CN104152444B - 一种与长牡蛎糖原含量性状相关的snp标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种与长牡蛎糖原含量性状相关的SNP标记及其应用。SNP标记位点命名为TY202，位于糖原脱支酶基因的第3个外显子上，基因型为Y。所述TY202位于糖原脱支酶基因的5’端第7022碱基处。第3个外显子位于糖原脱支酶基因的5’端6446‑7043碱基对处。SNP标记位点基因型为T/T或T/C的个体糖原含量高于基因型为C/C的个体。本发明用检测个体基因型的方法可以预测个体糖原含量的高低，育种中可用于选择目标个体，用于分子标记辅助选择育种。避免了糖原检测过程中浓酸浓碱的使用，使操作更加安全简便。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体地说是一种与长牡蛎糖原含量性状相关的SNP标记。
背景技术
长牡蛎，属软体动物门中的瓣鳃纲(或双壳纲)，肉质肥嫩，营养丰富，糖原是牡蛎中一种重要的风味营养物质，可直接被机体吸收，从而减轻胰腺负担，因此对糖尿病的防治十分有效。
糖原脱支酶是牡蛎糖原降解过程中的一种酶，其作用主要是水解α-1,6糖苷键，移去糖原的分支，使支链糖原变为直链糖原。人糖原脱支酶缺乏可引起糖原累积症一111型疾病。目前已有糖原脱支酶的DNA全长，国内外对其进行了突变筛查并发现多处突变位点，但并未发现公认的突变热点。
SNP即单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性。SNP分布广，密度高，具有高度的遗传稳定性。与其他种类的分子标记相比，SNP标记能够更好地反应生物基因组内的序列信息，可以更详细地研究基因组内序列多态性与表型性状之间的关联，有效地指导基因鉴定和定位的工作。
水产动物育种研究起步晚，主要集中于对生长性状的研究，方法大多采用传统的选择，杂交，周期长，见效慢。对长牡蛎的品质性状研究还不多见。近年来，随着基因组学研究取得一系列突破，分子标记辅助选择等分子育种技术日渐成熟，大大提高了遗传育种水平。利用分子标记辅助选择可以减少盲目性，缩短育种年限，提高育种的效率。关联分析是近些年发展起来的鉴定与目标性状关联的分子标记和基因的热门方法。关联分析，又称连锁不平衡作图(LD mapping)或关联作图(Association Mapping)，是一种以连锁不平衡为基础，鉴定某一群体内目标性状与遗传标记或候选基因关系的分析方法。关联分析能够检测特定群体的所有重组和变异事件，具有较强的精度。
发明内容
本发明的目的是提供一种与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记，为长牡蛎的分子标记辅助选择提供参考。
为实现上述目的本发明的技术方案为一种与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记，它位于糖原脱支酶基因的第3个外显子上，基因型为Y。得到SNP位点TY202，位于糖原脱支酶基因的5’端6446-7043碱基对处的第3个外显子上。所述TY202位于糖原脱支酶基因的5’端第7022碱基处。
其特异性引物序列为：F：5’-TAGTAAAGACAGGCAGCA-3’；R：5’-TCATTTGTAGACAGGGAG-3’；引物扩增片段长度为75bp，扩增核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
基因型为T/T、T/C或C/C，在该位点基因型为T/T或T/C的个体糖原含量高于基因型为C/C的个体。
在野生群体中检测各个个体的基因型和表型数据，由基因型和表型数据通过关联分析预测得出TY202和长牡蛎糖原含量的性状相关度达到显著水平(P<0.05)，与长牡蛎糖原含量的性状关联，可用于长牡蛎的标记辅助选择育种。
与长牡蛎糖原含量性状相关的SNP标记的检测方法，其筛选步骤是：
a)采集青岛胶南的野生长牡蛎群体中多个个体，对其进行解剖，分组织(闭壳肌、鳃组织等)取样，用液氮速冻后于-80℃保存，做为实验材料；
b)测定每个个体闭壳肌中的糖原含量，得到表型数据；
c)用酚-氯仿抽提法提取每个个体鳃的总DNA；
d)选定长牡蛎糖原代谢相关基因作为候选基因，根据长牡蛎转录组数据预测的SNP位点设计引物，筛选引物后利用HRM方法针对每一个SNP检测个体基因型；
e)利用GAPIT软件进行关联分析，预测与长牡蛎糖原含量性状相关的SNP位点。
本发明的优点：
本发明用检测个体基因型的方法可以预测个体糖原含量的高低，育种中可用于选择目标个体，用于分子标记辅助选择育种。避免了糖原检测过程中浓酸浓碱的使用，使操作更加安全简便。
