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CN104780939A - 用于细胞免疫治疗的方法和组合物 - Google Patents

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CN104780939A CN201380054794.3A CN201380054794A CN104780939A CN 104780939 A CN104780939 A CN 104780939A CN 201380054794 A CN201380054794 A CN 201380054794A CN 104780939 A CN104780939 A CN 104780939A
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Seattle Childrens Hospital
Fred Hutchinson Cancer Center
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Abstract

本发明提供了赋予和/或增强通过细胞免疫治疗介导的免疫应答的核酸，载体，宿主细胞，方法和组合物，所述细胞免疫治疗例如过继转移CD8+中心记忆T细胞，或过继转移中心记忆T细胞与经遗传修饰以表达嵌合受体的CD4+T细胞的组合。在实施方案中，遗传修饰的宿主细胞包含核酸，所述核酸含有编码配体结合结构域的多核苷酸，含有定制间隔子区域的多核苷酸，含有跨膜结构域的多核苷酸，和含有细胞内信号转导结构域的多核苷酸。令人惊奇地发现，间隔子区域的长度可以影响嵌合受体修饰的T细胞体外识别靶细胞的能力，和影响嵌合受体修饰的T细胞的体内效力。还描述了由该方法产生的药物制剂，和使用所述药物制剂的方法。

Description

用于细胞免疫治疗的方法和组合物
本申请作为PCT国际专利申请提交于2013年8月20日并且要求2012年8月20日提交的美国专利申请序列号61/691,117的优先权，通过引用将其公开内容全文并入。
发明领域
本发明涉及生物医学领域并且特别地涉及用于癌症治疗的方法。尤其，本发明的实施方案涉及用于进行细胞免疫治疗的方法和组合物，包含肿瘤靶向受体修饰的T细胞。
关于联邦资助研究的声明
在政府支持下，以来自于美国卫生和人类服务部和白血病与淋巴瘤协会的资助金的形式进行本发明。美国政府拥有本发明的某些权利。
发明背景
通过基因转移来改造以表达特异针对肿瘤细胞上表达的表面分子的嵌合抗原受体(嵌合受体)的人T淋巴细胞的过继转移具有有效地治疗晚期恶性肿瘤的潜力。嵌合受体为合成的受体，包括细胞外配体结合结构域，最常见与细胞内信号转导组分连接的单克隆抗体的单链可变区(scFv)，最常见单独地CD3ζ或与一个或多个共刺激结构域组合的CD3ζ。许多嵌合受体设计中的研究集中于明确靶向于恶性细胞而不引起重要正常组织严重毒性的scFv和其他配体结合元件，和集中于明确用以活化T细胞效应功能的细胞内信号转导模块的最佳组合。然而，不确定嵌合受体设计中介导优越体外功能的变异是否在嵌合受体修饰的T细胞的临床应用中可再现地转变为改进的体内治疗活性。
需要鉴定用于确定对治疗活性及遗传修饰和过继转移细胞群重要的嵌合受体设计的元件的方法，所述方法提供了体内增强的存活和效力。
发明概述
在一方面，本公开涉及赋予和/或增强由细胞免疫治疗介导的免疫应答的方法和组合物，诸如通过过继转移肿瘤特异的，遗传修饰的单独的CD8+T细胞亚型或CD4+T细胞亚型，或其组合。本公开提供了包括此类核酸的嵌合受体核酸，和载体，和宿主细胞。编码嵌合受体的核酸序列与许多模块化组分连接在一起，所述模块化组分可以切除和用其他组分替代以便定制用于有效的T细胞活化和特异的靶分子或靶分子上表位的识别的嵌合受体。
在实施方案中，嵌合受体核酸包含编码配体结合结构域的多核苷酸，其中配体为恶性的或受感染的细胞上所表达的分子，编码多肽间隔子的多核苷酸，其中多肽间隔子为大约200个氨基酸或更少，编码跨膜结构域的多核苷酸；和编码细胞内信号转导结构域的多核苷酸。在实施方案中，多肽间隔子包含含有氨基酸序列X1PPX2P的修饰的IgG4铰链区，其可与其他氨基酸序列连接，包括但不限于Ig Fc的CH2序列和CH3序列，或仅Ig Fc的CH3序列。令人惊奇地发现假定没有信号转导能力的间隔子区域的长度影响经修饰表达嵌合受体的T细胞的体内效力并且需要针对单独的靶分子定制用于最佳的肿瘤或靶细胞识别。
本公开的另一方面提供了分离的嵌合受体核酸，其包含：编码配体结合结构域的多核苷酸，其中配体为肿瘤特异性抗原，病毒抗原，或靶细胞群上所表达的适于介导通过淋巴细胞识别和清除的任何其他分子；编码多肽间隔子的多核苷酸，其中多肽间隔子为针对每一靶配体特异的定制的长度，其中与参照嵌合受体相比，间隔子提供了增强的T细胞增殖和/或细胞因子产生；编码跨膜结构域的多核苷酸；以及编码一个或多个细胞内信号转导结构域的多核苷酸。在实施方案中，如果靶配体上的表位在靠近膜位置，则应用长的间隔子，如果靶配体上的表位在远离膜位置，应用短的间隔子。本公开包括包含如本文所述的分离的嵌合受体的表达载体和宿主细胞。
本公开的另一方面提供了嵌合受体多肽，其包含配体结合结构域，其中配体为肿瘤特异性抗原，病毒抗原，或表达在靶细胞群上并且可以被靶向以介导通过淋巴细胞识别和清除的任何其他分子；多肽间隔子，其中多肽间隔子为大约10-229个氨基酸；跨膜结构域；和一个或多个细胞内信号转导结构域。在实施方案中，多肽间隔子包含含有氨基酸序列X1PPX2P的修饰的IgG铰链区。
在另一方面，本公开提供了赋予和/或增强由细胞免疫治疗介导的免疫应答的组合物，诸如通过过继转移肿瘤特异的，特异遗传修饰的CD4+T细胞亚型，其中CD4+T细胞赋予和/或增强CD8+T细胞维持抗肿瘤反应性并且增加肿瘤特异性增殖和/或使肿瘤特异性增殖最大化的能力。在实施方案中，CD4+细胞经遗传修饰以表达如本文所述的嵌合受体核酸和/或嵌合受体多肽。
在另一方面，本公开提供了赋予和/或增强由细胞免疫治疗介导的免疫应答的组合物，诸如过继转移肿瘤特异的，特异遗传修饰的CD8+T细胞亚型。在实施方案中，CD8+细胞表达如本文所述的嵌合受体核酸和/或嵌合受体多肽。
在另一实施方案中，本发明提供了具有遗传修饰的CD8+细胞毒性T细胞群以赋予和/或增强免疫应答的过继细胞免疫治疗组合物，其中细胞毒性T淋巴细胞制剂包含表达嵌合受体的CD8+T细胞，嵌合受体包含与疾病或病症有关的配体的配体结合结构域，定制的间隔子区域，跨膜结构域；和T细胞或其他受体的细胞内信号转导结构域，诸如共刺激结构域，和/或遗传修饰的辅助T淋巴细胞制剂，其中辅助T淋巴细胞制剂具有表达嵌合受体的CD4+T细胞，嵌合受体包含对与疾病或病症有关的配体特异性抗体可变区，定制的间隔子区域，跨膜结构域；和一个或多个细胞内信号转导结构域。
在一实施方案中，本发明提供了在患有疾病或病症的个体中进行细胞免疫治疗的方法，其通过将提供细胞免疫应答的遗传修饰的细胞毒性T淋巴细胞制剂给予所述个体而，其中细胞毒性T淋巴细胞制剂包含具有嵌合受体的CD8+T细胞，嵌合受体包含编码配体结合结构域的多核苷酸，其中配体为肿瘤特异性抗原，病毒抗原，或靶细胞群上表达的适于介导通过淋巴细胞识别和清除的任何分子；编码多肽间隔子的多核苷酸，其中多肽间隔子为针对每一靶向配体特异的定制的长度，其中与参照嵌合受体相比，间隔子提供了增强的T细胞增殖和/或细胞因子产生；编码跨膜结构域的多核苷酸；以及编码一个或多个细胞内信号转导结构域的多核苷酸。在实施方案中，配体结合结构域为对与疾病或病症有关的配体特异的细胞外抗体可变区。实施方案包括遗传修饰的辅助T淋巴细胞制剂，其中辅助T淋巴细胞制剂包含具有嵌合受体的CD4+T细胞，嵌合受体包含编码配体结合结构域的多核苷酸，其中配体为肿瘤特异性抗原，病毒抗原，或靶细胞群上表达的适于介导通过淋巴细胞识别和清除的任何分子；编码多肽间隔子的多核苷酸，其中多肽间隔子为针对每一靶向配体特异的定制的长度，其中与参照嵌合受体相比，间隔子提供了增强的T细胞增殖和/或细胞因子产生；编码跨膜结构域的多核苷酸；以及编码一个或多个细胞内信号转导结构域的多核苷酸。在实施方案中，遗传修饰的CD8+细胞群和遗传修饰的CD4+细胞群为共给药的。在实施方案中，T细胞为自体的T细胞或同种异体的T细胞。
以上方法的各种修改是可能的。例如，通过CD4+T细胞所表达的嵌合受体与通过CD8+T细胞所表达的嵌合受体可以是相同的或不同的。
在另一方面，本发明提供了制造过继免疫治疗组合物的方法，其通过获取引起细胞免疫应答并且表达抗原反应的嵌合受体的嵌合受体修饰的肿瘤特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞制剂，其中修饰的细胞毒性T淋巴细胞制剂包含具有嵌合受体的CD8+T细胞，嵌合受体包含配体结合结构域，其中配体为肿瘤特异性抗原，病毒抗原，或靶细胞群上表达的适于介导通过淋巴细胞识别和清除的任何分子；多肽间隔子，其中多肽间隔子为针对每一靶向配体特异的定制的长度，其中与参照嵌合受体相比，间隔子提供了增强的T细胞增殖和/或细胞因子产生；跨膜结构域；以及一个或多个细胞内信号转导结构域；和/或通过获取修饰的初始的或记忆的CD4+T辅助细胞，其中修饰的辅助T淋巴细胞制剂包含具有嵌合受体的CD4+T细胞，嵌合受体包含配体结合结构域，其中配体为肿瘤特异性抗原，病毒抗原，或靶细胞群上表达的适于介导通过淋巴细胞识别和清除的任何分子；多肽间隔子，其中多肽间隔子为针对每一靶向配体特异的定制的长度，其中与参照嵌合受体相比间隔子提供了增强的T细胞增殖和/或细胞因子产生；跨膜结构域；以及一个或多个细胞内信号转导结构域。
本发明的这些和其他实施方案在所附的详述，附图和权利要求中进一步地描述。
附图简述
图1间隔子序列文库。我们构建了质粒文库，其包含密码子优化的DNA序列，所述DNA序列编码包括单独的IgG4铰链，与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链，或与CH3结构域连接的IgG4铰链的细胞外组分。任何scFV序列(VH和VL)可以克隆到编码可变的间隔子结构域的这一文库的序列的5’。进而，间隔子结构域与CD28跨膜和细胞内信号转导结构域连接并且与CD3ζ连接。载体中T2A序列将编码截短的人表皮生长因子受体(tEGFR)选择标记与嵌合受体分离。
图2：经修饰以表达具有修饰的间隔子长度的2A2ROR1嵌合受体的T-细胞的体外细胞毒性，细胞因子产生和增殖。(A)用具有长的，中等的和短的间隔子结构域的2A2ROR1嵌合受体分别修饰的纯化的CD8+TCM-衍生的细胞系的表型。与2A2scFV中的表位结合的抗-F(ab)抗体的染色显示具有全长或截短的间隔子的ROR1嵌合受体的表面表达。(B)表达具有长的(●)、中等的(▲)和短的间隔子(◆)的各种2A2ROR1嵌合受体或tEGFR对照慢病毒载体(x)的T细胞抗ROR1+和对照靶细胞的细胞溶解活性。柱状图概述了来自3组独立的实验(E:T＝30:1)的细胞毒性数据，标准化为2A2ROR1嵌合受体‘长的’的细胞溶解活性＝1，并且通过学生t检验分析。(C)没有外源性细胞因子添加，Raji/ROR1(左侧图)和原发性CLL细胞(右侧图)刺激后72小时，CFSE染料稀释法用于测量2A2ROR1嵌合受体和tEGFR对照T细胞的增殖。为了分析，合并一式三份的孔并且分析活的(PI-)CD8+T细胞的增殖。每一直方图以上的数字指示增殖亚型经历的细胞分裂的数目，每一图旁边提供了每一门中经历≥4/3/2/1次细胞分裂的T细胞分数。(D)来自于一式三份的表达各种2A2ROR1嵌合受体的5×104个T细胞与Raji/ROR1和原发性CLL细胞共培养24小时后获得的上清液的多重细胞因子测定。标准化来自于3个独立的实验的多重细胞因子数据(2A2ROR1嵌合受体‘长的’的细胞因子释放＝1)并且通过学生t检验分析(右侧柱状图)。
图3.R11嵌合受体需要长的间隔子用于ROR1+肿瘤细胞的识别。将编码来自于R11单克隆抗体scFV，对孤儿酪氨酸激酶受体ROR1的膜近端Kringle结构域中的表位特异的序列克隆到包含4-1BB共刺激结构域的我们的嵌合受体文库中单独的IgG4铰链(短的)，IgG4铰链/CH3(中等的)，和IgG4铰链/CH2/CH3序列的上游并且制备为慢病毒载体。A).转导人CD8+T细胞并且通过tEGFR标记染色检测短的，中等的，和长的嵌合受体各自的转导效率。B).测定表达短的(顶部)，中等的(中部)，和长的(底部)的转导的T细胞对单独的K562白血病细胞或经转染以表达ROR1的K562白血病细胞的溶解。只有表达长的间隔子嵌合受体的T细胞有效地杀死ROR1+K562细胞。C).用CFSE标记表达短的(顶部)，中等的(中部)，和长的(底部)的转导的T细胞，用表达ROR1或CD19(对照)的K562细胞刺激并且在72小时后测定细胞增殖。表达长的间隔子嵌合受体的T细胞针对ROR1+K562细胞特异性增殖。D).用表达ROR1或CD19(对照)的Raji淋巴瘤细胞和K562细胞刺激表达短的(顶部)，中等的(中部)，和长的(底部)的转导的T细胞并且在24小时内测定干扰素γ向上清液的分泌。表达长的间隔子嵌合受体的T细胞对ROR1阳性靶细胞响应而增殖和产生最高水平的干扰素γ。
图4：具有修饰的间隔子长度的衍生自2A2的ROR1嵌合受体和具有不同亲和力R12scFV的设计。(A)编码一组ROR1嵌合受体的慢病毒转基因插入物的设计，所述设计包含2A2scFV，‘铰链-CH2-CH3’(长间隔子，229AA)，‘铰链-CH3’(中等的，119AA)，或只有‘铰链’(短的，12AA)的IgG4-Fc衍生的间隔子，和具有CD3ζ和CD28的信号转导模块。每一嵌合受体盒包含T2A元件下游编码的截短的EGFR标记。(B)慢病毒转基因插入物，编码衍生自R12和2A2scFV的ROR1-特异性嵌合受体，其具有短的IgG4-Fc‘铰链’间隔子(12AA)和分别包含CD28和CD3ζ，或4-1BB和CD3ζ的信号转导模块(合计:4个构建体)。
图5：用衍生自具有高于2A2的亲和力的mAb R12的ROR1嵌合受体修饰的T细胞的抗肿瘤反应性。(A)用具有短的IgG4-Fc‘铰链’间隔子，和CD28或4-1BB共刺激结构域的R12和2A2ROR1嵌合受体分别修饰的纯化多克隆CD8+TCM-衍生的T-细胞系上tEGFR表达。(B)表达R12(28-▲；4-1BB-Δ)和2A2ROR1嵌合受体(28-●；4-1BB○)或tEGFR对照载体(x)的T细胞抗ROR1+和对照靶细胞的细胞毒性。(C)24小时后从5×104个表达各种ROR1嵌合受体的T细胞与Raji/ROR1肿瘤细胞的共培养获得的上清液的多重细胞因子测定。中间/右侧柱状图显示了来自通过学生t检验分析的3个独立的实验标准化的多重数据(ROR1嵌合受体2A2的细胞因子释放＝1)。(D)通过CFSE染色稀释法评估用Raji/ROR1刺激并且没有外源性细胞因子添加72小时后ROR1嵌合受体T细胞和tEGFR对照T细胞的增殖。每一直方图以上的数字指示增殖亚型经历的细胞分裂的数目，每一图旁边提供了每一门中经历≥4/3/2/1次细胞分裂的T细胞分数。
图6：用衍生自具有高于2A2的亲和力的mAb R12的ROR1嵌合受体修饰的CD4+T细胞系的细胞因子的产生和增殖的分析。(A-B)2A2和R12ROR1嵌合受体具有短的间隔子和CD28共刺激结构域。(A)来源于用Raji/ROR1肿瘤细胞刺激5×104个表达2A2和R12ROR1嵌合受体的CD4+T细胞24小时后获得的上清液的多重细胞因子分析。(B)通过CFSE染色稀释法评估用Raji/ROR1细胞刺激并且没有外源性细胞因子添加72小时后CD4+R12和2A2ROR1嵌合受体T细胞和tEGFR对照T细胞的增殖。每一直方图以上的数字指示增殖亚型经历的细胞分裂的数目，直方图上提供了每一门中经历≥5/4/3/2/1次细胞分裂的T细胞分数。
图7：原发性CLL被用具有最佳的短的间隔子和4-1BB共刺激结构域的2A2和R12ROR1嵌合受体修饰的T细胞，或用CD19特异性嵌合受体修饰的T细胞识别。(A)原发性CLL上ROR1/CD19的表达，和原发性CLL和Raji/ROR1肿瘤细胞(黑点状图)上CD80/86的表达，它们可以吸引嵌合受体T细胞上的CD28(白色直方图)。匹配的同型对照mAb染色显示为灰点状图/直方图。(B)通过铬释放测定分析表达2A2(●)和R12ROR1嵌合受体(■)，CD19-特异性嵌合受体(▲)的T细胞和tEGFR对照载体(x)修饰的T细胞抗原发性CLL(左图)和正常的B细胞(右图)的细胞溶解活性。标准化来自4组独立的实验(E:T＝30:1)的抗原发性CLL的细胞毒性数据(ROR1嵌合受体2A2的细胞溶解活性＝1)，并且通过学生t检验分析(柱状图)。(C)原发性CLL细胞刺激5×104个嵌合受体T细胞24小时后多重细胞因子分析。未刺激的嵌合受体T细胞的细胞因子释放低于3.6pg/ml(检测极限)(左侧柱状图)。ELISA用于检测通过5×104个2A2和R12ROR1嵌合受体T细胞与原发性CLL共培养24小时后产生的IFN-γ。1的O.D.相当于大约250pg/ml(右侧柱状图)。(D)原发性CLL细胞刺激72小时后，2A2ROR1，R12ROR1和CD19嵌合受体修饰的CD8+T细胞的增殖。每一直方图以上的数字指示增殖亚型经历的细胞分裂的数目，每一图旁边提供了每一门中经历≥3/2/1次细胞分裂的T细胞分数。
图8：通过嵌合受体修饰的CD4+辅助T细胞增强了ROR1嵌合受体和CD19嵌合受体修饰的CD8+T细胞抗原发性CLL的功能。(A)产生于一式三份的5×104个分别表达R12ROR1和CD19-嵌合受体的CD8+和CD4+T细胞共培养，用原发性CLL孵育24小时的IL-2的ELISA。1的O.D.相当于大约800pg/ml。(B)通过添加嵌合受体修饰的CD4+T细胞增强了嵌合受体修饰的CD8+T细胞对原发性CLL响应的的增殖。分别表达2A2ROR1、R12ROR1和CD19嵌合受体的CFSE标记的CD8+T细胞与肿瘤细胞，2A2ROR1，R12ROR1和CD19嵌合受体转导的或对照未转导的CD4+T细胞共培养(CD8+:CD4+＝1:1)。刺激72小时后分析CD8+亚型的增殖。每一直方图以上的数字指示细胞分裂的数目，每一图旁边提供了每一门中经历≥3/2/1次细胞分裂的T细胞分数。
图9：2A2ROR1，R12ROR1和CD19嵌合受体T细胞的体内抗肿瘤效力。经由尾静脉注射用0.5×106个JeKo-1/ffluc MCL接种小鼠群，肿瘤接种后7天给予5×106个2A2ROR1，R12ROR1或CD19嵌合受体T细胞，或表达tEGFR对照载体的T细胞。所有嵌合受体构建体都具有短的IgG4‘只有铰链’间隔子和4-1BB共刺激结构域。(A，B)用表达2A2ROR1嵌合受体(▼)，高亲和力R12ROR1嵌合受体(■)，CD19-特异性嵌合受体(▲)的T细胞，用tEGFR(●)单独地转导的T细胞，处理的小鼠群和未处理的小鼠的肿瘤的连续生物发光成像。生物发光成像显示了骨髓和胸腔中肿瘤临床表现，因此在包含每一个体小鼠的全身和胸腔的感兴趣的区域中测量信号强度。(C)个体处理和对照组中生存率的Kaplan-Meier分析。使用对数秩和(log-rank)检验进行统计分析。A-C中所示的数据代表2个独立的实验中所获得的结果。(D)2A2ROR1，R12ROR1和CD19嵌合受体T细胞的体内增殖。肿瘤接种后第7天，荷瘤NSG/JeKo-1小鼠接受单次剂量的5×106个CFSE-标记的2A2ROR1，R12ROR1或CD19嵌合受体T细胞，72小时后，从每一个体小鼠收集外周血，骨髓和脾脏。分析活的(PI-)，CD45+CD8+tEGFR+T细胞的频率和增殖。每一直方图的左侧分别以活细胞的百分比提供了2A2ROR1，R12ROR1和CD19嵌合受体T细胞的频率，每一图上提供了经历≥4/3/2/1次细胞分裂的T细胞分数。
图10.ROR1和NKG2D配体在上皮癌细胞系上的表达。(A)ROR1在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和468，肾细胞癌系FARP，TREP和RWL(黑色直方图)上的表达。匹配的同型对照的抗体的染色显示为灰色直方图。(B)CD80/86和NKG2D配体MICA/B在MDA-MB-231和Raji/ROR1肿瘤细胞上的表达，NKG2D(CD314)在2A2和R12ROR1嵌合受体T细胞上的表达。匹配的同型对照的mAb染色显示为灰色点状图/直方图。
图11：ROR1嵌合受体修饰的T细胞体外识别ROR1+上皮肿瘤细胞。(A)评估R12ROR1嵌合受体修饰的T细胞(短的间隔子/4-1BB共刺激结构域，实心符号)和tEGFR对照T细胞(空心符号)抗ROR1+乳腺癌系和肾细胞癌系的细胞溶解活性的铬释放测定。(A-D)2A2和R12ROR1嵌合受体具有最佳的短的间隔子和4-1BB共刺激结构域。(B)MDA-MB-231和Raji/ROR1肿瘤细胞刺激表达2A2和R12ROR1嵌合受体的T细胞后多重细胞因子分析。(C)MDA-MB-231肿瘤细胞刺激后72小时2A2和R12ROR1嵌合受体修饰的CD8+T细胞的增殖。为了分析，合并一式三份的孔并且分析活的(PI-)CD8+T细胞的增殖。每一直方图以上的数字指示增殖亚型经历的细胞分裂的数目，每一直方图旁边提供了每一门中经历≥4/3/2/1次细胞分裂的T细胞分数。(D)普通培养基中R12ROR1嵌合受体T细胞与MDA-MB-231共培养24小时，添加NKG2D途径的抗体鸡尾酒阻断剂[抗NKG2D(克隆1D11)，抗-MICA/B(克隆6D4)和抗-ULBP]或匹配的同型对照mAb后产生的IL-2的ELISA。0.6的O.D.相当于大约1900pg/ml。
图12.细胞外间隔子长度对表达HER2特异性嵌合受体的CD8+人T细胞识别和引起肿瘤细胞溶解的影响。A.)赫赛汀(Herceptin)Fab表位在人HER2上靠近肿瘤细胞膜端表位位置的描述。B.)赫赛汀scFvCAR间隔子长度变体的结构格式为具有羧基EGFRt标记跨膜蛋白的-T2A-连接的多肽，C.)人CD8+CTL中表达的短的，中等的和长的间隔子赫赛汀-CAR变体的蛋白质印迹检测，D.)用赫赛汀-CAR变体转导，然后通过赫赛汀-生物素，抗生物素微磁珠免疫磁珠纯化的转导的人CD8+CTL的EGFRt的流式细胞术检测，E.)经转导以表达赫赛汀CAR变体(短的-S；中等的-M；和长的-L)的T细胞抗HER2+Med411FH和D283人成神经管细胞瘤细胞系的不同的细胞溶解功能(D341为HER2-对照成神经管细胞瘤细胞系，插图流式图为抗HER2特异的mAb染色的肿瘤靶细胞系)。绿色＝完整的IgG4(长的间隔子，▼)，蓝色＝IgG4铰链:CH3(中等的间隔子；▲)，红色＝只有IgG4铰链(短的间隔子；■)。
图13：CD19嵌合受体载体和CD19嵌合受体T细胞的产生。(A)编码一组在细胞外间隔子长度和细胞内共刺激方面不同的CD19特异性嵌合受体的慢病毒转基因插入物的设计。每一嵌合受体编码衍生自FMC63mAb的VL-VH方向的CD19特异的单链可变片段，铰链-CH2-CH3(长的间隔子，229AA)或只有铰链(短的间隔子，12AA)的IgG4-衍生的间隔子结构域，和信号转导模块，其包含CD3ζ与单独的CD28或4-1BB，或CD3ζ与串联的CD28和4-1BB。每一嵌合受体盒包含可裂解的2A元件的下游编码的截短的EGFR标记。(B，C)从正常供体的纯化的CD8+CD45RO+CD62L+中心记忆T细胞(TCM)制备每一个CD19嵌合受体构建体修饰的多克隆T细胞系。慢病毒转导后，使用tEGFR标记纯化每一细胞系中转基因阳性的T细胞并且扩增用于体外和体内实验。(D)tEGFR标记染色后MFI显示了在每一个CD19嵌合受体修饰的T细胞中相等的转基因表达。
图14：具有不同的CD19嵌合受体修饰的T细胞的体外细胞毒性、细胞因子产生和增殖。(A)表达各种CD19嵌合受体的T细胞抗CD19+和对照靶细胞的细胞溶解活性。(B)一式三份的表达各种CD19嵌合受体的T细胞和CD19转染的K562细胞，和CD19+Raji细胞共培养24小时后获得的上清液的多重细胞因子测定。(C)表达各种CD19嵌合受体的T细胞的细胞因子产生的比较。标准化来自于6个独立的实验的多个细胞因子数据(CD19嵌合受体‘短的/CD28’CTL的细胞因子释放＝1)并通过学生t检验分析。(D)没有外源性细胞因子添加，K562/CD19(上图)刺激和CD19+Raji肿瘤细胞(下图)刺激72小时后，CFSE染料稀释法用于测量CD19嵌合受体T细胞的增殖。为了分析，合并一式三份的孔并且分析活的(PI-)CD8+T细胞的增殖。每一直方图以上的数字指示增殖亚型经历的细胞分裂的数目，每一图左上部提供了每一门中经历≥4/3/2/1次细胞分裂的T细胞分数。(E)在表达各种CD19嵌合受体的T细胞与Raji肿瘤细胞共培养72小时结束时进行PI染色。每一直方图中提供了嵌合受体T细胞系(CD3+)内PI+细胞的百分比。
图15：具有短的细胞外间隔子结构域的CD19嵌合受体T细胞消除NOD/SCID小鼠中Raji肿瘤。(A)经由尾静脉注射用Raji-ffluc接种小鼠群，肿瘤接种后2天和9天通过尾静脉注射给予用包含长的和短的间隔子结构域的CD19嵌合受体转导的T细胞或单独用tEGFR转导的T细胞。荧光素底物注射后，通过连续生物发光成像评估肿瘤进展和分布。(B)用表达具有短的间隔子(‘短的/CD28’和‘短的/4-1BB’)和长的间隔子(‘长的/CD28’和‘长的/4-1BB’)结构域的CD19嵌合受体的T细胞，tEGFR对照载体转导的T细胞处理的小鼠群或未处理的小鼠群中肿瘤的连续生物发光成像。代表CD19嵌合受体或tEGFR转导的T细胞处理的小鼠群的每一图也显示了用于比较的未处理的小鼠中肿瘤进展的平均值(红色三角)。(C)未处理的小鼠和表达具有短的间隔子(‘短的/CD28’和‘短的/4-1BB’)和长的间隔子(‘长的/CD28’和‘长的/4-1BB’)结构域的CD19嵌合受体的T细胞，对照tEGFR处理的小鼠的生存率的Kaplan-Meier分析。使用对数秩和(log-rank)检验进行统计分析。B和C中所示的数据代表3个独立的实验中所获得的结果。
图16：具有短的间隔子(短的/4-1BB)的CD19嵌合受体T细胞以剂量依赖的方式消除NSG小鼠中已建立的Raji肿瘤。(A)经由尾静脉注射用Raji-ffluc接种小鼠并且在第6天通过生物发光成像确认肿瘤移植。在第7天，小鼠接受各种剂量CD19嵌合受体‘短的/4-1BB’或tEGFR-对照慢病毒转导的T细胞的单次静脉注射。(B，C)表达CD19嵌合受体‘短的/4-1BB’的T细胞的剂量依赖的抗肿瘤效力。对照的小鼠群接受单次高剂量的tEGFR单独修饰的T细胞。(D)过继转移到NSG/Raji小鼠后CD19嵌合受体T细胞的存留。用2.5×106个CD19嵌合受体‘短的/4-1BB’T细胞处理的小鼠群中外周血(眼睛出血)的流式细胞术分析。CD8+tEGFR+T细胞的频率显示为活的外周血细胞的百分比。
图17：表达具有短的间隔子和CD28或4-1BB的CD19嵌合受体的T细胞比那些表达具有长的间隔子的CD19嵌合受体的T细胞更有效地对抗已建立的淋巴瘤。(A)第0天用Raji-ffluc接种NSG小鼠，并且在第7天用2.5×106个表达短的或长的间隔子和CD28或4-1BB共刺激结构域的CD19嵌合受体T细胞的单次剂量处理小鼠。(B)每一处理组中小鼠的生存率的Kaplan-Meier分析。使用对数秩和(log-rank)检验进行统计分析。(C)用表达具有短的间隔子(‘短的/CD28’和‘短的/4-1BB’)、和长的间隔子(‘长的/CD28和‘长的/4-1BB’)的CD19嵌合受体的T细胞处理的小鼠群的生物发光成像。每一时间点处在未处理的小鼠中观察到的肿瘤负荷平均值显示在每一图中用于比较(三角形)。(D)与表达具有长的间隔子结构域的CD19嵌合受体的T细胞相比，表达具有短的间隔子结构域的CD19嵌合受体的T细胞的体内存留增强。通过流式细胞术检测转移后第3天和第10天获得的外周血中CD8+tEGFR+T细胞的频率并且显示为活的(PI-)外周血细胞的百分比。通过学生t检验进行统计分析。B-D中所示的数据代表3个独立的实验中所获得的结果。
图18：增加嵌合受体T细胞剂量或增强共刺激信号转导没有改善具有长的间隔子结构域的CD19嵌合受体对抗已建立的淋巴瘤的抗肿瘤效力。(A)表达‘长的/CD28’，‘长的/4-1BB’和‘长的/CD28_4-1BB’CD19嵌合受体的T细胞抗CD19+和对照靶细胞的细胞溶解活性。(B)一式三份的K562/CD19和Raji肿瘤细胞与表达各种CD19嵌合受体的T细胞共培养24小时后获得的上清液的多重细胞因子测定。(C)用CD19+肿瘤细胞刺激后72小时通过CFSE染料稀释法评估CD19嵌合受体T细胞的增殖(K562/CD19-左图；Raji-右图)。为了分析，合并一式三份的孔并且分析活的(PI-)CD8+T细胞的增殖。每一直方图以上的数字指示增殖亚型经历的细胞分裂的数目，每一图左上部提供了每一门中经历≥4/3/2/1次细胞分裂的T细胞分数。(D)表达具有短的(‘短的/CD28’)和长的间隔子结构域(‘长的/CD28’和‘长的/CD28_4-1BB’)的CD19嵌合受体的T细胞，或编码tEGFR的对照慢病毒载体修饰的T细胞处理的小鼠的生存率Kaplan-Meier分析。使用对数秩和(log-rank)检验进行统计分析。(E)表达具有短的间隔子(‘短的/CD28’)，和长的间隔子(‘长的/CD28和‘长的/CD28_4-1BB’)的CD19嵌合受体的T细胞处理的小鼠群的生物发光成像。图表显示了未处理的小鼠中肿瘤进展平均值用于比较(红色三角形)。(F)表达各种CD19嵌合受体的T细胞的体内存留。通过流式细胞术检测转移后第3天和第10天获得的外周血中CD8+tEGFR+T细胞的频率并且显示为活的(PI-)外周血细胞的百分比。通过学生t检验进行统计分析。
图19：具有长的间隔子结构域的CD19嵌合受体T细胞被体内肿瘤活化但未能增加细胞数目。(A)转移到NSG/Raji小鼠之前用每一CD19嵌合受体修饰的T细胞上CD69和CD25的表达。(B)用Raji-ffluc肿瘤细胞接种小鼠群，并且在7天后小鼠群接受CFSE-标记的CD19嵌合受体转导的T细胞或对照T细胞。给予T细胞24和72小时后从小鼠亚组收获骨髓和脾脏。(C，D)T细胞转移后24小时(C)和72小时(D)所获得的骨髓单核细胞的多参数流式细胞术分析。点状图显示在门控PI-细胞后抗CD3和抗CD45染色以检测可存活的人T细胞。CD3-CD45+门包含Raji肿瘤细胞。活的(PI-)CD3+CD45+T细胞上CD25和CD69的表达显示在直方图中。(E)T细胞转移后24和72小时获得的脾脏中CD3+CD45+T细胞的频率。点状图为门控的活的PI-脾细胞并且CD3+CD45+T细胞的频率显示在每一图中。(F)T细胞转移到NSG/Raji小鼠后数小时骨髓和脾细胞的PI染色。直方图中的数字表示CD3+群内PI+的百分比。(G)表达具有短的间隔子(‘短的/CD28’和‘短的/4-1BB’)，长的间隔子(‘长的/CD28和‘长的/4-1BB’)的CD19嵌合受体的T细胞，或对照T细胞处理的小鼠群的生物发光成像。
图20：与表达具有4-1BB和CD3ζ和CD8α铰链的CD19嵌合受体的T细胞相比，表达具有4-1BB和CD3ζ和修饰的IgG4-Fc铰链的CD19嵌合受体的T细胞展示了优越的体外和体内功能。A.具有IgG4Fc铰链，CD8α铰链的CD19嵌合受体修饰的T细胞和对照T细胞抗Cr51-标记CD19转染的K562细胞，表达CD19的Raji淋巴瘤细胞，和K562对照T细胞的细胞溶解活性。显示4小时Cr51释放测定中不同E/T比率的溶解。B.5×104个表达具有IgG4Fc铰链或CD8α铰链的CD19嵌合受体的T细胞与Raji肿瘤细胞共培养24小时后的干扰素γ产生。1的O.D.相当于约500pg/ml干扰素γ。C.CFSE染料稀释法测定用以测量与CD19阳性Raji淋巴瘤细胞共培养72小时后表达具有IgG4Fc铰链或CD8α铰链的CD19嵌合受体的T细胞和单独表达tEGFR的T细胞(对照)的增殖。每一直方图以上的数字指示增殖亚型经历的细胞分裂的数目，每一图旁边提供了每一门中经历≥3/2/1次细胞分裂的T细胞分数。D.表达具有IgG4Fc铰链(组1)或CD8α铰链(组2)的CD19嵌合受体的T细胞和单独表达tEGFR(组3)的T细胞在用表达萤火虫荧光素酶(ffluc)的Raji肿瘤细胞接种的NSG小鼠中体内抗肿瘤活性。肿瘤接种后17天和T细胞接种后10天使小鼠成像。数据显示，与CD19嵌合受体IgG4Fc铰链T细胞(组1)相比，对照tEGFR T细胞(组3)处理的或CD19嵌合受体CD8α铰链T细胞(组2)处理的小鼠中肿瘤负荷更大。
发明详述
除非另有定义，本文所用的所有科技和科学术语都具有与本发明所属的领域中那些普通技术人员通常理解的相同的意义。
如本文所用的“大约”当涉及测量值时指的是包括特定值±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±l％，仍更优选±0.1％的变化。
如本文所用的“活化”指的是T细胞的状态，其已被刺激足以诱导可检测的细胞增殖，细胞因子产生或诸如CD69和CD25的细胞表面标记的表达或可检测的效应功能。
如本文所用的“活化诱导的细胞死亡”指的是T细胞的状态，其已被活化但不能够增殖超过2代并且展示凋亡标记。
如本文所用的“抗原”或“Ag”指的是引起免疫应答的分子。这一免疫应答涉及抗体产生，或特异的免疫活性细胞的活化，或这两者。非常明显的是抗原可以合成生成，重组产生或可以衍生自生物样品。此类生物样品可以包括但不限于组织样品，肿瘤样品，细胞或生物体液。
如本文所用的“抗肿瘤效应”指的是生物学效应，可以通过肿瘤体积的减小，肿瘤细胞数目的减少，转移酶数目的减少，预期寿命的增加，或与癌症状态有关的各种生理症状的减少所证明。也可以通过复发减少或复发之前的时间延长证明“抗肿瘤效应”。
如本文所用的“嵌合受体”指的是合成设计的受体，其包含抗体的配体结合结构域或与疾病或病症相关分子结合的其他蛋白序列，经由间隔子结构域连接到T细胞的一个或多个细胞内信号转导结构域，或其他受体，诸如共刺激结构域。
如本文所用的术语“共刺激结构域”指的是向T细胞提供信号的信号转导部分，除了例如TCR/CD3复合体的CD3ζ链所提供的原始信号之外，其介导T细胞应答，包括但不限于活化，增殖，分化，细胞因子分泌等。共刺激结构域可以包括CD27，CD28，4-1BB，OX40，CD30，CD40，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-l(LFA-l)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3和与CD83特异性结合的配体的全部或一部分。在实施方案中，共刺激结构域为细胞内信号转导结构域，其与其他细胞内介质相互作用从而介导包括活化，增殖，分化，细胞因子分泌等细胞应答。
如本文所用的“编码”指的是多核苷酸中核苷酸的特异序列，诸如基因，cDNA，mRNA，其用作其他大分子诸如确定的氨基酸序列的合成模板。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，那么该基因编码该蛋白。“编码多肽的核酸序列”包括彼此的简并版本和编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。
如本文所用的“细胞毒性T淋巴细胞”(CTL)指的是在其表面上表达CD8的T淋巴细胞(即CD8+T细胞)。在一些实施方案中，此类细胞优选抗原刺激过的“记忆”T细胞(TM细胞)。
如本文所用的“中心记忆”T细胞(或“TCM”)指的是在其表面上表达CD62L或CCR-7和CD45RO，不表达CD45RA或与初始细胞相比具有表达减少的CD45RA，抗原刺激过的CTL。在实施方案中，中心记忆细胞为CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO和CD95表达阳性的，并且与初始细胞相比具有表达减少的CD54RA。
如本文所用的“效应记忆”T细胞(或“TEM”)指的是其表面上不表达CD62L或与中心记忆细胞相比具有表达减少的CD62L，并且不表达CD45RA或与初始细胞相比具有表达减少的CD45RA，抗原刺激过的T细胞。在实施方案中，效应记忆细胞为与初始细胞或中心记忆细胞相比CD62L和CCR7表达阴性的，并且具有可变的CD28和CD45RA表达。
如本文所用的“初始”T细胞指的是表达CD62L和CD45RA，与中心或效应记忆细胞相比不表达CD45RO，未经过抗原刺激的T淋巴细胞。在一些实施方案中，通过初始T细胞的表型标记包括CD62L，CCR7，CD28，CD127，和CD45RA的表达表征初始CD8+T淋巴细胞
如本文所用的“效应”“TE”T细胞指的是不表达CD62L，CCR7，CD28或与中心记忆或初始T细胞相比CD62L，CCR7，CD28表达减少，粒酶B和穿孔素阳性的，抗原刺激过的细胞毒性T淋巴细胞。
描述混合物中细胞类型量的如本文所用的“富集的”或“耗竭的”指的是细胞混合物经历导致“富集的”类型数量增加和“耗竭的”细胞数量减少的过程或步骤。因此，取决于经历富集过程的初始群的来源，混合物或组合物可包含大约60，70，80，90，95，或99百分比或更多的(数量或计数)“富集的”细胞和大约40，30，20，10，5或1百分比或更少的(数量或计数)“耗竭的”细胞。
如本文所用的“表位”指的是被包括抗体，T细胞，和/或B细胞的免疫系统所识别的抗原或分子的一部分。表位通常具有至少7个氨基酸并且可以为线型的或构象的。
当用于描述本文所公开的各种多肽时，“分离的”意指从它的天然环境的组分鉴定和分离和/或回收的多肽或核酸。优选地，分离的多肽或核酸与在其天然相关的所有组分无关。它的天然环境的污染物为通常干扰多肽或核酸诊断或治疗用途的物质，可包括酶，激素，和其他蛋白质的或非蛋白质的溶质。
如本文所用的“细胞内信号转导结构域”指的是为淋巴细胞提供活化作用的分子(本文为嵌合受体分子)的一个或多个结构域的全部或一部分。此类分子的细胞内结构域通过与细胞介质相互作用来介导信号从而导致增殖，分化，活化和其他效应功能。在实施方案中，此类分子包括CD28，CD3，4-1BB及其组合的全部或一部分。
如本文所用的“配体”指的是与其他物质特异性结合从而形成复合体的物质。配体的实例包括抗原表位，与受体结合的分子，底物，抑制剂，激素，和活化剂。如本文所用的“配体结合结构域”指的是与配体结合的物质或物质的一部分。配体结合结构域的实例包括抗体的抗原结合部分，受体的细胞外结构域，和酶的活化部位。
如本文所用的“可操作地连接”指的是调控序列与异源性核酸序列之间功能连接从而导致异源性核酸序列表达。例如，当第一核酸序列被置于与第二核酸序列功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列为连续的，当需要加入两个蛋白编码区域时在相同的阅读框中。
