dazu angepassten Defibrillators, eingesetzt werden. Sie könnte auch Anwendung finden für die Behandlung der Restenose durch die Expression von Genen, die inhibitorisch auf die Proliferation von glatten Muskelzellen wirken, wie des GAX-Proteins.
Die Kombination von wenig starken Feldern und von langen Verabreichungsdauern, welche insbesondere auf die Muskeln in vivo angewendet wird, verbessert die Transfektion durch die Nukleinsäuren, ohne bemerkenswerte Schädigungen der Gewebe zu verursachen. Diese Ergebnisse verbessern die Ausbeute der DNA-Transfers im Rahmen der Gentherapie, welche Nukleinsäuren einsetzt.
Folglich erlauben die Vorteile des Muskelgewebes, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verbunden sind, erstmalig in Betracht zu ziehen, durch Gentherapie ein Mittel in physiologischen und/oder therapeutischen Dosen entweder in den Muskelzellen oder sekretiert in deren Umgebung oder in den Blutkreislauf oder in den lymphatischen Kreislauf zu produzieren. Außerdem erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren zum ersten Mal die feine Modulation und die Kontrolle der wirksamen Menge eines exprimierten Transgens durch die Möglichkeit, das Volumen des zu transfizierenden Muskelgewebes zu modulieren, beispielsweise mittels einer Mehrzahl von Verabreichungsstellen, oder ferner die Möglichkeit, die Anzahl, die Form, die Oberfläche und die Anordnung der Elektroden zu modulieren. Ein zusätzliches Kontrollelement ergibt sich aus der Möglichkeit, die Wirksamkeit der Transfektion durch die Variation der Feldstärke, der Anzahl, der Dauer und der Frequenz der Impulse und, selbstverständlich gemäß dem Stand der Technik, der Verabreichungsmenge und des Verabreichungsvolumens der Nukleinsäuren zu modulieren. Man kann so ein für das gewünschte Produktions- oder Sekretionsniveau geeignetes Transfektionsniveau erhalten. Das Verfahren erlaubt schließlich ein Mehr an Sicherheit verglichen mit den chemischen oder viralen Verfahren zum Transfer von Genen in vivo, bei welchen die Beeinträchtigung von anderen Organen als des Zielorgans nicht vollständig ausgeschlossen und beherrscht werden kann. Tatsächlich erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Kontrolle der Lage der transfizierten Gewebe (streng verbunden mit dem Gewebevolumen, das den örtlichen elektrischen Impulsen unterworfen wird) und trägt folglich die Möglichkeit einer Rückkehr zu der Ausgangssituation durch die vollständige oder teilweise operative Entfernung des Muskels, welche durch den nicht-vitalen Charakter dieses Gewebes und durch seine Regnerationsfähigkeiten ermöglicht wird, bei. Diese große Anpassungsfähigkeit der Verwendung erlaubt, das Verfahren je nach der Tierspezies (Anwendungen beim Menschen oder veterinärmedizinische Anwendungen), dem Alter des Patienten, dessen physiologischem und/oder pathologischen Zustand zu optimieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt außerdem erstmals, Nukleinsäuren von großer Größe durch Transfektion zu transferieren im Gegensatz zu den viralen Methoden, die durch die Größe des Kapsids begrenzt werden. Diese Möglichkeit ist essentiell für den Transfer von Genen von sehr großer Größe wie jenem des Dystrophins, oder von Genen mit Introns und/oder regulatorischen Elementen von großer Größe, was beispielsweise für eine physiologisch regulierte Produktion von Hormonen erforderlich ist. Diese Möglichkeit ist essentiell für den Transfer von Episomen oder künstlichen Hefe-Chromosomen oder von Minichromosomen.
Die folgenden Beispiele sind dazu bestimmt, die Erfindung auf nichteinschränkende Weise zu veranschaulichen.
In diesen Beispielen wird Bezug genommen werden auf die folgenden Figuren:
1 Wirkungen von elektrischen Impulsen von hoher Feldstärke auf die Transfektion des kranialen Tibia-Muskels bei der Maus mittels der Plasmid-DNA pXL2774; Mittelwerte ± Standardabweichung.
2 Wirkungen von elektrischen Impulsen von mittlerer Feldstärke auf die Transfektion des kranialen Tibia-Muskels bei der Maus mittels der Plasmid-DNA pXL2774; Mittelwerte ± Standardabweichung.
3 Wirkungen von elektrischen Impulsen von geringer Feldstärke und von unterschiedlichen Dauern auf die Transfektion des kranialen Tibia-Muskels bei der Maus mittels der Plasmid-DNA pXL2774; Mittelwerte ± Standardabweichung.
4 Wirkungen von elektrischen Impulsen von geringer Feldstärke und von unterschiedlichen Dauern auf die Transfektion des kranialen Tibia-Muskels bei der Maus mittels der Plasmid-DNA pXL2774; Mittelwerte ± Standardabweichung.
5 Wirksamkeit der Elektrotransfektion des kranialen Tibia-Muskels der Maus mit geringen elektrischen Feldstärken mittels der Plasmid-DNA pXL2774: Mittelwerte ± Standardabweichung.
6 Kinetik der Expression der Luciferase in dem kranialen Tibia-Muskel der Maus. Verabreichung des Plasmids pXL2774 mit Elektrotransfer (¦) und ohne Elektrotransfer (X); Mittelwerte ± Standardabweichung (H = Stunde; J = Tag).
7 Niveau der Expression des Transgens abhängig von der verabreichten DNA-Dosis mit Elektrotransfer (•) und ohne Elektrotransfer (?)
8 Wirkung von verschiedenen Elektrodenarten auf die Wirksamkeit des Elektrotransfers.
9 Kinetik der Serumkonzentration von sekretierter alkalischer Phosphatase. Verabreichung des Plasmids pXL3010 mit Elektrotransfer (¦) und ohne Elektrotransfer (?); Mittelwerte ± Standardabweichung.
10 Kinetik der Expression von FGF1 im Muskel mit Elektrotransfer (weiße Histogrammbalken) oder ohne Elektrotransfer (schwarze Histogrammbalken).
11 Karten der Plasmide pXL3179 und pXL3212.
12 Karten der Plasmide pXL3388 und pXL3031.
13 Karten der Plasmide pXL3004 und pXL3010.
14 Karten der Plasmide pXL3149 und pXL3096.
15 Karten der Plasmide pXL3353 und pXL3354.
16 Karte des Plasmids pXL3348.
Beispiel 1: Unter den Bedingungen des Standes der Technik ausgeführtes Experiment, bei welchem die elektrischen Felder sich als Inhibitoren der Transfektion erweisen.
Es wurden die Standard-Elektroporationsbedingungen, wie jene, die im Stand der Technik eingesetzt und die vorstehend diskutiert worden waren, getestet und sie haben sich als unwirksam erwiesen, ja sogar derart, dass sie eine inhibitorische Wirkung auf den Transfer von Nukleinsäuren (Plasmid-DNA) in den quergestreiften Muskel haben.
Material und Methoden – Allgemeine Verfahrensbedingungen
In diesem Beispiel wurden die folgenden Produkte eingesetzt:
DNA pXL2774 (Patent PCT/FR 96/01414) ist eine Plasmid-DNA, die das Luciferase-Reportergen umfasst. Die anderen Produkte sind von Lieferanten des Handels erhältlich: Ketamin, Xylazin, physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%).
Es wurden ein Oszilloskop und ein Generator von elektrischen Impulsen (rechteckig oder quadratisch) des Handels (Electro-pulsateur PS 15, Jouan, Frankreich) eingesetzt. Die eingesetzten Elektroden sind die Plattenelektroden aus rostfreiem Stahl mit einem Abstand von 1 bis 15 mm.
Das Experiment erfolgt an C57 B1/6-Mäusen. Die Mäuse, die aus unterschiedlichen Käfigen stammen, werden zufallsgesteuert vor dem Experiment in Gruppen eingeteilt („Randomisierung").
Die Mäuse werden durch eine Ketamin-Xylazin-Mischung anästhesiert. Die Lösung von Plasmid (30 μl von einer Lösung mit 500 μg/ml NaCl 0,9%) wird längs durch die Haut hindurch in den kranialen Tibia-Muskel der linken und rechten Pfote mit Hilfe einer Hamilton-Spritze injiziert. Die beiden Elektroden werden mit einem leitfähigen Gel bestrichen und die Pfote, die die Injektion erhalten hat, wird zwischen den Elektroden in Kontakt mit jenen angeordnet.
Die elektrischen Impulse werden rechtwinklig zu der Achse des Muskels mit Hilfe eines Generators von Rechteckimpulsen eine Minute nach der Injektion angewendet. Ein Oszilloskop erlaubt, die Intensität in Volt (die in den Beispielen angegebenen Werte repräsentieren die maximalen Werte), die Dauer in Millisekunden und die Frequenz in Hertz der abgegebenen Impulse, die 1 Hz beträgt, zu kontrollieren. Es werden 8 aufeinanderfolgende Impulse abgegeben.
Für die Auswertung der Transfektion des Muskels werden die Mäuse 7 Tage nach der Verabreichung des Plasmids getötet. Die kranialen Tibia-Muskeln der linken und rechten Pfote werden dann entnommen, gewogen, in Lysepuffer gegeben und zerkleinert. Die erhaltene Suspension wird zentrifugiert, um einen klaren Überstand zu erhalten. Die Messung der Luciferase-Aktivität erfolgt an 10 μl Überstand mit Hilfe eines Luminometers des Handels, in welchem das Substrat automatisch zu der Lösung hinzugesetzt wird. Die Intensität der Lichtreaktion wird in RLU (Relative Luminescence Unit) für einen Muskel unter Kenntnis des Gesamtvolumens der Suspension angegeben (1.10⁶ RLU sind äquivalent zu 30 pg Luciferase). Jeder experimentelle Zustand wird an 10 Stellen getestet: 5 Tiere, die auf beiden Seiten eine Injektion erhalten. Die statistischen Vergleiche erfolgen mit Hilfe von nicht-parametrischen Tests.
Ergebnisse und Diskussion
Zwei Figuren, deren Maßstab linear oder logarithmisch ist, veranschaulichen die Ergebnisse.
In diesem ersten Experiment wurden die Wirkungen eines elektrischen Feldes von 800 bis 1200 Volt/cm, welches die Elektroporation von Tumoren erlaubt (Mir et al., Eur. J. Cancer 27, 68, 1991), getestet.
Man stellt gemäß der 1 fest, dass, bezogen auf die Kontrollgruppe, wo die DNA ohne elektrische Impulse injiziert wird:

• mit 8 Impulsen von 1200 Volt/cm und einer Dauer von 0,1 ms ist der Mittelwert der Luciferase-Aktivität viel geringer,
• bei Impulsen von 1200 Volt/cm und 1 ms sind 3 Tiere gestorben, ist der Mittelwert der Luciferase-Aktivität viel geringer,
• mit Impulsen von 800 Volt/cm und 1 ms ist der Mittelwert der Luciferase-Aktivität ebenfalls signifikant verringert.

Die meisten Muskeln, die der Wirkung des elektrischen Felds unterzogen worden sind, sind sichtbar verändert (zerreibbar und von weißlichem Aussehen).
