ES2926513T3

ES2926513T3 - Métodos para evaluar la presencia o ausencia de virus competente en replicación

Info

Publication number: ES2926513T3
Application number: ES17754530T
Authority: ES
Inventors: Allison Bianchi; Ruth Berry
Original assignee: Juno Therapeutics Inc
Current assignee: Juno Therapeutics Inc
Priority date: 2016-07-29
Filing date: 2017-07-28
Publication date: 2022-10-26
Anticipated expiration: 2037-07-28
Also published as: JP7483373B2; CA3031994A1; US20230091137A1; JP2019521695A; US20200056249A1; CN109804089A; MA45783A; MX2019001186A; WO2018023094A1; US11421287B2; AU2017301881A1; JP2022130714A; EP3491152A1; EP3491152B1

Abstract

Se proporcionan métodos para detectar retrovirus competentes para la replicación en una muestra que contiene una célula transducida con una partícula de vector viral que codifica una molécula recombinante y/o heteróloga, por ejemplo, un producto génico heterólogo. Los métodos pueden incluir evaluar la transcripción de uno o más genes diana, tales como genes virales, que se expresan en un retrovirus pero no se expresan en la partícula del vector viral. Se puede determinar la presencia de retrovirus competentes para la replicación si los niveles de ARN de uno o más genes diana son superiores a un valor de referencia, que puede medirse directa o indirectamente, incluso a partir de una muestra de control positivo que contiene ARN del respectivo gen diana en un nivel conocido y/o en o por encima del límite de detección del ensayo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para evaluar la presencia o ausencia de virus competente en replicación

Listado de secuencias

La presente solicitud se presenta junto con un Listado de Secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado 735042005640SeqList.TXT, creado el 28 de julio de 2017, que tiene un tamaño de 40.464 bytes.

Campo

La presente invención proporciona métodos para detectar la presencia o ausencia de, o el riesgo de, un retrovirus competente en la replicación. Los métodos incluyen evaluar los niveles de ARN de uno o más genes objetivo seleccionados de env, gag, pol y rev, a partir de los cuales los productos génicos se expresan en ciertas células infectadas con un retrovirus competente en la replicación, como un gammaretrovirus o un lentivirus, pero que no están presentes en un vector viral usado para transducir células con un ácido nucleico heterólogo y que no están presentes y/o se expresan, o no se espera que estén presentes, en células que no contienen retrovirus competentes en la replicación. Puede determinarse la presencia de retrovirus competentes en la replicación si los niveles de ARN de uno o más genes objetivo son superiores a un valor de referencia, lo que puede medirse directa o indirectamente, por ejemplo, a partir de una muestra de control positiva que contiene el gen objetivo.

Antecedentes

Las partículas de vectores retrovirales, como las partículas de vectores gammaretrovirales y lentivirales, se usan en varias aplicaciones clínicas, incluyendo la introducción de genes terapéuticos en células y/o sujetos. Tales partículas de vectores virales están manipuladas para ser defectuosas en la replicación, sin embargo, en muchos casos puede ser deseable o incluso necesario verificar la ausencia de virus competentes en la replicación (por ejemplo, como retrovirus competentes en la replicación (RCR) o lentivirus competentes en la replicación (RCL)) en una muestra o composición, como una composición terapéutica o farmacéutica formulada para su administración. Por ejemplo, en ciertas aplicaciones, los métodos se usan para verificar o confirmar que no se ha producido RCR durante los pasos de generación o procesamiento, como a través de la recombinación homóloga o no homóloga entre el vector de transferencia, los componentes de empaquetamiento, y/o elementos virales endógenos en las células usadas para la producción de las partículas del vector viral. Hay varios métodos disponibles para dicha confirmación y verificación, como verificar la ausencia de virus competentes en la replicación, por ejemplo, durante o después de la generación y el procesamiento, en composiciones terapéuticas formuladas y/o productos farmacéuticos para administración, como células manipuladas y/o en muestras de sujetos, por ejemplo, aquellos que han recibido terapias que contienen células transducidas con partículas de vectores virales. Sin embargo, los métodos existentes pueden consumir demasiado tiempo y/o conllevar el riesgo de resultados falsos positivos. Hay una necesidad de métodos mejorados para detectar RCR.

La Patente de Estados Unidos N° 6712612 describe una línea de células auxiliares retroviral segura y estable y composiciones y métodos relacionados.

Miskin et al. "Assays for the Quality Control of Lentiviral Vectors" In: "Concepts in Genetic Medicine", 1 de enero de 2008 (2008-01-01), John Wiley & Sons, describe métodos para detectar la presencia de un lentivirus competente en replicación en preparaciones de vectores para su uso en ensayos clínicos en humanos.

Sumario

La presente invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. En particular, la presente invención proporciona un método para detectar la presencia o ausencia de, o el riesgo de, un retrovirus competente en la replicación que comprende:

a) determinar un nivel de un parámetro en una muestra de prueba, en donde la muestra de prueba es o se deriva de una muestra biológica o una parte de la misma, y en donde el nivel se correlaciona inversamente con la cantidad de un ARN viral en la muestra biológica, la muestra biológica comprendiendo por lo menos una célula que se ha transducido con un vector retroviral y contiene un ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga, en donde:

la presencia, ausencia o cantidad o concentración del ARN viral en la muestra biológica indica una presencia o ausencia, o riesgo de, un retrovirus competente en la replicación en la muestra biológica, o una muestra de la que se deriva la muestra biológica;

el ARN viral se requiere para, o codifica un producto génico o una parte específicamente identificable del mismo que se requiere para la competencia de la replicación de un virus competente en replicación; el ARN viral es de los genes env, gag, pol o rev;

la determinación comprende realizar PCR cuantitativa con transcriptasa inversa (RT-qPCR); y

el parámetro es o comprende un valor de umbral de ciclo (Ct).

La presente invención también proporciona un método para detectar la presencia o ausencia de, o el riesgo de, un retrovirus competente en la replicación que comprende:

a) determinar un primer nivel de un primer parámetro en una muestra de prueba, en donde dicho primer nivel del primer parámetro se correlaciona inversamente con la cantidad, en una muestra biológica, de un primer ARN viral;

b) determinar o evaluar un segundo nivel de un segundo parámetro en una muestra de prueba, que opcionalmente es la misma muestra de prueba o una diferente, en donde dicho segundo nivel del segundo parámetro se correlaciona inversamente con la cantidad, en la muestra biológica, de un segundo ARN viral distinto del primer ARN viral;

en donde por lo menos una célula que contiene un ácido nucleico heterólogo, un producto génico heterólogo y/o un ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga ha sido transducida con un vector retroviral y la muestra biológica comprende por lo menos una célula que ha sido transducida con un vector retroviral y contiene un ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga;

en donde tanto la primera muestra de prueba como la segunda muestra de prueba, individualmente se derivan o contienen ARN derivado de la muestra biológica o una parte de la misma; y

en donde:

la presencia, ausencia o cantidad o concentración del primer ARN viral o del segundo ARN viral, y/o la presencia, ausencia o cantidad o concentración tanto del primer como del segundo ARN viral, en la muestra biológica indica una presencia o ausencia de, o riesgo de, un retrovirus competente en la replicación en la muestra biológica, o una muestra de la que se deriva la muestra biológica;

el primer ARN viral, el segundo ARN viral y/o tanto el primer como el segundo ARN viral se requieren para, o codifican, un producto génico o una parte específicamente identificable del mismo que se requiere para la competencia de replicación de un virus competente en la replicación;

el ARN viral es de los genes env, gag, pol o rev;

la determinación comprende realizar PCR cuantitativa con transcriptasa inversa (RT-qPCR); y el parámetro es o comprende un valor de umbral de ciclo (Ct).

En la presente, como parte de la invención reivindicada, se proporcionan métodos que incluyen: a) determinar un nivel de un parámetro en una muestra de prueba, en donde el parámetro o nivel indica o se correlaciona inversamente con la cantidad de ARN viral en una muestra biológica, la muestra biológica incluyendo por lo menos una célula que ha sido transducida con un vector retroviral y contiene un ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga, en donde: la presencia, ausencia o cantidad o concentración del ARN viral en la muestra biológica indica una presencia o ausencia, o riesgo de, un virus competente en la replicación en la muestra biológica, o una muestra de la que se deriva la muestra biológica; el ARN viral se requiere para, o codifica un producto génico o una parte específicamente identificable del mismo que se requiere para la competencia en la replicación de un virus competente en la replicación; el ARN viral es de los genes env, gag, pol o rev; la determinación comprende realizar PCR cuantitativa con transcriptasa inversa (RT-qPCR); y el parámetro es o comprende un valor de umbral de ciclo (Ct).

En algunas realizaciones, el método incluye además determinar la presencia, ausencia, concentración o cantidad del ARN viral en la muestra biológica o el riesgo de ello, en base a dicho nivel determinado de este modo. En algunas realizaciones, el método incluye además los pasos de: b) comparar el nivel del parámetro, determinado en (a), con un primer valor de referencia para el parámetro. En algunas realizaciones, la comparación indica la presencia, ausencia, concentración o cantidad del ARN viral en la muestra biológica o muestra derivada de la misma, o el riesgo de cualquiera de los anteriores.

En algunas realizaciones, el método incluye además determinar la presencia, ausencia o cantidad o concentración del ARN viral, o el riesgo de cualquiera de los anteriores, en la muestra biológica o parte de la misma; y/o determinar si el virus competente en la replicación está (o está potencialmente o es probable que esté) presente o en riesgo de estar presente en la muestra biológica, o en una parte de la misma.

En algunas realizaciones, se considera que la muestra biológica tiene, o corre el riesgo de tener, la presencia del virus competente en la replicación, y/o tiene la presencia o por lo menos una cantidad umbral del ARN viral, si, y opcionalmente solo si, el nivel del parámetro determinado en (a) está por debajo del primer valor de referencia, en donde el nivel del parámetro se correlaciona inversamente con la cantidad de ARN viral en la muestra biológica; y/o la muestra biológica y/o una o más de por lo menos una célula se considera que no tiene, o no está en riesgo de tener, presencia del virus competente en la replicación, y/o no tiene la presencia o por lo menos un cantidad umbral del ARN viral, si, y opcionalmente solo si, el nivel del parámetro determinado en (a) está por encima del primer valor de referencia, en donde el nivel del parámetro se correlaciona inversamente con la cantidad de ARN viral en la muestra biológica.

En algunas realizaciones, la muestra biológica se considera negativa, no tiene, o no está en riesgo, incluso si se determina que está presente en la muestra biológica otro ARN viral requerido competente en la replicación; la muestra biológica se considera negativa, no tiene, o no está en riesgo, incluso si un nivel, en o por encima de un segundo valor de referencia, de un segundo parámetro que se correlaciona positivamente con una cantidad de otro ARN viral requerido competente en la replicación en la muestra biológica es o ha sido detectado en la muestra de prueba o en una segunda muestra de prueba derivada o que contiene ácido nucleico de la muestra biológica; y/o la muestra biológica se considera negativa, no tiene, o no está en riesgo, incluso si un nivel, en o por debajo de un segundo valor de referencia, de un segundo parámetro correlacionado negativamente con una cantidad de otro ARN viral requerido competente en la replicación, es o se ha detectado en la muestra de prueba u otra muestra de prueba derivada de o que contiene ácido nucleico de la muestra biológica.

En algunas realizaciones, se considera que la muestra biológica tiene, tiene potencialmente o corre el riesgo de tener la presencia del virus competente en la replicación, si (y opcionalmente solo si) se determina la presencia del ARN viral en la muestra biológica, y/o si (y opcionalmente solo si) se determina que una cantidad, que opcionalmente está en o por encima de una cantidad umbral, del ARN viral está en la muestra biológica; se considera que la muestra biológica tiene potencialmente o está en riesgo de presencia del virus competente en la replicación si (y opcionalmente solo si) se determina la presencia del ARN viral en la muestra biológica, y/o si (y opcionalmente solo si) se determina que una cantidad, que opcionalmente está en o por encima de una cantidad umbral, del ARN viral está en la muestra biológica, pero no se considera que contiene la presencia del virus competente en la replicación sin indicación adicional de riesgo y/o sin evaluar otro parámetro indicativo de otro ARN viral; y/o se considera que la muestra biológica no tiene, no tiene potencialmente y/o no está en riesgo de presencia del virus competente en la replicación, si se determina la ausencia del ARN viral en la muestra biológica, y/ o si se determina que una cantidad (o no más de la cantidad), cantidad que opcionalmente está en o por debajo de una cantidad umbral, del ARN viral está en la muestra biológica, opcionalmente incluso si se determina la presencia de otro ARN requerido para la competencia en la replicación del virus en la muestra biológica; y/o la muestra biológica se considera negativa para el virus competente en la replicación si el parámetro y/o el ARN viral es indetectable o no se detecta en la muestra de prueba y/o no se determina que esté presente en la muestra biológica.

En algunas realizaciones, el primer valor de referencia es un valor en o aproximadamente en o justo por encima de un nivel de umbral o un nivel mínimo detectable o lectura correspondiente al mismo; el primer valor de referencia es un valor del parámetro detectado en, y/o un valor de un parámetro indicativo de una cantidad de ARN en una muestra de control positiva; y/o el nivel del parámetro indica la presencia o ausencia del ARN viral en la muestra biológica; y/o el ARN viral incluye un ácido nucleico que codifica un primer gen viral seleccionado de env, gag, pol o rev; y/o el ácido nucleico heterólogo codifica una proteína heteróloga.

El parámetro evaluado en la muestra de prueba es o incluye un valor de umbral de ciclo (Ct).

En algunas realizaciones, se determina que el ARN viral o la expresión del mismo está presente o corre el riesgo de estar presente en la muestra biológica o en la muestra de prueba, si el valor de CT para la muestra de prueba está por debajo de un primer valor de referencia, que es una puntuación de Ct de referencia. La muestra de prueba es o se deriva de o contiene ARN derivado de la muestra biológica o una parte de la misma.

También se proporcionan en la presente como parte de la invención reivindicada métodos que incluyen a) determinar o evaluar un primer nivel de un primer parámetro en una muestra de prueba, en donde dicho primer nivel o primer parámetro se correlaciona inversamente con la cantidad, en una muestra biológica, de un primer ARN viral; b) determinar o evaluar un segundo nivel de un segundo parámetro en una muestra de prueba, que opcionalmente es la misma muestra de prueba o una diferente, en donde dicho segundo nivel o segundo parámetro se correlaciona inversamente con la cantidad, en la muestra biológica, de un segundo ARN viral distinto del primer ARN viral; en donde por lo menos una célula que contiene un ácido nucleico heterólogo, un producto génico heterólogo, y/o un ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga ha sido transducido con un vector viral y la muestra biológica comprende por lo menos una célula que ha sido transducida con un vector retroviral y contiene un ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga; en donde tanto la primera muestra de prueba como la segunda muestra de prueba, individualmente se derivan o contienen ARN derivado de la muestra biológica o una parte de la misma; y en donde: la presencia, ausencia o cantidad o concentración del primer ARN viral o el segundo ARN viral, y/o la presencia, ausencia o cantidad o concentración tanto del primer como del segundo ARN viral, en la muestra biológica indica una presencia o ausencia, o riesgo de, un virus competente en la replicación en la muestra biológica, o una muestra de la que se deriva la muestra biológica; el primer ARN viral, el segundo ARN viral, y/o tanto el primer como el segundo ARN viral, se requiere para, o codifica un producto génico o una parte específicamente identificable del mismo que se requiere para la competencia en la replicación de un virus competente en la replicación; el ARN viral es de los genes env, gag, pol o rev; la determinación comprende realizar PCR cuantitativa con transcriptasa inversa (RT-qPCR); y el parámetro es o comprende un valor de umbral de ciclo (Ct).

En algunas realizaciones, el método incluye además determinar la presencia, ausencia, concentración o cantidad del primer y/o segundo ARN viral en la muestra biológica, o el riesgo del mismo, en base a dichos nivel o niveles así determinados. En algunas realizaciones, el método incluye además c) comparar el nivel del primer y/o el segundo parámetro determinado en (a) y/o (b) con un primer y/o segundo valor de referencia, en donde la comparación indica opcionalmente el presencia, ausencia, concentración o cantidad del ARN viral en la muestra biológica o muestra derivada de la misma, o el riesgo de cualquiera de los anteriores.

En algunas realizaciones, el método incluye además c) determinar la presencia, ausencia o cantidad o concentración del primer ARN viral o expresión, o riesgo de cualquiera de los anteriores, en la muestra biológica o parte de la misma, y/o determinar la presencia, ausencia, cantidad o concentración del segundo ARN viral o expresión, o riesgo de cualquiera de los anteriores, en la muestra biológica o parte de la misma; y/o d) determinar si un virus competente en la replicación está (o está potencialmente o es probable que esté) presente o en riesgo de estar presente en la muestra biológica o una parte de la misma, opcionalmente en base a la determinación en c).

El ARN viral proviene de los genes env, gag, pol o rev.

También se proporcionan en la presente como parte de la invención reivindicada métodos que incluyen a) evaluar un primer nivel de un primer parámetro en una muestra de prueba, que se correlaciona inversamente con la cantidad de un primer ARN viral en una muestra biológica, en donde el primer ARN viral es de un primer gen viral que es un gen env, y evaluar un nivel de un segundo parámetro en una muestra de prueba, que opcionalmente es la misma muestra de prueba o una diferente, en donde el segundo nivel del segundo parámetro se correlaciona inversamente con la cantidad de un segundo ARN viral en la muestra biológica, en donde el segundo ARN viral es de un gen seleccionado de un gen gag, pol y rev, en donde por lo menos una célula que contiene un ácido nucleico heterólogo, un producto génico heterólogo, y/o un ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga ha sido transducido con un vector retroviral y la muestra biológica comprende por lo menos una célula que ha sido transducida con un vector retroviral y contiene un ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga; en donde tanto la primera muestra de prueba como la segunda muestra de prueba, individualmente se derivan o contienen ARN derivado de la muestra biológica o una parte de la misma; en donde: la presencia, ausencia o cantidad o concentración del primer ARN o gen viral o el segundo ARN o gen viral, y/o la presencia, ausencia o cantidad o concentración tanto del primer como del segundo ARN o gen viral, en la muestra biológica indica una presencia o ausencia de, o el riesgo de, un virus competente en la replicación en la muestra biológica, o una muestra de la que se deriva la muestra biológica; el primer ARN viral, el segundo ARN viral y/o tanto el primer como el segundo ARN viral se requieren para, o codifican, un producto génico o una parte específicamente identificable del mismo que se requiere para la competencia de replicación de un virus competente en replicación; el ARN viral es de los genes env, gag, pol o rev; la determinación comprende realizar PCR cuantitativa con transcriptasa inversa (RT-qPCR); y el parámetro es o comprende un valor de umbral de ciclo (Ct).

En algunos casos de la divulgación descrita en la presente, el parámetro es una presencia o ausencia de ARN viral. En algunas realizaciones, el valor de referencia, el primer valor de referencia y/o el segundo valor de referencia es o corresponde a un nivel de umbral o un nivel mínimo detectable. En algunas realizaciones, el valor de referencia, el primer valor de referencia y/o el segundo valor de referencia es un valor correspondiente a o para el parámetro en una muestra de prueba de control positiva, que opcionalmente contiene una cantidad o concentración conocida del ARN viral, el segundo ARN viral y/o el primer ARN viral.

En algunas realizaciones, se considera que la muestra biológica contiene o tiene el riesgo de contener o contener potencialmente un virus competente en la replicación si el método determina la presencia o una cantidad por encima de una cantidad umbral del primer y el segundo ARN viral en la muestra biológica, y opcionalmente no si el método determina la presencia o una cantidad por encima de una cantidad umbral para uno pero no para tanto el primer como el segundo ARN; y/o la muestra biológica se considera negativa para o que no contiene o no está en riesgo de contener o no contiene potencialmente un virus competente en la replicación, si el método determina la ausencia, la ausencia de una cantidad detectable, o una cantidad por debajo de una cantidad umbral del primer ARN viral, o del segundo ARN viral, y/o tanto del primer como del segundo ARN viral, en la muestra biológica.

En algunas realizaciones, la muestra biológica se considera negativa para el virus competente en la replicación si el nivel de ARN viral que codifica el primer y el segundo genes virales es indetectable en la muestra de prueba y/o no se determina que esté presente o presente por encima de un nivel de umbral en la muestra biológica.

En algunas realizaciones, el método incluye además un paso de aislamiento de ARN de la muestra biológica o una parte de la misma o una muestra o parte de la misma derivada de la muestra biológica, antes del paso a), en donde el ARN contiene ARN de uno o más de los por lo menos una célula.

El virus competente en la replicación es un retrovirus, y/o el ARN viral o el primer y/o segundo ARN viral es expresado por un retrovirus. En algunas realizaciones, el retrovirus es un gammaretrovirus. En algunas realizaciones, el retrovirus es un lentivirus.

En algunas realizaciones, la muestra biológica es de un ser humano o un mamífero y/o la una o más células son una célula primaria, que es opcionalmente una célula humana o de mamífero. En algunas realizaciones, la una o más células y/o muestras biológicas proceden de un banco de células maestras (MCB), un banco de células de trabajo (WCB) o una línea celular, o una muestra de las mismas. En algunas realizaciones, la por lo menos una célula o muestra biológica es o proviene de un material crioconservado (CMAT), un producto farmacéutico crioconservado (CDP) o un producto farmacéutico formulado (FDP) para terapia celular autóloga, o una muestra de los mismos. En algunas realizaciones, la por lo menos una célula o muestra biológica es o es de una célula que experimenta expansión, como expansión ex vivo, después de la transducción.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo o el producto génico heterólogo es o codifica un receptor recombinante, un receptor quimérico, opcionalmente un receptor de antígeno quimérico o un receptor de células T transgénico.

En algunas realizaciones, la determinación o evaluación se lleva a cabo usando uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del ARN viral, el primer ARN viral y/o el segundo ARN viral. En algunas realizaciones, el nivel de ARN viral que codifica el segundo gen viral se evalúa usando uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del segundo gen viral. En algunos casos descritos en la presente como parte de la divulgación, el nivel de ARN viral se evalúa mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. La determinación o evaluación incluye la realización de PCR cuantitativa con transcriptasa inversa (RT-qPCR).

El ARN viral y/o el primer y/o el segundo ARN viral y/o el ARN viral y/o el gen proceden de un retrovirus. En algunas realizaciones, el ARN viral, el primer ARN viral y/o el segundo ARN viral (o el gen que codifica cualquiera de los anteriores) es o está codificado por un gen implicado en la replicación y/o empaquetamiento de viriones. El ARN viral y/o el primer ARN viral y/o el segundo ARN viral (o el gen que codifica uno o más de los anteriores) no es un gen codificado por un vector de transferencia que se haya usado para transducir la célula transducida. En algunos casos de la divulgación, el ARN viral, el primer ARN viral y/o el segundo ARN viral codifican una proteína de superficie viral, una proteína de cubierta, un antígeno específico de grupo, una polimerasa derivada de virus, una transcriptasa inversa derivada de virus, un elemento regulador derivada de virus, un transactivador de la transcripción, o un elemento de respuesta.

En algunas realizaciones, el gen gag se selecciona del grupo que consiste de gag del virus de la leucemia murina (MMLV) y gag del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En algunas realizaciones, el gen env se selecciona de GaLV env y VSVG. En algunas realizaciones, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del primer gen viral incluyen una o más secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 4-5. En algunas realizaciones, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del primer gen viral incluyen una o más secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 16-24. En algunas realizaciones, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del segundo gen viral incluyen una o más secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 4-5. En algunas realizaciones, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del segundo gen viral incluyen una o más secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 16-24.

En algunas realizaciones, la evaluación o determinación incluye el uso de una sonda de hidrólisis específica para una secuencia del ARN viral, el gen viral, el primer ARN viral o el primer gen viral, o el segundo ARN viral o el segundo gen viral. En algunas realizaciones, la sonda de hidrólisis específica para una secuencia del primer gen viral incluye una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, la sonda de hidrólisis específica para una secuencia del primer gen viral incluye una secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 18, 21 o 24.

En algunas realizaciones, la evaluación, determinación o detección incluye el uso de una sonda de hidrólisis específica para una secuencia de uno o más del ARN viral, segundo ARN viral, primer ARN viral y/o segundo gen viral. En algunas realizaciones, la sonda de hidrólisis incluye una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, la sonda de hidrólisis específica para una secuencia del primer gen viral incluye una secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 18, 21 o 24

En algunas realizaciones, el método incluye además evaluar en la muestra de prueba un nivel de, o un nivel de un parámetro indicativo o correlativo con, un ARN que codifica un gen de control en la muestra de prueba o biológica, opcionalmente en donde el gen de control es o incluye p-actina y/u opcionalmente en donde el nivel del parámetro o gen de control se evalúa usando uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del gen de control, que individualmente incluyen opcionalmente una o más secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 1 o 2 o una de las 8-15, en donde opcionalmente el nivel se evalúa usando una sonda de hidrólisis específica para una secuencia del gen de control, que opcionalmente incluye una secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 3, 9, 12 o 15.

En algunas realizaciones, la evaluación o determinación incluye llevar a cabo una reacción multiplex, en donde opcionalmente el nivel, el primer nivel y/o el segundo nivel; y opcionalmente el nivel o parámetro indicativo o correlativo con el gen de control, se evalúa en la reacción multiplex.

En algunos casos de la divulgación, el parámetro, el primer parámetro y/o el segundo parámetro, individualmente, es o incluye una cantidad o cantidad relativa del ARN viral (o primer o segundo ARN viral), o un producto expresado a partir del mismo o de un gen viral correspondiente al ARN, que opcionalmente es un número de copias relativo, o un peso relativo, o es o incluye una concentración, o concentración relativa, del ARN viral (o primer o segundo ARN viral) o de un producto expresado a partir del mismo o de un gen viral correspondiente al ARN (o primer ARN o viral).

En algunas realizaciones, la cantidad es una cantidad absoluta o relativa. El parámetro es o incluye un valor de umbral de ciclo (Ct). En algunas realizaciones, se determina que el ARN viral o la expresión del mismo está presente o corre el riesgo de estar presente en la muestra biológica o en la muestra de prueba, si el valor de CT para la muestra de prueba está por debajo de un primer valor de referencia, que es un puntuación de Ct de referencia.

En algunas realizaciones, la muestra biológica y/o la una o más células son de un sujeto. En algunas realizaciones, dicha por lo menos una célula incluye una pluralidad de células, y en donde: dicha pluralidad de células y/o dicha muestra biológica incluye células en suspensión; dicha pluralidad de células y/o dicha muestra biológica incluye glóbulos blancos; y/o dicha pluralidad de células y/o dicha muestra biológica incluye células T o células NK.

Tanto la primera muestra de prueba como la segunda muestra de prueba, individualmente se derivan o contienen ARN derivado de la muestra biológica o una parte de la misma. En algunas realizaciones, la muestra de prueba evaluada para el primer ARN viral y la muestra de prueba evaluada para el segundo ARN son iguales o son partes de la misma muestra o composición. En algunas realizaciones, dicha pluralidad de células incluye células T no fraccionadas, células T CD8+ aisladas o células T CD4+ aisladas. En algunas realizaciones, dicha por lo menos una célula es una célula humana. En algunas realizaciones, la muestra de prueba es o es una parte de la muestra biológica.

En algunas realizaciones, se establecen criterios de aceptación para evaluar la validez de la PCR cuantitativa con transcriptasa inversa. En algunas realizaciones, los criterios de aceptación incluyen un porcentaje de eficacia de entre aproximadamente el 90% y el 110%. En algunas realizaciones, los criterios de aceptación incluyen un valor R2 de aproximadamente o mayor que o aproximadamente 0,95, 0,96, 0,97, 0,98 o 0,99. En algunas realizaciones, los métodos incluyen además la evaluación de la pureza, la integridad y/o la concentración del ARN.

En la presente, como parte de la divulgación, se describen cebadores que incluyen un oligonucleótido que incluye una secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-24. En algunos casos, el cebador incluye una fracción o marcador fluorescente.

También se describen en la presente como parte de la divulgación kits que incluyen uno o más cebadores de acuerdo con la divulgación. En algunos casos, el kit incluye además uno o más de agua libre de nucleasas, una transcriptasa inversa, una polimerasa, trifosfatos de desoxinucleótidos, un tampón y una ADNasa.

En algunas realizaciones, el método es capaz de detectar el ARN viral o el primer y/o el segundo ARN viral en una muestra de prueba en la que por lo menos 5 o por lo menos 10 o por lo menos 20 o por lo menos 50 o por lo menos 100 células en la muestra, o por 10 millones de células en la muestra de prueba o muestra biológica; y/o en donde el método es capaz de detectar una cantidad de ARN objetivo que no es superior a o aproximadamente 1,5 pg, 1 pg o 0,75 pg o menos de la objetivo viral, en la muestra de prueba y/o la muestra biológica.

Descripción detallada

A continuación se describen realizaciones de la invención en algunos de los casos y aspectos.

En la presente se describen métodos y composiciones para detectar la presencia, ausencia, cantidad y/o concentración de ARN viral de un retrovirus competente en la replicación en una muestra o composición, como una composición celular terapéutica que contiene células transducidas. En casos particulares, los métodos incluyen uno o más pasos para medir o determinar el nivel o la cantidad de un parámetro que indica o se correlaciona con la presencia, ausencia, cantidad y/o concentración del ARN viral. En algunos casos, la presencia, ausencia, cantidad y/o concentración del ARN viral en la muestra biológica indica la presencia o ausencia, o un riesgo asociado con la presencia o ausencia, de un retrovirus competente en la replicación. En algunos casos, el ARN viral es necesario para, o codifica un producto génico o parte específicamente identificable del mismo que se requiere para, la competencia de replicación de un virus competente en la replicación.

Los procesos de producción viral, incluyendo el proceso de producción retroviral, incluyen el uso de elementos de empaquetamiento viral. Para ciertos virus ejemplares basados en gammaretrovirales, una combinación de gag y pol del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV), junto con la envoltura del virus de la leucemia del simio Gibbon (GaLV env) se codifican todos en plásmidos separados con una secuencia homóloga mínima y promotores y potenciadores heterólogos, lo que reduce el riesgo de recombinación. El uso de una línea celular parental humana para la producción viral, en algunos aspectos, reduce adicionalmente el riesgo de recombinación eliminando la presencia de secuencias retrovirales homólogas endógenas. Sin embargo, generalmente se emplean pruebas de rCr en múltiples puntos durante el proceso de fabricación viral para garantizar la ausencia de RCR.

Hay dos categorías principales de ensayos que se usan actualmente para detectar RCR. El primero es un ensayo rápido basado en PCR dirigido a un ADN de un gen específico del vector viral (por ejemplo, GaLV env). El segundo es un ensayo de cocultivo basado en células en el que las células o el sobrenadante recogido se cocultivan primero con una línea celular permisiva durante unas pocas semanas para permitir la amplificación de cualquier virus de replicación existente, seguido de la incubación con una línea celular indicadora para detectar cualquier virus activo presente. Aunque el cocultivo de RCR basado en células se usa ampliamente, el ensayo es largo y costoso y, en algunos casos, los resultados del ensayo de cocultivo de RCR pueden no estar disponibles hasta después de que haya pasado el tiempo deseado para administrar un producto. Por el contrario, aunque las pruebas actuales basadas en PCR son más rápidas, esta técnica es propensa a falsos positivos.

Las composiciones y métodos descritos en algunos casos proporcionan un ensayo rápido y preciso capaz de detectar RCR contaminante con alta sensibilidad. Por ejemplo, en algunos casos, las composiciones y los métodos descritos en la presente miden de manera rápida y precisa los parámetros de una muestra, por ejemplo, una muestra de prueba y/o una muestra biológica que puede usarse para indicar la presencia o cantidad de ARN viral de un RCR. Las composiciones y métodos descritos son capaces de medir rápidamente tales parámetros sin amplificación previa en cultivo celular. Además, las composiciones y los métodos descritos proporcionan un grado más alto de sensibilidad que los métodos de PCR basados en ADN existentes.

Actualmente se utilizan vectores virales, dichos vectores retrovirales que incluyen vectores lentivirales y gammaretrovirales, para el desarrollo de terapias para abordar una amplia variedad de necesidades médicas no satisfechas. Los retrovirus deficientes en la replicación se generan para servir como sistemas de administración de genes que permiten una administración controlada del gen de interés. Tales vectores virales pueden usarse para administrar genes directamente, como en la terapia génica, o para administrar genes en las células para la producción de una terapia celular como la terapia con células CAR-T. Sin embargo, en casos raros, se plantea la hipótesis de que pueden surgir virus competentes en la replicación durante el proceso de administración de genes debido a eventos como la recombinación específica del sitio. Aunque tales eventos se consideran extremadamente raros y/o improbables, es ventajoso desarrollar pruebas u otras salvaguardas para detectar la presencia y/o riesgo de virus competente en la replicación en una muestra, por ejemplo una terapia como una terapia génica o terapia de células CAR-T, para confirmar que no haya virus competentes en la replicación en la muestra.

Los métodos y composiciones descritos en la presente son útiles para la detección sensible y precisa de posibles virus competentes en la replicación que pueden surgir durante la producción de vectores virales para la administración de genes. En algunos casos, los métodos descritos en la presente se usan para determinar si un virus competente en la replicación se ha contaminado, originado, desarrollado o se ha producido inadvertidamente a partir de los plásmidos y vectores virales usados para la transducción. En ciertos casos, los métodos de la presente invención se adaptan y/o utilizan para probar el virus competente en la replicación que puede tener o podría haber derivado de los mismos vectores virales que se usaron para la administración de genes. Por tanto, en algunos casos, los métodos descritos en la presente se utilizan para detectar la forma competente de replicación del virus que se ha usado para la transducción y/o la administración de genes. En casos particulares, los métodos descritos en la presente son especialmente útiles para la detección de genes virales que están presentes y/o se requieren para la versión competente en la replicación del virus. En algunos casos, los genes virales están presentes en los plásmidos usados para la producción de virus deficiente en la replicación.

En algunos casos, los métodos descritos incluyen uno o más pasos de medir o detectar uno o más parámetros que están asociados con el ARN viral, en oposición al ADN viral. Los casos particulares contemplan que la detección de parámetros que están asociados o se correlacionan con niveles o cantidades de ARN viral reduzca o prevenga casos de falsos positivos. Por ejemplo, sin estar limitados a la teoría, pueden producirse falsos positivos en las técnicas de PCR basadas en ADN como resultado del ADN residual de la línea productora viral que permanece presente en las reservas de vectores virales usadas para la transducción. En algunos aspectos, la detección de los parámetros asociados con y/o correlacionados con el ARN viral minimiza o evita la detección del ADN residual y, por lo tanto, minimiza o previene un falso positivo.

En algunos aspectos, los métodos descritos incluyen uno o más pasos para medir o detectar parámetros que están asociados con un nivel o cantidad de ARN viral que codifica genes específicos. En ciertos casos, los genes específicos que se evalúan o detectan midiendo estos parámetros tienen poca similitud con las secuencias de ARN humano normalmente endógenas y, por tanto, permiten una detección sensible y/o precisa de los genes virales. Por ejemplo, en algunos casos, el gen viral es del virus de la leucemia del simio Gibbon (GaLV).

En algunos casos, los métodos descritos en la presente son útiles para indicar la presencia de RCR y/o ARN viral de RCR en una muestra con por lo menos la misma o mayor sensibilidad que los métodos alternativos. En algunos casos, los métodos descritos pueden indicar una presencia o cantidad de RCR y/o ARN viral del RCR cuando el RCR o el ARN está por debajo de un umbral para la detección de otros métodos y/o es detectable en un punto temporal anterior en un proceso. Por ejemplo, en algunos casos, los métodos descritos en la presente son útiles para detectar el RCR o su ARN viral en una cantidad o nivel en una muestra que está por debajo del nivel umbral de detección de un ensayo de PCR basado en ADN. En ciertos casos, los métodos descritos en la presente son útiles para detectar RCR o su ARN viral en una cantidad o nivel en una muestra que se evalúa en un momento anterior en comparación con un protocolo de ensayo de RCR basado en cultivo celular. Por ejemplo, en ciertos casos, los métodos descritos en la presente son útiles para detectar RCR y/o ARN viral en una muestra analizada sin pases, amplificación o expansión mediante cocultivo con una línea celular permisiva entre la recogida de la muestra y la evaluación de RCR.

A menos que se defina de otra manera, se pretende que todos los términos de la técnica, anotaciones y otros términos o terminología técnica y científica usados en la presente tengan el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la materia reivindicada. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se describen en la presente por claridad y/o para facilitar la referencia, y la inclusión de tales descripciones en la presente no debe interpretarse necesariamente como una diferencia sustancial sobre lo que se entiende generalmente en la técnica.

Si una definición expuesta en la presente es contraria o de otra manera inconsistente con una definición expuesta en las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones a las que se hace referencia en la presente, prevalecerá la definición expuesta en la presente.

Los encabezados de las secciones usados en la presente son solo para propósitos organizativos y no deben interpretarse como una limitación de la materia descrita.

I. DETECCIÓN DE VIRUS COMPETENTES EN LA REPLICACIÓN

En la presente se describen métodos para detectar la presencia, ausencia o nivel de virus competente en la replicación en una muestra. En algunos casos, los métodos descritos en la presente incluyen medir, determinar, evaluar y/o cuantificar el valor, la cantidad o el nivel de un parámetro. En algunos casos, la cantidad, valor y/o nivel del parámetro indica o se correlaciona con la presencia, ausencia y/o cantidad o concentración de un ARN viral. En casos particulares, la presencia, ausencia o cantidad o concentración del ARN viral en la muestra biológica indica una presencia o ausencia, o riesgo de, un virus competente en la replicación. En ciertos casos, el ARN viral se requiere para, o codifica un producto génico o una parte específicamente identificable del mismo que se requiere para la competencia de replicación de un virus competente en replicación.

En algunos aspectos, los métodos descritos implican medir o evaluar parámetros para determinar si un retrovirus competente en la replicación está presente en una muestra que contiene o se deriva de una o más células transducidas con una partícula de vector viral. Por tanto, en algunos casos, la partícula del vector viral se ha usado o puede usarse para transducir las células que se evalúan posteriormente mediante los métodos descritos para asegurar que el virus usado para la transducción no está presente en una forma competente en la replicación.

En algunos casos, el parámetro se mide en una muestra. En casos particulares, la muestra es una muestra de prueba y/o una muestra biológica. En ciertos casos, la muestra de prueba es la muestra biológica. En algunos casos, la muestra de prueba se deriva de la muestra biológica. En casos particulares, la muestra de prueba es una parte de una muestra biológica. En algunos casos, la muestra de prueba se origina, se deriva y/o se toma de la muestra biológica y/o de la misma fuente que la muestra biológica. En casos particulares, la cantidad, nivel, concentración y/o valor de uno o más parámetros en la muestra de prueba refleja, se correlaciona y/o está asociado con la cantidad, nivel, concentración y/o valor de uno o más parámetros en la muestra biológica. En algunos casos, la cantidad, nivel, concentración, y/o el valor de uno o más parámetros en la muestra de prueba refleja, se correlaciona y/o está asociado con la presencia, ausencia, cantidad, nivel, concentración y/o valor del ARN viral en la muestra biológica. En casos particulares, la cantidad, nivel, concentración y/o valor del uno o más parámetros en la muestra de prueba refleja, se correlaciona y/o está asociado con la presencia, ausencia, cantidad, nivel y/o concentración de virus, por ejemplo, retrovirus competente en la replicación, en la muestra biológica. En casos particulares, la cantidad, el nivel, la concentración y/o el valor de uno o más parámetros en la muestra de prueba refleja, se correlaciona y/o está asociado con un riesgo de presencia de ARN viral y/o virus, por ejemplo, retrovirus competente en la replicación, en la muestra biológica.

En algunos casos, los métodos incluyen evaluar, medir y/o detectar uno o más parámetros de la muestra que indican y/o se correlacionan con una cantidad, nivel y/o expresión de uno o más genes objetivo, por ejemplo, genes virales. En casos particulares, el uno o más parámetros indican y/o se correlacionan con la presencia, ausencia, cantidad y/o nivel de un virus competente en la replicación, como un retrovirus competente en la replicación. En algunos casos, uno o más genes objetivo sirven como marcador para la detección de virus potencialmente competentes en la replicación.

En ciertos casos, los métodos descritos en la presente incluyen uno o más pasos de comparar la medición, evaluación, detección y/o cuantificación del parámetro con un valor de referencia correspondiente. En algunos casos, el valor de referencia es un valor conocido del parámetro. En algunos casos, el parámetro se correlaciona positivamente con la cantidad, el nivel y/o la concentración de ARN viral, genes objetivo que codifican el ARN viral y/o virus competente en la replicación, y el virus competente en la replicación se detecta como presente si el valor del parámetro está por encima del valor de referencia. En aspectos particulares, el parámetro se correlaciona negativa o inversamente con la cantidad, el nivel y/o la concentración de ARN viral, genes objetivo que codifican ARN viral y/o virus competentes en la replicación.

En casos particulares, el valor o la medición del parámetro indica la presencia o ausencia y/o está correlacionado y/o asociado con la presencia o ausencia del gen objetivo, por ejemplo, un gen viral, un ARN viral y/o un gen de ARN viral. En ciertos casos, el valor o medición del parámetro se correlaciona, por ejemplo, negativa o positivamente, con la presencia o ausencia del gen objetivo. En casos particulares, el valor o medición del parámetro se correlaciona, por ejemplo, negativa o positivamente, con el nivel o cantidad del gen objetivo.