关于本文所鉴定的嵌合受体多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为每一配体结合结构域，间隔子，跨膜结构域，和/或淋巴细胞活化结构域的候选序列中氨基酸残基与参照序列中氨基酸残基一致的百分比，比对两个序列和(如有必要)引入缺口后以实现最大的百分比序列同一性，并且不认为任何保守取代为序列同一性的一部分。出于确定百分比氨基酸序列同一性的目的可以以本领域中技术人员已知的各种方式实现比对，例如，使用公众可获得的计算机软件诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域中技术人员可以确定用于测量比对的适当的参数，包括需要在被比较的序列全长上实现最大比对的任何算法。例如，使用WU-BLAST-2计算机程序[Altschul等，酶学方法(Methods in Enzymology)，266:460-480(1996)]所产生的％氨基酸序列同一性值使用几种研究参数，其大多数设定为缺省值。未设定为缺省值的那些(即可调参数)根据下列值设定：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，字符阈值(T)＝11和得分矩阵＝BLOSUM62。通过(a)表2中所提供的参照嵌合受体序列的多肽氨基酸序列的每一个或所有与通过WU-BLAST-2所测定的感兴趣的比较氨基酸序列之间匹配一致的氨基酸残基数除以(b)感兴趣的多肽的氨基酸残基总数，测定A％氨基酸序列同一性值。
如本文所用的“嵌合受体变体多核苷酸”或“嵌合受体变体核酸序列”指的是以下所定义的具有与表1中所示的多核苷酸序列至少大约80％核酸序列同一性的编码多肽的核酸分子或其特别衍生的片段，诸如编码抗原结合结构域的多核苷酸，编码间隔子结构域的多核苷酸，编码跨膜结构域的多核苷酸和/或编码淋巴细胞刺激结构域的多核苷酸。通常，多核苷酸的嵌合受体变体或其片段具有与表中所示的核酸序列或其衍生的片段至少大约80％核酸序列同一性，更优选至少大约81％核酸序列同一性，更优选至少大约82％核酸序列同一性，更优选至少大约83％核酸序列同一性，更优选至少大约84％核酸序列同一性，更优选至少大约85％核酸序列同一性，更优选至少大约86％核酸序列同一性，更优选至少大约87％核酸序列同一性，更优选至少大约88％核酸序列同一性，更优选至少大约89％核酸序列同一性，更优选至少大约90％核酸序列同一性，更优选至少大约91％核酸序列同一性，更优选至少大约92％核酸序列同一性，更优选至少大约93％核酸序列同一性，更优选至少大约94％核酸序列同一性，更优选至少大约95％核酸序列同一性，更优选至少大约96％核酸序列同一性，更优选至少大约97％核酸序列同一性，更优选至少大约98％核酸序列同一性，和还更优选至少大约99％核酸序列同一性。变体不包括天然的核苷酸序列。就这一点而言，由于遗传密码的简并性，本领域中技术人员会立即认识到，大量具有与图1的核苷酸序列至少大约80％核酸序列同一性的嵌合受体变体多核苷酸将编码具有与表2的氨基酸序列一致的氨基酸序列的多肽。
“基本上纯化的”指的是基本上没有其他分子类型的分子或基本上没有其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指的是从正常与它的天然存在的状态有关的其他细胞类型分离的细胞。在某些情况下，基本上纯化的细胞群指的是同源的细胞群。
当关于肿瘤抗原或正常细胞上其他分子的存在使用时，“基本上未发现”指的是具有抗原或分子的正常细胞类型的百分比，和/或细胞上抗原的密度。在实施方案中，基本上未发现意指在小于50％正常细胞类型上发现抗原或分子和/或与肿瘤细胞或其他病态的细胞上发现的细胞或抗原量相比50％更小的密度。
如本文所用的“T细胞”或“T淋巴细胞”可来自于任何哺乳动物物种，优选灵长类物种，其包括猴子，狗，和人。在一些实施方案中，T细胞对于接受者来说为同种异体的(来自于相同的物种但是不同的供体)；在一些实施方案中，T细胞为自体的(供体和受体是相同的)；在一些实施方案中，T细胞为同系的(供体和受体是不同的，但是同卵双生)。
公开内容的模式
本公开内容提供了嵌合受体核酸，和包括此类核酸的载体和宿主细胞。嵌合受体核酸包含许多可以切除和用其他组分取代以便定制用于特异靶分子的嵌合受体的分子组分。本公开内容提供了模块组分的其中之一为间隔子组分。令人惊奇地发现假定没有信号转导能力的间隔子区域的长度影响经修饰以表达嵌合受体的T细胞的体内效力，并且需要针对个体的靶分子定制用于增强治疗活性。
在一方面，提供了方法和核酸构建体用于设计与参照嵌合受体相比，改进了肿瘤识别，增加了T细胞增殖和/或对配体响应的细胞因子产生的嵌合受体。在实施方案中，提供了核酸文库，其中每一核酸编码在序列和长度方面与其他不同的间隔子区域。然后每一核酸可以用于形成嵌合受体核酸构建体，可以在体内(动物模型中)和/或体外测试所述核酸构建体，从而使得可以选择提供改进了肿瘤识别，增加了T细胞增殖和/或对配体响应的细胞因子产生的间隔子。
在实施方案中，嵌合受体核酸包含编码配体结合结构域的多核苷酸，其中配体为肿瘤或病毒特异的抗原或分子，编码定制的多肽间隔子的多核苷酸，其中间隔子提供了增强的T细胞增殖；编码跨膜结构域的多核苷酸；和编码一个或多个细胞内信号转导结构域的多核苷酸。在实施方案中，如果靶分子的表位在靶细胞的近膜处就应用长的间隔子，如果靶分子的表位在靶细胞的远膜处就应用短的间隔子。
取决于肿瘤或病毒的类型，肿瘤上存在的靶抗原或分子，抗体对靶分子的亲和力，抗原结合结构域所需的柔性，和/或细胞内信号转导结构域，可以定制嵌合受体的设计。在实施方案中，在体外和体内模型中测试许多嵌合受体构建体从而确定用受体修饰的T细胞杀死免疫缺陷小鼠中肿瘤细胞的能力和过继转移后增殖和存留的能力。在实施方案中，选择在体外和/或引入体内72小时内提供了至少30％细胞增殖通过至少两代能力的嵌合受体。在实施方案中，不选择导致免疫缺陷小鼠体内72小时内大于50％细胞经历活化诱导的细胞死亡(AICD)或未能消除肿瘤细胞的嵌合受体。
取决于靶分子是否存在于个体的肿瘤细胞上，嵌合受体包括与该靶细胞分子特异性结合的配体结合结构域。在实施方案中，个体的肿瘤细胞表征为细胞表面肿瘤分子。基于靶分子在特别的个体肿瘤细胞的存在的确定来选择靶分子。在实施方案中，选择所发现的细胞表面分子在肿瘤细胞上占主导地位而在正常的组织上没有任何实质程度的发现的靶分子。在实施方案中，选择与靶细胞表面分子上的表位结合的抗体。在某些情况下，用表位与细胞膜的距离来表征表位。当通过结构分析预测或已知表位比通过结构分析或已知的居留在离靶细胞膜更远距离的另一表位居留在离靶细胞膜更近的距离时，表位表征为在近膜处。在实施方案中，通过结合测定比较构建的scFV所来自的抗体的亲和力，在T细胞表达的嵌合受体格式中检验不同亲和力的抗体，从而基于出众的靶细胞的细胞毒性，和/或T细胞细胞因子产生和增殖，来检测谁的亲和力赋予最佳的肿瘤识别。
另外，可改变嵌合受体的间隔子区域从而使T细胞对靶细胞上的配体识别优化。在实施方案中，当抗体与靶细胞上非常靠近膜处的表位结合时，选择比大约15个氨基酸长的间隔子。例如，在实施方案中，如果靶抗原上的表位或其部分在邻近跨膜结构域的细胞外结构域的线性序列的前100个氨基酸中，可选择长的间隔子区域。在实施方案中，当抗体与靶细胞上远离膜处的表位结合时，选择大约119个或15个或更少的氨基酸的间隔子。例如，在实施方案中，当发现表位或其部分在离末端的细胞外结构域的线性序列的150个氨基酸中时，可利用短的或中等的间隔子。在实施方案中，间隔子包含氨基酸序列X1PPX2P。
可应用各种主要的和共刺激的细胞内信号转导结构域的组合从而增强嵌合受体的体内效力。在实施方案中，可以在动物模型体内测试不同的嵌合受体构建体以确定其肿瘤杀伤效力。在实施方案中，共刺激的细胞内信号转导结构域选自CD28和其修饰版本，4-1BB和其修饰版本，及其组合。可合并其他共刺激结构域，诸如OX40。
CD8+中心记忆T细胞具有允许它们在给药后留存较长时期的内在编程，这使得它们成为优选的用于免疫治疗的CD8+T细胞亚型。在实施方案中，在CD4+CD19特异性嵌合受体修饰的T细胞存在和不存在的情况下，给予自纯化的CD8+T细胞种类制备的CD19特异性嵌合受体修饰的细胞毒性T细胞。在实施方案中，肿瘤特异的CD4+T细胞在体外和体内发挥抗肿瘤反应性并且为肿瘤特异的CD8+T细胞提供帮助。在具体的实施方案中，单独利用肿瘤特异的CD4+T细胞或选自初始的或中心记忆亚型的CD4+T细胞或与CD8+TCM组合利用。
核酸，载体和多肽
本公开内容提供了用于转化或转导淋巴细胞供过继免疫治疗使用的嵌合受体核酸。在实施方案中，核酸包含许多提供给核酸元件简单替换的模块化组分。虽然没有意图限制本公开内容的范围，据信在组分方面期望地定制针对每一肿瘤抗原的嵌合受体以便提供体内效力和在哺乳动物细胞中有效的表达。例如，在具体的实施方案中，为了实现包含与位于膜远端Ig/卷曲的结构域的ROR1表位结合的scFV的嵌合受体的效力，应用大约15个或更少的氨基酸的间隔子。在另一具体的实施方案中，为了实现包含与位于膜近端Kringle结构域的ROR1表位结合的scFV的嵌合受体的效力，应用比15个氨基酸长的间隔子。在其他实施方案中，为了实现包含与CD19结合的scFV的嵌合受体的效力，应用15个或更少的氨基酸的间隔子。
在实施方案中，分离的嵌合受体核酸包含编码配体结合结构域的多核苷酸，其中靶分子为肿瘤特异性抗原，编码多肽间隔子的多核苷酸，其中多肽间隔子为大约229个或更少的氨基酸；编码跨膜结构域的多核苷酸；和编码细胞内信号转导结构域的多核苷酸。在实施方案中，表达载体包含如本文所述的嵌合核酸。本文也包括嵌合受体核酸的所有或一部分所编码的多肽。
配体结合结构域
在实施方案中，嵌合受体核酸包含编码配体结合结构域的多核苷酸。在实施方案中，配体结合结构域与肿瘤或病毒特异性抗原特异性结合。在实施方案中，配体结合结构域为抗体或其片段。可以容易地确定编码抗体或抗体片段的核酸序列。在具体的实施方案中，多核苷酸编码与CD19特异性结合的单链Fv。在另一具体的实施方案中，多核苷酸编码与ROR1特异性结合的单链Fv。这些抗体的序列为已知的或可以由本领域中技术人员容易地确定。
肿瘤抗原为肿瘤细胞所产生的引起免疫应答的蛋白。本发明的配体结合结构的选择取决于待被治疗的癌症类型，可靶向肿瘤抗原或其他肿瘤细胞表面分子。某些生物标记或细胞表面标记的存在可表征来自于个体的肿瘤样品。例如，来自于个体的乳腺癌细胞对于Her2Neu，雌激素受体，和/或黄体酮受体中的每一个是阳性的或阴性的。选择在个体主体肿瘤细胞上发现的肿瘤抗原或细胞表面分子。肿瘤抗原和细胞表面分子为本领域中熟知的，并且包括，例如癌胚抗原(CEA)，前列腺特异性抗原，PSMA，Her2/neu，雌激素受体，黄体酮受体，酪氨酸蛋白激酶B2，CD19，CD20，CD22，CD23，CD123，CS-1，ROR1，间皮素，c-Met，GD-2，和MAGE A3TCR。在实施方案中，靶分子为在肿瘤细胞上发现的并且在正常组织上基本上未发现的，或其表达限制在非重要的正常组织的细胞表面分子。
其他靶分子包括但不限于来源于感染性病原体诸如HIV(人免疫缺陷病毒)，HBV(乙型肝炎病毒)，HPV(人乳头瘤病毒)和丙型肝炎病毒的抗原。
在一实施方案中，肿瘤上的靶分子包含一个或多个与恶性肿瘤相关的表位。恶性肿瘤表达许多可以用作T细胞受体或嵌合受体介导的识别的靶抗原的蛋白。其他靶分子属于细胞转化有关的分子组诸如致癌基因HER-2/Neu/ErbB2。在实施方案中，与相同的组织类型的对照细胞相比，肿瘤抗原在肿瘤细胞上选择性表达或过度表达。在其他实施方案中，肿瘤抗原为细胞表面多肽。
一旦鉴定了可被嵌合受体靶向的肿瘤细胞表面分子，就选择和表征靶分子的表位。在实施方案中，选择靠近肿瘤细胞膜的表位。在其他实施方案中，选择远离肿瘤细胞膜的表位。当通过结构分析预测或已知表位比通过结构分析或已知的居留在离靶细胞膜更远距离的另一表位居留在离靶细胞膜更近的距离时，表位表征为在靠近膜处。
使用获取单克隆抗体的方法，噬菌体展示的方法，产生人或人源化抗体的方法，或使用转基因动物或基因改造的植物产生人抗体的方法可以制备与肿瘤细胞表面分子特异性结合的抗体。部分地或完全地合成的抗体的噬菌体展示文库是可利用的并且可以用于筛选可以与靶分子结合的抗体或其片段。人抗体的噬菌体展示文库是可利用的。在实施方案中，抗体与肿瘤细胞表面分子特异性结合并且与非特异性组分，诸如牛血清白蛋白或其他无关的抗原不发生交叉反应。一旦鉴定了，就可以分离和/或确定编码抗体的氨基酸序列或多核苷酸序列。
抗体或抗原结合片段包括多克隆抗体，单克隆抗体，人抗体，人源化抗体，合成的抗体，嵌合抗体，双特异性抗体，微抗体，和线性抗体的所有或一部分。“抗体片段”包含完整的抗体的一部分，优选地完整抗体的抗原结合区或可变区并且可以容易地制备。抗体片段的实例包括Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和形成于抗体片段的多特异性抗体。
在实施方案中，可以分离和表征许多与特定肿瘤细胞表面分子结合的不同的抗体。在实施方案中，基于靶分子的表位特异性表征抗体。另外，在某些情况下，可以基于抗体对表位的亲和力来选择与相同表位结合的抗体。在实施方案中，抗体具有至少1mM，优选地<50nM的亲和力。在实施方案中，选择具有与其他抗体相比亲和力更高的抗体。例如，选择具有与相同的表位结合的参照抗体亲和力相比至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍亲和力的抗体。
在实施方案中，靶分子选自CD19，CD20，CD22，CD23，CD123，CS-1，ROR1，间皮素，Her2，c-Met，PSMA，GD-2，MAGE A3TCR及其组合。
在具体的实施方案中，靶抗原为CD19。许多对CD19特异性抗体为本领域中技术人员已知的并且可以用序列，表位结合，和亲和力容易地表征。在具体的实施方案中，嵌合受体构建体包括来自FMC63抗体的scFV序列。在其他实施方案中，scFV为包含可变的轻链的人或人源化ScFv，可变的轻链包含CDRL1序列RASQDISKYLN，CDRL2序列SRLHSGV，和CDRL3序列GNTLPYTFG。在其他实施方案中，scFV为包含可变的重链的人或人源化ScFv，可变的重链包含CDRH1序列DYGVS，CDRH2序列VIWGSETTYYNSALKS，和的CDRH3序列YAMDYWG。本公开内容也涵盖与FMC63的scFv的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性，并且具有至少相同的CD19亲和力的可变区。在实施方案中，嵌合受体具有119个或更少的氨基酸的，或12个或更少的氨基酸的短的或中等的间隔子。在具体的实施方案中，间隔子为12个或更少的氨基酸并且具有SEQ ID NO:4序列。
在实施方案中，抗体区域内发现的通过Kabat编号的CDR区域如下：对轻链而言；CDRL1在氨基酸24-34；CDRL2在氨基酸50-56；CDRL3在氨基酸89-97；对重链而言，CDRH1在氨基酸31-35；CDRH2在氨基酸50-65；并且CDRH3在氨基酸95-102。可以容易地检测抗体中CDR区域。
在具体的实施方案中，靶抗原为ROR1。许多对ROR1特异性抗体为本领域中技术人员已知的并且可以用序列，表位结合，和亲和力容易地表征。在具体的实施方案中，嵌合受体构建体包括来自R12抗体的scFV序列。在其他实施方案中，scFV为包含可变的轻链的人或人源化ScFv，可变的轻链包含CDRL1序列ASGFDFSAYYM，CDRL2序列TIYPSSG，CDRL3序列ADRATYFCA。在其他实施方案中，scFV为包含可变的重链的人或人源化ScFv，可变的重链包含CDRH1序列DTIDWY，CDRH2序列VQSDGSYTKRPGVPDR，和CDRH3序列YIGGYVFG。本公开内容也涵盖与R12的scFv的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性，并且具有至少相同的ROR1亲和力的可变区。在实施方案中，嵌合受体具有119个或更少的氨基酸的，或12个或更少的氨基酸的短的或中等的间隔子。在具体的实施方案中，间隔子为12个或更少的氨基酸并且具有SEQ ID NO:4序列。
在具体的实施方案中，靶抗原为ROR1。许多对ROR1特异性抗体为本领域中技术人员已知的并且可以用序列，表位结合，和亲和力容易地表征。在具体的实施方案中，嵌合受体构建体包括来自R11抗体的scFV序列。在其他实施方案中，scFV为包含的人或人源化ScFv，可变的轻链包含CDRL1序列SGSDINDYPIS，CDRL2序列INSGGST，和CDRL3序列YFCARGYS。在其他实施方案中，scFV为包含可变的重链的人或人源化ScFv，可变的重链包含CDRH1序列SNLAW，CDRH2序列RASNLASGVPSRFSGS，和CDRH3序列NVSYRTSF。本公开内容也涵盖与R11的scFv的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性，并且具有至少相同的ROR1亲和力的可变区。在实施方案中，嵌合受体具有229个或更少的氨基酸的长的间隔子。在具体的实施方案中，间隔子为229个氨基酸并且具有SEQ IDNO:50序列。
在具体的实施方案中，靶抗原为Her2。许多对Her2特异性抗体为本领域中技术人员已知的并且可以用序列，表位结合，和亲和力容易地表征。在具体的实施方案中，嵌合受体构建体包括来自赫赛汀抗体的scFV序列。在其他实施方案中，scFV为包含可变的轻链的人或人源化ScFv，可变的轻链包含赫赛汀抗体的CDRL1序列，CDRL2序列，和CDRL3序列。在其他实施方案中，scFV为包含可变的重链的人或人源化ScFv，可变的重链包含赫赛汀的CDRH1序列，CDRH2序列，和CDRH3序列。可以从赫赛汀的氨基酸序列容易地确定CDR序列。本公开内容也涵盖与赫赛汀的scFv的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性，并且具有至少相同的Her2亲和力的可变区。在实施方案中，嵌合受体具有229个或更少的氨基酸的长的间隔子。在具体的实施方案中，间隔子为229个氨基酸并且具有SEQ ID NO:50序列。
在实施方案中，编码配体结合结构域的多核苷酸与编码间隔子区域的多核苷酸可操作地连接。在实施方案中，编码配体结合结构域的多核苷酸也可在编码序列的5’和/或3’末端具有一个或多个限制性内切酶位点以便提供简单的切除和用其他编码不同抗原的配体结合结构域的多核苷酸或具有不同的结合特征的多核苷酸取代多核苷酸。例如，在前导序列的上游编码限制位点NheI；和位于铰链区内的3’RsrII允许任何期望的scFv亚克隆到嵌合受体载体。在实施方案中，多核苷酸经密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达。
在实施方案中，编码配体结合结构域的多核苷酸与信号肽可操作地连接。在实施方案中，信号肽为粒细胞集落刺激因子的信号肽。可以利用编码诸如CD8α的其他信号肽的多核苷酸。
在实施方案中，编码配体结合结构域的多核苷酸与启动子可操作地连接。选择提供嵌合抗原受体在哺乳动物细胞中的表达的启动子。在具体的实施方案中，启动子为伸长生长因子启动子(EF-1)。其他合适的启动子的实例为即早巨细胞病毒(CMV)启动子序列。然而，也可使用其他组成型启动子序列，其包括但不限于猿猴病毒40(SV 40)早期启动子，小鼠乳头瘤病毒(MMTV)，人免疫缺陷病毒(HlV)长末端重复(LTR)启动子，MuMoLV启动子，禽白血病病毒启动子，艾巴氏(Epstein-Barr)病毒即早启动子，劳斯氏肉瘤病毒启动子，及人基因启动子诸如但不限于肌动蛋白启动子，肌球蛋白启动子，血红蛋白启动子，和肌酸激酶启动子。也涵盖诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫因启动子，糖皮质激素启动子，黄体酮启动子，和四环素启动子。
编码配体结合结构域的多核苷酸的具体实施方案显示于表1中，作为来自于诸如FMC63的与CD19特异性结合的抗体的scFv。编码包括氨基酸GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:36)的柔性连接体的多核苷酸将scFV中的VH和VL链分离。包括连接体的scFv的氨基酸序列显示于表2中(SEQ ID NO:11)。其他CD19-靶向抗体诸如SJ25C1和HD37为已知的。(SJ25C1:Bejcek等Cancer Res 2005，PMID 7538901；HD37:Pezutto等JI 1987，PMID 2437199)。
间隔子
在实施方案中，嵌合受体核酸包含编码间隔子区域的多核苷酸。令人惊奇地发现假定没有信号转导能力的间隔子区域的长度影响经修饰以表达嵌合受体的T细胞的体内效力并且需要针对个体的靶分子定制用于最佳的肿瘤或靶细胞识别。在实施方案中，嵌合受体核酸包含编码可定制的间隔子区域的多核苷酸，其选自编码间隔子区域多核苷酸文库。在实施方案中，基于表位位置，抗体对表位的亲和力，和/或表达嵌合受体的T细胞对抗原识别响应而体外和/或体内增殖的能力，选择间隔子长度。
通常在嵌合受体的配体结合结构域和跨膜结构域之间发现间隔子区域。在实施方案中，间隔子区域提供了配体结合结构域的柔性，允许在淋巴细胞中高表达。具有大约229个氨基酸的间隔子结构域的CD19特异性嵌合受体具有的抗肿瘤活性比具有由只含有修饰的IgG4铰链的短间隔子区域的CD19特异性嵌合受体的抗肿瘤活性小。其他嵌合受体，诸如从R12或2A2scFv构建的那些嵌合受体也需要短的间隔子用于最佳地触发T细胞的效应功能，但是用R11ROR1scFv构建的嵌合受体需要大约229个氨基酸的长的间隔子结构域用于肿瘤识别。
在实施方案中，间隔子区域具有大约10-229个氨基酸，大约10-200个氨基酸，大约10-175个氨基酸，大约10-150个氨基酸，大约10-125个氨基酸，大约10-100个氨基酸，大约10-75个氨基酸，大约10-50个氨基酸，大约10-40个氨基酸，大约10-30个氨基酸，大约10-20个氨基酸，或大约10-15个氨基酸，并且包括任何所列的范围的端点之间的任何整数。在实施方案中，间隔子区域具有大约12个或更少的氨基酸，大约119个或更少的氨基酸，或大约229个或更少的氨基酸。
在一些实施方案中，间隔子区域衍生自免疫球蛋白样分子的铰链区。在实施方案中，间隔子区域包含来自于人IgG1，人IgG2，人IgG3，或人IgG4的铰链区的所有或一部分，并且可包含一个或多个氨基酸取代。表8中提供了铰链区的示例性序列。在实施方案中，铰链区的一部分包括在可变的重链与核心之间发现的上部铰链氨基酸，和包括聚脯氨酸区的核心铰链氨基酸。通常，上部铰链区具有大约3-10个氨基酸。在某些情况下，间隔子区域包含氨基酸序列X1PPX2P(SEQ IDNO:1)。在实施方案中，X1为半胱氨酸，甘氨酸，或精氨酸并且X2为半胱氨酸或苏氨酸。
在实施方案中，可以在一个或多个氨基酸中修饰铰链区序列以避免不期望的结构相互作用诸如二聚化。在具体的实施方案中，间隔子区域包含来自于IgG4的修饰的人铰链区的一部分，例如，如表2或表8中所示(SEQ ID NO:21)。表1中提供了编码修饰的IgG4铰链区的一部分的多核苷酸的代表(SEQ ID NO:4)。在实施方案中，铰链区可以与表2或表8中所鉴定的铰链区氨基酸序列具有至少大约90％，92％，95％或100％序列同一性。在具体的实施方案中，来自于IgG4的人铰链区的一部分在核心氨基酸中具有氨基酸取代，从CPSP到CPPC。
在一些实施方案中，铰链区的所有或一部分与免疫球蛋白恒定区的一个或多个结构域组合。例如，铰链区的一部分可以与CH2或CH3结构域或其变体的所有或一部分组合。在实施方案中，间隔子区域不包括来自CD8α的47-48氨基酸铰链区序列或由CD28分子的细胞外部分组成的间隔子区域。
在实施方案中，短的间隔子区域具有大约12个或更少的氨基酸并且包含IgG4铰链区序列或其变体的所有或一部分，中等的间隔子区域具有大约119个或更少的氨基酸并且包含IgG4铰链区序列和CH3区域或其变体的所有或一部分，并且长的间隔子具有大约229个或更少的氨基酸并且包含IgG4铰链区序列，CH2区域，CH3区域或其变体的所有或一部分。
通过合成的或重组的方法可以容易地从氨基酸序列制备编码间隔子区域的多核苷酸。在实施方案中，编码间隔子区域的多核苷酸与编码跨膜区域的多核苷酸可操作地连接。在实施方案中，编码间隔子区域的多核苷酸也可在编码序列的5’和/或3’末端具有一个或多个限制性内切酶位点以便提供简单的切除和用其他编码不同抗原的配体结合结构域的多核苷酸或用编码不同的间隔子区域的其他多核苷酸取代多核苷酸。在实施方案中，编码间隔子区域的多核苷酸经密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达。
在实施方案中，提供了多核苷酸的文库，每一个编码不同的间隔子区域。在一实施方案中，间隔子区域选自：来自IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4或其一部分的铰链区序列，来自IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4与CH2区域或其变体的所有或一部分组合的铰链区序列，来自IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4与CH3区域或其变体的所有或一部分组合的铰链区序列，来自IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4与CH2区域或其变体和CH3区域或其变体的所有或一部分组合的铰链区序列。在实施方案中，短的间隔子区域为具有12个或更少的氨基酸(SEQ ID NO:4)的修饰的IgG4铰链序列，中等的序列为具有119个或更少的氨基酸(SEQ IDNO:49)的具有CH3序列的IgG4铰链序列；或具有229个或更少的氨基酸(SEQ ID NO:50)的具有CH2区和CH3区的IgG4铰链序列。
在实施方案中，本文提供了选择用于嵌合受体的间隔子区域的方法。令人惊奇地，尽管一些嵌合受体构建体在体外可有效地活化T细胞并且引导它们杀死肿瘤细胞，它们在体内是无效的。另外，嵌合受体修饰的T细胞的副作用类可以为诸如导致更多细胞经历活化诱导的细胞死亡或引起体内细胞因子的增加。在实施方案中，方法包括提供许多嵌合受体核酸，其中嵌合受体核酸只在间隔子区域不同；将每一嵌合受体核酸引入单独的T淋巴细胞群；体外扩增每一单独的淋巴细胞群，并且将每一淋巴细胞群引入荷瘤动物以便检测当在T细胞中表达时每一嵌合受体的抗肿瘤效力，和选择与每一其他嵌合受体修饰的每一其他单独的淋巴细胞群相比，提供了抗肿瘤效力的嵌合受体。
不同肿瘤的动物模型为已知的。可以通过鉴定肿瘤体积的减小，通过确定动物死亡，遗传修饰的T细胞的体内存留，遗传修饰的T细胞的活化(例如，通过检测CD25和/或CD69表达的增加)，和/或遗传修饰的T细胞的体内增殖来测定抗肿瘤的效力。在一实施方案中，选择提供了如通过一个或多个这些参数所检测的最好的体内抗肿瘤效力的嵌合受体。通过遗传修饰的淋巴细胞体内存留的缺乏，动物死亡，通过半胱天冬酶-3诱导增加所测的凋亡增加，和/或遗传修饰的淋巴细胞增殖减少，可以检测抗肿瘤效力的缺乏。
在其他实施方案中，选择间隔子的方法包括选择靶分子的表位并且表征表位相对于细胞膜的位置，取决于表位相对于细胞膜的位置选择长的或短的间隔子区域，选择与参照抗体相比具有较高或较低对表位亲和力的抗体或其片段，并且检测嵌合受体构建体是否在体外和/或体内提供了增强的T细胞增殖或细胞因子产生。
在一些实施方案中，如果靶表位或其部分位于靠近膜处，它就位于邻近跨膜结构域的细胞外结构域的线性序列的前100个氨基酸中。如果表位位于靠近膜处，选择长的间隔子(例如229个或更少的氨基酸和大于119个氨基酸)。在一些实施方案中，如果靶表位位于远离膜处，它就位于细胞外结构域末端的线性序列的前150个氨基酸中。如果表位位于远离膜处，选择中等的或短的间隔子(例如119个或更少的氨基酸或12-15个或更少的氨基酸)。可选地，通过建造三维结构模型或基于晶体结构的分析，可以确定表位与细胞膜是靠近还是远离。
在一些实施方案中，选择提供了至少30％细胞体外和/或体内增殖通过两代的嵌合受体。在其他实施方案中，不选择72小时内导致至少50％细胞经历活化诱导的细胞死亡的嵌合受体。在实施方案中，如果表位在远离膜处，就选择短的间隔子(例如15个或更少的氨基酸)。在实施方案中，如果表位在靠近膜处，就选择长的间隔子(例如229个或更少的氨基酸和大于119个氨基酸)。
在实施方案中，提供了许多嵌合受体核酸，其中嵌合受体核酸只在间隔子区域不同，包括提供嵌合受体构建体，其包含编码配体结合结构域的多核苷酸，其中配体为肿瘤特异性抗原，病毒抗原，或任何表达在靶细胞群上适于介导通过淋巴细胞识别和清除的其他分子；编码第一多肽间隔子的多核苷酸，其在第一多肽间隔子的编码序列的5’和3’末端具有确定的限制性位点；编码跨膜结构域的多核苷酸；和编码一个或多个细胞内信号转导结构域的多核苷酸。
在实施方案中，方法还包括提供一个或多个多核苷酸，每一个编码不同的间隔子区域。在实施方案中，不同的间隔子区域选自来自IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4或其一部分的铰链区序列，来自IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4与CH2区域或其变体的所有或一部分组合的铰链区序列，来自IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4与CH3区域或其变体的所有或一部分组合的铰链区序列，来自IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4与CH2区域或其变体和CH3区域或其变体的所有或一部分组合的铰链区序列。在实施方案中，可通过一个或多个缺失修饰CH2或CH3区以便提供淋巴细胞中的表达和/或以便使与其他分子相互作用最小化。在实施方案中，铰链区的一部分包含至少上部氨基酸和核心序列。在实施方案中，铰链区包含X1PPX2P序列。
在实施方案中，方法还包括用编码不同间隔子区域的多核苷酸取代编码间隔子区域的多核苷酸从而形成具有不同间隔子区域的嵌合受体核酸。可以重复方法从而形成任何数量的嵌合受体核酸，每一个在间隔子区域不同。在实施方案中，嵌合受体核酸彼此只在间隔子区域方面不同。
跨膜结构域
在实施方案中，嵌合受体核酸包含编码跨膜结构域的多核苷酸。跨膜结构域提供嵌合受体在膜上的锚定。
在实施方案中，使用与嵌合受体的结构域其中之一天然相关的跨膜结构域。在某些情况下，可以选择或通过氨基酸取代修饰跨膜结构域以避免此类结构域与相同的或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合体的其他成员相互作用最小化。
跨膜结构域可衍生自天然的或合成的来源。当来源为天然的时，结构域可衍生自任何膜结合的或跨膜蛋白。跨膜区包括至少T细胞受体CD28，CD3，CD45，CD4，CD8，CD9，CD16，CD22；CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154的α，β或ζ链的跨膜区。在具体的实施方案中，跨膜结构域包括如表2中所示的CD28跨膜结构域的氨基酸序列。表1中显示了编码CD28跨膜结构域的代表的多核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。
跨膜结构域可为合成的或天然存在的跨膜结构域的变体。在实施方案中，合成的或变体跨膜结构域包含占主导地位的疏水残基诸如亮氨酸和缬氨酸。在实施方案中，跨膜结构域可以与表2或表6中所示的跨膜结构域具有至少大约80％，85％，90％，95％，或100％氨基酸序列同一性。变体跨膜结构域优选地具有如通过Kyte Doolittle所计算的至少50的疏水得分。
通过合成的或重组的方法可以容易地制备编码跨膜结构域的多核苷酸。在实施方案中，编码跨膜结构域的多核苷酸与编码细胞内信号转导区域的多核苷酸可操作地连接。在实施方案中，编码跨膜结构域的多核苷酸也可在编码序列的5’和/或3’末端具有一个或多个限制性内切酶位点以便提供简单的切除和用编码不同的跨膜结构域的其他多核苷酸取代编码跨膜结构域的多核苷酸。在实施方案中，编码跨膜结构域的多核苷酸经密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达。
细胞内信号转导结构域
在实施方案中，嵌合受体核酸包含编码细胞内信号转导结构域的多核苷酸。细胞内信号转导结构域通过与肿瘤细胞上表达的配体结合从而提供表达嵌合受体的转导细胞的一种功能的活化。在实施方案中，细胞内信号转导结构域包含一个或多个细胞内信号转导结构域。在实施方案中，细胞内信号转导结构域为提供了转导细胞至少一种功能的活化的细胞内信号转导结构域的一部分和/或变体。
用于本公开内容的嵌合受体的细胞内信号转导结构域的实例包括CD3ζ链的胞质序列，和/或在嵌合受体结合后共同作用启动信号转导的共受体，及任何这些序列的衍生或变体和任何具有相同的功能能力的合成序列。可以说通过两类胞质信号转导序列介导T细胞活化：启动抗原依赖性初级活化和提供T细胞受体样信号的那些序列(初级胞质信号转导序列)和以抗原依赖的方式发挥作用从而提供次级或共刺激信号的那些序列(次级胞质信号转导序列)。以刺激方式发挥作用的初级胞质信号转导序列可包含被称为基于受体酪氨酸活化基序或ITAM的信号转导基序。含有ITAM的初级胞质信号转导序列的实例包括衍生自CD3ζ，FcRγ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b和CD66d的那些。在实施方案中，初级信号转导细胞内结构域可以与具有表2中所提供的序列的CD3ζ具有至少大约80％，85％，90％，或95％序列同一性。在实施方案中，CD3ζ的变体保留了至少一个，两个，三个或所有表7中所示的ITAM区域。
在优选的实施方案中，嵌合受体的细胞内信号转导结构域可以设计为包含CD3ζ信号转导结构域自身或CD3ζ信号转导结构域与任何其他期望的胞质结构域组合。例如，嵌合受体的细胞内信号转导结构域可以包含CD3ζ链和共刺激信号转导区域。
共刺激信号转导区域指的是包含共刺激分子的细胞内结构域的嵌合受体的一部分。共刺激分子为除了抗原受体或它们的配体之外淋巴细胞对抗原应答所必需的细胞表面分子。此类分子的实例包括CD27，CD28，4-1BB(CD 137)，OX40，CD30，CD40，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-l)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，和与CD83特异性结合的配体。在实施方案中，共刺激信号转导结构域可以与表5中所示的CD28的细胞内结构域或与表2中所提供的序列的4-1BB具有至少大约80％，85％，90％，或95％氨基酸序列同一性。在一实施方案中，CD28细胞内结构域的变体包含位置186-187处氨基酸取代，其中LL被GG取代。
嵌合受体的细胞内信号转导序列可以随机的或特定的顺序彼此连接。任选地，短的低聚肽或多肽连接体，优选2-10个氨基酸长度，可形成键。在一实施方案中，细胞内信号转导结构域包含CD3ζ的信号转导结构域的所有或一部分或其变体和CD28的信号转导结构域的所有或一部分或其变体。在其他实施方案中，细胞内信号转导结构域包含CD3ζ的信号转导结构域的所有或一部分或其变体和4-lBB的信号转导结构域的所有或一部分或其变体。还在另一实施方案中，细胞内信号转导结构域包含CD3ζ的信号转导结构域的所有或一部分或其变体，CD28的信号转导结构域的所有或一部分或其变体，和4-lBB的信号转导结构域的所有或一部分或其变体。在具体的实施方案中，表2中提供了包含CD3ζ变体和4-lBB细胞内信号转导结构域的一部分的细胞内信号转导结构域的氨基酸序列。表1中提供了代表的核酸序列(SEQ IDNO:6；SEQ ID NO:7)。
在一实施方案中，编码细胞内信号转导结构域的多核苷酸包含与CD3ζ结构域的一部分连接的4-1BB细胞内结构域。在其他实施方案中，4-1BB细胞内结构域和CD28细胞内结构域与CD3ζ结构域的一部分连接。
通过合成的或重组的方法可以容易地从氨基酸序列制备编码细胞内信号转导结构域的多核苷酸。在实施方案中，编码细胞内信号转导结构域的多核苷酸也可在编码序列的5’和/或3’末端具有一个或多个限制性内切酶位点以便提供简单的切除和用编码不同的细胞内信号转导结构域的其他多核苷酸取代编码细胞内信号转导结构域的多核苷酸。在实施方案中，编码细胞内信号转导结构域的多核苷酸经密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达。
标记序列
在实施方案中，嵌合受体核酸还任选地包含编码标记序列的多核苷酸。标记序列可以提供转导细胞的选择，和转导细胞的鉴定。在实施方案中，标记序列任选地与编码连接体序列的多核苷酸序列可操作地连接。在实施方案中，连接体序列为可裂解的连接体序列。
可以应用许多不同的标记序列。通常标记序列具有允许转导细胞的选择和/或转导细胞的检测的功能特征。在实施方案中，标记序列可与人淋巴细胞的转导相容。
阳性选择标记可为基因，其一旦被引入到宿主细胞，就表达显性的表型，允许携带该基因的细胞的阳性选择。这种类型的基因为本领域中已知的，并且尤其包括赋予潮霉素B抗性的潮霉素-B磷酸转移酶基因(hph)，编码抗生素G418抗性的来自于Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶(neo或aph)，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，腺苷脱氨酶基因(ADA)和多药物抗性(MDR)基因。
在一实施方案中，嵌合受体核酸还包含编码标记序列的多核苷酸。在一实施方案中，标记序列为表2中所示的截短的表皮生长因子受体。截短的表皮生长因子受体的示例性多核苷酸显示于表1中(SEQ IDNO:9)。在实施方案中，编码标记序列的多核苷酸与编码连接体序列的多核苷酸可操作地连接。在一具体的实施方案中，连接体序列为表2中所示的可裂解的连接体序列T2A。表1中提供了编码T2A连接体的示例性多核苷酸序列。(SEQ ID NO:8)
可以通过合成的或重组的方法从氨基酸序列容易地制备编码标记序列的多核苷酸。在实施方案中，编码标记序列的多核苷酸与编码细胞内信号转导结构域的多核苷酸可操作地连接。在实施方案中，编码标记序列的多核苷酸也可在编码序列的5’和/或3’末端具有一个或多个限制性内切酶位点以便提供简单的切除和用编码不同的标记序列的其他多核苷酸取代编码标记序列的多核苷酸。在实施方案中，编码标记序列的多核苷酸经密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达。