Beispiel 2: Experiment eines Elektrotransfers von Nukleinsäuren mit moderaten elektrischen Feldern
Dieses Experiment wird mit C57 B1/6-Mäusen ausgeführt. Abgesehen von der elektrischen Feldstärke der Impulse und deren Dauer sind die Ausführungsbedingungen jene des Beispiels 1.
Die Ergebnisse sind in der 2 gezeigt. Man reproduziert das Ergebnis des Beispiels 1, d.h. die inhibitorische Wirkung einer Reihe von 8 Impulsen bei 800 Volt/cm mit einer Dauer von 1 ms auf die im Muskel nachgewiesene Luciferase-Aktivität. Mit einem Feld von 600 Volt/cm beobachtet man die gleiche Inhibition und die gleiche Veränderung des Muskelgewebes. Im Gegensatz dazu erlaubt die Verringerung der Spannung auf bemerkenswerte und überraschende Weise, die Muskeln nicht mehr sichtbar zu verändern und außerdem ist bei 400 und 200 Volt/cm das Transfektionsniveau der Muskeln im Mittel höher als jenes, das bei den nicht einem Feld unterworfenen Muskeln erhalten wird. Es ist festzuhalten, dass bezogen auf die Vergleichsgruppe (die keinem elektrischen Feld unterworfen worden ist) die Streuung der Werte der Luciferase-Aktivität bei 200 Volt/cm verringert ist (SEM (Standardabweichung) = 20,59 des Mittelwertes gegenüber 43,32% in Abwesenheit des elektrischen Felds (2A)).
Beispiel 3: Experiment eines Elektrotransfers von Nukleinsäuren mit Impulsen von geringer Feldstärke, welches eine sehr starke Stimulation der Expression des Transgens zeigt.
Dieses Experiment wird mit C57 B1/6-Mäusen ausgeführt. Abgesehen von der elektrischen Feldstärke der Impulse und deren Dauer und der Tatsache, dass die Impulse 25 s nach der Injektion der DNA abgegeben werden, sind die Ausführungsbedingungen jene der vorangegangenen Beispiele.
Die Ergebnisse sind in der 3 gezeigt. Der Mittelwert der Expression des Luciferase-Transgens ist bei einer Impulsdauer von 20 ms bei 100 Volt/cm und ausgehend von einer Impulsdauer von 5 ms bei 200 Volt/cm deutlich erhöht.
Dieses Experiment zeigt auch deutlich, dass der Mittelwert der Luciferase-Aktivität, der durch Elektrotransfektion des Muskels mit der DNA erhalten wird, eine Funktion der Dauer der elektrischen Impulse ist, wenn man Spannungen von 200 und 100 Volt/cm einsetzt. Man stellt auch fest, dass die Streuung der Werte bei den Gruppen von elektrotransfizierten Muskeln bemerkenswert verringert ist (3A). In Abwesenheit von elektrischen Impulsen (Kontrolle) repräsentiert die Standardabweichung (SEM) 77,43% des Mittelwerts, wohingegen die Standardabweichung bezogen auf den Mittelwert auf 14% (200 Volt/cm, 5 ms), 41,27 (200 Volt/cm, 20 ms) und zwischen 30% und 48% für den Elektrotransfer bei 100 Volt/cm elektrisches Feld verringert ist.
Unter den besten Bedingungen dieses Experiments verbessert man die Expression des Transgens bezogen auf die in Abwesenheit von elektrischen Impulsen injizierte Kontrolle um einen Faktor von 89,7.
Beispiel 4: Experiment eines Elektrotransfers von Nukleinsäuren in den Muskel bei 200 Volt/cm, welches eine Erhöhung der Expression des Transgens um einen Faktor von über 200 zeigt
Dieses Experiment wird an DBA 2-Mäusen mit elektrischen Impulsen einer Feldstärke von 200 Volt/cm und variabler Dauer ausgeführt, wobei die anderen Bedingungen dieses Experiments jene des Beispiels 3 sind.
Dieses Beispiel bestätigt, dass bei 200 Volt/cm die Transfektion mittels der Luciferase-Aktivität ab einer Impulsdauer von 5 ms erhöht ist, dann bei längeren Dauern weiter zunimmt (4 und 5). Man beobachtet bei der Elektrotransfektion auch hier wieder eine Verringerung der inter-individuellen Variabilität, was angegeben wird durch die Standardabweichung bezogen auf die nicht-elektrotransfizierte Kontrolle (der sich auf die Standardabweichung beziehende Wert beträgt 35% für die Kontrolle und 25, 22, 16, 18, 16 und 26% für Impulsreihen von 1, 5, 10, 15, 20 bzw. 24 ms).
Bei den besten Bedingungen dieses Experiments verbessert man die Expression des Transgens verglichen mit der in Abwesenheit von elektrischen Impulsen injizierten Kontrolle um einen Faktor von 205. Es erweist sich so, dass die Variation der Dauer von jedem abgegebenen Impuls ein Mittel ist, um die Wirksamkeit des Transfers von Nukleinsäuren zu modulieren und das Expressionsniveau des Transgens anzupassen.
Beispiel 5: Wirksamkeit des Elektrotransfers von Nukleinsäuren abhängig von dem Produkt „Anzahl der Impulse × Feldstärke × Dauer von jedem Impuls"
Die 5 exemplifiziert die Bedeutung des Parameters, der dem Produkt „Anzahl der Impulse × Feldstärke × Dauer von jedem Impuls" entspricht. Dieser Parameter entspricht tatsächlich dem Integral abhängig von der Zeit der Funktion, die die Variation des elektrischen Felds beschreibt.
Die Darstellung der während der Experimente 2, 3 und 4 mit elektrischen Feldstärken von 200 V/cm, 100 V/cm oder in Abwesenheit von elektrischen Feldern erhaltenen Ergebnisse in 5 zeigt, dass die Wirksamkeit der Transfektion abhängig von dem Produkt der gesamten Dauer der Exposition gegenüber dem elektrischen Feld mit der Feldstärke zunimmt. Bei einem Wert über 1 kV × ms/cm des Produkts „Feldstärke × gesamte Dauer der Impulse" wird ein Stimulationseffekt erhalten. Gemäß einer bevorzugten Weise wird eine Stimulation bei einem Wert über oder gleich 5 kV × ms/cm des Produkts „Feldstärke × gesamte Dauer der Impulse" erhalten.
Beispiel 6: Wirkung der Erhöhung der Dauer der elektrischen Impulse.
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass man die Einheitsdauer der Impulse deutlich über die Werte, die in Beispiel 4 getestet worden sind, erhöhen kann.
Dieses Experiment wird mit C57B1/6-Mäusen ausgeführt. Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL 2774, die verabreichte DNA-Menge beträgt 15 μg. Der Elektropulsator, der eingesetzt wird, um die elektrischen Impulse einer Dauer über 20 ms abzugeben, ist ein im Handel erhältlicher Elektropulsator (Genetronics, Modell T 820, USA, San Diego, CA). Die elektrischen Impulse sind von der Anzahl und von der Dauer her variabel, aber: von einer konstanten Feldstärke von 200 Volt/cm; die anderen Bedingungen dieses Experiments sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben worden sind. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: Mittelwerte +/– Standardabweichung der Luciferase-Aktivität in Millionen RLU pro Muskel. N = 10 für jede Gruppe. Elektrotransfer-Bedingungen: Feldstärke 200 V/cm, 8 oder 4 Impulse (variable Einheitsdauer), Frequenz 1 Hz.
Man stellt eine Erhöhung der Expression des Transgens mit der Verlängerung der Einheitsdauer der Impulse (wenigstens bis zu 40 ms für eine Reihe von 8 Impulsen und wenigstens bis zu 50 ms für eine Reihe von 4 Impulsen mit einer Intensität von 200 Volt/cm) fest. Dieses Beispiel zeigt, dass das Optimum der Dauer der Impulse von der Anzahl von eingesetzten Impulsen abhängt und dass die Einheitsdauer der Impulse bis zu 80 ms erreichen kann, wobei dieser Wert für die Dauer nicht einschränkend verstanden wird.
Beispiel 7: Wirksamkeit des Elektrotransfers abhängig von der Anzahl von elektrischen Impulsen
Dieses Beispiel weist die Wirkung der Erhöhung der Anzahl von elektrischen Impulsen auf die Wirksamkeit des Transfers von Nukleinsäuren nach.
Dieses Beispiel wird mit C57B1/6-Mäusen ausgeführt. Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL 2774, die verabreichte DNA-Menge beträgt 15 μg. Die elektrischen Impulse sind von variabler Anzahl. Die Dauer von jedem Impuls beträgt 20 ms. Die Feldstärke beträgt 200 Volt/cm. Die anderen Bedingungen dieses Experiments sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben worden sind. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2: Mittelwerte +/– Standardabweichung der Luciferase-Aktivität in Millionen RLU pro Muskel. M = 10 pro Gruppe. Bedingungen: Feldstärke 200 V/cm, variable Anzahl von Impulsen von 20 ms, Frequenz 1 Hz.
Man beobachtet, dass die Expression der Luciferase auf sehr bedeutende Weise ab der Anwendung eines einzigen Impulses zunimmt und dass sie abhängig von der Anzahl von Impulsen weiter zunimmt. Es erweist sich folglich, dass die Variation der Anzahl von abgegebenen Impulsen ein Mittel ist, um die Wirksamkeit des Transfers von Nukleinsäuren zu modulieren und das Expressionsniveau des Transgens anzupassen.
Es wird gleichfalls eine Verringerung der Variabilität der Reaktion bestätigt, welche nachgewiesen wird durch die Verringerung des Werts der Standardabweichung bezogen auf den Mittelwert für alle Gruppen, die dem Elektrotransfer unterworfen worden waren.
Beispiel 8: Wirkung der Erhöhung der Frequenz der elektrischen Impulse.
Dieses Beispiel zeigt, dass die Erhöhung der Frequenz der Impulse es auf unerwartete Weise erlaubt, die Wirksamkeit der Transfektion zu verbessern. Andererseits und unter einer klinischen Perspektive muss die Erhöhung der Frequenz den Komfort für den Patienten verbessern, indem die gesamte Dauer der Behandlung verringert wird.
Dieses Experiment wird mit C57B1/6-Mäusen ausgeführt. Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL 2774, die verabreichte DNA-Menge beträgt 15 μg. Die Frequenz der elektrischen Impulse ist variabel (von 0,1 bis 4 Hertz). Die Dauer von jedem Impuls beträgt 20 ms, die Feldstärke beträgt 200 Volt/cm, die anderen Bedingungen dieses Experiments sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben worden sind. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3: Mittelwerte +/– Standardabweichung der Luciferase-Aktivität in Millionen RLU pro Muskel. N = 10 für jede Gruppe. Bedingungen: Feldstärke 200 V/cm, 8 oder 4 Impulse von 20 ms, variable Frequenz.
Die in dem Experiment „A", Tabelle 3, erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die höchsten Frequenzen (≥ 1 Hz) wirkungsvoller sind als die schwachen Frequenzen, die einer längeren Dauer zwischen zwei aufeinanderfolgenden Impulsen (10 s bei 0,1 Hz) entsprechen. Die Wirksamkeit der Transfektion nimmt mit der Frequenz über den Bereich der getesteten Werte von 0,1 bis 4 Hertz bei 4 Impulsen und von 0,1 bis 3 Hertz bei 8 Impulsen zu.
