CN107354234B

CN107354234B - 用于筛选长牡蛎高糖原含量亲贝的方法及其相关引物对

Info

Publication number: CN107354234B
Application number: CN201710855485.6A
Authority: CN
Inventors: 张国范; 李莉; 孟杰; 宋凯; 李春燕; 刘圣; 史瑞辉
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2017-09-20
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2037-09-20
Also published as: CN107354234A

Abstract

本发明涉及一种用于筛选长牡蛎高糖原含量亲贝的方法及其相关SNP标记的引物对。该SNP位点在基因组DNA中存在A和G两个等位基因形式；其上下游500bp核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。实施结果表明利用该方法可以准确检测该SNP位点，筛选高糖原含量个体。同时该位点GG基因型个体相比较于AA基因型个体，糖原含量显著提高4.5％。后续可以通过该方法，筛选GG基因型的亲贝，指导牡蛎育种。本发明提供了一个筛选长牡蛎高糖原含量个体的SNP标记开发及其潜在应用，其有益效果在于可以在苗种繁育前对亲贝进行基因型鉴定，提高子代糖原含量。本研究结果获得SNP标记可信度更高，适应群体的范围更广，效果更稳定。

Description

用于筛选长牡蛎高糖原含量亲贝的方法及其相关引物对

技术领域

本发明属于基因工程与遗传育种领域，涉及到一种用于筛选长牡蛎高糖原含量亲贝的方法及其相关SNP标记的引物对。

背景技术

牡蛎是一种重要的海洋水产资源，也是世界上最重要的海水养殖贝类之一。我国牡蛎养殖规模和产量多年都稳居世界首位，但是长期以来，我国牡蛎只能自产自销，难以进入高端市场。究其原因，主要是由于在养殖和繁育过程中，只注重牡蛎的高产高量，忽视了其营养品质的含量。而糖原等营养物质的高含量是牡蛎最主要的特色之一，其不仅影响牡蛎的肥满度和产量，同时影响着牡蛎消费口感，是牡蛎产品品质的重要组成部分。所以提高糖原等营养品质的含量并进行遗传改良，是解决我国牡蛎产业高产低效现状的重要途径。

水产动物育种研究起步晚，且目前主要采用传统的群体选育方法，构建家系，其主要弊端在于育种周期长，见效慢。而近年来，随着育种技术发展，分子标记辅助选育以及全基因组选择等逐渐应用于水产动物育种，大大提高了贝类的遗传育种水平，相比较于传统育种，显著提升了性状的选育效率和精度。同时利用分子标记辅助选择可以减少盲目性，缩短育种年限，提高育种的效率。而进行分子育种关键是获得可靠的分子标记。目前普遍采用的手段是性状的QTL定位及全基因组关联分析GWAS。虽然QTL 定位方法能够快速定位与性状相关联的染色体区段，在性状解析方面具有准确度高的特点。但其基于有限减数分裂的连锁分析，定位的基因组大片段的区域都连锁在一起，很难精确定位。而全基因组关联分析GWAS的方法则能全基因组范围内对遗传变异基因进行总体关联分析，将关联位点定位于很小的区间内，显著提高了定位的准确度和精度，尤其适用于复杂性状的遗传解析。

尽管GWAS在作物和畜禽的农业生物研究中发挥了重要作用，但在水产动物中还仅有少量报道。在贝类已有的研究中，分子标记开发主要集中已知的功能基因上，标记相对数目不多，且不一定能获得主效位点，无法对表型的遗传调控机制有一个全面的认识。迄今为止，还未有基于全基因组关联分析获得主效位点的相关报道。但随着长牡蛎全基因组测序的完成以及高密度遗传连锁图谱的获取，本研究团队率先进行了牡蛎关键品质性状的GWAS分析，获得影响品质性状的关键位点及其基因，其中包括控制糖原含量的主效多态性位点及关键基因。而本发明在全基因组关联分析的基础上，开发海量SNP标记，解析决定牡蛎糖原含量的遗传基础，筛选出与糖原含量极显著相关的SNP标记，用于筛选高糖原含量个体。与以往开发的单个SNP位点相比，该研究结果可靠性更强，适用群体范围更广。