载体，细胞和转导细胞的方法
T淋巴细胞群的选择和分选
本文所述的组合物提供了CD4+和/或CD8+T淋巴细胞。根据已知的技术可以收集T淋巴细胞并且通过已知的技术诸如与抗体结合的亲和力，诸如流式细胞术和/或免疫磁珠选择富集或耗竭。富集和/或耗竭后，根据已知的技术(包括但不限于美国专利6,040,177号，Riddell等)或对本领域技术人员明显的其变体，可以进行所需T淋巴细胞的体外扩增。在实施方案中，T细胞为从患者获得的自体T细胞。
例如，通过以下扩增所需T细胞群或亚群：将初始的T淋巴细胞群添加到体外培养基，然后添加饲养细胞至培养基，诸如不分裂的外周血单核细胞(PBMC)(例如，从而使得对待被扩增的初始群中每一T淋巴细胞而言，由此得到的细胞群包含至少大约5，10，20，或40个或多个PBMC饲养细胞)；并且孵育培养基(例如培养足以扩增T细胞数量的时间)。不分裂的饲养细胞可包含γ-辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用大约3000-3600拉德范围的γ射线辐照PBMC。如需要可以逆转T细胞和饲养细胞添加到培养基的顺序。通常在适于T淋巴细胞生长的温度等条件下孵育培养基。为了T淋巴细胞的生长，例如，温度通常为至少大约25摄氏度，优选至少大约30摄氏度，更优选大约37摄氏度。
扩增的T淋巴细胞包括对人肿瘤或病原体上存在的抗原特异性的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4+辅助T淋巴细胞。
任选地，扩增方法还包括添加非分裂的EBV-转化的淋巴样干细胞(LCL)作为饲养细胞的步骤。可以用大约6000-10,000拉德范围的γ射线辐照LCL。可以任何合适的量提供LCL饲养细胞，诸如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比例至少大约10:1。
任选地，扩增方法还包括添加抗CD3和/或抗CD28抗体到培养基(例如，以至少大约0.5ng/ml的浓度)的步骤。任选地，扩增方法还包括添加IL-2和/或IL-15到培养基的步骤(例如，其中IL-2的浓度为至少大约10单位/ml)。
T淋巴细胞分离后，在扩增前或扩增后可以将细胞毒性和辅助T淋巴细胞分选为初始，记忆和效应T细胞亚群。
通过使用标准的方法可以获得CD8+细胞。在一些实施方案中，通过鉴定与那些CD8+细胞类型每一个有关的细胞表面抗原，还可将CD8+细胞分选为初始，中心记忆和效应记忆细胞。在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚型。用抗CD8和抗CD62L抗体染色后，将PBMC分选为CD62L-CD8+和CD62L+CD8+部分。在一些实施方案中，中心记忆TCM的表型标记的表达包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和CD127，并且粒酶B是阴性的或低的。在一些实施方案中，中心记忆T细胞为CD45RO+、CD62L+、CD8+T细胞。在一些实施方案中，效应TE对CD62L、CCR7、CD28和CD127是阴性的，并且对粒酶B和穿孔素是阳性的。在一些实施方案中，通过初始T细胞的表型标记包括CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和CD45RA的表达表征初始CD8+T淋巴细胞。
可以使用表面标记特异性抗体和同型匹配的对照抗体的染色通过流式细胞术，检测细胞或细胞群对特定的细胞表面标记是否是阳性的。对标记阴性的细胞群指的是缺乏特异性抗体超过同型对照的对细胞群的显著染色，阳性指的是细胞群超过同型对照的均匀染色。在一些实施方案中，一个或多个标记表达的减少指的是平均荧光强度的1个log10的损失和/或展示标记的细胞与参照细胞群相比至少大约20％的细胞、25％o的细胞、30％的细胞、35％的细胞、40％的细胞、45％的细胞、50％的细胞、55％的细胞、60％的细胞、65％的细胞、70％的细胞、75％的细胞、80％的细胞、85％的细胞、90％的细胞、95％的细胞、和100％的细胞和在20-100％之间任何％的细胞百分比减少。在一些实施方案中，对一个或多个标记阳性的细胞群指的是展示标记的细胞当与参照细胞群相比时为至少大约50％的细胞、55％的细胞、60％的细胞、65％的细胞、70％的细胞、75％的细胞、80％的细胞、85％的细胞、90％的细胞、95％的细胞、和100％的细胞和在50-100％之间任何％的细胞。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分选为初始，中心记忆，和效应细胞。可以通过标准的方法获得CD4+淋巴细胞。在一些实施方案中，初始CD4+T淋巴细胞为CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中心记忆CD4+细胞为CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+细胞为CD62L-和CD45RO-。
在实施方案中，通过用抗原刺激初始的或抗原特异性T淋巴细胞可以获得抗原特异性CD4+群和CD8+群。例如，通过从感染的个体分离T细胞并且用相同的抗原体外刺激细胞，可以产生巨细胞病毒抗原抗原特异性T细胞系或克隆。也可使用初始T细胞。许多来自于肿瘤细胞的抗原可以用作靶标从而引起T细胞应答。在一些实施方案中，过继细胞免疫治疗组合物可用于包括实体瘤，血液系统恶性肿瘤，乳腺癌或黑色素瘤的疾病或病症的治疗。
T淋巴细胞群的修饰
在一些实施方案中，根据本发明，需要将功能基因引入到用于免疫治疗的T细胞中。例如，引入的一种或多种基因可通过促进转移的T细胞的存活力和/或功能来改善治疗功效；或他们可以提供允许体内存活或迁移的选择和/或评估的基因标记；或它们可以引入改善免疫治疗安全性的功能，例如通过使细胞对体内阴性选择易感，如Lupton S.D等.，Mol.and Cell Biol.，11:6(1991)；和Riddell等，Human GeneTherapy 3:319-338(1992)所述的；也可见Lupton等PCT/US91/08442和PCT/US94/05601公开内容，其描述了衍生自主要阳性的选择标记与阴性选择标记融合的双功能的选择融合基因。根据已知的技术或基于本发明内容进行对本领域中技术人员明显的其变化可以进行这些(例如见Riddell等美国专利6,040,177号，14-17栏)。
在实施方案中，用本文所述的嵌合受体修饰T细胞。在一些实施方案中，T细胞获取自待被治疗的个体，在另一实施方案中，淋巴细胞获取自同种异体的人供体，优选健康人供体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含本文所述的与肿瘤细胞表面分子特异性结合的配体结合结构域，多肽间隔子区域，跨膜结构域和细胞内信号转导结构域。在一些实施方案中，配体结合结构域为衍生自单克隆抗体(mAb)的可变的重链(VH)和可变的轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。通过融合CD28和/或4-1BB的共刺激结构域到CD3ζ链，也可以通过嵌合受体提供共刺激信号。独立于HLA，嵌合受体对细胞表面分子是特异的，因此克服了TCR-识别的限制包括HLA-限制和肿瘤细胞上HLA-表达的低水平。
通过利用抗原结合片段或例如抗体分子的抗体可变结构域，可以构建对任何细胞表面标记具有特异性的嵌合受体。抗原结合分子可以与一个或多个细胞信号转导模块连接。在实施方案中，细胞信号转导模块包括CD3跨膜结构域，CD3细胞内信号转导结构域，和CD28跨膜结构域。在实施方案中，细胞内信号转导结构域包含与CD3ζ细胞内结构域连接的CD28跨膜和信号转导结构域。在一些实施方案中，嵌合受体也可以包括转导标记诸如tEGFR。
在实施方案中，可以将相同的或不同的嵌合受体引入到每一CD4+和CD8+T淋巴细胞群。在实施方案中，这些群的每一个中的嵌合受体具有与肿瘤或感染细胞上相同的配体特异性结合的配体结合结构域。细胞信号转导模块可以不同。在实施方案中，CD8+细胞毒性T细胞的细胞内信号转导结构域与CD4+辅助T细胞的细胞内信号转导结构域相同。在其他实施方案中，CD8+细胞毒性T细胞的细胞内信号转导结构域与CD4+辅助T细胞的细胞内信号转导结构域不同。
在实施方案中，在本文所述的转导之前可以将CD4或CD8T淋巴细胞的每一个分选为初始，中心记忆，效应记忆或效应细胞。在可选的实施方案中，在转导之后可以将CD4或CD8T淋巴细胞的每一个分选为初始，中心记忆，效应记忆或效应细胞。
已研发了各种利用重组的感染病毒颗粒用于基因递送的转导技术。这代表了目前优选的转导本发明的T淋巴细胞的方法。以这种方式使用的病毒载体包括衍生自病毒40，腺病毒，腺相关病毒(AAV)，慢病毒，和逆转录病毒的病毒载体。因此，基因转移和表达方法是许多的但基本上功能为在哺乳动物细胞中引入和表达基因物质。以上技术的几种已用于转导造血细胞或淋巴样细胞，包括磷酸钙转染，原生质体融合，电穿孔和重组腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒载体感染。通过电穿孔和通过逆转录病毒或慢病毒感染已成功地转导主要的T淋巴细胞。
逆转录病毒和慢病毒载体提供了高效率的转移基因到真核细胞的方法。而且，以受制的方式发生逆转录病毒和慢病毒整合并且导致每个细胞的新基因信息的一个或少数拷贝的稳定整合。
值得注意的是刺激因子(例如淋巴因子或细胞因子)的过度表达对治疗的个体是有毒的。因此，包括引起本发明的T细胞对体内阴性选择易感的基因节段在本发明的范围内。所谓“阴性选择”意指细胞可以作为个体体内状况改变的结果被清除。阴性选择表型可起因于赋予例如化合物的给药剂敏感性的基因插入。阴性选择基因为本领域中已知的，并且尤其包括下列：单纯性疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因，其赋予了更昔洛韦敏感性；细胞次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因，细胞腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)基因，和细菌胸嘧啶脱氨酶。
在一些实施方案中，在T细胞中包括使阴性选择表型能够体外选择细胞的阳性标记是有用的。阳性选择标记可为基因，其一旦被引入到宿主细胞，就表达允许携带该基因的细胞的阳性选择的显性表型。这种类型的基因为本领域中已知的，并且尤其包括赋予潮霉素B抗性的潮霉素-B磷酸转移酶基因(hph)，编码抗生素G418抗性的来自于Tn5氨基糖苷磷酸转移酶(neo或aph)，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，腺苷脱氨酶基因(ADA)和多药物抗性(MDR)基因。
可以应用如本领域中熟知的各种转导T淋巴细胞的方法。在实施方案中，使用慢病毒载体进行转导。
在实施方案中，用编码嵌合受体的表达载体可以单独地修饰每一个CD4+和CD8+细胞以形成限定的群。在实施方案中，然后通过分选每一那些细胞群唯一的细胞表面抗原，还可以将这些细胞分选为如以上所述的初始，中心记忆和效应细胞的亚群。另外，可以通过CD4+或CD8+细胞群的细胞因子谱或增殖活性来选择它们。例如，可以选择具有与假转导的细胞或当用抗原刺激时转导的CD8+细胞相比增强的诸如IL-2，IL-4，IL-10，TNFα和IFNγ的细胞因子的产生的CD4+T淋巴细胞。在其他实施方案中，选择具有增强的IL-2和/或TNFα的产生的初始或中心记忆CD4+T细胞。同样地，选择与假的转导的CD8+细胞相比具有增强的IFNγ产生的CD8+细胞。
在实施方案中，选择对抗原或肿瘤靶标响应增殖的CD4+和CD8+细胞。例如，选择当用抗原或肿瘤靶标刺激时，与假的转导细胞或CD8+转导细胞相比，CD4+细胞强力增殖。在一些实施方案中，选择对携带抗原的细胞有细胞毒性的CD4+和CD8+细胞。在实施方案中，预期CD4+细胞与CD8+细胞相比是弱细胞毒性的。
在优选的实施方案中，使用已建立特定癌症类型的动物模型，选择提供体内杀死肿瘤细胞转导的淋巴细胞，诸如CD8+中心记忆细胞。此类动物模型为本领域中技术人员已知的并且人类除外。如本文所述的，不是所有转导到淋巴细胞的嵌合受体构建体都赋予体内杀死肿瘤的能力，尽管体外能力变得活化和杀死肿瘤细胞。特别是，对一些靶分子而言，与具有短间隔子区域嵌合受体构建体的T细胞相比，具有长间隔子区域嵌合受体构建体的T细胞在体内杀死肿瘤细胞方面不太有效。对其他靶分子而言，与具有长间隔子区域嵌合受体构建体的T细胞相比，具有短间隔子区域嵌合受体构建体的T细胞在体内杀死肿瘤细胞方面不太有效。
还在其他实施方案中，使用已建立的特定癌症类型的动物模型，选择可以体内存留的转导的表达嵌合受体的T细胞。在实施方案中，在引入到动物中后，具有短间隔子区域的转导的嵌合受体CD8+中心记忆细胞已显示在体内存留大约3天或更久，10天或更久，20天或更久，30天或更久，40天或更久，或50天或更久。
本公开内容涵盖在组合物中利用CD4+和CD8+T细胞的组合。在一实施方案中，嵌合受体转导的CD4+细胞可以与相同配体特异性的嵌合受体转导的CD8+细胞组合或与对独特的肿瘤配体特异的CD8+T细胞组合。在其他实施方案中，嵌合受体转导的CD8+细胞与对肿瘤上表达的不同的配体特异性的嵌合受体转导的CD4+细胞组合。还在另一实施方案中，嵌合受体修饰的CD4+和CD8+细胞是组合的。在实施方案中，CD8+和CD4+细胞可以不同的比率组合，例如CD8+和CD4+的1:1比率，CD8+和CD4+的10:1比率，或CD8+和CD4+的100:1比率。在实施方案中，测试组合群的体外和/或体内细胞增殖，选择提供细胞增殖的细胞比率。
如本文所述的，本公开内容注意到CD4+和CD8+细胞可以进一步地分成亚群，诸如初始，中心记忆，和效应记忆细胞群。如本文所述的，在一些实施方案中，初始CD4+细胞为CD45RO-，CD45RA+，CD62L+，CD4+阳性T细胞。在一些实施方案中，中心记忆CD4+细胞为CD62L阳性的和CD45RO阳性的。在一些实施方案中，效应CD4+细胞为CD62L阴性的和CD45RO阳性的。可用嵌合受体单独地修饰这些群的每一个。
如本文所述，在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚型中。用抗-CD8和抗CD62L抗体染色后，将PBMC分选为CD62L-CD8+和CD62L+CD8+部分。在一些实施方案中，中心记忆T细胞(TCM)的表型标记的表达包括CD62L、CCR7、CD28、CD3和CD127，并且粒酶B是阴性的或低的。在一些实施方案中，中心记忆T细胞为CD45RO+、CD62L+、CD8+T细胞。在一些实施方案中，效应T细胞(TE)对CD62L、CCR7、CD28、和CD127是阴性的，对粒酶B和穿孔素是阳性的。在一些实施方案中，通过CD8+、CD62L+、CD45RO+、CCR7+、CD28+CD127+，和CD45RO+表征初始CD8+T淋巴细胞。可用嵌合受体单独地修饰这些群的每一个。
携带嵌合受体的细胞转导和/或选择后，优选地体外扩增细胞群至获得提供至少一次向人体输注的足量细胞，通常大约104个细胞/kg-109个细胞/kg。在实施方案中，在携带抗原的细胞，抗CD3，抗CD28，和IL2、IL-7、IL15、IL-21及其组合存在的情况下，培养转导细胞。
CD4+和CD8+细胞的每一亚群都可以彼此组合。在具体的实施方案中，修饰的初始或中心记忆CD4+细胞与修饰的中心记忆CD8+T细胞组合从而提供对携带抗原的细胞诸如肿瘤细胞的协同细胞毒性作用。
组合物
本发明提供了过继细胞免疫治疗组合物，其包含本文所述的遗传修饰的T淋巴细胞制剂。
在实施方案中，T淋巴细胞制剂包含具有嵌合受体的CD4+T细胞，嵌合受体包含对与疾病或病症有关的配体特异的细胞外抗体可变结构域，可定制的间隔子区域，跨膜结构域，和T细胞受体或其他如本文所述的的受体的细胞内信号转导结构域。在其他实施方案中，过继细胞免疫治疗组合物还包含提供细胞免疫应答的嵌合受体修饰的肿瘤特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞制剂，其中细胞毒性T淋巴细胞制剂包含具有嵌合受体的CD8+T细胞，嵌合受体包含对与疾病或病症有关的配体特异的细胞外单链抗体，可定制的间隔子区域，跨膜结构域，和本文所述的T细胞受体的细胞内信号转导结构域。在实施方案中，本发明的嵌合受体修饰的T细胞群体内存留至少大约3天或更长。
在一些实施方案中，过继细胞免疫治疗组合物包含提供细胞免疫应答的嵌合受体修饰的肿瘤特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞制剂，其中细胞毒性T淋巴细胞制剂包含具有嵌合受体的CD8+T细胞，嵌合受体包含对与疾病或病症有关的配体特异的细胞外单链抗体，可定制的间隔子区域，跨膜结构域，和T细胞受体的细胞内信号转导结构域，以及衍生自CD45RO-CD62L+CD4+T细胞的抗原反应性嵌合受体修饰的初始CD4+T辅助细胞，和药学上可接受的载体。
在其他实施方案中，过继细胞免疫治疗组合物包含提供了细胞免疫应答的来源于患者的抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞制剂，和增加CD8+免疫应答的抗原反应的嵌合受体修饰的CD4+T辅助细胞，其中辅助T淋巴细胞制剂包含具有嵌合受体的CD4+T细胞，嵌合受体包含对与疾病或病症有关的配体特异的细胞外抗体可变结构域，可定制的间隔子区域，跨膜结构域，和T细胞受体的细胞内信号转导结构域。
在进一步的实施方案中，过继细胞免疫治疗组合物包含增加CD8+免疫应答的抗原反应的嵌合受体修饰的初始CD4+T辅助细胞，其中辅助T淋巴细胞制剂包含具有嵌合受体的CD4+T细胞，嵌合受体包含对与疾病或病症有关的配体特异的细胞外抗体可变结构域，可定制的间隔子区域，跨膜结构域，和T细胞受体的细胞内信号转导结构域。
在实施方案中，CD4+T辅助淋巴细胞选自初始CD4+T细胞，中心记忆CD4+T细胞，效应记忆CD4+T细胞，或大体积CD4+T细胞。在一些实施方案中，CD4+辅助淋巴细胞为初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞包含CD45RO-，CD45RA+，CD62L+CD4+T细胞。在实施方案中，CD8+T细胞毒性淋巴细胞选自初始CD8+T细胞，中心记忆CD8+T细胞，效应记忆CD8+T细胞或大体积CD8+T细胞。在一些实施方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞为中心记忆T细胞，其中中心记忆T细胞包含CD45RO+，CD62L+，CD8+T细胞。还在其他实施方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞为中心记忆T细胞，并且CD4+辅助T淋巴细胞为初始或中心记忆CD4+T细胞。
方法
本公开内容提供了制造过继免疫治疗组合物的方法，以及这些组合物用于在患病个体中进行细胞免疫治疗的用途或使用方法。在实施方案中，如本文所述的嵌合受体修饰的T细胞能够体内存留至少3天，或至少10天。在实施方案中，本文所述的嵌合受体修饰的T细胞可以如通过CFSE染料稀释法所检测的体内增殖通过至少2代，或至少3代。通过使用疾病或病症的动物模型和给予细胞和检测转移的细胞的存留和/或增殖能力可以检测嵌合受体修饰的T细胞的增殖和存留。在其他实施方案中，通过完成携带抗原的细胞的多个活化周期可以测定增殖和活化。
在实施方案中，大规模生产组合物的方法包括获得修饰的初始CD4+T辅助细胞，其中修饰的辅助T淋巴细胞制剂包含具有嵌合受体的CD4+T细胞，嵌合受体包含对肿瘤细胞表面分子特异的配体结合结构域，可定制的间隔子结构域，跨膜结构域，和本文所述的细胞内信号转导结构域。
在另一实施方案中，方法还包括获得修饰的CD8+细胞毒性T细胞，其中修饰的CD8+细胞毒性T淋巴细胞制剂包含具有嵌合受体的CD8+T细胞，嵌合受体包含对肿瘤细胞表面分子特异的配体结合结构域，可定制的间隔子结构域，跨膜结构域，和如本文所述的细胞内信号转导结构域。
在另一实施方案中，方法包括获得修饰的CD8+细胞毒性T细胞，其中修饰的细胞毒性T淋巴细胞制剂包含具有嵌合受体的CD8+T细胞，嵌合受体包含对肿瘤细胞表面分子特异的配体结合结构域，可定制的间隔子结构域，跨膜结构域，和如本文所述的细胞内信号转导结构域，并且还包括将修饰的CD8+细胞毒性T细胞与CD4+辅助细胞淋巴细胞制剂组合。
上文及实施例中描述了嵌合受体修饰的CD4+和CD8+细胞制剂。可以从患病个体获得抗原特异性T淋巴细胞，并且可以通过在抗原存在的情况下体外刺激T淋巴细胞制备抗原特异性T淋巴细胞。也可以如本文所述的分离所选的无抗原特异性的CD4+和CD8+T淋巴细胞的亚群并且在大规模生产的方法中组合。在实施方案中，可以评估细胞群组合的细胞表面标记的均一性，增殖通过至少两代，具有统一的细胞分化状态的能力。使用本领域中已知的细胞毒性，增殖，或细胞因子产生测定，通过共培养表达靶配体的细胞系与嵌合受体修饰的T细胞进行质量控制以检测嵌合受体修饰的T细胞是否识别细胞系。通过流式细胞术可以检测细胞分化状态和嵌合受体修饰的T细胞上细胞表面标记。在实施方案中，CD8+细胞上的标记和细胞分化状态包括CD3、CD8、CD62L、CD28、CD27、CD69、CD25、PD-1、CTLA-4、CD45RO和CD45RA。在实施方案中，CD4+细胞上的标记和细胞分化状态包括CD3、CD4、CD62L、CD28、CD27、CD69、CD25、PD-1、CTLA-4CD45RO、和CD45RA。
在实施方案中，本文提供了选择用于嵌合受体的间隔子区域的方法。令人惊奇地是一些嵌合受体构建体，尽管可体外有效活化T细胞，在体内不能有效活化T细胞。在实施方案中，方法包括提供许多嵌合受体核酸，其中嵌合受体核酸只在间隔子区域不同；将每一嵌合受体核酸引入单独的T淋巴细胞群；体外扩增每一单独的淋巴细胞群，并且将每一淋巴细胞群引入荷瘤动物以便检测时每一嵌合受体修饰的T细胞的抗肿瘤效力，和选择与每一其他嵌合受体修饰的每一其他单独的淋巴细胞群相比，提供了抗肿瘤效力的嵌合受体。
不同肿瘤的动物模型为已知的。可以通过以下来测定抗肿瘤的效力：鉴定肿瘤体积的减小，通过检测动物死亡，遗传修饰的T细胞的体内存留，遗传修饰的T细胞的活化(例如，通过检测CD25和/或CD69表达的增加)，和/或遗传修饰的T细胞的体内增殖。在一实施方案中，选择提供了通过一个或多个这些参数所检测的最好的体内抗肿瘤效力的嵌合受体。可以通过以下检测抗肿瘤效力的缺乏：遗传修饰的淋巴细胞体内存留的缺乏，动物死亡，通过半胱天冬酶-3诱导增加所测的凋亡增加，和/或遗传修饰的淋巴细胞增殖减少。
在实施方案中，提供了许多嵌合受体核酸，其中嵌合受体核酸只在间隔子区域不同，包括提供嵌合受体构建体，其包含编码配体结合结构域的多核苷酸，其中配体为肿瘤特异性抗原，病毒抗原，或任何表达在靶细胞群上适于介导通过淋巴细胞识别和清除的其他分子；编码第一多肽间隔子的多核苷酸，其在第一多肽间隔子的编码序列的5’和3’末端具有确定的限制性位点；编码跨膜结构域的多核苷酸；和编码一个或多个细胞内信号转导结构域的多核苷酸。
本公开内容也提供了在患有疾病或病症的个体内进行细胞免疫治疗的方法，其包括：给予本文所述的表达嵌合受体的淋巴细胞的组合物。在其他实施方案中，方法包括给予患者提供了细胞免疫应答的遗传修饰的细胞毒性T淋巴细胞制剂，其中细胞毒性T淋巴细胞制剂包含具有嵌合受体的CD8+T细胞，嵌合受体包含对肿瘤细胞表面分子特异的配体结合结构域，可定制的间隔子结构域，跨膜结构域，和如本文所述的细胞内信号转导结构域，和引起直接的肿瘤识别并且增强遗传修饰的细胞毒性T淋巴细胞制剂介导细胞免疫应答的能力的遗传修饰的辅助T淋巴细胞制剂，其中辅助T淋巴细胞制剂包含具有嵌合受体的CD4+T细胞，嵌合受体包含对肿瘤细胞表面分子特异的配体结合结构域，可定制的间隔子结构域，跨膜结构域，和如本文所述的细胞内信号转导结构域。
虽然没有限制本发明的范围，据信给予前通过选择可以体内存留和增殖的嵌合受体修饰的T细胞群可导致使用较低剂量的T细胞的能力并且提供更统一的治疗活性。在实施方案中，T细胞的剂量可以减少至少10％，20％，或30％或更大。T细胞剂量的减少有利于降低风险或肿瘤溶解综合征和细胞因子风暴。
在另一实施方案中，在患有疾病或病症的个体内进行细胞免疫应答的方法包括：给予个体遗传修饰的辅助T淋巴细胞制剂，其中遗传修饰的辅助T淋巴细胞制剂包含具有嵌合受体的CD4+T细胞，嵌合受体包含对肿瘤细胞表面分子特异的配体结合结构域，可定制的间隔子结构域，跨膜结构域，和如本文所述的细胞内信号转导结构域。在实施方案中，方法还包括给予个体遗传修饰的细胞毒性T淋巴细胞制剂，其中遗传修饰的细胞毒性T淋巴细胞制剂包含具有嵌合受体的CD8+T细胞，嵌合受体包含对肿瘤细胞表面分子特异的配体结合结构域，可定制的间隔子结构域，跨膜结构域，和如本文所述的细胞内信号转导结构域。
另一实施方案描述了在患有疾病或病症的个体内进行细胞免疫治疗的方法，其包括：在与疾病或病症相关的靶分子存在的情况下分析个体的生物样品并且给予如本文所述的过继免疫治疗组合物，其中嵌合受体与靶分子特异性结合。
在一些实施方案中，在嵌合受体引入之前从初始CD4+T细胞，中心记忆CD4+T细胞，效应记忆CD4+T细胞或大体积CD4+T细胞选择CD4+T辅助淋巴细胞。在具体的实施方案中，CD4+辅助淋巴细胞为初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞包含CD45RO-、CD45RA+、CD62L+CD4+T细胞。还在其他实施方案中，在嵌合受体引入之前从初始CD8+T细胞，中心记忆CD8+T细胞，效应记忆CD8+T细胞或大体积CD8+T细胞选择CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在具体的实施方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞为中心记忆T细胞，其中中心记忆T细胞包含CD45RO+、CD62L+、CD8+T细胞。在具体的实施方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞为中心记忆T细胞，并且CD4+辅助T淋巴细胞为初始CD4+T细胞。
在实施方案中，用包含与肿瘤特异的细胞表面分子特异性结合的抗体重链结构域的嵌合受体遗传修饰CD8+T细胞和CD4+T细胞。在其他实施方案中，CD8细胞毒性T细胞的细胞内信号转导结构域与CD4辅助T细胞的细胞内信号转导结构域相同。还在其他实施方案中，CD8细胞毒性T细胞的细胞内信号转导结构域与CD4辅助T细胞的细胞内信号转导结构域不同。
可以被本发明治疗的个体，通常为人类和其他灵长类个体，诸如出于兽医学目的所用的猴子和猩猩。个体可以为雄性或雌性，并且可以为任何合适的年龄，包括婴儿，少年，青少年，成年，和老年个体。
例如，方法可用于血液系统恶性肿瘤，黑色素瘤，乳腺癌，和其他上皮恶性肿瘤或实体瘤的治疗。在一些实施方案中，与疾病或病症有关的分子选自孤儿酪氨酸激酶受体ROR1，Her2，CD19，CD20，CD22，间皮素，CEA和乙型肝炎表面抗原。
可以被治疗的个体包括患有癌症的个体，包括但不限于结肠癌，肺癌，肝癌，乳腺癌，肾癌，前列腺癌，卵巢癌，皮肤癌(包括黑色素瘤)，骨癌，和脑癌等。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原或分子为已知的，诸如黑色素瘤，乳腺癌，鳞状细胞癌，结肠癌，白血病，骨髓癌，和前列腺癌。在其他实施方案中，表达基因改造的嵌合受体的遗传修饰的T细胞可以靶向于肿瘤相关分子。实例包括但不限于B细胞淋巴瘤，乳腺癌，前列腺癌，和白血病。
根据已知的技术或基于直接公开内容对本领域中技术人员明显的其变体，可以在用于过继免疫治疗的方法和组合物中利用如上文所述的制备的细胞。
在一些实施方案中，通过从细胞的培养基首次收获它们，然后洗涤和在适于给药的培养基和容器系统(“药学上可接受的”载体)中以治疗有效的量浓缩细胞，来配制细胞。合适的输液培养基可以为任何等渗的介质制剂，通常为生理盐水，Normosol R(Abbott)或Plasma-LyteA(Baxter)，但是也可以利用含5％葡萄糖的水溶液或林格氏乳酸盐液。输液培养基可以添加人血清白蛋白，胎牛血清，或其他人血清组分。
组合物中细胞的治疗有效量为至少2个细胞亚型(例如，1个CD8+中心记忆T细胞亚型和1个CD4+辅助T细胞亚型)或更典型地大于102个细胞，和高达106个，高达并包括108个或109个细胞和多于1010个细胞。细胞数量取决于组合物意欲使用的最终用途和包括本文的细胞类型。例如，如果期望对特定抗原特异的细胞，然后细胞群将包含大于70％，通常大于80％，85％和90-95％的此类细胞。为本文所提供的用途，细胞体积以公升或更少的计量，可以为500ml或更少，甚至250ml或100ml或更少。因此期望的细胞的密度通常大于104个细胞/ml并且通常大于107个细胞/ml，通常108个细胞/ml或更大。可以分配免疫细胞的临床相关量到多个输注，使其最终等于或超过106个，107个，108个，108个，109个，1010个或1011个细胞。
在一些实施方案中，本发明的淋巴细胞可用于赋予个体免疫力。所谓“免疫力”意指减轻与病原体感染，或肿瘤，指导淋巴细胞应答的应答有关的一种或多种体征。细胞的给药量通常在存在于具有病原体免疫力的正常个体的范围中。因此，细胞通常通过输注给药，每次输注的范围为2个细胞，至高达至少106个至3×1010个细胞，优选在至少107个至109个细胞的范围。通过单次输注，或随着一系列的时间通过多次输注给予T细胞。然而，因为期望不同的个体在响应性方面不同，主治医生确定输注细胞的类型和数量，及输液量和随着给予的多次输注的时间段，并可以通过常规检查检测。使用如本文所示例的本发明的的快速扩增方法，可容易地获得足够的T淋巴细胞(包括细胞毒性T淋巴细胞和/或辅助T淋巴细胞)水平的产生。例如见Riddell等，美国专利6,040,177号，第17栏。
在实施方案中，通过静脉注射，腹腔内地，瘤内地给药如本文所述的组合物到骨髓，到淋巴结和/或脑脊液。在实施方案中，递送嵌合受体修饰的组合物到肿瘤的部位。可选地，如本文所述的组合物可以与靶向细胞到肿瘤或免疫系统隔间的化合物组合并且避免诸如肺的部位。
在实施方案中，本文所述的组合物与化疗剂和/或免疫抑制剂一起给药。在实施方案中，首先用抑制或破坏其他免疫细胞的化疗剂治疗患者，接下来用本文所述的组合物治疗患者。在某些情况下，可完全地避免化学疗法。
进一步地在下文所示实施例阐明本发明。
实施例
实施例1.定制间隔子长度和scFv亲和力用于用嵌合受体修饰的T细胞最佳的识别
我们构建了对ROR1分子特异的嵌合受体，所述ROR1分子表达在大量的人类恶性肿瘤上，包括慢性淋巴细胞性白血病，套细胞淋巴瘤，急性成淋巴细胞性白血病，和乳腺癌，肺癌，前列腺癌，胰腺癌和卵巢癌。从具有不同亲和力的并且包含不同长度的细胞外IgG4-Fc间隔子结构域的ROR1特异性scFV设计ROR1嵌合受体。分析表达每一ROR-1特异性嵌合受体的T细胞体外识别ROR1+血液系统肿瘤和上皮性肿瘤的能力和清除移入到免疫缺陷小鼠的人套细胞淋巴瘤的能力。
材料和方法
人体
从签署对癌症研究中心的机构审查委员会(FHCRC)批准的研究方案知情同意书的健康供者和患者获取外周血单核细胞(PBMC)。
细胞系
K562，Raji，JeKo-1，MDA-MB-231，MDA-MB-468和293T细胞系获取自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)。Dr.Edus H.Warren(FHCRC)友好地提供了肾细胞癌系FARP，TREP和RWL。K562/ROR1和Raji/ROR1产生于全长ROR1基因的慢病毒转导。为了衍生JeKo-1/ffluc，用编码T2A序列和eGFP上游的萤火虫荧光素酶(ffluc)基因的慢病毒载体转导天然的JeKo-1细胞。分选转导的JeKo-1细胞用于eGFP表达，并且扩增用于体内实验。
免疫表型
用下列偶联的mAb染色PBMC和细胞系：CD3、CD4、CD5、CD8、CD19、CD28、CD45RO、CD62L、CD314(NKG2D)、MICA/B和匹配的同型对照(BD Biosciences)。进行用于活的/死的细胞辨别的碘化丙啶(PI)染色。使用多克隆的羊抗人-ROR1抗体(R&D Systems)分析ROR1的细胞表面表达。
使用多克隆的羊抗小鼠-IgG抗体(Fab特异的)(JacksonImmunoResearch)分析2A2ROR1嵌合受体的表面表达。在上进行流分析，在(Becton Dickinson)上进行分选-纯化，并且使用软件(Treestar)分析数据。
载体构建和编码嵌合受体的慢病毒的制备
使用2A2，R12和R11mAb(ROR1)和FMC63mAb(CD19)的VL和VH链节段构建ROR1特异的和CD19特异的嵌合受体。(Yang等，Plos One 6(6):e21018，June 15，2011中提供了R11和R12的可变区序列)。通过(G4S)3(SEQ ID NO:12)肽将每一scFV连接到衍生自IgG4-Fc包含‘铰链-CH2-CH3’(229AA，SEQ ID NO:)，‘铰链-CH3’(119AA,SEQ ID NO:)或只有‘铰链’(12AA,SEQ.ID NO:4)序列(图1)的间隔子结构域(通用蛋白质资源数据库:P01861,SEQ ID NO:13)。所有间隔子包含位于天然的IgG4-Fc蛋白的位置108处‘铰链’结构域内S→P取代，并且与人CD28的27AA跨膜结构域(通用蛋白质资源:P10747，SEQ ID NO:14)和信号转导模块连接，信号转导模块包含(i)具有位于天然的CD28蛋白的位置186-187处LL→GG取代的人CD28的41AA胞质结构域(SEQ ID NO:14)或(ii)人4-1BB的42AA胞质结构域(通用蛋白质资源:Q07011，SEQ ID NO:15)，其每一个都与人CD3ζ的同种型3的112AA胞质结构域连接(通用蛋白质资源:P20963，SEQ ID NO；16)。构建体编码嵌合受体下游的T2A核糖体跳跃元件(SEQ ID NO:8))和tEGFR序列(SEQ ID NO:9)。合成编码每一转基因的密码子优化的核苷酸序列(Life Technologies)并且将其克隆到epHIV7慢病毒载体。
使用包装载体pCHGP-2，pCMV-Rev2和pCMV-G，和转染试剂(Clontech)在293T细胞中产生编码ROR1嵌合受体，CD19嵌合受体或tEGFR的慢病毒。
表达ROR1和CD19嵌合受体的T细胞系的产生
从健康供体的PBMC分选CD8+CD45RO+CD62L+中心记忆T细胞(TCM)或大体积CD4+T细胞，用抗CD3/CD28珠(Life Technologies)使其活化，在活化后第3天转导，在32℃下以800g离心添加了1μg/mL聚凝胺的慢病毒的上清液45分钟(MOI＝3)(Millipore)。在与10％人血清，2mM左旋谷氨酰胺和1％盘尼西林-链霉素(CTL培养基)一起在添加重组的人IL-2到最终浓度50U/mL的RPMI中扩增T细胞。通过具有生物素偶联的抗EGFR mAb(ImClone Systems)和链霉亲和素珠(Miltenyi)的免疫磁珠选择富集每一T细胞系的tEGFR+。使用快速扩增方案(Riddell SR，Greenberg PD，使用抗CD3和抗CD28单克隆抗体用于克隆和扩增人抗原特异性T细胞(J Immunol Methods.1990；128(2):189-201.Epub 1990/04/17.)扩增ROR1嵌合受体和tEGFR对照T细胞，并且通过用辐照的(8,000rad)B-LCL刺激扩增CD19嵌合受体修饰的T细胞，T细胞:LCL比率1:7。在CTL培养基中与50U/mL IL-2一起培养T细胞。
细胞毒性，细胞因子分泌和增殖测定
用51Cr(PerkinElmer)标记靶细胞，洗涤并且一式三份地以1-2×103个细胞/孔以各种效应细胞与靶细胞的比率(E:T)与效应嵌合受体修饰的T细胞一起孵育。4小时孵育后收获上清液用于γ计算并且使用标准的公式计算特异性溶解。为了细胞因子分泌的分析，5×104个T细胞一式三份地与靶细胞一起平板培养，E:T比率1:1(原发性CLL)，2:1(Raji/ROR1；JeKo-1)，4:1(K562/ROR1，K562/CD19和K562)或10:1(MDA-MB-231)，并在24小时孵育后移除的上清液中通过ELISA或多重细胞因子免疫测定(Luminex)测量IFN-γ，TNF-α与IL-2。在实验中，使用处于饱和浓度的抗NKG2D(克隆1D11)，抗MICA/B(克隆6D4，均都来自BD)和抗ULBP(由Veronika Groh博士，FHCRC友好提供的)阻断NKG2D信号转导。为了增殖的分析，用0.2μM琥珀酰亚胺酯(CFSE，Invitrogen)标记T细胞，洗涤并且一式三份地在没有外源性细胞因子的培养基中与刺激物细胞一起平板培养。72小时孵育后，用抗CD8mAb和PI标记细胞，并且通过流式细胞术分析评估活的CD8+T细胞的细胞分裂。
NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠中的实验
机构动物嵌合受体和使用委员会批准所有小鼠实验。6-8周龄雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠获取自杰克逊实验室或内部繁殖。用0.5×106个JeKo-1/ffluc肿瘤细胞经由尾静脉注射小鼠并且小鼠随后接受嵌合受体修饰的或对照T细胞的尾静脉注射。
为了肿瘤生长的生物发光成像，小鼠接受再悬浮在PBS中的荧光素底物(15μg/g体重)的腹腔内注射。用异氟烷麻醉小鼠并且在荧光素注射后10，12和14分钟，以小分级模式，在1秒-1分钟的采集时间，使用Xenogen IVIS成像系统(Caliper)使其成像从而获得未饱和的图像。使用Living Image软件(Caliper)和所分析的包括每一个体小鼠的整体或胸腔的感兴趣的区域内光子通量分析荧光素酶活性。
统计分析
使用Prism软件进行统计分析。进行双侧配对检验，95％置信区间的学生t检验并且p值结果p<0.05认为是有意义的。使用对数秩和(log-rank)检验进行统计分析并且p值结果p<0.05认为是有意义的。
结果
2A2ROR1嵌合受体的截短的间隔子赋予了优越的ROR1+肿瘤识别。