En algunos casos, el parámetro es un gen y/o un producto de expresión génica. Por tanto, en algunos casos, medir, evaluar, detectar y/o cuantificar un parámetro es o incluye medir, evaluar, detectar y/o cuantificar el nivel o la cantidad de un gen o producto de expresión génica. En casos particulares, el gen es un gen viral. En algunos casos, el parámetro es un ADNc que se genera y/o deriva del ARN viral, por ejemplo, ARN viral que codifica uno o más genes. En casos particulares, el gen es un gen objetivo. En ciertos casos, el parámetro es una proteína, y la medición, evaluación, detección y/o cuantificación de un parámetro es o incluye la medición, evaluación, detección y/o cuantificación del nivel o cantidad de la proteína. En algunos casos, la proteína es una proteína viral. En ciertos casos, la proteína está codificada por un gen viral, por ejemplo, un gen de ARN viral. En algunos casos, la proteína está codificada por el gen objetivo. En determinados casos, el parámetro es una proteína o un polinucleótido que está presente y/o se expresa cuando está presente el gen objetivo. En algunos casos, el parámetro es una proteína y/o un polinucleótido que está presente, se expresa, modifica, aumenta o disminuye como resultado de la presencia del gen objetivo. Por ejemplo, en algunos casos, el parámetro es una proteína expresada por una célula en respuesta a la presencia o estímulo del gen objetivo.

En algunos casos, la presencia, ausencia, nivel, concentración y/o cantidad de ARN viral se mide, evalúa, detecta y/o cuantifica para determinar la presencia, ausencia, nivel, concentración y/o cantidad de un virus. En algunos casos, el virus es un virus competente en replicación, por ejemplo, que está en una muestra. En ciertos casos, la presencia, ausencia, nivel, concentración y/o cantidad de ARN viral se mide, evalúa, detecta y/o cuantifica midiendo, evaluando, detectando y/o cuantificando uno o más parámetros, por ejemplo, uno o más parámetros de la muestra de prueba. En algunos casos, la presencia o ausencia de un virus competente en la replicación en una muestra biológica se determina a partir del nivel, cantidad y/o concentración del ARN viral.

En algunos aspectos, el método incluye comparar los niveles de ácidos nucleicos del gen objetivo en la muestra con un valor de referencia correspondiente, como un nivel conocido de ácidos nucleicos del gen objetivo y/o un nivel de ácidos nucleicos del gen objetivo en un límite de detección del ensayo usado para evaluar los niveles de ácido nucleico del gen. En algunos casos, el virus competente en la replicación se detecta como presente en la muestra de prueba si el nivel de ácidos nucleicos del gen objetivo está por encima de un valor de referencia para el gen objetivo. En algunos aspectos, se considera que el virus competente en la replicación no está presente en la muestra de prueba si el nivel de ácidos nucleicos del gen objetivo está por debajo del valor de referencia.

En algunos casos, los ácidos nucleicos virales no comprenden o no son ADN. En algunos casos, los ácidos nucleicos virales son o comprenden ARN. En algunos casos, el ARN es ARN viral. En algunos casos, los métodos incluyen la transcripción inversa del ARN en ADN para amplificación y/o detección.

En algunos casos, el virus competente en la replicación es un retrovirus competente en la replicación (RCR). En algunos casos, el retrovirus competente en la replicación es un gammaretrovirus competente en la replicación. En algunos casos, el virus competente en la replicación es un lentivirus competente en la replicación (RCL).

En algunos casos, los niveles de ARN viral indican el nivel de expresión de una secuencia viral o gen viral particular. En algunos casos, la expresión comprende la producción de ARN. En algunos casos, la expresión no incluye necesariamente la traducción de una secuencia o gen particular en una proteína. En algunos casos, los niveles de ARN viral indican el nivel de transcripción de una secuencia viral o gen viral particular. En algunos casos, la transcripción de ARN viral indica un nivel de transcripción de un ADN proviral integrado en ARN durante la replicación viral. En algunos casos, el ARN viral se traduce en proteínas virales. En algunos casos, el ARN viral es un genoma viral que se empaqueta en nuevas partículas virales durante la replicación. En aspectos de los métodos descritos, la muestra de prueba contiene ARN aislado u obtenido de una muestra biológica, como de una célula o población de células. En algunos casos, la muestra de prueba comprende ARN de una célula usada para producir partículas de vectores virales. En algunos casos, la célula procede de una línea celular de empaquetamiento viral. En algunos casos, la célula es una célula de empaquetamiento o una célula huésped usada para producir transitoriamente partículas de vectores virales. En algunos casos, la muestra de prueba comprende ARN de una célula o población de células manipuladas genéticamente con una partícula de vector viral. En algunos casos, la célula o población de células se deriva de un paciente. En algunos casos, la célula se deriva de la sangre, la médula ósea, la linfa o los órganos linfoides, es una célula del sistema inmunitario, como una célula de la inmunidad innata o adaptativa, por ejemplo, una célula mieloide o linfoide, incluyendo un linfocito, típicamente una célula T y/o una célula NK. En algunos casos, la muestra de prueba comprende ARN de una célula de un paciente que fue o está siendo tratado con terapia celular adoptiva.

En algunos casos, la célula o población de células es o ha sido transducida con una partícula de vector viral, como una que codifica una molécula recombinante y/o heteróloga. En algunos casos, la partícula del vector viral comprende un genoma que contiene un ácido nucleico que codifica una molécula heteróloga o recombinante, como un receptor recombinante, por ejemplo, un receptor de antígenos, como un receptor de antígeno quimérico o un receptor de células T transgénicas, por lo que la transducción de células puede generar células que expresan receptores recombinantes (por ejemplo, CAR). Heterólogo en este contexto se refiere a una proteína que normalmente no se expresa de un virus y/o no está codificada por un genoma viral. En algunos casos, la partícula del vector viral se usa o se ha usado para transducir las células, como las células T. En algunos casos, las células resultantes y las composiciones que comprenden tales células pueden usarse en métodos de inmunoterapia adoptiva. A continuación se describen células y partículas de vectores virales ejemplares.

En algunos casos, los métodos descritos se usan para evaluar la presencia, ausencia o nivel de virus competente en la replicación en la muestra biológica. En algunos casos, la muestra biológica es o incluye células que se han manipulado o se manipularán con una partícula de vector viral que codifica un ácido nucleico heterólogo, como en cualquier etapa del proceso de fabricación para producir células manipuladas genéticamente. En algunos aspectos, el virus competente en la replicación se detecta mediante la evaluación de los niveles de ARN de uno o más genes objetivo, como genes virales, por ejemplo, un primer, segundo y/o posterior gen viral, expresado en el retrovirus usado para producir la partícula del vector viral, pero no expresado en la propia partícula del vector viral, que en algunos casos es o ha sido manipulada para ser defectuosa en la replicación.

En ciertos casos, el parámetro es ARN viral de o que codifica el gen objetivo. En algunos casos, los niveles de ARN del gen objetivo, por ejemplo, el primer y/o segundo gen viral, se evalúan usando un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR). En algunos casos, la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) se realiza o como parte del mismo ensayo que la qPCR (por ejemplo, en un ensayo de RT-qPCR) o se realiza antes del ensayo de qPCR. Por tanto, en algunos casos, el ARN comprendido en la muestra de prueba, por ejemplo, el ARN que es o ha sido extraído de una muestra que comprende células transducidas, se usa como plantilla para la síntesis de ADNc por RT-PCR.

En algunos casos, la cantidad de ARN en las muestras se determina a partir de una lectura sustituta, por ejemplo, un parámetro o parámetro sustituto, que es indicativo o indica el grado, nivel o cantidad de ARN en la muestra. En algunos casos, la lectura sustituta es un valor de umbral de ciclo (CT) obtenido mediante los métodos de RT-PCR descritos, que es una lectura del número de ciclos necesarios para detectar una señal de la muestra. El valor de CT se correlaciona inversamente con la cantidad de ácido nucleico, por ejemplo, ARN, en la muestra, por lo que un valor de CT más bajo indica cantidades más altas de un ARN objetivo mientras que un valor de CT más alto indica cantidades más bajas de un ARN objetivo.

En ciertos casos, el parámetro es una lectura sustituta. En algunos casos, el parámetro es un valor de umbral de ciclo (CT) obtenido mediante los métodos de RT-PCR descritos. En casos particulares, el parámetro es un valor de CT.

En los métodos descritos, se evalúa la presencia, el nivel o la cantidad de uno o más ARN virales objetivo. En algunos casos, el uno o más ARN objetivo se seleccionan por su capacidad para discriminar entre muestras que contienen o corren el riesgo de contener RCR y muestras que no contienen RCR. Por ejemplo, en algunos casos, uno o más ARN objetivo están presentes en muestras que contienen o corren el riesgo de contener RCR y están ausentes o sustancialmente ausentes en muestras que no contienen RCR. En algunos casos, los niveles, las cantidades o las concentraciones de los ARN objetivo son más altos en las muestras que contienen o corren el riesgo de contener RCR que en las muestras que no contienen RCR. En algunos casos, el uno o más ARN objetivo producen relaciones de señal a ruido altas y/o niveles de fondo o ruido bajos cuando se usan en los métodos descritos en la presente. En algunos casos, el ARN viral objetivo es GaLV. En algunos casos, el ARN viral objetivo es MMLV. En algunos casos, el ARN viral objetivo es GaLV y MMLV.

En algunos aspectos, además del gen objetivo, se evalúa un gen de control, por ejemplo, actina, como control para el ensayo. La evaluación del gen de control puede tener lugar en la misma reacción, por ejemplo, pocillo, que la evaluación de uno o más de los genes objetivo, por ejemplo, en una reacción multiplex. Por ejemplo, pueden evaluarse en la misma reacción el gen de control y un primer gen viral. En otros casos, pueden evaluarse en la misma reacción el gen de control y un segundo gen viral. En algunos aspectos, el primer y el segundo genes virales pueden evaluarse en una reacción multiplex. En algunos casos, pueden evaluarse 3 o más genes objetivo en una reacción multiplex. En algunos casos, el gen de control puede evaluarse en una reacción multiplex tanto con el primer como con el segundo gen y/o con tres o más genes objetivo.

En algunos casos, el gen objetivo, por ejemplo, el primer y/o segundo gen viral, y/o el gen de control se evalúa usando cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del gen objetivo o del gen de control, respectivamente. En algunos casos, los niveles de ARN viral del gen objetivo y/o el gen de control se evalúan usando una sonda de hidrólisis específica para el gen objetivo o el gen de control, respectivamente. Los cebadores de oligonucleótidos y las sondas de hidrólisis ejemplares se analizan a continuación.

En algunos casos, se evalúan una o más muestras de control además de la muestra de prueba. Por ejemplo, puede usarse un control estándar de plásmido como control para la parte de amplificación del ensayo. En algunos aspectos, puede usarse un control sin plantilla para proporcionar información sobre el estado de contaminación de los reactivos de la PCR. En algunos casos, puede usarse un control sin transcriptasa inversa para evaluar la pureza de la plantilla de ARN y/o para detectar ADN contaminante. En algunos casos, se usa un control negativo que no contiene copias del gen objetivo, por ejemplo, ARN de una línea celular que no exprese el gen objetivo. En algunos casos, se usa como control un control en proceso que contiene ARN de material coincidente con el paciente que no se ha transducido con la partícula del vector viral que codifica una molécula recombinante y/o heteróloga, como para una señal de fondo, por ejemplo debido a la posible contaminación durante el procedimiento de aislamiento del ARN.

El grado de amplificación detectado en una condición negativa para RT en una RT-PCR puede ser indicativo de ADN contaminante. En algunos casos, el aislamiento de ARN se lleva a cabo para minimizar el ADN contaminante, por ejemplo, mediante la selección de métodos de preparación o aislamiento de ARN que se ha observado que dan como resultado una señal relativamente más baja en muestras negativas para RT. En algunos casos, se observa un menor grado de amplificación en la condición de no RT y/o un menor grado de presencia de cualquier ADN contaminante en muestras que contienen ARN aislado usando un método particular (en algunos aspectos, un kit RNeasy Plus). En algunos aspectos, se usa un kit RNeasy con digestión con ADNasa en columna.

En algunos casos, puede usarse un control positivo que contenga un nivel conocido del gen objetivo. El nivel de ARN conocido del gen objetivo puede estar en o ligeramente por encima del límite de detección del gen objetivo por el ensayo. En algunos casos de los métodos descritos, una muestra de prueba que contiene ARN derivado de células transducidas se enriquece con el ARN de control positivo. Como se describe adicionalmente más adelante, en algunos casos, los niveles de ARN del gen objetivo en la muestra de control positivo en algunos aspectos establecen un valor de referencia con el que se compara el nivel de ARN del gen objetivo en la muestra de prueba.

En algunos casos, cuando el nivel de ARN del gen objetivo en la muestra de prueba es más alto que el valor de referencia, puede considerarse que la muestra de prueba tiene presente uno o más ARN que provienen y, en general, se requieren o se cree que son requerido para, virus competente de replicación o la competencia de replicación de un virus. En algunos casos, una muestra que se considera que tiene un ARN que proviene, se requiere para, se cree que se requiere o que generalmente está asociado con un virus competente en la replicación, se considera positiva en el ensayo y/o se considera que corre el riesgo de contener virus competentes en la replicación, se considera que contiene uno o más ARN requeridos para la replicación retroviral y/o requeridos para virus competentes en la replicación; se considera que contiene un virus supuestamente competente para la replicación, y/o se considera que contiene potencialmente virus competentes en la replicación. En algunos casos, una muestra no se considera positiva o potencialmente positiva o en riesgo de RCR a menos que se considere positiva con respecto a una pluralidad de ARN objetivo virales o una pluralidad de ARN requeridos para la competencia de replicación del virus.

En algunos casos, una muestra que el ensayo considera (i) que contiene la presencia del ARN objetivo (y/o dos o más de la pluralidad de ARN objetivos), (ii) contiene un nivel de una lectura sustituta generalmente inversamente indicativa de una cantidad de ARN, como un valor de CT que está en o por debajo de un nivel de referencia, como un valor de CT de referencia, y/o (iii) que contiene una cantidad, o una lectura sustituta de la misma, del ARN que está en o por encima de un valor de referencia, en cada caso opcionalmente para cada uno de dos o más de una pluralidad de ARN virales objetivo, se considera positiva.

En algunos casos, se considera que una muestra (i) contiene la presencia del ARN objetivo (y/o dos o más de la pluralidad de ARN objetivo), (ii) contiene un nivel de una lectura sustituta generalmente inversamente indicativa de una cantidad del ARN, como un valor de CT que está en o por debajo de un nivel de referencia, como un valor de CT de referencia, (iii) que contiene una cantidad, o una lectura sustituta de la misma, del ARN que está en o por encima de un valor de referencia, en cada caso, opcionalmente para cada uno de dos o más de una pluralidad de ARN virales objetivo, y/o (iv) que es o se ha considerado positiva por el ensayo, (a) se considera que está en riesgo de contener virus competentes en la replicación, (b) se considera que contiene un ARN (u opcionalmente múltiples ARN y/o los ARN) requerido para la replicación retroviral y/o requerido para la replicación del virus competente; (c) se considera que contiene virus supuestamente competentes en la replicación, y/o (d) se considera que contiene potencialmente virus competentes en la replicación.

En algunos aspectos, se considera que la muestra, o solo se considera que corre el riesgo de contener virus competentes en la replicación y/o contener virus supuestamente competentes en la replicación, y/o contener potencialmente virus competentes en la replicación, y/o ser positiva en el ensayo, si se ha considerado que contiene la lectura respectiva en cualquiera de (i)-(iii) o (i)-(iv) para por lo menos dos ARN virales, como por lo menos el primer y el segundo ARN viral.

En algunos casos, una muestra que se considera en el ensayo (1) que no contiene la presencia, o contiene la ausencia, del ARN objetivo (y/o no contiene dos o más de la pluralidad de ARN objetivo), (2) que contiene un nivel de una lectura sustituta generalmente inversamente indicativa de una cantidad de ARN, como un valor de CT, que está en o por encima de un nivel de referencia, como un valor de referencia de CT, y/o (3) que contiene una cantidad, o lectura sustituta de la misma, del ARN que está en o por debajo de un valor de referencia, en cada caso opcionalmente para por lo menos dos de una pluralidad de ARN virales, se considera negativa.

En algunos casos, se considera que una muestra (1) no contiene la presencia del ARN objetivo (y/o dos o más de la pluralidad de los ARN objetivo), (2) contiene un nivel de una lectura sustituta generalmente inversamente indicativa de un cantidad de ARN, como un valor de CT que está en o por encima de un nivel de referencia, como un valor de CT de referencia, (3) contiene una cantidad, o una lectura sustituta de la misma, del ARN que está en o por debajo de un valor de referencia, y/o (4) que es o ha sido considerada negativo por el ensayo, (a) se considera que no tiene riesgo de contener virus competente en la replicación, (b) se considera que no contiene un ARN requerido para la replicación retroviral y/o requerido para la replicación del virus competente; (c) se considera que no contiene virus competente en la replicación putativa, y/o (d) se considera que no contiene virus competente en la replicación.

En algunos aspectos, se considera que la muestra no está en riesgo, es negativa o no contiene la presencia de virus competentes en la replicación, si se ha considerado que contiene la lectura respectiva en cualquiera de (1)-(4) para un ARN viral objetivo, como uno o más ARN virales objetivo que se requiere o se cree que se requiere para el virus competente en la replicación o la competencia de replicación de un virus, como uno o más del primer y el segundo ARN virales.

En algunos casos, cuando el nivel de ARN del gen objetivo es más bajo que el valor de referencia, se considera que la muestra de prueba no es positiva para el ensayo, la presencia, el riesgo o la presencia de virus supuestamente competentes en la replicación. En algunos de tales casos, la muestra y/o las células derivadas de la misma, por ejemplo, las células transducidas, se liberan, por ejemplo, para su posterior procesamiento o formulación y/o para su uso o administración en terapia, como terapia celular adoptiva. En algunos de tales casos, se considera que un paciente, que opcionalmente es un sujeto humano, del que se derivó la muestra biológica está libre de virus competentes en la replicación.

En algunos aspectos, los métodos descritos pueden usarse para proporcionar o evaluar la presencia o ausencia de, o el riesgo de, un virus competente en la replicación en una muestra de producto celular manipulada que contiene células que han sido sometidas a transducción retroviral y cultivadas. Las partículas de vectores retrovirales, como las partículas de vectores gammaretrovirales y lentivirales, se han usado en varias aplicaciones clínicas de transferencia de genes para introducir genes terapéuticos en las células, incluyendo en relación con la preparación de productos celulares. Las partículas del vector retroviral generalmente se derivan de la familia de los retrovirus, Retroviridae. En algunos casos, las partículas de viriones contienen un ARN genómico. Tras introducirse en una célula huésped, el ARN genómico se transcribe de manera inversa en ADN. En algunos casos, el ADN se integra en el ADN cromosómico de la célula huésped, en algunos casos usando una enzima integrasa, momento en el que puede hacerse referencia al ADN retroviral como provirus. En algunos casos, la célula huésped trata el ADN proviral como parte de su propio genoma, traduciendo y transcribiendo los genes integrados junto con los propios genes de la célula huésped, produciendo de este modo proteínas codificadas por el ácido nucleico genómico viral. En algunos casos, se requieren estas proteínas para ensamblar nuevas copias del virus en donde, opcionalmente, el virus es competente para la replicación y/o infeccioso.

Los retrovirus pueden clasificarse como retrovirus "simples" y "complejos". Los genomas de los retrovirus simples codifican únicamente los genes gag, pro, pol y env. Los ejemplos de retrovirus simples incluyen alfaretrovirus, betaretrovirus y gammaretrovirus. Por el contrario, los genomas de los retrovirus complejos incluyen los genes gag, pro, pol y env, así como una serie de genes reguladores o accesorios con una variedad de funciones. Los ejemplos de retrovirus complejos incluyen deltaretrovirus, epsilonretrovirus, lentivirus y spumavirus. Los ejemplos de genes accesorios incluyen vif, vpr, vpu, rev, vpx y nef.

En algunos casos, los genomas o partes de los mismos de retrovirus recombinantes, como gammaretrovirus y lentivirus, son capaces de integrarse de manera estable en un genoma huésped. En algunos casos, tales retrovirus contienen una transcriptasa inversa y/o una integrasa que permite dicha integración. En algunos casos, se han usado partículas del vector viral que contienen componentes de dicho retrovirus, como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), por ejemplo el VIH-1, el virus de la leucemia del simio Gibbon (GaLV) o el virus de la leucemia murina Moloney (MMLV), en varias aplicaciones clínicas de transferencia de genes para introducir genes terapéuticos en las células. En algunos casos, un vector retroviral es un vector oncorretroviral, por ejemplo, vectores derivados del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV). En algunos casos, el vector viral es un vector lentiviral de segunda o tercera generación.

Las partículas de vectores virales destinadas para su uso en terapia génica o transducción de células, incluyendo las células destinadas en última instancia a la implantación o administración a un sujeto, en algunos casos se derivan de tales virus y pueden manipularse para que tengan una replicación defectuosa. En algunos casos, esta manipulación implica separar ácidos nucleicos que codifican proteínas víricas y proteínas heterólogas en secuencias de ácidos nucleicos separadas. En algunos casos, a estas secuencias separadas puede hacerse referencia como secuencia del vector, en algunos casos denominada vector de transferencia y/o plásmido de transferencia, que comprende el gen heterólogo y una o más secuencias auxiliares que comprenden los genes necesarios para empaquetar el vector en un partícula viral infecciosa. Por ejemplo, en algunos casos, una secuencia de ácidos nucleicos puede comprender gag/pol, otra secuencia puede comprender env, y otra secuencia puede comprender el ácido nucleico heterólogo. En algunos casos, son deseables métodos que sean capaces de detectar cualquier virus competente en la replicación que se haya generado durante los pasos de generación o procesamiento, como por recombinación homóloga o no homóloga, por ejemplo, entre el vector y las secuencias auxiliares. En algunos casos, tales métodos pueden confirmar que dichos eventos no se han producido antes de la administración de una composición terapéutica.

En general, los vectores virales defectuosos en la replicación carecen de genes que codifican componentes de empaquetamiento, estructurales, reguladores y/o enzimáticos. Tales componentes incluyen los genes gag, pro, pol y env.

Aunque no es probable, la recombinación puede producirse entre el vector de transferencia (como uno que contiene una secuencia que codifica una molécula recombinante y/o heteróloga) y los componentes de empaquetamiento, estructurales, reguladores o enzimáticos (como env, gag, pol o rev), codificado por plásmidos introducidos en la célula de empaquetamiento. La aparición de tal evento de recombinación teóricamente podría producir virus competentes en la replicación (por ejemplo, RCR). Los métodos descritos pueden usarse para confirmar que no se ha producido recombinación entre el vector de transferencia, los componentes reguladores o de empaquetamiento y los elementos virales endógenos o introducidos, en una muestra, como en las células usadas para la producción de partículas de vectores virales. En algunos aspectos, los métodos descritos pueden usarse para confirmar o verificar la ausencia de RCR en ciertas muestras como composiciones terapéuticas y productos intermedios generados durante la producción.

En algunos aspectos, las muestras que comprenden células transducidas se analizan para determinar la presencia o ausencia de virus competentes en la replicación o un indicador de los mismos, por ejemplo, en varios o ciertos pasos durante la fabricación, formulación, envasado y/o antes o después de la administración a pacientes, como en métodos de terapia celular adoptiva. En algunos aspectos, la manipulación de células para la terapia celular puede incluir la transducción de células con las partículas del vector viral y el cultivo de las células durante hasta 14 días, generalmente a 37° C, antes de la crioconservación y/o formulación. En algunos aspectos, pueden evaluarse las muestras de prueba obtenidas de células obtenidas en cualquier momento después de la transducción, como por ejemplo después del cultivo durante por lo menos o más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más días después de la transducción, de acuerdo con los métodos descritos. En algunos aspectos, también pueden evaluarse las muestras de prueba obtenidas de células transducidas y cultivadas (por ejemplo, para expansión) que se han crioconservado y/o formulado para su administración a un sujeto mediante los métodos descritos, típicamente antes de la administración al sujeto.

En algunos aspectos, los métodos descritos ofrecen ventajas a los métodos existentes para detectar RCR en una muestra. Algunos métodos disponibles para las pruebas de RCR, como los métodos aprobados, incluyen ensayos basados en cultivos celulares. En tales ensayos, el sobrenadante se obtiene de una muestra celular cocultivada con una línea celular permisiva, como la línea celular HEK293, después de una fase de amplificación en la que las células se cultivan durante varias semanas, generalmente de 3 a 6 semanas, para amplificar las partículas virales para su detección. El sobrenadante de cultivo recogido durante la amplificación, por ejemplo, durante una fase de amplificación de 3 o 6 semanas, puede colocarse en una línea celular indicadora y RCR se indica cuando se produce una transformación, típicamente observada por la formación de placa. Un ensayo ejemplar es el ensayo S+/L-, que generalmente implica la detección de (o la verificación de la ausencia de) RCR usando una línea de células indicadoras, como la línea celular PG-4, que contiene el genoma del virus del sarcoma murino (S+) pero carece del genoma del virus de la leucemia murina (L-). Típicamente, en un ensayo de este tipo, las células solo producen un fenotipo transformado cuando se expresan tanto el virus del sarcoma murino como el virus de la leucemia murina.

Otros ensayos basados en cultivos celulares incluyen ensayos de rescate de marcadores, en los que puede usarse una línea celular permisiva, que contiene un vector retroviral con un marcador, como un transgén marcador, que puede identificarse en el sobrenadante después de una amplificación, como una amplificación de 3 semanas o 6 semanas, de cualquier RCR potencial. En general, si hubiera RCR, el genoma de RCR se empaquetaría y el transgén marcador se rescataría y, por tanto, se expresaría cuando se transdujera en una línea celular no tratada.

En algunos aspectos, ciertos ensayos basados en cultivos celulares pueden no ser del todo óptimos, por ejemplo, porque requieren mucho tiempo y/o mano de obra y/o requieren un gran volumen o cantidad de muestra para la prueba y/o dan como resultado resultados de RCR falsos positivos para composiciones que en realidad no contienen RCR, y/o pueden no proporcionar información en un marco temporal que sea suficiente para ciertos propósitos particulares. Ciertos ensayos basados en cultivos celulares también pueden dar como resultado resultados de falsos negativos para composiciones que realmente contienen RCR. Los resultados falsos negativos pueden producirse con mayor frecuencia en muestras evaluadas usando ciertos ensayos de cultivo celular en puntos temporales poco después de la exposición al vector y, por tanto, limitan el uso de dichos ensayos para proporcionar resultados rápidos. Ciertos ensayos de cultivos celulares comunes suelen tardar hasta seis semanas o más en completarse. Ciertos métodos pueden no ser apropiados para su uso con células que no pueden crioconservarse antes de su uso o durante un periodo temporal en el que se está completando el método.

Una alternativa ejemplar a ciertos ensayos basados en cultivos celulares puede incluir ensayos que implican el ensayo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las limitaciones de tales ensayos de PCR pueden incluir que los ensayos de PCR basados en plantillas de ADN, aunque sensibles, pueden ser propensos a producir falsos positivos, por ejemplo, debido al ADN residual no asociado con el RCR real, por ejemplo, debido a la presencia de ADN de la línea productora de vectores y/u otro ADN residual, que puede detectarse en condiciones permisivas de PCR basadas en ADN. Tales resultados falsos positivos pueden producirse con mayor frecuencia en muestras evaluadas en puntos temporales poco después de la exposición al vector y, por tanto, limitan el uso de tales ensayos para proporcionar resultados rápidos.

En algunos casos, los métodos, composiciones y sistemas descritos son ventajosos en varios aspectos. Los métodos descritos muestran una sensibilidad, especificidad y/o precisión similares o mejoradas en comparación con los métodos existentes. Sin embargo, los métodos descritos se llevan a cabo y/o pueden detectar la presencia o ausencia de virus competentes en la replicación en una muestra rápidamente, como en el transcurso de días u horas, a diferencia de los ensayos de cultivo celular que implican semanas de cultivo. En algunos aspectos, como en relación con los métodos de terapia celular adoptiva en los que las células autólogas o alogénicas se manipulan mediante métodos de transducción, la capacidad de obtener resultados más eficientemente es ideal.

En algunos aspectos, los métodos descritos son más sensibles, de tal manera que el ensayo puede ejecutarse en muestras de prueba obtenidas en un punto temporal anterior después de la transducción y/o de menos muestra total en comparación con los métodos existentes, en particular los métodos de cocultivo.

En algunos casos, los métodos y sistemas son ventajosos porque producen menos resultados de falsos positivos que ciertos métodos basados en PCR disponibles, por ejemplo, en pruebas de la misma composición o muestra, que pueden estar limitadas por su detección de contaminación, como por célula productora o ADN plásmido. En algunos aspectos, las ventajas de los presentes métodos en comparación con ciertos métodos basados en cultivos celulares y PCR disponibles se relacionan con el uso (o detección de la presencia o ausencia o nivel) de ARN (como el ARN de una muestra de prueba en lugar de un sobrenadante de una muestra en un método basado en cultivo celular), por los presentes métodos, en oposición a PCR moldeada por ADN. En algunos de estos aspectos, los casos descritos son ventajosos en su capacidad para detectar, en el caso de una muestra sujeta a los métodos que contenían RCR, que las células muestreadas están transcribiendo activamente genes virales. Por tanto, la presencia de virus competentes en la replicación detectados por los métodos actuales en muestras de prueba que contienen ARN puede ser un indicador más específico de virus competentes en la replicación en comparación con ciertos ensayos de PCR que usan plantillas de ADN y/o puede ser menos propenso a falsos positivos, a la vez que mantiene un nivel alto de sensibilidad y fiabilidad. En algunos aspectos, los métodos descritos pueden ser más sensibles y fiables que ciertos métodos basados en cultivos celulares disponibles, permitiendo de este modo la reducción de resultados falsos negativos.

En algunos casos, el rendimiento de los ensayos divulgados en la presente se compara con otros ensayos como punto de referencia. En algunos casos, en general, los ensayos divulgados en la presente son por lo menos tan sensibles como el ensayo S+/L-, el ensayo de rescate de marcadores y/o los ensayos RCR PCR basados en plantillas, como los descritos en la presente. Por ejemplo, en algunos casos, los ensayos divulgados en la presente pueden usarse para detectar RCR en puntos temporales más tempranos, en muestras que contienen cantidades más bajas de RCR, usando muestras más pequeñas, usando menos células o usando volúmenes más bajos en otros ensayos. En algunos casos, los ensayos divulgados en la presente pueden realizarse más rápidamente que el ensayo S+/L a la vez que se mantiene la misma o mayor sensibilidad. Por ejemplo, en algunos casos, los ensayos pueden realizarse en el plazo de horas o días de la generación de la muestra de prueba. En algunos casos, los ensayos divulgados en la presente tienen una tasa de falsos positivos más baja que otros ensayos, incluidos, por ejemplo, el ensayo S+/L-, el ensayo de rescate de marcadores y/o los ensayos RCR/RCL PCR basados en plantillas. En algunos casos, los ensayos divulgados en la presente pueden tener una tasa de falsos negativos baja, como una que es más baja que un ensayo de referencia dado. En algunos casos, los ensayos divulgados en la presente pueden ejecutarse en paralelo para detectar simultáneamente RCR a partir de un mayor número de muestras, condiciones o controles que otros ensayos de referencia.

Las secciones proporcionadas describen aspectos ejemplares de los métodos proporcionados.

II. MÉTODOS PARA DETECTAR RETROVIRUS COMPETENTES EN LA REPLICACIÓN EN UNA MUESTRA DE PRUEBA

En la presente se describen métodos para detectar la presencia, la ausencia o el nivel de, como confirmar la ausencia de virus competentes en la replicación en una muestra, como una muestra de prueba que contiene ARN de una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, que podría contener potencialmente, o en la que se desea y/o se requiere confirmar de manera concluyente la ausencia de un virus competente en la replicación. En algunos casos, la muestra de prueba se obtiene de una muestra, por ejemplo, una muestra biológica y/o la fuente de la muestra biológica, que comprende una célula que ha sido transducida con ácido nucleico usando una partícula de vector viral defectuosa en replicación que codifica una molécula recombinante y/o heteróloga. En algunos aspectos, es teóricamente posible, antes de la verificación o el ensayo, que pueda haberse generado un virus competente en la replicación, como mediante recombinación, y se verifica que tal muestra no contiene un virus competente en la replicación como un RCR, por ejemplo, mediante los métodos descritos.

En algunos casos, los métodos descritos son útiles para detectar retrovirus competente en la replicación, como un gammaretrovirus competente en la replicación (RCR) o un lentivirus competente en la replicación (RCL), en una muestra, por ejemplo, una muestra de prueba o una muestra biológica. En casos particulares, los métodos descritos son útiles para detectar retrovirus competentes en la replicación que se originan y/o se generaron a partir del vector viral usado para transducir células de la muestra, por ejemplo, muestra biológica. En ciertos casos, los métodos descritos son útiles para detectar genes virales y/o secuencias de polinucleótidos virales que se requieren para la competencia en la replicación en el vector viral que se usó para transducir las células en la muestra.

En algunos casos, la muestra comprende una célula transfectada con uno o más plásmidos provirales. En algunos casos, la muestra comprende una célula transfectada y/o que comprende uno o más ácidos nucleicos necesarios para generar una partícula viral infecciosa. En algunos casos, los métodos incluyen evaluar los niveles de ARN viral, como de uno o más genes objetivo, por ejemplo, genes virales, en la muestra que comprende la célula transducida. En algunos aspectos, los métodos incluyen comparar los niveles de ARN de uno o más genes objetivo en la muestra de prueba con un valor de referencia respectivo. En algunos casos, se detecta en la muestra la presencia de virus competentes en la replicación, como una muestra que comprende las células transducidas, basándose en la comparación de cada gen objetivo con su valor de referencia. En algunos casos, el virus competente en la replicación está presente en la muestra que comprende la célula transducida si los niveles de ARN viral del gen objetivo están por encima de su valor de referencia respectivo. En algunos casos, el virus competente en la replicación es un retrovirus competente en la replicación (RCR). En algunos casos, el retrovirus competente en la replicación es un gammaretrovirus competente en la replicación. En algunos casos, el virus competente en la replicación es un lentivirus (RCL).

A. Genes objetivo y de control

En algunos aspectos se describen métodos para detectar o verificar o confirmar la ausencia de virus competentes en la replicación. Tales métodos pueden incluir evaluar los niveles de ARN viral o codificado por una o más secuencias virales o uno o más genes objetivo virales, por ejemplo, genes virales. En algunos casos, el uno o más genes objetivo comprenden un primer gen viral. En algunos casos, el uno o más genes objetivo incluyen un primer y un segundo gen viral. En algunos casos, el primer y el segundo genes virales no son iguales. En algunos casos, el uno o más genes objetivo comprenden tres o más genes virales. En algunos aspectos, el uno o más genes objetivo son de un retrovirus, como un gammaretrovirus o un lentivirus. En algunos casos, además de la evaluación del gen objetivo, se evalúan los niveles de ARN de un gen de control, por ejemplo, para confirmar la validez o sensibilidad y/o especificidad del ensayo.

1. Genes objetivo

En algunos casos, los métodos proporcionan pasos para medir, detectar, evaluar y/o cuantificar un parámetro que está asociado y/o se correlaciona, ya sea negativa o positivamente, con la cantidad, el nivel y/o la concentración de un gen objetivo o un producto de expresión génica del gen objetivo. En algunos casos, el parámetro es una proteína codificada por el gen objetivo, y el nivel, cantidad o concentración de la proteína se correlaciona positivamente con la presencia o ausencia y/o la cantidad, nivel o concentración del gen objetivo. En ciertos casos, el parámetro es un ARN viral que codifica el gen objetivo, y el nivel, la cantidad o la concentración del ARN viral se correlaciona positivamente con la presencia o ausencia y/o la cantidad, el nivel o la concentración del gen objetivo.

En algunos casos, el parámetro es una proteína que está regulada negativamente por el gen objetivo, y el nivel, la cantidad o la concentración de la proteína se correlaciona negativamente con la presencia o ausencia y/o la cantidad, el nivel o la concentración del gen objetivo. En casos particulares, el parámetro es un polinucleótido que está regulado negativamente por el gen objetivo, y el nivel, cantidad o concentración del polinucleótido se correlaciona negativamente con la presencia o ausencia y/o la cantidad, nivel o concentración del gen objetivo.

En algunos casos, el parámetro es un ARN viral que codifica el gen objetivo y/o el ADNc derivado del ARN viral que codifica el gen objetivo. En casos particulares, medir, detectar, evaluar y/o cuantificar el parámetro es o incluye medir, detectar, evaluar y/o cuantificar el nivel y/o la cantidad del ARN viral que codifica el gen objetivo y/o el ADNc derivado del ARN viral que codifica el gen objetivo. En casos particulares, el parámetro de control se mide, evalúa, detecta y/o cuantifica con PCR, por ejemplo, RT-PCR.

Generalmente, el uno o más genes o secuencias objetivo son genes o secuencias virales que no están codificadas por el vector de transferencia usado para producir partículas de vectores virales usadas para transducir la célula. En algunos casos, las secuencias o genes virales están codificados por virus de tipo salvaje. En algunos casos, las secuencias o genes virales son secuencias o genes recombinantes. En algunos casos, las secuencias o genes virales son necesarios para la replicación viral. En algunos casos, las secuencias o genes virales codifican componentes de empaquetamiento, estructurales, reguladores o enzimáticos de un virus, o partes de secuencias del mismo.

En casos particulares, el uno o más genes o secuencias objetivo son genes o secuencias virales que se usan para producir una partícula de vector viral deficiente en la replicación. En ciertos casos, el uno o más genes o secuencias objetivo se usan para producir un vector retroviral. En algunos casos, el uno o más genes objetivo se usan para producir uno o más de un vector viral que se describe en la Sección IV. En casos particulares, el vector viral se usa para la administración de genes, por ejemplo, un gen que codifica un CAR. En ciertos casos, el uno o más genes o secuencias objetivo se usan para producir un vector retroviral, por ejemplo, un retrovirus deficiente en la replicación, que se usa para la administración de genes. En casos particulares, el vector retroviral es un vector gammaretroviral. En algunos casos, el vector retroviral es un vector lentiviral.

En algunos casos, el uno o más genes objetivo son de o se derivan de un virus diferente, por ejemplo, una especie o isotipo viral diferente, que el vector retroviral, por ejemplo, un vector retroviral deficiente en la replicación usado para la administración de genes. En ciertos casos, el uno o más genes objetivo son de o se derivan de un virus diferente, por ejemplo, una especie o isotipo viral diferente, que el vector retroviral, por ejemplo, un vector retroviral deficiente en la replicación usado para la administración de genes.

En algunos casos, el uno o más genes objetivo, por ejemplo, el primer y/o el segundo genes virales, incluyen un gen env, gag, pol o rev. Los genes objetivo adicionales pueden incluir aquellos que están asociados con la virulencia, por ejemplo, un transactivador primario del VIH y/o son genes accesorios. En algunos casos, uno o más de los genes env, gag, pol o rev se usan para producir un vector retroviral, por ejemplo, un retrovirus deficiente en la replicación, que se usa para la administración de genes. En casos particulares, el uno o más de los genes env, gag, pol o rev se usan para producir un vector gammaretroviral. En casos particulares, el uno o más de los genes env, gag, pol o rev se usan para producir un vector lentiviral. En algunos casos, el uno o más de los genes env, gag, pol o rev son o se derivan de un virus diferente, por ejemplo, una especie o isotipo viral diferente, que el vector retroviral, por ejemplo, un vector retroviral deficiente en la replicación usado para la administración de genes. En ciertos casos, uno o más de los genes env, gag, pol o rev son de o se derivan de un virus diferente, por ejemplo, una especie o isotipo viral diferente, que el vector retroviral, por ejemplo, un vector retroviral deficiente en la replicación usado para la administración de genes.

En algunos casos, el uno o más genes objetivo incluyen un primer gen viral y un segundo gen viral. En casos particulares, el uno o más genes objetivo son o incluyen dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve y/o diez genes virales. En casos particulares, el primer gen viral es un gen env, gag, pol, rev, pro, vpr, vif, vpu, nef, vpx o Tat. En algunos casos, el segundo gen viral es un gen env, gag, pol, rev, pro, vpr, vif, vpu, nef, vpx o Tat. En casos particulares, el primer y/o sel egundo gen viral es el gen env, gag, pol o rev. En algunos casos, el primer gen viral es un gen env. En algunos casos, el segundo gen viral es un gen gag, pol o rev. En algunos casos, el primer gen viral es un gen gag, pol o rev. En algunos casos, el segundo gen viral es un gen env. En algunos casos, el primer o el segundo gen viral es un gen pro, vpr, vif, vpu, nef, vpx y/o Tat.

En ciertos casos, los métodos descritos se usan para determinar si hay un virus competente en la replicación en una muestra, por ejemplo, en una muestra de prueba, una muestra biológica y/o la fuente de la muestra biológica y/o de prueba. En algunos casos, la muestra contiene o se deriva de una célula que ha sido transducida con un vector viral. En algunos casos, la célula se ha transducido con un vector retroviral. En algunos casos, la célula ha sido transducida con un vector gammaretroviral. En casos particulares, la célula ha sido transducida con un vector lentiviral.

En algunos casos, la célula se transdujo con un vector viral, por ejemplo, un vector retroviral. En casos particulares, la célula se transdujo con un vector viral deficiente en la replicación. En ciertos casos, las partículas del vector viral deficiente en la replicación se produjeron mediante métodos de producción transitorios que incluían la cotransfección de múltiples plásmidos que codificaban el genoma del vector y construcciones de empaquetamiento en una célula huésped, por ejemplo, una célula de una línea celular de empaquetamiento viral (VPC). En algunos casos, el vector viral, por ejemplo, el vector retroviral deficiente en la replicación. En algunos casos, los plásmidos y/o genes usados para la producción y/o incorporados en el vector viral contienen genes de más de un virus, por ejemplo, especie o isotipo del virus. Por ejemplo, en algunos casos, el vector retroviral contiene uno o más genes que no se originaron o derivaron de un retrovirus.

En algunos casos, un vector retroviral contiene uno o más genes virales y/o secuencias de polinucleótidos que no se originan ni se derivan de un retrovirus. En casos particulares, un vector gammaretroviral contiene uno o más genes virales y/o secuencias de polinucleótidos que no se originan ni se derivan de un gammaretrovirus. En casos particulares, un vector lentiviral contiene uno o más genes virales y/o secuencias de polinucleótidos que no se originan ni se derivan de lentivirus.