发明内容：

本发明的目的是提供一种与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记，为长牡蛎的分子标记辅助选择提供参考。

具体的获取SNP方法如下：(1)材料的收集及同质化驯养：收集486个长牡蛎野生个体，进行同质化养殖。(2)表型数据的测定：利用蒽酮比色发检测牡蛎个体糖原含量。(3)基因分型：Illumina二代测序平台，对486 个牡蛎亲本进行重测序，筛查SNPs位点并进行个体分型，获得用于关联分析的有效SNPs位点。(4)关联分析：利用混合线性模型进行全基因组关联分析，获得与性状显著关联的7个SNP位点(P-value<10^-6)，位于长牡蛎基因组scaffold1597的36,512-37,583bp范围内。通过LD block分析， 7个SNP位点紧密连锁(LD＞0.7)。全基因组关联分析的曼哈顿图见附图1。随后选取位于scaffold1597的36,675碱基处的1个SNP位点(P-value 为2.49×10^-7)，做为后续开发的SNP位点。该位点存在A和G两个碱基形式。位于scaffold 1597的36,512-37,583bp范围内的其它SNP位点都应用相同的鉴定方法。

本发明通过以下技术方案得以实现：

一种与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记：该标记位于长牡蛎基因组 scaffold1597的36,675碱基处，此碱基存在A和G两个碱基形式。所述该位点上下游500bp的序列如SEQ IDNo.1所示。主要检测步骤如下：

1、DNA采用酚-氯仿抽提法，具体步骤如下：

1)取1.5ml离心管，加入700μl DNA提取缓冲液(100mM Tris-HCl， 5mM EDTA)，取3-10mg的牡蛎鳃组织，用剪刀剪碎。所用器皿在两个个体之间必须用火焰灭菌和ddH₂O冲洗以防个体间的交叉污染。加入 35μl SDS，混匀。加入2μl蛋白酶K，混匀。

2)将离心管在65℃金属浴中孵育，1.5小时后每管补加2μl蛋白酶K，期间轻轻摇动离心管组织完全消化后继续孵育半小时以上，总孵育时间至少3小时。

3)将孵育后的样品冷却至室温，加入等体积的PCI，充分混匀，13000 rpm离心10min。重复上述步骤一次。PCI为酚：氯仿：异戊醇(25:24:1) 的混合溶液。

4)将步骤3)的上清液再用氯仿：异戊醇(24:1)抽提1次，13000 rpm离心5min。

5)将步骤4)的上清液移入等体积-20℃异丙醇，来回颠倒充分混匀，-20℃放置20min。

6)将步骤5)的混合液在4℃，13000rpm离心5min。小心倒出所有液体，注意不要让底部的白色沉淀颗粒移动或倒出。

7)用-20℃75％乙醇洗涤2次倒出液体，开口放置离心管晾干乙醇，待白色沉淀变为无色透明时加入50-100μl(具体看DNA的量)ddH2O 来溶解DNA。置于-20℃备用。

2、利用特异引物，进行外围扩增。

取上述长牡蛎基因组DNA为模板，利用引物配制反应体系：基因组 DNA 1uL，通用PCR mix 5uL，引物F和R各0.2uL，灭菌双蒸水3.6uL；所述反应体系可同比放大；

引物为：上游引物F：5’-TCCGAACTTGGAATCCTCTC-3’

下游引物R：5’-GCAAATGTTAAGGTGGCTCA-3’

