CN107475413B - 一种筛选高不饱和脂肪酸c20:3ω6含量长牡蛎亲贝的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鉴定长牡蛎高不饱和脂肪酸二十碳三烯酸(C20:3Ω6)含量个体的SNP标记开发及其应用方法。通过前期全基因组关联分析，鉴定出位于长牡蛎1号染色体上的38个与C20:3Ω6含量显著相关的成簇SNP信号。本发明针对该区域scaffold460_104,049碱基处的1个SNP位点，开发了其相应的检测方法，该位点存在A/T两种碱基形式，上下游500bp的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。通过该检测方法，筛选AT基因型的亲贝，指导牡蛎育种。本发明提供了在苗种繁育前对亲贝进行基因型鉴定，提高子代不饱和脂肪酸含量的方法，其结果是基于全基因组关联分析获得的SNP标记，效果更稳定。
Description
技术领域
本发明属于基因工程与遗传育种领域，涉及到一种筛选高不饱和脂肪酸C20:3Ω6含量长牡蛎亲贝的方法及相关的SNP的引物对。
背景技术
牡蛎是一种重要的海洋水产资源，也是世界上最重要的海水养殖贝类之一。尽管我国牡蛎产量很高，但出口量仅占世界牡蛎贸易量的3.3％，且平均价格仅为其他国家牡蛎产品的1/3，这表明我国产牡蛎大多只能自产自销，难以进入国际市场和国内的高端市场。而中国产牡蛎在国际市场难觅踪迹的主要原因是产品规格达不到国际贸易的品质标准，事实上这也是我国牡蛎养殖产业整体效益长期在低水平徘徊的主要原因。因此，要高我国养殖牡蛎的经济效益，实现产业由高产低效向高产高效模式的转型升级，提高牡蛎产品品质是亟需解决的问题。
多不饱和脂肪酸是海洋贝类中关注的一个重要的品质性状，也是重要的重要的膳食脂肪酸。牡蛎等海氧无脊椎动物也以富含多种不饱和脂肪酸而闻名。多不饱和脂肪酸主要分为Ω-3和Ω-6两个系列，Ω-6系列脂肪酸属于必需脂肪酸，即必须由食物中取得，无法在人体内自行合成。所以提高食用牡蛎中的Ω-6多不饱和脂肪酸的含量对于提高牡蛎品质以及人体健康具有非常重要的作用。而本项目中C20:3Ω6即属于Ω-6系列不饱和脂肪酸的一种。
我国水产动物育种研究起步晚，目前主要采用传统的选择，杂交，周期长，见效慢。近些年来，基因组学发展，分子标记辅助选育以及全基因组选择等育种技术也得到了迅猛发展，大大提高了牡蛎的遗传育种水平，不但使复杂品质性状的育种成为可能，同时也将显著的提升性状的选育效率和精度。同时利用分子标记辅助选择可以减少盲目性，缩短育种年限，提高育种的效率。而进行分子育种，获得与性状显著相关的SNP标记是关键。而目前获得分子标记的方法主要包括QTL定位及全基因组关联分析的方法。虽然QTL定位能够快速定位与性状相关联的染色体区段，但由于其基于有限减数分裂的连锁分析，定位的基因组大片段的区域都连锁在一起，很难精确定位。而全基因组关联分析方法则能够克服这一缺点，在全基因组范围内对遗传变异基因进行总体关联分析，将关联位点定位于很小的区间内，显著提高了定位的准确度和精度，尤其适用于复杂性状的遗传解析。近年来，随着非模式生物全基因组测序的完成，应用GWAS方法研究复杂数量性状基因定位已成流行趋势。
尽管GWAS在作物和畜禽的农业生物研究中发挥了重要作用，但在水产动物中还仅有少量报道。而目前已报道的水产动物，尤其是双壳贝类获得SNP的方法主要采用候选基因关联分析。但是这种方法是根据先验信息，在已知的功能基因上进行多态性位点的开发，标记相对数目不多，不一定能获得主效位点，且无法对表型的遗传调控机制有一个全面的认识。随着长牡蛎全基因组测序的完成以及高密度遗传连锁图谱的获取，使得进行GWAS分析成为可能。本发明基于长牡蛎基因组，通过二代测序技术进行全基因组重测序，并针对不饱和脂肪酸含量进行全基因组关联分析，获得控制其含量的主效多态性位点及关键基因。与以往开发的SNP位点相比，本发明获得的SNP信号可信度更高，适应群体范围更广，更有效应用于进行不饱和脂肪酸含量的筛选。
发明内容：
本发明的目的是提供一种与长牡蛎不饱和脂肪酸C20:3Ω6含量相关的SNP标记，为长牡蛎的分子标记辅助选择提供参考。
具体的获取SNP方法如下：(1)实验材料的收集及同质化驯养：收集486个长牡蛎野生个体，进行同质化养殖。(2)表型数据的测定：利用气相色谱法对长牡蛎个体进行C20:3Ω6含量测定。(3)基因分型：采用二代测序技术平台，对486个牡蛎亲本进行重测序，筛查SNPs位点并进行个体分型，获得用于关联分析的有效SNPs位点，构建牡蛎的单倍型图谱。(4)关联分析：利用混合线性模型进行全基因组关联分析，获得与性状显著关联的38个SNP位点(P-value<10-6)，位于长牡蛎基因组scaffold 460的15,302-114,852bp范围内。通过LDblock分析，38个SNP位点紧密连锁(LD＞0.7)。全基因组关联分析获得的曼哈顿图如附图1所示。随后选取位于scaffold460_104,049bp上的碱基，P-value为5.53×10-10，做为后续开发的SNP位点。该位点存在A和T两个碱基形式。本研究中，位于scaffold 460的15,302-114,852bp范围内的其它SNP位点都应用相同的鉴定方法。本发明通过以下技术方案得以实现：