Beispiel 9: Wirkung der Anwendung eines elektrischen Felds, das gemäß einer abhängig von der Zeit abnehmenden Exponentialfunktion variiert
Dieses Beispiel weist die Wirkung der Anwendung eines elektrischen Felds, das gemäß einer abnehmenden Exponentialfunktion variiert, auf die Wirksamkeit des Transfers von Nukleinsäuren nach.
Dieses Experiment wird mit C57B1/6-Mäusen ausgeführt.
Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL 3031. Das Plasmid pXL3031 (12) ist ein von dem Plasmid pXL2774 (WO 97/10343) abgeleiteter Vektor, in den das luc+-Gen, welches die modifizierte (zytoplasmatische) Luciferase von Photinus pyralis, welche aus pGL3basic (Genbank: CVU47295) stammt, kodiert, unter der Kontrolle des Promotors, der aus der frühen Region des humanen Zytomegalievirus (hCMV IE, Genbank HS5IEE) stammt, und des Polyadenylierungssignals der späten Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt worden war. Die verabreichte DNA-Menge ist 10 μg.
Der eingesetzte Generator von elektrischen Impulsen erlaubt, Impulse mit einer elektrischen Feldstärke, die gemäß einer abhängig von der Zeit abnehmenden Exponentialfunktion variiert, abzugeben (Elektropulsator Equibio, Modell easyjectT plus, Kent, Vereinigtes Königreich). Die auferlegte Spannung ist die Spannung am Peak der Exponentialfunktion. Der zweite einstellbare Parameter ist die Kapazität (μFarad), die erlaubt, die abgegebene Energiemenge und die Zeitkonstante der Exponentialfunktion variieren zu lassen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 aufgeführt.
Tabelle 4: Faktor der Erhöhung der Expression (Luciferase-Aktivität), erhalten durch Anwendung eines Impulses mit exponentieller Abnahme. Der Erhöhungsfaktor wird berechnet durch Bezugnahme auf die Luciferase-Aktivität, die bei der Verabreichung des Plasmids pXL3031 ohne Elektrotransfer erhalten wird (Mittelwerte des Erhöhungsfaktors, N = 4 bis 6 pro Bedingung).
Zu Vergleichszwecken betrug in dem gleichen Experiment der Erhöhungsfaktor der Expression, der bei dem Transfer von pXL3031 in Gegenwart eines elektrischen Feldes mit Impulsen von Rechteckform (Feldstärke von 200 V/cm, 8 Impulse von 20 ms bei einer Frequenz von 1 Hertz) erhalten wird, 44.
Diese Ergebnisse zeigen, dass man elektrische Impulse von Rechteckform oder einer abhängig von der Zeit exponentiell abnehmenden Intensität einsetzen kann. Außerdem kann in diesem letzteren Falle eine bedeutende Erhöhung der Expression bei einer geringen Feldstärke und einer hohen Kapazität (z.B. 200 V/cm, Kapazität 3000 μFarad) oder einer hohen Feldstärke und einer geringen Kapazität (z.B. 400 V/cm, Kapazität 300 μFarad) erhalten werden.
Beispiel 10: Wirkung der Kombination eines kurzen Impulses von hoher Spannung und von mehreren langen Impulsen von geringer Spannung.
Dieses Beispiel zeigt, dass das abgegebene elektrische Feld eine Kombination von wenigstens einem Feld zwischen 500 und 800 Volt/cm für eine kurze Dauer, beispielsweise 50 oder 100 μs, und wenigstens einem schwachen Feld (< 100 Volt/cm) während einer längeren Dauer, beispielsweise ≥ 1 ms und bis zu 90 ms in diesem Experiment, sein kann.
Die geringen Werte des elektrischen Felds sind hier 80 V/cm, welche angewendet werden in Form von 4 Impulsen einer Dauer von 90 ms mit einer Frequenz von 1 Hertz. Für dieses Experiment werden zwei Elektropulsatoren eingesetzt. Die elektrischen Impulse werden durch das eine, dann durch das andere Gerät angewendet, wobei die Änderung in weniger als einer Sekunde mit Hilfe eines Handbetriebs erfolgt.
Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL3031. Die verabreichte DNA-Menge beträgt 3 μg. Die Werte des elektrischen Felds sind in der Tabelle 5 angegeben; die anderen Bedingungen dieses Experiments sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben worden sind.
Tabelle 5: Mittelwerte +/– Standardabweichung der Luciferase-Aktivität in Millionen RLU pro Muskel. N = 10 Muskeln pro Gruppe.
Die Tabelle 5, welche die für die beiden Reihen von Experimenten erhaltenen Ergebnisse zusammenfasst, zeigt, dass ein kurzer Impuls von hoher Spannung oder dass vier aufeinanderfolgende lange Impulse und von geringer Spannung die Transfektion bezogen auf die Kontrollgruppe, die eine Injektion von pXL3031 erhalten hat, aber keinem elektrischen Feld unterworfen worden ist, nur wenig verbessern. Das gleiche gilt, wenn die Impulse mit schwachem Feld vor dem Impuls mit hohem Feld angewendet werden.
Im Gegensatz dazu erhöht in den beiden Reihen von Experimenten die Kombination eines kurzen Impulses von hoher Spannung, gefolgt von vier aufeinanderfolgenden langen Impulsen und von geringer Spannung die Wirksamkeit des Transfers der DNA sehr deutlich.
Die in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Ergebnisse haben gezeigt, dass 8 Impulse von 600, 800 oder 1200 Volt von einer Einheitsdauer von 1 ms bei 1Hz Verletzungen hervorriefen und die Transfektion inhibierten. Die in Beispiel 10 erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass es unter besonderen Bedingungen möglich ist, Feldstärken von hoher Spannung auf eine keine Verletzungen hervorrufende Weise einzusetzen tatsächlich werden aus makroskopischer Sicht die Muskeln niemals sichtbar verändert. Die Verwendung von hohen elektrischen Feldern von kurzer Dauer kombiniert mit schwachen Feldern von längerer Dauer erweist sich als ein ergänzendes Mittel, um die Wirksamkeit des Transfers der DNA zu modulieren.
Beispiel 11: Elektrotransfer mit Plasmiden von unterschiedlichen Größen, von Genen unter der Kontrolle von verschiedenen Promotoren oder mit Stellen für ein variables Targeting des durch das Transgen exprimieren Proteins.
11.a – Elektrotransfer mit Plasmiden von unterschiedlicher Größe
Es wurden Plasmide von unterschiedlicher Größe (2,8 kb, 3,8 kb, 8,6 kb, 20 kb und 52,5 kb), welche das Luciferase kodierende Gen umfassen, getestet. Die verabreichte Menge Plasmid betrug 10 μg pro Muskel. Es wird ein elektrisches Feld mit einer Intensität von 200 V/cm in 8 Impulsen von 20 ms bei 2 Hz angewendet, wobei die anderen Bedingungen dieses Experiments jene sind, die in Beispiel 1 beschrieben worden sind.
Man beobachtet eine ungefähr 50-fache Erhöhung der Expression des Transgens mit den Plasmiden von 2,8 kb und 3,8 kb, eine ungefähr 80-fache mit dem Plasmid von 8,6 kb und eine 3- bis 6-fache mit den Plasmiden von 20 und 52,6 kb.
Dieses Beispiel zeigt so die Möglichkeit, Plasmide von bedeutender Größe, die bis zu 20 kb und höher geht, zu transferieren.
11.b Kontrolle des Lumineszenzsignals in Abwesenheit von einem Luciferase kodierenden Gen
Als Kontrolle und um die Möglichkeit auszuschließen, dass die bei der quantitativen Bestimmung der Luciferase-Aktivität beobachteten Lumineszenzsignale auf Radikale, die im Gewebe infolge der elektrischen Behandlung produziert werden, zurückzuführen sind, wurde die Luciferase-Aktivität an mit einem Plasmid, welches nicht Luciferase kodiert, behandelten und einem elektrischen Feld unterworfenen Muskeln getestet.
Tabelle 6: Luciferase-Aktivität in Muskeln, in die verschiedene Plasmide injiziert worden waren, mit oder ohne Anwendung eines elektrischen Felds. Bedingungen: 200 V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz. Mittelwerte +/– Standardabweichung der Luciferase-Aktivität in Millionen RLU pro Muskel.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Grundaktivität der Luciferase in Muskeln, denen ein Plasmid, welches keine Luciferase kodiert, injiziert worden ist, ganz und gar vernachlässigbar ist.
11.c – Elektrotransfer von Genen unter der Kontrolle von verschiedenen Promotoren
Der Einfluss von verschiedenen Promotoren wurde auf der Ebene der Expression der mit und ohne Anwendung des elektrischen Felds transferierten Gene getestet.
Die pro Muskel injizierte Plasmidmenge beträgt 2 μg. Das angewendete elektrische Feld ist 200 V/cm in 8 Impulsen von 20 ms bei 1 Hz, die anderen Bedingungen dieses Experiments sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben worden sind. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 aufgeführt. Das getestete Plasmid ist das Plasmid pXL3031 für das CMV-LUC Konstrukt. Das PGK-Konstrukt entspricht der Substitution des CMV-Promotors durch den PGK-Promotor in pXL3031.
Tabelle 7: Mittelwerte +/– Standardabweichung der Luciferase-Aktivität in Millionen RLU pro Muskel.
Diese Ergebnisse zeigen, dass, wenn die DNA in Gegenwart eines elektrischen Felds transferiert wird, der Erhöhungsfaktor der Expression des Transgens vergleichbar ist unabhängig von der Herkunft oder der Stärke des Promotors.
11.d – Elektrotransfer eines Gens mit unterschiedlichen Stellen für ein Targeting des durch das Transgen exprimierten Proteins.
Dieses Beispiel veranschaulicht den Transfer eines Gens, welches Proteine mit unterschiedlichen zellulären Lokalisationen kodiert. Das Plasmid pXL3031 kodiert eine Luciferase, die im Zytosol synthetisiert wird, und das Plasmid pXL2774 kodiert eine Luciferase, die für die Peroxysomen bestimmt ist (Targeting).
Die Menge von pro Muskel injiziertem Plasmid beträgt 10 μg. Das angewendete elektrische Feld ist 200 V/cm in 8 Impulsen von 20 ms bei 1 Hz, die anderen Bedingungen dieses Experimetns sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben worden sind. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 8 aufgeführt.
Tabelle 8: Mittelwerte +/– Standardabweichung der Luciferase-Aktivität in Millionen ALU.
Diese Ergebnisse weisen nach, dass das erfindungsgemäße Verfahren für den Transfer von Genen, welche Proteine von unterschiedlichen zellulären Lokalisationen und insbesondere peroxysomale Proteine oder zytosolische Proteine kodieren, angewendet werden kann.
Beispiel 12: Kinetische und histologische Analyse der Expression des Transgens.
12.a – Kinetik der Expression des Transgens
Dieses Beispiel zeigt, das der Transfer von Nukleinsäuren in Gegenwart eines elektrischen Felds unter den erfindungsgemäßen Bedingungen erlaubt, die Expression eines Transgens auf hohem und stabilem Niveau während einer Dauer von wenigstens 4 Monaten zu erhalten.