En algunos casos, un retrovirus competente en la replicación contiene uno o más genes virales y/o secuencias de polinucleótidos que no se originan ni se derivan de un retrovirus. En casos particulares, un gammaretrovirus competente en la replicación (por ejemplo, un RCR) contiene uno o más genes virales y/o secuencias de polinucleótidos que no se originan ni se derivan de un gammaretrovirus. En casos particulares, un vector lentiviral competente para la replicación (por ejemplo, un RCL) contiene uno o más genes virales y/o secuencias de polinucleótidos que no se originan ni se derivan de lentivirus.

En ciertos casos, el vector viral se pseudotipifica, por ejemplo, se combina con genes y/o proteínas virales extraños, por ejemplo, para alterar el tropismo del huésped y/o aumentar o disminuir la estabilidad del vector viral. En ciertos casos, la detección, evaluación y/o medición de un virus competente en la replicación, por ejemplo, un RCR o RCL, es o incluye la evaluación, medición y/o detección de un gen viral y/o un parámetro asociado o correlacionado al gen viral, que no se deriva y/u origina del virus.

En algunos casos, la detección, evaluación y/o medición de un virus competente en la replicación, por ejemplo, un RCR o RCL, es o incluye la evaluación de detección, la medición y/o la detección de un gen viral que se usó para la producción del vector viral. En algunos casos, se detecta, mide o evalúa un retrovirus, lentivirus y/o gammaretrovirus competente en la replicación detectando un gen viral o una secuencia de polinucleótidos que se usa para seudotipificar el vector viral.

En algunos casos, el gen objetivo, por ejemplo, un gen viral (como un primer o segundo gen viral o gen viral adicional), puede derivarse de cualquier virus apropiado como un retrovirus, por ejemplo, un gammaretrovirus o un lentivirus. En algunos casos, el gen objetivo es un gen derivado de un virus retroviral que incluye, pero no se limita a a: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV o MMLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV o HSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV o MMTV), virus de la leucemia del simio gibón (GaLV o GALV), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el virus del sarcoma de Rous (RSV). En algunos casos, el gen objetivo puede ser uno de otros virus como el virus de la estomatitis vesicular (VSV), virus de la hepatitis o gripe.

En algunos casos, el gen objetivo es de un virus de la leucemia del simio gibón (GaLV). En algunos aspectos, el gen objetivo, por ejemplo, un gen viral (como un primer o segundo gen viral o gen viral adicional), es de un virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV). En algunos casos, el gen objetivo, por ejemplo, un gen viral (como un primer o segundo gen viral o gen viral adicional), es de un virus de estomatitis vesicular (VSV).

En algunos casos, el gen objetivo se mide, evalúa, cuantifica y/o determina para evaluar la presencia, ausencia, cantidad, nivel y/o concentración de un retrovirus competente en la replicación. En casos particulares, el retrovirus competente en la replicación es un gammaretrovirus competente en la replicación (RCR). En algunos casos, el gammaretrovirus competente en la replicación se detecta midiendo un gen objetivo que se deriva y/o se origina a partir de un gammaretrovirus. En algunos casos, el gen objetivo es un gen env, gag, pol, rev, pro, vpr, vif, vpu, nef, vpx o Tat que se origina y/o se deriva de un gammaretrovirus. En casos particulares, el gen objetivo es un env, gag, pol o rev que se origina y/o se deriva de un gammaretrovirus. En algunos casos, el gen objetivo se usa y/o está contenido en un plásmido o se expresa en una célula que se usa para producir un vector gammaretroviral, y se origina y/o se deriva de un virus que no es un gammaretrovirus. En algunos casos, el gen objetivo es un gen env, gag, pol, rev, pro, vpr, vif, vpu, nef, vpx o Tat que no se deriva de un gammaretrovirus. En algunos casos, el gen objetivo es un gen de seudotipificación. En casos particulares, el gen objetivo es un env que se origina y/o se deriva de un virus que no es un gammaretrovirus, por ejemplo, VSV. Los gammaretrovirus ejemplares incluyen, pero no se limitan a, el virus de la leucemia murina (MLV), el virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV), el virus de la leucemia murina de Abelson, el virus de la leucemia felina, el virus del sarcoma felino y los virus de la reticuloendoteliosis aviar.

En algunos casos, el gen objetivo es un gen gag retroviral. En algunos casos, el gen gag es un gen gag del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV) o un gen gag del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En algunos casos, el gen gag codifica una proteína viral presente en virus competentes en la replicación, pero el gen está ausente en una partícula de vector viral no competente en la replicación que comprende la molécula recombinante y/o heteróloga. En algunos casos, el gen gag codifica una poliproteína que comprende proteínas de la matriz viral, cápside y nucleocápside. Las proteínas ejemplares incluyen p17, p24, p9 y p6. En algunos casos, las células transducidas que albergan virus competentes en la replicación transcribirán varios genes virales que no están presentes en la partícula del vector viral, incluyendo el gen gag de MMLV o VIH. En algunos casos, el gen gag de MMLV comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 27, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos casos, el gen gag del VIH comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 31, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia.

En algunos casos, el gen objetivo es un gen pol retroviral. En algunos casos, el gen pol es un gen pol de MLV o un gen pol de VIH. En algunos casos, el gen pol codifica, entre otras proteínas, proteasa (PR), transcriptasa inversa (RT) e integrasa (IN). En algunos casos, el gen pol codifica una proteína viral presente en virus competentes en la replicación, pero el gen está ausente en una partícula de vector viral no competente en la replicación que comprende la molécula recombinante y/o heteróloga. En general, las células transducidas que albergan virus competentes en la replicación transcribirán varios genes virales que no están presentes en la partícula del vector viral, incluido el gen pol. En algunos casos, el gen pol comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 29, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos casos, el gen pol comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 32, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia.

En ciertos casos, el gen objetivo es un gen env retroviral. En algunos casos, el gen env es un gen env del virus de la leucemia del simio gibón (GaLV). En algunos casos, el gen env de GaLV codifica una proteína de envoltura viral presente en retrovirus competentes en la replicación, pero el gen está ausente de una partícula de vector viral no competente en la replicación que codifica la molécula recombinante y/o heteróloga. En general, las células transducidas que albergan virus competentes en la replicación transcribirán varios genes virales que no están presentes en la partícula del vector viral, incluyendo el gen env de GaLV. En algunos casos, el gen env de GaLV comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 25, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia.

En algunos casos, el gen objetivo se mide, evalúa, cuantifica y/o determina para evaluar la presencia, ausencia, cantidad, nivel y/o concentración de un lentivirus competente en la replicación (RCL). En algunos casos, el RCL se detecta midiendo un gen objetivo que se deriva y/o se origina a partir de un lentivirus. En algunos casos, el gen objetivo es un gen env, gag, pol, rev, pro, vpr, vif, vpu, nef, vpx o Tat que se origina y/o se deriva de un lentivirus. En casos particulares, el gen objetivo es un env, gag, pol o rev que se origina y/o se deriva de un lentivirus. En algunos casos, el gen objetivo se usa y/o está contenido en un plásmido o se expresa en una célula que se usa para producir un vector gammaretroviral, y se origina y/o se deriva de un virus que no es un lentivirus. En algunos casos, el gen objetivo es un gen env, gag, pol, rev, pro, vpr, vif, vpu, nef, vpx o Tat que no se deriva de un lentivirus. En algunos casos, el gen objetivo es un gen de seudotipificación. En casos particulares, el gen objetivo es un env que se origina y/o se deriva de un virus que no es un lentivirus, por ejemplo, VSV.

En algunos casos, los lentivirus incluyen miembros del grupo de lentivirus bovinos, grupo de lentivirus equinos, grupo de lentivirus felinos, grupo de lentivirus ovinocaprinos y grupo de lentivirus de primates. El diseño y uso de vectores lentivirales adecuados para la administración de genes se describe, por ejemplo, en Patente de Estados Unidos N° 6.207.455, concedida el 27 de marzo de 2001, y la Patente de Estados Unidos N° 6.165782, concedida el 26 de diciembre de 2000. Los ejemplos de lentivirus incluyen, pero no se limitan a, VIH-1, VIH-2, pseudotipo VIH-1/VIH-2, VIH-1/SIV, FIV, virus de la artritis encefalitis caprina (CAEV), virus de la anemia infecciosa equina y virus de la inmunodeficiencia bovina. En algunos casos, los vectores lentivirales incluyen, pero no se limitan a, uno derivado de un lentivirus de VIH-1, SIVmnd1, SIVlst, SIVsun, SIVolc o SIVwrc

En algunos casos, el gen objetivo es un gen rev lentiviral. En algunos casos, el gen rev es un gen rev del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En algunos casos, el gen rev codifica una proteína transactivadora. En algunos casos, el gen rev codifica una proteína viral presente en virus competentes en la replicación, pero el gen está ausente en una partícula de vector viral no competente en la replicación que comprende la molécula recombinante y/o heteróloga. En general, las células transducidas que albergan virus competentes en la replicación transcribirán varios genes virales que no están presentes en la partícula del vector viral, incluyendo el gen rev. En algunos casos, el gen rev comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 33, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia.

En algunos casos, el gen objetivo es un gen de seudotipificación y/o es un env que se origina y/o se deriva de un virus que no es un retrovirus. En algunos aspectos, el gen env es un gen env del virus de la estomatitis vesicular (por ejemplo, VSVG). En algunos casos, el gen env de VSV codifica una proteína de envoltura viral presente en virus competentes en la replicación, pero el gen está ausente de una partícula de vector viral no competente en la replicación que codifica la molécula recombinante y/o heteróloga. En general, las células transducidas que albergan virus competentes en la replicación transcribirán varios genes virales que no están presentes en la partícula del vector viral, incluido el gen env de VSVG. En algunos casos, el gen env de VSVG comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 26, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia.

En casos particulares, los métodos incluyen uno o más pasos para la detección de un RCR en una muestra, por ejemplo, en una muestra de prueba y/o una muestra biológica. En casos particulares, los métodos descritos en la presente incluyen uno o más pasos para la detección, medición, evaluación y/o cuantificación de uno o más genes objetivo que son genes gammaretrovirales y/o son genes que se usaron para generar un vector gammaretroviral, como un vector gammaretroviral deficiente en la replicación usado para la administración de genes. En casos particulares, los métodos incluyen uno o más pasos para la detección, medición, evaluación y/o cuantificación de uno o más genes de control. En algunos casos, el gen de control es la actina. En casos particulares, el gen objetivo es env de GaLV. En ciertos casos, el gen objetivo es gag de MMLV. En algunos casos, los genes objetivo son GaLV env y MMLV gag.

En casos particulares, los métodos incluyen uno o más pasos para la detección de un RCL en una muestra, por ejemplo, en una muestra de prueba y/o una muestra biológica. En casos particulares, los métodos descritos en la presente incluyen uno o más pasos para la detección, medición, evaluación y/o cuantificación de uno o más genes objetivo que son genes lentivirales y/o son genes que se usaron para generar un vector lentiviral, como un vector lentiviral deficiente en la replicación usado para la administración de genes. En casos particulares, los métodos incluyen uno o más pasos para la detección, medición, evaluación y/o cuantificación de uno o más genes de control. En algunos casos, el gen de control es la actina. En casos particulares, el gen objetivo es rev, por ejemplo, rev de VIH.En ciertos casos, el gen objetivo es VSV-G. En algunos casos, los genes objetivo son rev y VSV-G.

2. Genes de control

En algunos casos, además de medir, detectar, evaluar y/o cuantificar el parámetro, también se mide, detecta, evalúa y/o cuantifica la cantidad, el nivel y/o la concentración de un parámetro de control. En casos particulares, el valor o medición del parámetro de control está correlacionado y/o asociado con la cantidad, nivel y/o concentración de un gen de control o producto de expresión génica. En algunos casos, el parámetro y el parámetro de control son ambos un gen o un producto de expresión génica, por ejemplo, una proteína. En ciertos casos, el parámetro y el parámetro de control son ambos un gen, un polinucleótido de ARN y/o un polinucleótido de ADN derivado de un polinucleótido de ARN. En ciertos casos, el valor o la medición del parámetro de control se correlaciona, por ejemplo, negativa o positivamente, con el nivel, concentración, y/o cantidad del gen de control o producto de expresión génica. En algunos casos, el producto de expresión génica es un ARNm. En casos particulares, el producto de expresión del gen de control es un ARN no viral, por ejemplo, un ARNm humano.

En algunos casos, el parámetro de control es un ARN. En casos particulares, medir, detectar, evaluar y/o cuantificar el parámetro de control es o incluye medir, detectar, evaluar y/o cuantificar el nivel y/o la cantidad de un ARN. En casos particulares, el parámetro de control se mide, evalúa, detecta y/o cuantifica con PCR, por ejemplo, RT-PCR.

En algunos casos, además de evaluar los niveles de ARN viral del gen objetivo, también se evalúan los niveles de ARN de un gen de control. En algunos casos, el gen de control es uno cuyos niveles de ARN y/o transcripción no se cree que se vean afectados o cambien con la presencia de virus competentes en la replicación. En algunos casos, el gen de control es un gen de mantenimiento, por ejemplo: beta actina (ACTB; p-actina), beta tubulina (p-tubulina; TUBB), ubiquitina, p-glucuronidasa (GUSB), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HPRT1), ARN ribosomales (por ejemplo, 28s o 18s) y/o gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). En algunos aspectos, la evaluación del gen de control se multiplexa con el gen objetivo. En algunos casos, la evaluación del gen de control controla la calidad del ARN en el ensayo. En algunos casos, la presencia del gen de control en una reacción, por ejemplo, pocillo, confirma que el ARN está presente y es de suficiente calidad para ser capaz de experimentar transcripción inversa y amplificación por PCR.

En algunos casos, el gen de control es cualquiera de una serie de genes o polinucleótidos o partes de los mismos que se sabe que se usan como gen de control para ensayos de RT-PCR y/o qPCR.

En algunos casos, el gen de control es o comprende actina, como beta actina humana (p-actina). En algunos aspectos, el gen de actina comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 28, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia.

B. Preparación, protocolo y análisis del ensayo

En ciertos casos, se realizan uno o más ensayos para detectar, medir, evaluar y/o cuantificar un parámetro. En algunos casos, detectar, medir, evaluar y/o cuantificar un parámetro es o incluye detectar, medir, evaluar y/o cuantificar el nivel de un polinucleótido, por ejemplo, un polinucleótido de ARN viral y/o un polinucleótido de ADN derivado de un polinucleótido de ARN. En ciertos casos, la detección, medición, evaluación y/o cuantificación de un parámetro es o incluye detectar, medir, evaluar y/o cuantificar el nivel de una proteína, por ejemplo, una proteína viral.

En algunos casos, el parámetro es o incluye un nivel o cantidad de un polinucleótido. En casos particulares, la cantidad o el nivel de un polinucleótido en una muestra puede evaluarse, medirse, determinarse y/o cuantificarse mediante cualquier medio adecuado. Por ejemplo, en algunos casos, la cantidad o el nivel de un polinucleótido puede evaluarse, medirse, determinarse y/o cuantificarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), incluyendo la PCR con transcriptasa inversa (rt), la PCR digital de gotitas, métodos de PCR en tiempo real y cuantitativos (incluidos, por ejemplo, TAQMAN®, baliza molecular, LIGHTUP™, SCORPION™, SIMPLE^pR^oBES®; ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 5.538.848; 5,925,517; 6,174,670; 6,329,144; 6,326,145 y 6,635,427); transferencia northern; transferencia Southern, por ejemplo, de productos de transcripción inversa y derivados; métodos basados en matrices, incluyendo las matrices transferidas, micromatrices o matrices sintetizadas in situ; y secuenciación, por ejemplo, secuenciación por síntesis, pirosecuenciación, secuenciación dideoxi o secuenciación por ligación, o cualquier otro método conocido en la técnica como se analiza en Shendure et al., Nat. Rev. Genet. 5:335-44 (2004) o Nowrousian, Eukaryotic Cell 9(9): 1300-1310 (2010), incluyendo plataformas específicas como secuenciación HELICOS®, ROCHE® 454, ILLUMINA® /SOLEXA®, ABI SOLiD® y POLONATOR® En casos particulares, los niveles de un polinucleótido se miden mediante qRT-PCR. En algunos casos, la qRT-PCR usa tres conjuntos de ácidos nucleicos para cada gen, donde los tres ácidos nucleicos comprenden un par de cebadores junto con una sonda que se une entre las regiones de un ácido nucleico objetivo donde se unen los cebadores.

En algunos casos, el uno o más parámetros se miden, evalúan, detectan y/o cuantifican secuenciando uno o más polinucleótidos. En algunos casos, la secuenciación se realiza mediante un método de secuenciación que no es de Sanger y/o una técnica de secuenciación de próxima generación (NGS). Los ejemplos de técnicas de secuenciación de próxima generación incluyen,pero no se limitan a, secuenciación de firmas masivamente en paralelo (MPSS), secuenciación de Polony, pirosecuenciación, secuenciación de terminador de colorante reversible, secuenciación SOLiD, secuenciación de semiconductores de iones, secuenciación de nanobolas de ADN, secuenciación de una sola molécula de helioscopio, molécula única secuenciación en tiempo real (SMRT), secuenciación en tiempo real de una sola molécula (RNAP) y secuenciación de ADN de nanoporos. En algunos casos, la técnica NGS es secuenciación de ARN (ARN-Seq). Los métodos de secuenciación de ARN se han adaptado para las plataformas de secuenciación de ADN más comunes [sistemas HiSeq (Illumina), 454 Genome Sequencer FLX System (Roche), Applied Biosystems SOLiD (Life Technologies), IonTorrent (Life Technologies)]. Estas plataformas generalmente requieren una transcripción inversa inicial de ARN en ADNc. Por el contrario, el secuenciador de una sola molécula HeliScope (Helicos BioSciences) puede usar el ARN como plantilla para la secuenciación. También se ha demostrado una prueba de principio para la secuenciación directa de ARN en la plataforma PacBio RS (Pacific Bioscience). En algunos casos, el uno o más productos génicos de ARN se evalúan, miden, determinan y/o cuantifican mediante ARN-seq.

En algunos casos, el parámetro es o incluye un nivel o cantidad de una proteína. En algunos casos, se miden, evalúan, detectan y/o cuantifican una o más proteínas por medios adecuados. Los métodos adecuados incluyen, pero no se limitan a, inmunocitoquímica o inmunohistoquímica, ELISA (incluyendo ELISA directo, indirecto, de sándwich, competitivo, múltiple y portátil (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 7.510.687), transferencia Western (incluyendo la transferencia de una, dos o más dimensiones u otros medios cromatográficos, incluyendo opcionalmente la secuenciación de péptidos), RIA (radioinmunoensayo), SPR (resonancia de plasmón superficial), técnicas de aptámero basadas en ácidos nucleicos o basadas en proteínas, HPLC (cromatografía líquida de alta precisión), secuenciación de péptidos (como la secuenciación de degradación de Edman o espectrometría de masas (como MS/MS), opcionalmente acoplada a HPLC) y adaptaciones de micromatrices de cualquiera de los anteriores (incluyendo matrices de ácidos nucleicos, anticuerpos o proteína-proteína (es decir, sin anticuerpos).

En algunos casos, el parámetro es un nivel o cantidad de ARN de un gen objetivo. En algunos casos, los niveles de ARN del gen objetivo, por ejemplo, el primer o segundo gen viral y/o el gen de control, se evalúan mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) y/o PCR en tiempo real (qPCR). En algunos aspectos, la RT-PCR y la qPCR se llevan a cabo en el mismo ensayo, por ejemplo, en un ensayo de un solo paso (RT-qPCR). En algunos casos, el nivel de ARN del gen objetivo se evalúa usando uno o más cebadores de oligonucleótidos, por ejemplo, cebadores directos e inversos, específicos para una o más secuencias del gen objetivo. En algunos casos, el nivel de ARN del gen de control se evalúa usando uno o más cebadores de oligonucleótidos, por ejemplo, cebadores directos e inversos, específicos para una o más secuencias del gen de control. En algunos casos, se usa una sonda de oligonucleótidos específica para una secuencia del gen objetivo o gen de control para evaluar el nivel de ARN del gen objetivo o el gen de control, respectivamente.

En algunos casos, el nivel de ARN del gen objetivo y/o del gen de control se evalúa en la muestra de prueba, por ejemplo, en ARN de células que comprenden un ácido nucleico heterólogo. En algunos casos, los niveles de ARN de los genes objetivo y de control se evalúan determinando una cantidad relativa de ARN objetivo y de control presente en la muestra de prueba, respectivamente.

En algunos casos, el ARN se extrae de la muestra, como de las células transducidas. En algunos casos, las células se lisan antes de la extracción del ARN. Por tanto, en algunos casos, el ARN se extrae del lisado celular. El ARN puede aislarse usando reactivos y métodos conocidos por el experto en la técnica.

En algunos casos, el ARN se extrae de la muestra, como de las células transducidas. En algunos casos, las células se lisan antes de la extracción del ARN. Por tanto, en algunos casos, el ARN se extrae del lisado celular. El ARN puede aislarse usando reactivos y métodos conocidos por los expertos en la técnica.

En algunos aspectos, se evalúa la pureza, integridad y/o concentración del ARN. En algunos casos, se considera que el ARN tiene una pureza aceptable, por ejemplo, está libre de contaminación sustancial, como con el ADN, si tiene un valor A260/280 por encima de 2, como entre 2,000 y 2,100.

En algunos casos, el ADNc se sintetiza usando el ARN de la muestra de prueba como plantilla para la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Puede usarse cualquiera de varios reactivos de RT-PCR conocidos.

En algunos casos, se evalúan los niveles de ARN de uno o más genes objetivo mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR). En algunos casos, antes del ensayo de qPCR, el ADNc se sintetiza mediante RT-PCR con ARN de la muestra de prueba como plantilla. En algunos casos, la RT-PCR y la qPCR se llevan a cabo en una reacción de un solo paso (RT-qPCR).

En algunos casos, las muestras de control y de prueba se asignan a uno o más pocillos de un formato o placa de múltiples pocillos, como una placa de 96 pocillos. En algunos casos, las muestras de control y/o de prueba se analizan cada una en un solo pocillo de la placa de múltiples pocillos. En algunos casos, las muestras de control y/o de prueba se procesan por replicado, como por triplicado.

En algunos casos, la muestra de control y/o de prueba se mezcla con uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del gen de control y/o el gen objetivo, como cebadores directos e inversos, como cualquiera de los descritos en la presente. En algunos casos, se mezcla una sonda de hidrólisis específica para el gen de control y/o una sonda de hidrólisis específica para el gen objetivo con la muestra de prueba y/o de control. En algunos casos, la muestra de control y/u objetivo se mezcla con otros reactivos para realizar el ensayo de RT-PCR y/o PCR en tiempo real, como cualquier reactivo conocido en la técnica.

En algunos casos, la cantidad de ARN se determina o estima en base a la detección mediante PCR en tiempo real y el cálculo de un valor de Ct. Por tanto, en algunos casos, la presencia del amplicón del gen de control y/u objetivo se detecta mediante PCR en tiempo real. En algunos casos, se determina o calcula un umbral de señal definido para todas las reacciones a analizar. En algunos casos, se determina la cantidad de ciclos de amplificación requeridos para alcanzar este umbral de señal (ciclo umbral o "Ct") para el ácido nucleico objetivo, como un ARN viral o un gen viral, así como para uno o más genes de control. La presencia o cantidad, como la cantidad absoluta o relativa, del gen viral o del gen de control en la muestra de prueba puede determinarse en base a los valores de Ct obtenidos para el ácido nucleico objetivo y el gen de control usando métodos conocidos en la técnica (Gibson et al., Genome Research 6:995-1001; Bieche et al., Cancer Research 59:2759-2765, 1999; WO 97/46707; W^o97/46712; WO 97/46714).

En algunos casos, el ensayo se lleva a cabo como una reacción multiplex. Por ejemplo, en algunos casos, la evaluación de los niveles de ARN del gen objetivo y el gen de control se lleva a cabo en una reacción multiplex. Una ventaja de evaluar el gen objetivo y el gen de control simultáneamente incluye que puede confirmarse y normalizarse la calidad del ARN en el ensayo en pocillos y placas de ensayo. En algunos casos, la presencia del gen de control en una reacción, por ejemplo pocillo, confirma que hay ARN y tiene la calidad suficiente para poder someterse a la transcripción inversa y la amplificación por PCR y esto puede evitar la detección de falsos negativos debidos a la mala calidad del ARN o condiciones de reacción comprometidas.

En algunos aspectos, pueden multiplexarse en el ensayo dos o más genes objetivo, por ejemplo, primer o segundo genes virales o genes virales adicionales. En algunos casos, los dos o más genes objetivo se multiplexan con el gen de control o los genes de control. En algunos aspectos, una ventaja de evaluar dos o más genes objetivo en una reacción multiplexada incluye que los niveles de ARN de los genes se determinarán a partir del mismo material de partida, por ejemplo, la misma cantidad de ARN con la misma calidad. En algunos casos, la evaluación de uno o más genes de control en el mismo pocillo que el gen objetivo puede ser ventajoso porque la presencia o detección del gen de control proporciona un control positivo en el mismo pocilio que experimenta las mismas condiciones de reacción que el gen objetivo.

En algunos casos, los métodos descritos incluyen comparar el nivel de ARN viral en la muestra de prueba con un valor o nivel de referencia para cada uno de los genes virales que se han evaluado y, en base a la comparación, determinar si está presente en la muestra de prueba el virus competente en la replicación. En algunos casos, la muestra de prueba y/o el valor de referencia pueden medirse directa o indirectamente.

1. Preparación de muestras

a. Muestra de prueba

En algunos casos, la muestra de prueba contiene uno o más parámetros que están asociados, se correlacionan y/o son predictivos de los niveles de ARN viral. En casos particulares, el uno o más parámetros que están asociados, se correlacionan y/o son predictivos de los niveles de ^aRⁿviral en una muestra biológica.

En ciertos casos, la muestra de prueba contiene una o más células. En algunos casos, las células se originan y/o derivan de la muestra biológica y/o de la misma fuente que la muestra biológica. En casos particulares, la muestra de prueba contiene polipéptidos y/o polinucleótidos que se derivan de células de la muestra biológica o de la misma fuente que la muestra biológica. En algunos casos, la muestra de prueba contiene ARN. En ciertos casos, la muestra de prueba contiene ADN, por ejemplo, ADNc, que se deriva del ARN viral. En algunos casos, la muestra de prueba contiene proteína.

En ciertos casos, la muestra de prueba contiene uno o más productos de expresión génica, por ejemplo, un polipéptido y/o polinucleótido que refleja, se correlaciona y/o está asociado con la presencia y/o actividad de un gen, por ejemplo, un gen de ARN viral objetivo. En ciertos casos, la muestra de prueba contiene uno o más polipéptidos que reflejan, se correlacionan y/o están asociados con la presencia y/o actividad de un gen, por ejemplo, un gen de ARN viral objetivo. En algunos casos, los polipéptidos son o incluyen polipéptidos modificados, por ejemplo, polipéptidos dimetilados, trimetilados, acetilados, fosforilados, ubiquinados, palmitoilados, glicosilados, lipidados, sulfonados y/o nitrosilados, que reflejan, se correlacionan y/o están asociados con la presencia y/o actividad de un gen, por ejemplo, un gen de ARN viral objetivo. En casos particulares, la muestra de prueba contiene uno o más polinucleótidos que reflejan, se correlacionan y/o están asociados con la presencia y/o actividad de un gen, por ejemplo, un gen de ARN viral objetivo. En algunos casos, el uno o más polinucleótidos son o incluyen ARN que codifican genes virales, por ejemplo, genes virales objetivo. En ciertos casos, el uno o más polinucleótidos son o incluyen ADN, por ejemplo, ADNc, que se derivan de ARN que codifican genes virales, por ejemplo, genes virales objetivo.

En ciertos casos, la muestra de prueba contiene un parámetro que se toma, se deriva y/o se origina de una célula. En casos particulares, la célula está contenida en la muestra de prueba. En casos particulares, la muestra de prueba contiene una célula que se toma, se origina y/o se deriva de una muestra biológica y/o de la misma fuente que la muestra biológica. En ciertos casos, la célula es de una muestra biológica. En casos particulares, la célula es de la misma fuente que la muestra biológica. En algunos casos, la muestra de prueba contiene ARN de una célula. En ciertos casos, la muestra de prueba contiene ADN, por ejemplo ADNc, que se deriva del ARN de una célula, por ejemplo, una célula de una muestra biológica o de la misma fuente que la muestra biológica.

En algunos casos, la célula, por ejemplo, una célula de una muestra biológica y/o de la misma fuente que la muestra biológica, es una que se ha generado en relación con el procesamiento y la preparación de células manipuladas, como para su uso en terapia celular adoptiva y/o las formuladas para dicho uso, por ejemplo, en una composición farmacéutica que comprende un recipiente y/o crioconservante farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, una célula, por ejemplo, una célula de una muestra biológica y/o de la misma fuente que la muestra biológica, evaluada por los métodos, que en algunos aspectos puede ser una célula de control, es de una línea celular de empaquetamiento viral (VPC), un banco de células maestro (MCB) o un banco de células de trabajo (WCB). En algunos casos, el vector viral se produce usando una VPC diseñada para sintetizar proteínas retrovirales requeridas para producir partículas de vectores retrovirales funcionales. En algunos casos, las VPC no incluyen el genoma del vector. En algunos casos, un MCB comprende células, como VPC, establecidas o certificadas para su uso como línea de células de empaquetamiento. Tales células son generalmente capaces de producir partículas de vectores virales de alta calidad o alto titulación. En algunos casos, la WCB se usa para fabricar lotes de partículas de vectores virales. En algunos casos, la fabricación de un lote de vector viral comprende la expansión de viales de siembra de un banco de células de trabajo, un banco de células maestras o una línea celular en medios de cultivo en condiciones apropiadas. En algunos casos, los lotes de sobrenadante que contienen las partículas del vector se recogen durante varios días, según lo determinado en base a experimentos preliminares que demuestran el período de mayor rendimiento del vector. En algunos casos, el sobrenadante que contiene el vector viral puede someterse a pasos de purificación limitados para eliminar los restos celulares. En algunos casos, el sobrenadante de la cosecha a granel se prueba en busca de virus competentes en la replicación como parte de las pruebas de liberación de lotes.

En algunos casos, la célula, por ejemplo, una célula de una muestra biológica y/o de la misma fuente que la muestra biológica, es una célula de empaquetamiento o una célula huésped usada para producir transitoriamente partículas de vector viral. En algunos casos, las partículas del vector viral pueden producirse mediante métodos de producción transitorios que requieren la cotransfección de plásmidos que codifican el genoma del vector y construcciones de empaquetamiento en una célula huésped. En algunos casos, la producción transitoria puede ser ventajosa cuando se producen vectores lentivirales, ya que las VPC para vectores lentivirales no están ampliamente disponibles, en parte debido a los efectos potencialmente citotóxicos de ciertos componentes del empaquetamiento como gag de VIH y VSV-G). En algunos casos, pueden usarse métodos de producción transitoria para producir vectores gammaretrovirales. En algunos casos, la producción transitoria evita la necesidad de VPC. Las células usadas para la producción de partículas de vectores virales transitorios típicamente se expanden y caracterizan de una manera similar a las pruebas usadas para un banco de células maestras y un banco de células de trabajo de una VPC para garantizar que las células produzcan partículas de vectores virales de alta calidad y título alto.

En algunos casos, las preparaciones de vectores resultantes tienen altos niveles de ADN plasmídicos contaminantes usados durante la transfección. Por lo tanto, en algunos casos, las partículas del vector viral producidas transitoriamente pueden someterse a pasos adicionales para eliminar los ADN plasmídicos, como la digestión con ADNasa seguido de pasos de purificación posteriores.

En algunos casos, las preparaciones de vectores resultantes tienen niveles detectables de ácidos nucleicos contaminantes, incluyendo ADN plasmídicos contaminantes usados durante la transfección y los ARN producidos durante la producción viral, incluyendo los ARN contaminantes de las VPC o células usadas para la producción transitoria de partículas de vectores virales. Por lo tanto, en algunos casos, los genes objetivo seleccionados para su uso en los métodos descritos para detectar RCR pueden discriminar entre cantidades, niveles o concentraciones de fondo de ácidos nucleicos contaminantes y cantidades, niveles o concentraciones de ARN viral que indican la presencia, ausencia, cantidad, concentración o riesgo de RCR en una muestra.

En algunos casos, las células, por ejemplo, células de la muestra de prueba, de la muestra biológica y/o de la misma fuente que la muestra biológica, evaluadas por los métodos y/o composiciones descritos, han sido transducidas para contener un ácido nucleico heterólogo y /o ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga u otro ácido nucleico o producto polipeptídico, por ejemplo, una proteína recombinante humana o derivada de un ser humano. En algunos casos, el ácido nucleico heterólogo codifica una molécula de unión, como un receptor recombinante, como un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T transgénicas (TCR). En algunos casos, la célula está compuesta por poblaciones de dichas células, composiciones que contienen dichas células y/o enriquecidas para dichas células, por ejemplo, en las que las células que expresan la molécula de unión constituyen por lo menos el 15%, 20%, 25%, 30%., 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más por ciento del total de células en la composición o células de cierto tipo, como células T o células CD8+ o CD4+. En algunos casos, las células son células T primarias. Entre las composiciones se encuentran composiciones farmacéuticas y formulaciones para administración, como para terapia celular adoptiva.

En algunos casos, la muestra de prueba comprende ARN de células manipuladas genéticamente que expresan el ácido nucleico heterólogo y/o el ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga u otro ácido nucleico o producto polipeptídico, por ejemplo, una proteína recombinante humana o derivada de un ser humano. Las células generalmente son células eucarióticas, tales como células de mamíferos, y típicamente son células humanas. En algunos casos, las células, por ejemplo, las células de la muestra de prueba y/o de la muestra biológica, se derivan de la sangre, la médula ósea, la linfa o los órganos linfoides, son células del sistema inmunitario, como las células del inmunidad innata o adaptativa, por ejemplo, células mieloides o linfoides, incluyendo linfocitos, típicamente células T y/o células NK. Otras células ejemplares incluyen células madre, como células madre multipotentes y pluripotentes, incluyendo células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En algunos casos, las células son células primarias, como las que se aíslan directamente de un sujeto y/o se aíslan de un sujeto y se congelan.

En algunos casos, las células son células asesinas naturales (NK). En algunos casos, las células son monocitos o granulocitos, por ejemplo, células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mastocitos, eosinófilos y/o basófilos.

En algunos casos, las células, por ejemplo, células de la muestra de prueba, muestra biológica y/o de la misma fuente que la muestra biológica, incluyen uno o más ácidos nucleicos introducidos mediante ingeniería genética y, por lo tanto, expresan productos recombinantes o manipulados genéticamente de tales ácidos nucleicos. En algunos casos, los ácidos nucleicos son heterólogos, es decir, normalmente no están presentes en una célula o muestra obtenida de la célula, como la obtenida de otro organismo o célula, que por ejemplo, no se encuentra normalmente en la célula que se está manipulando y/ o un organismo del que se deriva dicha célula. En algunos casos, los ácidos nucleicos no son de origen natural, como un ácido nucleico que no se encuentra en la naturaleza, incluyendo uno que comprende combinaciones quiméricas de ácidos nucleicos que codifican varios dominios de múltiples tipos de células diferentes.

En algunos casos, la presencia o ausencia de virus competentes en la replicación puede evaluarse en cualquier punto de la preparación, producción o fabricación de células transducidas o manipuladas, incluyendo las células que son, serán o han sido transducidas para su uso en terapia celular adoptiva y la monitorización después de la terapia del sujeto. Los pasos ejemplares para procesar células incluyen pasos implicados en el aislamiento, separación, selección, cultivo (por ejemplo, estimulación de las células, por ejemplo, para inducir su proliferación y/o activación), transducción, lavado, suspensión, dilución, concentración y/o o formulación de las células, incluyendo las conocidas y/o descritas en la presente. En casos particulares, los pasos de procesamiento incluyen la transducción de las células con partículas de vectores virales, donde por lo menos una parte de la incubación con las partículas del vector viral se realiza en un sistema o cámara cerrados para iniciar la transducción. Los métodos pueden además y/o alternativamente incluir otros pasos de procesamiento, como pasos para el aislamiento, separación, selección, cultivo (por ejemplo, estimulación de las células, por ejemplo, para inducir su proliferación y/o activación), lavado, suspensión, dilución, concentración y/o formulación de las células. En algunos casos, la muestra de prueba se obtiene de células que se sometieron a transducción y luego se cultivaron, por ejemplo a 37° C, durante más o más de aproximadamente 1 día, 2 días o 3 días, como generalmente más de 4 días. días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días o más.

En algunos casos, la muestra de prueba y/o la muestra biológica comprende ARN de una célula en cualquier etapa de un proceso de fabricación de ingeniería genética. En algunos casos, la muestra de prueba contiene ADN derivado del ARN de una célula en cualquier etapa de un proceso de fabricación de ingeniería genética. Por ejemplo, la muestra de prueba puede comprender ARN de células que han sido transducidas con una partícula de vector viral que codifica una molécula recombinante y/o heteróloga. En algunos casos, la muestra de prueba puede comprender ADN derivado de ARN de células que han sido transducidas con una partícula de vector viral que codifica una molécula recombinante y/o heteróloga. En algunos casos, la muestra de prueba se obtiene de una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, que contiene células, por ejemplo, células autólogas o alogénicas, manipuladas por transducción con un ácido nucleico heterólogo que codifica un receptor de antígenos (por ejemplo, CAR) y se han cultivado o expandido, como para su uso en relación con la terapia celular adoptiva. En algunos casos, la muestra de prueba contiene ARN, o ADN derivado del ARN, de dichas células transducidas que se han crioconservado, a lo que, en algunos aspectos, se hace referencia como producto farmacéutico crioconservado (CDP). En algunos casos, la muestra de prueba contiene ARN o ADN derivado del ARN, de dichas células transducidas que se han formulado para su administración a un sujeto, a lo que, en algunos aspectos, se hace referencia como producto farmacéutico formulado (FDP). En algunos casos, la muestra de prueba se obtiene de un sujeto después de que dicho sujeto haya recibido una terapia que comprende células que han sido transducidas, como con una partícula de vector viral que codifica una molécula recombinante y/o heteróloga, por ejemplo, un CAR. En algunos casos, como control, los métodos descritos pueden realizarse en una muestra de control emparejada con el paciente que no se ha sometido a transducción o ingeniería genética, que puede ser una muestra que contiene las células seleccionadas o enriquecidas que se usarán para la transducción.. En algunos casos, dicha muestra de control emparejada con el paciente puede ser una muestra crioconservada a la que, en algunos casos, se hace referencia como material crioconservado (CMAT). En algunos casos, el ARN de la muestra de prueba se aísla de las células. En algunos casos, el ARN se aísla de aproximadamente 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 1o7, o más células. En algunos casos, el ARN se aísla de 1 x 106 células. En algunos casos, el ARN se aísla de todas o sustancialmente todas las células comprendidas en una muestra o parte seleccionada de la misma.

En algunos casos, las células se incuban con un agente o agentes estimulantes celulares que son un agente de unión celular, como un reactivo de unión a antígeno, como un anticuerpo, que es capaz de inducir la señalización intracelular y/o la proliferación celular. En algunos casos, las células se incuban con perlas anti-CD3/anti-CD28, incluyendo mezcladas con ellas.

b. Muestras de control

En algunos aspectos, el método descrito se realiza adicionalmente en una o más muestras de control. En algunos casos, se usa un control estándar de plásmido como control para la parte de amplificación por PCR del ensayo. En algunos aspectos, el control estándar de plásmido contiene un gen de control, como un gen de mantenimiento. En algunos casos, el gen de control es b-actina.

En algunos casos, el control estándar de plásmido comprende un ácido nucleico que codifica un gen de control o una parte del mismo y el gen objetivo o una parte del mismo. Un control estándar de plásmido ejemplar es o incluye gag de pActin-MMLV (SEQ ID N^o: 30) o pActin-GaLV (SEQ ID NO: 34). En algunos casos, un plásmido que codifica tanto el gen objetivo como el gen de control permite la transcripción de niveles similares de ARN que codifica el gen objetivo y el gen de control. En algunos casos, la secuencia que codifica el gen de control se enlaza operativamente a la secuencia que codifica el gen objetivo de tal manera que las dos secuencias se cotranscriben. En algunos casos, las dos secuencias se cotranscriben como un único ácido nucleico. En algunos casos, las dos secuencias se cotranscriben como ácidos nucleicos separados a tasas similares y/o con cantidades similares de transcritos de ARN producidos. En algunos casos, la transcripción del gen de control y el gen objetivo está controlada por el mismo promotor. En algunos casos, la transcripción del gen de control y el gen objetivo están controladas por diferentes promotores. En algunos casos, se usa, una serie de dilución de control estándar de plásmido de 106 a 101 copias por reacción, por ejemplo, pocilio.

En algunos casos, en el ensayo se usa un control sin plantilla (NTC). En algunos aspectos, el control sin plantilla solo contiene agua y reactivos de PCR. En algunos casos, el control sin plantilla proporciona información sobre el estado de contaminación de los reactivos de PCR.

En algunos casos, se usa un control sin transcriptasa inversa (-RT). En algunos aspectos, el control -RT contiene la muestra de prueba o la muestra de control, pero no la transcriptasa de referencia. Como resultado, la RT-PCR no produce un amplicón. Por tanto, en algunos casos, se usa la muestra -RT para evaluar la pureza de la plantilla de ARN y/o para detectar ADN contaminante.

En algunos aspectos, se usa un control negativo que no contiene copias del gen objetivo. En algunos casos, se usa como control negativo ARN de una línea celular que no expresa el gen objetivo. En algunos casos, el control negativo puede usarse a una concentración similar en comparación con la muestra de prueba.

En algunos casos, como control de contaminación durante el procedimiento de aislamiento de ARN se usa un control en proceso que contiene ARN de material emparejado con el paciente que no se ha transducido con la partícula del vector viral que codifica una molécula recombinante y/o heteróloga.