长牡蛎基因组DNA为模板，利用特异引物，进行外围扩增:
上游引物F：5’-ACGTCACAAGTAGGTGTTTAGAGA-3’
下游引物R：5’-CTTTTCACGTCTCGCCATTCC-3’。
SNP标记位于长牡蛎基因组1号染色体scaffold460_104,049碱基处；该位点存在A和T两个碱基形式，在苗种繁育前对亲贝进行该SNP标记位点基因型鉴定，不同基因型C20:3Ω6含量的顺序为AT>TT>AA，根据该SNP标记位点不同基因型的亲贝选择，通过筛选该位点AT基因型的亲贝，提高后代群体的C20:3Ω6含量；包括步骤如下：
1)提取长牡蛎基因组DNA，使用灭菌水或TE缓冲液稀释10-20ng/uL；利用特异引物，进行外围扩增:2)取上述长牡蛎基因组DNA为模板，利用特异引物F和R配制反应体系：
上游引物F：5’-ACGTCACAAGTAGGTGTTTAGAGA-3’
下游引物R：5’-CTTTTCACGTCTCGCCATTCC-3’；
基因组DNA 1uL，通用PCR mix 5uL，引物F和R各0.2uL，灭菌双蒸水3.6uL；所述反应体系可同比放大；
3)PCR扩增的反应程序为：
4)SnaPshot模板制备：
在15μL PCR产物中加入5U SAP和2U ExoI震荡混匀37℃保温1小时，然后75℃保温15min以灭活SAP和ExoI酶；
5)SnaPshotPCR扩增及纯化：
特异引物序列为：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGGACCGAACTTTATGAACT-3’
产物纯化：在10μL上述SNaPshot模板中加入1U SAP，震荡混匀，37℃保温1hr，75℃保温15min以灭活酶，4℃可保存24小时或-20℃长期保存；
6)毛细管电泳；
电泳样品制备：首先将SNaPshot产物稀释20倍：
试剂范围为：Hi-Di Formamid9.25μL，GS-120LIZ 0.25μL，SnaPshot产物0.5μL，
95℃变性5min，后迅速冰冷4min；
毛细管电泳：使用3730XLDNA Analyzer对制备好的样品进行毛细管电泳并搜集信号；环境条件：实验室温度：18-25℃；毛细管长度：50cm；加热炉温度：60℃；运行电压：15kV；结果使用GeneMapper V4.0对实验结果进行分析；判断不同基因型。
产物纯化：在10μL上述SNaPshot PCR产物中加入1U SAP，震荡混匀，37℃保温1hr，75℃保温15min以灭活酶，4℃可保存24hr或-20℃长期保存。
5、毛细管电泳。
1)电泳样品制备：首先将SNaPshot产物稀释20倍：
95℃变性5min，后迅速冰冷4min。
2)毛细管电泳。使用3730XLDNA Analyzer对制备好的样品进行毛细管电泳并搜集信号。环境条件：实验室温度：18-25℃；毛细管长度：50cm；加热炉温度：60℃；运行电压：15kV。结果使用GeneMapper V4.0对实验结果进行分析。判断不同基因型。
与长牡蛎不饱和脂肪酸C20:3Ω6含量相关的SNP标记的潜在应用：到目前为止，除本专利外，在牡蛎中，尚未有基于全基因组关联分析开发SNP标记的报道。本研究结果相对于以往开发的SNP标记，可信度更高，适应群体的范围更广，效果更稳定。在苗种繁育前，通过非致死性取样提取牡蛎基因组DNA，利用如上述所述的SNP标记及其鉴定方法判断亲贝基因型，通过筛选AT基因型亲贝有效提高后代长牡蛎不饱和脂肪酸C20:3Ω6含量。
附图说明
1.图1是C20:3Ω6含量全基因组关联分析的曼哈顿图。
具体实施方式：
以下结合实施例来进一步阐释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1：
a)样品的采集：采集胶南同时孵苗的野生群体100个个体，对其进行解剖，取闭壳肌和剩余组织，用液氮速冻后于-80℃保存备用。
b)DNA的提取：提取100个样本的基因组DNA并使用紫外吸光光度法测定浓度，根据测定浓度使用灭菌水将基因组DNA稀释至10-20ng/uL；
c)利用SnaPshot进行SNP位点基因型检测：(1)利用特异引物，进行外围扩增。取上述长牡蛎基因组DNA为模板，利用引物F和R配制反应体系：基因组DNA 1uL，通用PCR mix5uL，引物F和R各0.2uL，灭菌双蒸水3.6uL；所述反应体系可同比放大；引物序列为：
上游引物F：5’-ACGTCACAAGTAGGTGTTTAGAGA-3’
下游引物R：5’-CTTTTCACGTCTCGCCATTCC-3’
PCR扩增的反应程序为：