PCR扩增的反应程序为：

3、SnaPshot模板制备

在15μL PCR产物中加入5U SAP和2U ExoI震荡混匀37℃保温1hr 然后75℃保温15min以灭活SAP和ExoI酶。

4、SnaPshotPCR扩增及纯化。

以PCR产物作为SNaPshot PCR的模板，在纯化好后，每种各取2μL混合。SNaPshotPCR具体步骤为：

特异引物序列为：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTGAGAATTGTAAACCACACACGG-3’

产物纯化：在10μL上述SNaPshot PCR产物中加入1 U SAP，震荡混匀，37℃保温1hr，75℃保温15min以灭活酶，4℃可保存24hr 或-20℃长期保存。

5、毛细管电泳。

1)电泳样品制备：首先将SNaPshot产物稀释20倍：

95℃变性5min，后迅速冰冷4min。

2)毛细管电泳。使用3730XLDNA Analyzer对制备好的样品进行毛细管电泳并搜集信号。环境条件：实验室温度：18-25℃；毛细管长度： 50cm；加热炉温度：60℃；运行电压：15kV。结果使用GeneMapper V4.0 对实验结果进行分析。判断不同基因型。

与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记的潜在应用：到目前为止，除本专利外，在牡蛎中，尚未有基于全基因组关联分析开发SNP标记的报道。本研究结果相对于以往开发的SNP标记，可信度更高，适应群体的范围更广，效果更稳定。在苗种繁育前，通过非致死性取样提取牡蛎基因组DNA，利用如上述所述的SNP标记及其鉴定方法判断亲贝基因型，通过筛选GG基因型亲贝有效提高后代长牡蛎糖原含量。

附图说明

图1是长牡蛎糖原含量全基因组关联分析的曼哈顿图。

具体实施方式：

以下结合实施例来进一步阐释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1：

a)样品的采集：采集胶南同时孵苗的野生群体288个个体，对其进行解剖，取闭壳肌和剩余组织，用液氮速冻后于-80℃保存备用。

b)DNA的提取：提取288个样本的基因组DNA并使用紫外吸光光度法测定浓度，根据测定浓度使用灭菌水将基因组DNA稀释至10-20ng/uL；

c)利用SnaPshot进行SNP位点基因型检测：(1)利用特异引物，进行外围扩增。取上述长牡蛎基因组DNA为模板，利用引物F和R配制反应体系：基因组DNA 1uL，通用PCR mix5uL，引物F和R各0.2uL，灭菌双蒸水3.6uL；所述反应体系可同比放大；引物序列为：

上游引物F：5’-TCCGAACTTGGAATCCTCTC-3’

下游引物R：5’-GCAAATGTTAAGGTGGCTCA-3’

PCR扩增的反应程序为：

(2)SnaPshot模板制备。在15μL PCR产物中加入5U SAP和2U ExoI 震荡混匀37℃保温1hr然后75℃保温15min以灭活SAP和ExoI 酶。

(3)SnaPshotPCR扩增及纯化。以PCR产物作为SNaPshot PCR的模板，在纯化好后，每种各取2μL混合。SNaPshot PCR具体步骤为：

特异引物序列为：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTGAGAATTGTAAACCACACACGG-3’

产物纯化：在10μL上述SNaPshot PCR产物中加入1U SAP，震荡混匀，37℃保温1hr，75℃保温15min以灭活酶，4℃可保存24hr 或-20℃长期保存。

(4)毛细管电泳。电泳样品制备：首先将SNaPshot产物稀释20倍：

95℃变性5min，后迅速冰冷4min。使用3730XLDNA Analyzer 对制备好的样品进行毛细管电泳并搜集信号。环境条件：实验室温度：18-25℃；毛细管长度：50cm；加热炉温度：60℃；运行电压：15kV。结果使用GeneMapper V4.0对实验结果进行分析。判断不同基因型。

d)结果分析:检测后，有第86个个体基因型为G/G，141个个体基因型为A/G，61个个体基因型为A/A。

e)糖原含量的检测：数据显示，得到不同基因型糖原含量的顺序为 GG>AG>AA。GG基因型糖原含量相较于AA型，提高4.5％。所以，该位点的分型与糖原含量是显著关联的。育种中通过筛选GG型个体，可以显著提高后代糖原含量。