En algunos casos, se evalúa un control positivo que contiene el ARN del gen objetivo, por ejemplo, el primer o el segundo gen viral. En algunos aspectos, el control positivo se establece para el ensayo en base al límite de detección de los niveles de ARN del gen objetivo del ensayo. En algunos casos, para el control positivo, se usa el ARN de una línea celular que expresa el gen objetivo en una cantidad igual o justo por encima del límite de detección del ensayo. En algunos aspectos, se establece el control positivo para el ensayo en base a un nivel conocido o un nivel máximo aceptable de ARN del gen objetivo. En algunos casos, para el control positivo, se usa el ARN de una línea celular que expresa el gen objetivo en una cantidad en el nivel conocido o máximo aceptable de ARN del gen objetivo. En ciertos casos, se usa el nivel de ARN de esta muestra de control positivo como valor de referencia para la comparación con las muestras de prueba como se describe a continuación. En algunos aspectos, se usa un control sin RT para confirmar o evaluar la pureza del ARN.

2. Cebadores y sondas

En algunos casos, se evalúa en la muestra de prueba y/o la muestra de control el gen objetivo, por ejemplo, el primer gen viral y/o el segundo gen viral, usando uno o más cebadores de oligonucleótidos. En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una secuencia del gen objetivo. En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una secuencia del gen de control. En algunos aspectos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos comprenden un cebador directo y un cebador inverso. Por tanto, en algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos comprenden un par de cebadores. En algunos casos, la pareja de cebadores contiene un cebador directo y uno inverso, cada uno específico para una secuencia del gen objetivo o del gen de control. En algunos aspectos, los cebadores directo e inverso son específicos para diferentes secuencias del mismo gen objetivo o gen de control.

En algunos casos, los cebadores y las sondas descritos son útiles para detectar un gen viral objetivo y/o una secuencia de polinucleótidos viral asociada con retrovirus competentes en la replicación, como un gammaretrovirus competente en la replicación (RCR) o un lentivirus competente en la replicación (RCL), en una muestra, por ejemplo, una muestra de prueba o una muestra biológica. En casos particulares, las sondas y los cebadores descritos son útiles para detectar el gen viral objetivo y/o la secuencia de polinucleótidos viral asociada con un retrovirus competente en la replicación que se origina y/o se generó a partir del vector viral usado para transducir células de la muestra biológica. En ciertos casos, los cebadores y sondas descritos son útiles para detectar genes virales objetivo y/o secuencias de polinucleótidos virales que se requieren para la competencia en la replicación en el vector viral que se usó para transducir las células en la muestra.

En algunos casos, los cebadores de oligonucleótidos son específicos para un gen objetivo en su forma de ADN. En algunos aspectos, los cebadores de oligonucleótidos son específicos para un gen objetivo en su forma de ARN.

En algunos aspectos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen objetivo, por ejemplo, el primer o el segundo gen viral, son específicos para, por ejemplo, unirse a una secuencia de un gen env, gag, pol o rev viral. En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen objetivo, por ejemplo, el primer o el segundo gen viral, son específicos para, por ejemplo, unirse a una secuencia de un gen vpr, vif, vpu, vpx, nef y/o Tat viral.

En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una parte de un gen de un virus que incluye, pero no se limita a: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV o MMLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV o HSV), virus de tumor mamario murino (MuMTV o MMTV), virus de la leucemia del simio gibón (GaLV o GALV), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y virus del sarcoma de Rous (RSV). En algunos casos, los cebadores de oligonucleótidos pueden ser específicos para genes de otros virus, como el virus de la estomatitis vesicular (VSV), virus de la hepatitis o la gripe.

En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una parte de una secuencia de env de GaLV, env de VSVG o gag de MMLV. En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una parte de una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 25, 26 o 27, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia o parte de dicha secuencia. En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos comprenden una o más secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 4-5, 16-17, 19-20 o 22-23.

En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del gen objetivo son específicos para una parte de una secuencia del gen env de GaLV, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 25, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos de tales aspectos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos comprenden la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4 o 5. En algunos casos, el cebador directo comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos aspectos, el cebador inverso comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. Por tanto, en algunos aspectos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5.

En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una parte de una secuencia del gen env de VSVG, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 26, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia.

En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una parte de una secuencia del gen gag de MMLV, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 27, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos de tales aspectos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos comprenden una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 16-17, 19-20 o 22-23. En algunos casos, el cebador directo comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 16, 19 o 22, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos aspectos, el cebador inverso comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 17, 20 o 23, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos casos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 16 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 17. En algunos casos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 19 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 20. En algunos casos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 22 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 23.

En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una parte de una secuencia del gen rev, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 33, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos de tales aspectos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos comprenden una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 38-39. En algunos casos, el cebador directo comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 38, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% identidad con dicha secuencia. En algunos aspectos, el cebador inverso comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 39, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos casos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 38 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 39. En algunos aspectos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen de control, por ejemplo, actina, se unen a una parte de la secuencia del gen de control. En algunos casos, cuando el gen de control es actina, los cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del gen de control son específicos, por ejemplo se unen, para una parte de una secuencia de actina. En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para una parte de la secuencia del gen de control son específicos para una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 28. En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para actina comprenden una o más secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 1-2, 8, 10-11 o 13-14.

En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una parte de una secuencia del gen de actina, como una parte de una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 28, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos de tales aspectos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos comprenden una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1-2, 7-8, 10-11 o 13-14. En algunos casos, el cebador directo comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1, 7, 10 o 13, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos aspectos, el cebador inverso comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, 8, 11 o 14, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos casos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ IDO NO: 2. En algunos casos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ IDO NO: 8. En algunos casos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 10 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ IDO NO: 11. En algunos casos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 13 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ IDO NO: 14.

En algunos casos, el gen objetivo, por ejemplo, el primer gen viral y/o el segundo gen viral, y/o el gen de control se evalúa usando un cebador de oligonucleótidos y un tinte fluorescente. Los tintes específicos de ácidos nucleicos de cadena doble ejemplares incluyen, pero no se limitan a, SYBR™ Verde I, SYBR™ Oro, bromuro de etidio, bromuro de propidio, Pico Green, Hoechst 33258, YO-PRO-I y YO-YO-I, Boxto, EVAGREEN®, LC GREEN®, LC GREEN PLUS® y SYTO® 9. En algunos casos, el tinte fluorescente es SYBR™ Verde. En algunos casos, el cebador de oligonucleótidos es específico para una parte de la secuencia del gen objetivo. En algunos casos, el cebador de oligonucleótidos es específico para una parte de la secuencia del gen de control. En algunos casos, el cebador de oligonucleótidos es específico para una secuencia del mismo gen objetivo o gen de control que uno o más de los otros cebadores de oligonucleótidos. Por tanto, en algunos casos, un cebador de oligonucleótidos específico para una secuencia de un gen objetivo o gen de control se usa con un cebador directo y un cebador inverso, por ejemplo, una pareja de cebadores específicos para el mismo gen objetivo o gen de control, respectivamente.

En algunos casos, el gen objetivo, por ejemplo, el primer gen viral y/o el segundo gen viral y/o el gen de control se evalúa usando una sonda de hidrólisis. En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una parte de la secuencia del gen objetivo. En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una parte de la secuencia del gen de control. En algunos aspectos, la sonda de hidrólisis es específica para una secuencia del mismo gen objetivo o gen de control que uno o más de los cebadores de oligonucleótidos. Por tanto, en algunos casos, se usa una sonda de hidrólisis específica para una secuencia de un gen objetivo o gen de control con un cebador directo y un cebador inverso, por ejemplo, un par de cebadores, específicos para el mismo gen objetivo o gen de control, respectivamente.

En algunos casos, la sonda de hidrólisis comprende una fracción o marcador fluorescente. En algunos casos, la fracción o marcador fluorescente es una fracción o marcador de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) (ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 4.996.143, 5.565.322, 5.849.489, y 6.162.603). En algunos casos, cuando una fracción fluorescente donante y una fracción fluorescente aceptora correspondiente se colocan dentro de una cierta distancia entre sí, tiene lugar la transferencia de energía entre las dos fracciones fluorescentes que pueden visualizarse o detectarse y/o cuantificarse de otro manera. El donante generalmente transfiere la energía al aceptor cuando el donante es excitado por una radiación de luz con una longitud de onda adecuada. El aceptor generalmente vuelve a emitir la energía transferida en forma de radiación de luz con una longitud de onda diferente. En algunos casos o sistemas, la energía no fluorescente puede transferirse entre fracciones donantes y aceptoras, por medio de biomoléculas que incluyen fracciones donantes sustancialmente no fluorescentes (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 7.741.467).

En algunos casos, una sonda de oligonucleótidos puede contener una fracción fluorescente donante y un inactivador correspondiente, que puede ser fluorescente o no. En algunos casos, el inactivador disipa la energía transferida en una forma distinta a la luz. En algunos casos, cuando la sonda de oligonucleótidos está intacta, se produce una transferencia de energía entre las dos fracciones fluorescentes de tal manera que se inactiva la emisión fluorescente de la fracción fluorescente donante. En algunos casos, durante un paso de extensión de una reacción en cadena de la polimerasa, una sonda de oligonucleótidos unida a un producto de amplificación es escindida por la actividad de nucleasa de 5' a 3' de, por ejemplo, una polimerasa Taq de tal manera que la emisión fluorescente de la fracción fluorescente donante ya no se inactiva. Las sondas de oligonucleótidos ejemplares para este propósito se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 5.210.015; 5.994.056; y 6.171.785. Las parejas de donante-aceptor de uso común incluyen la pareja FAM-TAMRA. Los inactivadores comúnmente usados son DABCYL y TAMRA™. Los inactivadores oscuros comúnmente usados incluyen BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™, (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa) y BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ -650), (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).

En algunos casos, la sonda de hidrólisis específica para el gen objetivo, por ejemplo, el primer o segundo gen viral, es específica para, por ejemplo se une a, una secuencia de un gen viral env, gag, pol o rev. En algunos casos, la sonda de hidrólisis específica para el gen objetivo, por ejemplo, el primer o segundo gen viral, es específica para, por ejemplo se une a, una secuencia de un gen viral vpr, vif, vpu, vpx, nef y/o Tat.

En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una parte de una secuencia de un retrovirus, como el virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV o MMLV), el virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV o HSV), el virus del tumor mamario murino (MuMTV o MMTV), virus de la leucemia del simio gibón (GaLV o GALV), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y virus del sarcoma de Rous (RSV). En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una parte de una secuencia del virus de la estomatitis vesicular (VSV), virus de la hepatitis o la gripe.

En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una secuencia de env de GaLV, env de VSVG o gag de MMLV. En algunos casos, la sonda de hidrólisis contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6, 18, 21 o 24.

En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una secuencia de un gen env de GaLV, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 25, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos de estos aspectos, la sonda de hidrólisis contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una secuencia o parte de una secuencia de un gen VSVG, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 26, o una secuencia que tiene por lo menos 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos de estos aspectos, la sonda de hidrólisis contiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 40.

En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una parte de una secuencia de un gen gag de MMLV, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 27, o una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos de estos aspectos, la sonda de hidrólisis contiene una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 18, 21 o 24.

En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una parte de una secuencia de un gen rev, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 33, o una secuencia que tiene por lo menos un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos de tales aspectos, la sonda de hidrólisis contiene una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 37.

En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una parte de una secuencia del gen de control, por ejemplo, actina, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 28, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. Por lo tanto, en algunos aspectos, la sonda de hidrólisis específica para una secuencia del gen de control es específica para, por ejemplo se une a, la secuencia de actina. En algunos casos, la sonda de hidrólisis contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3, 9, 12 o 15.

3. Nivel o valor de referencia

En algunos casos, puede determinarse la presencia de retrovirus competentes en la replicación si la cantidad, el nivel o la concentración de uno o más parámetros es mayor o menor que el valor de referencia, que puede medirse directa o indirectamente, por ejemplo, a partir de una muestra de control positivo que contiene el gen objetivo. En algunos casos, puede determinarse que la presencia del retrovirus competente en la replicación si la cantidad, el nivel o la concentración de uno o más parámetros que se correlacionan positivamente con la cantidad, el nivel o la concentración de uno o más genes objetivo es mayor que el valor de referencia. En casos particulares, puede determinarse la presencia del retrovirus competente en la replicación si la cantidad, nivel o concentración de uno o más parámetros que se correlacionan negativamente con la cantidad, nivel, o la concentración de uno o más genes objetivo es inferior al valor de referencia. En algunos casos, el parámetro y/o el nivel o valor de referencia son y/o indican un nivel o cantidad de un gen objetivo. En algunos casos, el parámetro y/o el nivel o valor de referencia son y/o indican un nivel o cantidad de un gen objetivo que es un gen de ARN viral.

Puede determinarse la presencia de retrovirus competentes en la replicación si los niveles de ARN del uno o más genes objetivo son más altos que un valor de referencia, que puede medirse directa o indirectamente, por ejemplo, a partir de una muestra de control positivo que contiene el gen objetivo y/o que contiene un parámetro que indica una cantidad o nivel del gen objetivo.

En algunos casos, el resultado del virus competente en la replicación para la muestra de prueba se notifica como "ARN de virus competente en la replicación detectado". En algunos casos, el resultado del virus competente en la replicación para la muestra de prueba se notifica como "ARN del virus competente en la replicación no detectado". En algunos aspectos, el resultado del virus competente en la replicación de la muestra de prueba se basa en una comparación de los niveles de ARN del gen objetivo con un valor de referencia.

En algunos casos, el valor o nivel de referencia es un nivel de ARN o una lectura sustituta de un nivel de ARN (por ejemplo, valor de CT), o se deriva en base a un nivel de ARN o una lectura sustituta de un nivel de ARN (por ejemplo, valor de CT), que indica un umbral para la presencia del ARN objetivo en una muestra indicativo de la presencia o riesgo de presencia de RCR en una muestra. En algunos casos, el valor de referencia puede predeterminarse en base a pruebas previas en condiciones de ensayo similares para la detección del ARN objetivo en una muestra, como mediante el uso de un modelo de virus competente en la replicación o un control de ARN positivo para el gen objetivo. En algunos casos, el valor de referencia puede basarse en una serie de control positivo en el mismo ensayo.

En algunos casos, el valor de referencia lo establece la muestra de control positivo que contiene un parámetro que está asociado y/o indica el gen objetivo a un nivel conocido y/o contiene el parámetro que está aproximadamente o justo por encima del límite de detección del parámetro por el ensayo. En algunos casos, el valor de referencia se establece calibrando el ensayo usando una concentración conocida del control positivo de tal manera que el ensayo sea lo suficientemente sensible para detectar el parámetro de o resultante de una o más células o partículas que contienen virus competentes en la replicación en un determinado volumen de una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, o un cierto volumen o cantidad de células o total. En ciertos casos, el valor de referencia se calibra para detectar un parámetro de una partícula de virus competente en la replicación en un cierto volumen de muestra de prueba o un cierto volumen o cantidad de células con un intervalo de confianza. En algunos casos, el intervalo de confianza es del 50%, 75%, 80%, 90%, y típicamente es de o aproximadamente o por lo menos o aproximadamente del 95%, 96%, 97%, 98% o 99%; en algunos aspectos, es por lo menos del 97%.

En algunos casos, el valor de referencia se establece mediante la muestra de control positivo que contiene el gen objetivo a un nivel conocido y/o aproximadamente o justo por encima del límite de detección del gen objetivo por el ensayo. En algunos casos, el valor de referencia se establece calibrando el ensayo usando una concentración conocida del control positivo de tal manera que el ensayo sea lo suficientemente sensible para detectar el ARN de una o más células o partículas que contienen virus competentes en la replicación en un cierto volumen de muestra de prueba. o un determinado volumen o cantidad de células o total. En algunos casos, el valor de referencia se calibra para detectar el ARN de una partícula de virus competente en la replicación en un cierto volumen de muestra de prueba o un cierto volumen o cantidad de células con un intervalo de confianza. En algunos casos, el intervalo de confianza es del 50%, 75%, 80%, 90%, y típicamente es o aproximadamente o por lo menos o aproximadamente del 95%, 96%, 97%, 98% o 99%; en algunos aspectos, es por lo menos del 97%.

En algunos casos, el valor de referencia se calcula en base a una cantidad conocida de ARN del gen viral, como el que está presente en un control positivo y/o una muestra de control de referencia. En algunos casos, una muestra de control de referencia comprende una cantidad conocida de ARN y/o de ARN objetivo, y/o puede usarse para determinar el límite de detección del ensayo y/o establecer un valor de referencia para el ensayo. En algunos casos, la muestra de control positivo o control de referencia comprende ARN de una muestra que comprende un virus competente en la replicación, como un virus de control, como un virus de tipo salvaje. En algunos casos, el virus de control comprende o codifica la misma secuencia o el complemento inverso de la secuencia del ARN del gen objetivo. En algunos casos, el virus de control es un virus de tipo salvaje, como un GaLV, MMLV o cualquiera de los virus descritos en la presente de tipo salvaje.

En algunos casos, el valor de referencia del ARN se determina en base al valor de Ct en un control positivo. Por tanto, en algunos casos, el valor de Ct del gen objetivo en la muestra de prueba puede compararse con el valor de Ct del gen objetivo en el control positivo. En algunos casos, el valor de Ct de una muestra que se ha identificado que comprende o se considera que contiene o posiblemente contiene virus competentes en la replicación es inferior a un valor de Ct de referencia y/o umbral. En algunos casos, el valor de Ct de una muestra que se ha identificado que no comprende o se considera que no comprende virus competentes en la replicación es más alto que un valor de Ct de referencia y/o umbral.

En algunos casos, el valor de referencia se basa en un control positivo que contiene una cantidad de ARN, o una lectura sustituta del mismo, como un valor de CT correspondiente a dicha cantidad de ARN, como el ARN objetivo, por ejemplo, el ARN de un gen viral particular, como env de GaLV que está en o cerca, está por encima o justo por encima del límite de detección del ensayo. En algunos casos, la cantidad de ARN es o está en o aproximadamente o está justo por encima (o alternativamente está hasta o hasta aproximadamente) o en o aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75 o 1,0 pg de ARN objetivo o una lectura correspondiente al mismo, como un valor de CT correspondiente al mismo y en algunos aspectos es de 2, 3, 4, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 750 o 1000 pg de ARN del gen objetivo. En algunos casos, el valor de referencia está en o aproximadamente o justo por encima de 0,75 pg del ARN del gen objetivo o es un valor de CT correspondiente a tal cantidad. En casos alternativos, el nivel de referencia es una cantidad de ARN en un número dado de células RCR+ en la muestra de prueba, por un número dado de células en la muestra de prueba, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 o 20, en algunos aspectos 10 o menos, células RCR+ por millón o por 10 millones o por 100 millones de células en la muestra, o un valor de CT correspondiente, como correspondiente a un control con tal concentración o número o número relativo de células RCR+. Por tanto, en algunos casos, el virus competente en la replicación puede detectarse si se determina que la cantidad de ARN del gen objetivo es mayor que el valor de referencia.

En algunos casos, el valor de referencia es un valor delta CT (ACT). En algunos casos, el valor de referencia es un ACT para una muestra de control, como un control positivo o un control negativo. En algunos casos, el valor de ACT es un valor de CT de un gen objetivo normalizado a un gen de control dentro de una muestra determinada. En algunos casos, ACT = CT (ARN viral objetivo) - CT (gen de control) dentro de una muestra determinada. En algunos casos, el valor de ACT de la muestra se compara con un valor de referencia que es el valor de ACT de la muestra de control. En algunos casos, el valor de ACT de la muestra se compara con un valor de referencia que es el valor de ACT de la muestra de control. En algunos casos, el valor de ACT de la muestra se compara con un valor de referencia que se conoce o se determina experimentalmente como el valor de ACT en o aproximadamente en o justo por encima de un nivel de umbral o un nivel mínimo detectable o una lectura correspondiente al mismo; el valor de referencia es un valor de ACT del parámetro detectado en, y/o un valor de un parámetro indicativo de una cantidad de ARN en, una muestra de control positivo; y/o el nivel del parámetro indica la presencia o ausencia del ARN viral en la muestra biológica; y/o el ARN viral incluye un ácido nucleico que codifica un primer gen viral; y/o el ácido nucleico heterólogo codifica un producto génico heterólogo

En algunos casos, el AACT = ACT (muestra) - ACT (muestra de control). En algunos casos, una muestra que es considerada por el ensayo que tiene un valor de ACT (muestra) que indica que la muestra tiene el mismo o más ARN viral objetivo que el ACT correspondiente (muestra de control) se considera positiva. En algunos casos, una muestra se considera positiva si el AACT indica que hay el mismo o más ARN viral objetivo en la muestra que en la muestra de control. En algunos casos, se prueban dos o más de una pluralidad de ARN virales usando los métodos descritos.

En algunos casos, si se observara que el valor de Ct en un pocillo (o la media de las réplicas), por ejemplo, para un objetivo dado, en el ensayo que contiene la muestra de prueba es mayor que el valor de Ct de la muestra de control positivo, entonces el ARN del gen objetivo en la muestra de prueba se consideraría o se indicaría que es inferior al valor de referencia y la muestra que comprende las células transducidas se identifica como "ARN de virus competente en la replicación no detectado". En algunos casos, se liberan células transducidas que se identifican como "ARN de virus competente en la replicación no detectado", como para su procesamiento adicional y/o uso en terapia.

En algunos aspectos, si el valor de Ct en un pocillo (o media de réplicas) del ensayo que contiene la muestra de prueba se observara como menor que el valor de Ct de la muestra de control positivo, entonces el ARN viral de tal muestra de prueba se considerará más alto que el valor de referencia y/o tal muestra de prueba se identificaría como "ARN de virus competente en la replicación detectado".

En algunos casos, no se puede calcular el valor de Ct en un pocillo (o la media de las réplicas) del ensayo que contiene la muestra de prueba. Esto puede producirse en algunos casos cuando la cantidad de amplificación objetivo o de control detectada en el pocillo no alcanza el nivel de umbral dentro de un número prescrito de ciclos. En algunos casos, dicho resultado indica que no hay ARN de un virus competente en la replicación en la muestra de prueba y/o que la cantidad de ARN de un virus competente en la replicación en la muestra de prueba es indetectable mediante el ensayo. En algunos casos, dicha muestra de prueba se identifica como 'ARN de virus competente en la replicación no detectado'. En algunos casos, se liberan las células transducidas que se ha confirmado que no contienen ARN del virus competente en la replicación mediante los métodos descritos, por ejemplo, para procesamiento adicional y/o uso en terapia.

En algunos casos, cuando se evalúan dos o más genes objetivo, ya sea en una reacción multiplex o en reacciones separadas, se detecta la presencia de ARN de un virus competente en la replicación cuando el ARN de uno de los genes objetivo es más alto que su valor de referencia. En algunos aspectos, cuando se evalúan dos o más genes objetivo, ya sea en una reacción multiplex o en reacciones separadas, se detecta la presencia de ARN de un virus competente en la replicación solo cuando el ARN de por lo menos dos y tantos como todos de los dos o más genes objetivo es mayor que cada uno de los valores de referencia respectivos. Por ejemplo, en algunos casos, se evalúan dos genes objetivo, por ejemplo, el primer y el segundo genes virales, y se detecta la presencia de ARN de un virus competente en la replicación si el ARN del primer y el segundo gen viral es mayor que el valor de referencia del primer y el segundo gen viral, respectivamente. En algunos de tales aspectos, el a Rn de un virus competente en la replicación no se detecta como presente cuando el ARN de solo uno del primer o el segundo gen viral es mayor que el primer o el segundo valor de referencia, respectivamente. En otros casos, cuando se evalúan dos o más genes objetivo, se consideraría o detectaría que el ^aRⁿde un virus competente en la replicación está presente incluso si el ARN de un solo gen objetivo (o menos de todos) es mayor que su valor de referencia correspondiente.

En algunos casos, cuando no se detecta ARN de un virus competente en la replicación en la muestra de prueba, se considera que las partículas de virus competente en la replicación no estaban o están presentes en las células o la muestra de la que se aisló el ARN.

4. Parámetros de ensayo

En algunos casos, el ensayo es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que incluye PCR con transcriptasa inversa (rt), PCR digital de gotitas, métodos de PCR cuantitativos y en tiempo real, un ensayo de transferencia Northern; un ensayo de transferencia Southern; un ensayo basado en matrices, que incluye matrices transferidas, micromatrices o matrices sintetizadas in situ; o ensayo basado en secuenciación. En algunos casos, el ensayo es un ensayo de secuenciación de próxima generación (NGS), por ejemplo, ARN-seq. En algunos casos, el ensayo es o incluye inmunocitoquímica o inmunohistoquímica, ELISA, transferencia Western, secuenciación de péptidos, espectrometría de masas (como MS/MS) opcionalmente con HPLC.

En casos particulares, el ensayo es un ensayo de RT-PCR y/o PCR en tiempo real. En algunos casos, la RT-PCR se realiza en una muestra, por ejemplo, una muestra de prueba, que es o contiene ARN, por ejemplo, ARN viral, o ADN, por ejemplo, ADNc derivado de ARN viral.

En casos particulares, el ARN se obtiene de una muestra. Se conocen técnicas y métodos adecuados para obtener y purificar ARN de una muestra. Por ejemplo, los reactivos y kits para aislar ARN de una muestra están disponibles comercialmente e incluyen, pero no se limitan a, kits RNeasy y RNeasy plus (Qiagen).

En algunos casos, el ADNc se obtiene o deriva del ARN. La síntesis de ADN a partir de una plantilla de ARN, a través de la transcripción inversa, produce ADN complementario (ADNc). Las transcriptasas inversas (RT) utilizan una plantilla de ARN y un cebador corto complementario al extremo 3' del ARN para dirigir la síntesis de la primera cadena de ADNc, que puede usarse directamente como plantilla para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta combinación de transcripción inversa y PCR (RT-PCR) permite la detección de ARN de baja abundancia en una muestra y la producción del ADNc correspondiente, facilitando de este modo la clonación de genes con pocas copias. En algunos casos, se conocen técnicas y métodos adecuados para generar ADNc a partir de ARN, como por transcripción inversa.

En algunos aspectos, la transcripción inversa se lleva a cabo mediante una reacción de transcriptasa inversa (RT), para generar ADNc, que en algunos aspectos se usa luego como plantilla para la amplificación por PCR, como el uso de cebadores diseñados para amplificar por lo menos una parte de uno o más ARN objetivo o de control o ADNc derivados de los mismos. En algunos aspectos, se lleva a cabo una RT-PCR cuantitativa de un solo paso. En algunos aspectos, la RT-PCR se lleva a cabo usando un enfoque de un solo paso con una mezcla de reacción que incluye transcriptasa inversa (RT) y una polimerasa, como TAQ polimerasa, y opcionalmente un inhibidor de ARNasa. En algunos aspectos, la mezcla es sistema de RT-PCR cuantitativa de un paso RNA UltraSense™, incluyendo la mezcla enzimática RNA UltraSense™ (que incluye SuperScript® III RT, ADN polimerasa Platinum® Taq e inhibidor de ribonucleasa RNaseOUT™) (ThermoFisher Scientific).

En algunos casos, la RT-PCR se realiza con uno o más pasos. En algunos casos, la RT-PCR incluye una desnaturalización inicial, ciclos de amplificación y/o un paso final de extensión. En ciertos casos, la RT-PCR se realiza para medir, detectar, evaluar y/o cuantificar genes objetivo y de control. En ciertos casos, la detección de los genes objetivo y de control se realiza con cualquier reactivo adecuado, incluyendo pero no limitados a, reactivos de kits disponibles en el mercado, como pero no limitados a, mezcla enzimática de RT-PCR cuantitativa de un paso RNA UltraSense y mezcla de reacción 5X de RT-PCR cuantitativa de un paso RNA UltraSense (ThermoFisher Scientific).

En algunos casos, la RT-PCR se realiza con una etapa de retención o un paso de retención inicial. En algunos casos, el paso de retención se realiza durante aproximadamente 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 12 minutos, 15 minutos, 20 minutos o más de 10 minutos; o entre aproximadamente 10 minutos y 20 minutos, inclusive. En casos particulares, el paso de retención inicial se realiza a aproximadamente 40° C, 45° C, 46° C, 47° C, 48° C, 49° C, 50° C, 51° C, 52° C, 53° C, 54° C o 55° C, o entre 40° C y 60° C; 35° C y 45° C, o 45° C y 60° C, inclusive. En ciertos casos, la RT-PCR se realiza con un paso o etapa de retención inicial a una temperatura de 50° C durante 15 minutos.

En algunos casos, la RT-PCR se realiza con un paso de desnaturalización inicial. En algunos casos, el paso de desnaturalización inicial se realiza durante aproximadamente 15 segundos, 30 segundos, 45 segundos, 60 segundos, 75 segundos, 90 segundos, 105 segundos, 120 segundos, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos o más de 10 minutos. En casos particulares, el paso de desnaturalización inicial se realiza a aproximadamente 85° C, 86° C, 87° C, 88° C, 89° C, 90° C, 91° C, 92° C, 93° C, 94° C, 95° C, 96° C, 97° C, 98° C, 99° C, o entre 85° C y 95° C; 90° C y 96° C, o 94° C y 99° C. En algunos casos, la RT-PCR se realiza con un paso de desnaturalización inicial a una temperatura de 95° C durante 2 minutos.

En algunos casos, el ensayo de RT-PCR incluye dos o más ciclos de amplificación. En algunos casos, el ensayo de RT-PCR incluye 2, 5, 10, 15, 20, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 o más de 45 ciclos. En algunos casos, el ensayo de RT-PCR incluye entre 35 y 40 ciclos de amplificación, inclusive. En ciertos casos, el ensayo RT-PCR incluye 40 ciclos.

En algunos casos, el ciclo de amplificación es un ciclo de amplificación de dos pasos. En algunos casos, el ciclo de amplificación de dos pasos incluye un primer paso y un segundo paso. En algunos casos, el primer paso se realiza a o a aproximadamente 85° C, 86° C, 87° C, 88° C, 89° C, 90° C, 91° C, 92° C, 93° C, 94° C, 95° C, 96° C, 97° C, 98° C, 99° C, o entre 85° C y 95° C; 90° C y 96° C, o 94° C y 99° C, inclusive. En algunos casos, el primer paso se realiza durante aproximadamente 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 20 segundos, 30 segundos, 45 segundos, 60 segundos, 75 segundos, 90 segundos, 105 segundos, 120 segundos o entre 5 segundos y 30 segundos, 15 segundos y 45 segundos, o 30 segundos y 120 segundos, inclusive. En algunos casos, el primer paso del ciclo de amplificación es a una temperatura de 95° C durante 15 segundos.

En ciertos casos, el segundo paso del ciclo de amplificación de dos pasos se realiza a aproximadamente 55° C, 56° C, 57° C, 58° C, 59° C, 60° C, 61° C, 62° C, 63° C, 64° C o 65° C, o entre 50° C y 70° C, 55° C y 65° C, o 57° C y 63° C, inclusive. En algunos casos, el segundo paso se realiza durante aproximadamente 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 20 segundos, 30 segundos, 45 segundos, 60 segundos, 75 segundos, 90 segundos, 105 segundos, 120 segundos o entre 5 segundos y 30 segundos, 15 segundos y 45 segundos, o 30 segundos y 120 segundos, inclusive. En algunos casos, el segundo paso del ciclo es a una temperatura de 60° C durante 60 segundos.

En algunos casos, la reacción de RT-PCR incluye un paso de extensión final. En algunos casos, el paso de extensión final se realiza entre 50° C y 75° C, entre 60° C y 70° C, entre 65° C y 70° C, inclusive. En algunos casos, el paso de extensión final se realiza durante o durante aproximadamente 60 segundos, 75 segundos, 90 segundos, 105 segundos, 120 segundos, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos o más de 10 minutos.

En algunos casos, el ciclo de amplificación contiene tres pasos. En algunos casos, el ciclo de amplificación contiene un paso de desnaturalización, un paso de apareamiento del cebador y un paso de extensión del cebador. En algunos casos, el paso de desnaturalización tiene entre 5 segundos y 30 segundos, 15 segundos y 45 segundos, o 30 segundos y 120 segundos, inclusive. En ciertos casos, el paso de desnaturalización se realiza a una temperatura de entre 80° C y 100° C. En casos particulares, el paso de apareamiento del cebador es de entre 5 segundos y 30 segundos, 15 segundos y 45 segundos, o 30 segundos y 120 segundos, inclusive. En algunos casos, el paso de apareamiento del cebador se realiza a una temperatura entre 40° C y 60° C. En ciertos casos, el paso de extensión del cebador es de entre 5 segundos y 30 segundos, 15 segundos y 45 segundos, o 30 segundos y 120 segundos, inclusive. En algunos casos, el paso de extensión del cebador es a una temperatura entre 60° C y 80° C.

En algunos casos, el ensayo de RT-PCR se realiza con un paso o etapa de retención inicial a una temperatura de 50° C durante 15 minutos, un paso de desnaturalización inicial a una temperatura de 95° C durante 2 minutos, 40 ciclos de amplificación por pasos que contienen un primer paso a una temperatura de 95° C durante 15 segundos y un segundo paso a una temperatura de 60° C durante 60 segundos.

En algunos casos, los métodos incluyen evaluar o confirmar la validez del ensayo, como un todo o en un caso particular, como el ensayo RT-PCR y/o PCR en tiempo real. En algunos casos, el ensayo se considera válido o confirmado si se cumplen uno o más de los criterios y/o intervalos del ensayo. En algunos aspectos, estos son específicos para una muestra de control u objetivo particular y/o una pareja particular de cebadores de oligonucleótidos.

Por ejemplo, en algunos casos, puede ser deseable que no se observe ningún valor de Ct en ningún pocillo del ensayo para un control, como una muestra de control sin plantilla (NTC), cuando se usa el conjunto de cebadores del gen de control, por ejemplo, actina. En algunos casos, es deseable que no se observe ningún valor de Ct en ningún pocillo del ensayo para la muestra de control sin plantilla (NTC) cuando se usa el conjunto de cebadores del gen objetivo, por ejemplo, el primer o el segundo gen viral.

En algunos casos, se desea que la pendiente para el gen de control, por ejemplo, actina, en las muestras estándar de plásmido esté entre un cierto intervalo, como entre aproximadamente -3,1 y aproximadamente -3,6. En algunos aspectos, se desea que la eficacia del gen de control en las muestras estándar de plásmido esté entre aproximadamente el 90 y el 110%. En algunos aspectos, los criterios de ensayo incluyen que el valor de R2 para el gen de control en las muestras estándar de plásmido sea aproximadamente o mayor que aproximadamente 0,90, como mayor de o de aproximadamente 0,95, 0,98 o 0,99. En algunos casos, los criterios de ensayo incluyen que el valor de R2 para el gen de control en las muestras estándar de plásmido sea de aproximadamente o mayor de aproximadamente 0,98.

En algunos casos, se desea que la pendiente para el gen objetivo, por ejemplo, el primer y/o segundo gen viral, en las muestras estándar de plásmido esté entre aproximadamente -3,1 y -3,6. En algunos casos, se desea que la eficiencia para el gen objetivo en las muestras estándar de plásmido esté entre aproximadamente el 90 y el 110%. En algunos aspectos, los criterios de ensayo incluyen que el valor de R2 para el gen objetivo en las muestras estándar de plasma sea de aproximadamente o mayor de aproximadamente 0,90, como mayor de o aproximadamente 0,95, 0,98 o 0,99. En algunos casos, los criterios de ensayo incluyen que el valor de R2 para el gen objetivo en las muestras estándar de plasma es de aproximadamente o es mayor de o aproximadamente 0,98.

En algunos casos, se desea que el valor de Ct para el gen de control, por ejemplo, actina, conjunto de cebadores para la muestra de control negativa no transducida, sea menor de o menor de aproximadamente 22. En algunos casos, los criterios del ensayo incluyen que no hay valor de Ct en cada pocillo del control negativo no transducido usando el conjunto de cebadores del gen objetivo. En algunos casos, se desea que el valor A260/280 para la muestra de control negativo no transducida esté por encima o por encima de aproximadamente 2.000. En algunos aspectos, se desea que el valor A260/280 para la muestra de control negativo no transducida esté entre aproximadamente 2,000 y 2,100.

En algunos casos, se desea que el valor de Ct para el gen de control, por ejemplo, actina, conjunto de cebadores sea menor o menor de aproximadamente 15. En algunos aspectos, los criterios de ensayo incluyen que la desviación estándar de los valores de Ct para las réplicas del gen de control en la muestra de prueba sea menor o menor de aproximadamente 1, como menor o menor de aproximadamente 0,75, 0,5 o 0,25. En algunos casos, se desea que la desviación estándar de los valores de Ct para las réplicas del gen de control en la muestra de prueba sea menor o menor de aproximadamente 0,5. En algunos casos, se desea que el valor A260/280 para la muestra de prueba esté por encima o por encima de aproximadamente 2,000. En algunos aspectos, se desea que el valor A260/280 para la muestra de prueba esté entre aproximadamente 2,000 y 2,100. En algunos casos, el valor de Ct para el gen de control en la muestra de control de transcriptasa no inversa (-RT) sea de aproximadamente o por lo menos aproximadamente 13,2 más alta que el valor de Ct para el gen de control en la muestra de prueba.

III. COMPOSICIONES, COMBINACIONES, KITS Y ARTICULOS DE FABRICACIÓN

En algunos aspectos se describen composiciones, combinaciones y/o kits para detectar virus competentes en la replicación en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, que comprende células transducidas. En algunos casos, las composiciones, combinaciones y/o kits comprenden reactivos para evaluar un parámetro, por ejemplo, niveles de ARN génico en células, como células transducidas. En algunos casos, los reactivos incluyen reactivos para aislamiento de ARN, RT-PCR, qPCR y/o RT-qPCR. En algunos aspectos, las composiciones, combinaciones y/o kits comprenden uno o más cebadores de oligonucleótidos, una o más parejas de cebadores de oligonucleótidos y/o una o más sondas de hidrólisis.

En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una secuencia del gen objetivo. En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una secuencia del gen de control. En algunos aspectos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos comprenden un cebador directo y un cebador inverso. Por tanto, en algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos comprenden una pareja de cebadores. En algunos casos, la pareja de cebadores contiene un cebador directo y uno inverso, cada uno específico para una secuencia del gen objetivo o del gen de control. En algunos aspectos, los cebadores directo e inverso son específicos para diferentes secuencias del mismo gen objetivo o gen de control.

En algunos casos, la composición, combinación y/o kit comprende una o más sondas de hidrólisis. En algunos casos, la sonda de hidrólisis comprende una fracción o marcador fluorescente. Las fracciones y marcadores fluorescentes ejemplares se han analizado con anterioridad.

En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una secuencia del gen objetivo. En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una secuencia del gen de control. En algunos aspectos, la sonda de hidrólisis es específica para una secuencia del mismo gen objetivo o gen de control que uno o más de los cebadores de oligonucleótidos. Por tanto, en algunos casos, se usa una sonda de hidrólisis específica para una secuencia de un gen objetivo o gen de control con un cebador directo y un cebador inverso, por ejemplo, una pareja de cebadores, específicos para el mismo gen objetivo o gen de control, respectivamente.

En algunos casos, las composiciones, combinaciones y/o kits descritos son útiles para detectar retrovirus competentes en la replicación, como un gammaretrovirus competente en la replicación (RCR) o un lentivirus competente en la replicación (RCL), en una muestra, por ejemplo, una muestra de prueba o muestra biológica. En casos particulares, las composiciones, combinaciones y/o kits descritos son útiles para detectar retrovirus competentes en replicación que se originan y/o se generaron a partir del vector viral usado para transducir células de la muestra biológica. En ciertos casos, las composiciones, combinaciones y/o kits descritos son útiles para detectar genes virales y/o secuencias de polinucleótidos virales que se requieren para la competencia en la replicación en el vector viral que se usó para transducir las células en la muestra. En ciertos casos, las composiciones, combinaciones y/o kits descritos incluyen cebadores y sondas de oligonucleótidos, por ejemplo, sondas de hidrólisis, que son específicos para el uno o más genes objetivo.

En algunos casos, las composiciones, combinaciones y/o kits descritos son útiles para detectar una (RCR) competente en la replicación en una muestra, por ejemplo, una muestra de prueba o una muestra biológica. En casos particulares, las composiciones, combinaciones y/o kits descritos son útiles para detectar retrovirus competentes en la replicación que se originan y/o se generaron a partir del vector gammaretroviral usado para transducir células de la muestra biológica. En ciertos casos, las composiciones, combinaciones y/o kits descritos son útiles para detectar genes virales y/o secuencias de polinucleótidos virales que se requieren para la competencia en la replicación en el vector gammaretroviral que se usó para transducir las células en la muestra. En algunos aspectos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen objetivo, por ejemplo, primer o segundo gen viral, son específicos para, por ejemplo unirse a, una secuencia de un gen viral env, gag, pol o rev. En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen objetivo, por ejemplo, el primer o segundo gen viral, son específicos para, por ejemplo unirse a, una secuencia de un gen env, gag, pol o rev gammaretroviral y/o son específicos para un gen env, gag, pol o rev que se usa para generar el vector gammaretroviral, por ejemplo, un vector gammaretroviral deficiente en la replicación usado para la administración de genes. En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una secuencia de env de GaLV, VSVG o gag de MMLV. En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una secuencia o parte de una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 25, 26 o 27, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia o parte de tal secuencia. En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos comprenden una o más secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 4-5, 16-17, 19-20 o 22-23.

En algunos casos, la sonda de hidrólisis específica para el gen objetivo, por ejemplo, el primer o segundo gen viral, es específica para, por ejemplo se une a, una secuencia de un gen env, gag, pol o rev viral. En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una secuencia de env de GaLV, env de VSVG o gag de MMLV. En algunos casos, la sonda de hidrólisis contiene la secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 6, 18, 21 o 24.

En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del gen objetivo son específicos para una secuencia de un gen env de GaLV, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 25, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos de estos aspectos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos comprenden la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4 o 5. En algunos casos, el cebador directo comprende la secuencia expuesta en la SEQ I^dNO: 4, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos aspectos, el cebador inverso comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. Por tanto, en algunos aspectos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5.

En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una secuencia de un gen gag de MMLV, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 27, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos de tales aspectos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos comprenden una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 16-17, 19-20 o 22-23. En algunos casos, el cebador directo comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 16, 19 o 22, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos aspectos, el cebador inverso comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 17, 20 o 23, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos casos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 16 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 17. En algunos casos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 19 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 20. En algunos casos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 22 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 23

En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una secuencia o parte de una secuencia de un gen gag de MMLV, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 27, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha parte de una secuencia. En algunos de tales aspectos, la sonda de hidrólisis contiene una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 18, 21 o 24.