Dieses Experiment wird mit C57B1/6-Mäusen ausgeführt. Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL 2774, die verabreichte DNR-Menge beträgt 15 μg. Der DNA-Injektion folgt die Anwendung eines elektrischen Felds unter den folgenden Bedingungen: Intensität 200 V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz, oder nicht (Kontrollgruppe). Die anderen Bedingungen dieses Experiments sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben werden. Die Luciferase-Aktivität wird an Gruppen von 10 zu unterschiedlichen Zeitpunkten getöteten Mäusen bestimmt. Die Ergebnisse sind in der 6 aufgeführt.
Man beobachtet bei der Kontrollgruppe, dass die Expression der Luciferase ab der 3. Stunde nach der Injektion des Plasmids nachweisbar ist und bis zum 3. Tag (J3) zunimmt, dann nach 35 Tagen in bemerkenswerter Weise abnimmt.
Man stellt fest, dass bei der den elektrischen Impulsen unterworfenen Gruppe die Expression des Transgens auf einem Niveau bestehen bleibt, welches sehr deutlich höher ist als jenes der Kontrollgruppe. Außerdem und in bemerkenswerter Weise beobachtet man, dass dieses Expressionsniveau hoch und über 35 Tage hinaus und wenigstens bis 120 Tage konstant bleibt. Dieses hohe und dauerhafte Expressionsniveau des Transgens ist ein besonders vorteilhaftes Ergebnis aus der Perspektive von klinischen Langzeitbehandlungen mit therapeutischen Genen.
12.b – Histologische Analyse
Es wurde eine histologische Analyse unter den gleichen Bedingungen, aber unter Verabreichung des Plasmids pCOR CMV-lacZ (pXL3004), welches die a-Galactosidase mit nukleärer Lokalisation kodiert, ausgeführt.
Das Plasmid pXL3004 (13) ist ein von dem Plasmid pXL2774 (WO 97/10343) abgeleiteter Vektor, in den das um eine nukleäre Lokalisationssequenz (nls) (Nouvel et al., 1994, Virology 204:180-189)) ergänzte lacZ-Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors des Plasmids pCDNA3 (Invitrogen, Niederlande) und des Polyadenylierungssignals der frühen Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt worden ist.
Die Tiere werden sieben Tage nach der Verabreichung des Plasmids getötet. Die histologische Analyse erlaubt, die Zellen nachzuweisen, die die β-Galactosidase exprimieren und deren Kern sich in der Schnittebene befindet (Xgal-Histochemie).
Die Anzahl von Muskelfasern, welche positive Kerne auf der Ebene der untersuchten Schnitte aufweisen, beträgt im Mittel 76 in der Gruppe (n = 8), welche das Plasmid pXL3004 erhalten hat, dann den elektrischen Impulsen unterworfen worden ist, gegenüber einem Mittelwert von 8,5 in der Kontrollgruppe (n = 8) (Tiere, die das Plasmid pXL3004 erhalten haben, aber keinen elektrischen Impulsen unterworfen worden sind).
Man beobachtet, dass die Anzahl von Muskelfasern, welche das Transgen exprimieren, im Mittel neunmal höher ist bezogen auf die Kontroll gruppe. Die meisten dieser Muskelfasern sind ruhend mit Kernen, die sich an der Peripherie befinden. Sehr seltene Muskelfasern mit zentral positioniertem Kern (zentronukleär) exprimieren die (3-Galactosidase. Man beobachtet gleichfalls, dass entlang der Injektionsbahn des Plasmids die Dichte der positiven Muskelfasern pro Einheit Oberfläche in der Gruppe, die durch Elektrotransfer behandelt worden ist, bedeutender ist verglichen mit der Kontrollgruppe.
Die Gesamtheit dieser Ergebnisse zeigt, dass bezogen auf Muskeln, die keinem elektrischen Feld unterworfen worden sind, der Elektrotransfer eine sehr deutliche Erhöhung der Anzahl von Muskelfasern, die das Transgen exprimieren, wie auch eine sehr deutliche Erhöhung der Oberfläche der Zone, die das Transgen exprimiert, ermöglicht. Es wird gleichfalls beobachtet, dass die Anwendung des elektrischen Felds keine bemerkenswerte Entzündungsreaktion mit sich bringt.
Beispiel 13: Auswirkung des Injektionszeitpunkts der Nukleinsäure bezogen auf die Anwendung des elektrischen Felds.
Dieses Beispiel veranschaulicht die Tatsache, dass die Nukleinsäure wenigstens 30 min und sogar wenigstens eine Stunde vor der Anwendung des elektrischen Felds verabreicht werden kann.
Dieses Experiment wird mit C57B1/6-Mäusen ausgeführt. Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL 2774. Die verabreichte DNA-Menge beträgt 15 μg oder 1,5 μg. Der Injektion von DNA folgt oder geht voran die Anwendung eines elektrischen Felds unter den folgenden Bedingungen:
Intensität 200 V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz. Die anderen Bedingungen dieses Experiments sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben wurden. Eine Kontrollgruppe wird aus Tieren gebildet, die eine Injektion des Plasmids erhalten haben, die aber keinen elektrischen Impulsen unterworfen worden sind. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 9 aufgeführt.
Tabelle 9A: DNA-Injektion in Abwesenheit eines elektrischen Felds
Tabelle 9B: DNA-Injektion vor Anwendung des elektrischen Felds
Tabelle 9C: DNA-Injektion nach Anwendung des elektrischen Felds
Tabelle 9: Mittelwerte +/– Standardabweichung der Luciferase-Aktivität in Millionen RLU pro Muskel. N = 10 Muskeln pro Gruppe.
Die Anwesenheit der DNA im Zeitpunkt der Anwendung des elektrischen Felds ist eine Bedingung für die Wirksamkeit der Elektrotransfektion. In bemerkenswerter Weise wird beobachtet, dass die Injektion des Plasmids wenigstens 30 min und sogar 1 h (Experimente 4 und 5) vor der Anwendung des elektrischen Felds ausgeführt werden kann und dies ohne bemerkenswerte Modifizierung des Expressionsniveaus. Ein ähnliches Ergebnis wird ebenso mit mit einer Dosis von 15 μg Plasmid pro Muskel wie auch einer 10-fach geringeren Dosis von 1,5 μg erhalten.
Diese Beobachtungen erlauben insbesondere, eine Mehrzahl von Injektionen des gleichen Plasmids oder von unterschiedlichen Plasmiden in den Muskel zu verschiedenen Zeitpunkten vor der Anwendung des elektrischen Felds in Betracht zu ziehen. Es ist gleichfalls möglich, eine Mehrzahl von Injektionen in eine ausgedehnte Zone des Muskels vorzunehmen, dann eine Reihe von elektrischen Impulsen auf die Gesamtheit des zu behandelnden Gebiets, in welchem die Injektionen vorgenommen worden sind, anzuwenden.
Beispiel 14: Statistische Untersuchung zur Beziehung zwischen der injizierten DNA-Dosis und dem Expressionsniveau
Die in diesem Beispiel aufgeführte statistische Untersuchung erlaubt, die Wirkungs/Dosis-Beziehung eines in Gegenwart oder in Abwesenheit eines elektrischen Felds verabreichten Transgens zu vergleichen. Diese Untersuchung bestätigt gleichfalls, dass das erfindungsgemäße Verfahren die Variabilität der Expression des Transgens beträchtlich verringert.
C57B16-Mäuse im Alter von 5 Wochen erhielten eine Injektion von Plasmid pXL3031 in den kranialen Tibia-Muskel und beidseitig. Die Plasmid-Dosen variieren von 0,25 bis 32 μg DNA. Jede Dosis wird an 10 Tieren getestet. Unverzüglich nach der Injektion des Plasmids unterwirft man eine der beiden Pfoten einem Feld von 250 V/cm mit 4 Impulsen von 20 ms und einer Frequenz von 1 Hz.
Die Tiere werden 5 Tage nach der Behandlung getötet und die Expression des Transgens wird in dem Gewebeextrakt von jedem Muskel untersucht. Die Ergebnisse sind in der 7 aufgeführt.
Der Vergleich der Entwicklung der Varianzen abhängig von jener der Mittelwerte für jede Reihe von 10 Wiederholungen zeigt klar, dass die Verteilung der Expression des Transgens log-normal ist. Die graphische Analyse der Ergebnisse der 7, die durch die Berechnung bestätigt wird, zeigt, dass die Expression linear mit dem Logarithmus der Dosis von injizierter DNA variiert.
Der Cochran-Test zeigt, dass es eine Homogenität der Varianzen für jede Regression (mit und ohne Elektrotransfer) gibt, was erlaubt, die restlichen Varianzen einzusetzen, um die Gesamtheit der Berechnungen auszuführen.
Ein Test bezüglich der Abweichung von der Linearität ist mit 5%-igem Risiko nicht signifikant in dem Falle, wo es einen Elektrotransfer gegeben hat; im Gegensatz dazu existiert eine sehr signifikante Abweichung von der Linearität (p < 0,01), was eine bedeutende Heterogenität der Reaktionen in Abwesenheit des Elektrotransfers zum Ausdruck bringt. Die restliche Varianz ist fünfmal geringer mit dem Elektrotransfer.
Berücksichtigt man abgeschätzte Werte der restlichen Varianzen, ist es möglich, fünfmal weniger Tiere einzusetzen, um in einem Test für den Vergleich der Transfektionswirksamkeit die gleiche Potenz zu erhalten je nachdem, ob man den Elektrotransfer anwendet oder nicht. Um einen Unterschied bei der Expression um einen Faktor 2, 5 oder 10 mit einem Konfidenzintervall von P = 95% nachzuweisen, erfordert es so 33, 8 bzw. 5 Tiere, wenn das Transgen durch Elektrotransfer verabreicht wird, und 165, 40 bzw. 25 Tiere in Abwesenheit eines Elektrotransfers. Nachfolgend wird eine Tabelle aufgeführt, die diese Berechnungsart in dem Falle, wo der Elektrotransfer eingesetzt wird, zusammenfasst.
So erlaubt die Verringerung der Variabilität zwischen den Individuen, die mit dem Elektrotransfer erzielt wird, genaue analytische Untersuchungen hinsichtlich des Vergleichs der Expression von verschiedenen Genen auszuführen. Sie erlaubt gleichfalls eine bessere Definition der Behandlungsdosen und muss das Risiko, welches mit dem Überschrei ten der in dem therapeutischen Fenster annehmbaren Dosen verbunden sind, verhüten.
Der Test zum Vergleich der Neigungen, die für jede Regression erhalten werden, ist nicht-signifikant. Man kann folglich mit einem 5%-igen Risiko damit rechnen, dass es eine Parallelität der beiden Regressionen gibt.
Die Berechnung der relativen Potenz zeigt, dass man, um ein Expressionsniveau zu erreichen, das vergleichbar ist mit jenem, das in Gegenwart eines Elektrotransfers erhalten wird, in Abwesenheit eines Elektrotransfers ungefähr 250-mal mehr pro Muskel injizierte DNA (243 ± 85; Konfidenzintervall P = 95%) benötigt.
Die Berechnung der relativen Potenz zeigt korrelierend, dass bei einer gegebenen DNA-Menge das Expressionsniveau ungefähr 500-fach höher ist in Anwesenheit von Elektrotransfer verglichen mit dem in Abwesenheit eines Elektrotransfers erhaltenen Expressionsniveau.