附图说明：
图1是引物筛选结果。其中，泳道5为Marker，所用Marker为Marker1。泳道10-13为SNP位点TY202引物筛选结果。
图2是SNP位点TY202 HRM验证结果。
图3是SNP位点TY202群体分型结果。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步的阐述，实施例仅用于说明本发明，本发明不限于此。本发明所采用实验用品均来自市购。
序列表(1)SEQ ID NO.1的信息
序列特征长度：75bp
类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线形
分子类型：DNA
来源：长牡蛎
序列描述：
TAGTAAAGACAGGCAGCATGCTGAYGGTGAAGGGTACTTTTTGGTGGACCCCATCCTCTCCCTGTCTACAAATGA
实施例1
与糖原含量相关的SNP位点的筛选
a)样品的采集：采集青岛胶南的野生长牡蛎群体中多个个体，共144只，对其进行解剖，分组织(闭壳肌、鳃组织等)取样，用液氮速冻后于-80℃保存备用。
b)糖原含量检测：用南京建成生物工程研究所的肌糖原及肝糖原测定试剂盒检测每个个体闭壳肌中的糖原相对含量，检测方法按照说明书中的操作步骤进行。
1)取样：取冻存的肌肉样品用生理盐水漂洗后，滤纸吸干，称重(样本重量≤100mg)。
2)水解：按样本重量(mg)：试剂盒中碱液体积(μl)＝1:3，一起加入试管中，沸水浴煮20min，流水冷却，得到糖原水解液。
3)制备糖原检测液：将糖原水解液加蒸馏水稀释即得到糖原检测液，加蒸馏水的量为(μl)：样本重量(mg)*16。
操作表如表1所示。
表1
| 空白管 | 标准管 | 测定管 | |
| 蒸馏水(ml) | 1.0 | 0.9 |
| 0.01mg/ml标准(ml) | 1.0 | ||
| 糖原检测液(ml) | 0.1 | ||
| 显色液(ml) | 2 | 2 | 2 |
标准溶液和显色液均采用试剂盒中自带溶液。
混匀后置沸水中煮5min，冷却后于620nm波长，1cm光径下，用空白管调零，测各管OD值。
计算公式如下：
c)DNA提取：用酚-氯仿抽提法提取每个个体鳃的总DNA。
1)取1.5 ml离心管，加入700μl DNA提取缓冲液(100 mM Tris-HCl，5 mM EDTA)，取3-10mg的牡蛎鳃组织，用剪刀剪碎。所用器皿在两个个体之间必须用火焰灭菌和ddH2O冲洗以防个体间的交叉污染。加入35μlSDS，混匀。加入2μl蛋白酶K，混匀。
2)将离心管在65℃金属浴中孵育，1.5小时后每管补加2μl蛋白酶K，期间轻轻摇动离心管组织完全消化后继续孵育半小时以上，总孵育时间至少3小时。
3)将孵育后的样品冷却至室温，加入等体积的PCI，充分混匀，13000rpm离心10min。重复上述步骤一次。PCI为酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)的混合溶液。
4)将步骤3)的上清液再用氯仿：异戊醇(24:1)抽提1次，13000 rpm离心5 min。
5)将步骤4)的上清液移入等体积-20℃异丙醇，来回颠倒充分混匀，-20℃放置20min。
6)将步骤5)的混合液在4℃，13000 rpm离心5 min。小心倒出所有液体，注意不要让底部的白色沉淀颗粒移动或倒出。
7)用-20℃75％乙醇洗涤2次倒出液体，开口放置离心管晾干乙醇，
待白色沉淀变为无色透明时加入50-100μl(具体看DNA的量)ddH2O来溶解DNA。置于-20℃备用。
d)引物设计：依据长牡蛎转录组数据预测出的SNP位点，利用Primerpremier 5软件进行引物设计，扩增产物大小控制在50-100bp，本实验最终引物序列为：F：5’-TAGTAAAGACAGGCAGCA-3’；R：5’-
TCATTTGTAGACAGGGAG-3’。引物扩增片段长度为75bp，扩增核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示。
e)引物筛选：从实验群体中随机挑取4个个体的DNA做为模板进行PCR扩增，PCR反应采用10μl体系，以15μl矿物油封口，反应条件如表2所示。
表2
扩增产物用10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行检测，在电压200V下电泳20min。紫外凝胶成像仪下观察结果(图1)。电泳条带清晰单一且在4个模板中一致，表明该引物特异性好且扩增效率高，可用于下一步实验；f)HRM法验证SNP位点：