En algunos casos, las composiciones, combinaciones y/o kits descritos son útiles para detectar RCL en una muestra, por ejemplo, una muestra de prueba o una muestra biológica. En casos particulares, las composiciones, combinaciones y/o kits descritos son útiles para detectar retrovirus competentes en la replicación que se originan y/o se generaron a partir del vector gammaretroviral usado para transducir células de la muestra biológica. En ciertos casos, las composiciones, combinaciones y/o kits descritos son útiles para detectar genes virales y/o secuencias de polinucleótidos virales que se requieren para la competencia de replicación en el vector gammaretroviral que se usó para transducir las células en la muestra. En algunos aspectos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen objetivo, por ejemplo, el primer o el segundo gen viral, son específicos para, por ejemplo unirse a, una secuencia de un gen env, gag, pol o rev viral. En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen objetivo, por ejemplo, el primer o segundo gen viral, son específicos para, por ejemplo unirse a, una secuencia de un gen env, gag, pol o rev gammaretroviral y/o son específicos para un gen env, gag, pol o rev que se usa para generar el vector gammaretroviral, por ejemplo, un vector gammaretroviral deficiente en la replicación usado para la administración de genes.

En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una secuencia de un gen env de VSV-G, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 26, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia.

En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una secuencia o parte de una secuencia de un gen env de VSVG, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 26, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha parte de una secuencia.

En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una parte de una secuencia del gen rev, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 33, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos de tales aspectos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos comprenden una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 38-39. En algunos casos, el cebador directo comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 38, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos aspectos, el cebador inverso comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 39, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos casos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 39 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 39.

En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una parte de una secuencia de un gen rev, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 33, o una secuencia que tiene por lo menos un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos de estos aspectos, la sonda de hidrólisis contiene una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 37.

En algunos aspectos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen de control, por ejemplo, actina, se unen a una secuencia del gen de control. En algunos casos, cuando el gen de control es actina, los cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del gen de control son específicos para, por ejemplo unirse a, una secuencia de actina. En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del gen de control son específicos para una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 28. En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para actina comprenden uno o más secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 1-2, 8, 10-11 o 13-14.

En algunos casos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos son específicos para una secuencia de un gen de actina, como una parte de una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 28, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha parte de una secuencia. En algunos de tales aspectos, el uno o más cebadores de oligonucleótidos comprenden una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1-2, 8, 10-11 o 13-14. En algunos casos, el cebador directo comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1, 10 o 13, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos aspectos, el cebador inverso comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, 8, 11 o 14, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha secuencia. En algunos casos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2. En algunos casos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8. En algunos casos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 10 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 11. En algunos casos, el cebador directo contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 13 y el cebador inverso contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 14.

En algunos casos, la sonda de hidrólisis es específica para una secuencia o parte de una secuencia del gen de control, por ejemplo, actina, como una parte de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 27, o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dicha parte de una secuencia. Por tanto, en algunos aspectos, la sonda de hidrólisis específica para una secuencia del gen de control es específica para, por ejemplo se une a, actina. En algunos casos, la sonda de hidrólisis contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3, 9, 12 o 15.

En casos particulares, un kit descrito en la presente es útil para la detección de un RCR en una muestra. En casos particulares, el kit incluye cebadores y sondas de oligonucleótidos específicas para genes objetivo que son genes gammaretrovirales y/o son genes que se usaron para generar un vector gammaretroviral, como un vector gammaretroviral deficiente en la replicación usado para la administración de genes. En casos particulares, el kit incluye cebadores y sondas de oligonucleótidos que son específicos para un gen de control. En algunos casos, el gen de control es actina. En casos particulares, el gen objetivo es env de GaLV. En ciertos casos, el gen objetivo es gag de MMLV. En algunos casos, los genes objetivo son env de GaLV y gag de MMLV.

En ciertos casos, un kit descrito en la presente es útil para la detección de un RCL en una muestra. En casos particulares, el kit incluye cebadores y sondas de oligonucleótidos específicos para genes objetivo que son genes lentivirales y/o son genes que se usaron para generar un vector lentiviral, como un vector lentiviral deficiente en la replicación usado para la administración de genes. En casos particulares, el kit incluye cebadores y sondas de oligonucleótidos que son específicos para un gen de control. En algunos casos, el gen de control es actina. En casos particulares, el gen objetivo es rev, por ejemplo, rev de HIV. En ciertos casos, el gen objetivo es VSV-G. En algunos casos, los genes objetivo son rev y VSV-G.

IV. PARTÍCULAS DE VECTORES VIRALES Y MOLÉCULAS HETERÓLOGAS Y/O

RECOMBINANTES CODIFICADAS

En algunos aspectos, los métodos descritos implican detectar un parámetro que está asociado y/o correlacionado con el a Rn de retrovirus competentes en la replicación. En algunas realizaciones, el parámetro se mide en una muestra de prueba que contiene ARN o ADNc de una célula transducida con una partícula de vector viral que codifica una molécula recombinante y/o heteróloga. Así, en algunos casos, la partícula del vector viral se ha usado o puede usarse para transducir las células que posteriormente se evalúan mediante los métodos descritos.

En algunos casos, la partícula del vector viral, como la partícula del vector lentiviral o gammaretroviral, contiene un ácido nucleico que codifica una molécula recombinante y/o heteróloga (por ejemplo, un producto génico), por ejemplo, una proteína recombinante o heteróloga, como un receptor recombinante y/o heterólogo, como un receptor de antígeno quimérico (CAR) u otro receptor de antígeno, en un genoma del vector viral. Tales moléculas recombinantes y/o heterólogas pueden incluir proteínas solubles, por ejemplo, proteínas secretadas y/o proteínas de la superficie celular. En algunos casos, la molécula es o incluye un receptor recombinante. Tales receptores recombinantes pueden incluir receptores de antígenos, como receptores de antígenos no TCR funcionales, incluyendo receptores de antígenos quiméricos (CAR) y otros receptores de unión a antígenos como receptores de células T transgénicas (TCR). Los receptores también pueden incluir otros receptores, como otros receptores quiméricos, como receptores que se unen a ligandos particulares y que tienen dominios de señalización transmembrana y/o intracelulares similares a los presentes en un CAR.

En algunos casos, el genoma de la partícula del vector viral puede incluir secuencias además del ácido nucleico que codifica la molécula recombinante y/o heteróloga. Tales secuencias pueden incluir secuencias que permiten empaquetar el genoma en la partícula de virus y/o secuencias que promueven la expresión de un ácido nucleico que codifica una molécula recombinante y/o heteróloga, por ejemplo, un receptor recombinante, como un CAR.

En algunos casos, el ácido nucleico codifica un receptor recombinante y/o un receptor quimérico, como una proteína receptora heteróloga. El receptor recombinante, como el receptor heterólogo, puede incluir receptores de antígenos, como receptores de antígenos no TCR funcionales, incluyendo los receptores de antígenos quiméricos (CAR) y otros receptores de unión a antígenos, como los receptores de células T transgénicas (TCR). Los receptores también pueden incluir otros receptores, como otros receptores quiméricos, como receptores que se unen a ligandos particulares y que tienen dominios de señalización transmembrana y/o intracelulares similares a los presentes en un CAR.

En algunos casos, la molécula recombinante y/o heteróloga, por ejemplo, el producto génico, es una molécula soluble, como una molécula inmunomoduladora y/o inmunoestimuladora, como una citoquina, por ejemplo, IL-2, IL-12, IL-6., 41BBL, CD40L, y/o ligando o receptor soluble como un ligando soluble para una molécula coestimuladora de células inmunitarias, por ejemplo, CD40L, 41BBL, o una molécula de unión a antígeno soluble como un scFv. También entre las moléculas están los marcadores de expresión o transducción y cualquier otra molécula conocida para su uso en vectores y/o casetes de expresión.

En algunos casos, el receptor de antígeno recombinante, por ejemplo, CAR, se une específicamente a uno o más ligandos en una célula o enfermedad, como cáncer, enfermedad infecciosa, enfermedad inflamatoria o autoinmune u otra enfermedad o afección, incluyendo las descritas en la presente. Los antígenos ejemplares incluyen integrina avp6 (integrina avb6), antígeno de maduración de células B (BCMA), B7-H6, anhidrasa carbónica 9 (CA9, también conocida como CAIX o G250), un antígeno de cáncer de testículo, antígeno de cáncer/testículo 1B (CTAG, también conocido como NY-ESO-1 y LAGE-2), antígeno carcinoembrionario (CEA), una ciclina, ciclina A2, Ligando de quimiocina 1 motivo C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, Cd44v7/8, CD123, CD138, CD171, proteína del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proteína del factor de crecimiento epidérmico truncado (tEGFR), mutación del receptor del factor de crecimiento epidérmico tipo III (EGFR vlII), glicoproteína epitelial 2 (EpG-2), glicoproteína epitelial 4o (EPG-40), efrina B2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrógeno, receptor de Fc tipo 5 (FCRL5; también conocido como homólogo del receptor de Fc 5 o FCRH5), acetilcolina fetal (AchR fetal), una proteína de unión a folato (FBP), receptor de folato alfa, receptor de acetilcolina fetal, gangliósido Gd2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliósido Gd3, glicoproteína 100 (gp100), Her2/neu (receptor de tirosina quinasa erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno asociado a melanoma humano de alto peso molecular humano (HMW-MAA), antígeno de superficie de la hepatitis B, antígeno leucocitario humano A1 (HLA-AI), antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Ra), receptor alfa de IL-132 (IL-13Ra2), receptor de dominio de inserción de quinasa (kdr), cadena ligera kappa, molécula de adhesión celular L1 (L1CAM), epítopo CE7 de LI-CAM, repetición rica en leucina que contiene 8 miembros de la familia A (LRRC8A), Lewis Y, antígeno asociado a melanoma (MAGE)-Al, mAg E-A3, MAGE-A6, mesotelina, c-Met, citomegalovirus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligandos del miembro D del grupo 2 de asesinas naturales (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adhesión celular neural (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno de melanoma expresado preferentemente (PRAME), receptor de progesterona, un antígeno prostético específico, antígeno de células madre prostéticas (PSCA), antígeno prostético específico de membrana (PSMA), receptor huérfano similar a tirosina quinasa receptora 1 (ROR1), survivina, glicoproteína trofobléstica (TPBG también conocida como 5T4), glicoproteína 72 asociada a tumores (TAG72), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2 (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), un antígeno específico de un patógeno o un antígeno asociado con un marcador universal y/o moléculas biotiniladas y/o moléculas expresadas por el VIH, el VHC, el VHB u otros patógenos.

Los antígenos dirigidos por los receptores en algunos casos incluyen antígenos asociados con una enfermedad maligna de células B, como cualquiera de varios marcadores de células B conocidos. En algunos casos, el antígeno al que se dirige el receptor es Cd2o, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b o CD30.

En algunos casos, el antígeno es un antígeno específico de un patógeno. En algunos casos, el antígeno es un antígeno viral (como un antígeno viral del VIH, VHC, v Hb , etc.), antígenos bacterianos y/o antígenos parasitarios.

Los receptores de antígenos, incluyendo los CAR y los TCR recombinantes, y la producción e introducción de los mismos, en algunos casos incluyen los descritos, por ejemplo, en los números de publicación de solicitudes de patentes internacionales WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, Publicaciones de solicitudes de patentes de Estados Unidos números US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patentes de Estados Unidos N°: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592,, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7.446.191, 8,324,353, y 8,479,118, y solicitud de patente europea número EP2537416, y/o los descritos por Sadelain et al., Cancer Discov. abril 2013; 3(4): 388-398; Dévila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., octubre 2012; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, marzo 201218 (2): 160-75.

En algunos casos, la molécula o moléculas recombinantes o heterólogas codificadas por el écido nucleico dentro de la partícula del vector viral es o incluye una molécula de écido nucleico, como un ARN, ADN o una secuencia de ácidos nucleicos artificial, como una diseñada para la interferencia con expresión o actividad de un ARNm objetivo, como un ARN de interferencia corto (ARNip), ARN de horquilla corta (ARNhc) o micro-ARN (miARN). Tales moléculas pueden incluir aquellas diseñadas para interferir con la expresión o actividad de moléculas asociadas con, promover o inhibir la actividad de células inmunitarias como inmunomoduladores, moléculas inmunoinhibidoras y moléculas de punto de control inmunitario. En algunos casos, una secuencia de nucleótidos de ARNip o ARNmi (por ejemplo, de 21 a 25 nucleótidos de longitud) puede producirse, por ejemplo, a partir de un vector de expresión mediante la transcripción de una secuencia de ARN de horquilla corta (ARNhc), una secuencia precursora més larga (por ejemplo, 60-80 nucleótidos), que posteriormente es procesada por la maquinaria de ARNi celular para producir una secuencia de ARNip o ARNmi. Alternativamente, una secuencia de ARNip o ARNmi de nucleótidos (por ejemplo, de 21 a 25 nucleótidos de longitud) puede, por ejemplo, sintetizarse químicamente. La síntesis química de secuencias de ARNip o ARNmi esté disponible comercialmente de corporaciones como Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO), Qiagen (Valencia, CA) y Ambion (Austin, TX). El ARN puede tener una longitud de 10 a 30 nucleótidos, como 19-25 o 21-25 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, una secuencia de ARNip generalmente se une a una secuencia única dentro de un ARNm objetivo con complementariedad exacta y da como resultado la degradación de la molécula de ARNm objetivo. Una secuencia de ARNip puede unirse a cualquier lugar dentro de la molécula de ARNm; las secuencias dirigidas por el ARNip incluyen genes que expresan un polipéptido de interés, o un modulador en sentido ascendente o en sentido descendente de tal gen, por ejemplo un modulador en sentido ascendente o en sentido descendente de un gen, como un factor de transcripción que se une a un promotor génico, una quinasa o fosfatasa que interactúa con un polipéptido de interés y polipéptidos implicados en vías reguladoras capaces de influir en el polipéptido de interés. Una secuencia de ARNmi generalmente se une a una secuencia única dentro de un ARNm objetivo con una complementariedad exacta o menos que exacta y da como resultado la represión traslacional de la molécula de ARNm objetivo. Una secuencia de ARNmi puede unirse a cualquier lugar dentro de la secuencia de ARNm, pero generalmente se une dentro de la región 3' no traducida de la molécula de ARNm.

A. Receptores de antígenos quiméricos

En algunos casos, la molécula recombinante y/o heteróloga es o incluye un receptor de antígeno quimérico (CAR). El CAR es generalmente un receptor manipulado genéticamente con un dominio de unión a ligando extracelular enlazado a uno o més componentes de señalización intracelular. Tales moléculas típicamente imitan o se aproximan a una señal a través de un receptor de antígeno natural y/o una señal a través de dicho receptor en combinación con un receptor coestimulador.

En algunos casos, los CAR se construyen con especificidad para un marcador particular, como un marcador expresado en un tipo de célula particular para ser el objetivo de una terapia adoptiva, por ejemplo, un marcador de cáncer y/o cualquiera de los antígenos descritos. Por tanto, el CAR típicamente incluye uno o más fragmentos, dominios o partes de un anticuerpo de unión a antígenos, o uno o más dominios variables de anticuerpos y/o moléculas de anticuerpos. En algunos casos, el CAR incluye una parte o partes de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo, como una cadena pesada variable (VH) o una porción de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) derivado de cadenas pesadas variables (VH) y ligeras variables (VL) de un anticuerpo monoclonal (mAb).

En algunos casos, la parte extracelular del CAR, como una parte de anticuerpo del mismo, incluye además un espaciador, como una región espaciadora entre el componente de reconocimiento de antígeno, por ejemplo, scFv, y un dominio transmembrana. El espaciador puede ser o incluir por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina o una variante o versión modificada de la misma, como una región bisagra, por ejemplo, una región bisagra de IgG4 y/o una región CH1/CL y/o Fc. En algunos casos, la parte o región constante es una IgG humana, como IgG4 o IgG1. El espaciador puede tener una longitud que proporcione una capacidad de respuesta aumentada de la célula después de la unión al antígeno, en comparación con la ausencia del espaciador. En algunos ejemplos, el espaciador tiene una longitud de o de aproximadamente 12 aminoácidos o no tiene más de 12 aminoácidos de longitud. Los espaciadores ejemplares incluyen aquellos que tienen por lo menos aproximadamente de 10 a 229 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 200 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 175 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 150 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 125 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 100 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 75 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 50 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 40 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 30 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 20 aminoácidos, o de aproximadamente 10 a 15 aminoácidos, e incluyendo cualquier número entero entre los puntos finales de cualquiera de los intervalos enumerados. En algunos casos, una región espaciadora tiene aproximadamente 12 aminoácidos o menos, aproximadamente 119 aminoácidos o menos, o aproximadamente 229 aminoácidos o menos. Los espaciadores ejemplares incluyen la bisagra de IgG4 sola, la bisagra de IgG4 enlazada a los dominios CH2 y CH3, o la bisagra de IgG4 enlazada al dominio CH3. Los espaciadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153 o número de publicación de solicitud de patente internacional WO2014031687.

El dominio de unión al ligando extracelular, como el dominio de reconocimiento de antígeno, generalmente está enlazado con uno o más componentes de señalización intracelular, como componentes de señalización que imitan la activación a través de un complejo receptor de antígeno, como un complejo TCR, en el caso de un ^cA^r, y/o señal a través de otro receptor de superficie celular. En algunos casos, un dominio transmembrana enlaza los dominios de señalización intracelular y de unión al ligando extracelular. En algunos casos, el CAR incluye un dominio transmembrana fusionado con el dominio extracelular. En un caso, se usa un dominio transmembrana que está asociado de manera natural con uno de los dominios en el receptor, por ejemplo, CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana

El componente de unión o reconocimiento específico de antígeno generalmente está enlazado a uno o más dominios de señalización transmembrana e intracelulares. En algunos casos, el CAR incluye un dominio transmembrana fusionado con el dominio extracelular. En un caso, se usa un dominio transmembrana que está asociado de manera natural con uno de los dominios en el receptor, por ejemplo, CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana se selecciona o modifica por sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembrana de las mismas proteínas de membrana superficial o unas diferentes para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.

El dominio transmembrana en algunos casos se deriva o de una fuente natural o de una sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio en algunos aspectos se deriva de cualquier proteína transmembrana o unida a la membrana. Las regiones transmembrana incluyen aquellas derivadas de (es decir, comprenden por lo menos la región o regiones transmembrana de la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. El dominio transmembrana en algunos casos es sintético. En algunos aspectos, el dominio transmembrana sintético comprende residuos predominantemente hidrófobos como leucina y valina. En algunos aspectos, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana sintético. En algunos casos, el enlace es por conectores, espaciadores, y/o dominio o dominios transmembrana.

En algunos casos, hay un conector oligopeptídico o polipeptídico corto, por ejemplo, un conector de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, como uno que contiene glicinas y serinas, por ejemplo, el doblete de glicina-serina, y forma un enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplasmática del CAR.

El receptor, por ejemplo, el CAR, incluye generalmente por lo menos un componente o componentes de señalización intracelular. En algunos casos, el receptor incluye un componente intracelular de un complejo TCR, como una cadena TCR CD3 que media en la activación y la citotoxicidad de las células T, por ejemplo, la cadena zeta CD3. Por tanto, en algunos aspectos, la parte de unión a antígeno está enlazada a uno o más módulos de señalización celular. En algunos casos, los módulos de señalización celular incluyen el dominio transmembrana de CD3, los dominios de señalización intracelular de CD3 y/u otros dominios transmembrana de CD. En algunos casos, el receptor, por ejemplo, CAR, incluye además una parte de una o más moléculas adicionales, como el receptor Fc Y, CD8, CD4, ^cD25 o CD16. Por ejemplo, en algunos aspectos, el CAR u otro receptor quimérico incluye una molécula quimérica entre CD3-zeta (CD3-Z) o receptor Fc y y CD8, CD4, CD25 o CD16.

En algunos casos, tras la ligación del CAR u otro receptor quimérico, el dominio citoplásmico o el dominio de señalización intracelular del receptor activa por lo menos una de las funciones o respuestas efectoras normales de la célula, por ejemplo, célula inmunitaria, por ejemplo, célula T, manipulada para expresar el CAR. Por ejemplo, en algunos contextos, el CAR induce una función de una célula T, como la actividad citolítica o la actividad T-auxiliar, como la secreción de citoquinas u otros factores. En algunos casos, se usa una parte truncada de un dominio de señalización intracelular de un componente del receptor de antígeno o molécula coestimuladora en lugar de una cadena inmunoestimuladora intacta, por ejemplo, si transduce la señal de función efectora. En algunos casos, el dominio o dominios de señalización intracelular incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de células T (TCR), y en algunos aspectos también las de coreceptores que en el contexto natural actúan en conjunto con tales receptores para iniciar la transducción de señales después del acoplamiento antígeno receptor, y/o cualquier derivado o variante de tales moléculas, y/o cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional.

En el contexto de un TCR natural, la activación completa generalmente requiere no solo la señalización a través del TCR, sino también una señal coestimuladora. Por tanto, en algunos casos, para promover la activación completa, también se incluye en el CAR un componente para generar una señal secundaria o coestimuladora. En otros casos, el CAR no incluye un componente para generar una señal coestimuladora. En algunos aspectos, se expresa un CAR adicional en la misma célula y proporciona el componente para generar la señal secundaria o coestimuladora.

En algunos aspectos, la activación de las células T se describe como mediada por dos clases de secuencias de señalización citoplasmática: las que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través de TCR (secuencias de señalización citoplasmática primaria) y las que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una activación señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplasmáticas secundarias). En algunos aspectos, el CAR incluye uno o ambos componentes de señalización.

En algunos aspectos, el CAR incluye una secuencia de señalización citoplasmática primaria que regula la activación primaria del complejo TCR. Las secuencias de señalización citoplasmáticas primarias que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptores o ITAM. Los ejemplos de secuencias de señalización citoplasmáticas primarias que contienen ITAM incluyen las derivadas de TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CDS, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En algunos casos, la molécula o moléculas de señalización citoplasmática en el CAR contienen un dominio de señalización citoplasmática, una parte del mismo o una secuencia derivada de CD3 zeta.

En algunos casos, el CAR incluye un dominio de señalización y/o una parte transmembrana de un receptor coestimulador, como CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 e ICOS. En algunos aspectos, el mismo CAR incluye tanto el componente activador como el coestimulador.

En algunos casos, el dominio activador se incluye dentro de un CAR, mientras que el componente coestimulador lo proporciona otro CAR que reconoce otro antígeno. En algunos casos, los CAR incluyen CAR activadores o estimuladores y CAR coestimuladores, ambos expresados en la misma célula (ver WO2014/055668). En algunos aspectos, el CAR es el CAR estimulador o activador; en otros aspectos, es el CAR coestimulador. En algunos casos, las células incluyen además CAR inhibidores (iCAR, ver Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (diciembre de 2013), como un CAR que reconoce un antígeno diferente, por lo que se disminuye o inhibe una señal de activación se administra a través de un CAR que reconoce un primer antígeno por la unión del CAR inhibidor a su ligando, por ejemplo, para reducir los efectos fuera del objetivo.

En ciertos casos, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio transmembrana y de señalización de CD28 enlazado a un dominio intracelular de CD3. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende dominios coestimuladores de CD28 y CD137 quiméricos, enlazados a un dominio intracelular de CD3.

En algunos casos, un CAR también puede incluir un marcador de transducción (por ejemplo, tEGFR). En algunos casos, el dominio de señalización intracelular de las células T citotóxicas CD8+ es el mismo que el dominio de señalización intracelular de las células T auxiliares CD4+. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular de las células T citotóxicas CD8+ es diferente del dominio de señalización intracelular de las células T auxiliares CD4+.

En algunos casos, CAR abarca uno o más, por ejemplo, dos o más, dominios coestimuladores y un dominio de activación, por ejemplo, dominio de activación primario, en la parte citoplásmica. Los CAR ejemplares incluyen componentes intracelulares de CD3-zeta, CD28 y 4-1BB.

En algunos casos, la molécula recombinante y/o heteróloga codificada por el ácido nucleico o los ácidos nucleicos dentro de la partícula del vector viral incluye además uno o más marcadores, por ejemplo, con el propósito de confirmar la transducción o manipulación de la célula para expresar el receptor y/o la selección y/o el direccionamiento de células que expresan la molécula o moléculas codificadas por el ácido nucleico. En algunos aspectos, dicho marcador puede estar codificado por un ácido nucleico o polinucleótido diferente, que también puede introducirse durante el proceso de ingeniería genética, típicamente mediante el mismo método, por ejemplo, transducción por el mismo vector o tipo de vector.

En algunos aspectos, el marcador, por ejemplo, el marcador de transducción, es una proteína y/o es una molécula de superficie celular. Los marcadores ejemplares son variantes truncadas de marcadores endógenos de origen natural, por ejemplo, como moléculas de superficie celular de origen natural. En algunos aspectos, las variantes tienen inmunogenicidad reducida, función de tráfico reducida y/o función de señalización reducida en comparación con la molécula de superficie celular natural o endógena. En algunos casos, el marcador es una versión truncada de un receptor de superficie celular, como EGFR truncado (tEGFR). En algunos aspectos, el marcador incluye todo o parte (por ejemplo, forma truncada) de CD34, un NGFR o receptor del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, tEGFR). En algunos casos, el ácido nucleico que codifica el marcador está enlazado operativamente con un polinucleótido que codifica una secuencia conectora, como una secuencia conectora escindible, por ejemplo, T2A. Ver la WO2014031687. En algunos casos, el marcador es una molécula, por ejemplo, una proteína de superficie celular, que no se encuentra de manera natural en las células T o que no se encuentra de manera natural en la superficie de las células T, o una parte de las mismas.

En algunos casos, el marcador es una molécula no propia, por ejemplo, una proteína no propia, es decir, una que no es reconocida como "propia" por el sistema inmunitario del huésped al que se transferirán adoptivamente las células.

En algunos casos, el marcador no cumple ninguna función terapéutica y/o no produce ningún otro efecto que no sea el de ser usado como marcador para la ingeniería genética, por ejemplo, para seleccionar células manipuladas con éxito. En otros casos, el marcador puede ser una molécula terapéutica o una molécula que ejerza de otro modo algún efecto deseado, como un ligando para que una célula se encuentre in vivo, como una molécula coestimuladora o de punto de control inmunitario para mejorar y/o amortiguar las respuestas de las células tras la transferencia adoptiva y el encuentro con el ligando.

En algunos casos, a los CAR se hace referencia como CAR de primera, segunda y/o tercera generación. En algunos aspectos, un CAR de primera generación es aquel que únicamente proporciona una señal inducida por la cadena de CD3 tras la unión al antígeno; en algunos aspectos, un CAR de segunda generación es aquel que proporciona dicha señal y una señal coestimuladora, como una que incluye un dominio de señalización intracelular de un receptor coestimulador como CD28 o CD137; en algunos aspectos, un CAR de tercera generación en algunos aspectos es uno que incluye múltiples dominios coestimuladores de diferentes receptores coestimuladores.

En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico incluye una parte de unión a ligando extracelular, como una parte de unión a antígeno, como un anticuerpo o fragmento del mismo y en un dominio intracelular. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento incluye un scFv o un anticuerpo de Vh de dominio único y el dominio intracelular contiene un ITA^m. En algunos aspectos, el dominio de señalización intracelular incluye un dominio de señalización de una cadena zeta de una cadena CD3-zeta (CD3Z). En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico incluye un dominio transmembrana que enlaza el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular. El dominio extracelular y el transmembrana pueden enlazarse directa o indirectamente. En algunos casos, el dominio extracelular y la transmembrana están enlazados por un espaciador, como cualquiera de los descritos en la presente. En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico contiene un dominio intracelular de una molécula coestimuladora de células T, como entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular. En algunos aspectos, la molécula coestimuladora de células T es CD28 o 41BB.

En algunos casos, el dominio transmembrana del receptor, por ejemplo, CAR, es un dominio transmembrana de CD28 humana o una variante del mismo, por ejemplo, un dominio transmembrana de 27 aminoácidos de una CD28 human (N° de registro: P10747.1). En algunos casos, el dominio intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador intracelular de CD28 humana o una variante funcional del mismo, como un dominio de 41 aminoácidos del mismo y/o un dominio de este tipo con una sustitución de LL por GG en las posiciones 186-187 de una proteína de CD28 nativa. En algunos casos, el dominio intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador intracelular de 41BB o una variante funcional del mismo, como un dominio citoplásmico de 42 aminoácidos de un 4-1BB humano (N° de registro Q07011.1). En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización estimulador de CD3 zeta humano o una variante funcional del mismo, como un dominio citoplasmático de 112 AA de la isoforma 3 de CD3Z humana (N° de registro: P20963.2) o un dominio de señalización de CD3 zeta como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 7.446.190. En algunos aspectos, el espaciador contiene solo una región bisagra de una IgG, como solo una bisagra de IgG4 o IgG1. En otros casos, el espaciador es una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra de IgG4, enlazada a dominios de CH2 y/o CH3. En algunos casos, el espaciador es una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra de IgG4, enlazada a los dominios de CH2 y CH3. En algunos casos, el espaciador es una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra de IgG4, enlazada solamente a un dominio de CH3. En algunos casos, el espaciador es o comprende una secuencia rica en glicina-serina u otro conector flexible, como los conectores flexibles conocidos.

Por ejemplo, en algunos casos, el CAR incluye: una parte de unión a ligando extracelular, como una parte de unión a antígeno, como un anticuerpo o fragmento del mismo, incluyendo sdAbs y scFvs, que se une específicamente a un antígeno, por ejemplo, un antígeno descrito en la presente; un espaciador como cualquiera de los espaciadores que contienen bisagras de Ig; un dominio transmembrana que es una parte de CD28 o una variante del mismo; un dominio de señalización intracelular que contiene una parte de señalización de CD28 o una variante funcional del mismo; y una parte de señalización del dominio de señalización de CD3 zeta o una variante funcional del mismo. En algunos casos, el CAR incluye: una parte de unión a ligando extracelular, como una parte de unión a antígeno, como un anticuerpo o fragmento del mismo, incluyendo sdAbs y scFvs, que se une específicamente a un antígeno, por ejemplo, un antígeno descrito en la presente; un espaciador como cualquiera de los espaciadores que contienen bisagras de Ig; un dominio transmembrana que es una parte de CD28 o una variante del mismo; un dominio de señalización intracelular que contiene una parte de señalización de 4-1BB o variante funcional del mismo; y una parte de señalización del dominio de señalización de CD3 zeta o una variante funcional del mismo. En algunos casos, tales constructos de CAR incluyen además un elemento de salto ribosómico T2A y/o una secuencia de tEGFR, por ejemplo, en sentido descendente del CAR.

B. Receptores de células T (TCR)

En algunos casos, la molécula recombinante y/o heteróloga codificada por la partícula del vector viral es o incluye un receptor de células T recombinante (TCR). En algunos casos, el TCR recombinante es específico para un antígeno, generalmente un antígeno presente en una célula objetivo, como un antígeno específico de un tumor, un antígeno expresado en un tipo de célula particular asociado con una enfermedad autoinmune o inflamatoria, o un antígeno derivado de un patógeno viral o un patógeno bacteriano.

En algunos casos, el TCR es uno que ha sido clonado a partir de células T de origen natural. En algunos casos, se identifica y aísla de un paciente un clon de células T de alta afinidad para un antígeno objetivo (por ejemplo, un antígeno del cáncer). En algunos casos, el clon de TCR para un antígeno objetivo se ha generado en ratones transgénicos manipulados con genes del sistema inmunitario humano (por ejemplo, el sistema de antígenos leucocitarios humanos o HLA). Ver, por ejemplo, antígenos tumorales (ver, por ejemplo, Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 y Cohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808. En algunos casos, se usa la presentación de fagos para aislar TCR contra un antígeno objetivo (ver, por ejemplo, Varela-Rohena et al. (2008) NatMed.

14:1390-1395 y Li (2005) NatBiotechnol. 23:349-354.

En algunos casos, después de que se ha obtenido el clon de células T, se aíslan las cadenas alfa y beta de TCR y se clonan en un vector de expresión génica. En algunos casos, los genes TCR alfa y beta están enlazados a través de un péptido de salto ribosómico 2A de picornavirus, de modo que ambas cadenas se coexpresan. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica un t Cr incluye además un marcador para confirmar la transducción o manipulación de la célula para expresar el receptor.

C. Partículas de vectores virales

En algunos casos, las células que se probaron para virus competentes en replicación se transdujeron con una partícula de vector viral que incluye un ácido nucleico que codifica la molécula recombinante y/o heteróloga, por ejemplo, el producto génico. En algunos casos, el ácido nucleico, es decir, el polinucleótido, está contenido dentro de un casete de expresión. El ácido nucleico o casete de expresión puede estar contenido en un vector de expresión, como un vector viral, para la expresión de la molécula recombinante y/o heteróloga codificada por el ácido nucleico en la partícula del vector viral.

1. Casete de expresión

En algunos casos, el casete de expresión puede contener el ácido nucleico que codifica la molécula heteróloga y/o recombinante bajo el control de un promotor. El casete de expresión también puede contener uno o más de otros elementos reguladores. En algunos casos, el ácido nucleico puede estar enlazado operativamente con otras secuencias de ácidos nucleicos, incluyendo pero no limitados a, promotores, potenciadores, otros elementos reguladores postranscripcionales, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción, sitios de clonación múltiple o segmentos codificadores.

a. Promotores

En algunos casos, el casete de expresión incluye un promotor enlazado operativamente a la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína recombinante o heteróloga. El promotor puede comprender cualquier promotor deseado por el usuario según sea apropiado para el contexto de la expresión. En algunos casos, un promotor puede comprender un promotor de origen eucariota o procariota que puede proporcionar niveles altos de expresión constitutiva en una variedad de tipos de células y será suficiente para dirigir la transcripción del ácido nucleico que codifica la proteína heteróloga o recombinante en una célula. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica la proteína recombinante o heteróloga es una secuencia localizada distalmente, que es una secuencia enlazada operativamente con el extremo 5' de la secuencia promotora. La región del promotor también puede incluir elementos de control para la mejora o represión de la transcripción y puede modificarse según se desee por el usuario y dependiendo del contexto.

En algunos casos, un promotor comprende una secuencia que funciona para posicionar el sitio de inicio para la síntesis de ARN. En algunos casos, el promotor comprende la caja TATA. En algunos casos, el promotor carece de una caja TATA como, por ejemplo, el promotor del gen de la desoxinucleotidil transferasa terminal de mamífero y el promotor de los genes tardíos de SV40. En tal caso, el promotor puede contener un elemento discreto superpuesto al propio sitio de inicio que ayuda a fijar el lugar de inicio. Elementos promotores adicionales regulan la frecuencia de inicio transcripcional. En algunos casos, estos están localizados en la región 30-110 pb en sentido ascendente del sitio de inicio, aunque se ha demostrado que una serie de promotores también contienen elementos funcionales en sentido descendente del sitio de inicio. Para poner una secuencia de codificación "bajo el control de" un promotor, se coloca el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción del marco de lectura transcripcional "en sentido descendente" (es decir, 3') del promotor elegido. El promotor "en sentido ascendente" estimula la transcripción del ADN y promueve la expresión del ARN codificado.

En algunos casos, el espacio entre los elementos promotores es flexible, de manera que cuando los elementos se invierten o se mueven entre sí se conserva la función del promotor. En algunos casos en los que el promotor es el promotor tk, la separación entre los elementos del promotor puede aumentarse a 50 pb antes de que la actividad comience a disminuir. Dependiendo del promotor, los elementos individuales pueden funcionar de manera cooperativa o independiente para activar la transcripción. En algunos casos, puede usarse un promotor junto con un "potenciador", que se refiere a una secuencia reguladora que actúa en cis implicada en la activación transcripcional de una secuencia de ácidos nucleicos.

En algunos casos, un promotor puede ser uno que esté asociado de manera natural con una secuencia de ácidos nucleicos, como puede obtenerse aislando las secuencias no codificantes 5' localizadas en sentido ascendente del segmento codificante y/o exón. A tal promotor puede hacerse referencia como "endógeno". En algunos casos, un potenciador puede estar asociado de manera natural con una secuencia de ácidos nucleicos, localizada o en sentido descendente o en sentido ascendente de esa secuencia.

Alternativamente, en algunos casos, el segmento de ácido nucleico codificante puede colocarse bajo el control de un promotor y/o potenciador recombinante y/o heterólogo, que normalmente no está asociado con la secuencia de ácidos nucleicos codificante en el entorno natural. Tales promotores o potenciadores pueden incluir promotores o potenciadores que en la naturaleza están enlazados operativamente a otros genes dentro de la especie de la que se deriva el ácido nucleico, y promotores o potenciadores aislados de otras especies, como de otras células procariotas o eucariotas, y promotores o potenciadores que no son de 'origen natural', es decir, que contienen diferentes elementos de diferentes regiones reguladoras de la transcripción y/o mutaciones que alteran la expresión en comparación con las que se encuentran en cualquier promotor o potenciador en la naturaleza. Por ejemplo, los promotores ejemplares usados en la construcción de ADN recombinante incluyen, pero no se limitan a, los promotores de p-lactamasa (penicilinasa), lactosa, triptófano (trp), ARN polimerasa (pol) III, incluyendo los promotores humanos y murinos U6 pol III, así como los promotores H1 ARN pol III humano y murino; promotores de ARN polimerasa (pol) II; promotor temprano inmediato del citomegalovirus (pCMV), factor de elongación-1 alfa (EF-1 alfa) y los sistemas promotores del promotor de repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (pRSV). Además de producir secuencias de ácidos nucleicos de promotores y potenciadores sintéticamente, las secuencias pueden producirse usando tecnología de clonación recombinante y/o amplificación de ácidos nucleicos, incluyendo la PCR™, en relación con las composiciones y métodos divulgados en la presente (ver Patentes de Estados Unidos N° 4.683.202 y 5,928,906). Además, en algunos casos, también pueden emplearse secuencias de control que dirigen la transcripción y/o expresión de secuencias dentro de orgánulos no nucleares como mitocondrias, cloroplastos y similares. Las secuencias de control que comprenden promotores, potenciadores y otros locus o elementos de control/modulación de la transcripción también se denominan "casetes transcripcionales".

En algunos casos, el promotor y/o potenciador está enlazado operativamente para dirigir eficazmente la expresión del segmento de ADN en el orgánulo, tipo de célula, tejido, órgano u organismo elegido para la expresión. Los expertos en la técnica de la biología molecular generalmente conocen el uso de promotores, potenciadores y combinaciones de tipos de células para la expresión de proteínas (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989). Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos de tejido, inducibles y/o útiles en las condiciones apropiadas para dirigir un alto nivel de expresión del segmento de ADN introducido, como es ventajoso para la terapia génica o para aplicaciones como la producción a gran escala de proteínas recombinantes y/o péptidos. El promotor puede ser heterólogo o endógeno.

En algunos casos, puede emplearse un sistema de expresión citoplasmático T3, T7 o SP6. Las células eucariotas pueden soportar la transcripción citoplasmática de ciertos promotores bacterianos si se proporciona la polimerasa bacteriana apropiada, ya sea como parte del complejo de administración o como un constructo de expresión genética adicional.

En algunos casos, puede usarse un promotor inducible. Como se usa en la presente, un "promotor inducible" se refiere a un elemento de control transcripcional que puede regularse en respuesta a señales específicas. Un promotor inducible es transcripcionalmente activo cuando se une a un activador transcripcional, que a su vez se activa bajo un conjunto específico de condiciones, por ejemplo, en presencia de una combinación particular de señales químicas que afectan a la unión del activador transcripcional al promotor inducible y /o afectan a la función del propio activador transcripcional. Por tanto, un promotor inducible es un promotor que, en ausencia de un inductor, no dirige la expresión, o dirige niveles bajos de expresión, de una secuencia de ácidos nucleicos a la que está enlazado operativamente el promotor inducible; o muestra un bajo nivel de expresión en presencia de un factor regulador que, cuando se elimina, permite un nivel de expresión alto del promotor, por ejemplo, el sistema tet. En presencia de un inductor, un promotor inducible dirige la transcripción a un nivel aumentado.

En algunos casos, el sistema regulable por tetraciclina-(tet), que se basa en la acción inhibitoria de la represión tet (tetr) de Escherichia coli en la secuencia del operador tet (TECO), puede modificarse para su uso en sistemas de mamíferos y usarse como elemento regulable para casetes de expresión. Estos sistemas son bien conocidos por los expertos en la técnica. (Ver, Goshen y Badgered, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-51 (1992), Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6522-26 (1996), Lindemann et al., Mol. Med. 3:466-76 (1997)). b. Otros elementos reguladores

En algunos casos, el casete de expresión puede incluir además un potenciador que está enlazado operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína recombinante o el producto génico heterólogo.

En algunos casos, los elementos de los sitios de unión de ribosomas internos (IRES) están enlazados operativamente a casetes de expresión para crear mensajes multigénicos o policistrónicos. Los elementos IRES pueden evitar el modelo de escaneo de ribosomas de la traducción dependiente de caperuza 5'-metilada y comenzar la traducción en sitios internos (ver Pelletier y Sonenberg, (1988) Nature. 334:320-325). Los ejemplos no limitativos de elementos IRES incluyen, pero no se limitan a, elementos IRES de la familia de los picornavirus (poliomielitis y encefalomiocarditis) (ver Pelletier y Sonenberg, (1988) Nature. 334:320-325) o un IRES de un mensaje de mamífero (ver Macejak y Sarnow, (1991) Nature, 353:90-94). Los elementos IRES pueden enlazarse a marcos de lectura abiertos heterólogos. Pueden transcribirse juntos múltiples marcos de lectura abiertos, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. En virtud del elemento IRES, cada marco de lectura abierto es accesible a los ribosomas para una traducción eficiente. Pueden expresarse eficientemente múltiples genes usando un promotor/potenciador para transcribir un único mensaje.

En algunos casos que implican la expresión de genes eucariotas, el casete de expresión puede enlazarse operativamente a una señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación apropiada de la transcrito. Puede emplearse cualquier secuencia de este tipo. Algunos ejemplos incluyen la señal de poliadenilación de SV40 o la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, convenientes y conocidas por funcionar bien en varias células objetivo. La poliadenilación puede aumentar la estabilidad del transcrito o puede facilitar el transporte citoplasmático.