(2)SnaPshot模板制备。在15μL PCR产物中加入5U SAP和2U ExoI震荡混匀37℃保温1hr然后75℃保温15min以灭活SAP和ExoI酶。
(3)SnaPshotPCR扩增及纯化。以PCR产物作为SNaPshot PCR的模板，在纯化好后，每种各取2μL混合。SNaPshot PCR具体步骤为：
引物序列为：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGGACCGAACTTTATGAACT-3’
产物纯化：在10μL上述SNaPshot PCR产物中加入1U SAP，震荡混匀，37℃保温1hr，75℃保温15min以灭活酶，4℃可保存24hr或-20℃长期保存。
(4)毛细管电泳。电泳样品制备：首先将SNaPshot产物稀释20倍：
95℃变性5min，后迅速冰冷4min。使用3730XLDNA Analyzer对制备好的样品进行毛细管电泳并搜集信号。环境条件：实验室温度：18-25℃；毛细管长度：50cm；加热炉温度：60℃；运行电压：15kV。结果使用GeneMapper V4.0对实验结果进行分析。判断不同基因型。
d)结果分析:检测后，仅有9个个体基因型为A/A，33个个体基因型为T/A，45个个体基因型为T/T，13个个体基因型为NN，
e)不饱和脂肪酸C20:3Ω6含量的检测：数据显示，可以得到不同基因型C20:3Ω6含量的顺序为AT>TT>AA。AT基因型C20:3Ω6含量相较于AA和TT型，C20:3Ω6含量显著提高47％和11％。所以，该位点的分型与C20:3Ω6含量是显著关联的。育种中通过筛选AT型个体，可以显著提高后代C20:3Ω6含量。
表1：100个个体不饱和脂肪酸C20:3Ω6含量和基因分型分析。
序列表(1)SEQ ID NO.1的信息序列特征长度：1001bp，scaffold460_104,049位点上下游500bp。
类型：核酸
链型：单链
拓扑结构：线形
分子类型：DNA
来源：长牡蛎
序列描述：
CATCACATTGTAAGCGGTTTTATTGGCGAAGATCAGAGATGATAATAAGGAAAGGTCAATCATTTCTTCTTAAGGACTGAAGCAAAAGACTCCGGACTTCGCGCATATAACCGATACACAATTATTAAGCTATTTTATAAGTGAAAGTCATATAAATAAAGTAATTGTGATTGACACTTGGATTATCAAAACCTGCGGTATATTACATATATCTATAAACACCATAAAATACGCTCAAACTAAAATTACCGATGTAATTACAGGCAAAATACAGAAAACATAATAGTTTTATGTCTACGTCACAAGTAGGTGTTTAGAGACAATGCTACTATCGACAGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGTGCAAATCTCTCTTAATTAATTAAAACATTACAAATGATTTGCCATTTGTAACACCATCTTTGCTTTTTGTAGAAATCATTTCTTTCACACCTTTACCGACAGCGGGGACCGAACTTTATGAACTAAATGTGTTGTTAACTTACCAAAACTTTTCAAGTTTTCTCGAGACAGCATTGTTCGAATGAAAAAGCGGTAGGAATGGCGAGACGTGAAAAGTTTCTTTTTTCTGTAAAATAATGTTGTATTTAAAAATCTTTCTATTGGTATAACAAAGACAATATTTTAAAAGAAAATCCGAGGTTGTTATTTCAAATTGACACGATATTGTTCCAAACACGAAGCAATTTCTTGTATCAACAGTGATGTAGCAAGATAACAGATCGTACATCGACAAAACGATTAACATCAATTAAATTCACTCGTTCATAAAATGTTTCAATCAAAAGGGATATTCTGTATGTATTGGTGAAGATATTAGCACAGAATGACTATTACATTGTGTCATTAATCTTATAAATATTTGATTTTGGTCTTAAAAGGAATGTGTAGGAAATTACGTTTAAAGTTTCATACCCGAAAATGTAAACGGTTAATTTAAAAACATTTAACAGCCTGTGACCGCGGA。
本发明通过前期全基因组关联分析，鉴定出位于长牡蛎1号染色体上的38个与C20:3Ω6含量显著相关的成簇SNP信号。本发明针对该区域scaffold460_104,049碱基处的1个SNP位点，开发了其相应的检测方法，该位点存在A/T两种碱基形式，上下游500bp的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。通过该检测方法，筛选AT基因型的亲贝，指导牡蛎育种。本发明提供了在苗种繁育前对亲贝进行基因型鉴定，提高子代不饱和脂肪酸含量的方法，其结果是基于全基因组关联分析获得的SNP标记，效果更稳定。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 一种筛选提高不饱和脂肪酸C20:3Ω6含量长牡蛎的方法相关的SNP的引物对