1)从实验群体中随机挑取8个个体的DNA做为模板，用筛选出的引物重新进行PCR扩增，扩增反应在带裙边的96孔PCR反应板里进行，PCR反应采用10μl体系，以15μl矿物油封口，反应条件如表2所示。
2)反应结束后加入1μl内标和1μl LC-green染料，瞬时离心后95℃变性10min，冷却至室温。
内标为退火温度稳定的短核苷酸序列，长50bp，由高温内标和低温内标等体积混合而成。
3)取出96孔PCR反应板放入LightScanner 96机器进行HRM检测，收集55℃-95℃之间的荧光信号，运行完毕根据熔解曲线进行结果分析(图2)，熔解曲线整齐的位点为验证出的SNP位点。
g)HRM法检测个体基因型：用筛选出的合格引物对实验群体中的144个体进行PCR扩增，得出每个个体的熔解曲线(图3)。具体操作方法同上。
h)关联分析：将表型数据和基因型数据导入GAPIT软件，运行软件进行关联分析。得到全基因组预测的结果，根据全基因组预测结果筛选出与长牡蛎糖原含量性状相关的SNP位点TY202(P＝0.008)，在SEQ ID NO.1中自5’末段起第25个核苷酸。
统计每个个体的糖原含量得出144个个体的糖原含量的平均值，在基因型为T/T的个体糖原含量平均为5.48mg/g，基因型为T/C的个体糖原含量平均为5.59mg/g。基因型为C/C的个体糖原含量平均为4.12mg/g。所以，在该位点基因型为T/T或T/C的个体糖原含量高于基因型为C/C的个体。
实施例2
一种与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记的应用
a)样品的采集：采集青岛神汤沟的野生长牡蛎群体共96只，对其进行解剖，取鳃和闭壳肌，用液氮速冻后于-80℃保存备用。
b)DNA的提取：提取方法同实施例一中的c)。
c)SNP位点TY202基因型检测：
1)以神汤沟的96只野生长牡蛎DNA为模板，用TY202的特异性引物进行PCR扩增，扩增反应在带裙边的96孔PCR反应板里进行，PCR反应采用10μl体系，以15μl矿物油封口，反应条件如表2所示。
2)反应结束后加入1μl内标(内标同上)和1μl LC-green染料，瞬时离心后95℃变性10min，冷却至室温。
3)取出96孔PCR反应板放入LightScanner 96机器进行HRM检测，收集55℃-95℃之间的荧光信号，运行完毕根据熔解曲线进行结果分析，统计每个个体的基因型。
检测后，仅有第40组的基因型为C/C，其他均为基因型为T/T或基因型为T/C，根据实施例1的结论进行预测判断，第40组个体的糖原含量低于其他各组含量，再进行糖原含量的检测。
d)糖原含量的检测：检测方法同实施例一中的d)。
表3数据显示，在SNP位点TY202基因型为T/T的个体糖原含量平均为6.11mg/g，基因型为T/C的个体糖原含量平均为6.76mg/g，基因型为C/C的个体糖原含量为2.50mg/g。以上结果证明，基因型为T/T或T/C的个体糖原平均含量高于基因型为C/C的个体。
经检测，我们的预测结果正确，第40组个体的糖原含量低于其他各组含量。
综上所述，SNP位点TY202与糖原含量是关联的，通过检测SNP位点TY202的基因型，可以预测出个体的糖原含量的高低。
表3
| 个体编号 | 糖原含量 | 基因型 | 个体编号 | 糖原含量 | 基因型 | 个体编号 | 糖原含量 | 基因型 |
| 1 | 8.43 | TT | 33 | 2.19 | TC | 65 | 5.89 | TT |
| 2 | 5.98 | TT | 34 | 3.93 | TT | 66 | 8.35 | TC |
| 3 | 7.84 | TC | 35 | 6.36 | TT | 67 | 5.53 | TT |
| 4 | 4.50 | TT | 36 | 5.23 | TT | 68 | 6.42 | TT |
| 5 | 6.58 | TT | 37 | 4.58 | TT | 69 | 8.99 | TC |
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注：糖原含量单位为mg/g。
Claims (1)
1.一种与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记特异性引物对在糖原含量检测中的应用，所述特异性引物对序列为：F：5’-TAGTAAAGACAGGCAGCA-3’；R：5’-TCATTTGTAGACAGGGAG-3’；
所述SNP标记位于糖原脱支酶基因的第3个外显子上，基因型为Y。
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