En algunos casos, el casete o vector de expresión contiene uno o más orígenes de sitios de replicación (a menudo denominados "ori") para propagarse en una célula huésped. Un origen de replicación es una secuencia de ácidos nucleicos específica en la que se inicia la replicación. Alternativamente, puede emplearse una secuencia de replicación autónoma (ARS) si la célula huésped es una levadura.

En algunos casos, la secuencia de ácidos nucleicos contenida en el genoma del vector viral que codifica un receptor recombinante, como un receptor de antígeno, por ejemplo, un CAR, está enlazada operativamente en una relación funcional con otros elementos genéticos, por ejemplo, secuencias reguladoras de la transcripción que incluyen promotores o potenciadores, para regular la expresión de la secuencia de interés de una manera particular. En ciertos casos, tales secuencias reguladoras de la transcripción son aquellas que están reguladas temporal y/o espacialmente con respecto a la actividad. Se conocen los elementos de control de la expresión que pueden usarse para regular la expresión de los componentes e incluyen, pero no se limitan a, promotores inducibles, promotores constitutivos, señales de secreción, potenciadores y otros elementos reguladores.

En algunos casos, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un receptor recombinante, como un receptor de antígeno, por ejemplo un CAR, está enlazada operativamente con secuencias reguladoras promotoras/potenciadoras internas. Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos de tejido, inducibles y/o útiles en las condiciones apropiadas para dirigir un nivel alto de expresión del segmento de ADN introducido. El promotor puede ser heterólogo o endógeno. En algunos casos, un promotor y/o potenciador se produce sintéticamente. En algunos casos, se produce un promotor y/o potenciador usando tecnología de clonación recombinante y/o amplificación de ácidos nucleicos.

En algunos casos, un promotor y/o potenciador puede ser uno que esté asociado de manera natural con una secuencia de ácidos nucleicos, como puede obtenerse aislando las secuencias no codificantes 5' localizadas en sentido ascendente del segmento codificante y/o exón. Alternativamente, en algunos casos, el segmento de ácidos nucleicos codificante puede colocarse bajo el control de un promotor y/o potenciador recombinante y/o heterólogo, que normalmente no está asociado con la secuencia de ácidos nucleicos codificante en el entorno natural. Por ejemplo, los ejemplos de promotores usados en la construcción de ADN recombinante incluyen, pero no se limitan a, los promotores de p-lactamasa (penicilinasa), lactosa, triptófano (trp), ARN polimerasa (pol) III, incluyendo los promotores U6 pol III humanos y murinos así como los promotores H1 ARN pol III humano y murino; promotores de ARN polimerasa (pol) II; el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (pCMV), el factor de elongación-1 alfa (EF-1 alfa) y los sistemas promotores del promotor de repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (pRSV). En algunos casos, el promotor puede obtenerse, por ejemplo, de los genomas de virus como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, el adenovirus, el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el virus simio 40 (SV40). El promotor también puede ser, por ejemplo, un promotor de mamífero heterólogo, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, un promotor de choque térmico o el promotor normalmente asociado con la secuencia nativa, siempre que dichos promotores sean compatibles con la célula objetivo. En un caso, el promotor es el promotor viral de origen natural en un sistema de expresión viral.

En algunos casos, el promotor puede ser constitutivamente activo. Los ejemplos no limitativos de promotores constitutivos que pueden usarse incluyen el promotor de ubiquitina (Patente de Estados Unidos N° 5.510.474; WO 98/32869), CMV (Thomsen et al., PNAS 81:659, 1984; Patente de Estados Unidos N° 5.168.062), beta-actina (Gunning et al. 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4831-4835) y pgk (ver, por ejemplo, Adra et al. 1987 Gene 60:65-74; Singer-Sam et al., 1984 Gene 32:409-417 y Dobson et al., 1982 Nucleic Acids Res. 10:2635-2637).

En algunos casos, el promotor puede ser un promotor específico de tejido y/o un promotor específico de células objetivo. En algunos casos, los promotores pueden seleccionarse para permitir la expresión inducible de la secuencia de interés. Se conocen una serie de sistemas para la expresión inducible, incluyendo el sistema sensible a la tetraciclina, el sistema operador-represor lac, así como promotores sensibles a una variedad de cambios ambientales o fisiológicos, incluyendo el choque térmico, iones metálicos, como el promotor de metalotioneína, interferones, hipoxia, esteroides, como la progesterona o el promotor del receptor de glucocorticoides, radiación, como el promotor del VEGF. En algunos casos, puede modificarse el sistema regulable por tetraciclina-(tet), que se basa en la acción inhibidora de la represión tet (tetr) de Escherichia coli en la secuencia del operador tet (TECO), para su uso en sistemas de mamíferos y usarse como elemento regulable para casetes de expresión. Estos sistemas son bien conocidos. (Ver, Goshen y Badgered, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-51 (1992), Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6522-26 (1996), Lindemann et al., Mol. Med. 3:466-76 (1997)).

También puede usarse una combinación de promotores para obtener la expresión deseada del gen de interés. Los expertos en la técnica podrán seleccionar un promotor basándose en el patrón de expresión deseado del gen en el organismo o la célula objetivo de interés.

En algunos casos, también puede estar presente un potenciador en el constructo viral para aumentar la expresión del gen de interés. Los potenciadores son típicamente elementos de ácidos nucleicos que actúan en cis, habitualmente de aproximadamente 10 a 300 pb de longitud, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Se conocen muchos potenciadores de los genomas virales, como el VIH o el CMV. Por ejemplo, puede usarse el potenciador de CMV (Boshart et al. Cell, 41:521, 1985). Otros ejemplos incluyen, por ejemplo, el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (bp 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. En algunos casos, un potenciador es de un gen de mamífero, como un potenciador de una globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína o insulina). Un potenciador puede usarse en combinación con un promotor heterólogo. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia de polinucleótidos que codifica el gen de interés, pero generalmente se localiza en un sitio 5' del promotor. Un experto en la técnica será capaz de seleccionar el potenciador apropiado en base al patrón de expresión deseado.

El genoma del vector viral también puede contener elementos genéticos adicionales. Los tipos de elementos que pueden incluirse en los constructos no están limitados de ninguna manera y pueden ser elegidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, puede incluirse una señal que facilite la entrada nuclear del genoma viral en la célula objetivo.

En algunos casos, puede incluirse más de un marco de lectura abierto que codifica proteínas heterólogas separadas. Por ejemplo, en algunos casos, si se incluye un gen informador y/o detectable y/o seleccionable en el constructo de expresión, puede incluirse una secuencia del sitio de entrada ribosomal interno (IRES). Típicamente, los elementos genéticos adicionales están enlazados operativamente y son controlados por un promotor/potenciador independiente. El elemento genético adicional puede ser un gen informador, un marcador seleccionable u otro gen deseado.

En algunos casos, otros varios elementos reguladores pueden incluir una región de inicio y/o una región de terminación de la transcripción. Los vectores de expresión también pueden contener secuencias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias son conocidas y se encuentran a menudo de manera natural en las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente, 3' de los ADN o ADNc eucariotas o virales. Los ejemplos de la región de terminación de la transcripción incluyen, pero no se limitan a, secuencias señal de poliadenilación. Los ejemplos de secuencias señal de poliadenilación incluyen, pero no se limitan a, secuencias poli(A) de hormona de crecimiento bovino (BGH), poli(A) tardío de SV40, poli(A) de betaglobina de conejo (RBG), poli(A) de timidina quinasa (TK), y cualquier variante de las mismas.

2. Vectores virales

En algunos casos, las partículas del vector viral usadas para transducir las células que se van a probar contienen un genoma derivado de un vector basado en el genoma retroviral, como el derivado de un vector basado en el genoma gammaretroviral o lentiviral. Se conoce cualquiera de un gran número de tales genomas de vectores adecuados (ver, por ejemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy 3 de abril de 2014. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. noviembre de 2011 29(11): 550-557; Pfeifer y Verma (2001) Annu Rev. Genomics Hum. Genet., 2:177-211). En algunos aspectos de los vectores virales descritos, el ácido nucleico heterólogo que codifica un receptor recombinante, como un receptor de antígeno, como un CAR, está contenido y/o localizado entre las secuencias 5' LTR y 3' LTR del genoma del vector. En algunos casos, al genoma del vector se hace referencia como vector de transferencia y/o plásmido de transferencia.

Los vectores virales ejemplares incluyen vectores retrovirales, como vectores lentivirales o gammaretrovirales, vectores derivados del virus de simio 40 (SV40), adenovirus y virus adenoasociados (AAV). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células usando vectores retrovirales, como vectores lentivirales o vectores gamma-retrovirales (ver, por ejemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy 3 de abril de 2014. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. noviembre de 2011 29(11): 550-557. Los retrovirus son útiles como vectores de distribución debido a su capacidad para integrar sus genes en el genoma del huésped, transfiriendo una gran cantidad de material genético extraño, infectando un amplio espectro de especies y tipos de células y empaquetándose en líneas celulares especiales (Miller, 1992).

En algunos casos, la transferencia genética se logra a través de vectores gammaretrovirales. Por tanto, en algunos casos, el genoma del vector viral es un genoma de gammaretrovirus, como un genoma de virus de la leucemia murina (MLV), el virus de la leucemia del simio Gibbon (GALV), el virus endógeno relacionado con el virus de la leucemia murina xenotrópica endógena (XMRV) o el virus de la leucemia felina (FLV).

En algunos casos, la transferencia genética se logra a través de vectores lentivirales. En algunos aspectos, pueden usarse lentivirus para transducir ciertas células que no se dividen.

Los ejemplos no limitativos de vectores lentivirales incluyen los derivados de un lentivirus, como el virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1), el VIH-2, un virus de la inmunodeficiencia de simio (VIS), el virus linfotrópico T humano 1 (HTLV-1), HTLV-2 o virus de la anemia infecciosa equina (E1AV). Por ejemplo, se han generado vectores lentivirales mediante la atenuación múltiple de los genes de virulencia del VIH, por ejemplo, se eliminan los genes env, vif, vpr, vpu, vpx y nef, lo que en algunos casos puede hacer que un vector sea más seguro, más aceptado como seguro. o más deseable para propósitos terapéuticos. En la técnica se conocen los vectores lentivirales, ver Naldini et al., (1996 y 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, Patentes de Estados Unidos N° 6.013.516; y 5.994.136). En algunos casos, estos vectores virales se basan en plásmidos o en virus y están configurados para transportar las secuencias esenciales para incorporar ácidos nucleicos extraños, para la selección y para la transferencia del ácido nucleico a una célula huésped. Los lentivirus conocidos pueden obtenerse fácilmente de depósitos o colecciones como la American Type Culture Collection ("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209), o aislarse de fuentes conocidas usando técnicas comúnmente disponibles.

En algunos casos, los vectores virales incluyen, pero no se limitan a, uno derivado de un lentivirus de VIH-1, SIVmnd1, SIV1st, SIVsun, SIVolc o SIVwrc.

En algunos casos, dos componentes están implicados en la elaboración de un sistema de administración de genes basado en virus: primero, empaquetar plásmidos, que abarcan las proteínas estructurales y las enzimas necesarias para generar una partícula de vector viral, y segundo, el propio vector viral, es decir, el material genético a transferir. Pueden introducirse salvaguardas de bioseguridad en el diseño de uno o ambos componentes. En algunos casos, el plásmido de empaquetamiento puede contener todas las proteínas del VIH-1 distintas de las proteínas de la envoltura (Naldini et al., 1998). En algunos casos, los vectores virales pueden carecer de genes virales adicionales, como los que están asociados con la virulencia, por ejemplo, vpr, vif, vpu, vpx y nef, y/o Tat, un transactivador primario del VIH. En algunos casos, los sistemas de empaquetamiento para vectores lentivirales, como los vectores lentivirales basados en el VIH, incluyen plásmidos de empaquetamiento separados que juntos comprenden solo tres genes del virus original: gag, pol y rev, lo que reduce o elimina la posibilidad de reconstitución de un virus de tipo salvaje por recombinación.

En algunos aspectos de los métodos descritos, el ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína recombinante, como se proporciona como parte de un casete de expresión que contiene el transgén bajo el control de un promotor, está contenido y/o localizado entre las secuencias LTR 5' y LTR 3' del genoma del vector, incluyendo LTR de tipo salvaje o partes o partes quiméricas de las mismas. En algunos casos, el genoma del vector viral puede contener secuencias de las LTR 5' y 3' de un retrovirus. En algunos aspectos, el constructo del genoma viral puede contener secuencias de las LTR 5' y 3' de un retrovirus y, en particular, puede contener las secuencias R y U5 de LTR 5' de un retrovirus y una LTR 3' inactivada o autoinactivante de un retrovirus. Las secuencias LTR pueden ser secuencias LTR de cualquier retrovirus de cualquier especie. Por ejemplo, pueden ser secuencias LTR de HIV, SIV, FIV o BIV.

El genoma del vector puede contener una LTR 3' inactivada o autoinactivante (Zuffrey et al. J Virol 72: 9873, 1998; Miyoshi et al., J Virol 72:8150, 1998)). Por ejemplo, la deleción en la región U3 de la LTR 3' del ácido nucleico usado para producir el ARN del vector viral puede usarse para generar vectores autoinactivantes (SIN). Esta deleción puede luego transferirse a la LTR 5' del ADN proviral durante la transcripción inversa. Un vector autoinactivante generalmente tiene una deleción de las secuencias potenciadoras y promotoras de la repetición terminal larga (LTR) 3', que se copia en la LTR 5' durante la integración del vector. En algunos casos, puede eliminarse suficiente secuencia, incluyendo la eliminación de una caja TATA, para suprimir la actividad transcripcional de la LTR. Esto puede evitar la producción de ARN de vector de longitud completa en las células transducidas. En algunos aspectos, el elemento U3 del LTR 3' contiene una deleción de su secuencia potenciadora, la caja TATA, los sitios Sp1 y NF-kappa B. Como resultado de la LTR 3' autoinactivante, el provirus que se genera después de la entrada y la transcripción inversa contiene una LTR 5' inactivada. Esto puede mejorar la seguridad al reducir el riesgo de movilización del genoma del vector y la influencia de la LTR sobre los promotores celulares cercanos. La LTR 3' autoinactivante puede construirse mediante cualquier método conocido en la técnica. En algunos casos, esto no afecta a los títulos del vector o las propiedades in vitro o in vivo de la partícula del vector viral.

Opcionalmente, la secuencia U3 de la LTR 5' lentiviral puede reemplazarse con una secuencia promotora en el constructo viral, como una secuencia promotora heteróloga. Esto puede aumentar el título de virus recuperado de la línea celular de empaquetamiento. También puede incluirse una secuencia potenciadora. Puede usarse cualquier combinación de potenciador/promotor que aumente la expresión del genoma de ARN viral en la línea celular de empaquetamiento. En un ejemplo, se usa la secuencia potenciadora/promotora de CMV (Patente de Estados Unidos N° 5.385.839 y Patente de Estados Unidos N° 5.168.062).

En algunos casos, el genoma del vector viral también puede contener elementos genéticos adicionales. Los tipos de elementos que pueden incluirse en los constructos no están limitados de ninguna manera y pueden ser elegidos por un experto en la técnica. En algunos casos, el genoma del vector contiene secuencias derivadas de un genoma viral (por ejemplo, genoma retroviral) que son regiones no codificantes del genoma que facilitan o proporcionan señales de reconocimiento para la síntesis y procesamiento de ADN o ARN. En algunos casos, tales secuencias pueden incluir secuencias que actúan en cis que pueden estar implicadas en el empaquetamiento o encapsidación, transcripción inversa y transcripción y/o transferencia o integración de genes. En algunos casos, las secuencias de activación de cis proporcionadas como parte del vector viral se derivan del mismo organismo similar a lentivirus o retrovirus.

En algunos casos, el genoma del vector retroviral puede contener elementos seleccionados entre un sitio donante de corte y empalme (SD), un sitio aceptor de corte y empalme (SA) y/o un elemento sensible a Rev (RRE). En algunos casos, se proporciona RRE para permitir la exportación de a Rn mensajero viral desde el núcleo al citosol después de la unión de la proteína Rev proporcionada como parte de un plásmido auxiliar durante el empaquetamiento viral. En algunos casos, el genoma del vector puede contener la señal de empaquetamiento psi (Y), que, en algunos casos, puede derivarse del fragmento N-terminal del ORF de gag. En algunos casos, la secuencia señal de empaquetamiento psi puede modificarse mediante mutación o mutaciones de marco de lectura para evitar cualquier interferencia de una posible transcripción/traducción del péptido de gag con la del transgén.

En ciertos casos, el genoma del vector viral, como el genoma del vector gammaretroviral o lentiviral, u otro genoma viral, se manipula para que tenga una integración defectuosa. Pueden seguirse una variedad de enfoques para producir un genoma de vector que no se integra. En algunos casos, pueden diseñarse mutaciones en el componente de la enzima integrasa del gen pol, de tal manera que codifique una proteína con una integrasa inactiva. En algunos casos, puede modificarse el propio genoma del vector para evitar la integración, por ejemplo, mutando o eliminando uno o ambos sitios de unión, o haciendo que el tracto de polipurina proximal (PPT) LTR 3' no sea funcional mediante deleción o modificación. En algunos casos, se encuentran disponibles enfoques no genéticos; estos incluyen agentes farmacológicos que inhiben una o más funciones de la integrasa. Los enfoques no son necesariamente mutuamente excluyentes; es decir, puede usarse más de uno a la vez. Por ejemplo, tanto el sitio de integración como el de unión pueden ser no funcionales, o el sitio de integrasa y PPT pueden ser no funcionales, o los sitios de unión y el sitio de PPT pueden ser no funcionales, o todos ellos pueden ser no funcionales. Tales métodos y genomas de vectores virales son conocidos y están disponibles (ver Philpott y Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Engelman et al. J Virol 69:2729, 1995; Brown et al J Virol 73:9011 (1999); WO 2009/076524; McWilliams et al., J Virol 77:11150, 2003; Powell and Levin J Virol 70:5288, 1996).

En algunos casos, el vector también puede contener secuencias para la propagación en una célula huésped, como una célula huésped procariota. En algunos casos, el ácido nucleico del vector viral contiene uno o más orígenes de replicación para la propagación en una célula procariota, como una célula bacteriana. En algunos casos, los vectores que incluyen un origen de replicación procariota también pueden contener un gen cuya expresión confiere un marcador detectable o seleccionable como resistencia a fármacos.

3. preparación de partículas de vectores virales

En algunos casos de los métodos descritos, un ácido nucleico que codifica la molécula recombinante y/o heteróloga se inserta en el genoma viral en lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que es defectuoso en la replicación. Para producir viriones, puede construirse una línea celular de empaquetamiento que contenga los genes gag, pol y env pero sin la LTR ni los componentes de empaquetamiento. Cuando se introducen un plásmido recombinante junto con la LTR retroviral y las secuencias de empaquetamiento en una línea celular especial (por ejemplo, por precipitación con fosfato de calcio, por ejemplo), la secuencia de empaquetamiento puede permitir que la transcripción de ARN del plásmido recombinante se empaquete en partículas virales, que luego puede secretarse en los medios de cultivo. Luego, se recogen los medios que contienen los retrovirus recombinantes en algunos casos, opcionalmente se concentran, y se usan para la transferencia génica.

El genoma del vector viral se construye típicamente en forma de plásmido que puede transfectarse en una línea celular de empaquetamiento o productora. Puede usarse cualquiera de una variedad de métodos conocidos para producir partículas virales cuyo genoma contiene una copia de ARN del genoma del vector viral. En algunos casos, están implicados por lo menos dos componentes en la creación de un sistema de administración de genes basado en virus: primero, plásmidos de empaquetamiento, que abarcan las proteínas estructurales y las enzimas necesarias para generar una partícula de vector viral, y segundo, el propio vector viral, es decir, el material genético a transferir. Pueden introducirse salvaguardas de bioseguridad en el diseño de uno o ambos componentes.

En algunos casos, el plásmido de empaquetamiento puede contener todas las proteínas virales distintas de las proteínas de la envoltura (Naldini et al., 1998). En otros casos, los vectores virales pueden carecer de genes virales adicionales, como los que están asociados con la virulencia, por ejemplo, vpr, vif, vpu, vpx y nef, y/o Tat, un transactivador primario del VIH.

En algunos casos, los vectores lentivirales, como los vectores lentivirales basados en el VIH, comprenden solo tres genes del virus original: gag, pol y rev, lo que reduce o elimina la posibilidad de reconstitución de un virus de tipo salvaje a través de la recombinación.

Como se ha descrito anteriormente, en algunos casos, el genoma del vector viral se introduce en una línea celular de empaquetamiento que contiene todos los componentes necesarios para empaquetar el ARN genómico viral, transcrito a partir del genoma del vector viral, en partículas virales. Alternativamente, el genoma del vector viral puede comprender uno o más genes que codifican componentes virales además de una o más secuencias, por ejemplo, ácidos nucleicos recombinantes, de interés. Sin embargo, en algunos aspectos, para prevenir la replicación del genoma en la célula objetivo, se eliminan los genes virales endógenos requeridos para la replicación y se proporcionan por separado en la línea celular de empaquetamiento.

En algunos casos, una línea celular de empaquetamiento se transfecta con uno o más vectores plasmídicos que contienen los componentes necesarios para generar las partículas. La línea celular de empaquetamiento puede expresar o hacer que exprese genes retrovirales esenciales para permitir la generación de partículas de vectores virales. Estos genes pueden ser expresados por varios plásmidos. En algunos casos, una línea celular de empaquetamiento se transfecta con un plásmido que contiene el genoma del vector viral, incluyendo las LTR, la secuencia de empaquetamiento que actúa en cis y la secuencia de interés, es decir, un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno, como un CAR; uno o más plásmidos auxiliares que codifican los componentes enzimáticos y/o estructurales del virus, como Gag, pol y/o rev. En algunos casos, se utilizan múltiples vectores para separar los varios componentes genéticos que generan las partículas del vector viral. En algunos de estos casos, proporcionar vectores separados a la célula de empaquetamiento reduce la posibilidad de que se produzcan eventos de recombinación que, de lo contrario, podrían generar virus competentes en la replicación. En algunos casos, puede usarse un único vector de plásmido que tenga todos los componentes virales.

En algunos casos, una línea celular de empaquetamiento puede transfectarse con un plásmido de expresión lentiviral que contiene una secuencia de empaquetamiento psi (Y) que actúa en cis e insertarse el gen transgénico entre las LTR lentivirales para permitir la integración de la célula objetivo; un plásmido o plásmidos de empaquetamiento que codifican los genes virales pol, gag, rev y/o tat y, en algunos casos, que contienen el elemento de respuesta inversa (RRE) y un plásmido de pseudotipificación, como un plásmido que codifica una proteína de envoltura, como la proteína G del gen de la envoltura del Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV-G).

En algunos casos, una línea celular de empaquetamiento se transfecta con un plásmido que contiene el genoma del vector viral, incluyendo las LTR, la secuencia de empaquetamiento que actúa en cis y la secuencia de interés, es decir, un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante (por ejemplo, un receptor de antígeno, como un CAR) junto con varios plásmidos auxiliares que codifican los componentes enzimáticos y/o estructurales del virus, como Env, Gag, pol y/o rev. En algunos casos, se introduce por separado en una línea celular de empaquetamiento un plásmido de empaquetamiento GagPol que contiene los genes gag y pol que codifican componentes estructurales y enzimáticos y un plásmido Rev que contiene el gen rev que codifica la proteína reguladora Rev. En algunos casos, puede usarse un solo vector de plásmido que tenga todos los componentes retrovirales. En algunos casos, también puede introducirse un plásmido envolvente que codifica un gen env lo que, en algunos casos, puede dar como resultado partículas virales pseudotipadas con proteínas Env alternativas. En algunos casos, la partícula del vector viral, como la partícula del vector gammaretroviral o lentiviral, se pseudotipifica para aumentar la eficiencia de transducción de las células huésped. Por ejemplo, una partícula de vector viral puede seudotipificarse con una glicoproteína de VSV-G, que proporciona una amplia variedad de huéspedes celulares que amplían los tipos de células que pueden transducirse. En algunos casos, se transfecta una línea celular de empaquetamiento con un plásmido o polinucleótido que codifica una glicoproteína de envoltura no nativa, como para incluir envolturas xenotrópicas, politrópicas o anfotrópicas, como la envoltura del virus Sindbis, GALV o VSV-G.

El gen env puede derivarse de cualquier virus apropiado, como un retrovirus. En algunos casos, el env es una proteína de envoltura anfotrópica que permite la transducción de células humanas y de otras especies. Algunos casos usan genes env derivados de retrovirus incluyendo, pero no limitados a: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV o MMLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV o HSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV o MMTV), virus de la leucemia del simio gibón (GaLV o GALV), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y virus del sarcoma de Rous (RSV). En algunos casos, también pueden usarse otros genes env como la proteína G (VSVG) del virus de la estomatitis vesicular (VSV), los de los virus de la hepatitis y los de la gripe.

En algunos casos, el plásmido de empaquetamiento que proporciona la secuencia de ácidos nucleicos de env viral está asociado o enlazado operativamente con secuencias reguladoras, por ejemplo, un promotor o potenciador. La secuencia reguladora en algunos casos puede ser cualquier promotor o potenciador eucariota, incluyendo, por ejemplo, EF1a, PGK, el elemento potenciador del promotor del virus de la leucemia murina de Moloney, el potenciador del citomegalovirus humano, el promotor P7.5 de vaccinia o similares. En algunos casos, como el elemento potenciador del promotor del virus de la leucemia murina de Moloney, los elementos potenciadores del promotor están localizados dentro o adyacentes a las secuencias de LTR. En algunos casos, la secuencia reguladora no es endógena al lentivirus a partir del cual se construye el vector. Por tanto, si el vector se hace a partir de SIV, la secuencia reguladora de SIV encontrada en la LTR de SlV puede reemplazarse por cualquier elemento regulador que no se origine de SIV.

En algunos casos, la línea celular de empaquetamiento proporciona los componentes, incluyendo las proteínas estructurales y reguladoras virales, que se requieren en trans para el empaquetamiento del ARN genómico viral en partículas de vector lentiviral. En algunos casos, la línea celular de empaquetamiento puede ser cualquier línea celular que sea capaz de expresar proteínas retrovirales y producir partículas de vectores virales funcionales. En algunos aspectos, las líneas celulares de empaquetamiento adecuadas incluyen células 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLA (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) y Cf2Th (ATCC CRL 1430).

En algunos casos, la línea celular de empaquetamiento expresa de manera estable la o las proteínas virales. Por ejemplo, en algunos aspectos, puede construirse una línea celular de empaquetamiento que contenga los genes gag, pol, rev y/u otros genes estructurales pero sin la LTR ni los componentes de empaquetamiento. En algunos casos, una línea celular de empaquetamiento puede transfectarse transitoriamente con moléculas de ácidos nucleicos que codifican una o más proteínas virales junto con el genoma del vector viral que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula recombinante y/o heteróloga, y/o un ácido nucleico que codifica un glicoproteína de la envoltura.

En algunos casos, los vectores virales y los plásmidos auxiliares y/o de empaquetamiento se introducen mediante transfección o infección en la línea celular de empaquetamiento. La línea celular de empaquetamiento produce partículas de vectores virales que contienen el genoma del vector viral. Los métodos de transfección o infección son bien conocidos. Los ejemplos no limitativos incluyen fosfato de calcio, DEAE-dextrano y métodos de lipofección, electroporación y microinyección. Cuando un plásmido recombinante y la LTR viral y las secuencias de empaquetamiento se introducen en una línea celular especial (por ejemplo, por precipitación con fosfato de calcio, por ejemplo), las secuencias de empaquetamiento pueden permitir que la transcripción de ARN del plásmido recombinante se empaquete en partículas virales, que luego pueden secretarse en los medios de cultivo. Luego, en algunos casos se recogen los medios que contienen los retrovirus recombinantes, opcionalmente se concentran y se usan para la transferencia génica. Por ejemplo, en algunos aspectos, después de la cotransfección de los plásmidos de empaquetamiento y el vector de transferencia a la línea celular de empaquetamiento, las partículas del vector viral se recuperan del medio de cultivo y se titulan mediante métodos estándar usados por los expertos en la técnica. Por tanto, en algunos casos se introducen los plásmidos de empaquetamiento en líneas celulares humanas mediante estos métodos, generalmente junto con un marcador seleccionable dominante, como neomicina, DHFR, glutamina sintetasa o ADA, seguido de selección en presencia del fármaco apropiado y aislamiento de clones. El gen marcador seleccionable puede enlazarse físicamente a los genes de empaquetamiento en el constructo.

En algunos casos, las partículas de vector viral pueden producirse mediante líneas celulares estables en donde las funciones de empaquetamiento están configuradas para expresarse. Se conocen células de empaquetamiento adecuadas que incluyen, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.686.279; y Ory et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1996) 93:11400-11406. En algunos casos, las células de empaquetamiento con un vector viral incorporado en ellas forman células productoras. Las células productoras son, por tanto, típicamente células o líneas celulares que pueden producir o liberar partículas de vectores virales que portan el gen de interés. En algunos casos, estas células pueden depender además del anclaje, lo que significa que estas células crecerán, sobrevivirán o mantendrán su función de manera óptima cuando se unan a una superficie como vidrio o plástico. En algunos casos, las células productoras pueden ser células transformadas neoplásicamente. En algunos casos, las células huésped para la transfección con el vector lentiviral y los plásmidos de empaquetamiento incluyen, por ejemplo, células primarias de mamífero; líneas celulares de mamífero establecidas, como células COS, CHO, HeLa, NIH3T3, 293T y PC12; células de anfibios, como embriones y ovocitos de Xenopus; otras células de vertebrados; células de insecto (por ejemplo, Drosophila), células de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe o Pichia pastoris) y células procarióticas (por ejemplo, E. coli).

En algunos casos, las partículas de vector viral se pueden producir en una línea celular de empaquetamiento, como una línea celular ejemplar HEK 293T, mediante la introducción de plásmidos para permitir la generación de partículas de vector viral. En algunos casos, una célula de empaquetamiento se transfecta y/o contiene un polinucleótido que codifica gag y pol, y un polinucleótido que codifica una molécula recombinante y/o heteróloga, como un receptor de antígeno, por ejemplo, un CAR. En algunos casos, la línea celular de empaquetamiento se transfecta opcional y/o adicionalmente con y/o contiene un polinucleótido que codifica una proteína de rev. En algunos casos, la línea celular de empaquetamiento se transfecta opcional y/o adicionalmente con y/o contiene un polinucleótido que codifica una glicoproteína de cubierta no nativa, como VSV-G. En algunos de estos casos, aproximadamente dos días después de la transfección de las células, por ejemplo células HEK 293T, el sobrenadante celular contiene partículas de vector viral recombinante, que pueden recuperarse y titularse. Las partículas de vector viral recuperadas y/o producidas pueden usarse para transducir células objetivo, como células inmunitarias, por ejemplo, células T, como se describe. En algunos aspectos, una vez en las células objetivo, el ARN viral se transcribe inversamente, se importa al núcleo y se integra de manera estable en el genoma del huésped. En algunos aspectos, uno o dos días después de la integración del ARN viral, puede detectarse la expresión de la molécula recombinante y/o heteróloga.

En algunos casos, las partículas del vector viral aisladas pueden evaluarse en cuanto a virus competentes en la replicación mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente.

4. Transducción de células

En algunos casos, la muestra de prueba comprende células y/o ARN de dichas células, por ejemplo, células inmunitarias, como las células T, que son o han sido transducidas incubando y/o poniendo en contacto una población de células que contienen dichas células con un partícula de vector viral, como partícula de vector lentiviral o gammaretroviral, que contiene: un ácido nucleico que codifica una molécula recombinante y/o heteróloga, como un CAR u otro receptor de antígeno en un genoma del vector viral. La partícula de vector viral, como una partícula de vector lentiviral o gammaretroviral, puede ser cualquiera de las descritas. En algunos de estos casos, las células transducidas resultantes, como las células T transducidas, expresan la molécula recombinante y/o heteróloga, como un CAR, y pueden usarse en métodos de inmunoterapia adoptiva. En algunos casos puede evaluarse la presencia o ausencia de virus competentes en la replicación en cualquier punto del procesamiento de las células, incluyendo las células que se transducen o se transducirán, incluyendo las células para su uso en terapia celular adoptiva. A continuación se describen con detalle los pasos para el procesamiento de células, incluyendo los pasos implicados en el aislamiento, separación, selección, cultivo (por ejemplo, estimulación de las células, por ejemplo, para inducir su proliferación y/o activación), transducción, lavado, suspensión, dilución, concentración y/o o formulación de las células.

En algunos casos, los pasos de procesamiento pueden llevarse a cabo en un orden en el que: las células, por ejemplo, las células primarias, se aíslan primero, como se seleccionan o separan, de una muestra biológica; las células aisladas o seleccionadas resultantes se estimulan en presencia de un reactivo de estimulación; las células estimuladas se incuban con partículas de vector viral para la transducción; y las células transducidas se formulan en una composición. En algunos casos, la estimulación se realiza adicional o alternativamente durante por lo menos una parte de la incubación con las partículas del vector viral. En algunos casos, la estimulación se lleva a cabo adicional o alternativamente después de la incubación de las células con las partículas del vector viral. En algunos casos, los métodos no incluyen un paso de estimulación de las células. En algunos casos, el método puede incluir uno o más pasos de procesamiento entre el lavado, suspensión, dilución y/o concentración de las células, que puede producirse antes, durante o simultáneamente con o después de uno o más de los pasos aislamiento, como separación o selección, estimulación, transducción, cultivo, cultivo o expansión, crioconservación y/o formulación. Los métodos descritos pueden usarse para determinar la presencia o ausencia de, o el riesgo de, un virus competente en la replicación en una muestra recogida en cualquiera de los pasos anteriores de acuerdo con los métodos descritos.

a. Sistemas cerrados

Todos o una parte de cada uno de los pasos de procesamiento pueden realizarse en un sistema cerrado. En aspectos de los métodos, no es necesario que los procesos se realicen en el mismo sistema cerrado, sino que pueden realizarse en un sistema cerrado diferente.

En algunos casos, los métodos para transducir una célula incluyen uno o más de (a) lavar una muestra biológica que contiene células (por ejemplo, una muestra de sangre completa, una muestra de capa leucocitaria, una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), una muestra de células T no fraccionadas, una muestra de linfocitos, una muestra de glóbulos blancos, un producto de aféresis o un producto de leucoféresis) en una cavidad de una cámara, (b) aislar, por ejemplo, seleccionar, de la muestra, un subconjunto deseado o una población de células (por ejemplo, células T CD4+ o CD8+) en una cavidad de una cámara, por ejemplo, mediante incubación de células con un reactivo de selección o de inmunoafinidad para la separación basada en inmunoafinidad; c) incubar las células aisladas, como células seleccionadas, con partículas de vectores virales, como de acuerdo con los métodos descritos anteriormente y d) formular las células transducidas, como en un tampón farmacéuticamente aceptable, crioconservante u otro medio adecuado. En algunos casos, los métodos para transducir una célula pueden incluir además (e) estimular células en una cavidad de una cámara exponiendo las células a condiciones de estimulación, induciendo de este modo a las células para que proliferen. En algunos casos, el paso de estimular las células se realiza antes, durante y/o después de la incubación de las células con partículas de vectores virales. En algunos casos, también pueden llevarse a cabo uno o más pasos adicionales de lavado o suspensión, como dilución, concentración y/o intercambio de tampón de células, antes o después de cualquiera de los pasos anteriores.

Por tanto, en algunos casos, los métodos de transducción de una célula incluyen realizar uno, más o todos los pasos en la preparación de células para uso clínico, por ejemplo, en terapia celular adoptiva, sin exponer las células a condiciones no estériles y sin la necesidad de usar una habitación o armario estéril. En algunos casos de dicho proceso, las células se aíslan, separan o seleccionan, estimulan, transducen, lavan y formulan, todo dentro de un sistema cerrado. En algunos casos, los métodos de transducción de una célula se llevan a cabo de manera automatizada. En algunos casos, uno o más de los pasos se llevan a cabo aparte del sistema cerrado.

b. Muestras y preparaciones de células

En aspectos de los métodos descritos, la población de células incluye células primarias, como una población de células primarias que contienen células T, que se obtienen de un sujeto. En algunos casos, el sujeto es un sujeto mamífero, como un primate, como un humano.

En algunos casos, antes de incubar y/o poner en contacto un vector viral con una población de células, se aísla u obtiene de un sujeto la población de células. Tales células en algunos casos se derivan de muestras, por ejemplo, muestras biológicas, como las obtenidas de un sujeto que se pretende que reciba la terapia adoptiva o de otro sujeto.

En algunos casos, los pasos de procesamiento incluyen el aislamiento de células o composiciones de las mismas a partir de muestras biológicas, como las obtenidas o derivadas de un sujeto, como uno que tiene una enfermedad o afección particular o que necesita una terapia celular o al que se administrará la terapia celular. En algunos aspectos, el sujeto es un humano, como un sujeto que es un paciente que necesita una intervención terapéutica particular, como la terapia celular adoptiva para la que se están aislando, procesando y/o manipulando las células. Por consiguiente, las células en algunos casos son células primarias, por ejemplo, células humanas primarias. Las muestras incluyen tejidos, fluidos y otras muestras tomadas directamente del sujeto, así como muestras resultantes de uno o más pasos de procesamiento, como separación, centrifugación, ingeniería genética (por ejemplo, transducción con vector viral), lavado y/o incubación. La muestra biológica puede ser una muestra obtenida directamente de una fuente biológica o una muestra procesada. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, fluidos corporales, como sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina y sudor, muestras de tejidos y órganos, incluyendo las muestras procesadas derivadas de los mismos.

En algunos aspectos, la muestra es sangre o una muestra derivada de sangre, o es o se deriva de un producto de la aféresis o leucoféresis. Las muestras ejemplares incluyen sangre completa, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), leucocitos, médula ósea, timo, biopsia de tejido, tumor, leucemia, linfoma, ganglio linfático, tejido linfoide asociado al intestino, tejido linfoide asociado a la mucosa, bazo, otros tejidos linfoides, hígado, pulmón, estómago, intestino, colon, riñón, páncreas, mama, hueso, próstata, cuello uterino, testículos, ovarios, amígdala u otro órgano y/o células derivadas de los mismos. Las muestras incluyen, en el contexto de la terapia celular, por ejemplo, terapia celular adoptiva, muestras de fuentes autólogas y alogénicas.

En algunos casos, las células se derivan de líneas celulares, por ejemplo, líneas de células T. Las células en algunos casos se obtienen de una fuente xenogénica, por ejemplo, de ratón, rata, primate no humano y cerdo.

Las muestras generalmente incluyen células T. En algunos ejemplos, las muestras o poblaciones de células T incluyen una población de células T no fraccionadas, células CD4+ no fraccionadas y/o células T CD8+ no fraccionadas, y/o uno o más subtipos de las mismas, como las definidos por la función, carecen de un estado de activación, madurez, potencial de diferenciación, expansión, recirculación, localización y/o capacidades de persistencia, especificidad de antígeno, tipo de receptor de antígeno, presencia en un órgano o compartimento particular, marcador o perfil de secreción de citoquinas, y/o grado de diferenciación o falta de diferenciación. Tales subtipos pueden seleccionarse mediante métodos de selección positivos o negativos.

En algunos casos, el aislamiento de las células incluye uno o más pasos de preparación y/o separación de células basada en la no afinidad. En algunos ejemplos, las células se lavan, centrifugan y/o incuban en presencia de uno o más reactivos, por ejemplo, para eliminar componentes no deseados, enriquecer los componentes deseados, lisar o eliminar células sensibles a reactivos particulares. En algunos ejemplos, las células se separan en base a una o más propiedades, como densidad, propiedades adherentes, tamaño, sensibilidad y/o resistencia a componentes particulares.

En algunos ejemplos, se obtienen células de la sangre circulante de un sujeto, por ejemplo, por aféresis o leucoféresis. Las muestras, en algunos aspectos, contienen linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y/o plaquetas, y en algunos aspectos contienen células distintas de glóbulos rojos y plaquetas.

En algunos casos, los métodos descritos incluyen procesar, total o parcialmente, una o más de las muestras en un sistema cerrado. En algunos casos, el paso de procesamiento puede implicar el lavado de la muestra, por ejemplo, muestra que contiene células sanguíneas, del sujeto, por ejemplo, para eliminar la fracción de plasma y/o reemplazar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores y/o realizar métodos de separación de células basados en la densidad, como en la preparación de glóbulos blancos a partir de sangre periférica lisando los glóbulos rojos y centrifugando a través de un gradiente de Percoll o Ficoll.

En algunos casos, las células sanguíneas recogidas del sujeto se lavan, por ejemplo, para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. En algunos casos, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunos casos, la solución de lavado carece de calcio y/o magnesio y/o muchos o todos los cationes divalentes. En algunos aspectos, se realiza un paso de lavado en una centrífuga de "flujo continuo" semiautomática (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991, Baxter) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos aspectos, se realiza un paso de lavado mediante filtración de flujo tangencial (TFF) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos casos, las células se vuelven a suspender en una variedad de tampones biocompatibles después del lavado, como, por ejemplo, PBS libre de Ca+/Mg++. En ciertos casos, se eliminan los componentes de una muestra de células sanguíneas y las células se vuelven a suspender directamente en medios de cultivo.

En algunos casos, los métodos incluyen métodos de separación de células basados en la densidad, como la preparación de glóbulos blancos a partir de sangre periférica lisando los glóbulos rojos y la centrifugación a través de un gradiente de Percoll o Ficoll.