我们以前报道了使用2A2scFVROR1特异性嵌合受体的设计，所述嵌合受体与ROR1-1的远离膜的Ig样/卷曲的部分NH2末端中的表位结合。最初的2A2ROR1嵌合受体具有长的229个AA间隔子，其包括IgG4-Fc的‘铰链-CH2-CH3’区，和整合的CD28共刺激结构域，和CD3ζ信号转导结构域(Hudecek M等.Blood，2010)。这种嵌合受体赋予了ROR1+肿瘤的特异识别，但是我们假设因为ROR1表位的远离膜的位置，截短间隔子可能增强肿瘤识别和T细胞信号转导。因此，我们构建了2个额外的嵌合受体，其中依次删除IgG4-Fc间隔子从而衍生‘铰链-CH3’(119个AA，中等的)，和‘只有铰链’(12个AA，短的)变体。每一新的受体包含相同的2A2scFV，和CD28和CD3ζ信号转导模块。转基因盒包括用作嵌合受体修饰的T细胞的转导，选择和体内追踪标记的截短的EGFR(tEGFR)。
我们用包含全长或截短的IgG4-Fc间隔子的2A2ROR1嵌合受体和tEGFR对照载体转导纯化的CD8+TCM。平均的转导效率为15％(范围9-22％)，通过tEGFR表达选择在第10天富集统一纯度(>90％)的转基因阳性的T细胞，并且扩增(图2A)。通过F(ab)特异性抗体染色确认每一嵌合受体的表面表达(图2A)。
修饰表达每一2A2ROR1-嵌合受体的CD8+T细胞的体外功能的分析证明每一受体赋予了JeKo-1MCL和天然地表达ROR1的原发性CLL细胞，和已被ROR1转导的K562细胞的特异溶解，但是没有赋予对照ROR1-靶标的识别(图2B)。表达短的‘只有铰链’2A2ROR1嵌合受体的T细胞具有最大的细胞溶解活性，并且抗所有ROR1+肿瘤靶标的肿瘤溶解的层级(短的>中等的>>长的)是很明显的，例证了间隔子长度对ROR1+肿瘤细胞识别的重要性。
过继T细胞治疗的抗肿瘤效力与转移的T细胞的增殖和存活相关，其可以通过嵌合受体被信号转导所改变。我们使用CFSE稀释测定分析与Raji/ROR1或CLL结合后每一2A2ROR1嵌合受体修饰的T细胞的增殖，发现短的间隔子构建体促进了刺激后最大的T细胞增殖(图2C)。为确保这增强的增殖与更大的活化诱导的细胞死亡(AICD)无关，我们也分析在Raji/ROR1和JeKo-1肿瘤细胞刺激后用碘化丙啶(PI)染色的2A2ROR 1嵌合受体修饰的T细胞的比例。我们检测到与中等的(41.6％/42.4％)和长的(44.5％/48.5％)间隔子相比，短的(Raji/ROR1:17.2％/JeKo-1:20.2％)间隔子修饰的T细胞系中PI+CD8+T细胞低得多的频率。
响应Raji/ROR1和原发性CLL细胞刺激所产生细胞因子的定量分析显示表达每一2A2ROR1嵌合受体的T细胞产生的IFN-γ、TNF-α和IL-2如在细胞毒性测定中观察到的，短的间隔子构建体在介导肿瘤识别后细胞因子分泌方面优越(图2D)。因此，这一分析显示截短2A2ROR1嵌合受体的细胞外IgG4-Fc间隔子结构域导致在细胞毒性，增殖和肿瘤识别后体外效应功能方面显著的增强。
对Kringle结构域中靠近膜的表位特异的R11scFv需要长的细胞外间隔子结构域。
我们构建了具有ROR1嵌合受体的纯化的CD8+T细胞，所述嵌合受体包含对ROR1的Kringle结构域特异的R11scFv和包含全长或截短的IgG4-Fc间隔子(CH3和只有铰链)。通过EGFR表达所测的每一具有短的(只有IgG4铰链)，中等的(IgG4铰链/CH3)，和长的(IgG4铰链/CH2/CH3)载体的转导效率是可比较的(图3A)。测定每一载体转导的T细胞对表达或不表达ROR1的白血病或淋巴瘤响应的细胞溶解(图3B)，增殖(图3C)，和细胞因子产生(图3D)。如所示，只有包含长的间隔子序列的R11嵌合受体转导的T细胞能够有效地识别ROR1+肿瘤和介导效应功能。
衍生自具有比2A2更高的亲和力的mAb R12的ROR1嵌合受体介导优越的抗肿瘤反应性
我们下一步检验增加用于构建ROR1嵌合受体的scFV的亲和力是否影响肿瘤识别和T细胞功能。我们从mAb R12产生ROR1特异性嵌合受体，所述嵌合受体与2A2相似，与ROR1的Ig/卷曲的结构域NH2末端中表位结合，但是具有高于>50倍单价的结合亲和力。
用长的和短的IgG4-Fc间隔子构建R12ROR1嵌合受体从而检测这一较高的亲和力scFV的最佳的间隔子设计是否与这一较低的亲和力scFV的最佳的间隔子设计不同。我们发现与2A2相似，短的间隔子R12ROR1嵌合受体赋予了改善的细胞溶解活性，细胞因子分泌和增殖(数据未显示)，提示较短的间隔子长度提供了T细胞和ROR1+靶细胞的优越的空间结合用于T细胞活化。
然后我们设计R12和2A2ROR1嵌合受体，其包含最佳的(短的)细胞外间隔子，和CD28或4-1BB共刺激结构域，与CD3ζ(4个构建体)串联用于比较(图4A.B)。这些ROR1嵌合受体构建体表达在健康供体的纯化的CD8+TCM中，并且通过tEGFR染色我们确认等价的转基因表达(图5A)。2A2和R12ROR1嵌合受体中每一个修饰的T细胞以大约等价的效率特异地溶解K562/ROR1和Raji/ROR1肿瘤细胞(图5B)。然而，细胞因子产生的分析显示包含CD28或4-1BB的高亲和力R12ROR1嵌合受体赋予了与相应的2A2构建体相比显著更高的IFN-γ，TNF-α和IL-2产生(图5C)。我们发现与表达具有4-1BB共刺激结构域的嵌合受体的T细胞相比，表达具有CD28共刺激结构域的嵌合受体的T细胞产生更多的IFN-γ，TNF-α和IL-2。
分析ROR1嵌合受体T细胞的增殖的实验显示，与表达各自的2A2对应物的T细胞(图4D)相比，具有CD28或4-1BB结构域表达高亲和力R12ROR1嵌合受体的T细胞中增殖T细胞的百分比更高和细胞分裂的数量更高。在表达具有CD28结构域的嵌合受体的T细胞中有更强有力的增殖，与这些受体诱导产生的更高的IL-2一致。与2A2ROR1嵌合受体相比，存在分别用Raji/ROR1和JeKo-1肿瘤细胞刺激后(R12:5.6％/6.9％与2A2:10％/9.65％)，通过PI染色所测的R12修饰的T细胞系中AICD的频率更低。分别对Raji/ROR1和JeKo-1肿瘤细胞(R12:16.4％/18.4％与2A238.1％/39.6％)响应，与表达具有4-1BB结构域的嵌合受体的T细胞系相比，表达具有CD28结构域的嵌合受体的T细胞系也具有更低的AICD。
为检测R12ROR1嵌合受体在CD8+T细胞中观察到增强的功能是否延伸到CD4+T细胞，我们用包含短的间隔子和CD28共刺激结构域的2A2和R12ROR1嵌合受体转导大体积CD4+T细胞。对Raji/ROR1+肿瘤细胞响应，表达高亲和力R12scFV的CD4+T细胞比表达2A2的CD4+T细胞产生更高水平的IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-4和IL-10，并且经历更大的增殖(图5A，B)。与相同的ROR1嵌合受体修饰的CD8+T细胞相比，ROR1嵌合受体修饰的CD4+T细胞在细胞因子产生和增殖方面优越。总之，我们的数据证明剪裁非信号转导的细胞外嵌合受体间隔子结构域的长度和scFV亲和力为影响ROR1嵌合受体T细胞功能的独立的参数。
高亲和力ROR1嵌合受体修饰的CD8+T细胞具有与CD19嵌合受体修饰的CD8+T细胞可比较的体外抗原发性CLL活性
ROR1和CD19一致地表达在所有原发性CLL(图6A)，然而估计ROR1分子/肿瘤细胞的绝对数量比CD19分子/肿瘤细胞的绝对数量低10倍，这已在临床试验中成功地靶向于CD19嵌合受体T细胞。我们比较了表达最佳的R12和2A2ROR1嵌合受体，和衍生自FMC63scFV的CD19嵌合受体的CD8+T细胞对原发性CLL的识别。
我们使用纯化的CD8+TCM用于嵌合受体修饰从而提供统一的细胞产物并且每一嵌合受体包含短的IgG4-Fc‘只有铰链’间隔子和4-1BB共刺激结构域。我们确认我们的CD19嵌合受体(IgG4铰链)与用于进行中临床试验的具有CD8α铰链间隔子和4-1BB共刺激结构域的CD19嵌合受体在识别CD19+肿瘤方面至少相同或更有效(图20)。与具有4-1BB和CD3ζ和CD8α铰链表达CD19嵌合受体的T细胞相比，具有4-1BB和CD3ζ和修饰的IgG4-Fc铰链表达CD19嵌合受体的T细胞展示优越的体外和体内功能。在图20D中，比较表达CD19嵌合受体具有IgG4Fc铰链(组1)或CD8α铰链(组2)的T细胞和只表达tEGFR(组3)的T细胞在表达萤火虫荧光素酶(ffluc)Raji肿瘤细胞接种的NSG小鼠中的体内抗肿瘤活性。在肿瘤接种后17天和T细胞接种后10天使小鼠成像。数据显示与用CD19嵌合受体IgG4Fc铰链T细胞处理的小鼠相比，用对照tEGFR T细胞(组3)或CD19嵌合受体CD8α铰链T细胞(组2)处理的小鼠中肿瘤负荷更大。
与较低亲和力2A2ROR1嵌合受体修饰的T细胞相比，R12ROR1嵌合受体T细胞抗来自于多个CLL患者(n＝4)原发性肿瘤细胞的细胞溶解活性更高，与CD19嵌合受体T细胞所观察到的溶解相等(图6B)。多重细胞因子分析显示与原发性CLL共培养后，与表达CD19嵌合受体的那些相比，表达R12ROR1的CD8+T细胞产生接近相等的IFN-γ和TNF-α，产生IL-2较少(图6C)。如以上所述，2A2ROR1嵌合受体T细胞产生的所有细胞因子量比R12ROR1嵌合受体T细胞少。CLL刺激后所有嵌合受体转导的T细胞产生的细胞因子基本上少于Raji/ROR1刺激后所有嵌合受体转导的T细胞产生的细胞因子，这不同于CLL表达使CD28能够表达在嵌合受体T细胞上的CD80和CD86(图6A，C)。
我们观察到CLL刺激后，与CD19嵌合受体相比，表达R12和2A2ROR1嵌合受体的T细胞增殖更少(CD19>R12>2A2)(图6D)。我们假设在嵌合受体修饰的CD4+T细胞存在的情况下增强CD8+ROR1嵌合受体T细胞对CLL响应的增殖，因为与CD8+TCM相比它们分泌IL-2更高(图4A；图8A)。为测试这种可能性，我们进行共培养实验，其中分别用R12ROR1，2A2ROR1和CD19嵌合受体单独地修饰CD4+和CD8TCM，嵌合受体表达富集，以1:1比率组合从而确保每一载体修饰的CD8+和CD4+T细胞的比例相等。这些细胞为CFSE标记的并且用原发性CLL刺激。我们观察到在嵌合受体转导的CD4+T细胞添加后CD8+R12ROR1嵌合受体T细胞的增殖有急剧的增加，而未转导的CD4+T细胞没有(图8B)。显著地，当提供CD4辅助时，我们观察到R12ROR1和CD19嵌合受体CD8+T细胞对CLL响应的增殖相等，而表达较低亲和力2A2ROR1嵌合受体的CD8+T细胞的增殖仍然较少。总而言之，我们的数据显示高亲和力R12ROR1嵌合受体赋予了与2A2相比体外抗原发性CLL细胞的优越的反应性。
全身性套细胞淋巴瘤的小鼠模型中ROR1嵌合受体T细胞介导体内抗肿瘤活性
仍然不确定较高亲和力R12嵌合受体修饰的T细胞优越的体外活性是否可以转化为改善的体内抗肿瘤活性，和靶向ROR1如何与靶向CD19比较。为解决这些问题，我们通过尾静脉注射用人MCL系JeKo-1/ffluc接种免疫缺陷NSG小鼠群，当肿瘤播散7天后，用单剂量的R12ROR1，2A2ROR1或CD19嵌合受体CD8+T细胞静脉内处理小鼠。所有嵌合受体都具有最佳的短的间隔子和4-1BB共刺激结构域。肿瘤接种后大约4周，未处理的NSG/JeKo-1小鼠经历了快速进展的全身性淋巴瘤迫使实行安乐死(图9A-C)。
我们在所有R12ROR1，2A2ROR1和CD19嵌合受体T细胞处理的小鼠中观察到肿瘤消退和改善的存活。与2A2ROR1嵌合受体T细胞相比，R12ROR1嵌合受体T细胞处理的小鼠具有优越的抗肿瘤反应和存活(p<0.01)，和与CD19嵌合受体T细胞处理的小鼠可比较的抗肿瘤活性(图9A-C)。
我们分析过继转移后外周血中嵌合受体T细胞的频率并且检测到与2A2ROR1嵌合受体相比，R12ROR1嵌合受体处理小鼠中tEGFR+T细胞数量更高，提示更强有力的体内改善的肿瘤控制增殖。为确认这一点，我们将CFSE标记的CD19嵌合受体，R12和2A2ROR1嵌合受体T细胞给予携带JeKo-1/ffluc的NSG小鼠群，并且分析转移后72小时外周血、骨髓、和脾脏中T细胞增殖。与2A2ROR1嵌合受体T细胞相比，R12和CD19嵌合受体T细胞增殖的百分比更高并且经历细胞分裂的数目的更大(图9D)。最终JeKo-1肿瘤在ROR1或CD19嵌合受体T细胞处理的所有小鼠中复发(图9A-C)。肿瘤复发不是ROR1或CD19缺失变体选择的结果，因为复发的肿瘤对这两种分子都是阳性的。
为了比较，我们分析移植了Raji肿瘤的NSG小鼠中CD19嵌合受体T细胞的抗肿瘤效力，并且观察到完全的肿瘤消除，这表明JeKo-1的复发反映了消除这种肿瘤的难度(数据未显示)。总之，这一数据首先显示ROR1嵌合受体T细胞具有体内抗肿瘤效力，并且提示对B细胞恶性肿瘤而言，优化的ROR1嵌合受体诸如R12是有效的并且分出缺乏ROR1表达的正常的CD19+B细胞。
与2A2相比，表达R12ROR1嵌合受体的T细胞具有优越的抗ROR1+上皮肿瘤的细胞反应性
已在许多上皮性肿瘤上检测到ROR1，尽管未知ROR1嵌合受体表达对ROR1嵌合受体T细胞识别是否足够。使用流式细胞术，我们确认ROR1表达在乳腺癌系MDA-MB-231和468，和肾细胞癌系FARP，TREP，及RWL上(图10A)。然后我们分析通过具有最佳的短的间隔子和4-1BB结构域，R12ROR1嵌合受体转导的CD8+T细胞的肿瘤识别，并且观察到有效的MDA-MB-231，MDA-MB-468，FARP，TREP和RWL的识别(图11A)。我们分析与MDA-MB-231共培养后R12和2A2ROR1-嵌合受体修饰的T细胞的细胞因子分泌和增殖，并且在具有R12ROR1嵌合受体的T细胞的细胞因子产生更多和增殖更强(图11B，C)。与我们在ROR1+B细胞恶性肿瘤中观察的内容相似，MDA-MB-231刺激后R12ROR1嵌合受体T细胞的优越的活化与增加的AICD无关(R12:9.8％与2A2:10.9％)。
讨论
由于ROR1在许多B淋巴样和上皮癌症，包括肺癌，结肠直肠癌和肾细胞癌上表达，ROR1吸引了作为潜在的癌症免疫治疗的靶标的兴趣。我们以前显示CLL和MCL被修饰表达ROR1特异性嵌合受体的T细胞特异地识别(Hudecek M,等.Blood.2010；116(22):4532-41.Epub 2010/08/13)。通过细胞外间隔子结构域的修饰和从高亲和力scFV衍生受体改善ROR1嵌合受体的设计和功能，证明设计的ROR1嵌合受体的T细胞具有抗ROR1+B细胞淋巴瘤的体内活性和抗大范围的上皮性肿瘤的体外活性。
我们比较衍生自2A2mAb，包含已显示能够高水平细胞表面表达的原始长的IgG4-Fc‘铰链-CH2-CH3’间隔子，或截短的中等的‘铰链-CH3’和短的‘只有铰链’间隔子变体的ROR1嵌合受体修饰的T细胞的功能。基于灵活的间隔子为从T细胞膜上分离scFV并且允许识别肿瘤细胞上抗原所必需的以前数据，我们在我们短的间隔子构建体中保存12个AA铰链结构域(Fitzer-Attas CJ等，利用Syk家族酪氨酸激酶作为可变的结构域受体的嵌合单链的信号转导结构域：用于T细胞活化最佳的设计。J Immunol.1998；160(1):145-54.Epub 1998/04/29)。
我们对2A2ROR1嵌合受体的研究显示与长的间隔子构建体相比，具有中等和短的间隔子构建体在肿瘤细胞识别后T细胞细胞因子分泌和增殖方面优越。抗F(ab)Abs染色显示所有三种受体的相等的嵌合受体表达，这证明具有短的间隔子嵌合受体的改善的T细胞的功能不归因于嵌合受体密度的差异。这一数据支持细胞外间隔子的设计应为每一靶分子和表位量身订做的原则。
选择用于设计嵌合受体的scFV亲和力是可能影响T细胞识别的额外的参数。我们产生和表征了一组不同亲和力的ROR1特异的mAb并且选择R12mAb，其如2A2识别Ig样/卷曲的区域中的表位。由于低得多的分离，R12对ROR1蛋白具有更高的亲和力。R12嵌合受体，像2A2嵌合受体当与短的细胞外间隔子一起设计时赋予了最佳的T细胞识别和功能。2A2和R12嵌合受体修饰的T细胞结合肿瘤后增殖和细胞因子产生的直接比较证明衍生自较高亲和力mAb的R12嵌合受体为优越的。我们关心的是R12从ROR1较慢的分离可能延长T细胞活化并且赋予了增强的AICD易感性。然而，我们检测到与2A2相比，R12ROR嵌合受体修饰的T细胞中AICD的速率更慢，这证明增加的R12亲和力对T细胞在我们的临床前模型中存活没有不利的影响。
ROR1具有比CD19潜在的优势，作为CLL和MCL的靶标，因为它不表达在正常成熟的初始和记忆B细胞上。然而，与CD19相比，B细胞肿瘤上ROR1分子数量较低并且不确定优化的ROR1嵌合受体是否与设计中相似的CD19嵌合受体一样对临床中所用的那些有效。不幸的是，以前所用的NSG小鼠中用来评估包括Raji，Daudi和Nalm-6的CD19嵌合受体T细胞的功能的B细胞肿瘤异种移植模型不是衍生自CLL或MCL并且不能组成型表达ROR1。因此，为比较体内靶向CD19和ROR1，我们使用JeKo-1MCL细胞系，其天然地表达CD19和ROR1和NSG小鼠的移植物。为制作我们的临床相关的模型，我们通过静脉注射接种JeKo-1淋巴瘤细胞从而产生全身的肿瘤并且一旦确立肿瘤就用均一一致性的T细胞产物处理小鼠。我们发现表达高亲和力R12嵌合受体的T细胞与CD19嵌合受体的T细胞一样赋予了相等的体内抗肿瘤活性。与我们的体外分析一致，与最佳的2A2ROR1嵌合受体相比，R12ROR1嵌合受体也介导优越的体内活性。这些结果都应谨慎地解释因为小鼠肿瘤模型可能不预测过继治疗在临床环境中的效力。然而，结果提示保证考虑ROR1作为CD19的替换物，或提供额外的靶标从而使CD19缺失变体出现的潜在性最小化。
ROR1好像在一些上皮性肿瘤的存活中发挥了决定性的作用。因此靶向ROR1的优势为单一的嵌合抗体可用于治疗大量患有血液系统和非血液系统肿瘤的患者。
我们的数据首次显示了表达设计的ROR1嵌合受体的T细胞体外有效地识别上皮性肿瘤。ROR1+乳腺癌细胞所诱导的细胞因子分泌和T细胞增殖高于白血病细胞所诱导的细胞因子分泌和T细胞增殖，尽管缺乏CD80/86共刺激配体。本文报道的研究证明了细胞外间隔子结构域和嵌合受体亲和力的设计为可以调控增强嵌合受体修饰的T细胞体外和体内对ROR1+血液系统和上皮性肿瘤的识别的参数。具有增强的肿瘤反应性的ROR1嵌合受体研发为各种人类肿瘤的临床应用提供了机会。
实施例2
具有Her2特异性嵌合受体识别位于靠近肿瘤细胞膜的表位的细胞外间隔子结构域长度对引起肿瘤细胞溶解的影响。
使用以上所述的与ROR1相似的方法，检查CAR间隔子长度对识别和引起表达HER2特异的嵌合抗体的CD8+人T淋巴细胞对肿瘤细胞识别的影响。使用HER2特异的mAb的VL和VH链节段构建HER2特异性嵌合受体，其识别HER2上靠近膜的表位(图12A)，并且scFv与IgG4铰链/CH2/CH3，IgG4铰链/CH3，和IgG4只有铰链细胞外间隔子结构域和CD28跨膜结构域，4-1BB和CD3ζ信号转导结构域连接(图12B)。用每一HER2嵌合受体转导初始CD8+T细胞并且选择EGFR转导标记的表达(图12D)。通过蛋白印迹法确认HER 2嵌合受体的表达和每一受体的大小(图12C)。然后用抗CD3mAb和饲养细胞扩增T细胞并且检验它们识别HER2+肿瘤细胞的能力。如对R11ROR 1特异性嵌合受体所观察到的，包含长的细胞外间隔子结构域的HER2嵌合受体赋予了优越的HER2+肿瘤细胞的T细胞识别(图12E)。
讨论
细胞外间隔子长度对肿瘤细胞的嵌合受体修饰的T细胞识别影响的这一实施例使用包含建造于赫赛汀嵌合mAb的VH+L序列的scFv的嵌合受体。Cho等(Nature 421:756，2003)研究定位于赫赛汀的表位位置在HER2(ERRB2)细胞外结构域上靠近膜的位置(图12A)。基于我们对人IgG4铰链:Fc变体结构的理解(图12B)，我们假设表达编码长的间隔子的嵌合受体的效应T细胞最佳地识别细胞外肿瘤细胞抗原上靶标表位的靠近膜的位置。我们数据展示了细胞溶解活性的梯度，从最后面的表达短的间隔子赫赛汀嵌合受体的T细胞的活性，到表达中等长度的间隔子嵌合受体的T细胞的中等的活性，和表达长的间隔子嵌合受体的T细胞最大的溶解。因此，细胞外间隔子对T细胞识别肿瘤具有决定性影响，并且这一数据进一步提供了需要基于靶分子表达肿瘤的表位位置量体定制嵌合受体设计的支持。
实施例3
定制用于具有嵌合受体修饰的T细胞CD19的最佳的识别和体内效力的间隔子长度和序列
材料和方法
受试者
从签署参与癌症研究中心的机构审查委员会(FHCRC)批准的研究方案知情同意书的健康供体获取血液样品。通过离心聚蔗糖-泛影葡胺分离外周血单核细胞(PBMC)(Sigma，St.Louis，MO)，并且冷藏保存在RPMI，20％人血清和10％二甲亚砜中。
细胞系
K562，Raji，JeKo-1和293T细胞系获取自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)(Manassas，VA)并且如所示培养。编码T2A序列和eGFP上游的ffluc基因的慢病毒产生于293T细胞中并且用于转导Raji和JeKo-1肿瘤细胞。在慢病毒转导和eGFP阳性亚型分选纯化后扩增Raji和JeKo-1细胞。
免疫表型
用一个或多个下列偶联的单克隆抗体染色PBMC和T细胞系：CD3，CD4，CD8，CD25，CD45RA，CD45RO，CD62L，CD69和匹配的同型对照(BD Biosciences)。通过制造商所示进行用于活的/死的细胞辨别的碘化丙啶染色(PI，BD Biosciences)。在FACSCanto上进行流式细胞术，在FACSAriaII(Becton Dickinson)上进行分选纯化，并且使用FlowJo软件分析数据(Treestar)。
载体构建和编码CD19嵌合受体的慢病毒的制备
使用(1)CD19特异的mAb FMC63(SEQ ID NO:3)的VL和VH链节段，通过(G4S)3连接体(SEQ ID NO:12)肽连接(VL-连接体-VH)；(2)包含铰链-CH2-CH3部分(229个AA，(SEQ ID NO:))或只有铰链(12个AA；(SEQ ID NO:4))衍生自IgG4-Fc(通用蛋白质资源数据库:P01861，(SEQ ID NO:13))的间隔子结构域，构建CD19特异性嵌合受体。两个间隔子都包含位于初始IgG4-Fc蛋白的位置108处铰链结构域内的S→P取代；(3)人CD28的27个AA跨膜结构域(通用蛋白质资源数据库:P10747，(SEQ ID NO:14))；(4)包含(i)人CD28的41个AA胞质结构域，具有位于初始CD28蛋白的位置186-187处LL→GG取代(SEQ IDNO:14)；和/或(ii)人4-1BB的42个AA胞质结构域((通用蛋白质资源数据库:Q07011，(SEQ ID NO:15))；连接到(iii)人CD3ζ的同种型3的112个AA胞质结构域(通用蛋白质资源数据库:P20963，(SEQ ID NO:16))；自切割的T2A序列(SEQ ID NO:8)；和(6)截短的表皮生长因子受体(EGFR)序列(SEQ ID NO:9)的信号转导模块。
合成编码每一转基因的密码子优化的核苷酸序列(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)并且使用NheI和Not1限制位点将其克隆到epHIV7慢病毒载体。通过用EF-1启动子置换pHIV7的巨细胞病毒启动子，epHIV7慢病毒载体衍生自pHIV7载体。
在与慢病毒载体和包装载体pCHGP-2，pCMV-Rev2和pCMV-G共转染的293T细胞中产生编码CD19嵌合受体或tEGFR的慢病毒。转染后16小时更换培养基，24，48和72小时后收集慢病毒。
表达CD19嵌合受体的T细胞系的产生
根据制造商说明书，用抗CD3/CD28珠(Life Technologies)活化健康供体的分选纯化的CD8+CD45RA-CD45RO+CD62L+中心记忆T细胞(TCM)，活化后第3天通过在32℃下以2,100rpm离心45分钟用添加了1μg/mL聚凝胺的慢病毒上清液(MOl＝3)将其转导。在RPMl，10％人血清，2mM左旋谷氨酰胺和1％盘尼西林-链霉素(CTL培养基)中扩增T细胞，每48小时添加重组的人(rh)lL-2达到最终浓度50U/mL。扩增后，用生物素偶联的抗EGFR(表皮生长因子)抗体和链霉亲和素珠(Miltenyi)染色每一份转导的T细胞系，并且通过免疫磁珠选择分离tEGFR+T细胞。
然后用辐照的(8,000rad)TM EBV-LCL，以T细胞:LCL比率1:7，刺激tEGFR+T细胞亚型，并且在CTL培养基中扩增8天，每48小时添加50U/mL IL-2。
铬释放，细胞因子分泌和CFSE增殖测定
用51Cr(PerkinElmer)标记靶细胞过夜，洗涤并且一式三份地以1-2×l03个细胞/孔孵育各种效应细胞与靶细胞(E:T)比率的效应T细胞。4小时孵育后收获上清液用于γ计数并且使用标准的公式计算特异的溶解。为了细胞因子分泌的分析，一式三份地，以E:T比率2:1(Raji)或4:1(K562/CDI9和K562)/孔平板培养靶细胞和效应细胞，通过24小时孵育后移除的上清液中多重细胞因子免疫测定(Luminex)测量INF-γ，TNF-α，IL-2，IL-4，IL-6和IL-10。
为了增殖的分析，用0.2μM琥珀酰亚胺酯(CFSE，Invitrogen)标记T细胞，洗涤并且一式三份地在没有外源性细胞因子的CTL培养基中以2:1(Raji)或4:1(K562/CD19和K562)比率与刺激物细胞一起平板培养。72小时孵育后，用抗CD3mAb和碘化丙啶(PI)标记细胞以便从分析中除外死细胞。通过流式细胞术分析样品和通过CFSE稀释法评估活的CD3+T细胞的细胞分裂。
NOD/SCID和NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠中实验
机构动物嵌合受体和使用委员会批准所有小鼠实验。6-8周龄雌性NOD.CBI7-Prkdcscid/J(NOD/SCID)和NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtmlWjl/SzJ(NSG)小鼠获取自杰克逊实验室或内部繁殖(FRCRC)。用0.5×106个JeKo-1/ffluc肿瘤细胞经由尾静脉静脉内(i.v.)注射小鼠并且小鼠接受嵌合受体修饰的T细胞，对照T细胞，或PBS如所示的经由尾静脉注射。
为了肿瘤生长的生物发光成像，小鼠接受再悬浮在PBS中新鲜制备的荧光素底物(Caliper Life Sciences，MA)的腹腔内(i.p.)注射(15μg/g体重)。然后在诱导箱中用异氟烷麻醉小鼠并且在深度麻醉诱导后，i.p.荧光素注射后10，12和14分钟，以小分级模式，在1秒-1分钟的采集时间，使用Xenogen IVIS成像系统(Caliper Life Sciences，MA)使其成像从而获得未饱和的图像。使用Living Image软件(Caliper)和所分析的包括每一个体小鼠的整体或胸腔的感兴趣的区域内光子通量分析荧光素酶活性。
统计分析
使用Prism软件(GraphPad，CA)进行统计分析。进行双侧检验，95％置信区间的学生t检验并且p值结果p<0.05认为是有意义的。使用对数秩和(log-rank)检验进行统计分析并且p值结果p<0.05认为是有意义的。
结果
具有长的和短的细胞外间隔子的表达CD19嵌合受体多克隆的CD8+TCM衍生的细胞系的制备
我们构建编码一组密码子优化的CD19嵌合受体基因的个体的慢病毒载体用以检验细胞外间隔子长度对CD19嵌合受体修饰的T细胞的体外功能和体内抗肿瘤活性的影响。每一嵌合受体包括对应于CDl9特异的mAb FMC63的序列的单链可变片段(scFv:VL-VH)，衍生自IgG4-Fc包括'铰链-CH2-CH3'结构域(229个AA，长的间隔子)或'只有铰链'结构域(12个AA，短的间隔子)的间隔子，单独地或近膜的CD28或4-1BB共刺激结构域与CD3ζ串联的信号转导模块(图13A)。转基因盒包括来自于嵌合受体基因的截短的EGFR(tEGFR)下游，通过可裂解的T2A元件分开，从而用作嵌合受体修饰的T细胞的转导，选择和体内示踪标记。
我们通过细胞分选从健康供体的血液分离CD8+CD45RO+CD62L+中心记忆T细胞(TCM)群用于转导和扩增，因为过继转移后TCM体内存留的优越的能力。用抗CD3/28珠刺激CD8+T细胞，用每一慢病毒载体转导，并且在用于体外和体内实验之前培养扩增18天。(图13B)每一慢病毒载体实现相似的转导效率(平均25％)并且使用生物素化的抗EGFRmAb和链霉亲和素珠，通过免疫磁珠选择富集均一纯度的转基因阳性的T细胞。tEGFR富集后，通过CD19+B-LCL的单一刺激扩增每一CD19嵌合受体T细胞系，表达各种CD 19嵌合受体构建体的T细胞系间体外生长动力学没有明显的区别。扩增后，在>90％的每一载体转导的T细胞上等价水平地表达tEGFR标记(图13C)。
具有长的和短的细胞外间隔子结构域的CD19嵌合受体赋予了特异的体外抗肿瘤反应性
我们比较修饰表达CD19嵌合受体与CD2和4-1BB共刺激信号转导部分的，分别具有短的('短的/CD28'；'短的/4-1BB')或长的('长的/CD28'；'长的/4-1BB')细胞外间隔子结构域的TCM衍生的T细胞系的效应功能。表达4个CD19嵌合受体构建体中每一个的T细胞赋予了特异的抗CD19+Raji和JeKo-l淋巴瘤细胞，和抗CD19稳定转染的但不是初始CD19-K562细胞的K562细胞的细胞溶解活性(图14A)。通过多重细胞因子测定(Luminex)，响应K562/CD19或Raji肿瘤细胞刺激所产生细胞因子的定量分析显示表达每一CD19嵌合受体的T细胞产生的IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-4，IL-6和IL-10(图14B)。产生了与具有4-1BB共刺激结构域构的对应的构建体相比，表达CD19嵌合受体具有CD28共刺激结构域的T细胞显著高水平的IFN-γ，TNF-α，IL-2和IL-10(图14B，C)。与表达短的'短的/CD28'嵌合受体的那些相比，表达CD19'长的/CD28'嵌合受体的T细胞产生显著高水平的IFN-γ和显著低水平低的IL-4。在具有4-1BB共刺激信号转导模块的CD19嵌合受体中，我们检测到表达具有短的间隔子结构域的构建体的T细胞中分泌显著高水平的IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-4和IL-10(图14B,C)。
我们使用CFSE染料稀释法分析结合CD 19+肿瘤细胞后每一CD19嵌合受体修饰的T细胞的增殖。用K562/CD19或Raji刺激后72小时观察到每一CD19嵌合受体T细胞系的特异的和强有力的增殖。与具有4-1BB的那些相比，具有CD28共刺激结构域的CD19嵌合受体T细胞的细胞分裂平均数更高，与表达CD28包含嵌合受体的T细胞产生的高水平的IL-2一致(图14B-D)。通过与CD3+和PI一起培养共染色，我们也分析在K562/CD19和Raji肿瘤细胞刺激后72小时结束时经历活化诱导的细胞死亡的嵌合受体T细胞的比例。我们检测到CD19嵌合受体细胞系'长的/4-1BB'中CD3+CD8+PI+T细胞的高频率，但是在具有其他CD19嵌合受体几乎观察不到PI+细胞(图14E)。
比较CD28和4-1BB共刺激结构域的体外效应功能的这一分析与以前的研究一致，没有揭示T细胞功能的差异，这提示来自这组特定的CD19嵌合受体构建体缺乏体内抗肿瘤效力。
在免疫缺陷小鼠模型中，具有短的细胞外间隔子结构域但不是长的细胞外间隔子结构域的表达CD19嵌合受体T细胞消除Raji肿瘤
我们下一步评估移植了萤火虫荧光素酶转染的Raji细胞(Raji-ffluc)免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠中每一CD19嵌合受体修饰的T细胞的体内抗肿瘤效力，其使用生物发光成像能够连续的定量分析肿瘤负荷和分布。经由尾静脉注射0.5×106个Raji-ffluc细胞接种的NOD/SCID小鼠发展为播散性淋巴瘤，如果对其不处理就会引起大约3.5周后后肢瘫痪，迫使对其安乐死。用每一CD19嵌合受体修饰的CD8+TCM-衍生的T细胞或或肿瘤接种后第2天和第9天给予的tEGFR对照载体的2个剂量处理荷瘤小鼠(图15A)。
令人惊奇地，在这一模型中只有修饰表达具有短的细胞外间隔子结构域('短的/CD28'和'短的/4-1BB')CD19嵌合受体的T细胞消除Raji肿瘤，而用具有长的间隔子('长的/CD28'和'长的/4-1BB')表达CD19嵌合受体T细胞处理的小鼠发展为全身性淋巴瘤并且后肢瘫痪，具有与未处理的小鼠或用对照tEGFR+T细胞处理的小鼠接近一致的动力学(图15B，C)。具有短的和长的间隔子结构域CD19嵌合受体之间抗肿瘤活性突出的差异是高度显著的，并且在来自3个不同的健康供体所产生的嵌合受体T细胞系多个实验中是可重现的。
NOD/SCID淋巴瘤模型对预测临床环境中抗肿瘤活性是次最优的，因为在肿瘤接种和T细胞给予之间的短间隔和与多个免疫缺陷小鼠株诸如NOD/SCID/γc-/-(NSG)相比对人细胞移植的抗性更大。因此，我们在更有临床相关性的模型中评估过继治疗的抗肿瘤活性，其中在NSG小鼠中建立Raji-ffluc淋巴瘤，并且当通过生物发光成像易于在骨髓中检测到肿瘤时7天后给予CD19嵌合受体T细胞(图16A)。我们进行初始剂量滴定实验以便检测CD19'短的/4-1BB'嵌合受体转导的T细胞消除已建立的Raji肿瘤所必需的最小剂量。表达CD19嵌合受体'短的/4-1BB'的2.5×106个T细胞的单一剂量促进已建立的Raji肿瘤的完全消退并且导致100％小鼠长期无瘤存活(图16B,C)。在2.5×106个细胞剂量水平，过继转移随后至少3周在NSG小鼠的外周血中容易地检测到T细胞和肿瘤消除。因此，这一模型能够用于我们组中每一CD19嵌合受体修饰的T细胞的抗肿瘤活性和存留的比较研究(图16D)。
然后我们用单独的PBS，单一剂量2.5×106个表达每一CD19嵌合受体的T细胞或tEGFR编码对照载体修饰的T细胞处理移植了Raji淋巴瘤的NSG小鼠群(图17A)。在已建立了淋巴瘤的这种模型中，具有短的细胞外间隔子结构域和4-1BB或CD28共刺激结构域(‘短的/CD28'和'短的/4-1BB')表达CD19嵌合受体的T细胞介导经过7-10天完全的肿瘤消退并且所有小鼠无瘤存活>56天。相比之下，用修饰表达具有长的间隔子结构域('长的/CD28'和'长的/4-1BB')CD19嵌合受体的T细胞处理的小鼠展示了肿瘤进展和不得不在与接受对照tEGFR T细胞的小鼠相似的时间时牺牲小鼠(图17B，C)。考虑到表达这些构建体的T细胞体外溶解肿瘤细胞的能力，与4-1BB构建体相比表达'长的/CD28'CD19嵌合受体T细胞结合后增强IL-2产生和增殖，不期望具有长的间隔子的嵌合受体构建体的体内康肿瘤效力的缺乏。
为提供深刻理解效力缺乏的基础，我们进行在T细胞输注后不时在小鼠的外周血样品上进行连续的流式细胞术。用表达对应的具有长的细胞外间隔子的T细胞处理的小鼠相比，过继转移后所有用表达'短的/CD28'和'短的/4-1BB'CD19嵌合受体的T细胞处理的小鼠具有在所有时间点血液中显著高水平的转移的T细胞(p<0.01)(图17D)。在接受具有CD28或4-1BB共刺激结构域和短的间隔子结构域表达CD19嵌合受体的T细胞的小鼠的外周血中我们没有观察到T细胞抗性的显著差异(图17D)。
具有长的间隔子CD19嵌合受体的体内抗肿瘤效力没有被增加T细胞剂量或提供额外的共刺激结构域所改善
具有长的间隔子结构域CD19嵌合受体修饰的T细胞处理的小鼠中体内抗肿瘤效力的缺乏和存留嵌合受体T细胞的低水平，提示效力可能被增加嵌合受体T细胞剂量或嵌合受体中包括CD28和4-IBB结构域从而增强共刺激信号转导所改善。为评估这种可能性，我们用'长的/CD28'，'短的CD28'和'长的/CD28_4-1BB'CD19嵌合受体载体修饰CD8+TCM并且确认长的/CD28_4-1BB'CD19嵌合受体赋予了CD19+靶细胞识别后体外特异的溶解和细胞因子产生(图18A-C)。与CD19嵌合受体以前的研究一致，与具有单独的CD28的相同的构建体相比，表达CD28_4-IBB'CDI9嵌合受体T细胞的细胞因子产生水平和体外增殖是差的，与表达'长的4-IBB'CD19嵌合受体的T细胞相比，表达CD28_4-IBB'CDI9嵌合受体T细胞的细胞因子产生水平和体外增殖是优越的(图18B，C)。
然后用高剂量的T细胞(10×106个)或表达长的/CD28'CD19嵌合受体的T细胞，表达'长的/CD28_4-IBB'CDI9嵌合受体的T细胞，表达'短的/CD28'CD19嵌合受体的T细胞，和单独的tEGFR处理已建立Raji肿瘤的NSG小鼠组。通过生物发光成像测量肿瘤负荷并且进行外周血样品的连续的流式细胞术以检测转移的T细胞的频率。与我们使用低得多的T细胞剂量的实验的结果一致，Raji肿瘤在用表达'短的/CD28'CD19嵌合受体的T细胞处理的小鼠中完全地消退。然而，甚至是高于4倍的T细胞剂量，表达'长的/CD28'CD19嵌合受体或'长的/CD28_4-1BB'CD19嵌合受体的T细胞的处理没有提供可辨别的抗肿瘤效应(图18D,E)。
因此，增加嵌合受体T细胞剂量和添加4-1BB共刺激结构域到CD19嵌合受体都未能克服长的间隔子结构域对体内抗肿瘤活性的负性影响。因此，在这种模型中，CD19嵌合受体的抗肿瘤反应性在很大程度上受细胞外间隔子结构域的长度但不是细胞内共刺激信号转导模块所指挥。
拥有长的细胞外间隔子的CD19嵌合受体修饰的T细胞经历体内细胞活化诱导的细胞死亡
我们力图确定潜藏在具有长的间隔子结构域表达CD19嵌合受体的T细胞的体内抗肿瘤活性差的潜在机制。因为，存在于血液中修饰表达具有长的间隔子结构域表达CD19嵌合受体的转移的T细胞的量很少，我们考虑T细胞体内不能被肿瘤细胞有效地活化或相反地的可能性为它们经历了体内细胞活化诱导的T细胞死亡。因此，我们用CFSE标记CD19嵌合受体修饰的和相应对照的T细胞并且将这些T细胞给予荷瘤NSG/Raji小鼠从而检验每一CD19嵌合受体构建体修饰的T细胞在体内肿瘤部位处活化，增殖和存活(图19A)。在它们的体外扩增结束时，CFSE标记之前当下和输注到建立了Raji肿瘤的NSG小鼠中，每一CD19嵌合受体转导的T细胞表达低水平的活化标记CD69和CD25(图19B)。
骨髓获取自T细胞输注后24和72小时小鼠亚群以检验转移的T细胞的频率，活化和增殖。24小时时，肿瘤细胞(CD45+CD3-)存在于所有处理组的骨髓中并且大部分的嵌合受体T细胞，但不是对照T细胞，上调CD69和CD25。在转移的嵌合受体T细胞中没有可测量的CFSE稀释(图19C)。高比例的长的间隔子'CD19嵌合受体修饰的T细胞表达CD69和CD25，这提示与具有'短的间隔子'CD19嵌合受体T细胞相比这些细胞可能接受了更强烈的刺激(图__C)。虽然有24小时T细胞活化的证据，但是与CD28和4-IBB'短的间隔子'构建体修饰的那些相比，或与对照tEGFR载体修饰的那些相比，在用CD28和4-IBB'长的间隔子'构建体修饰的T细胞处理的小鼠的骨髓中存在显著低的嵌合受体T细胞数量(图19C，E)。