Beispiel 15: Vergleich der verschiedenen Elektrodentypen
Dieses Beispiel hat zum Ziel, die Wirkung von zwei Elektrodentypen, Plattenelektroden und nadelförmigen Elektroden, auf die Wirksamkeit des Nukleinsäuretransfers zu vergleichen. Die nadelförmigen Elektroden wurden gleichfalls entsprechend unterschiedlichen Implantationsorientierungen getestet.
Das Plasmid pXL 2774 (150 μg) wird in den Triceps-Muskel der Ratte injiziert. Die Plattenelektroden werden plaziert, wie in Beispiel 1 angegeben. Der Abstand zwischen den Elektroden beträgt für die Plattenelektroden 1,2 cm. Bei den nadelförmigen Elektroden beträgt der Abstand zwischen den Elektroden 0,9 cm. Die nadelförmigen Elektroden werden in das Muskelgewebe auf eine äquivalente Länge entweder rechtwinklig oder parallel zur Achse der Fasern zu beiden Seiten des Injektionsorts eingeführt. Unabhängig von der Art der Elektroden oder von deren Orientierung sind die Bedingungen für die Anwendung des elektrischen Felds die Folgenden: Intensität 200 V/cm, 8 Impulse von 20 ms bei 2 Hz. Die Ergebnisse sind in der 8 aufgeführt.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Anwendung des elektrischen Felds mit Hilfe der beiden parallelen, in den Muskel implantierten Nadeln Ergebnisse liefert, die vergleichbar sind mit jenem, das mit Plattenelektroden, die in Kontakt mit der Haut, die den Muskel umgibt, gebracht werden, erhalten wird. Es wird gleichfalls gezeigt, dass die Wirksamkeit des Elektrotransfers von der Implantierungsrichtung der nadelförmigen Elektroden bezogen auf die Achse der Muskelfasern unabhängig ist.
Dieses Beispiel zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren den Elektrotransfer von Nukleinsäuren mit Hilfe von äußerlichen oder invasiven Elektroden erlaubt und dies unabhängig von ihrer Orientierung. Die Verwendung von nadelförmigen Elektroden ist besonders vorteilhaft, um den Transfer von Nukleinsäuren in die Muskeln von großer Größe sicherzustellen, da man sich an elektrische Impulse von mäßiger Spannung (beispielsweise 100 V mit einem Abstand von 0,5 cm, um ein elektrisches Feld von 200 V/cm abzugeben) hält.
Beispiel 16: Wirksamkeit des Elektrotransfers bei verschiedenen Muskeln der Maus, der Ratte, des Kaninchens und des Affen.
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass der Elektrotransfer von Nukleinsäuren auf unterschiedliche Arten von Muskeln in unterschiedlichen Spezies von Säugetieren (Maus, Kaninchen, Ratte und Affe) anwendbar ist.
Die Bedingungen für die Anwendung des elektrischen Felds sind in der Tabelle 10A in Hinblick auf jede Spezies definiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 10A aufgeführt.
Tabelle 10A: Verstärkungsfaktor der Expression der Luciferase, welcher mit der Elektrotransfektion erhalten wird. Dieser Faktor wird durch Bezugnahme auf die Luciferaseaktivität, welche bei Injektion des Plasmids pXL3031 oder pXL2774 ohne Elektrotransfer erhalten wird, berechnet. Mittelwerte aus 10 Muskeln pro Gruppe. Die Luciferaseaktivität wird 7 Tage nach der Verabreichung des Plasmids quantitativ bestimmt.
Der Elektrotransfer wird gleichfalls beim Affen (Macaca fascicularis) untersucht. Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL3179, welches das den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 (FGF1 oder aFGF) kodierende Gen umfasst.
Das Plasmid pXL3179 (11) ist ein Vektor, welcher abgeleitet ist von dem Plasmid pXL2774 (WO 97/10343), in welches das eine Fusion zwischen dem Signalpeptid des Interferons von humanen Fibroblasten und der cDNA von FGF1 (Fibroblastenwachstumsfaktor 1) (sp-FGF1, Jouanneau et al., 1991, PNAS 88:2893-2897) kodierende Gen unter die Kontrolle des aus der frühen Region des humanen Zytomegalievirus (hCMV IE) stammenden Promotors und des Polyadenylierungssignals aus der späten Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt worden ist.
Die Anwesenheit von FGF1 wird durch Immunhistochemie bestimmt. Die Werte geben die Anzahl von positiven Schnitten 3 Tage nach einer intramuskulären Injektion von 500 μg des Plasmids pXL3179 an. Die Anwendungsbedingungen des elektrischen Felds sind die folgenden: Inten sität des elektrischen Felds 200 V/cm, 8 Impulse von 20 ms bei 1 Hz. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt.
Tabelle 10B: Nachweis der Expression von FGF1 in verschiedenen Muskeln des Affen (Macaca fascicularis) durch Immunhistochemie. Die Werte geben die Anzahl von positiven Schnitten 3 Tage nach intramuskulärer Injektion von 500 μg des Plasmids pXL3179, welches FGF1 kodiert, mit oder ohne Elektrotransfer an.
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Elektrotransfer die Expression eines Transgens in unterschiedlichen Arten von Muskeln, in unterschiedlichen Spezies von Säugetieren auf bemerkenswerte Weise erhöht.
Beispiel 17: Wirksamkeit des Elektrotransfers beim Diaphragma-Muskel der Ratte
Die Möglichkeit, Gene von therapeutischem Interesse auf dauerhafte und stabile Weise direkt auf der Höhe des Diaphragmas zu exprimieren, ist ein besonders interessanter therapeutischer Ansatz im Rahmen der Behandlung von bestimmten degenerativen Erkrankungen, die die Funktionsfähigkeit dieses Muskels beeinträchtigen, wie insbesondere der Duchenne-Myopathie.
Die Ratten werden mit einer Mischung von Largactyl und Ketamin (1 mg/kg Largactyl, 150 mg/kg Ketamin) anästhesiert. In diesem Experimenten wird das Diaphragma durch einen Einschnitt entlang des Sternums zugänglich gemacht. Die Injektion erfolgt in das halbe Diaphragma (50 μg des Plasmids pXL 2774 in 50 μl 20 mM NaCl und 5% Glucose). Die Plattenelektroden werden dann auf beiden Seiten der Ebene des Diaphragmas entlang der Injektionsbahn (Abstand zwischen den Elektroden = 1 mm) angeordnet. Die Bedingungen des Elektrotransfers sind die folgenden: Feldstärke 160 V/cm oder 300 V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz. Das elektrische Feld wird weniger als eine Minute nach der Injektion angewendet. Das Tier wird dann wieder vernäht.
Tabelle 11: Mittelwerte +/– Standardabweichung der Luciferase-Aktivität in Millionen RLU pro Muskel. N = 12 für jede Gruppe.
Dieses Beispiel zeigt eine signifikante Verstärkung der Expression des Transgens in dem Diaphragma nach Anwendung von 8 Impulsen von 20 ms mit einer Feldstärke von 160 V/cm (p < 0,003 mit dem nicht-parametrischen Mann-Whitney-Test).
Beispiel 18: Transfer eines die sekretierte alkalische Phosphatase (SeAP) kodierenden Gens und Kinetik der Expression der SeAP.
Dieses Beispiel veranschaulicht die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens, den Muskel in ein Organ umzuwandeln, das ein Polypeptid von therapeutischem Interesse oder von Interesse in Zusammenhang mit Impfungen sezerniert, und die Anwesenheit einer hohen und stabilen Konzentration des Polypeptids von Interesse sicherzustellen.
In diesem Beispiel wurde das Elektrotransferverfahren an der ausgewachsenen Maus mit einem Plasmid getestet, welches das die sekretierte plazentare humane alkalische Phosphatase kodiert. Ausgewachsene C57BL6-Mäuse erhielten in den kranialen Tibia-Muskel und einseitig eine Injektion des Plasmids pXL3010.
Das Plasmid pXL3010 (13) ist ein Vektor, der von ColEl abgeleitet ist, in welchen das die aus pSEAP-basic (Clontech, Genbank: CVU09660) stammende, sekretierte alkalische Phosphatase kodierende Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors, welcher aus dem Plasmid pCDNA3 (Invitrogen, Niederlande) stammt, und des Polyadenylierungssignals der späten Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt worden ist.
Die Bedingungen für den Elektrotransfer sind die folgenden elektrisches Feld 200 V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz. Das elektrische Feld wird 20 s nach der Injektion angewendet. Die Blutentnahmen erfolgten 7 Tage später auf der Höhe des retroorbitalen Plexus. Die Konzentration von alkalischer Phosphatase im Serum wird bestimmt wird gemessen mit Hilfe eines Chemolumineszenztests (Phospha-light, Tropix, Bedford, MA 01730). Die Injektion eines nicht-kodierenden Plasmids (pUC19) in den Muskel, gefolgt von der Anwendung eines elektrischen Felds oder nicht, erlaubt, die Abwesenheit des der endogenen alkalischen Phosphatase-Aktivität entsprechenden Signals zu verifizieren. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 12 aufgeführt.
Tabelle 12: Mittelwerte ± Standardabweichung der im Blut zirkulierenden Konzentration von alkalischer Phosphatase (SeAP) in ng/ml Serum.
Wenn das Plasmid pXL3010 durch Elektrotransfektion verabreicht wird, stellt man eine Erhöhung der SeAP-Konzentration im Blut um einen Faktor von 140 oder 170 fest.
Die Injektion von 400 μg Plasmid (Injektion von 100 μg DNA in den kranialen Tibia-Muskel beidseitig und auf zwei Mal im Abstand von 30 min vor Anwendung des elektrischen Felds) erlaubt, mit dem Elektrotransfer eine Serumkonzentration von 2200 ng/ml von alkalischer Phosphatase gegenüber 16 ng/ml in Abwesenheit des Elektrotransfers zu erreichen.
Es ist anzumerken, dass die Zugabe einer nicht-kodierenden DNA (pUC19), die erlaubt, bei konstanter DNA-Menge (10 μg DNA insgesamt pro Maus) zu arbeiten, erlaubt, das Expressionsniveau der alkalischen Phosphatase bei geringen injizierten Mengen von pXL3010-Plasmid (≤ 1 μg) noch zu erhöhen.
Es wurde eine Kinetik der Expression der SeAP ausgeführt. Die verabreichte Plasmid-Dosis beträgt 15 μg pro Muskel beidseitig, was 30 μg pro Maus entspricht. Die Ergebnisse sind in der 9 aufgeführt. Man beobachtet ab 7 Tage nach der Injektion eine bedeutende und dauerhafte (wenigstens während zweier Monate) Erhöhung der im Blut nachgewiesenen SeAP-Konzentration, wenn das Plasmid pXL3010 durch Elektrotransfer verabreicht wird.
Die Gesamtheit dieser Ergebnisse bestätigt, dass der Transfer von Nukleinsäuren in den Muskel mit dem erfindungsgemäßen Verfahren es erlaubt, ein hohes und dauerhaftes Expressionsniveau zu erhalten ebenso für im Muskel lokalisierte Proteine wie auch für sekretierte Proteine, und dass es so möglich ist, den Muskel in ein Organ, welches ein Polypeptid von Interesse sezerniert, umzuwandeln.