C. Selección basada en afinidad

Los pasos de procesamiento pueden incluir el aislamiento de células de poblaciones y/o composiciones mixtas, como el uso de uno de varios pasos de selección que incluyen métodos de separación basados en densidad u otros métodos de separación basados en propiedades físicas y selección basada en afinidad. En algunos casos, los métodos de aislamiento incluyen la separación de diferentes tipos de células en base a la expresión o presencia en la célula de una o más moléculas específicas, como marcadores de superficie, por ejemplo, proteínas de superficie, marcadores intracelulares o ácido nucleico. En algunos casos, puede usarse cualquier método conocido para la separación basado en tales marcadores. En algunos casos, la separación es una separación basada en afinidad o inmunoafinidad. Por ejemplo, el aislamiento en algunos aspectos incluye la separación de células y poblaciones celulares en base a la expresión de las células o el nivel de expresión de uno o más marcadores, típicamente marcadores de superficie celular, por ejemplo, por incubación con un anticuerpo o compañero de unión que se une específicamente a tales marcadores, seguido generalmente por pasos de lavado y separación de las células que se han unido al anticuerpo o compañero de unión, de aquellas células que no se han unido al anticuerpo o al compañero de unión.

Tales pasos de separación pueden basarse en la selección positiva, en la que las células que se han unido a los reactivos se conservan para su uso posterior, y/o la selección negativa, en la que se conservan las células que no se han unido al anticuerpo o al compañero de unión. En algunos ejemplos, ambas fracciones se conservan para su uso posterior. En algunos aspectos, la selección negativa puede ser particularmente útil cuando no hay ningún anticuerpo disponible que identifique específicamente un tipo de célula en una población heterogénea, de tal manera que la separación se lleva a cabo mejor en base a marcadores expresados por células distintas de la población deseada.

No es necesario que la separación dé como resultado un enriquecimiento o eliminación del 100% de una población celular particular o células que expresan un marcador particular. Por ejemplo, la selección positiva o el enriquecimiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a aumentar el número o porcentaje de dichas células, pero no necesariamente da como resultado una ausencia total de células que no expresan el marcador. De igual manera, la selección negativa, la eliminación o el agotamiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a la disminución del número o porcentaje de tales células, pero no tiene por qué dar como resultado una eliminación completa de todas esas células.

En algunos ejemplos, se llevan a cabo múltiples rondas de pasos de separación, donde la fracción seleccionada positiva o negativamente de un paso se somete a otro paso de separación, como una selección positiva o negativa posterior. En algunos ejemplos, un solo paso de separación puede agotar las células que expresan múltiples marcadores simultáneamente, como incubando células con una pluralidad de anticuerpos o compañeros de unión, cada uno específico para un marcador objetivo de selección negativa. De igual manera, pueden seleccionarse positivamente simultáneamente múltiples tipos de células incubando células con una pluralidad de anticuerpos o compañeros de unión expresados en los varios tipos de células.

En algunos casos, las células incluyen uno o más subconjuntos de células T u otros tipos de células, como poblaciones de células T completas, células CD4+, células CD8+ y subpoblaciones de las mismas, como las definidas por función, estado de activación, madurez, potencial para capacidades de diferenciación, expansión, recirculación, localización y/o persistencia, especificidad de antígeno, tipo de receptor de antígeno, presencia en un órgano o compartimento particular, marcador o perfil de secreción de citoquinas y/o grado de diferenciación. Con referencia a un sujeto a tratar, las células pueden ser alogénicas y/o autólogas. Entre los métodos se incluyen métodos listos para su uso. En algunos aspectos, como en el caso de las tecnologías listas para su uso, las células son pluripotentes y/o multipotentes, como las células madre, como las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En algunos casos, los métodos incluyen aislar células del sujeto, prepararlas, procesarlas, cultivarlas y/o manipularlas, y reintroducirlas en el mismo paciente, antes o después de la crioconservación, y/o antes o después de probar virus competentes para la replicación.

Entre los subtipos y subpoblaciones de células T y/o de células T CD4+ y/o de células T CD8+ se encuentran las células T no tratadas (Tⁿ), células Tefectoras (T ^eff), células T de memoria y subtipos de las mismas, como células T de memoria de células madre (T^scm), T de memoria central (T^cm), T de memoria efectora (T ^em), o T de memoria efectoras diferenciadas terminalmente, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células T inmaduras, células T maduras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT), células T reguladoras (Treg) naturales y adaptativas, células T auxiliares, como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH9, células ^tH22, células T auxiliares foliculares, células T alfa/beta y células T delta/gamma.

En algunos casos, las células T se separan de una muestra de PBMC u otra muestra mediante la selección negativa de marcadores expresados en células que no son T, como células B, monocitos u otros glóbulos blancos. En algunos casos, las células T pueden enriquecerse a partir de una población de células mediante métodos de selección negativa para seleccionar células que no son T de la población en base a la expresión superficial de uno o más de los marcadores CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD34., CD36, CD56, CD123 y CD235a. En algunos casos, se realiza la selección de células T pan, como por ejemplo mediante el uso de un kit de aislamiento de células T Pan disponible comercialmente contra un cóctel de marcadores (por ejemplo, Miltenyi N° 130-096-535). Tal estrategia de selección proporciona una población de células T que no han sido tocadas por un anticuerpo u otro reactivo usado en el proceso de selección.

En algunos aspectos, se usa un paso de selección de CD4+ y/o CD8+ para separar las células T auxiliares CD4+ y las células T citotóxicas CD8+. En algunos casos, se realiza un paso de selección de CD4+. En algunos casos, se realiza un paso de selección de CD8+.

En algunos casos, dichas poblaciones de CD4+ y CD8+ pueden clasificarse adicionalmente en subpoblaciones mediante selección positiva o negativa para marcadores expresados o expresados en un grado relativamente mayor en una o más subpoblaciones de células T efectoras, de memoria y/o no tratadas. Por ejemplo, en algunos aspectos, se aíslan las subpoblaciones específicas de células T, como las células positivas o negativas para uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD4, CD8, CD45RA y/o CD45RO, mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, pueden seleccionarse una o más poblaciones de células T no tratadas (por ejemplo, uno o más marcadores CD45RO-, CD44bajo, CD62Lalto), de memoria (por ejemplo, uno o más marcadores CD45RO+, CCR7+, CD27+, CD28+ y/o CD62L+) y/o efectoras (por ejemplo, uno o más marcadores CD45RO+, CD62L-, CCR7-).

En algunos casos, los métodos no comprenden la selección y/o el enriquecimiento de células T efectoras. En algunos casos, los métodos comprenden eliminar o agotar las células T efectoras de la población celular.

En algunos casos, las células CD8+ se enriquecen adicionalmente o se agotan en células madre de memoria central, memoria efectora, memoria central y/o no tratadas, como por selección positiva o negativa basada en antígenos de superficie asociados con la subpoblación respectiva. En algunos casos, el enriquecimiento de células T de memoria central (Tcm) se lleva a cabo para aumentar la eficacia, como mejorar la supervivencia a largo plazo, la expansión y/o el injerto después de la administración, que en algunos aspectos es particularmente sólido en tales subpoblaciones. VerTerakura et al. (2012) Blood. 1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701. En algunos casos, la combinación de células T CD8+ y células T CD4+ enriquecidas con T^cmmejora adicionalmente la eficacia.

En algunos casos, las células T de memoria están presentes tanto en subconjuntos CD62L+ como en CD62L- de linfocitos de sangre periférica CD8+. Las PBMC pueden enriquecerse o empobrecerse en fracciones de CD62L-CD8+ y/o CD62L+CD8+, como usando anti-CD8 y anti-CD62L.

En algunos casos, el enriquecimiento de las células T de memoria central (T^cm) se basa en una expresión superficial alta o positiva de CD45R^o, CD62L, CCR7, CD28, CD3 y/o CD 127; en algunos aspectos, se basa en la selección negativa de células que expresan o expresan mucho CD45RA y/o granzima B. En algunos aspectos, el aislamiento de una población de CD8+ enriquecida en células T^cmse lleva a cabo mediante el agotamiento de las células que expresan CD4, CD14, CD45RA y selección positiva o enriquecimiento de células que expresan CD62L. En un aspecto, el enriquecimiento de las células T de memoria central (Tcm) se lleva a cabo a partir de una fracción negativa de células seleccionadas en base a la expresión de CD4, que se somete a una selección negativa basada en la expresión de CD14 y CD45RA, y una selección positiva basada en CD62L. Tales selecciones en algunos aspectos se realizan simultáneamente y en otros aspectos se realizan secuencialmente, en cualquier orden. En algunos aspectos, para generar la población o subpoblación de células CD4+ también se usa el mismo paso de selección basado en la expresión de CD4 que se usa para preparar la población o subpoblación de células CD8+, de tal manera que se conservan tanto las fracciones positivas como las negativas de la separación basada en CD4 y usan en pasos posteriores de los métodos, opcionalmente después de uno o más pasos de selección positivos o negativos adicionales.

En un ejemplo particular, una muestra de PBMC u otra muestra de glóbulos blancos se somete a selección de células CD4+, donde se conservan tanto las fracciones negativas como las positivas. La fracción negativa luego se somete a selección negativa basada en la expresión de CD14 y CD45RA o CD19, y selección positiva basada en un marcador característico de las células T de memoria central, como CD62L o CCR7, donde las selecciones positivas y negativas se llevan a cabo en cualquier orden.

Las células auxiliares T CD4+ se clasifican en células no tratadas, de memoria central y efectoras mediante la identificación de poblaciones celulares que tienen antígenos de superficie celular. Los linfocitos CD4+ pueden obtenerse mediante métodos estándar. En algunos casos, los linfocitos T CD4+ no tratados son células T CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+. En algunos casos, las células CD4+ de la memoria central son CD62L+ y CD45RO+. En algunos casos, las células CD4+ efectoras son CD62L- y CD45RO-. En algunos casos, los métodos no comprenden la selección y/o el enriquecimiento para células T CD4+ efectoras. En algunos casos, los métodos comprenden eliminar o agotar las células T CD4+ efectoras de la población celular.

En un ejemplo, para enriquecer células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales típicamente incluye anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. En algunos casos, el anticuerpo o el compañero de unión se une a un soporte sólido o matriz, como una perla magnética o una perla paramagnética, para permitir la separación de células para selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, en algunos casos, las células y las poblaciones celulares se separan o aíslan usando técnicas de separación inmunomagnéticas (o magnéticas por afinidad) (revisadas en Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Editado por: S.A. Brooks y U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).

En algunos aspectos, la selección se lleva a cabo mediante una selección basada en la afinidad incubando la muestra o las células con un material magnetizable o magnéticamente sensible, como partículas o micropartículas magnéticamente sensibles, como perlas paramagnéticas (por ejemplo, como Dynalbeads o perlas MACS). El material magnéticamente sensible, por ejemplo, una partícula, generalmente se une directa o indirectamente a un compañero de unión, por ejemplo, un anticuerpo, que se une específicamente a una molécula, por ejemplo, un marcador de superficie, presente en la célula, células o población de células que se desea separar, por ejemplo, que se desea seleccionar negativa o positivamente.

En algunos casos, la partícula o perla magnética comprende un material magnéticamente sensible unido a un elemento de unión específico, como un anticuerpo u otro compañero de unión. Hay muchos materiales magnéticamente sensibles bien conocidos que se usan en los métodos de separación magnética. Las partículas magnéticas adecuadas incluyen las descritas en Molday, Patente de Estados Unidos N° 4.452.773, y en la Memoria descriptiva de la Patente Europea EP 452342B. Las partículas de tamaño coloidal, como las descritas en Owen Patente de Estados Unidos N° 4.795.698, y Liberti et al., Patente de Estados Unidos N° 5.200.084 son otros ejemplos.

El paso de incubación generalmente se lleva a cabo en condiciones en las que los anticuerpos, otros compañeros de unión o moléculas, como anticuerpos secundarios u otros reactivos, que se unen específicamente a tales anticuerpos o compañeros de unión, que están unidos a la partícula o perla magnética, se unen específicamente a las moléculas de la superficie celular si están presentes en las células dentro de la muestra.

En algunos aspectos, la muestra se coloca en un campo magnético, y aquellas células que tienen partículas magnéticamente sensibles o magnetizables unidas a ellas serán atraídas por el imán y separadas de las células no marcadas. Para la selección positiva, se conservan las células que son atraídas por el imán; para la selección negativa, se conservan las células que no son atraídas (células no marcadas). En algunos aspectos, se realiza una combinación de selección positiva y negativa durante el mismo paso de selección, donde las fracciones positivas y negativas se conservan y se procesan adicionalmente o se someten a pasos de separación adicionales.

En ciertos casos, las partículas magnéticamente sensibles están recubiertas en anticuerpos primarios u otros compañeros de unión, anticuerpos secundarios, lectinas, enzimas o estreptavidina. En ciertos casos, las partículas magnéticas se unen a las células a través de un recubrimiento de anticuerpos primarios específicos para uno o más marcadores. En determinados casos, las células, en lugar de las perlas, se marcan con un anticuerpo primario o un compañero de unión y luego se añaden partículas magnéticas recubiertas con un anticuerpo secundario específico de tipo celular u otro compañero de unión (por ejemplo, estreptavidina). En ciertos casos, se usan partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina junto con anticuerpos primarios o secundarios biotinilados.

En algunos casos, las partículas magnéticamente sensibles se dejan adheridas a las células que se van a incubar, cultivar y/o manipular posteriormente; en algunos aspectos, las partículas se dejan unidas a las células para su administración a un paciente. En algunos casos, se eliminan de las células las partículas magnetizables o magnéticamente sensibles. Se conocen métodos para eliminar partículas magnetizables de las células e incluyen, por ejemplo, el uso de anticuerpos competitivos no marcados, partículas magnetizables o anticuerpos conjugados con conectores escindibles, etc. En algunos casos, las partículas magnetizables son biodegradables.

En algunos casos, la selección basada en la afinidad se realiza a través de clasificación celular activada magnéticamente (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Los sistemas de clasificación celular activada magnéticamente (MACS) son capaces de una selección de alta pureza de células que tienen partículas magnetizadas unidas a las mismas. En ciertos casos, la MACS funciona en un modo en el que las especies objetivo y no objetivo se eluyen secuencialmente después de la aplicación del campo magnético externo. Es decir, las células unidas a las partículas magnetizadas se mantienen en su lugar mientras que las especies no unidas se eluyen. Luego, después de que se completa este primer paso de elución, las especies que quedaron atrapadas en el campo magnético y se les impidió eluir se liberan de alguna manera para que puedan eluirse y recuperarse. En ciertos casos, las células no objetivo se marcan y agotan de la población heterogénea de células.

En ciertos casos, el aislamiento o separación se lleva a cabo usando un sistema, dispositivo o aparato que lleva a cabo uno o más de los pasos de aislamiento, preparación celular, separación, procesamiento, incubación, cultivo y/o formulación de los métodos. En algunos aspectos, el sistema se usa para llevar a cabo cada uno de estos pasos en un ambiente cerrado o estéril, por ejemplo, para minimizar el error, la manipulación por parte del usuario y/o la contaminación. En un ejemplo, el sistema es un sistema como se describe en la Solicitud de Patente Internacional, Número de Publicación WO2009/072003, o la Publicación de Estados Unidos Número 20110003380 A1.

En algunos casos, el sistema o aparato lleva a cabo uno o más, por ejemplo, todos los pasos de preparación, selección, cultivo, manipulación y/o formulación en un sistema integrado o autónomo, y/o de una manera automatizada o programable. En algunos aspectos, el sistema o aparato incluye un ordenador y/o programa informático en comunicación con el sistema o aparato, que permite al usuario programar, controlar, evaluar el resultado y/o ajustar varios aspectos de los pasos de procesamiento, aislamiento, manipulación y formulación.

En algunos aspectos, la separación y/u otros pasos se llevan a cabo usando el sistema CliniMACS (Miltenyi Biotic), por ejemplo, para la separación automatizada de células a nivel de escala clínica en un sistema cerrado y estéril. Los componentes pueden incluir un microordenador integrado, una unidad de separación magnética, una bomba peristáltica y varias válvulas de pinza. El ordenador integrado en algunos aspectos controla todos los componentes del instrumento y dirige el sistema para realizar procedimientos repetidos en una secuencia estandarizada. La unidad de separación magnética en algunos aspectos incluye un imán permanente móvil y un soporte para la columna de selección. La bomba peristáltica controla el caudal en todo el conjunto de tubos y, junto con las válvulas de pinza, asegura el flujo controlado de tampón a través del sistema y la suspensión continua de las células.

En algunos aspectos el sistema CliniMACS usa partículas magnetizables acopladas a anticuerpos que se suministran en una solución estéril no pirogénica. En algunos casos, después de marcar las células con partículas magnéticas, las células se lavan para eliminar el exceso de partículas. Luego se conecta una bolsa de preparación de células al conjunto de tubos, que a su vez se conecta a una bolsa que contiene tampón y una bolsa de recogida de células. El conjunto de tubos consiste de tubos estériles preensamblados, que incluyen una precolumna y una columna de separación, y son de un solo uso. Después de iniciar el programa de separación, el sistema aplica automáticamente la muestra de células en la columna de separación. Las células marcadas se retienen dentro de la columna, mientras que las células no marcadas se eliminan mediante una serie de pasos de lavado. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente no están marcadas y no se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente están marcadas y se retienen en la columna. En algunos casos, las composiciones para su uso con los métodos descritos en la presente se eluyen de la columna después de eliminar el campo magnético y se recogen dentro de la bolsa de recogida de células.

En ciertos casos, la separación y/u otros pasos se realizan mediante el sistema CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). En algunos aspectos el sistema CliniMACS Prodigy está equipado con una unidad de procesamiento celular que permite el lavado y fraccionamiento automático de células por centrifugación. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara integrada y un software de reconocimiento de imágenes que determina el punto final de fraccionamiento celular óptimo discerniendo las capas macroscópicas del producto celular de origen. Por ejemplo, la sangre periférica se separa automáticamente en capas de eritrocitos, glóbulos blancos y plasma. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara de cultivo celular integrada que lleva a cabo protocolos de cultivo celular como, por ejemplo, diferenciación y expansión celular, carga de antígenos y cultivo celular a largo plazo. Los puertos de entrada pueden permitir la extracción y la reposición estériles de medios y las células pueden monitorizarse usando un microscopio integrado. Ver, por ejemplo, Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82, y Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.

En algunos casos, la separación o selección se lleva a cabo mediante citometría de flujo, en la que las células teñidas para múltiples marcadores de superficie celular se transportan en una corriente fluídica. En algunos casos, se recoge y enriquece (o agota) una población celular descrita en la presente mediante clasificación a escala preparativa (FACS). En ciertos casos, una población de células descrita en la presente se recoge y enriquece (o agota) mediante el uso de chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS) en combinación con un sistema de detección basado en FACS (ver, por ejemplo, WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; y Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376. En ambos casos, las células pueden marcarse con múltiples marcadores, lo que permite el aislamiento de subconjuntos de células T bien definidos con alta pureza.

En algunos casos, los anticuerpos o compañeros de unión se marcan con uno o más marcadores detectables, para facilitar la separación para selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, la separación puede basarse en la unión a anticuerpos marcados con fluorescencia. En algunos ejemplos, la separación de células basada en la unión de anticuerpos u otros compañeros de unión específicos para uno o más marcadores de superficie celular se lleva a cabo en una corriente fluídica, como por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), incluyendo FACS a escala preparativa y/o chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS), por ejemplo, en combinación con un sistema de detección de citometría de flujo. Tales métodos permiten la selección positiva y negativa basada en múltiples marcadores simultáneamente.

d. Congelación y crioconservación

En algunos casos, los métodos descritos incluyen passo para congelar, por ejemplo, crioconservar, las células, ya sea antes o después de la preparación, el cultivo y/o la manipulación. En algunos casos, las células se congelan mientras se prueba una muestra de tales células para detectar virus competentes en la replicación. En algunos casos, el paso de congelación y posterior descongelación elimina los granulocitos y, hasta cierto punto, los monocitos en la población celular. En algunos casos, las células se suspenden en una solución de congelación, por ejemplo, después de un paso de lavado para eliminar el plasma y las plaquetas. En algunos aspectos puede usarse cualquiera de una variedad de soluciones y parámetros de congelación conocidos. Un ejemplo implica el uso de PBS que contiene un 20% de DMSO y un 8% de albúmina de suero humano (HSA), u otro medio de congelación celular adecuado. Luego esto se diluye 1:1 con medios para que la concentración final de DMSO y HSA sea del 10% y del 4%, respectivamente. Luego, las células se congelan a -80° C a una velocidad de 1° C por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. En algunos casos, las células se congelan, por ejemplo, se crioconservan, ya sea antes, durante o después de dichos métodos para evaluar las células en busca de virus competentes en la replicación. En algunos casos, las células se congelan, por ejemplo, se crioconservan, ya sea antes, durante o después de dichos métodos de procesamiento.

e. Incubación de partículas de vectores virales con células

En algunos aspectos, las células, por ejemplo, una población de células, como una población de células obtenida y/o aislada como se describe, pueden ser o han sido incubadas y/o puestas en contacto con una partícula de vector viral en condiciones que permiten la transferencia génica. En cualquiera de estos casos, la partícula del vector viral se incuba y/o se pone en contacto con la población de células en condiciones, por ejemplo entrada viral, que permiten la transferencia de la partícula viral a la célula y/o la expresión del ácido nucleico que codifica el molécula recombinante y/o heteróloga, por ejemplo, receptor recombinante, como un CAR, en la célula.

Se conocen métodos de transducción viral, como transducción gammaretroviral o lentiviral. Los métodos ejemplares se describen, por ejemplo, en Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; y Cavalieri et al. (2003) Blood.

102(2): 497-505.

En algunos casos, la población de células puede ser una población de células que se ha sometido previamente a crioconservación.

La composición que contiene las partículas y células del vector viral durante el paso de transducción puede incluir además uno o más agentes adicionales, como los que promueven la eficiencia de la transducción, como policationes que incluyen protamina (por ejemplo, sulfato de protamina), bromuro de hexadimetrina (POLYBRENE®, Abbott Laboratories Corp) y CH-296 (RETRONECTIN®, Clontech). En algunos casos, el policatión puede estar presente en la composición de entrada a una concentración final de 1 pg/ml a 100 pg/ml, como 5 pg/ml a 50 pg/ml. La composición también puede incluir medios, incluyendo el medio de cultivo celular, incluyendo el medio diseñado para el cultivo del tipo celular a procesar, como el medio de células madre hematopoyéticas, por ejemplo, medio libre de suero.

En algunos casos, la transducción puede lograrse a una multiplicidad de infección (MOI) de menos de 100, como generalmente menos de 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 o menos.

En algunos casos, las células pueden ser o han sido transducidas y/o manipuladas genéticamente con un ácido nucleico que codifica un receptor recombinante, como un receptor quimérico, como un receptor de antígeno, por ejemplo, un CAR o un TCR transgénico. En algunos aspectos, se transducen con el ácido nucleico por lo menos el 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50% o más células T.

F. Cultivo y estimulación

En algunos casos, las células se estimulan y/o proliferan y/o expanden en conexión con o posteriormente a la manipulación genética. En algunos casos, los pasos de procesamiento incluyen incubaciones de células, como células seleccionadas y/o células transducidas, en las que los pasos de incubación pueden incluir cultivo, cultivo, estimulación, activación y/o propagación de células. En algunos casos, las composiciones o células se incuban en presencia de condiciones estimulantes o un agente estimulador. Tales condiciones incluyen aquellas diseñadas para inducir la proliferación, expansión, activación y/o supervivencia de las células en la población, para imitar la exposición al antígeno y/o preparar las células para ingeniería genética, como para la introducción de un receptor de antígeno recombinante.

En algunos casos, se estimulan o activan células aisladas, como poblaciones de células seleccionadas. En algunos casos, los pasos de procesamiento incluyen la incubación de una composición que contiene las células en condiciones de estimulación. La incubación puede ser previa o relacionada con la ingeniería genética, como la ingeniería genética resultante de casos del método de transducción descrito anteriormente. En algunos casos, la estimulación da como resultado la activación y/o proliferación de las células, por ejemplo, antes de la transducción.

En algunos casos, la proliferación y/o expansión se realiza posteriormente a la transducción para cultivar las células transducidas en cantidades suficientes para aplicaciones clínicas. En algunos casos, las células transducidas se incuban o cultivan en condiciones para inducir la expansión durante por lo menos 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días. días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días o más. En algunos casos, las células se expanden mediante cultivo durante de 7 a 10 días. En algunos casos, la incubación o el cultivo de células se lleva a cabo a una temperatura de o aproximadamente 37° C ± 2° C o aproximadamente en presencia de uno o más agentes estimulantes.

En algunos casos, las condiciones para la estimulación y/o activación pueden incluir uno o más medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones y/o factores estimuladores, como citoquinas, quimiocinas, antígenos, compañeros de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes y cualquier otro agente diseñado para activar las células.

En algunos casos, las condiciones o agentes estimulantes incluyen uno o más agentes, por ejemplo, un ligando, que es capaz de activar un dominio de señalización intracelular de un complejo TCR. En algunos aspectos, el agente activa o inicia la cascada de señalización intracelular de TCR/CD3 en una célula T. Tales agentes pueden incluir anticuerpos, como los específicos de un TCR, por ejemplo, anti-CD3. En algunos casos, las condiciones de estimulación incluyen uno o más agentes, por ejemplo, un ligando, que es capaz de estimular un receptor coestimulador, por ejemplo, anti-CD28. En algunos casos, tales agentes y/o ligandos pueden estar unidos a un soporte sólido como una perla y/o una o más citoquinas. Opcionalmente, el método de expansión puede comprender además el paso de añadir anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 al medio de cultivo (por ejemplo, a una concentración de por lo menos aproximadamente 0,5 ng/ml). En algunos casos, los agentes de estimulación incluyen IL-2, IL-15 y/o IL-7. En algunos aspectos, la concentración de IL-2 es de por lo menos unas 10 unidades/ml.

En algunos casos, las células T se expanden añadiendo a la composición células alimentadoras, como células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que no se dividen (por ejemplo, de tal manera que la población resultante de células contenga por lo menos aproximadamente 5, 10, 20 o 40 o más células alimentadoras de PBMC por cada linfocito T en la población inicial a expandir); e incubar el cultivo (por ejemplo, durante un tiempo suficiente para expandir el número de células T). En algunos aspectos, las células alimentadoras que no se dividen pueden comprender células alimentadoras de PBMC irradiadas con rayos gamma. En algunos casos, las PBMC se irradian con rayos gamma en el intervalo de aproximadamente 3000 a 3600 rads para evitar la división celular. En algunos aspectos, las células alimentadoras se añaden al medio de cultivo antes de añadir las poblaciones de células T.

En algunos casos, las condiciones de estimulación generalmente incluyen una temperatura adecuada para el crecimiento de linfocitos T humanos, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 25 grados Celsius, generalmente por lo menos aproximadamente 30 grados y generalmente aproximadamente 37 grados Celsius. Opcionalmente, la incubación puede comprender además la adición de células linfoblastoides (LCL) transformadas por EBV que no se dividen como células alimentadoras. Las LCL pueden irradiarse con rayos gamma en el intervalo de aproximadamente 6000 a 10,000 rads. Las células alimentadoras LCL en algunos aspectos se proporcionan en cualquier cantidad adecuada, como una proporción de células alimentadoras LCL a linfocitos T iniciales de por lo menos aproximadamente 10:1.

En algunos casos, las células T específicas de antígeno, como las células T CD4+ y/o CD8+ específicas de antígeno, se obtienen estimulando linfocitos T no tratados o específicos de antígeno con antígeno. Por ejemplo, pueden generarse líneas o clones de células T específicas de antígeno para antígenos de citomegalovirus aislando células T de sujetos infectados y estimulando las células in vitro con el mismo antígeno.

En algunos casos, por lo menos una parte de la incubación con una o más condiciones de estimulación o agentes estimuladores, como cualquiera de los descritos anteriormente, se realiza en un sistema cerrado.

En algunos casos, la duración total de la incubación con el agente estimulante es de o de aproximadamente 1 hora y 72 horas, 1 hora y 48 horas, 4 horas y 36 horas, 8 horas y 30 horas o 12 horas y 24 horas, como por lo menos o aproximadamente por lo menos 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas o 72 horas. En algunos casos, la duración total de la incubación es de o de aproximadamente 5 minutos a 6 horas, como de 30 minutos a 3 horas, por ejemplo, por lo menos o aproximadamente por lo menos 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos o 180 minutos.

En algunos casos, la población de células transducidas con una partícula de vector viral se somete a uno o más pasos y/o selecciones para enriquecer las células manipuladas genéticamente. Por ejemplo, en algunos aspectos, puede usarse un marcador de transducción dentro del vector viral para confirmar la transducción o manipulación de la célula para expresar el receptor y/o la selección de las células manipuladas que expresan el receptor. En algunos aspectos, dicho marcador puede estar codificado por un ácido nucleico o polinucleótido diferente, que también puede introducirse durante el proceso de manipulación genética, típicamente mediante el mismo método, por ejemplo, transducción por el mismo vector o tipo de vector.

5. Formulación

En algunos casos, los pasos del proceso pueden incluir la formulación de células, como la formulación de células manipuladas genéticamente resultantes de los pasos de procesamiento de transducción proporcionados y/o uno o más de otros pasos de procesamiento como se describe. En algunos casos, las células se formulan como un producto farmacéutico formulado (FDP). En algunos casos, los métodos descritos asociados con la formulación de células incluyen procesar células transducidas, como células transducidas y/o expandidas usando los pasos de procesamiento descritos anteriormente, en un sistema cerrado.

En algunos casos, las células se formulan en un tampón farmacéuticamente aceptable que, en algunos aspectos, puede incluir un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, el procesamiento incluye el intercambio de un medio en un medio o tampón de formulación que sea farmacéuticamente aceptable o deseable para la administración a un sujeto. En algunos casos, los pasos de procesamiento pueden implicar el lavado de las células transducidas y/o expandidas para reemplazar las células en un tampón farmacéuticamente aceptable que puede incluir uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables opcionales. Un ejemplo de tales formas farmacéuticas, incluyendo los portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables, puede ser cualquiera de las descritas a continuación junto con las formas aceptables para administrar las células y las composiciones a un sujeto. En algunos casos la composición farmacéutica contiene las células en cantidades eficaces para tratar o prevenir la enfermedad o afección, como un cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz.

En algunos casos, el tampón de formulación contiene un crioconservante. En algunos casos, las células se formulan con una solución crioconservante que contiene una solución de DMSO del 1,0% al 30%, como una solución de DMSO del 5% al 20% o una solución de DMSO del 5% al 10%. En algunos casos, la solución de crioconservación es o contiene, por ejemplo, PBS que contiene un 20% de DMSO y un 8% de albúmina de suero humano (HSA), u otro medio de congelación celular adecuado. En algunos casos, la solución crioconservante es o contiene, por ejemplo, por lo menos o aproximadamente un 7,5% de DMSO. En algunos casos, los pasos de procesamiento pueden implicar el lavado de las células transducidas y/o expandidas para reemplazar las células en una solución crioconservante.

En algunos casos, el procesamiento puede incluir la dilución o concentración de las células a una concentración o cantidad deseadas, como composiciones en forma de dosis unitaria que incluyen el número de células para administración en una dosis dada o fracción de la misma. En algunos casos, los pasos de procesamiento pueden incluir una reducción de volumen para aumentar de este modo la concentración de células según se desee. En algunos casos, los pasos de procesamiento pueden incluir una adición de volumen para disminuir de este modo la concentración de células según se desee.

En algunos casos, el procesamiento incluye añadir un volumen de un tampón de formulación a las células transducidas y/o expandidas. En algunos casos, el volumen del tampón de formulación es de aproximadamente 10 ml a 1000 ml, como por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente 50 ml, 100 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600 ml. ml, 700 ml, 800 ml, 900 ml o 1000 ml.

En algunos casos, el sistema cerrado, como el asociado con un sistema de procesamiento celular, puede expresar las células de proceso en un número deseado o una pluralidad de recipientes de salida, por ejemplo, bolsas. En algunos aspectos, las células pueden expresarse en una o más de la pluralidad de bolsas de salida en una cantidad para administración de dosificación, como para una administración de dosificación única o administración de dosificación múltiple. Por ejemplo, en algunos casos, las bolsas de salida pueden contener cada una el número de células para administración en una dosis dada o fracción de la misma. Por tanto, cada bolsa, en algunos aspectos, puede contener una única dosis unitaria para su administración o puede contener una fracción de una dosis deseada de tal manera que más de una de la pluralidad de bolsas de salida, como dos de las bolsas de salida, o 3 de las bolsas de salida, en conjunto constituyen una dosis para su administración.

Por tanto, los recipientes, por ejemplo, bolsas, contienen generalmente las células a administrar, por ejemplo, una o más dosis unitarias de las mismas. La dosis unitaria puede ser una cantidad o número de células a administrar al sujeto o dos veces el número (o más) de las células a administrar. Puede ser la dosis más baja o la dosis más baja posible de las células que se administrarían al sujeto.

En algunos casos, cada uno de los recipientes, por ejemplo, bolsas, comprende individualmente una dosis unitaria de las células. Por tanto, en algunos casos, cada uno de los recipientes comprende el mismo, o aproximadamente o sustancialmente, el mismo número de células. En algunos casos, la dosis unitaria incluye menos de aproximadamente 1 x 108, menos de aproximadamente 5 x 107, menos de aproximadamente 1 x 106 o menos de aproximadamente 5 x 105 de células, por kg del sujeto a tratar y/o del que se han derivado las células. En algunos casos, cada dosis unitaria contiene por lo menos o aproximadamente por lo menos 1 x 106, 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107 o 1 x 108 células manipuladas, células totales, células T o PBMC. En algunos casos, el volumen de la composición celular formulada en cada bolsa es de 10 ml a 100 ml, como por lo menos o aproximadamente por lo menos 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml o 100 ml.

En algunos casos, pueden usarse una o más de la pluralidad de bolsas de salida para realizar pruebas, como para detectar vectores competentes de replicación o evaluar la eficiencia de transducción. Los vectores competentes en la replicación pueden detectarse usando cualquiera de los métodos descritos en la presente. La eficacia de la transducción en algunos aspectos puede evaluarse midiendo el nivel de expresión de una proteína recombinante, como una proteína heteróloga, codificada por un ácido nucleico contenido en el genoma de la partícula del vector viral después de la transducción usando casos de los métodos descritos. Por tanto, en algunos casos, el nivel de expresión de las moléculas recombinantes puede evaluarse mediante cualquiera de una serie de métodos bien conocidos, como la detección mediante métodos basados en afinidad, por ejemplo, métodos basados en inmunoafinidad, por ejemplo, en el contexto de proteínas de la superficie celular, como por citometría de flujo. En algunos aspectos, las células contenidas en uno o más de la pluralidad de recipientes, por ejemplo, bolsas, se analizan para determinar el nivel de expresión de moléculas recombinantes mediante la detección de un marcador de transducción y/o un constructo informador. En otros casos, la expresión se evalúa usando un ácido nucleico que codifica una proteína de superficie truncada incluida dentro del vector como marcador.

V DEFINICIONES

El término "vector", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está enlazado. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están enlazados operativamente. Atales vectores se hace referencia en la presente como "vectores de expresión". Entre los vectores se encuentran vectores virales, como vectores retrovirales, por ejemplo, gammaretrovirales y lentivirales.

Los términos "célula huésped", "línea celular huésped" y "cultivo de células huésped" se usan indistintamente y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la progenie de tales células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de la misma sin tener en cuenta el número de pases. La progenie puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, pero puede contener mutaciones. En la presente se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la examinada o seleccionada en la célula transformada originalmente.

Como se usan en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, "un" o "uno" significa "por lo menos uno" o "uno o más". Se entiende que los aspectos y variaciones descritos en la presente incluyen "que consisten" y/o "que consisten esencialmente de" aspectos y variaciones.

A lo largo de esta divulgación, varios aspectos de la materia reivindicada se presentan en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible en el alcance de la materia reivindicada. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, está incluido dentro de la materia reivindicada. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también están incluidos dentro de la materia reivindicada, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la materia reivindicada. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

El término "aproximadamente" como se usa en la presente se refiere al intervalo de error habitual para el valor respectivo fácilmente conocido por el experto en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) realizaciones que están dirigidas a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

Como se usa en la presente, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos, sustancias o compuestos, incluyendo células. Puede ser una solución, suspensión, líquido, polvo, una pasta, acuoso, no acuoso o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en la presente, un "sujeto" es un mamífero, como un humano u otro animal, y típicamente es un humano.

VI. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen únicamente con propósitos ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la invención.

Ejem plo 1: Ensayo ejem plar que evalúa niveles de parám etros indicativos de objetivos de ARN viral, com o env de G aLV y/o gag de MM LV

Este ejemplo describe un método ejemplar para evaluar un nivel de uno o más parámetros en una muestra de prueba indicativos de la presencia, ausencia, nivel u otra lectura de ARN viral y/o presencia o riesgo existente o potencial de retrovirus competentes en la replicación (RCR) en una muestra biológica. La muestra biológica generalmente incluye por lo menos una célula, como una célula que comprende un ácido nucleico heterólogo o un ácido nucleico que codifica todo o parte de un producto génico heterólogo, como un ácido nucleico y/o proteína heterólogos, exógenos y/o recombinantes. En algunos aspectos, dichas células se han sometido a la introducción de ácidos nucleicos u otras biomoléculas, generalmente codificadas por y/o contenidas en un vector retroviral, partícula de vector retroviral o retrovirus, como por transducción. La muestra de prueba generalmente comprende ARN, o producto producido a partir del mismo, como ADNc, habiéndose aislado el ARN de o estando presente en la célula o células en la muestra biológica, como las células transducidas con una partícula de vector viral que comprende un producto génico heterólogo. La célula o células en la muestra biológica pueden ser células de mamífero, como células humanas.

En un aspecto del método, la detección del parámetro es o incluye la presencia o ausencia o la cantidad o cantidad relativa de un ARN o ácido nucleico de env de GaLV transcrito o codificado por el mismo, o un parámetro que es un sustituto, por ejemplo, que se correlaciona inversamente o positivamente con dicho ARN, ya sea en la muestra de prueba o en la biológica. En algunos aspectos, el nivel de dicho parámetro sirve como marcador para la determinación del potencial, riesgo, presencia o ausencia de RCR en la muestra. En general, el gen env de GaLV codifica una proteína de envoltura viral presente en retrovirus competentes en la replicación y en algunos aspectos se requiere o es necesario, pero no suficiente, para virus competentes en la replicación o competencia de replicación de los mismos.

En algunos aspectos, del método, el nivel del parámetro es o incluye la presencia o ausencia o la cantidad de un ARN de gag de MMLV, o ácido nucleico u otro producto transcrito o codificado por el mismo, o un parámetro que es un sustituto de dicho ARN o ácido nucleico, por ejemplo, que se correlaciona inversa o positivamente con dicho ARN, ya sea en la muestra de prueba o en la biológica. En algunos aspectos, el nivel de dicho parámetro sirve como marcador para la determinación del potencial, riesgo, presencia o ausencia de RCR en la muestra. En general, el gen gag de MMLV codifica una proteína viral que comprende proteínas de la matriz viral, cápside y nucleocápside, y en algunos aspectos se requiere o es necesario, pero no suficiente, para la replicación del virus competente en la replicación o competencia de replicación del mismo.

En algunos aspectos, un nivel, presencia, cantidad, concentración, ausencia o cantidad o concentración relativa de cada uno o más de los ARN virales, como el ARN de env de GaLV o el ARN de gag de MMLV, se indica o determina mediante un nivel de un parámetro correspondiente en la muestra de prueba, donde el parámetro se correlaciona inversa o positivamente con el nivel, presencia, cantidad, concentración, ausencia o cantidad o concentración relativa del ARN respectivo, por ejemplo, en la muestra de prueba y/o en la biológica.

En general, las células transducidas que albergan RCR pueden transcribir varios genes virales requeridos para la producción de partículas virales infecciosas, como las requeridas para virus competentes en la replicación. En general, tales genes (y/o un número o grupo suficiente de tales genes) están presentes o no en los ácidos nucleicos heterólogos o derivados de virus presentes en una célula transducida en la que se ha insertado la molécula heteróloga o recombinante usando un vector viral. Tales genes pueden incluir genes env y gag, como env de GaLV y/o gag de MMLV.

Se lleva a cabo un ensayo ejemplar (que, como se describe en el Ejemplo 2, 4 o 6, se realizó para evaluar o confirmar la ausencia de RCR en muestras particulares, incluyendo muestras de prueba o muestras de control), en una o más muestras de prueba. Las muestras de prueba incluyen una o más muestras de prueba que contienen ARN aislado y/o derivado de una o más muestras biológicas, respectivamente. Entre las muestras biológicas se encuentran generalmente aquellas que contienen una o más células, como una célula humana o una célula de mamífero, como las formuladas para terapia o administración celular, para las cuales se desea confirmar la ausencia de virus competentes en la replicación; también entre las muestras biológicas o las muestras de prueba de referencia pueden estar aquellas que se sabe que contienen o no ciertas cantidades de referencia de ARN virales y/o ácidos nucleicos de control, que se evalúan en el ensayo. En el ensayo pueden usarse las combinaciones de tales muestras como muestras biológicas o muestras de prueba , como en muestras enriquecidas.

En ciertas aplicaciones, como en los estudios descritos en los Ejemplos 4 o 6, la muestra biológica que se evalúa contiene células transducidas usando un vector retroviral con ácido nucleico heterólogo que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR); las muestras usadas en el ensayo también incluyen generalmente una o más muestras de control, como muestras biológicas de control y/o muestras de prueba de control.

Se descongelan opcionalmente una o una pluralidad de muestras biológicas, como las que comprenden células transducidas, y se extrae el ARN de las muestras para generar una o una pluralidad de muestras de prueba. Las muestras de prueba pueden prepararse por triplicado o por duplicado o más. El ARN se usa como plantilla para generar ADNc mediante transcripción inversa.

Las muestras de control pueden analizarse en paralelo, incluyendo los controles negativos y/o los que contienen cantidades conocidas de uno o ambos objetivos/partes. En algunos aspectos, el ARN de control es o comprende por lo menos una parte de actina y/o el ARN viral comprende todo o una parte de un ARN de env de GaLV y/o todo o una parte de un ARN de gag de MMLV. En tales aspectos, se usan en la reacción cebadores y sondas de hidrólisis específicos para actina y/o env de GaLV (o gag de MMLVJ; en algunos casos, como aquellos en los que se añaden constructos duales que contienen tanto ARN objetivo como de control a las muestras de control, se incluyen o multiplexan en la misma reacción cebadores/sondas específicos para el ARN objetivo y de control. Los cebadores y las sondas de actina y env de GaLV ejemplares se muestran en la Tabla 1.