表1：288个个体糖原含量和基因分型分析。

序列表(1)SEQ ID NO.1的信息序列特征长度：1001bp

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线形

分子类型：DNA

来源：长牡蛎

序列描述：

>scaffold1597

CAATGGTTTTTTTTTTACTACTACCTCAGAATTAAAAAATTGTACATCTGATACAAAATGGC GGGGCAGGGTGCGGTCTAGCGGTGGAGTTTAATATCCTTGATGTGGATAAAAAGCAATTAGT GGAACTGTCAGAGAAGAGAAAAATGGCGATGTTTCTTCGATTCGCAAATCATATGCCTGACA GGTTCTCAAATTTTACAATTTACGATTTATTGGCCTTGATTTATAACAGCAGATCATTTTTG GTCAATGTCCCGAGTGTCTTGTTTCTGTACTGAGCAGCCACGCGTGCACAATAGTAATTTCC GAACTTGGAATCCTCTCATATCGGCGAAGACGGGCCGAAAATAACTGATACCGCGAATAGTC AAAAAATGTCTGTTAACAGTGAAGCGTTAACAGTGAAATTTTGCACCATCTTTTTCAAAACG TCCCATCTTCAGCAACATTTGACTGTTTAGTGTTGTTTAAAAGAGAACGATGTCCAATAGGT TTTTACCGTGTGTGGTTTACAATTCTCCCTATAATTCTCCTTCCCACAGGGCCGTAGATTAC GGGTCGGCGGAACATAAGCGGGCCTCAACCATGCCGTCACAGGGTTCACTGTTCACCAATTT TGAGGAAGTTCAGGTAAGATCTCACCTTTGGCAATCTAATATACTAGTAGCAGTATCCTAGT GAGCCACCTTAACATTTGCTTTTCGTTTTTGAAGATTTTGAAACAGACCAAAAAAAATATCA TGTTCATTTCATCATTTTGAGAATTTTGAATTAACTAGATAAATAAGTGTAAATACAAAATT TACAATTTTTAAAACAAAGTATACTTGTATTGTGTGAAAATACATAGTTATTTCTAGCCCTG AAAAACTAAAAATATACACTTGTAGTATGTATTATAGATCGTGTGTCGTGGGAATATTTTGG GAAAACTGTGGTTTCAACATTATTTATAGGCATCAATTTAGAAATTAAAGCACAGTTACAAA CTATGGTTA。

本发明SNP位点在基因组DNA中存在A和G两个等位基因形式；其上下游500bp核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。实施结果表明利用该方法可以准确检测该SNP位点，筛选高糖原含量个体。同时该位点GG基因型个体相比较于AA基因型个体，糖原含量显著提高4.5％。后续可以通过该方法，筛选GG基因型的亲贝，指导牡蛎育种。本发明提供了一个筛选长牡蛎高糖原含量个体的SNP标记开发及其潜在应用，其有益效果在于可以在苗种繁育前对亲贝进行基因型鉴定，提高子代糖原含量。本研究结果获得SNP标记可信度更高，适应群体的范围更广，效果更稳定。

序列表

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 一种用于筛选长牡蛎高糖原含量亲贝的方法及其相关SNP标记的引物对

<141> 2017-09-20

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> gene

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1001)