Beispiel 19: Transfer eines Erythropoietin (EPO) kodierenden Gens
Ausgewachsene C57B1/6-Mäuse haben in den kranialen Tibia-Muskel und einseitig eine Injektion von Plasmid pXL3348 erhalten. Das Plasmid pXL3348 (16) ist ein Vektor, der von dem Plasmid pXL2774 abgeleitet ist, in welchen das Erythropoietin-Gen aus der Maus (NCBI: 193086) unter der Kontrolle des Promotors, welcher aus der frühen Region des humanen Zytomegalievirus (hCMV IE) stammt, und des Polyadenylierungssignals der späten Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt worden ist.
Die Bedingungen für den Elektrotransfer sind die folgenden: elektrische Feldstärke 200 V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz. Das elektrische Feld wird unverzüglich nach der Injektion der Plasmid-DNA angewendet.
Tabelle 13: Mittelwerte ± Standardabweichung. N = 4 bis 5.
Man beobachtet bei dem Elektrotransfer eine sehr deutliche Erhöhung der Erythropnietin-Menge im Blut am Tag 7 (J7) und am Tag 24 (J24) bei einer Verabreichung von 10 μg pXL3348. Außerdem ist die physiologische Wirkung der Erhöhung des Erythropoietins, die durch eine Erhöhung des Hämatokrits zum Ausdruck kommt, sehr bedeutend (85%) ab Tag 7 (J7) und dies sogar bei einer sehr geringen Plasmidmenge (1 μg).
Beispiel 20: Transfer eines vaskulären Wachstumsfaktor (VEGF) kodierenden Gens
Ausgewachsene C57B16- oder SCID-Mäuse erhielten in den kranialen Tibia-Muskel und beidseitig eine Injektion von pCOR hVEGF (pXL3212, 15 μg).
Das Plasmid pXL3212 (11) ist ein Vektor, der von dem Plasmid pXL2774 (WO 97/10343) abgeleitet ist, in welchen die den VEGF165 („Vascular Endothelial Growth Factor", Genbank: HUMEGFAA) kodierende cDNA unter der Kontrolle des aus der frühen Region des humanen Zytomegalievirus (hCMV IE) stammenden Promotors und des Polyadenylierungssignals der späten Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt wurde.
Die Bedingungen des Elektrotransfers sind die folgenden: elektrische Feldstärke 250 V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 2 Hz. Die Blutabnahmen erfolgten auf der Höhe des retroorbitalen Plexus. Die Abnahmen erfolgten einen Tag vor und sieben Tage nach der Injektion des Plasmids. Die immunenzymatische quantitative Bestimmung des humanen VEGF erfolgte mit Hilfe des Kits Quantikine (R&D System). Der Test wurde mit humanem VEGF in Mäuse-Serum kalibriert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 14 aufgeführt.
Tabelle 14: Serumkonzentration (ng/l) von VEGF bei C57B16- und SCID-Mäusen
Beispiel 21: Transfer eines Faktor IX kodierenden Gens.
Ausgewachsene C57B16- oder SCID-Mäuse erhielten in den kranialen Tibia-Muskel und beidseitig eine Injektion von pXL3388 (15 μg).
Das Plasmid pXL3388 (12) ist ein Vektor, der von dem Plasmid pXL2774 (WO 97/10343) abgeleitet ist, in welchen die den humanen Faktor IX (Christmas-Faktor), Genbank: HUMFIXA) kodierende cDNA unter der Kontrolle des aus der frühen Region des humanen Zytomegalievirus stammenden Promotors (hCMV IE, Genbank HS5IEE) und des Polyadenylierungssignals der späten Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt wurde.
Die Bedingungen des Elektrotransfers sind die folgenden: elektrische Feldstärke 200 V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 2 Hz. Die Blutabnahmen erfolgten auf der Höhe des retroorbitalen Plexus. Die Abnahmen erfolgten sieben Tage nach der Injektion des Plasmids. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 15 aufgeführt.
Tabelle 15: Plasmakonzentration von Faktor IX bei C57B16- oder SCID-Mäusen
Der humane Faktor IX ist im Blut lediglich dann nachweisbar, wenn das Plasmid unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens verabreicht worden ist.
Beispiel 22: Transfer eines den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 (FGF1) kodierenden Gens
Ausgewachsene C57B16- oder SCID-Mäuse erhielten in den kranialen Tibia-Muskel und beidseitig eine Injektion von pCOR FGF1 (pXL3096, 15 μg).
Das Plasmid pXL3096 (14) ist ein Vektor, der abgeleitet ist von dem um eine Sequenz, die in der Lage ist, eine Dreifachhelix zu bilden (TH, Wils et al., 1997, Gene Ther. 4:323-330), ergänzten Plasmid pXL2774 (WO 97/10343), in das das eine Fusion zwischen dem Signalpeptid des Interferons von humanen Fibroblasten und der cDNA von FGF1 (Fibroblastenwachstumsfaktor 1) (sp-FGF1, Jouanneau et al., 1991, PNAS 88:2893-2897) kodierende Gen unter der Kontrolle des aus der frühen Region des humanen Zytomegalievirus (hCMV IE) stammenden Promotors, gefolgt von der Leader-Sequenz (transkribiert, nicht translatiert) des TK-Gens von HSV1 und dem Polyadenylierungssignal aus der späten Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG), eingeführt worden ist.
Die Bedingungen für den Elektrotransfer sind die folgenden: elektrische Feldstärke 200 V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 2 Hz. Die Anwesenheit von FGF1 wird dann durch Immunhistochemie nachgewiesen.
Die Ergebnisse für die C57BL6-Mäuse sind in der 10 aufgeführt. Man stellt fest, dass die Anzahl von positiven Fasern sehr deutlich höher ist bei der Gruppe, die dem elektrischen Feld unterworfen worden ist, verglichen mit der Kontrollgruppe (welche eine Injektion von pXL3096 erhalten hat, aber keinem elektrischen Feld unterworfen worden ist). Die Anwesenheit von FGF1 bei der Kontrollgruppe ist am Tag 21 und Tag 35 praktisch nicht nachweisbar, wohingegen eine bedeutende Anzahl von positiven Fasern bei den durch Elektrotransfer behandelten Gruppen beobachtbar bleibt.
Die Ergebnisse für die SCID-Mäuse sind in der Tabelle 16 aufgeführt.
Tabelle 16: Expression von FG F, immunhistochemische Untersuchung und Anzahl von positiven Fasern auf einem Muskelschnitt, der in dem medianen Abschnitt des Muskels entnommen wurde.
Die Expression von FGF1, wie durch die Anzahl von durch Immunhistochemie nachgewiesenen positiven Fasern bestimmt, wird einzig in den Muskeln nachgewiesen, die dem elektrischen Feld unterworfen worden sind. Es ist festzuhalten, dass die Expression von FGF1 sogar bei einer geringen Dosis von verabreichtem Plasmid (1,5 μg) nachgewiesen wird.
Beispiel 23: Transfer eines den neurotrophen Faktor NT3 kodierenden Gens
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde auf die ausgewachsene Maus (C57B16) und die kleine Xt/pmn-Maus für den Transfer des Neurotrophin 3 (NT3) kodierenden Gens angewendet. Die pmn-Mäuse bilden ein Mäuse-Modell für die amyotrophe Lateralsklerose (ALS), die durch eine frühe und schnelle Degeneration der Motoneuronen und durch eine mittlere Lebensdauer von ungefähr 40 Tagen gekennzeichnet ist.
23.1 – Transfer des NT3 kodierenden Gens in ausgewachsene Mäuse
C57B1/6-Mäuse im Alter von 5 Wochen haben in den kranialen Tibia-Muskel und einseitig eine Injektion des Plasmids pXL3149 (12,5 μg), welches das Neurotrophin 3 (NT-3) aus der Maus kodierende Gen enthält, erhalten.
Das Plasmid pXL3149 (14) ist ein Vektor, der von dem Plasmid pXL2774 (WO 97/10343) abgeleitet ist, in welchen das Neurotrophin 3 (NT-3) kodierende Gen aus der Maus (Genbank MMNT3) unter der Kontrolle des Promotors, welcher aus der frühen Region des humanen Zytomegalievirus (hCMV IE) stammt, und des Polyadenylierungssignals der späten Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt worden ist.
Die Bedingungen für den Elektrotransfer sind die folgenden: elektrische Feldstärke 250 V/cm, 4 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz. Das elektrische Feld wird unverzüglich nach der Injektion der Plasmid-DNA angewendet. Die Anwesenheit von NT3 wird im 12000 g-Überstand von Muskelhomogenisaten in PBS-Puffer 7 Tage nach der Behandlung der Mäuse untersucht. Die NT3-Menge wird durch quantitative ELISA-Bestimmung [Kit Promega} gemessen.
Die Mittelwerte (± 95%-Konfidenzintervall) von 20 Muskeln sind 77 +/–11 pg/Muskel (ohne Elektrotransfer verabreichte Plasmid-DNA) und 2700 +/– 900 pg/Muskel (mit Elektrotransfer verabreichte Plasmid-DNA) Man beobachtet so eine Erhöhung der produzierten NT3-Menge im Muskel um den Faktor 55, wenn das Plasmid pXL3149 unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens transferiert wird.
23.2 – Transfer des NT3 kodierenden Gens in kleine Mäusen
Ein Vergleichsexperiment wurde an heterozygoten Xt pmn-Mäusen im Alter von 4 bis 5 Tagen mit dem Plasmid pXL3149 ausgeführt. Die injizierten Dosen sind 130 μg pro Tier und die Injektionen erfolgen an einer Mehrzahl von Stellen in unterschiedliche Muskeln des Tiers Gastroknemicus 25 μg, kranialer Tibiamuskel 12,5 μg).
Die Bedingungen für den Elektrotransfer sind die folgenden: elektrische Feldstärke 500 V/cm, 4 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz.
Die Anwesenheit von NT3 wird 7 Tage nach der Verabreichung des Plasmids im Plasma und im Muskel (Gastroknemicus oder kranialer Tibiamuskel) untersucht. Ein Vergleichstest hinsichtlich des NT3-Grundniveaus erfolgt durch Verabreichung einer NaCl 0,9%-Lösung. Die Menge von NT3 wird durch eine quantitative ELISA-Bestimmung [Kit Promega] bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 17 aufgeführt.
Tabelle 17: Mittelwerte ± Standardabweichung der Menge von NT3 (pg pro Muskel und pg pro ml Plasma).
Unter den Bedingungen des Experiments beobachtet man ein Grundniveau des Signals des Nachweises von NT3 in dem Gastroknemicus-Muskel und in dem kranialen Tibia-Muskel. In Abwesenheit eines Elektrotransfers ist das Expressionsniveau des NT3-Gens, welches bei der Injektion des Plasmids pXL3149 erhalten wird, nicht höher als das Grundniveau des Nachweises von NT3 im Muskel. Wenn das Plasmid mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verabreicht wird, stellt man fest, dass die im Muskel nachgewiesene Menge von NT3 sehr signifikant erhöht ist. Man beobachtet gleichfalls, dass die durch den Muskel sezernierte und im Plasma nachgewiesene NT3-Menge unter diesen Bedingungen sehr deutlich erhöht ist (Erhöhungfaktor ~ x 35):
Diese Ergebnisse zeigen, dass bei einer gegebenen DNA-Menge das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt, die Wirksamkeit des DNA-Transfers sehr signifikant zu verbessern und nicht nur im Muskel, sondern gleichfalls im Plasma eine bedeutende Erhöhung der Menge eines Neurotrophins, wie NT3, zu erhalten.