T l 1: n i n r in nv m l r

En algunas realizaciones, por ejemplo, cuando se usa un ensayo de PCR en tiempo real multiplexado, por ejemplo, para actina (como control) y secuencias de ARN y/o gag de MMLV. En la Tabla 2 se muestran las secuencias de cebadores y sondas de hidrólisis ejemplares de actina (HuActin) y gag de MMLV (gag) directa (F) e inversa (R).

T l 2: n i n r in M M LV m l r

Se usa una muestra de control, como una muestra de prueba de control, como un control estándar de plásmido, como control para la parte del ensayo de amplificación por PCR. En un ejemplo, las muestras de control incluyen una muestra que contiene células y que además contiene (por ejemplo, enriquecidas con) una cantidad o concentración conocida (por ejemplo, valor de referencia) del estándar, como una cantidad/concentración/suma conocida del ARN viral o una parte del mismo, el ARN de control o una parte del mismo, por ejemplo, en forma de un control estándar de plásmido, opcionalmente ambos, en el mismo constructo. En algunos ejemplos, los controles (o la muestra usada para calibrar el ensayo) incluyen una muestra con un número conocido o un número relativo de células objetivo positivas (por ejemplo, células objetivo+ por número total de células).

En algunos contextos donde se usa un control estándar de plásmido, el plásmido incluye los ácidos nucleicos de control positivo y negativo en el mismo constructo, para mejorar el control. En aspectos del método, el control estándar de plásmido incluye un constructo pActin-GaLVgag (SEQ ID NO: 34). En aspectos del método, los controles estándar de plasma incluyen un constructo pActin-MMLVgag (SEQ ID NO: 30).

En un ejemplo, se determina empíricamente la cantidad o concentración conocida que se usará en el ensayo, por ejemplo, realizando estudios para determinar la sensibilidad y/o especificidad del ensayo para un estándar de plásmido particular. En uno de tales ejemplos, se usa una serie de diluciones de muestra de control estándar de plásmido, que incluye varias concentraciones o cantidades, como dentro del intervalo de 106 a 101 copias por reacción. Se usa una serie de diluciones de muestra de control estándar de plásmido de 106 a 101 copias por 7 |jl.

Se usa un control sin plantilla que contiene agua y reactivos de PCR solamente para proporcionar información sobre cualquier contaminación y/o estado de contaminación potenciales, por ejemplo, de uno o más de los reactivos de PCR. Para evaluar la pureza de la plantilla de ARN y para verificar o confirmar la ausencia y/o detectar cualquier ADN contaminante potencial se usa un control sin transcriptasa inversa (-RT).

Como control negativo se usa el ARN de una línea celular que no expresa el gen viral objetivo, por ejemplo, no expresa env de GaLV, El control negativo se usa a una concentración o cantidad similar, por ejemplo, de ARN total y/o células, en comparación con la muestra de prueba.

Se establece un control positivo para el ensayo en base a un valor de referencia, como un límite de detección ejemplar, que en algunos aspectos se determina empíricamente, por ejemplo, seleccionando un intervalo de confianza deseado y evaluando muestras con una serie de cantidades conocidas de ARN de env de GaLV.

En algunas realizaciones, como control positivo, se usa el ARN de una línea celular que expresa el gen viral objetivo, como el que no expresa env de GaLV (por ejemplo, 293Vec-GaLV), en una cantidad igual o alrededor o justo por encima de un límite o nivel de detección ejemplares del ensayo. En un ensayo realizado en el Ejemplo 2, un control positivo contenía 0,75 pg de ARN de GaLV. El nivel de ARN de este control positivo se usa como valor de referencia para la comparación con las muestras de prueba.

La detección de actina se multiplexa con la detección del gen viral objetivo, por ejemplo, env de GaLV, en cada pocillo del ensayo. Este parámetro controla la calidad del ARN. La presencia de actina en cada pocillo confirma que el ARN está presente y tiene la calidad suficiente para poder experimentar la transcripción inversa y la amplificación por PCR. En algunos aspectos no se evalúa la actina en las reacciones de control positivo porque típicamente puede no ser detectable.

En algunos ejemplos de métodos, se usa el ARN del material emparejado con el paciente que no se ha transducido con la partícula del vector viral que comprende el producto del gen heterólogo como control de la contaminación durante el procedimiento de aislamiento del ARN.

Para las muestras de prueba, se prueba el ARN aislado de 10 x 106 células con 7 jL usados por pocillo. En un método ejemplar, cada muestra de control y prueba se asigna a uno o más pocillos en un formato de 96 pocillos. Las muestras de control y de prueba se analizan por triplicado. Las muestras se mezclan con los cebadores directos e inversos de actina y env de GaLV, las sondas de hidrólisis y los componentes para llevar a cabo la RT-PCR proporcionados por la mezcla enzimática RNA UltraSense y la mezcla de reacción 5X de RT-PCR cuantitativa de un paso RNA UltraSense (ThermoFisher Scientific).

En algunos aspectos, el ensayo se lleva a cabo usando un sistema de RT-PCR cuantitativa de un paso comercialmente disponible. El ensayo de PCR en tiempo real multiplexado puede ejecutarse durante 40 ciclos. Generalmente, la hidrólisis de la sonda que se produce con la generación de amplicones libera una molécula fluorescente, que es detectada por la máquina de PCR en tiempo real. Se establece un nivel de umbral y se obtienen valores de ciclo de umbral (Ct) para cada pocillo del ensayo. Se promedian los valores de Ct de las réplicas.

En algunos aspectos el ensayo se considera apropiado para un uso particular y/o válido en base a ciertos criterios. En algunos aspectos, se desea que el control de plantilla tenga poco o ningún valor de Ct en cada pocillo. Los parámetros estándar del plásmido en algunos aspectos están dentro de los intervalos apropiados para el método de detección usado. En algunos aspectos, el control negativo no transducido no debe tener un valor de Ct en cada pocilio y un valor A260/280 apropiado indicativo de la calidad de ARN adecuada. Las muestras de prueba generalmente también deben tener un valor A260/280 apropiado (por ejemplo, entre 2 y 2,1 inclusive), un valor de Ct apropiado para la actina y otros parámetros de control que se deseen para un ensayo en particular.

A continuación se enumeran los resultados hipotéticos para un ensayo realizado en muestras hipotéticas que tienen condiciones particulares, para ilustrar los resultados que pueden obtenerse si los métodos se usaran para evaluar una muestra de prueba derivada de una muestra biológica que contenía virus competente en la replicación. En este ejemplo, los amplicones de actina y env de GaLV se detectan mediante PCR en tiempo real, y los resultados de las muestras de prueba se informan como "ARN asociado a RCR detectado" o "ARN asociado a RCR no detectado" en base a una comparación del nivel de un parámetro (por ejemplo, un valor de Ct o valor de ACt o valor de AACt) detectado o determinado para tales muestras de prueba y un valor de referencia correspondiente, por ejemplo, el nivel correspondiente para dicho parámetro (por ejemplo, valor de Ct o valor de ACt o valor de AACt) determinado para un control positivo con el cantidad conocida del ARN objetivo (que contiene, por ejemplo, 1,5, 1 o 0. 75 o 0,5 pg de ARN de env de GaLV). Por ejemplo, en algunas realizaciones, si se considera que el valor de Ct en un pocillo (o media de réplicas) para la muestra de prueba es mayor que el valor de Ct determinado para el control positivo (que contiene la cantidad conocida o predeterminada de ARN de env de GaLV), entonces puede considerarse que el ARN de env de GaLV no está presente en la muestra biológica correspondiente que es la muestra de prueba o de la que se deriva la muestra de prueba y, en general, dicha muestra de prueba se identifica como 'ARN asociado a RCR no detectado'. En algunos ejemplos, si la muestra de prueba se identifica como "ARN asociado a RCR detectado" o "ARN asociado a RCR no detectado" se determina en base a una comparación de los valores delta Ct o delta delta Ct, por ejemplo, en base al grado de diferencia (delta) entre el valor de Ct o el valor de CT delta obtenido para una muestra de control negativa (como una que se sabe que no ha estado expuesta a la partícula viral de interés o al virus de replicación) y el valor de Ct o el valor de CT delta obtenido para una muestra de prueba dada. En algunos aspectos, un nivel de umbral para el ensayo (como el nivel por encima o por debajo del cual una muestra de prueba se considera positiva o negativa y/o se considera o no contiene ARN asociado a RCR) se expresa como el grado de dicha diferencia o delta para una muestra de control positivo, como una que se sabe que contiene el ARN viral en cuestión en o cerca del límite de detección (LOD) para el ensayo. Por ejemplo, el valor umbral puede establecerse en la diferencia (o delta) entre el valor de Ct o el valor de CT delta para dicha muestra de control positivo y el valor de Ct o el valor de CT delta para la muestra de control negativo, o el valor de umbral puede establecerse en algún punto relativo a tal diferencia de control o delta, como un múltiplo del mismo.

En algunas realizaciones, se determina la diferencia entre el valor de Ct para un control positivo (como uno que se sabe que contiene ARN viral en o cerca del límite de detección (LOD) y el valor de Ct para una muestra de control negativo, como una muestra (o una muestra derivada de una muestra) que se sabe que no ha estado expuesta a la partícula del vector viral que comprende el producto génico heterólogo o cualquier virus replicante); en algunos aspectos, dicha diferencia, o múltiples o veces de diferencia de la misma, se establece como un valor umbral. En algunos ejemplos, para una muestra de prueba dada y/o cada muestra de prueba, se determina la diferencia entre el valor de Ct para esa muestra de prueba y el valor de Ct para la muestra de control negativo, como la muestra (o muestra derivada de una muestra) que se sabe que no ha estado expuesta a la partícula de vector viral que comprende el producto génico heterólogo o cualquier virus replicante) y en algunos aspectos se compara con dicho valor umbral. En algunos ejemplos, la muestra de prueba dada se considera "ARN asociado a RCR detectado" si dicha diferencia es igual o menor que el valor umbral.

En algunos ejemplos, si se determina que el valor de Ct en un pocillo (o la media de réplicas) para la muestra de prueba es menor que el valor de Ct determinado para el control positivo (que contiene una cantidad conocida de ARN de env de GaLV), (o la diferencia, o delta, entre el valor de Ct o el valor de Ct delta para la muestra de prueba y el valor de Ct o el valor de Ct delta para el control negativo está en o por encima del valor umbral que es o corresponde a la diferencia entre el Ct o delta Ct para el control positivo (por ejemplo, Ct o delta Ct para la muestra con ARN viral en o aproximadamente el LOD) y el valor de Ct o delta Ct para el control negativo), entonces puede considerarse que el ARN viral está potencialmente presente o presente en la muestra de prueba y/o la muestra biológica y, en este ensayo ejemplar, dicha muestra de prueba se identificaría como 'ARN asociado a RCR detectado', lo que en algunos aspectos puede indicar un riesgo de presencia de RCR o RC potencial.

En algunos de estos aspectos, el método incluiría además ensayos adicionales, como realizar o analizar los resultados de un ensayo similar pero dirigido a un ARN asociado a RCR diferente, como gag de MMLV.

Ejemplo 2: Diseño de un ensayo de PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) para detectar el gen que codifica la envoltura (env) del virus de la leucemia del mono gibón (GaLV)

Para llevar a cabo el ensayo como se describe en el Ejemplo 1, se diseñó un ensayo para detectar el gen que codifica la envoltura (env) del virus de la leucemia del simio gibón (GaLV). Se eligió env de GaLV como objetivo en parte porque su presencia en una composición de células humanas transducidas podría indicar eventos de recombinación basados en la transducción, en lugar de la presencia de secuencias virales endógenas.1

1. Conjuntos de cebador/sonda

Se generó un plásmido de control de amplificación positivo para contener la secuencia de env de GaLV y un fragmento de una secuencia de actina beta humana para proporcionar plantillas para conjuntos de cebadores y sondas para su uso en RT-PCR. En la SEQ ID NO:34 se expone una secuencia del plásmido pActin-GaLV. Se diseñaron cuatro conjuntos de cebadores y sondas candidatos para amplificar en diferentes regiones de la secuencia de env de GaLV y también se diseñaron dos conjuntos de cebadores y sondas candidatos alrededor del objetivo del fragmento de actina. La PCR con transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR) se llevó a cabo en presencia de una polimerasa RT y TAQ. Las condiciones de amplificación usadas para la RT-PCR se exponen en la Tabla 3.

Los conjuntos de cebador/sonda se probaron inicialmente usando un control sin plantilla (control negativo) y una serie de diluciones del plásmido pActin-GaLV como plantilla. Además, se usó el ARN aislado de una línea celular de empaquetamiento viral de 293 Vec-GaLV (BioVec), que expresa de manera estable la envoltura de GaLV y el gag/pol de M^mLV, como control positivo para la reacción de transcripción inversa y los pasos de amplificación por PCR. Como control adicional, se usó el ARN de una composición de células crioconservadas descongeladas (material crioconservado, CMAT), generado mediante un proceso que incluía la selección basada en inmunoafinidad de células T CD4+ y CD8+ de una muestra de leucoféresis de un sujeto individual seguido de la crioconservación de células aisladas. Se usó la muestra CMAT, que no se sometió a transducción con un vector viral y, por lo tanto, no había sido expuesta a la reserva viral, como control positivo para el conjunto de cebador/sonda de activa pero no debería generar una señal de amplificación para el conjunto de cebador/sonda de env de GaLV.

Los dos principales conjuntos de cebador sonda de env de GaLV se seleccionaron en base a los criterios de aceptación de los parámetros de rendimiento de la curva estándar que se muestran en la Tabla 4.

A continuación, los conjuntos de cebador/sonda se probaron individualmente y se combinaron para verificar que la multiplexación entre los emparejamientos seleccionados de cebador/sonda de env de GaLV y de actina no afectara el rendimiento de la amplificación en la detección de objetivos. Se seleccionaron y usaron las parejas de sonda/cebador de actina y env de GaLV ejemplares expuestos en la Tabla 1 para el desarrollo del ensayo posterior.

2. Aislamiento de ARN y calidad de la muestra

Se compararon diferentes metodologías para obtener el aislamiento de una plantilla de ARN de alta calidad con una contaminación de ADN mínima. El ARN se aisló de muestras Cde MAT generadas como se ha descrito anteriormente. Se llevó a cabo RT-PCR con (+RT) y sin transcriptasa inversa (-RT) (en cada caso en presencia de Taq polimerasa) para distinguir entre la señal procedente de la plantilla de ARN y de la plantilla de ADN contaminante.

Se comparó entre las muestras la señal de amplificación para la plantilla de actina. Un alto nivel de amplificación en un número de ciclo bajo indica una alta concentración de plantilla presente en una muestra.

Como criterio ejemplar relacionado con la pureza de la muestra de ARN, se estableció un valor umbral ejemplar de >2,0 (para la proporción de A260/A280 medida en un espectrofotómetro); también se establecieron valores umbral en base a la inclusión del conjunto de cebador/sonda dirigido al gen de mantenimiento, la actina. Se estableció un valor de umbral máximo de número de ciclo (C^t), relacionado con la concentración y la calidad de las muestras de ARN que se evaluarán en el ensayo para determinar la presencia del objetivo env de GaLV. Además, también se estableció un valor mínimo para la desviación estándar para los valores de Ct de actina entre réplicas, por ejemplo, para confirmar la coherencia entre réplicas. También se fijó un valor umbral para la señal para el control sin transcriptasa inversa (-RT) (indicativo de la presencia de cualquier contaminación de ADN). Se estableció un nivel mínimo umbral ejemplar para la diferencia en el número de ciclos con (+RT) y sin (-RT) transcriptasa inversa en > 13,2. La Tabla 5 resume los niveles de umbral de la muestra de ARN.

Se eligió un control celular para incluirlo en cada ensayo para garantizar el rendimiento apropiado del procedimiento de aislamiento de ARN. En algunas realizaciones, un ejemplo de control celular para la inclusión en los ensayos es una alícuota de la misma composición celular almacenada como alícuotas de un solo uso en nitrógeno líquido, en el que, en cada ensayo, se aisló el ARN del mismo número de células, por ejemplo, 5 x 106 celdas En algunos aspectos, se establece un valor umbral para dicho control. Un criterio ejemplar para el control de ARN fue la media de la concentración de ARN esperada (por ejemplo, determinada a partir de una pluralidad de partes alícuotas) ± 4 desviaciones estándar.

3. Detección de ARN de env de GaLV por RT-PCR

El ensayo de RT-PCR de env de GaLV realizado en ARN aislado de la línea celular 293Vec-GaLV o el control positivo del plásmido pActin-GaLV. También se aisló ARN de una composición celular crioconservada (CCC) que se había transducido con un vector gammaretroviral producido usando un plásmido que codifica el elemento de empaquetamiento de env de GaLV. Se evaluaron varios parámetros para el ensayo en este estudio, incluyendo la especificidad ejemplar, la linealidad, la interferencia de matriz de intervalo, la precisión y la estabilidad del control de muestras y plásmidos.

Se secuenciaron los amplicones generados a partir de RT-PCR singleplex con cebadores/sondas de GaLV o actina en la plantilla de plásmido pActin-GaLV y fueron 100% idénticos a las secuencias de GaLV y actina predichas. En clones de células 293Vec-GaLV o control CMAT, aproximadamente el 11% (1/9) de los amplicones secuenciados contenían un malapareamiento de un único par de bases con la secuencia de GaLV o actina predicha, respectivamente, probablemente debido a un error de transcriptasa inversa.

En una RT-PCR realizada con una serie de diluciones con el estándar de plásmido pActin-GaLV, el ensayo pudo cuantificar tan solo 10 copias por reacción; la detección del objetivo en o por encima de ese número de copias se observó en el 100% de los pocillos que cumplieron con este límite, con una desviación estándar de < 1,5. Se observó un intervalo lineal de detección de 101 a 106 copias/pl con detección en el 100% de los pocillos y una desviación estándar de < 0,5, excepto en 10 copias por reacción.

En otra serie de experimentos, se realizó RT-PCR en una serie de diluciones de ARN aislado de la línea celular 293Vec-GaLV. Se detectaron más del 95% de las muestras positivas con por lo menos 0,5 a 0,75 pg de ARN GalV+ como positivas en el ensayo. En otra serie de experimentos, la serie de diluciones de ARN aislado de la línea celular 293Vec-GaLV se añadió al ARN aislado de una muestra de CCC. Tan solo diez células GALV+ introducidas en 10 x 106 células CCC (0,001%) fueron detectables en el ensayo, con detección en el 100% de los pocillos y valor de Ct < valor de Ct del control positivo.

Para evaluar la estabilidad del ARN en el ensayo, se añadieron células 293 Vec-GaLV a una muestra de CCC y las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 0, 2, 6 o 25 horas y luego se aisló el ARN. El ARN se analizó para el Número de integridad del ARN (RIN) usando métodos estándar y para evaluar A260/A280 y la degradación. El estudio del transcurso temporal confirmó que el ARN se mantuvo estable a temperatura ambiente durante hasta 25 horas (por ejemplo, lo que puede ser deseable en ciertos entornos, por ejemplo, para tener en cuenta la variabilidad del operador en el manejo de muestras). Aunque se observó ARN de alta calidad hasta 25 horas, se observó una disminución en la concentración de ARN en el punto temporal de 25 horas, mientras que los puntos temporales anteriores fueron comparables. El RIN disminuyó de 10 a 9 solo en el punto temporal de 25 horas. Se determinó que la detección de GaLV era estable a lo largo del tiempo a temperatura ambiente, mientras que la detección de actina disminuyó a lo largo del tiempo a temperatura ambiente.

Estos resultados demostraron que el ensayo RT-PCR de GaLV fue capaz de detectar 10 células positivas para GaLV enriquecidas en una matriz de 10 millones de células CCC y fue lo suficientemente robusto como para que la señal de GaLV aún fuera detectable en muestras estresadas que se dejaron a temperatura ambiente durante hasta 25 horas. En estos estudios, se observaron niveles aceptables de variabilidad interensayo e intraensayo.

Ejem plo 3: Evaluación del objetivo u objetivos de ARN viral indicativos o asociados o requeridos para retrovirus com petentes en la replicación en m uestras con un ensayo de doble objetivo de env de G aLV y gag de M M LV

En algunas realizaciones, se usa un método ejemplar de objetivo dual para evaluar la ausencia o presencia de retrovirus competentes en la replicación (RCR) en células transducidas u otras células. El ensayo se lleva a cabo sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1, donde los ARN objetivo evaluados incluyen ARN de env de GaLV y ARN de gag de MMLV, cada uno evaluado en muestras de prueba, con el uso de cada uno de los respectivos estándares de plásmido de actina de ARN viral, de tal manera que se usa el mismo ARN de control en cada ensayo, lo que puede proporcionar un mejor control. Se identifica un riesgo de RCR en algunos aspectos en la muestra biológica solo si se determina mediante el método que hay tanto ARN de env de GaLV como de gag de MMLV o está por encima de la cantidad de referencia en la muestra. En algunos aspectos, la determinación de que uno de los ^aRⁿestá presente o está por encima de la referencia va seguido de ensayos adicionales antes de confirmar que una muestra es negativa.

Ejem plo 4: Evaluación del objetivo u objetivos de ARN viral indicativos o asociados o requeridos para retrovirus com petentes en la replicación en m uestras con un ensayo de objetivo de env de G aLV

Se evaluaron mediante el método las células T transducidas con vectores retrovirales y procesadas, confirmando la ausencia de ARN asociado a RCR. Se prepararon muestras y se realizó un método de detección de RCR basado en RT-PCR sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1. Brevemente, se aisló ARN de muestras biológicas que comprendían células transducidas por triplicado. Las muestras de prueba que contenían ARN resultantes se analizaron para determinar la calidad del ARN usando mediciones A260/280, se probaron para detectar ADN contaminante usando un espectrofotómetro, así como una PCR de control "sin transcriptasa inversa". Se determinó que todas las muestras tenían ARN funcionalmente puro al 99,999%. La linealidad de la plantilla de ARN usada en el ensayo se validó usando ARN de control positivo de una línea celular -GaLV (para env de GaLVj y una muestra de células transducidas (para actina).

Los valores de referencia de los parámetros evaluados se determinaron usando muestras con ARN derivado de células transducidas enriquecidas con una cantidad conocida (por ejemplo, aproximadamente 0,75 pg) de control de plásmido (pActin-GaLV; SEQ ID NO: 34) por reacción.

Las muestras de ARN de células transducidas no enriquecidas (tres muestras, por triplicado) se evaluaron en paralelo con las muestras enriquecidas usando el método de RT-PCR de GaLV/actina sustancialmente como se describe en el Ejemplo 2. En cada una de las muestras de prueba que contenían ARN de muestras biológicas que contenían las células transducidas, los valores de Ct observados indicaron la ausencia del ARN objetivo en las muestras biológicas y, como tal, se determinó que ninguna de las muestras de células transducidas evaluadas era positiva para RCR. Todas las muestras dieron positivo para actina. Los resultados de las muestras derivadas de células de control positivo confirmaron la sensibilidad y la función del ensayo.

Ejem plo 5: Prueba durante el proceso

En un proceso ejemplar, la prueba de RCR se realiza en múltiples etapas a lo largo de un proceso de fabricación de productos para manipular células mediante la transducción con una partícula de vector viral que codifica un producto génico heterólogo. En un método ejemplar para manipular células, se realiza leucaféresis para recoger células mononucleares de sangre periférica (PBMC), las células se lavan y las células T se enriquecen adicionalmente mediante enriquecimiento basado en inmunoafinidad. Opcionalmente, las células aisladas se crioconservan y posteriormente se descongelan. Las células, por ejemplo, células descongeladas, se cultivan en presencia de perlas anti-CD3/-CD28, seguido de transducción con un vector retroviral pseudotipado con GaLV que codifica un producto génico heterólogo, como un receptor de antígeno quimérico (CAR). Después de la transducción, las células se expanden en cultivo durante un período de tiempo, como hasta 10 días. Opcionalmente, las células transducidas se congelan mediante crioconservación. Las células expandidas y transducidas, que opcionalmente se descongelan, se formulan adicionalmente para su administración a un sujeto.

El ensayo, como se describe en los Ejemplos anteriores, se lleva a cabo, por ejemplo, para evaluar una o más de las siguientes muestras biológicas: partículas de vectores virales aisladas, sobrenadantes de vectores, un banco de células maestras para células productoras de vectores, muestras al final de la producción (EOPC), células transducidas por vector final (incluyendo las células durante varios períodos de expansión ex vivo y/o que se someten a un período de expansión ex vivo), material crioconservado (CMA^t), producto farmacéutico crioconservado (CDP) y un producto farmacéutico formulado (FDP). Además, las muestras biológicas también pueden incluir muestras derivadas de un sujeto después de la administración de un producto farmacéutico formulado. El ensayo de uno cualquiera o más de los Ejemplos 1-3 se usa para detectar RCR en muestras que comprenden las células transducidas en las varias etapas del proceso de fabricación del producto.

Ejem plo 6: Detección de virus com petente en la replicación en células T enriquecidas con un virus m odelo

Se usaron los métodos basados en RT-PCR descritos en los Ejemplos 1, 2 y 4 para detectar la presencia o ausencia de ARN viral de GaLV en una muestra de prueba obtenida de muestras de células T enriquecidas con un GaLV de tipo salvaje replicante en cantidades variables de unidades infecciosas. y sometido a un proceso in vitro. Las células T CD3+ se aislaron mediante enriquecimiento basado en inmunoafinidad a partir de leucaféresis de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de tres sujetos humanos diferentes. Luego, se crioconservaron células T aisladas de cada sujeto.

Se llevó a cabo un estudio inicial para evaluar el grado o ausencia de replicación de diferentes cantidades bajas conocidas de retrovirus competentes en replicación añadidos, durante un proceso ex vivo que implicaba el cultivo y la expansión de células T CD3+. Las células T aisladas se descongelaron, se activaron con perlas anti-CD3/anti-CD28, se enriquecieron con la adición de un virus de replicación GaLV de tipo salvaje a 0, 10, 100 o 1000 unidades infecciosas (UI) y se expandieron a 37° C durante 10 días. Como control positivo, se cultivaron en paralelo muestras que contenían células HEK293 permisivas, en las que se habían añadido las mismas UI del virus.

En un experimento inicial, se recogieron los sobrenadantes los días 4 y 10 después del inicio del cultivo y se evaluó el título viral usando la línea celular indicadora PG4 S+L de acuerdo con técnicas estándar. Para las muestras de prueba, solo cuando se añadió a los cultivos la cantidad más alta (UI) de virus (1000 unidades infecciosas (UI)), se observó el virus replicante en el día 10 según lo detectado por el ensayo de placa de línea celular indicadora PG4 S+L estándar. En las muestras de control en las que se habían enriquecido células HEK293 permisivas con las mismas cantidades virales, se observó que se detectaba virus replicante en los sobrenadantes para cada una de las cantidades enriquecidas, determinado mediante el ensayo de placa de línea celular indicadora PG4 S+L, confirmando además la capacidad del ensayo para detectar la replicación viral después de la adición de cada cantidad de virus.

Se usaron condiciones similares en un estudio realizado para confirmar la capacidad del ensayo de RCR basado en RT-PCR proporcionado a modo de ejemplo para detectar niveles bajos devirs replicante en muestras en un proceso de cultivo de células T ex vivo. Se descongelaron células T aisladas y se activaron con perlas anti-CD3/anti-CD28 y se enriquecieron con ninguna o con cantidades variables delvirs replicante de GaLV de tipo salvaje como se ha descrito anteriormente, excepto que durante el proceso, se transdujeron células de algunas muestras con un producto génico heterólogo usando una partícula de vector viral pseudotipada con GaLV que codifica el producto génico (vector). Las células se cultivaron a 37° C durante un período de 10 días. El sobrenadante de los cultivos expandidos se recogió en los días 4, 7 y 10 y se evaluó el título viral usando la línea celular indicadora PG4 S+L como se ha descrito anteriormente. Además, se recogió el ARN de las células T expandidas en los días 4, 7, y 10 y se evaluó para determinar la presencia de ARN viral indicativo devirs replicante usando un ensayo de RT-PCR ejemplar esencialmente como se describe en el Ejemplo 2 para ARN viral de GaLV que codifica env. En el ensayo de RT-PCR, los resultados del ensayo se normalizaron calculando los valores delta C^trestando el valor de C^tde GaLV para una muestra de ARN individual del valor C^tdel control positivo de ARN del ensayo. Como comparación, se llevó a cabo un ensayo de cocultivo de RCR recogiendo células T en los días 4, 7 y 10 y cocultivando las células T con una línea celular permisiva HEK293 durante un período de amplificación, seguido de la detección de la presencia o ausencia de virus en sobrenadante de células cocultivadas usando la línea celular indicadora PG4 S+L.

El estudio demostró que el ensayo podía detectar niveles bajos de replicación del virus, incluso con la misma o mayor sensibilidad en comparación con un ensayo de placa de cocultivo estándar. En la Tabla 6 se muestran los resultados de tres series diferentes de cada condición. El título de recogida de PG4S+L se incluye para resaltar que la línea indicadora de PG4 S+L- solo puede detectar RCR en algunas muestras no amplificadas enriquecidas con niveles altos de virus GaLV (1000 UI). Como se muestra, la presencia de virus enriquecido de replicación, en las muestras después de la adición del virus GaLV competente en la replicación, fue detectable en las muestras recogidas a los 7 y 10 días después del inicio del cultivo, usando tanto el ensayo de RT-PCR proporcionado ejemplar como el método de cocultivo. En las muestras recogidas el día 4, podría detectarse evidencia de dicho virus replicante (en muestras en las que se había añadido GaLV competente para la replicación) usando el método de RT-PCR, incluso en los casos en que dicha replicación no se detectó usando el ensayo de cocultivo.

Tabla 6: Comparación Resultados de ensayo de cocultivo de RCR con Resultados de RT-PCR para muestras correspondientes

TNTC = demasiado numerosa para contar

Como se muestra en la Tabla 6, los resultados del ensayo de cocultivo de RCR y el ensayo de RT-PCR se alinearon, con la excepción de las cuatro series que están sombreadas. El ensayo de RT-PCR detectó ARN del virus GaLV en muestras enriquecidas con 10 UI de virus GaLV el día 4 en una de las series, pero no en los días 7 y 10, mientras que el ensayo de cocultivo de RCR para estas muestras no detectó ARN de GaLV. en cualquier punto temporal. Sin querer estar limitados por la teoría, es posible que el resultado positivo en el día 4 refleje la detección de un nivel bajo de RCR que no se replicó o ARN residual de los enriquecimientos virales. También es posible que los resultados negativos en los días 7 y 10 reflejen una dilución del rCr o del ARN viral por debajo del umbral de detección del ensayo de RT-PCR que se produjo durante la alimentación con medios de los cultivos celulares.

El ensayo de cocultivo RT-PCR y RCR también produjo resultados diferentes para las muestras enriquecidas con 10 UI del virus GaLV que se transdujeron con el vector viral que codifica el gen (vector). El ensayo de RT-PCR fue positivo en los días 4 y 7, pero no en el día 10, mientras que las transiciones del ensayo de cocultivo RCR solo fueron positivas en el día 7. Sin pretender estar limitados por la teoría, es posible que estos resultados reflejen una presencia inicial de RCR en las muestras que no se replicaron lo suficiente como para ser detectables el día 10. Además, es posible que los resultados inconsistentes del ensayo de cocultivo de RCR en los días 4 y 7 indicaran que el virus estaba cerca del límite de detección para el ensayo.. Estos resultados respaldaron el descubrimiento de la sensibilidad del ensayo RT-PCR de GaLV.

Se observaron resultados similares en muestras enriquecidas con 100 UI de virus GaLV y transducidas con el vector del gen viral. Tanto los ensayos de cocultivo de RT-PCR como de RCR detectaron virus el día 4, pero solo el ensayo RT-PCR de GaLV detectó ARN de GaLV el día 7. Ninguno de los ensayos detectó ARN de GaLV el día 10. Al igual que con las muestras enriquecidas con 10 UI de virus GaLV y transducido, es posible que los niveles iniciales del virus GaLV no se replicaran lo suficiente como para evitar la dilución por la expansión del cultivo celular. La detección de ARN de GaLV en el día 7 apoyó la sensibilidad aumentada del ensayo de RT-PCR.

Los resultados demostraron la capacidad del método de RT-PCR para detectar la presencia de retrovirus competentes en la replicación presentes en una muestra de células T sometida a cultivo ex vivo, con la misma o mayor sensibilidad en comparación con un ensayo de cocultivo estándar. Al contrario que con el ensayo de cocultivo que implica una amplificación de múltiples semanas para la detección del virus GaLV, el ensayo RT-PCR de GaLV pudo lograr la detección de RCR en muestras directamente a partir de muestras de composición celular.

Ejem plo 7: Ensayo ejem plar que evalúa niveles de parám etros indicativos de objetivos de ARN viral, com o V SV -G y/o gag de rev

Los cebadores y las sondas marcadas dirigidas a un VSV-G y rev presente en un lentivirus competente en replicación (RCL) pseudotipado VSV-G, así como a un control de beta-actina (ACTB), se diseñaron como se muestra en la Tabla 7. Las sondas se marcaron con marcadores de colorante FAM o HEX y se inactivaron con inactivadores no fluorescentes negros Iowa.

T l 7: n i n r V V- r v in m l r

Las series de RT-PCR realizadas en plásmidos de producción de vectores que contenían el gen pol, el gen rev y el gen VSV-G verificaron que los cebadores y las sondas podían unirse y detectar selectivamente los genes objetivo. También se evaluó el RT-PCR en ARN extraído de líneas celulares ejemplares que expresan ARN objetivo y se confirmó la detección de los genes objetivo usando los cebadores y las sondas anteriores.

Los cebadores y las sondas descritos en la Tabla 4 se usan en un ensayo de RT-PCR realizado en una composición celular que contiene ácido nucleico heterólogo introducido por transducción con lentivirus que expresa VSV-G. El ensayo de RT-PCR se realiza para evaluar si están presentes uno o ambos de VSV-G y rev que codifica ARN viral.

El ARN se extrae de las composiciones celulares, se convierte en ADN complementario (ADNc) y se amplifica mediante técnicas convencionales. En un método ejemplar, el ARN se extrae con el mini kit Qiagen RNeasy-Plus. Las reacciones de RT-PCR multiplex se realizan con los cebadores y sondas para VSV-G y/o rev y ACTB que se muestran en la Tabla 4. El ARN aislado de cada muestra se mezcla con cebadores directos e inversos y sondas de hidrólisis para VSV-G y/o rev y ACTB que se muestran en la Tabla 4, y se añaden los componentes para llevar a cabo la RT-PCR. En un método ejemplar, los componentes para llevar a cabo la RT-PCR son proporcionados por la mezcla enzimática de RT-PCR cuantitativa de un paso RNA UltraSense y la mezcla de reacción 5X de RT-PCR cuantitativa de un paso RNA UltraSense (ThermoFisher Scientific). En algunos casos, las reacciones de PCR para VSV-G y rev se procesan en multiplexación en los mismos pocillos de PCR. La inclusión de cebadores para detectar ACTB se usa como control para confirmar la presencia de ARN y verificar la calidad del ARN. En el ensayo se usan varios controles, como una curva estándar basada en plásmidos para VSV-G y/o rev, un control de ARN basado en cultivo celular para VSV-G y/o rev y ACTB, sin plantilla de control y reacciones de control sin transcriptasa inversa. Los resultados de las reacciones de RT-PCR indican si hay presentes niveles detectables de VSV-G y/o rev en las composiciones celulares.

No se pretende que la presente invención esté limitada en su alcance a las realizaciones particulares divulgadas, que se proporcionan, por ejemplo, para ilustrar varios aspectos de la invención. Varias modificaciones a las composiciones y métodos descritos se harán evidentes a partir de la descripción y las enseñanzas de la presente.

SECUENCIAS

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Claims

REIVINDICACIO NES

1. Un método para detectar la presencia o ausencia de, o el riesgo de, un retrovirus competente en la replicación que comprende:

el ARN viral se requiere para, o codifica un producto génico o una parte específicamente identificable del mismo que se requiere para la competencia en la replicación de un virus competente en la replicación; el ARN viral es de los genes env, gag, pol o rev;

el parámetro es o comprende un valor de umbral de ciclo (Ct).

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además los pasos de:

b) comparar el nivel del parámetro, determinado en (a), con un primer valor de referencia para el parámetro, en donde la comparación indica la presencia, ausencia, concentración o cantidad del ARN viral en la muestra biológica o muestra derivada de la misma, o riesgo de cualquiera de los anteriores.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde se determina la presencia del ARN viral o la expresión del mismo o que corre el riesgo de estar presente en la muestra biológica o en la muestra de prueba, si el valor de Ct para la muestra de prueba está por debajo de un primer valor de referencia, que es una puntuación de Ct de referencia.

4. Un método para detectar la presencia o ausencia de, o el riesgo de, un retrovirus competente en la replicación que comprende:

en donde por lo menos una célula que contiene un ácido nucleico heterólogo, un producto génico heterólogo y/o un ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga ha sido transducida con un vector retroviral y la muestra biológica comprende por lo menos una célula que ha sido transducida con un vector retroviral vector y contiene un ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga;

en donde:

la presencia, ausencia o cantidad o concentración del primer ARN viral o del segundo ARN viral, y/o la presencia, ausencia o cantidad o concentración tanto del primer como del segundo ARN virales, en la muestra biológica indica una presencia o ausencia de, o riesgo de, un retrovirus competente en la replicación en la muestra biológica, o una muestra de la que se deriva la muestra biológica;

el primer ARN viral, el segundo ARN viral y/o tanto el primer como el segundo ARN virales se requieren para, o codifican, un producto génico o una parte específicamente identificable del mismo que se requiere para la competencia de replicación de un virus competente en la replicación;

el ARN viral es de los genes env, gag, pol o rev;

5. El método de la reivindicación 4, que comprende además:

c) comparar el nivel del primer y/o el segundo parámetro determinado en (a) y/o (b) con un primer y/o segundo valor de referencia, en donde la comparación indica la presencia, ausencia, concentración o cantidad del ARN viral en la muestra biológica o muestra derivada de la misma, o riesgo de cualquiera de los anteriores.

6. El método de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en donde el primer gen viral es un env y el segundo gen viral es de gag, pol o rev.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 5 y 6, en donde el valor de referencia, el primer valor de referencia y/o el segundo valor de referencia es un valor correspondiente a o para el parámetro en una muestra de prueba de control positivo, que opcionalmente contiene una cantidad o concentración conocida del ARN viral, el segundo ARN viral y/o el primer ARN viral.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 y 5 a 7, en donde el valor de referencia, el primer valor de referencia y/o el segundo valor de referencia se derivan en base a un valor de Ct que indica un umbral para la presencia del ARN objetivo en una muestra indicativa de la presencia o riesgo de presencia de retrovirus competentes en la replicación en una muestra.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 y 5 a 8, en donde el valor de referencia, el primer valor de referencia y/o el segundo valor de referencia se calcula en base a una cantidad conocida de ARN génico viral.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el vector retroviral es un vector gammaretroviral o un vector lentiviral.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el ácido nucleico heterólogo o el producto génico heterólogo es o codifica un receptor recombinante, un receptor quimérico, opcionalmente un receptor de antígeno quimérico o un receptor de células T transgénico.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la RT-qPCR se lleva a cabo usando uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para una o más secuencias del gen viral, o el primer o el segundo gen viral, opcionalmente en donde:

el gen viral, o el primer o el segundo gen viral, es env de GaLV y el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del primer gen viral comprenden un cebador directo e inverso, respectivamente, que comprende las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 4-5; y/o

el gen viral, o el primer o el segundo gen viral, es gag de MMLV y el uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del segundo gen viral comprenden un cebador directo e inverso, respectivamente, que comprende las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 16-17, las SEQ ID NO: 19-20 o las SEQ ID NO: 22-23.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la determinación comprende usar una sonda de hidrólisis específica para una secuencia del gen viral, el primer gen viral o el segundo gen viral, opcionalmente en donde:

el gen viral, o el primer o el segundo gen viral, es env de GaLV y la sonda de hidrólisis comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6; y/o

el gen viral, o el primer o el segundo gen viral, es gag de MMLV y la sonda de hidrólisis comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 18, 21 o 24.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que comprende además evaluar en la muestra de prueba un nivel de, o un nivel de un parámetro indicativo o correlativo con, un ARN que codifica un gen de control en la muestra de prueba o biológica, opcionalmente en donde el control el gen es o comprende p-actina y/u opcionalmente en donde el nivel del parámetro o gen de control se evalúa usando uno o más cebadores de oligonucleótidos específicos para una secuencia del gen de control, que individualmente y opcionalmente comprenden una o más secuencias expuestas en la SEQ ID NO: 1 o 2 o uno de 8-15, opcionalmente en donde el nivel se evalúa usando una sonda de hidrólisis específica para una secuencia del gen de control, que opcionalmente comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3, 9, 12 o 15.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde la determinación comprende llevar a cabo una reacción multiplex, en donde opcionalmente se evalúa el nivel, el primer nivel y/o el segundo nivel; y opcionalmente el nivel o parámetro indicativo o correlativo con el gen de control, en la reacción multiplex.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde la una o más células y/o muestras biológicas se recogen de un proceso en el que las células transducidas se han cultivado en condiciones para expandir las células, opcionalmente a o aproximadamente 37° C, opcionalmente además en presencia de uno o más agentes estimulantes.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde por lo menos una célula o muestra biológica es o es de un material crioconservado (CMAT), un producto farmacéutico crioconservado (CDP) o un producto farmacéutico formulado (FDP) para terapia de células autólogas, o una muestra de la misma.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde dicha por lo menos una célula comprende una pluralidad de células, y en donde:

dicha pluralidad de células y/o dicha muestra biológica comprende células en suspensión;

dicha pluralidad de células y/o dicha muestra biológica comprende glóbulos blancos; y/o

dicha pluralidad de células y/o dicha muestra biológica comprende células T o células NK;

opcionalmente en donde dicha pluralidad de células comprende células T no fraccionadas, células T CD8+ aisladas o células T CD4+ aisladas.