<400> 1

caatggtttt ttttttacta ctacctcaga attaaaaaat tgtacatctg atacaaaatg 60

gcggggcagg gtgcggtcta gcggtggagt ttaatatcct tgatgtggat aaaaagcaat 120

tagtggaact gtcagagaag agaaaaatgg cgatgtttct tcgattcgca aatcatatgc 180

ctgacaggtt ctcaaatttt acaatttacg atttattggc cttgatttat aacagcagat 240

catttttggt caatgtcccg agtgtcttgt ttctgtactg agcagccacg cgtgcacaat 300

agtaatttcc gaacttggaa tcctctcata tcggcgaaga cgggccgaaa ataactgata 360

ccgcgaatag tcaaaaaatg tctgttaaca gtgaagcgtt aacagtgaaa ttttgcacca 420

tctttttcaa aacgtcccat cttcagcaac atttgactgt ttagtgttgt ttaaaagaga 480

acgatgtcca ataggttttt accgtgtgtg gtttacaatt ctccctataa ttctccttcc 540

cacagggccg tagattacgg gtcggcggaa cataagcggg cctcaaccat gccgtcacag 600

ggttcactgt tcaccaattt tgaggaagtt caggtaagat ctcacctttg gcaatctaat 660

atactagtag cagtatccta gtgagccacc ttaacatttg cttttcgttt ttgaagattt 720

tgaaacagac caaaaaaaat atcatgttca tttcatcatt ttgagaattt tgaattaact 780

agataaataa gtgtaaatac aaaatttaca atttttaaaa caaagtatac ttgtattgtg 840

tgaaaataca tagttatttc tagccctgaa aaactaaaaa tatacacttg tagtatgtat 900

tatagatcgt gtgtcgtggg aatattttgg gaaaactgtg gtttcaacat tatttatagg 960

catcaattta gaaattaaag cacagttaca aactatggtt a 1001

Claims

1.一种用检测SNP标记位点的引物筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法，其特征在于：

所述SNP标记位点位于序列SEQ ID No.1第501bp处，该位点存在A和G两个碱基形式，在苗种繁育前对长牡蛎亲贝进行该SNP标记位点基因型鉴定，不同基因型糖原含量的顺序为GG>AG>AA，通过筛选该位点GG基因型的长牡蛎亲贝，提高后代群体的糖原含量;

包括步骤如下：

（1）所述长牡蛎亲贝基因组DNA的提取，具体为提取长牡蛎亲贝基因组DNA，使用灭菌水或TE缓冲液稀释到10-20ng/µL;

（2）取上述长牡蛎亲贝基因组DNA为模板，利用引物配制反应体系：

具体反应体系为：基因组DNA 1µL，通用PCR mix 5µL，上游引物F和下游引物R各0.2µL，灭菌双蒸水3.6µL；

所述上游引物F为：5’-TCCGAACTTGGAATCCTCTC-3’，

所述下游引物R为：5’-GCAAATGTTAAGGTGGCTCA-3’；

(3）PCR扩增的反应程序为：

（4）SnaPshot 模板制备：在15µL PCR产物中加入5U SAP和2U ExoI震荡混匀37℃保温1小时，然后75℃保温15 min以灭活SAP和ExoI酶;

（5）SnaPshot PCR扩增及纯化：以PCR产物作为SnaPshot PCR的模板，SnaPshot PCR的特异引物序列为：

5’- TTTTTTTTTTTTTTTGAGAATTGTAAACCACACACGG-3’

产物纯化：在10µL上述SnaPshot PCR产物中加入1 U SAP，震荡混匀，37℃保温1 小时，75℃保温15 min以灭活酶，4℃保存24小时或-20℃长期保存;

（6）毛细管电泳

1）电泳样品制备：首先将SnaPshot 产物稀释 20 倍：

试剂范围为：10µL总体积中包含Hi-Di Formamid 9.25µL，GS-120LIZ 0.25µL，SnaPshot产物0.5µL;

95℃变性5 min，后迅速冰冷 4 min;

2）毛细管电泳：使用3730XLDNA Analyzer对制备好的样品进行毛细管电泳并搜集信号;环境条件：实验室温度：18-25 ℃；毛细管长度：50cm；加热炉温度：60℃；运行电压：15kV,结果使用 GeneMapper V4.0 对实验结果进行分析,判断不同基因型。