T细胞转移后72小时时，骨髓和脾脏中表达'短的/CD28'和'短的/4-lBB'CD19嵌合受体的T细胞具有增加3->10倍的频率，已经历了几次细胞分裂(图19D,E)。在72小时时，对照tEGFR+T细胞仍然以与在24小时时观察到相似的水平存在于骨髓和脾脏中，如通过CFSE稀释法没有测到分裂。相比之下，骨髓和脾脏中表达'长的/CD28'和'长的/4-IBB'CD19嵌合受体的T细胞的数量没有增加(图19D，E)。与低的细胞数量一致，可变的PI-'长的/CD28'和'长的/4-IBB'CDl9嵌合受体T细胞中CFSE染色的分析显示'与短的/CD28'和短的/4-IBB'CDl9嵌合受体T细胞相比，这些细胞经历了低得多的细胞分裂数量。(图19D)当分析包括PI+T细胞的流量数据时，我们检测到在接受具有'长的间隔子结构域CD19嵌合受体T细胞的小鼠的骨髓和脾脏中高得多PI+CD3+T细胞的频率，这证明了虽然在体内被肿瘤活化，相当比例的T细胞经历了细胞死亡(图19F)。与生物发光成像一致，与用具有短的间隔子结构域CD19嵌合受体处理的小鼠相比，用具有长的间隔子结构域CD19嵌合受体或只表达tEGFR的T细胞处理的小鼠的骨髓中CD45+CD3-Raji肿瘤细胞的数量更多(图19D，E，G)。
总而言之，数据提供了证据：虽然介导等价的或优越的体外效应功能和体内识别肿瘤，具有长的细胞外间隔子结构域的CD19嵌合受体体内诱导高水平的活化诱导的细胞死亡并且不能消除已建立的淋巴瘤。
讨论
嵌合受体为包括细胞外抗原结合scFv，提供scFv与细胞膜分离的间隔子和介导T细胞活化的细胞内信号转导模块的人造受体。包含本文研究的衍生自CD19特异的FMC63mAb scFv的嵌合受体已发展到在患有B细胞恶性肿瘤的患者中临床试验中检验。抗肿瘤活性和T细胞存留在不同的试验中差异很大。这些临床试验的每一个在潜在地临界变量方面不同，包括不同的基因转移载体，细胞培养方法，和在CD19嵌合受体T细胞转移之前预处理方案。
我们检验独立于嵌合受体所提供的共刺激信号转导，嵌合受体的细胞外间隔子结构域是重要的体内抗肿瘤活性的决定因素的可能性。我们从IgG4-Fc衍生间隔子结构域，与其他IgG同种型相比，这能够使嵌合受体细胞表面表达高水平并且较少可能地引起被固有免疫细胞识别。我们在长的(229个AA)间隔子构建体的设计中使用IgG4‘铰链-CH2-CH3’并且在我们短的(12个AA)间隔子嵌合受体中使用IgG4‘铰链’结构域。为比较个体的嵌合受体构建体，我们使用纯化的(>90％)嵌合受体阳性的CD8+TCM–衍生的T细胞以便去除作为体外和体内功能分析中潜在的偏差来源，在细胞组合物和转导频率方面的差异。与血液中其他更为普遍的存留不良并且在肿瘤治疗中无效的T细胞亚型相比，CD8+TCM显示了具有优越的过继免疫治疗特性。使用与用于衍生用于临床试验嵌合受体T细胞相似的标准的培养方案产生CD19嵌合受体T细胞。我们的数据显示具有短的IgG4‘铰链’间隔子的CD19嵌合受体赋予了强有力的体外和体内抗肿瘤反应性，而相应的具有长的间隔子IgG4‘铰链-CH2-CH3’CD19嵌合受体，虽然有相等的或优越的体外反应性，在小鼠淋巴瘤模型中不能赋予显著的抗肿瘤效应。令人惊奇地，间隔子结构域的长度被证明为体内抗肿瘤活性的决定性要素，‘长的间隔子’嵌合受体效力的缺乏不能随着增加T细胞剂量而克服。
我们也观察到在包含CD28和4-1BB共刺激结构域表达CD19嵌合受体的T细胞之间细胞因子分泌和增殖方面主要的差异，与包含4-1BB共刺激结构域表达CD19嵌合受体的T细胞相比，包含CD28共刺激结构域表达CD19嵌合受体的T细胞增加IFN-γ，IL-2和TNF-α的分泌。与只编码4-1BB的嵌合受体相比，拥有串联的CD28_4-1BB的CD19嵌合受体也产生了更高水平的这些细胞因子。然而，我们的数据显示这些在体外功能中的差异不能预测体内抗肿瘤效力，因为具有CD28或4-1BB共刺激结构域和短的间隔子的CD19嵌合受体在NSG小鼠中相似有效地消除进展的已建立的Raji肿瘤。与此相反，具有次最优的间隔子长度和CD28、4-1BB，或这两个共刺激结构域的CD19嵌合受体，虽然赋予了与相同的具有短的间隔子结构域的嵌合受体构建体相似的体外功能，缺乏显著的体内抗肿瘤活性，这证明了间隔子长度对嵌合受体T细胞的体内功能的贡献。
我们的研究提供了深刻理解为具有长的间隔子结构域的CD19嵌合受体的体内效力缺乏负责的机制。过继转移到已建立Raji淋巴瘤的荷瘤NSG小鼠后，在骨髓和脾脏中都可以检测到表达具有长的和短的间隔子结构域的CD19嵌合受体的T细胞，并且如通过CD25和CD69上调的展示，大多数被活化。然而，修饰表达具有长的间隔子结构域CD19嵌合受体的T细胞细胞数目显示锐减，与此形成对照的是具有短的间隔子结构域的表达CD19嵌合受体的T细胞体内扩增的标记。与具有短的间隔子结构域的T细胞相比，和不表达CD19嵌合受体的对照T细胞相比，T细胞数目的下降是过继转移后前72小时高得多的细胞死亡水平的结果。这些数据共同地指出体内肿瘤细胞的识别导致了具有长的间隔子结构域表达CD19嵌合受体的T细胞的死亡。相似的机制可解释在应用长的间隔子CD19嵌合受体(14)的临床试验中T细胞短期存留和低水平。
本文报道的研究首次显示缺乏内在信号转导特性的CD19嵌合受体的间隔子结构域独立于共刺激信号转导对体内抗肿瘤活性具有惊人的影响，并且鉴定了分析在用于临床应用的嵌合受体的设计中这一区域最佳的组合物的重要性。
上文为本发明的例证，不应解释为其限制。通过下列的权利要求确定本发明，与权利要求的等同物包含在本文中。通过引用所有参考文献和本文所提及的文档并入本文。
表1
抗CD19短的间隔子嵌合受体的序列
GMCSFRss-CD19scFv-IgG铰链-CD28tm-41BB-ζ-T2A-EGFRt
Atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatcccc(GMCSFRss)(SEQ ID NO:2)
Gacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagc(CD19scFv)(SEQ ID NO:3)
Gaatctaagtacggaccgccctgccccccttgccct(IgG4铰链)(SEQ ID NO:4)
Atgttctgggtgctggtggtggtcggaggcgtgctggcctgctacagcctgctggtcaccgtggccttcatcatcttttgggtg(CD28tm-)(SEQ ID NO:5)
Aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg
(41BB)(SEQ ID NO:6)
Cgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaagg(CD3ζ)-(SEQ ID NO:7)
Ctcgagggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctagg(T2A)(SEQ ID NO:9)
Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacgcaaagtgtgtaacggaataggtattggtgaatttaaagactcactctccataaatgctacgaatattaaacacttcaaaaactgcacctccatcagtggcgatctccacatcctgccggtggcatttaggggtgactccttcacacatactcctcctctggatccacaggaactggatattctgaaaaccgtaaaggaaatcacagggtttttgctgattcaggcttggcctgaaaacaggacggacctccatgcctttgagaacctagaaatcatacgcggcaggaccaagcaacatggtcagttttctcttgcagtcgtcagcctgaacataacatccttgggattacgctccctcaaggagataagtgatggagatgtgataatttcaggaaacaaaaatttgtgctatgcaaatacaataaactggaaaaaactgtttgggacctccggtcagaaaaccaaaattataagcaacagaggtgaaaacagctgcaaggccacaggccaggtctgccatgccttgtgctcccccgagggctgctggggcccggagcccagggactgcgtctcttgccggaatgtcagccgaggcagggaatgcgtggacaagtgcaaccttctggagggtgagccaagggagtttgtggagaactctgagtgcatacagtgccacccagagtgcctgcctcaggccatgaacatcacctgcacaggacggggaccagacaactgtatccagtgtgcccactacattgacggcccccactgcgtcaagacctgcccggcaggagtcatgggagaaaacaacaccctggtctggaagtacgcagacgccggccatgtgtgccacctgtgccatccaaactgcacctacggatgcactgggccaggtcttgaaggctgtccaacgaatgggcctaagatcccgtccatcgccactgggatggtgggggccctcctcttgctgctggtggtggccctggggatcggcctcttcatgtga(EGFRt)(SEQ ID NO:9)
表2
表3
ZXR-014核苷酸和氨基酸序列(部分示意图)
GMCSFRss:nt2084-2149
CD19scFv:nt2150-2884
Igg4铰链:nt2885-2920
CD28tm:nt2921-3004
41BB:nt3005-3130
ζ:nt3131-3466
T2A:nt3467-3538
EGFRt:nt3539-4612
用于测序的引物：
表4 通用蛋白质资源P0861IgG4-Fc(SEQ ID NO:13)
1-98 CH1
99-110 铰链
111-220 CH2
221-327 CH3
位置 108S→P
表5 通用蛋白质资源P10747CD28(SEQ ID NO:14)
1-18 信号肽
19-152 胞外结构域
153-179 跨膜结构域
180-220 胞内结构域
位置186-187 LL→GG
表6 通用蛋白质资源Q070114-1BB(SEQ ID NO:15)
1-23 信号肽
24-186 胞外结构域
187-213 跨膜结构域
214-255 胞内结构域
表7 通用蛋白质资源P20963人CD3ζ同种型3(SEQ ID NO:16)
1-21 信号肽
22-30 胞外结构域
31-51 跨膜区
52-164 胞内结构域
61-89 ITAM1
100-128 ITAM2
131-159 ITAM3
表8 示例性铰链区序列
表9
R12长间隔子CAR:PJ_R12-CH2-CH3-41BB-Z-T2A-tEGFR(SEQ IDNO:37)
GTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAGGTCAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAGAACATCCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTGATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGATCTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGGGATCAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACG
GAATTCCTCGAGGCC
ACCCTGCTGCTGGTGACAAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATCCCCCAGGAACAGCTCGTCGAAAGCGGCGGCAGACTGGTGACACCTGGCGGCAGCCTGACCCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTTCGACTTCAGCGCCTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGATCGCCACCATCTACCCCAGCAGCGGCAAGACCTACTACGCCACCTGGGTGAACGGACGGTTCACCATCTCCAGCGACAACGCCCAGAACACCGTGGACCTGCAGATGAACAGCCTGACAGCCGCCGACCGGGCCACCTACTTTTGCGCCAGAGACAGCTACGCCGACGACGGCGCCCTGTTCAACATCTGGGGCCCTGGCACCCTGGTGACAATCTCTAGCGGCGGAGGCGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGATCTGAGCTGGTGCTGACCCAGAGCCCCTCTGTGTCTGCTGCCCTGGGAAGCCCTGCCAAGATCACCTGTACCCTGAGCAGCGCCCACAAGACCGACACCATCGACTGGTATCAGCAGCTGCAGGGCGAGGCCCCCAGATACCTGATGCAGGTGCAGAGCGACGGCAGCTACACCAAGAGGCCAGGCGTGCCCGACCGGTTCAGCGGATCTAGCTCTGGCGCCGACCGCTACCTGATCATCCCCAGCGTGCAGGCCGATGACGAGGCCGATTACTACTGTGGCGCCGACTACATCGGCGGCTACGTGTTCGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTGACCGGCGAGTCTAAG
IgG4间隔子
TACCCTGCCCCCCTTGCCCT
CH2
GCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAG
CH3
GGCCAGCCTCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCCTCCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAG
4-1BB
ATGTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGGGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
CD3ζ
CGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGGGAAGAGTACGACGTCCTGGATAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCTCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTATCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCAAGG
T2A
GGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGG
tEGFR
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGTGA
TCTAGACCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCATCGATACCGTCGACTAGCCGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAAGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCGTCGAGATCCGGTCGACCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTCGACGGTATCGATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGAATTCGGAGTGGCGAGCCCTCAGATCCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTG
表10
前导_R12-铰链-CH2-CH3-CD28tm/41BB-Z-T2A-tEGFR(SEQ ID NO:38)
前导
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
R12scFv
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铰链间隔子
ESKYGPPCPPCP
CH2
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKKVSNKGLPSSIEKTISKAK
CH3
GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
CD28
MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
4-1BB
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD3ζ
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
T2A
LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
tEGFR
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
表11
R12中等的间隔子CAR:PJ_R12-CH3-41BB-Z-T2A-tEGFR(SEQ IDNO:39)
GTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAGGTCAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAGAACATCCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTGATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGATCTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGGGATCAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACG
GAATTCCTCGAGGCC
R12ScFv
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铰链间隔子
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CH3
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4-1BB
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CD3ζ
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T2A
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tEGFR
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TCTAGACCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCATCGATACCGTCGACTAGCCGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAAGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCGTCGAGATCCGGTCGACCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTCGACGGTATCGATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGAATTCGGAGTGGCGAGCCCTCAGATCCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTG
表12
前导_R12-铰链-CH3-CD28tm/41BB-Z-T2A-tEGFR(SEQ ID NO:40)
前导
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
R12scFV
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铰链间隔子
ESKYGPPCPPCP
CH3
GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
CD28tm
MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
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KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
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RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
T2A
LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
tEGFR
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表13
R12短的间隔子CAR:PJ_R12-铰链-41BB-Z-T2A-tEGFR(SEQ IDNO:41)
GTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAGGTCAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAGAACATCCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTGATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGATCTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGGGATCAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACG
ACCCTGCTGCTGGTGACAAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATCCCCCAGGAACAGCTCGTCGAAAGCGGCGGCAGACTGGTGACACCTGGCGGCAGCCTGACCCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTTCGACTTCAGCGCCTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGATCGCCACCATCTACCCCAGCAGCGGCAAGACCTACTACGCCACCTGGGTGAACGGACGGTTCACCATCTCCAGCGACAACGCCCAGAACACCGTGGACCTGCAGATGAACAGCCTGACAGCCGCCGACCGGGCCACCTACTTTTGCGCCAGAGACAGCTACGCCGACGACGGCGCCCTGTTCAACATCTGGGGCCCTGGCACCCTGGTGACAATCTCTAGCGGCGGAGGCGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGATCTGAGCTGGTGCTGACCCAGAGCCCCTCTGTGTCTGCTGCCCTGGGAAGCCCTGCCAAGATCACCTGTACCCTGAGCAGCGCCCACAAGACCGACACCATCGACTGGTATCAGCAGCTGCAGGGCGAGGCCCCCAGATACCTGATGCAGGTGCAGAGCGACGGCAGCTACACCAAGAGGCCAGGCGTGCCCGACCGGTTCAGCGGATCTAGCTCTGGCGCCGACCGCTACCTGATCATCCCCAGCGTGCAGGCCGATGACGAGGCCGATTACTACTGTGGCGCCGACTACATCGGCGGCTACGTGTTCGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTGACCGGCGAGTCTAAG
铰链/间隔子
TACCCTGCCCCCCTTGCCCT
4-1BB
ATGTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGGGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
CD3ζ
CGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGGGAAGAGTACGACGTCCTGGATAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCTCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTATCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCAAGG
T2A
GGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGG
tEGFR
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGTGA
TCTAGACCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCATCGATACCGTCGACTAGCCGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAAGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCGTCGAGATCCGGTCGACCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTCGACGGTATCGATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGAATTCGGAGTGGCGAGCCCTCAGATCCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTG
表14
前导_R12-CD28tm/41BB-Z-T2A-tEGFR(SEQ ID NO:42)
前导
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
scFv R12
QEQLVESGGRLVTPGGSLTLSCKASGFDFSAYYMSWVRQAPGKGLEWIATIYPSSGKTYYATWVNGRFTISSDNAQNTVDLQMNSLTAADRATYFCARDSYADDGALFNIWGPGTLVTISSGGGGSGGGGSGGGGSELVLTQSPSVSAALGSPAKITCTLSSAHKTDTIDWYQQLQGEAPRYLMQVQSDGSYTKRPGVPDRFSGSSSGADRYLIIPSVQADDEADYYCGADYIGGYVFGGGTQLTVTG
铰链/间隔子
ESKYGPPCPPCP
CD28tm
MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
4-1BB
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD3ζ
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
T2A
LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
tEGFR
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
表15
R11长的间隔子CAR:PJ_R11-CH2-CH3-41BB-Z-T2A-tEGFR(SEQ IDNO:43)
GTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAGGTCAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAGAACATCCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTGATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGATCTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGGGATCAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACG
scFv R12
GAATTCGCCACCCTGCTGCTGGTGACAAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATCCCCCAGAGCGTGAAAGAGTCCGAGGGCGACCTGGTCACACCAGCCGGCAACCTGACCCTGACCTGTACCGCCAGCGGCAGCGACATCAACGACTACCCCATCTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCTGGCAAGGGACTGGAATGGATCGGCTTCATCAACAGCGGCGGCAGCACTTGGTACGCCAGCTGGGTCAAAGGCCGGTTCACCATCAGCCGGACCAGCACCACCGTGGACCTGAAGATGACAAGCCTGACCACCGACGACACCGCCACCTACTTTTGCGCCAGAGGCTACAGCACCTACTACGGCGACTTCAACATCTGGGGCCCTGGCACCCTGGTCACAATCTCTAGCGGCGGAGGCGGCAGCGGAGGTGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGATCCGAGCTGGTCATGACCCAGACCCCCAGCAGCACATCTGGCGCCGTGGGCGGCACCGTGACCATCAATTGCCAGGCCAGCCAGAGCATCGACAGCAACCTGGCCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCACCCTGCTGATCTACAGAGCCTCCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCAGATCTGGCACCGAGTACACCCTGACCATCTCCGGCGTGCAGAGAGAGGACGCCGCTACCTATTACTGCCTGGGCGGCGTGGGCAACGTGTCCTACAGAACCAGCTTCGGCGGAGGTACTGAGGTGGTCGTCAAA
铰链/间隔子
TACCCTGCCCCCCTTGCCCT
CH2
GCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAG
CH3
GGCCAGCCTCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCCTCCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAG
4-1BB
ATGTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGGGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
CD3ζ
CGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGGGAAGAGTACGACGTCCTGGATAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCTCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTATCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCAAGG
T2A
GGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGG
tEGFR
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGTGA
TCTAGACCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCATCGATACCGTCGACTAGCCGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAAGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCGTCGAGATCCGGTCGACCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTCGACGGTATCGATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGAATTCGGAGTGGCGAGCCCTCAGATCCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTG
表16
前导_R11-铰链-CH2-CH3-CD28tm/41BB-Z-T2A-tEGFR(SEQ ID NO:44)
前导
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
R11scFv
QSVKESEGDLVTPAGNLTLTCTASGSDINDYPISWVRQAPGKGLEWIGFINSGGSTWYASWVKGRFTISRTSTTVDLKMTSLTTDDTATYFCARGYSTYYGDFNIWGPGTLVTISSGGGGSGGGGSGGGGSELVMTQTPSSTSGAVGGTVTINCQASQSIDSNLAWFQQKPGQPPTLLIYRASNLASGVPSRFSGSRSGTEYTLTISGVQREDAATYYCLGGVGNVSYRTSFGGGTEVVVK
铰链/间隔子
ESKYGPPCPPCP
CH2
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKKVSNKGLPSSIEKTISKAK
CH3
GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
CD28tm
MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
4-1BB
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD3ζ
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
T2A
LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
tEGFR
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
表17
R11中等的间隔子CAR:PJ_R11-CH3-41BB-Z-T2A-tEGFR(SEQ IDNO:45)
GTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAGGTCAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAGAACATCCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTGATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGATCTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGGGATCAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACG
R11 scFV