Beispiel 24: Transfer des humanes Wachstumshormon kodierenden Gens
C57B1/6-Mäuse haben in den kranialen Tibia-Muskel und einseitig eine Injektion des Plasmids pXL3353 (10 μg) oder des Plasmids pXL3354 (10 μg) erhalten. Das Plasmid pXL3353 (15) ist ein Vektor, der von dem Plasmid pXL2774 abgeleitet ist, in das das vollständige Gen des humanen Wachstumshormons (XbaI/SphI-Fragment von hGH, das sich von dem Transkriptionsstartsignal, BamH1-Stelle, bis 224 bp nach der polyA-Stelle erstreckt) unter der Kontrolle des aus der frühen Region des humanen Zytomegalievirus (hCMV IE) stammenden Promotors und des Polyadenylierungssignals der späten Region des SV40-Virus eingeführt worden ist.
Die cDNA des Gens von humanem Wachstumshormon wurde erhalten durch umgekehrte Transkription einer mRNA-poly(A+)-Bank der humanen Hypophyse, gefolgt von 30 Zyklen PCR-Amplifizierung mit den folgenden Oligonukleotiden:
Zu der 5'-Region komplementäres Oligonukleotid:
5'- GGGTCTAGAGCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGAC-3'
Dieses Oligonukleotid enthält eine XbaI-Stelle und die Kozak-Sequenz.
Zu der 3'-Region komplementäres Oligonukleotid:
5'- GGGATGCATTTACTAGAAGCCACAGCTGCCTC-3'
Dieses Oligonukleotid enthält eine NsiI-Stelle und das Stop-Codon.
Das amplifizierte Fragment wurde in das Plasmid pCR2.1 (TA Cloning kit, Invitrogen) eingeführt und sequenziert. Ein XbaI/NsiI-Fragment von 681 bp, welches die cDNA von hGH enthält, wurde mit dem XbaI/NsiI-Fragment von pXL3353 ligiert, wodurch das Plasmid pXL3354 erzeugt wurde (15).
Die Bedingungen für den Elektrotransfer sind die folgenden: elektrische Feldstärke 200 V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz. Das elektrische Feld wird unverzüglich nach der Injektion der Plasmid-DNA angewendet. Es wird das Vorhandensein von hGH 7 Tage nach der Behandlung der Mäuse an dem bei 12000 g zentrifugierten Überstand der Muskelhomogenisate in PBS-Puffer untersucht. Die hGH-Menge wird durch eine quantitative ELISA-Bestimmung (Boehringer Mannheim) gemessen.
Tabelle 18: Mittelwerte ± Standardabweichung des hGH-Proteins (Pikogramm)/Muskel
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Elektrotransfer ermöglicht, eine sehr bedeutende Erhöhung des humanen Wachstumshormons zu erhalten. Es ist festzuhalten, dass diese Amplifizierung gleichfalls mit dem Plasmid, welches das vollständige Gen mit allen seinen Regulationssequenzen enthält, beobachtet wird.
Beispiel 25: Wirkung des Elektrotransfers auf die Expression von Impftransgenen
Dieses Beispiel weist nach, dass das erfindungsgemäße Verfahren gleichfalls anwendbar ist auf den Transfer von Genen, die Polypeptide von Interesse in Zusammenhang mit Impfungen kodieren.
Das Experiment erfolgt an weiblichen Balb/c-Mäusen im Alter von 9 Wochen. Die eingesetzten Elektroden sind Plattenelektroden aus rostfreiem Stahl im Abstand von 5 mm. VR-HA ist eine Plasmid-DNA, welche das Gen des Hämagglutinins aus dem Grippevirus (Stamm A/PR/8/34) umfasst. VR-gB ist eine Plasmid-DNA, welche das Gen des Glycoproteins B (gB) des humanen Zytomegalievirus (Stamm Towne) umfasst.
Die Plasmid-Lösung (50 μl einer Lösung mit 20 μg/ml oder 200 μg/ml in NaCl 0,9%) wird längs durch die Haut hindurch in den kranialen Tibia- Muskel einseitig injiziert. Die elektrischen Impulse werden 20 s nach der Verabreichung des Plasmids rechtwinklig zu der Achse des Muskels mit Hilfe eines Generators von Rechteckimpulsen (elektrische Feldstärke 200 V/cm, 8 aufeinanderfolgende Impulse mit einer Dauer von 20 ms, Frequenz 1 Hz) angwendet.
Zur Auswertung der Stimulation der Immunantwort wurde dem folgenden Immunisierungsprotokoll gefolgt.
J 0 (Tag 0) Entnahme des Vorimmun-Serums
J 1 (Tag 1) primäre Injektion, + oder – Elektrotransfer
J 2 (Tag 2) Entnahme von Immunserum
J 2 (Tag 2) Wiederholungs-Injektion, + oder – Elektrotransfer
J 42 (Tag 42) Entnahme von Immunserum
J 63 (Tag 63) Entnahme von Immunserum
Die Blutentnahmen erfolgen auf der Höhe des retro-orbitalen Sinus. Die quantitativen Bestimmungen der spezifischen Antikörper erfolgen durch ELISA. Jeder experimentelle Zustand wird an 10 Tieren, die eine einseitige Injektion erhalten haben, getestet.
Die Ergebnisse, die die Titer von Antikörpern, die gegen Hämagglutinin des Grippevirus gerichtet sind, betreffen, sind in der Tabelle 19A aufgeführt.
Tabelle 19-a: Titer von Antikörpern, die gegen Hämagglutinin des Grippe-Virus gerichtet sind, erhalten nach Injektion von 1 oder 10 μg DNA (VR-HA) in Abwesenheit oder in Gegenwart von elektrischen Impulsen. Die Ergebnisse sind die geometrischen Mittelwerte von 10 Tieren (8 Tiere für die Gruppe, denen 1 μg DNA in Gegenwart von elektrischen
Impulsen injiziert worden ist, und entnommen am Tag 63 (J 63)) ± Standardabweichung. Der Wert von p wurde durch Vergleich von jeweils zwei der Gruppen, die eine Injektion in Gegenwart und in Abwesenheit von elektrischen Impulsen erhalten haben, unter Verwendung des nicht-parametrischen Tests von Mann-Whitney erhalten.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Titer von Antikörpern, die gegen das Hämagglutinin des Grippe-Virus gerichtet sind, um einen Faktor von ungefähr 10 erhöht sind in den Gruppen, die den elektrischen Impulsen unterworfen worden waren. So weisen die Mäuse, die 1 μg DNA in Gegenwart von elektrischen Impulsen erhalten hatten, einen mittleren Antikörpertiter auf, der leicht höher ist als jener der Mäuse, die 10 μg DNA in Abwesenheit von elektrischen Impulsen erhalten hatten.
Die Ergebnisse, die die Titer von Antikörpern, die gegen das Glycoprotein B des humanen Zytomegalievirus gerichtet sind, betreffen, sind in der Tabelle 19B aufgeführt.
Tabelle 19B: Titer von Antikörpern, die gegen das Glycoprotein B (gB) des humanen Zytomegalievirus gerichtet sind, erhalten nach Injektion von 10 μg DNA (VR-gB) in Abwesenheit oder in Gegenwart von elektrischen Impulsen. Die Ergebnisse sind die geometrischen Mittelwerte von 10 Tieren (9 Tiere für die Gruppe, die eine Injektion in Gegenwart von elektrischen Impulsen erhalten hat) ± Standardabweichung. Der Wert von p wurde durch Vergleich von jeweils zwei der Gruppen, die eine Injektion in Gegenwart und in Abwesenheit von elektrischen Impulsen erhalten haben, unter Verwendung des nicht-parametrischen Mann-Whitney-Tests erhalten.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Titer von Antikörpern, die gegen das Glycoprotein B des humane Zytomegalievirus gerichtet sind, um einen Faktor von 4 am Tag 42 (J42) erhöht sind in der Gruppe, die den elektrischen Impulsen unterworfen worden war. Man stellt gleichfalls fest, dass der Variationskoeffizient in den Gruppen von Tieren, die den elektrischen Impulsen unterzogen worden sind, im Mittel dreimal geringer ist.

Claims

Verwendung von Nukleinsäure zur Herstellung einer Zusammensetzung, welche dazu bestimmt ist, in vivo in einen oder mehrere quergestreifte Muskeln transferiert zu werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung mit Zellen des Muskels in Kontakt gebracht wird durch gleichzeitiger oder nachfolgender Anwendung von einem oder mehreren elektrischen Impulsen von einpoligen Wellen mit einer Intensität zwischen 4 und 400 Volt/cm auf den Muskel.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zu transferierende Zusammensetzung für die Behandlung durch Gentherapie bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung für eine Impfanwendung oder immunstimulierende Anwendung bestimmt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkontaktbringen durch direkte Verabreichung in das Gewebe oder durch topische oder systemische Verabreichung erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellen einpolige oszillierende Wellen von begrenzter Dauer sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität des Felds zwischen 30 und 300 Volt/cm liegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die gesamte Dauer der Anwendung des elektrischen Felds über 10 Millisekunden beträgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Anwendung des elektrischen Felds auf den Muskel einen oder mehrere Impulse von regelmässiger Frequenz umfasst.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Anwendung. des elektrischen Felds auf den Muskel zwischen 1 und 100000 Impulse mit einer Frequenz zwischen 0,1 und 1000 Hertz umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse bezogen aufeinander auf unregelmässige Weise abgegeben werden und dass die Funktion, welche die Intensität des elektrischen Felds in Abhängigkeit von der Zeit eines Impulses beschreibt, variabel ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Integral der Funktion, welche die Variation des elektrischen Felds mit der Zeit beschreibt, über 1 kV × ms/cm beträgt.
Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Integral über oder gleich 5 kV × ms/cm beträgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse Impulse mit Rechteckwellen umfassen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse mittels Elektroden, die auf beiden Seiten des Muskels angeordnet sind oder in Kontakt mit der Haut angeordnet sind, angewendet werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse mittels Elektroden, die in das Innere des Muskels eingeführt worden sind, angewendet werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in den Muskel injiziert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure systemisch injiziert wird.
Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure intra-arteriell oder intravenös injiziert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure auf topischem, kutanem, oralem, vaginalem, intranasalem, subkutanem oder intraokularem Wege verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsaure in einer Zusammensetzung vorliegt, welche ausserdem pharmazeutisch annehmbare Träger oder Vehikel für die verschiedenen Verabreichungsweisen enthält.
Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung für die parenterale Verabreichung angepasst ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Desoxyribonukleinsäure ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure von synthetischem oder biosynthetischem Ursprung ist oder aus einem Virus oder einem prokaryotischen oder eukaryotischen einzelligen oder mehrzelligen Organismus extrahiert wird.
Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die verabreichte Nukleinsäure mit der Gesamtheit oder einem Teil der Bestandteile des Herkunftsorganismus und/oder des Synthesesystems assoziiert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine RNA oder ein Protein von Interesse kodiert.
Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA eine katalytische RNA oder Antisinn-RNA ist.
Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein Protein kodiert, welches unter den Enzymen, den Blutderivaten, den Hormonen, den Lymphokinen, den Wachstumsfaktoren, den trophischen Faktoren, den angiogenetischen Faktoren, den neurotrophen Faktoren, den Knochenwachstumsfaktoren, den hämopoetischen Faktoren, den Gerinnungsfaktoren, den Antigenen und den Proteinen, die an dem Stoffwechsel der Aminosäuren, der Lipide und der anderen essentiellen Bestandteile der Zelle beteiligt sind, ausgewählt wird.
Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure die angiogenetischen Faktoren VEGF und FGF, die neurotrophen Faktoren BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, FGF 1, NT3, NT5, das Protein Gax, Insulin für die Behandlung von Diabetes, Wachstumshormon, ein Zytokin, α-1-Antitrypsin, Calcitonin, Leptin und die Apolipoproteine, die Enzyme der Biosynthese der Vitamine, Hormone und Neuromediatoren kodiert.
Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Antikörper, ein variables Antikörper-Einzelkettenfragment (ScFv) oder ein jegliches anderes Antikörperfragment, welches Erkennungsfähigkeiten aufweist, mit einem Ziel einer Immuntherapie kodiert oder einen löslichen Rezeptor, ein Agonisten- oder Antagonisten-Peptid eines Rezeptors oder eines Adhäsionsproteins, ein künstliches, chimäres oder verkürztes Protein kodiert.
Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Anti-Idiotyp-Antikörper, ein lösliches Fragment des CD4-Rezeptors oder des TNFa-Rezeptors oder des Acetylcholinrezeptors kodiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 28 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Vorstufe eines therapeutischen Proteins kodiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in Form eines Plasmids vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein Gen von grosser Grösse und/oder Introns und/oder regulatorische Elemente von kleiner oder von grosser Grösse enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine episomale DNA oder ein künstliches Hefe-Chromosom oder ein Minichromosom ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure Sequenzen enthält, welche die Expression des Transgens in dem Muskel erlauben und/oder begünstigen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure mit einer jeglichen Art von Vektoren oder einer jeglichen Kombination von Vektoren, welche erlauben, den Transfer von Nukleinsäure zu verbessern, wie Viren, synthetischen oder biosynthetischen Agentien oder ferner angetriebenen oder nicht-angetriebenen Kügelchen assoziiert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass der Muskel einer Behandlung, welche darauf abzielt, den Gentransfer zu verbessern, einer Behandlung von pharmakologischer Natur mit lokaler oder systemischer Anwendung oder einer enzymatischen, permeabilisierenden, chirurgischen, mechanischen, thermischen oder physikalischen Behandlung unterzogen wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass sie erlaubt, durch den Muskel ein Mittel in physiologischen und/oder therapeutischen Dosen, entweder in den Muskelzellen oder welches sekretiert wird, produzieren zu lassen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass sie erlaubt, die Menge von exprimiertem Transgen zu modulieren, indem das Volumen von transfiziertem Muskelgewebe moduliert wird.
Verwendung nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass sie erlaubt, das Volumen von transfiziertem Muskelgewebe durch die Verwendung einer Mehrzahl von Verabreichungsstellen zu modulieren.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass sie erlaubt, die Menge von exprimiertem Transgen zu modulieren, indem die Anzahl, die Form, die Oberfläche und die Anordnung der Elektroden moduliert werden und indem die Intensität, die Anzahl, die Dauer, die Frequenz und die Form der Impulse sowie die Verabreichungsmenge und das Verabreichungsvolumen der Nukleinsäure variiert werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass sie erlaubt, die Lage der transfizierten Gewebe durch das Volumen von Gewebe, welches den örtlichen elektrischen Impulsen unterworfen wird, zu kontrollieren.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 43, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Rückkehr zu der Ausgangssituation durch operative Entfernung der Zone von transfiziertem Gewebe erlaubt.
Nukleinsäure und elektrisches Feld von einpoligen Wellen mit einer Intensität zwischen 4 und 400 Volt/cm als Kombinationsprodukt für deren getrennte oder zeitlich gestaffelte Verabreichung in vivo an den quergestreiften Muskel und für die Gentherapie, beruhend auf einer Elektrotransfektion in vivo in den quergestreiften Muskel nach Verabreichung der Nukleinsäure.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, das die Intensität des Felds zwischen 30 und 300 Volt/cm beträgt.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 46, dadurch gekennzeichnet, dass die gesamte Dauer der Anwendung des elektrischen Felds über 10 Millisekunden beträgt.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 47, dadurch gekennzeichnet, dass die Anwendung des elektrischen Felds auf den Muskel einen oder mehrere Impulse von regelmässiger Frequenz umfasst.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass die Anwendung des elektrischen Felds auf den Muskel zwischen 1 und 100000 Impulse mit einer Frequenz zwischen 0,1 und 1000 Hertz umfasst.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 47, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse bezogen aufeinander auf unregelmässig Weise abgegeben werden und dass die Funktion, welche die Intensität des elektrischen Felds in Abhängigkeit von der Zeit eines Impulses beschreibt, variabel ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 50, dadurch gekennzeichnet, dass das Integral der Funktion, welche die Variation des elektrischen Felds mit der Zeit beschreibt, über 1 kV × ms/cm beträgt.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Integral mehr als oder gleich 5 kV × ms/cm beträgt.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 52, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse einpolige oszillierende Wellen von begrenzter Dauer sind.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 53, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse Impulse mit Rechteckwellen umfassen.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 54, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse mittels Elektroden, welche auf beiden Seiten des Muskels angeordnet sind oder in Kontakt mit der Haut angeordnet sind, angewendet werden.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 54, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse mittels Elektroden, die in das Innere des Muskels eingeführt worden sind, angewendet werden.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 56, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in den Muskel injiziert wird.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 56, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure systemisch injiziert wird.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure intra-arteriell oder intravenös injiziert wird.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 56, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure auf topischem, kutanem, oralem, vaginalem, intranasalem, subkutanem oder intraokularem Wege verabreicht wird.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 60, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in einer Zusammensetzung vorliegt, welche ausserdem pharmazeutisch annehmbare Träger oder Vehikel für die verschiedenen Verabreichungsweisen umfasst.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 61, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung für eine parenterale Verabreichung angepasst ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 62, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Desoxyribonukleinsäure ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 62, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 64, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure von synthetischem oder biosynthetischem Ursprung ist oder aus einem Virus oder einem prokaryotischen oder eukaryotischen einzelligen oder mehrzelligen Organismus extrahiert wird.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, dass die verabreichte Nukleinsäure mit der Gesamtheit oder einem Teil der Bestandteile des Herkunftsorganismus und/oder des Synthesesystems assoziiert ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 66, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine RNA oder ein Protein von Interesse kodiert.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 67, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA eine katalytische RNA oder Antisinn-RNA ist.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 67, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein Protein kodiert, welches unter den Enzymen, den Blutderivaten, den Hormonen, den Lymphokinen, den Zytokinen, den Wachstumsfaktoren, den trophischen Faktoren, den angiogenetischen Faktoren, den neurotrophen Faktoren, den Knochenwachstumsfaktoren, den hämopoetischen Faktoren, den Gerinnungsfaktoren, den Antigenen und den Proteinen, die an dem Stoffwechsel der Aminosäuren, der Lipide und der anderen essentiellen Bestandteile der Zelle beteiligt sind, ausgewählt wird.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 69, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure die angiogenetischen Faktoren VEGF und FGF, die neurotrophen Faktoren BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, FGF1, NT3, NT5, das Protein Gax, Insulin für die Behandlung von Diabetes, Wachstumshormon, α-1-Antitrypsin, Calcitonin, Leptin und die Apolipoproteine, die Enzyme der Biosynthese der Vitamine, Hormone und Neuromediatoren kodiert.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 67, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Antikörper, ein variables Antikörpereinzelkettenfragment (ScFv) oder ein jegliches anderes Antikörperfragment, welches Erkennungsfähigkeiten aufweist, mit einem Ziel einer Immuntherapie kodiert oder einen löslichen Rezeptor, ein Agonisten- oder Antagonisten-Peptid eines Rezeptors oder eines Adhäsionsproteins, ein künstliches, chimäres oder verkürztes Protein kodiert.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 71, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsaure einen Anti-Idiotyp-Antikörper, ein lösliches Fragment des CD4-Rezeptors oder des TNFa-Rezeptors oder des Acetylcholinrezeptors kodiert.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 69 bis 72, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Vorstufe eines therapeutischen Proteins kodiert.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 73, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in Form eines Plasmids vorliegt.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 73, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein Gen von grosser Grösse und/oder Introns und/oder regulatorische Elemente von kleiner oder von grosser Grösse enthalt.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 73, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine episomale DNA oder ein künstliches Hefe-Chromosom oder ein Minichromosom ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 76, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure Sequenzen enthält, welche die Expression des Transgens in dem Muskel erlauben und/oder begünstigen.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 77, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure mit einer jeglichen Art von Vektoren oder einer jeglichen Kombination von Vektoren, welche erlauben, den Transfer von Nukleinsäure zu verbessern, wie Viren, synthetischen oder biosynthetischen Agentien oder ferner angetriebenen oder nicht-angetriebenen Kügelchen assoziiert ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 78, dadurch gekennzeichnet, dass der Muskel einer Behandlung, welche darauf abzielt, den Gentransfer zu verbessern, einer Behandlung von pharmakologischer Natur mit lokaler oder systemischer Anwendung oder einer enzymatischen, permeabilisierenden, chirurgischen, mechanischen, thermischen oder physikalischen Behandlung unterzogen wird.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 79, dadurch gekennzeichnet, dass es erlaubt, durch den Muskel ein Mittel in physiologischen und/oder therapeutischen Dosen, entweder in den Muskelzellen oder welches sekretiert wird, produzieren zu lassen.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 79, dadurch gekennzeichnet, dass es erlaubt, die Menge von exprimiertem Transgen zu modulieren, indem das Volumen von transfiziertem Muskelgewebe moduliert wird.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 81, dadurch gekennzeichnet, dass es erlaubt, das Volumen von transfiziertem Muskelgewebe durch die Verwendung einer Mehrzahl von Verabreichungsstellen zu modulieren.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 82, dadurch gekennzeichnet, dass es erlaubt, die Menge von exprimiertem Transgen zu modulieren, indem die Anzahl, die Form, die Oberfläche und die Anordnung der Elektroden moduliert werden und indem die Intensität des Felds, die Anzahl, die Dauer, die Frequenz und die Form der Impulse sowie die Verabreichungsmenge und das Verabreichungsvolumen der Nukleinsäure variiert werden.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 83, dadurch gekennzeichnet, dass es erlaubt, die Lage der transfizierten Gewebe durch das Volumen von Gewebe, welches den örtlichen elektrischen Impulsen unterworfen wird, zu kontrollieren.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 45 bis 84, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Rückkehr zu der Ausgangssituation durch operative Entfernung der Zone von transfiziertem Gewebe erlaubt.