GAATTCGCCACCCTGCTGCTGGTGACAAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATCCCCCAGAGCGTGAAAGAGTCCGAGGGCGACCTGGTCACACCAGCCGGCAACCTGACCCTGACCTGTACCGCCAGCGGCAGCGACATCAACGACTACCCCATCTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCTGGCAAGGGACTGGAATGGATCGGCTTCATCAACAGCGGCGGCAGCACTTGGTACGCCAGCTGGGTCAAAGGCCGGTTCACCATCAGCCGGACCAGCACCACCGTGGACCTGAAGATGACAAGCCTGACCACCGACGACACCGCCACCTACTTTTGCGCCAGAGGCTACAGCACCTACTACGGCGACTTCAACATCTGGGGCCCTGGCACCCTGGTCACAATCTCTAGCGGCGGAGGCGGCAGCGGAGGTGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGATCCGAGCTGGTCATGACCCAGACCCCCAGCAGCACATCTGGCGCCGTGGGCGGCACCGTGACCATCAATTGCCAGGCCAGCCAGAGCATCGACAGCAACCTGGCCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCACCCTGCTGATCTACAGAGCCTCCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCAGATCTGGCACCGAGTACACCCTGACCATCTCCGGCGTGCAGAGAGAGGACGCCGCTACCTATTACTGCCTGGGCGGCGTGGGCAACGTGTCCTACAGAACCAGCTTCGGCGGAGGTACTGAGGTGGTCGTCAAA
铰链/间隔子
TACCCTGCCCCCCTTGCCCT
GCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAG
CH3
GGCCAGCCTCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCCTCCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAG
4-1BB
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CD3ζ
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T2A
GGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGG
tEGFR
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGTGA
TCTAGACCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCATCGATACCGTCGACTAGCCGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAAGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCGTCGAGATCCGGTCGACCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTCGACGGTATCGATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGAATTCGGAGTGGCGAGCCCTCAGATCCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTG
表18
前导_R11-Hinge-CH3-CD28tm/41BB-Z-T2A-tEGFR(SEQ ID NO:46)
前导
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
scFV R11
QSVKESEGDLVTPAGNLTLTCTASGSDINDYPISWVRQAPGKGLEWIGFINSGGSTWYASWVKGRFTISRTSTTVDLKMTSLTTDDTATYFCARGYSTYYGDFNIWGPGTLVTISSGGGGSGGGGSGGGGSELVMTQTPSSTSGAVGGTVTINCQASQSIDSNLAWFQQKPGQPPTLLIYRASNLASGVPSRFSGSRSGTEYTLTISGVQREDAATYYCLGGVGNVSYRTSFGGGTEVVVK
铰链/间隔子
ESKYGPPCPPCP
CH3
GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
CD28tm
MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
4-1BB
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD3ζ
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
T2A
LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPRM
tEGFR
LLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
表19
R11短的间隔子CAR:PJ_R11-41BB-Z-T2A-tEGFR(SEQ ID NO:47)
GTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAGGTCAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAGAACATCCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTGATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGATCTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGGGATCAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACG
scFV R11
GAATTCGCCACCCTGCTGCTGGTGACAAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATCCCCCAGAGCGTGAAAGAGTCCGAGGGCGACCTGGTCACACCAGCCGGCAACCTGACCCTGACCTGTACCGCCAGCGGCAGCGACATCAACGACTACCCCATCTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCTGGCAAGGGACTGGAATGGATCGGCTTCATCAACAGCGGCGGCAGCACTTGGTACGCCAGCTGGGTCAAAGGCCGGTTCACCATCAGCCGGACCAGCACCACCGTGGACCTGAAGATGACAAGCCTGACCACCGACGACACCGCCACCTACTTTTGCGCCAGAGGCTACAGCACCTACTACGGCGACTTCAACATCTGGGGCCCTGGCACCCTGGTCACAATCTCTAGCGGCGGAGGCGGCAGCGGAGGTGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGATCCGAGCTGGTCATGACCCAGACCCCCAGCAGCACATCTGGCGCCGTGGGCGGCACCGTGACCATCAATTGCCAGGCCAGCCAGAGCATCGACAGCAACCTGGCCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCACCCTGCTGATCTACAGAGCCTCCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCAGATCTGGCACCGAGTACACCCTGACCATCTCCGGCGTGCAGAGAGAGGACGCCGCTACCTATTACTGCCTGGGCGGCGTGGGCAACGTGTCCTACAGAACCAGCTTCGGCGGAGGTACTGAGGTGGTCGTCAAA
铰链/间隔子
TACCCTGCCCCCCTTGCCCT
GGCCAGCCTCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCCTCCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAG
4-1BB
ATGTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGGGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
CD3ζ
CGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGGGAAGAGTACGACGTCCTGGATAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCTCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTATCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCAAGG
T2A
GGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGG
tEGFR
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGTGA
TCTAGACCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCATCGATACCGTCGACTAGCCGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAAGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCGTCGAGATCCGGTCGACCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTCGACGGTATCGATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGAATTCGGAGTGGCGAGCCCTCAGATCCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTG
表20
前导_R11-铰链-CD28tm/41BB-Z-T2A-tEGFR(SEQ ID NO:48)
前导
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
ScFv R11
QSVKESEGDLVTPAGNLTLTCTASGSDINDYPISWVRQAPGKGLEWIGFINSGGSTWYASWVKGRFTISRTSTTVDLKMTSLTTDDTATYFCARGYSTYYGDFNIWGPGTLVTISSGGGGSGGGGSGGGGSELVMTQTPSSTSGAVGGTVTINCQASQSIDSNLAWFQQKPGQPPTLLIYRASNLASGVPSRFSGSRSGTEYTLTISGVQREDAATYYCLGGVGNVSYRTSFGGGTEVVVK
间隔子/铰链
ESKYGPPCPPCP
CD28tm
MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
4-1BB
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD3ζ
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
T2A
LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
tEGFR
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
表21
中等的间隔子(SEQ ID NO:49)
铰链/间隔子
ESKYGPPCPPCP
CH3
GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
长的间隔子(SEQ ID NO:50)
铰链
ESKYGPPCPPCP
CH2
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKKVSNKGLPSSIEKTISKAK
CH3
GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
表22Her 2构建体-短的间隔子(SEQ Id No:54)
GMCSFss-Her2scFv-IgG4铰链-CD28tm-41BB-ζ-T2A-EGFRt
前导
Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatccca
Her2scFV
gatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctgtgggcgatagggtcaccatcacctgccgtgccagtcaggatgtgaatactgctgtagcctggtatcaacagaaaccaggaaaagctccgaaactactgatttactcggcatccttcctctactctggagtcccttctcgcttctctggttccagatctgggacggatttcactctgaccatcagcagtctgcagccggaagacttcgcaacttattactgtcagcaacattatactactcctcccacgttcggacagggtaccaaggtggagatcaaaggcagtactagcggcggtggctccgggggcggatccggtgggggcggcagcagcgaggttcagctggtggagtctggcggtggcctggtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgtgcagcttctggcttcaacattaaagacacctatatacactgggtgcgtcaggccccgggtaagggcctggaatgggttgcaaggatttatcctacgaatggttatactagatatgccgatagcgtcaagggccgtttcactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgttctagatggggaggggacggcttctatgctatggactactggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcgagt
铰链间隔子
Gagagcaagtacggaccgccctgccccccttgccct
CD28tm
atgttctgggtgctggtggtggtcggaggcgtgctggcctgctacagcctgctggtcaccgtggccttcatcatcttttgggtg
4-1BB
Aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg
CD3ζ
Cgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaagg
T2A
Ctcgagggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctagg
tEGFR
atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacgcaaagtgtgtaacggaataggtattggtgaatttaaagactcactctccataaatgctacgaatattaaacacttcaaaaactgcacctccatcagtggcgatctccacatcctgccggtggcatttaggggtgactccttcacacatactcctcctctggatccacaggaactggatattctgaaaaccgtaaaggaaatcacagggtttttgctgattcaggcttggcctgaaaacaggacggacctccatgcctttgagaacctagaaatcatacgcggcaggaccaagcaacatggtcagttttctcttgcagtcgtcagcctgaacataacatccttgggattacgctccctcaaggagataagtgatggagatgtgataatttcaggaaacaaaaatttgtgctatgcaaatacaataaactggaaaaaactgtttgggacctccggtcagaaaaccaaaattataagcaacagaggtgaaaacagctgcaaggccacaggccaggtctgccatgccttgtgctcccccgagggctgctggggcccggagcccagggactgcgtctcttgccggaatgtcagccgaggcagggaatgcgtggacaagtgcaaccttctggagggtgagccaagggagtttgtggagaactctgagtgcatacagtgccacccagagtgcctgcctcaggccatgaacatcacctgcacaggacggggaccagacaactgtatccagtgtgcccactacattgacggcccccactgcgtcaagacctgcccggcaggagtcatgggagaaaacaacaccctggtctggaagtacgcagacgccggccatgtgtgccacctgtgccatccaaactgcacctacggatgcactgggccaggtcttgaaggctgtccaacgaatgggcctaagatcccgtccatcgccactgggatggtgggggccctcctcttgctgctggtggtggccctggggatcggcctcttcatgtga
表23
Her 2构建体-中等的间隔子(SEQ Id No:55)
前导
Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacaccca
Her2scFv
Gcattcctcctgatcccagatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctgtgggcgatagggtcaccatcacctgccgtgccagtcaggatgtgaatactgctgtagcctggtatcaacagaaaccaggaaaagctccgaaactactgatttactcggcatccttcctctactctggagtcccttctcgcttctctggttccagatctgggacggatttcactctgaccatcagcagtctgcagccggaagacttcgcaacttattactgtcagcaacattatactactcctcccacgttcggacagggtaccaaggtggagatcaaaggcagtactagcggcggtggctccgggggcggatccggtgggggcggcagcagcgaggttcagctggtggagtctggcggtggcctggtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgtgcagcttctggcttcaacattaaagacacctatatacactgggtgcgtcaggccccgggtaagggcctggaatgggttgcaaggatttatcctacgaatggttatactagatatgccgatagcgtcaagggccgtttcactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgttctagatggggaggggacggcttctatgctatggactactggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcgagt
铰链间隔子
GagagcaagtacggaccgccctgccccccttgccctGgccagcctagagaaccccaggtgtacaccctgcctcccagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgatatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtactcccggctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtcttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagcctgggcaag
CD28tm
Atgttctgggtgctggtggtggtcggaggcgtgctggcctgctacagcctgctggtcaccgtggccttcatcatcttttgggtg
4-1BB
Aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg
CD3ζ
Cgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaagg
T2A
Ctcgagggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctagg
tEGFR
atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacgcaaagtgtgtaacggaataggtattggtgaatttaaagactcactctccataaatgctacgaatattaaacacttcaaaaactgcacctccatcagtggcgatctccacatcctgccggtggcatttaggggtgactccttcacacatactcctcctctggatccacaggaactggatattctgaaaaccgtaaaggaaatcacagggtttttgctgattcaggcttggcctgaaaacaggacggacctccatgcctttgagaacctagaaatcatacgcggcaggaccaagcaacatggtcagttttctcttgcagtcgtcagcctgaacataacatccttgggattacgctccctcaaggagataagtgatggagatgtgataatttcaggaaacaaaaatttgtgctatgcaaatacaataaactggaaaaaactgtttgggacctccggtcagaaaaccaaaattataagcaacagaggtgaaaacagctgcaaggccacaggccaggtctgccatgccttgtgctcccccgagggctgctggggcccggagcccagggactgcgtctcttgccggaatgtcagccgaggcagggaatgcgtggacaagtgcaaccttctggagggtgagccaagggagtttgtggagaactctgagtgcatacagtgccacccagagtgcctgcctcaggccatgaacatcacctgcacaggacggggaccagacaactgtatccagtgtgcccactacattgacggcccccactgcgtcaagacctgcccggcaggagtcatgggagaaaacaacaccctggtctggaagtacgcagacgccggccatgtgtgccacctgtgccatccaaactgcacctacggatgcactgggccaggtcttgaaggctgtccaacgaatgggcctaagatcccgtccatcgccactgggatggtgggggccctcctcttgctgctggtggtggccctggggatcggcctcttcatgtga
表24
Her 2构建体-长的间隔子(SEQ Id No:56)
前导
Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacaccca
Her2scFV
gcattcctcctgatcccagatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctgtgggcgatagggtcaccatcacctgccgtgccagtcaggatgtgaatactgctgtagcctggtatcaacagaaaccaggaaaagctccgaaactactgatttactcggcatccttcctctactctggagtcccttctcgcttctctggttccagatctgggacggatttcactctgaccatcagcagtctgcagccggaagacttcgcaacttattactgtcagcaacattatactactcctcccacgttcggacagggtaccaaggtggagatcaaaggcagtactagcggcggtggctccgggggcggatccggtgggggcggcagcagcgaggttcagctggtggagtctggcggtggcctggtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgtgcagcttctggcttcaacattaaagacacctatatacactgggtgcgtcaggccccgggtaagggcctggaatgggttgcaaggatttatcctacgaatggttatactagatatgccgatagcgtcaagggccgtttcactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgttctagatggggaggggacggcttctatgctatggactactggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcgagt
长的间隔子
gagagcaagtacggaccgccctgccccccttgccctgcccccgagttcctgggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaggtgtacaccctgcctccctccc aggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatc gccgtggagtgggagagcaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccctcccgtgctggaca gcgacggcagcttcttcctgtacagccggctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtc tttagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtccctg ggcaag
CD28tm
atgttctgggtgctggtggtggtgggcggggtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtg
4-1BB
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg
CD3ζ
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T2A
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Claims (35)

1.嵌合受体核酸，其包含：
a)编码配体结合结构域的多核苷酸，其中所述配体结合结构域结合配体，其中所述配体为肿瘤特异性分子，病毒分子，或靶细胞群上所表达的适于介导通过淋巴细胞的识别和清除的任何其他分子；
b)编码多肽间隔子的多核苷酸，所述多肽间隔子的长度为所述配体特异性的，其中与参照嵌合受体相比，所述间隔子提供应答所述配体的增强的T细胞增殖和/或细胞因子产生；
c)编码跨膜结构域的多核苷酸；以及
d)编码细胞内信号转导结构域的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的嵌合受体核酸，其中所述配体结合结构域为抗体片段。
3.如权利要求2所述的嵌合受体核酸，其中所述配体结合结构域为单链可变片段。
4.如权利要求1-3中任一项所述的嵌合受体核酸，其中所述肿瘤特异性分子选自CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、间皮素、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGE A3TCR及其组合。
5.如权利要求1-4中任一项所述的嵌合受体核酸，其中所述间隔子包含氨基酸序列X1PPX2P。
6.如权利要求5所述的嵌合受体核酸，其中所述间隔子区域包含人抗体的铰链区的一部分。
7.如权利要求5所述的嵌合受体核酸，其中所述间隔子区域包含铰链区，以及选自CH1、CH2、CH3及其组合的人抗体Fc结构域的至少一个其他部分。
8.如权利要求1-7中任一项所述的嵌合受体核酸，其中所述间隔子区域的长度选自12个或更少的氨基酸，119个或更少的氨基酸，和229个或更少的氨基酸。
9.如权利要求5所述的嵌合受体核酸，其中所述配体结合结构域与ROR1上的配体结合，并且所述间隔子区域选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:49(铰链-CH3)。
10.如权利要求1-9中任一项所述的嵌合受体核酸，其中所述淋巴细胞活化结构域包含CD3ζ的全部或一部分，以及选自以下的共刺激结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C、B7-H3及其组合。
11.如权利要求10所述的嵌合受体核酸，其中所述细胞内信号转导结构域包含CD3ζ的一部分，以及4-1BB的一部分或CD28的一部分或以上两者。
12.如权利要求4-11中任一项所述的嵌合受体核酸，其中所述配体结合结构域与ROR1结合，并且所述间隔子区域为12个或更少的氨基酸并具有序列SEQ ID NO:4。
13.如权利要求4-11中任一项所述的嵌合受体核酸，其中所述配体结合结构域与ROR1结合，并且所述间隔子区域具有序列SEQ IDNO:50。
14.如权利要求4-11中任一项所述的嵌合受体核酸，其中其中所述配体结合结构域与CD19结合，并且所述间隔子区域为12个或更少的氨基酸并具有序列SEQ ID NO:4。
15.如权利要求4-11中任一项所述的嵌合受体核酸，其中所述配体结合结构域与Her2结合，并且所述间隔子区域具有序列SEQ ID NO:50。
16.如权利要求1-15中任一项所述的嵌合受体核酸，其还包含编码标记序列的核酸。
17.嵌合受体多肽，其由权利要求1-16中任一项的嵌合受体核酸编码。
18.表达载体，其包含分离的权利要求1-16中任一项的嵌合受体核酸。
19.宿主细胞，其包含权利要求1-16中任一项的核酸或权利要求18的表达载体。
20.如权利要求19所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为CD8+T细胞毒性淋巴细胞，其选自初始CD8+T细胞、中心记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和大体积CD8+T细胞。
21.如权利要求20所述的宿主细胞，其中所述CD8+细胞毒性T淋巴细胞为中心记忆T细胞，其中所述中心记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的。
22.如权利要求19所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为CD4+T辅助淋巴细胞，其选自初始CD4+T细胞、中心记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和大体积CD4+T细胞。
23.如权利要求22所述的宿主细胞，其中所述CD4+辅助淋巴细胞为初始CD4+T细胞，其中所述初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的，对CD45RO是阴性的。
24.组合物，其包含在药学上可接受的赋形剂中的权利要求19-23中任一项的宿主细胞。
25.如权利要求24所述的组合物，其包含权利要求20或21的宿主细胞和权利要求23或34的宿主细胞。
26.制备权利要求19-23中任一项的宿主细胞的体外方法，其包括：
a)提供了权利要求1-16或18中任一项的编码嵌合受体的核酸的文库，其中多个核酸中的每一个编码长度不同的嵌合受体；
b)将多个核酸中的每一个引入到单独分离的T淋巴细胞群并且体外扩增每一T淋巴细胞群；
c)将每一遗传修饰的T淋巴细胞群给予荷瘤动物模型并且确定遗传修饰的T淋巴细胞群是否具有抗肿瘤效力；以及
d)选择编码提供了体外和/或动物模型中抗肿瘤效力的嵌合受体的核酸。
27.如权利要求26所述的方法，其还包括将选择的编码嵌合受体的核酸引入到宿主细胞。
28.用于制备权利要求19-23中任一项的宿主细胞的体外方法，其包括：
a)将权利要求1-16中任一项的核酸或权利要求18的表达载体引入到具有CD45RA-、CD45RO+和CD62L+表型的淋巴细胞群；以及
b)在抗CD3和/或抗CD28、和至少一种稳态细胞因子存在的情况下培养细胞，直到细胞扩增至足以用作细胞输注。
29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞为CD8+或CD4+。
30.权利要求19-23中任一项的宿主细胞或权利要求24-25的组合物在治疗癌症或病毒感染中的用途。
31.如权利要求30所述的用途，其中所述癌症为实体瘤或血液系统恶性肿瘤。
32.如权利要求31所述的用途，其中所述实体瘤选自乳腺癌，肺癌，结肠癌，肾癌，胰腺癌，前列腺癌和卵巢癌。
33.在患有癌症或病毒感染的个体中进行细胞免疫治疗的方法，其包括：向所述个体给予权利要求24-25中任一项的组合物或权利要求19-23的宿主细胞。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述癌症选自实体瘤或血液系统恶性肿瘤。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述实体瘤选自乳腺癌，肺癌，结肠癌，肾癌，胰腺癌，前列腺癌和卵巢癌。
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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105985444A (zh) * 2015-02-05 2016-10-05 博生吉医药科技(苏州)有限公司 一种嵌合抗原受体、以及快速构建嵌合抗原受体的方法及应用
WO2017028374A1 (en) * 2015-08-20 2017-02-23 Beijing Marino Biotechnology Pty Ltd. Construct, genetically modified lymphocyte, preparation method and usage thereof
CN106978442A (zh) * 2016-01-18 2017-07-25 爱康得生物医学技术（苏州）有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞的制备方法
CN107641615A (zh) * 2017-09-22 2018-01-30 苏州大学 一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法
CN107759699A (zh) * 2017-10-18 2018-03-06 银丰生物工程集团有限公司 靶向cd30抗原的转基因t细胞及其制备方法与应用
CN108348550A (zh) * 2015-07-21 2018-07-31 希望之城公司 用于表达嵌合抗原受体和其它受体的t细胞
CN109562151A (zh) * 2016-06-06 2019-04-02 朱诺治疗学股份有限公司 使用过继细胞疗法治疗b细胞恶性肿瘤的方法
WO2019128857A1 (zh) * 2017-12-28 2019-07-04 上海细胞治疗研究院 一种外源抗体基因拷贝数的检测方法和试剂盒
CN110603265A (zh) * 2017-01-09 2019-12-20 莱蒂恩技术公司 用于用抗间皮素免疫治疗癌症的组合物和方法
CN111683962A (zh) * 2017-11-10 2020-09-18 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体
CN112969467A (zh) * 2018-10-31 2021-06-15 贝里坤制药股份有限公司 具有自杀开关的t细胞
CN114829402A (zh) * 2019-09-27 2022-07-29 南京艾美斐生物医药科技有限公司 抗ror1抗体及其制备方法与应用
WO2022222846A1 (zh) * 2021-04-22 2022-10-27 河北森朗生物科技有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体、制备方法及其应用

Families Citing this family (417)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX351226B (es) 2011-09-08 2017-10-05 Yeda Res & Dev Celulas t con memoria central anti tercera parte, metodos para producirlas y uso de las mismas en transplante y tratamiento de enfermedades.
CA2865033C (en) 2012-02-23 2021-11-02 Stage Cell Therapeutics Gmbh Chromatographic isolation of cells and other complex biological materials
KR20220025161A (ko) 2012-08-20 2022-03-03 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 세포 면역요법을 위한 방법 및 조성물
ES2776698T3 (es) 2012-12-20 2020-07-31 Purdue Research Foundation Células T que expresan un receptor antigénico quimérico como terapia contra el cáncer
HUE046961T2 (hu) 2013-02-20 2020-04-28 Univ Pennsylvania Rák kezelése humanizált EGFRVIII elleni kiméra antigénreceptor alkalmazásával
US9573988B2 (en) 2013-02-20 2017-02-21 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-CD123 chimeric antigen receptor engineered T cells
ES2769574T3 (es) 2013-03-15 2020-06-26 Michael C Milone Reconocimiento de células citotóxicas con receptores quiméricos para inmunoterapia adoptiva
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
BR112016013187A2 (pt) 2013-12-19 2017-09-26 Novartis Ag receptores de antígenos quiméricos de mesotelina humanos e usos dos mesmos
US10287354B2 (en) 2013-12-20 2019-05-14 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
JP6942467B2 (ja) 2013-12-20 2021-10-06 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター タグ化キメラエフェクター分子およびそのレセプター
US11028143B2 (en) 2014-01-21 2021-06-08 Novartis Ag Enhanced antigen presenting ability of RNA CAR T cells by co-introduction of costimulatory molecules
PL3888674T3 (pl) 2014-04-07 2024-09-23 Novartis Ag Leczenie nowotworu złośliwego z zastosowaniem chimerycznego receptora antygenowego anty-CD19
ES2867224T3 (es) * 2014-04-10 2021-10-20 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Etiquetas genéticas transgénicas y métodos de uso
JP6696969B2 (ja) 2014-04-16 2020-05-20 ユノ・セラピューティクス・ゲーエムベーハーＪｕｎｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｇｍｂｈ 細胞の集団を拡大する方法、キット、及び装置
DK4219687T3 (da) 2014-04-23 2024-10-28 Juno Therapeutics Inc Fremgangsmåder til isolering, dyrkning og genmanipulering af immuncellepopulationer til adoptiv terapi
MX2016013964A (es) * 2014-04-25 2017-04-06 Bluebird Bio Inc Receptores de antigenos quimericos del promotor mnd.
SMT202100049T1 (it) 2014-06-06 2021-03-15 Bluebird Bio Inc Composizioni di cellule t migliorate
WO2016011210A2 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Juno Therapeutics, Inc. Engineered cells for adoptive cell therapy
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
SG11201700416TA (en) 2014-07-21 2017-02-27 Novartis Ag Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
RU2751660C2 (ru) 2014-07-21 2021-07-15 Новартис Аг Лечение злокачественного новообразования с использованием гуманизированного химерного антигенного рецептора против всма
KR20170037625A (ko) 2014-07-21 2017-04-04 노파르티스 아게 Cll-1 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
AU2015292590B2 (en) 2014-07-24 2020-01-16 2Seventy Bio, Inc. BCMA chimeric antigen receptors
CN113846062B (zh) * 2014-07-25 2025-02-21 赛拉福柯蒂斯公司 用于嵌合抗原受体分子的调控表达的慢病毒载体
ES2876925T3 (es) 2014-07-29 2021-11-15 Cellectis Receptores de antígeno quiméricos específicos para ROR1 (NTRKR1) para inmunoterapia contra el cáncer
EP3194432B1 (en) 2014-07-31 2019-04-10 Cellectis Ror1 specific multi-chain chimeric antigen receptor
KR102387122B1 (ko) * 2014-08-19 2022-04-14 밀테니 비오텍 비.브이. & 씨오. 케이지 Ssea4 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체
CN112410363A (zh) 2014-08-19 2021-02-26 诺华股份有限公司 抗cd123嵌合抗原受体(car)用于癌症治疗
TWI751102B (zh) 2014-08-28 2022-01-01 美商奇諾治療有限公司 對ｃｄ１９具專一性之抗體及嵌合抗原受體
EP3699188A1 (en) 2014-09-04 2020-08-26 Cellectis 5t4 (tpbg) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
CN107580628B (zh) 2014-09-17 2022-01-07 诺华股份有限公司 用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞
AU2015317351B2 (en) * 2014-09-19 2020-07-02 City Of Hope Costimulatory chimeric antigen receptor T cells targeting IL3Ra2
SG11201702895SA (en) 2014-10-08 2017-05-30 Novartis Ag Biomarkers predictive of therapeutic responsiveness to chimeric antigen receptor therapy and uses thereof
MX2017005106A (es) 2014-10-20 2017-07-05 Juno Therapeutics Inc Metodos y composiciones para dosificacion en terapia celular adoptiva.
MY186199A (en) 2014-11-05 2021-06-30 Juno Therapeutics Inc Methods for transduction and cell processing
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
KR20170087514A (ko) 2014-12-03 2017-07-28 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 입양 세포 치료를 위한 방법 및 조성물
WO2016094873A2 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 Emergent Product Development Seattle, Llc Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 binding proteins and related compositions and methods
HRP20211648T1 (hr) 2014-12-12 2022-02-04 2Seventy Bio, Inc. Kimerni receptori antigena bcma
FI3240805T3 (fi) 2014-12-15 2025-02-17 Univ California Cd19- ja cd20-vasteellinen bispesifinen tai-veräjän kimeerinen antigeenireseptori
US10273300B2 (en) 2014-12-29 2019-04-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
MA41346A (fr) 2015-01-12 2017-11-21 Juno Therapeutics Inc Eléments régulateurs post-transcriptionnels d'hépatite modifiée
JP6865688B2 (ja) 2015-01-16 2021-04-28 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｒｏｒ１に特異的な抗体およびキメラ抗原受容体
US11459390B2 (en) 2015-01-16 2022-10-04 Novartis Ag Phosphoglycerate kinase 1 (PGK) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
WO2016126608A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
KR20170134642A (ko) 2015-04-08 2017-12-06 노파르티스 아게 Cd20 요법, cd22 요법, 및 cd19 키메라 항원 수용체 (car) - 발현 세포와의 조합 요법
WO2016166568A1 (en) 2015-04-16 2016-10-20 Juno Therapeutics Gmbh Methods, kits and apparatus for expanding a population of cells
CN118726268A (zh) 2015-04-17 2024-10-01 诺华股份有限公司 改善嵌合抗原受体表达细胞的功效和扩增的方法
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
EP3288570A4 (en) 2015-04-29 2018-11-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified stem cells and uses thereof
CA3155251A1 (en) * 2015-05-01 2016-11-10 The Regents Of The University Of California Glycan-dependent immunotherapeutic molecules
KR20180029201A (ko) 2015-05-18 2018-03-20 티씨알2 테라퓨틱스 인크. 융합 단백질을 이용하는 tcr 리프로그래밍을 위한 조성물 및 방법
EP3298046B1 (en) 2015-05-20 2025-02-12 Cellectis Anti-gd3 specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
EP3303381A1 (en) 2015-05-29 2018-04-11 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions for cellular immunotherapy
AU2016271147B2 (en) 2015-05-29 2022-09-08 Juno Therapeutics, Inc. Composition and methods for regulating inhibitory interactions in genetically engineered cells
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
ES2963038T3 (es) 2015-07-16 2024-03-25 Yeda Res & Dev Uso de células T de memoria central antitercero
JP7146632B2 (ja) 2015-07-21 2022-10-04 ノバルティス アーゲー 免疫細胞の有効性および増大を改善する方法
CN108472314A (zh) 2015-07-31 2018-08-31 明尼苏达大学董事会 修饰的细胞和治疗方法
EP3331920A4 (en) * 2015-08-07 2019-04-03 Seattle Children's Hospital, dba Seattle Children's Research Institute BIS SPECIFIC CAR T CELLS FOR TARGETING OF SOLID TUMORS
US11667691B2 (en) 2015-08-07 2023-06-06 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric CD3 receptor proteins
JP6980659B2 (ja) * 2015-08-31 2021-12-15 ヘリックスミス カンパニー， リミテッド 抗シアリルｔｎキメラ抗原受容体
CN116334205A (zh) 2015-09-03 2023-06-27 诺华股份有限公司 预测细胞因子释放综合征的生物标志物
WO2017044487A1 (en) 2015-09-09 2017-03-16 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Genetic engineering of macrophages for immunotherapy
CN108430518A (zh) * 2015-09-11 2018-08-21 小利兰·斯坦福大学托管委员会 生物相关正交细胞因子/受体对
BR112018005931A2 (pt) 2015-09-24 2018-10-09 Abvitro Llc composições de anticorpo para hiv e métodos de uso
MX2018003534A (es) 2015-09-25 2019-04-25 Abvitro Llc Proceso de alto rendimiento para identificacion de blanco de receptor de celula t de secuencias de receptor de celula t apareadas de manera natural.
CN108290956B (zh) * 2015-10-06 2022-07-05 希望之城公司 靶向psca的嵌合抗原受体
MA45488A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés, kits et appareil de culture de cellules
MA45489A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés
MA45426A (fr) 2015-10-22 2019-05-01 Juno Therapeutics Gmbh Procédés, kits, agents et appareils de transduction
WO2017072361A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Nbe-Therapeutics Ag Anti-ror1 antibodies
JP7092662B2 (ja) 2015-10-30 2022-06-28 チルドレンズ ナショナル メディカル センター ナイーブｔ細胞集団からのｈｐｖ抗原特異的ｔ細胞の生成
CA3004306A1 (en) * 2015-11-04 2017-05-11 Stephen J. Forman Chimeric antigen receptors targeting her2
MA44314A (fr) 2015-11-05 2018-09-12 Juno Therapeutics Inc Récepteurs chimériques contenant des domaines induisant traf, et compositions et méthodes associées
WO2017079703A1 (en) 2015-11-05 2017-05-11 Juno Therapeutics, Inc. Vectors and genetically engineered immune cells expressing metabolic pathway modulators and uses in adoptive cell therapy
MX2018006789A (es) 2015-12-03 2019-02-13 Juno Therapeutics Inc Receptores quimericos modificados y composiciones y metodos relacionados.
EP3383419B1 (en) 2015-12-03 2022-08-03 Juno Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing immune responses against chimeric antigen receptors
MA43377A (fr) 2015-12-04 2021-05-19 Hutchinson Fred Cancer Res Méthodes et compositions liées à la toxicité associée à la thérapie cellulaire
MX2018006767A (es) 2015-12-04 2019-03-14 Novartis Ag Composiciones y metodos para oncologia inmunologica.
US11479755B2 (en) 2015-12-07 2022-10-25 2Seventy Bio, Inc. T cell compositions
CN109069597A (zh) 2015-12-22 2018-12-21 诺华股份有限公司 间皮素嵌合抗原受体(car)和抗pd-l1抗体抑制剂联用于抗癌治疗
SG11201805451TA (en) 2015-12-30 2018-07-30 Novartis Ag Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
CA3010869A1 (en) * 2016-01-15 2017-07-20 Etubics Corporation Methods and compositions for t-cell immunotherapy
CA3011815A1 (en) 2016-01-20 2017-07-27 The Scripps Research Institute Ror1 antibody compositions and related methods
MX2018009011A (es) 2016-02-02 2018-11-19 Hutchinson Fred Cancer Res Anticuerpos anti receptor 1 transmembrana de tirosina-proteina cinasa (ror1) y usos de los mismos.
AU2017225733A1 (en) 2016-03-04 2018-09-27 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (CAR) molecules and uses therefore
MA43758A (fr) 2016-03-16 2018-11-28 Yuan Ji Procédés pour déterminer le dosage d'un agent thérapeutique et traitements associés
WO2017161212A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Juno Therapeutics, Inc. Methods for adaptive design of a treatment regimen and related treatments
US10875927B2 (en) 2016-03-18 2020-12-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for CD20 immunotherapy
CN109476743A (zh) 2016-03-22 2019-03-15 西雅图儿童医院(以西雅图儿童研究所名义营业) 预防或缓解毒性的早期干预方法
EP3432924A1 (en) 2016-03-23 2019-01-30 Novartis AG Cell secreted minibodies and uses thereof
CN118147079A (zh) * 2016-03-31 2024-06-07 来恩生物医药私人有限公司 表达外源病毒特异性t细胞受体(tcr)的非活化t细胞
WO2017177149A2 (en) 2016-04-08 2017-10-12 Purdue Research Foundation Methods and compositions for car t cell therapy
CA3021027A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Novartis Ag Compositions and methods for selective expression of chimeric antigen receptors
US11963980B2 (en) 2016-04-25 2024-04-23 Musc Foundation For Research Development Activated CD26-high immune cells and CD26-negative immune cells and uses thereof
US20190136230A1 (en) 2016-05-06 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Genetically engineered cells and methods of making the same
ES2901215T3 (es) 2016-05-27 2022-03-21 Aadigen Llc Péptidos y nanopartículas para la liberación intracelular de moléculas de edición del genoma
WO2017210689A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Adoptive cell therapies as early treatment options
JP2019527537A (ja) 2016-06-07 2019-10-03 マックス−デルブリュック−セントルム フュール モレキュラー メディツィン イン デア ヘルムホルツ−ゲマインシャフト キメラ抗原受容体と、ｂｃｍａに結合するｃａｒ−ｔ細胞
CN107522786A (zh) * 2016-06-20 2017-12-29 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种分子、表达其的细胞及其制备方法和用途
JPWO2017221850A1 (ja) * 2016-06-21 2019-05-23 国立大学法人名古屋大学 Ｔ細胞機能向上のためのアダプター分子
MA45491A (fr) 2016-06-27 2019-05-01 Juno Therapeutics Inc Épitopes à restriction cmh-e, molécules de liaison et procédés et utilisations associés
CN110291402B (zh) 2016-06-27 2023-09-01 朱诺治疗学股份有限公司 鉴定肽表位的方法、结合此类表位的分子和相关用途
CA3030841A1 (en) * 2016-07-14 2018-01-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Multiple bi-specific binding domain constructs with different epitope binding to treat cancer
BR112019001327A2 (pt) 2016-07-29 2019-04-30 Juno Therapeutics Inc anticorpos anti-idiotípicos e métodos relacionados
ES2926513T3 (es) 2016-07-29 2022-10-26 Juno Therapeutics Inc Métodos para evaluar la presencia o ausencia de virus competente en replicación
ES2951552T3 (es) 2016-07-29 2023-10-23 Juno Therapeutics Inc Polipéptidos inmunomoduladores y composiciones y métodos relacionados
RU2019105693A (ru) 2016-08-01 2020-09-01 Новартис Аг Лечение рака с применением химерного антигенного рецептора в комбинации с ингибитором молекулы, способствующей фенотипу m2 макрофага
WO2018026953A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
RU2021123536A (ru) 2016-09-12 2022-01-14 Джуно Терапьютикс, Инк. Сборочные узлы перфузионных биореакторных мешков
EA201990591A1 (ru) 2016-09-23 2019-08-30 Фред Хатчинсон Кэнсер Рисерч Сентер Tcr, специфичные к минорному антигену гистосовместимости (h) ha-1, и их применения
EP4089116A1 (en) 2016-09-27 2022-11-16 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric engulfment receptor molecules
US20190298771A1 (en) 2016-09-28 2019-10-03 Atossa Genetics Inc. Methods of adoptive cell therapy
MA46354A (fr) 2016-10-03 2019-08-07 Juno Therapeutics Inc Molécules se liant spécifiquement au vph
GB2564823B8 (en) 2016-10-07 2022-06-29 Tcr2 Therapeutics Inc Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
AU2017341047B2 (en) 2016-10-07 2024-10-10 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
US11896615B2 (en) 2016-10-13 2024-02-13 Juno Therapeutics, Inc. Immunotherapy methods and compositions involving tryptophan metabolic pathway modulators
EP4338799A3 (en) 2016-10-18 2024-06-05 Regents of the University of Minnesota Tumor infiltrating lymphocytes and methods of therapy
WO2018081448A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modified immunoglobulin hinge regions to reduce hemagglutination
CA3040914A1 (en) 2016-11-03 2018-05-24 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapy of a cell based therapy and a microglia inhibitor
CN110139669A (zh) 2016-11-03 2019-08-16 朱诺治疗学股份有限公司 T细胞疗法和btk抑制剂的组合疗法
US12109234B2 (en) 2016-11-04 2024-10-08 2Seventy Bio, Inc. Anti-BCMA CAR T cell compositions
US11851491B2 (en) 2016-11-22 2023-12-26 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
WO2018102612A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 Juno Therapeutics, Inc. Engineered b cells and related compositions and methods
JP2020511462A (ja) 2016-12-03 2020-04-16 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド キナーゼ阻害剤との組み合わせで治療用ｔ細胞を使用するための方法および組成物
EP3548084B1 (en) 2016-12-03 2023-08-23 Juno Therapeutics, Inc. Methods for determining car-t cells dosing
US20190358262A1 (en) 2016-12-03 2019-11-28 Juno Therapeutics, Inc. Methods for modulation of car-t cells
CA3045338A1 (en) 2016-12-05 2018-06-14 Juno Therapeutics, Inc. Production of engineered cells for adoptive cell therapy
EP3551197B1 (en) 2016-12-12 2023-11-22 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) Chimeric transcription factor variants with augmented sensitivity to drug ligand induction of transgene expression in mammalian cells
CA3048648A1 (en) * 2017-01-10 2018-07-19 The General Hospital Corporation T cells expressing a chimeric antigen receptor
CN110691792A (zh) 2017-01-10 2020-01-14 朱诺治疗学股份有限公司 细胞疗法的表观遗传学分析及相关方法
JP7303749B2 (ja) * 2017-01-13 2023-07-05 セルダラ メディカル、エルエルシー Ｔｉｍ－１を標的とするキメラ抗原受容体
US11555178B2 (en) 2017-01-18 2023-01-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. Genetically modified veto cells and use of same in immunotherapy
US20190350980A1 (en) * 2017-01-18 2019-11-21 Drk Blutspendedienst Baden-W?Rttemberg-Hessen Gmbh Compositions and methods for transplant recipient conditioning
CA3050085A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Juno Therapeutics Gmbh Cell surface conjugates and related cell compositions and methods
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
RU2674894C2 (ru) * 2017-01-30 2018-12-13 Общество с ограниченной ответственностью "ПЛАНТА" Новые люциферазы и способы их использования
CA3051481A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Phospholipid ether (ple) car t cell tumor targeting (ctct) agents
BR112019017120A8 (pt) 2017-02-17 2023-05-02 Hutchinson Fred Cancer Res Terapias de combinação para tratamento de cânceres e distúrbios autoimunes relacionados a bcma
JP7228522B2 (ja) 2017-02-27 2023-02-24 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 細胞療法における投薬に関する組成物、製造物品、および方法
JP7178355B2 (ja) 2017-02-28 2022-11-25 エンドサイト・インコーポレイテッド Ｃａｒ ｔ細胞療法のための組成物および方法
IL292352B2 (en) 2017-03-14 2024-03-01 Juno Therapeutics Inc Methods for cryogenic storage
SG11201908527SA (en) 2017-03-15 2019-10-30 Hutchinson Fred Cancer Res High affinity mage-a1-specific tcrs and uses thereof
AU2018235130B2 (en) 2017-03-15 2023-12-07 Oxford Biomedica (Uk) Limited Method
RU2019133280A (ru) 2017-03-22 2021-04-22 Новартис Аг Композиции и способы для иммуноонкологии
CA3056261A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Juno Therapeutics, Inc. Engineered cells expressing prostate-specific membrane antigen (psma) or a modified form thereof and related methods
EP3610261A1 (en) 2017-04-14 2020-02-19 Juno Therapeutics, Inc. Methods for assessing cell surface glycosylation
CN110891967B (zh) 2017-04-18 2025-03-14 富士胶片细胞动力公司 抗原特异性免疫效应细胞
AR111625A1 (es) 2017-04-27 2019-07-31 Juno Therapeutics Gmbh Reactivos de partículas oligoméricas y métodos de uso de los mismos
CA3061945A1 (en) 2017-05-01 2018-11-08 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a cell therapy and an immunomodulatory compound
CN118374493A (zh) 2017-05-17 2024-07-23 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 生成哺乳动物t细胞活化诱导型合成启动子(syn+pro)以改善t细胞疗法
CN110891567B (zh) 2017-05-24 2024-01-09 效应治疗股份有限公司 用于改善的抗肿瘤免疫应答的组合物和方法
US10780119B2 (en) 2017-05-24 2020-09-22 Effector Therapeutics Inc. Methods and compositions for cellular immunotherapy
CN111201438A (zh) 2017-06-02 2020-05-26 朱诺治疗学股份有限公司 与和细胞疗法相关的毒性有关的制品和方法
US11413310B2 (en) 2017-06-02 2022-08-16 Juno Therapeutics, Inc. Articles of manufacture and methods for treatment using adoptive cell therapy
PL3538645T3 (pl) 2017-06-20 2021-11-08 Institut Curie Komórki odpornościowe z defektem suv39h1
US20210147800A1 (en) 2017-06-22 2021-05-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing regulatory immune cells and uses thereof
MX2019015155A (es) 2017-06-29 2020-08-03 Juno Therapeutics Inc Modelo de raton para valorar toxicidades asociadas con inmunoterapias.
CN111511375A (zh) 2017-06-30 2020-08-07 因提玛生物科学公司 用于基因治疗的腺相关病毒载体
GB201710838D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc Bispecific antibodies
GB201710836D0 (en) * 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc ROR1 Car T-Cells
GB201710835D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc ROR1 Antibodies
KR20200064060A (ko) 2017-07-29 2020-06-05 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 재조합 수용체를 발현하는 세포 증폭용 시약
WO2019030240A1 (en) 2017-08-07 2019-02-14 Nbe-Therapeutics Ag ANTIBODIES BINDING TO A LINEAR HUMAN CS1 EPITOPE
MX2020001490A (es) 2017-08-09 2020-08-06 Juno Therapeutics Inc Metodos para producir composiciones de celulas geneticamente modificadas y composiciones relacionadas.
US20200239910A1 (en) 2017-08-09 2020-07-30 Juno Therapeutics, Inc. Methods and compositions for preparing genetically engineered cells
EP3676403A1 (en) 2017-09-01 2020-07-08 Juno Therapeutics, Inc. Gene expression and assessment of risk of developing toxicity following cell therapy
EP3678690A1 (en) 2017-09-06 2020-07-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for improving adoptive cell therapy
AU2018327229A1 (en) 2017-09-06 2020-02-27 Fred Hutchinson Cancer Center Strep-tag specific binding proteins and uses thereof
AU2018327225A1 (en) 2017-09-06 2020-02-27 Fred Hutchinson Cancer Center Strep-tag specific chimeric receptors and uses thereof
WO2019051335A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 Juno Therapeutics, Inc. METHODS OF IDENTIFYING CELLULAR CHARACTERISTICS RELATED TO RESPONSES ASSOCIATED WITH CELL THERAPY
CN109517820B (zh) 2017-09-20 2021-09-24 北京宇繁生物科技有限公司 一种靶向HPK1的gRNA以及HPK1基因编辑方法
CA3073421A1 (en) 2017-09-26 2019-04-04 Daniel Mark COREY Chimeric engulfment receptor molecules and methods of use
CN111954679A (zh) 2017-10-03 2020-11-17 朱诺治疗学股份有限公司 Hpv特异性结合分子
AU2018351050A1 (en) 2017-10-18 2020-05-07 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
KR20250010043A (ko) 2017-10-18 2025-01-20 프레시전 인코포레이티드 스페이서를 포함하는 폴리펩타이드 조성물
US20210069241A1 (en) 2017-10-20 2021-03-11 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods of immunotherapy targeting tigit and/or cd112r or comprising cd226 overexpression
SG11202003688PA (en) 2017-11-01 2020-05-28 Juno Therapeutics Inc Process for generating therapeutic compositions of engineered cells
CN111902159A (zh) * 2017-11-01 2020-11-06 朱诺治疗学股份有限公司 对b细胞成熟抗原（bcma）具有特异性的嵌合抗原受体
WO2019089848A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods associated with tumor burden for assessing response to a cell therapy
WO2019089858A2 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods of assessing or monitoring a response to a cell therapy
MX2020004243A (es) 2017-11-01 2020-09-25 Juno Therapeutics Inc Receptores de anticuerpos y de antigenos quimericos especificos para el antigeno de maduracion de celulas b.
WO2019089982A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Method of assessing activity of recombinant antigen receptors
WO2019090004A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing a t cell composition
US20230061455A1 (en) 2017-11-01 2023-03-02 Editas Medicine, Inc. Methods, compositions and components for crispr-cas9 editing of tgfbr2 in t cells for immunotherapy
AU2018360031A1 (en) 2017-11-03 2020-05-21 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with anti-ROR1 immunotherapy
BR112020008812A2 (pt) 2017-11-06 2020-10-27 Juno Therapeutics Inc combinação de terapia celular e um inibidor de gama secretase
WO2019090202A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Editas Medicine, Inc. Methods, compositions and components for crispr-cas9 editing of cblb in t cells for immunotherapy
RU2020118832A (ru) * 2017-11-09 2021-12-09 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Биспецифические слитые полипептиды и способы их применения
WO2019094835A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Juno Therapeutics, Inc. Closed-system cryogenic vessels
WO2019098682A1 (ko) * 2017-11-14 2019-05-23 앱클론(주) 항-her2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체
US11649294B2 (en) 2017-11-14 2023-05-16 GC Cell Corporation Anti-HER2 antibody or antigen-binding fragment thereof, and chimeric antigen receptor comprising same
EP3716980A1 (en) 2017-12-01 2020-10-07 Juno Therapeutics, Inc. Methods for dosing and for modulation of genetically engineered cells
WO2019109047A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Binding proteins specific for 5t4 and uses thereof
WO2019113559A2 (en) 2017-12-08 2019-06-13 Juno Therapeutics, Inc. Phenotypic markers for cell therapy and related methods
MX2020005908A (es) 2017-12-08 2020-10-07 Juno Therapeutics Inc Proceso para producir una composicion de celulas t modificadas.
BR112020011144A2 (pt) 2017-12-08 2020-11-17 Juno Therapeutics Inc formulação de meio livre de soro para o cultivo de células e métodos de uso da mesma
KR20200110745A (ko) 2017-12-15 2020-09-25 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 항 - ｃｃｔ5 결합 분자 및 이의 사용 방법
EP3728322A1 (en) * 2017-12-22 2020-10-28 Cell Design Labs, Inc. Single- and multi-chain chimeric antigen receptors
WO2019139972A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Board Of Regents, The University Of Texas System T cell receptors for immunotherapy
WO2019140278A1 (en) 2018-01-11 2019-07-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting core binding factor antigens
WO2019144095A1 (en) 2018-01-22 2019-07-25 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Methods of use for car t cells
JP2021511802A (ja) 2018-01-31 2021-05-13 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 複製可能ウイルスの存在または非存在を評価するための方法および試薬
US20210069246A1 (en) 2018-01-31 2021-03-11 Celgene Corporation Combination therapy using adoptive cell therapy and checkpoint inhibitor
SG11202007426XA (en) * 2018-02-06 2020-09-29 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Fluorescein-specific cars exhibiting optimal t cell function against fl-ple labelled tumors
BR112020016330A8 (pt) 2018-02-12 2023-04-18 Hutchinson Fred Cancer Res Receptores de células t específicas a ciclina a1 e usos dos mesmos
CA3091674A1 (en) 2018-02-23 2019-08-29 Endocyte, Inc. Sequencing method for car t cell therapy
WO2019165116A1 (en) 2018-02-26 2019-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
EP3762012A1 (en) 2018-03-09 2021-01-13 Ospedale San Raffaele S.r.l. Il-1 antagonist and toxicity induced by cell therapy
SG11202008926RA (en) 2018-03-14 2020-10-29 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Il-13 receptor alpha 2 targeted, zetakine directed t cell immunotherapy
SG11202008795SA (en) 2018-03-14 2020-10-29 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Il-13 receptor alpha 2 (il13ra2) chimeric antigen receptor for tumor specific t cell immunotherapy
US10751399B2 (en) * 2018-03-20 2020-08-25 Cho Pharma Usa, Inc. Chimeric antigen receptors that bind to SSEA4 and uses thereof
KR20210024443A (ko) 2018-03-28 2021-03-05 세로 테라퓨틱스, 인코포레이티드 세포 면역요법 조성물 및 이의 용도
WO2019191332A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric engulfment receptors and uses thereof for neurodegenerative diseases
EP3774906A1 (en) 2018-03-28 2021-02-17 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric tim4 receptors and uses thereof
RU2020135106A (ru) 2018-03-28 2022-04-29 Серо Терапьютикс, Инк. Векторы экспрессии для химерных рецепторов поглощения, генетически модифицированные клетки-хозяева и их применения
US20210015869A1 (en) 2018-04-05 2021-01-21 Juno Therapeutics, Inc. T cells expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods
WO2019195486A1 (en) 2018-04-05 2019-10-10 Juno Therapeutics, Inc. T cell receptors and engineered cells expressing same
AU2019247200A1 (en) 2018-04-05 2020-10-15 Editas Medicine, Inc. Methods of producing cells expressing a recombinant receptor and related compositions
US20210145882A1 (en) * 2018-04-13 2021-05-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for adoptive cell therapy targeting ror1
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
US20210396739A1 (en) 2018-05-01 2021-12-23 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
EP3787751A1 (en) 2018-05-03 2021-03-10 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapy of a chimeric antigen receptor (car) t cell therapy and a kinase inhibitor
US20210213063A1 (en) 2018-05-25 2021-07-15 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
CN108441505B (zh) * 2018-05-28 2023-07-07 上海恒润达生生物科技股份有限公司 一种靶向ror1的嵌合抗原受体及其用途
WO2019232479A2 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Fred Hutchinson Cancer Research Center Biomarkers, uses thereof for selecting immunotherapy intervention, and immunotherapy methods
EP3802825A1 (en) 2018-06-08 2021-04-14 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
EP3806962A1 (en) 2018-06-13 2021-04-21 Novartis AG Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020018964A1 (en) 2018-07-20 2020-01-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors
AU2019316647A1 (en) 2018-08-09 2021-02-25 Juno Therapeutics, Inc. Methods for assessing integrated nucleic acids
MX2021001523A (es) 2018-08-09 2021-05-27 Juno Therapeutics Inc Procesos para generar células modificadas y composiciones de las mismas.
KR20210043622A (ko) * 2018-08-10 2021-04-21 주식회사 유틸렉스 암항원 특이적 세포독성 t세포
WO2020047257A1 (en) * 2018-08-31 2020-03-05 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Methods and compositions comprising b7h3 chimeric antigen receptors
CA3110905A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Invectys SA Chimeric antigen receptors against multiple hla-g isoforms
EA202190693A1 (ru) 2018-09-11 2021-07-27 Джуно Терапьютикс, Инк. Способы анализа масс-спектрометрии композиций модифицированных клеток
US20220098613A1 (en) 2018-09-12 2022-03-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells
US20240165232A1 (en) 2018-09-24 2024-05-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Chimeric receptor proteins and uses thereof
NL2021789B1 (en) 2018-10-10 2020-05-14 Academisch Ziekenhuis Leiden Binding proteins specific for HA-1H and uses thereof
AU2019370705A1 (en) 2018-10-31 2021-05-27 Juno Therapeutics Gmbh Methods for selection and stimulation of cells and apparatus for same
CN119569895A (zh) 2018-11-01 2025-03-07 朱诺治疗学股份有限公司 G蛋白偶合受体c类5族成员d(gprc5d)特异性嵌合抗原受体
AU2019372331A1 (en) 2018-11-01 2021-05-27 Juno Therapeutics, Inc. Methods for treatment using chimeric antigen receptors specific for B-cell maturation antigen
KR20210100624A (ko) 2018-11-06 2021-08-17 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 유전적으로 조작된 ｔ 세포를 제조하는 방법
JP2022512971A (ja) 2018-11-08 2022-02-07 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 処置およびｔ細胞調節のための方法および併用
BR112021009420A2 (pt) 2018-11-16 2021-11-23 Juno Therapeutics Inc Métodos de dosagem de células t manipuladas para o tratamento de malignidades de células b
CN113330034A (zh) 2018-11-16 2021-08-31 阿尔伯特爱因斯坦医学院 针对B7-H3的IgV结构域的单克隆抗体及其用途
JP7630832B2 (ja) 2018-11-19 2025-02-18 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム Ｃａｒおよびｔｃｒ形質導入用のモジュール式ポリシストロニックベクター
SG11202105609RA (en) 2018-11-28 2021-06-29 Univ Texas Multiplex genome editing of immune cells to enhance functionality and resistance to suppressive environment
KR20210096648A (ko) 2018-11-29 2021-08-05 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 자연 살해 세포의 생체외 확장을 위한 방법 및 이의 용도
AU2019387494A1 (en) 2018-11-30 2021-06-10 Juno Therapeutics, Inc. Methods for dosing and treatment of B cell malignancies in adoptive cell therapy
DK3886875T3 (da) 2018-11-30 2024-07-29 Juno Therapeutics Inc Behandlingsfremgangsmåder under anvendelse af adoptiv celleterapi
JP7429882B2 (ja) * 2018-12-19 2024-02-09 インサーム（インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル） キメラ抗原受容体を発現する粘膜関連インバリアントｔ（ｍａｉｔ）細胞
MX2021007392A (es) 2018-12-20 2021-08-24 Novartis Ag Regimen de dosificacion y combinacion farmaceutica que comprende derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona.
MA54863A (fr) 2019-01-29 2021-12-08 Juno Therapeutics Inc Anticorps et récepteurs antigéniques chimériques spécifiques du récepteur orphelin-1 de type récepteur à tyrosine kinase (ror1)
EA202192019A1 (ru) 2019-02-15 2021-11-02 Новартис Аг Производные 3-(1-оксо-5-(пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-диона и пути их применения
ES2982474T3 (es) 2019-02-15 2024-10-16 Novartis Ag Derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidin-1,6-diona sustituidos y usos de estos
GB2613715B (en) 2019-02-20 2023-12-06 Fred Hutchinson Cancer Center Binding proteins specific for RAS neoantigens and uses thereof
AU2020232691B2 (en) 2019-03-05 2023-06-29 Nkarta, Inc. CD19-directed chimeric antigen receptors and uses thereof in immunotherapy
EP3962519A1 (en) 2019-05-01 2022-03-09 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified cd247 locus, related polynucleotides and methods
CA3136737A1 (en) 2019-05-01 2020-11-05 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a recombinant receptor from a modified tgfbr2 locus, related polynucleotides and methods
CA3140064A1 (en) 2019-05-16 2020-11-19 University Of Washington Lockr-mediated recruitment of car t cells
AU2020279974B2 (en) 2019-05-21 2024-12-19 Novartis Ag CD19 binding molecules and uses thereof
CA3139965A1 (en) 2019-06-07 2020-12-10 Ivie AIFUWA Automated t cell culture
WO2020252218A1 (en) 2019-06-12 2020-12-17 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapy of a cell-mediated cytotoxic therapy and an inhibitor of a prosurvival bcl2 family protein
CA3143108A1 (en) * 2019-06-19 2020-12-24 Julius-Maximilians-Universitat Wurzburg Ultramodular igg3-based spacer domain and multi-function site for implementation in chimeric antigen receptor design
CN114729383A (zh) 2019-07-02 2022-07-08 弗莱德哈钦森癌症研究中心 重组ad35载体及相关基因疗法改进
US20220251572A1 (en) * 2019-07-23 2022-08-11 Mnemo Therapeutics Immune cells defective for suv39h1
CA3145223A1 (en) * 2019-07-23 2021-01-28 Wen Yang Composition and method for adoptive immunotherapy
KR20220066892A (ko) 2019-08-22 2022-05-24 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Ｔ 세포 요법 및 제스트 동족체 2의 인핸서 (ｅｚｈ2) 억제제의 병용 요법 및 관련 방법
KR20220073738A (ko) 2019-08-30 2022-06-03 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 세포 분류를 위한 기계 학습 방법
US20240082372A1 (en) 2019-09-02 2024-03-14 Institut Curie Immunotherapy targeting tumor neoantigenic peptides
EP4028523A1 (en) 2019-09-09 2022-07-20 Scribe Therapeutics Inc. Compositions and methods for use in immunotherapy
EP4038097A1 (en) 2019-10-03 2022-08-10 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric tim4 receptors and uses thereof
EP4048304A1 (en) 2019-10-22 2022-08-31 Institut Curie Immunotherapy targeting tumor neoantigenic peptides
CA3159380A1 (en) 2019-10-30 2021-05-06 Juno Therapeutics Gmbh Cell selection and/or stimulation devices and methods of use
KR20220131892A (ko) 2019-11-05 2022-09-29 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 치료용 ｔ 세포 조성물의 속성 결정 방법
BR112022007548A2 (pt) 2019-11-07 2022-07-12 Juno Therapeutics Inc Combinação de uma terapia de célula t e (s)-3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benzilóxi)-1-oxo-1,3-di-hidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona
EP4065157A1 (en) 2019-11-26 2022-10-05 Novartis AG Cd19 and cd22 chimeric antigen receptors and uses thereof
US20230053787A1 (en) 2019-12-06 2023-02-23 Juno Therapeutics, Inc. Methods related to toxicity and response associated with cell therapy for treating b cell malignancies
WO2021113780A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to gprc5d-targeted binding domains and related compositions and methods
AU2020395319A1 (en) 2019-12-06 2022-07-14 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to BCMA-targeted binding domains and related compositions and methods
US20230056470A1 (en) 2019-12-20 2023-02-23 Novartis Ag Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases
MX2022009041A (es) 2020-01-24 2022-10-07 Juno Therapeutics Inc Metodos de dosificacion y tratamiento de linfoma folicular y linfoma de zona marginal en terapia celular adoptiva.
US20230090117A1 (en) 2020-01-28 2023-03-23 Juno Therapeutics, Inc. Methods for t cell transduction
IL295384A (en) 2020-02-12 2022-10-01 Juno Therapeutics Inc Cd19-directed chimeric antigen receptor t cell compositions and methods and uses thereof
CN115361955A (zh) 2020-02-12 2022-11-18 朱诺治疗学股份有限公司 针对bcma的嵌合抗原受体t细胞组合物及其方法和用途
WO2021167908A1 (en) 2020-02-17 2021-08-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for expansion of tumor infiltrating lymphocytes and use thereof
WO2021173674A1 (en) 2020-02-26 2021-09-02 A2 Biotherapeutics, Inc. Polypeptides targeting mage-a3 peptide-mhc complexes and methods of use thereof
CN113402612A (zh) 2020-03-17 2021-09-17 西比曼生物科技（香港）有限公司 靶向cd19和cd20的联合嵌合抗原受体及其应用
IL297147A (en) 2020-04-10 2022-12-01 Juno Therapeutics Inc Methods and Uses Related to Transgenic Cell Therapy with a Chimeric Antigen Receptor Directed to a B-Cell Maturation Antigen
BR112022021788A2 (pt) 2020-04-28 2023-01-17 Juno Therapeutics Inc Combinação de terapia com células t direcionada para bcma e um composto imunomodulador
EP4149952A1 (en) 2020-05-12 2023-03-22 Institut Curie Neoantigenic epitopes associated with sf3b1 mutations
IL298114A (en) * 2020-05-12 2023-01-01 Lyell Immunopharma Inc Chimeric antigen receptor spacers
JP2023528215A (ja) 2020-05-13 2023-07-04 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 臨床応答に関連する特徴量の特定方法およびその使用
KR20230022868A (ko) 2020-05-13 2023-02-16 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 재조합 수용체를 발현하는 공여자-배치 세포의 제조 방법
AU2021275239A1 (en) 2020-05-21 2022-12-15 Board Of Regents, The University Of Texas System T cell receptors with VGLL1 specificity and uses thereof
WO2021235894A1 (en) * 2020-05-22 2021-11-25 Green Cross Lab Cell Corporation Anti-HER2 Antibody or Antigen-binding Fragment thereof, and Chimeric Antigen Receptor Comprising Same
WO2021252920A1 (en) 2020-06-11 2021-12-16 Novartis Ag Zbtb32 inhibitors and uses thereof
MX2022015852A (es) 2020-06-23 2023-01-24 Novartis Ag Regimen de dosificacion que comprende derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona.
US20240216508A1 (en) 2020-06-26 2024-07-04 Juno Therapeutics Gmbh Engineered t cells conditionally expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods
AU2021308078A1 (en) 2020-07-17 2023-02-09 Children's Hospital Los Angeles Chimeric MyD88 receptors for redirecting immunosuppressive signaling and related compositions and methods
US20230303974A1 (en) 2020-07-30 2023-09-28 Institut Curie Immune Cells Defective for SOCS1
EP4188549A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 Novartis AG Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
KR20230095918A (ko) 2020-08-05 2023-06-29 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Ror1-표적 결합 도메인에 대한 항이디오타입 항체 및 관련 조성물 및 방법
WO2022036285A1 (en) 2020-08-14 2022-02-17 Cero Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating cancer with chimeric tim receptors in combination with inhibitors of poly (adp-ribose) polymerase
WO2022036287A1 (en) 2020-08-14 2022-02-17 Cero Therapeutics, Inc. Anti-cd72 chimeric receptors and uses thereof
WO2022036265A1 (en) 2020-08-14 2022-02-17 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric tim receptors and uses thereof
CN112111014A (zh) * 2020-09-22 2020-12-22 廖文强 一种抗氧化嵌合型抗原受体和免疫细胞
WO2022066965A2 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting sox2 antigens
WO2022066973A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting pbk or oip5 antigens
NL2026614B1 (en) 2020-10-02 2022-06-03 Academisch Ziekenhuis Leiden T cell receptors directed against bob1 and uses thereof
TW202222841A (zh) 2020-10-06 2022-06-16 福瑞德哈金森腫瘤研究中心 用於治療表現mage-a1之疾病的組成物及方法
CA3199447A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 Asher Biotherapeutics, Inc. Fusions with cd8 antigen binding molecules for modulating immune cell function
EP4240756A1 (en) 2020-11-04 2023-09-13 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified invariant cd3 immunoglobulin superfamily chain locus and related polynucleotides and methods
IL302412A (en) 2020-11-06 2023-06-01 Novartis Ag Anti-cd19 agent and b cell targeting agent combination therapy for treating b cell malignancies
EP4243839A1 (en) 2020-11-13 2023-09-20 Catamaran Bio, Inc. Genetically modified natural killer cells and methods of use thereof
US20220195396A1 (en) * 2020-12-03 2022-06-23 Century Therapeutics, Inc. Genetically Engineered Cells and Uses Thereof
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
CN112481284B (zh) * 2020-12-07 2023-07-25 深圳瑞吉生物科技有限公司 一种编码CAR基因的mRNA、组合mRNA、构建方法、CAR-T细胞和应用
EP4259648A4 (en) * 2020-12-08 2025-03-26 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst ANTI-EGFR CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS
EP4259651A2 (en) 2020-12-14 2023-10-18 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2022133030A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapy of a cell therapy and a bcl2 inhibitor
AU2021401984A1 (en) 2020-12-16 2023-07-06 Juno Therapeutics, Inc. Threshold gating for flow cytometry methods
CA3204161A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 Jagesh Vijaykumar SHAH Use of cd8-targeted viral vectors
WO2022182891A1 (en) 2021-02-25 2022-09-01 Lyell Immunopharma, Inc. Ror1 targeting chimeric antigen receptor
AU2022227021A1 (en) 2021-02-26 2023-09-21 Kelonia Therapeutics, Inc. Lymphocyte targeted lentiviral vectors
WO2022187406A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a t cell therapy and a dgk inhibitor
EP4304635A1 (en) 2021-03-11 2024-01-17 Mnemo Therapeutics Tumor neoantigenic peptides and uses thereof
EP4304632A2 (en) 2021-03-11 2024-01-17 Mnemo Therapeutics Tumor neoantigenic peptides
JP2024510217A (ja) 2021-03-11 2024-03-06 アンスティテュ・クリー 膜貫通ネオ抗原ペプチド
CA3208944A1 (en) 2021-03-22 2022-09-29 Edith NALBANDIAN Method to assess potency of viral vector particles
US20240168012A1 (en) 2021-03-22 2024-05-23 Juno Therapeutics, Inc. Methods of determining potency of a therapeutic cell composition
JP2024513054A (ja) 2021-03-29 2024-03-21 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド リンパ腫の治療のためのｃａｒ ｔ細胞療法および免疫調節化合物の組合せ
CN117858719A (zh) 2021-03-29 2024-04-09 朱诺治疗学股份有限公司 使用检查点抑制剂疗法和car t细胞疗法的组合进行给药和治疗的方法
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
WO2022221726A2 (en) 2021-04-16 2022-10-20 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapies with bcma-directed t cell therapy
CN117529333A (zh) 2021-04-16 2024-02-06 细胞基因公司 对先前进行过干细胞移植的患者的t细胞疗法
EP4334341A2 (en) 2021-05-06 2024-03-13 Juno Therapeutics GmbH Methods for stimulating and transducing t cells
TW202317602A (zh) 2021-07-15 2023-05-01 福瑞德哈金森腫瘤中心 嵌合多肽
WO2023010097A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric tim4 receptors and uses thereof
TW202321457A (zh) 2021-08-04 2023-06-01 美商薩那生物科技公司 靶向ｃｄ４之病毒載體之用途
AU2022324040A1 (en) 2021-08-04 2024-02-22 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Lat activating chimeric antigen receptor t cells and methods of use thereof
AU2022330106A1 (en) 2021-08-16 2024-03-21 Hemogenyx Pharmaceuticals Llc Anti-flt3 antibodies, cars, car t cells and methods of use
PE20241173A1 (es) 2021-10-14 2024-05-28 Arsenal Biosciences Inc Celulas inmunitarias que tienen arnhc coexpresados y sistemas de compuerta logica
WO2023081715A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Viracta Therapeutics, Inc. Combination of car t-cell therapy with btk inhibitors and methods of use thereof
KR20240112994A (ko) 2021-11-03 2024-07-19 셀진 코포레이션 골수종을 치료하는 데 사용하기 위한 b-세포 성숙 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체
EP4444874A1 (en) 2021-12-09 2024-10-16 Zygosity Limited Vector
US20240408192A1 (en) 2021-12-17 2024-12-12 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae attachment glycoproteins
EP4448549A2 (en) 2021-12-17 2024-10-23 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae fusion glycoproteins
EP4456910A1 (en) 2021-12-28 2024-11-06 Mnemo Therapeutics Immune cells with inactivated suv39h1 and modified tcr
JP2025504882A (ja) 2022-01-21 2025-02-19 ムネモ・セラピューティクス Ｒｎａによるｓｕｖ３９ｈ１発現の調節
WO2023147515A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Juno Therapeutics, Inc. Methods of manufacturing cellular compositions
EP4472646A1 (en) 2022-02-01 2024-12-11 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
WO2023150801A2 (en) * 2022-02-07 2023-08-10 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Recombinant proteins that stimulate an immune response in the presence of naturally inhibitory ligand binding
NL2030990B1 (en) 2022-02-17 2023-09-01 Academisch Ziekenhuis Leiden T cell receptors directed against jchain and uses thereof
WO2023156587A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of tcr-deficient car-tregs in combination with anti-tcr complex monoclonal antibodies for inducing durable tolerance
AU2023223404A1 (en) 2022-02-22 2024-08-29 Juno Therapeutics, Inc. Proteinase 3 (pr3) chimeric autoantibody receptor t cells and related methods and uses
NL2031118B1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Academisch Ziekenhuis Leiden T cell receptors directed against transcription factor wt1 and uses thereof
AU2023236826A1 (en) 2022-03-18 2024-09-26 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Genetically engineered t-cell co-receptors and methods of use thereof
EP4499134A1 (en) 2022-03-24 2025-02-05 Institut Curie Immunotherapy targeting tumor transposable element derived neoantigenic peptides in glioblastoma
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
WO2023196933A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Chimeric antigen receptor t cells and methods of use thereof
WO2023196921A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Granzyme expressing t cells and methods of use
WO2023211972A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Medical University Of South Carolina Chimeric antigen receptor modified regulatory t cells for treating cancer
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
WO2023213969A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Juno Therapeutics Gmbh Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use
KR20250008774A (ko) 2022-05-11 2025-01-15 셀진 코포레이션 T 세포 요법 및 그의 생산과 관련된 방법 및 용도
WO2023220655A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Celgene Corporation Methods to overcome drug resistance by re-sensitizing cancer cells to treatment with a prior therapy via treatment with a t cell therapy
EP4525899A1 (en) 2022-05-17 2025-03-26 Umoja Biopharma, Inc. Manufacturing viral particles
EP4279085A1 (en) 2022-05-20 2023-11-22 Mnemo Therapeutics Compositions and methods for treating a refractory or relapsed cancer or a chronic infectious disease
WO2023230581A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Methods of manufacturing t cell therapies
WO2023230548A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Method for predicting response to a t cell therapy
AU2023281726A1 (en) * 2022-06-01 2025-01-09 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Recombinant receptors binding b cell activation factor receptor and uses thereof
WO2023237663A1 (en) 2022-06-09 2023-12-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of the f359l missense irf4 variant for increasing the stability of regulatory t cells
NL2032130B1 (en) 2022-06-10 2023-12-18 Academisch Ziekenhuis Leiden T cell receptors directed against melanoma-associated antigen and uses thereof
KR20250029137A (ko) 2022-06-22 2025-03-04 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Cd19-표적화된 car t 세포의 2차 요법을 위한 치료 방법
WO2024006960A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Juno Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
IL318416A (en) 2022-08-05 2025-03-01 Juno Therapeutics Inc Chimeric antigen receptors specific for GPRC5D and BCMA
AU2023329484A1 (en) 2022-08-26 2025-02-20 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for delta-like ligand 3 (dll3)
WO2024047110A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to generate more efficient car-t cells
WO2024054944A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a t cell therapy and continuous or intermittent dgk inhibitor dosing
WO2024062138A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Mnemo Therapeutics Immune cells comprising a modified suv39h1 gene
WO2024074713A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to generate improving car-t cells
WO2024081820A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells
WO2024097905A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 Celgene Corporation Methods of treatment with t cell therapy and immunomodulatory agent maintenance therapy
TW202434735A (zh) 2022-11-04 2024-09-01 美商烏莫賈生物製藥股份有限公司 展示黏著分子融合的顆粒
WO2024098028A2 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Umoja Biopharma, Inc. Lentiviral particles displaying fusion molecules and uses thereof
WO2024100604A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Juno Therapeutics Gmbh Methods for manufacturing engineered immune cells
NL2033510B1 (en) 2022-11-11 2024-05-28 Academisch Ziekenhuis Leiden T cell receptors directed against cancer-associated antigens and uses thereof
WO2024102948A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 Celgene Corporation Fc receptor-homolog 5 (fcrh5) specific binding molecules and bispecific t-cell engaging antibodies including same and related methods
WO2024124132A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Juno Therapeutics, Inc. Machine learning methods for predicting cell phenotype using holographic imaging
WO2024129778A2 (en) 2022-12-13 2024-06-20 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for baff-r and cd19 and methods and uses thereof
WO2024130179A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Repertoire Immune Medicines, Inc. T cell receptors binding hpv-16 epitopes
WO2024145599A1 (en) * 2022-12-29 2024-07-04 Kelonia Therapeutics, Inc. Recombinant retrovirus, compositions, and methods of use
WO2024141977A1 (en) 2022-12-29 2024-07-04 Astellas Pharma Inc. Engineered natural killer cells and related methods
WO2024161021A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Juno Therapeutics Gmbh Methods for non-viral manufacturing of engineered immune cells
WO2024182516A1 (en) 2023-02-28 2024-09-06 Juno Therapeutics, Inc. Cell therapy for treating systemic autoimmune diseases
WO2024186656A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Arsenal Biosciences, Inc. Systems targeting psma and ca9
TW202436346A (zh) 2023-03-13 2024-09-16 美商亞森諾生物科學公司 合成路徑活化劑
WO2024215987A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Sotio Biotech Inc. IMMUNE CELLS FOR TREATING CANCER IN COMBINATION WITH IL-15/IL-15Rα CONJUGATES
WO2024220560A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered protein g fusogens and related lipid particles and methods thereof
WO2024220588A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Juno Therapeutics, Inc. Cytotoxicity assay for assessing potency of therapeutic cell compositions
WO2024220574A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Universal protein g fusogens and adapter systems thereof and related lipid particles and uses
WO2024220598A2 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Lentiviral vectors with two or more genomes
NL2034657B1 (en) 2023-04-21 2024-10-28 Academisch Ziekenhuis Leiden RCN1-derived TEIPP neoantigens and uses thereof
NL2034658B1 (en) 2023-04-21 2024-10-28 Academisch Ziekenhuis Leiden TIMP3-derived TEIPP neoantigens and uses thereof
WO2024226827A2 (en) 2023-04-25 2024-10-31 Arsenal Biosciences, Inc. Novel receptors for transcription regulation
WO2024226858A1 (en) 2023-04-26 2024-10-31 Juno Therapeutics, Inc. Methods for viral vector manufacturing
WO2024243365A2 (en) 2023-05-23 2024-11-28 Juno Therapeutics, Inc. Activation markers of t cells and method for assessing t cell activation
WO2024243441A1 (en) 2023-05-24 2024-11-28 Kumquat Biosciences Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof
WO2024259376A2 (en) 2023-06-14 2024-12-19 Arsenal Biosciences, Inc. Non-viral cell engineering
WO2025054202A1 (en) 2023-09-05 2025-03-13 Sana Biotechnology, Inc. Method of screening a sample comprising a transgene with a unique barcode
WO2025052001A1 (en) 2023-09-07 2025-03-13 Mnemo Therapeutics Methods and compositions for improving immune response
EP4520334A1 (en) 2023-09-07 2025-03-12 Mnemo Therapeutics Methods and compositions for improving immune response

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU650085B2 (en) 1990-11-13 1994-06-09 Immunex Corporation Bifunctional selectable fusion genes
US5851828A (en) 1991-03-07 1998-12-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
IL101147A (en) * 1991-03-07 2004-06-20 Gen Hospital Corp Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
JPH09500783A (ja) 1993-05-21 1997-01-28 ターゲッティッド ジェネティクス コーポレイション シトシンデアミナーゼ（ｃｄ）遺伝子に基づく二機能性選択融合遺伝子
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
JP5312721B2 (ja) * 2000-11-07 2013-10-09 シティ・オブ・ホープ Ｃｄ１９特異的再指向免疫細胞
US20030148982A1 (en) * 2001-11-13 2003-08-07 Brenner Malcolm K. Bi-spcific chimeric T cells
PT1755674E (pt) 2004-05-14 2015-02-05 Alexion Pharma Inc Prolongamento da sobrevivência de um aloenxerto por inibição da atividade do complemento
US20080131415A1 (en) 2006-11-30 2008-06-05 Riddell Stanley R Adoptive transfer of cd8 + t cell clones derived from central memory cells
ES2666667T3 (es) 2008-01-29 2018-05-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Identificación de células T CD8+ que son CD161 hi y/o IL-18R (alfa) hi y tienen una capacidad de evacuación rápida de fármacos
HRP20211788T1 (hr) 2008-08-26 2022-02-18 City Of Hope Postupak i pripravci za poboljšanje anti-tumorskog efektorskog funkcioniranja t stanica
EP2496698B1 (en) 2009-11-03 2019-01-09 City of Hope TRUNCATED EPIDERIMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFRt) FOR TRANSDUCED T CELL SELECTION
US9163258B2 (en) 2010-07-23 2015-10-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method for the treatment of obesity
PH12013501201A1 (en) * 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
CN103502438A (zh) 2011-03-23 2014-01-08 弗雷德哈钦森癌症研究中心 用于细胞免疫治疗的方法和组合物
CN103917319B (zh) 2011-09-06 2017-09-08 艾默生电气公司 便携式紧凑型攻丝机
WO2013123061A1 (en) 2012-02-13 2013-08-22 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
JP2015513399A (ja) 2012-02-22 2015-05-14 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 癌の治療のために有用なｔ細胞の存続的集団を作製するための組成物および方法
KR20220025161A (ko) 2012-08-20 2022-03-03 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 세포 면역요법을 위한 방법 및 조성물
WO2014097442A1 (ja) 2012-12-20 2014-06-26 三菱電機株式会社 車載装置及びプログラム
US9108442B2 (en) 2013-08-20 2015-08-18 Ricoh Company, Ltd. Image forming apparatus

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARLOS A. RAMOS等: "Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Engineered Lymphocytes for Cancer Therapy", 《EXPERT OPIN BIOL THER.》 *
MICHAEL C. JENSEN等: "Anti-Transgene Rejection Responses Contribute to Attenuated Persistence of Adoptively Transferred CD20/CD19-Specific Chimeric Antigen Receptor Re-directed T Cells in Humans", 《BIOL BLOOD MARROW TRANSPLANT》 *
MICHAEL HUDECEK等: "The B-cell tumor–associated antigen ROR1 can be targeted with T cells modified to express a ROR1-specific chimeric antigen receptor", 《BLOOD》 *
XIULI WANG等: "Atransgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, andablation of engineered cells", 《BLOOD》 *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105985444A (zh) * 2015-02-05 2016-10-05 博生吉医药科技(苏州)有限公司 一种嵌合抗原受体、以及快速构建嵌合抗原受体的方法及应用
CN105985444B (zh) * 2015-02-05 2024-02-13 博生吉安科细胞技术有限公司 一种嵌合抗原受体、以及快速构建嵌合抗原受体的方法及应用
CN108348550A (zh) * 2015-07-21 2018-07-31 希望之城公司 用于表达嵌合抗原受体和其它受体的t细胞
US12115189B2 (en) 2015-07-21 2024-10-15 City Of Hope T cells for expression of chimeric antigen receptors and other receptors
WO2017028374A1 (en) * 2015-08-20 2017-02-23 Beijing Marino Biotechnology Pty Ltd. Construct, genetically modified lymphocyte, preparation method and usage thereof
CN106978442A (zh) * 2016-01-18 2017-07-25 爱康得生物医学技术（苏州）有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞的制备方法
CN109562151A (zh) * 2016-06-06 2019-04-02 朱诺治疗学股份有限公司 使用过继细胞疗法治疗b细胞恶性肿瘤的方法
CN110603265B (zh) * 2017-01-09 2024-01-30 莱蒂恩技术公司 用于用抗间皮素免疫治疗癌症的组合物和方法
CN110603265A (zh) * 2017-01-09 2019-12-20 莱蒂恩技术公司 用于用抗间皮素免疫治疗癌症的组合物和方法
CN107641615A (zh) * 2017-09-22 2018-01-30 苏州大学 一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法
CN107759699A (zh) * 2017-10-18 2018-03-06 银丰生物工程集团有限公司 靶向cd30抗原的转基因t细胞及其制备方法与应用
US11802163B2 (en) 2017-11-10 2023-10-31 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting glypican-3 or mesothelin
CN111683962A (zh) * 2017-11-10 2020-09-18 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体
WO2019128857A1 (zh) * 2017-12-28 2019-07-04 上海细胞治疗研究院 一种外源抗体基因拷贝数的检测方法和试剂盒
CN112969467A (zh) * 2018-10-31 2021-06-15 贝里坤制药股份有限公司 具有自杀开关的t细胞
CN114829402A (zh) * 2019-09-27 2022-07-29 南京艾美斐生物医药科技有限公司 抗ror1抗体及其制备方法与应用
WO2022222846A1 (zh) * 2021-04-22 2022-10-27 河北森朗生物科技有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体、制备方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
BR122020002988A2 (zh) 2017-11-28
RU2015109631A (ru) 2016-10-10
AU2018204209A1 (en) 2018-07-05
SG11201501259QA (en) 2015-03-30
AU2018204209C1 (en) 2022-08-18
NZ745375A (en) 2020-09-25
BR112015002816A8 (pt) 2023-04-18
DK3824905T3 (da) 2025-03-17
JP2019193676A (ja) 2019-11-07
US20210052649A1 (en) 2021-02-25
PH12019550223A1 (en) 2024-02-19
BR122020002986A8 (pt) 2023-04-18
RU2700765C2 (ru) 2019-09-19
IL269270A (en) 2019-11-28
US20240390491A1 (en) 2024-11-28
HRP20210011T1 (hr) 2021-04-30
PT2884999T (pt) 2021-01-05
AU2023266352A1 (en) 2023-12-14
RS61345B1 (sr) 2021-02-26
AU2021200249A1 (en) 2021-03-18
IL293944A (en) 2022-08-01
JP6574381B2 (ja) 2019-09-11
JP6997744B2 (ja) 2022-02-04
US10736918B2 (en) 2020-08-11
SMT202100005T1 (it) 2021-05-07
MX2020012744A (es) 2021-02-22
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