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1001
<212> DNA
<213> gene
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1001)
<400> 1
catcacattg taagcggttt tattggcgaa gatcagagat gataataagg aaaggtcaat 60
catttcttct taaggactga agcaaaagac tccggacttc gcgcatataa ccgatacaca 120
attattaagc tattttataa gtgaaagtca tataaataaa gtaattgtga ttgacacttg 180
gattatcaaa acctgcggta tattacatat atctataaac accataaaat acgctcaaac 240
taaaattacc gatgtaatta caggcaaaat acagaaaaca taatagtttt atgtctacgt 300
cacaagtagg tgtttagaga caatgctact atcgacagct ctctctctct ctctctctct 360
ctctctctct ctctgtgcaa atctctctta attaattaaa acattacaaa tgatttgcca 420
tttgtaacac catctttgct ttttgtagaa atcatttctt tcacaccttt accgacagcg 480
gggaccgaac tttatgaact aaatgtgttg ttaacttacc aaaacttttc aagttttctc 540
gagacagcat tgttcgaatg aaaaagcggt aggaatggcg agacgtgaaa agtttctttt 600
ttctgtaaaa taatgttgta tttaaaaatc tttctattgg tataacaaag acaatatttt 660
aaaagaaaat ccgaggttgt tatttcaaat tgacacgata ttgttccaaa cacgaagcaa 720
tttcttgtat caacagtgat gtagcaagat aacagatcgt acatcgacaa aacgattaac 780
atcaattaaa ttcactcgtt cataaaatgt ttcaatcaaa agggatattc tgtatgtatt 840
ggtgaagata ttagcacaga atgactatta cattgtgtca ttaatcttat aaatatttga 900
ttttggtctt aaaaggaatg tgtaggaaat tacgtttaaa gtttcatacc cgaaaatgta 960
aacggttaat ttaaaaacat ttaacagcct gtgaccgcgg a 1001
Claims (1)
1.一种用检测SNP标记位点的引物筛选高不饱和脂肪酸C20:3Ω6含量长牡蛎亲贝的方法，其特征在于：
所述SNP标记位点位于序列表SEQ ID NO.1第501bp处，该位点存在A和T两个碱基形式，在苗种繁育前对长牡蛎亲贝进行该SNP标记位点基因型鉴定，不同基因型C20:3Ω6含量的顺序为AT>TT>AA，通过筛选该位点AT基因型的长牡蛎亲贝，提高后代群体的C20:3Ω6含量；
包括步骤如下：
(1)提取长牡蛎亲贝基因组DNA，使用灭菌水或TE缓冲液稀释到10-20ng/uL；
(2)取上述长牡蛎亲贝基因组DNA为模板，配制反应体系：
基因组DNA 1uL，通用PCR mix 5uL，上游引物F和下游引物R各0.2uL，灭菌双蒸水3.6uL；
所述上游引物F为：5’-ACGTCACAAGTAGGTGTTTAGAGA-3’
所述下游引物R为：5’-CTTTTCACGTCTCGCCATTCC-3’；
(3)PCR扩增的反应程序为：
(4)SnaPshot模板制备：
在15μL PCR产物中加入5U SAP和2U ExoI震荡混匀37℃保温1小时，然后75℃保温15min以灭活SAP和ExoI酶；
(5)SnaPshotPCR扩增及纯化：
以PCR产物作为SnaPshotPCR的模板，SnaPshotPCR的特异引物序列为：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGGACCGAACTTTATGAACT-3’
产物纯化：在10μL上述SNaPshotPCR产物中加入1U SAP，震荡混匀，37℃保温1小时，75℃保温15min以灭活酶，4℃保存24小时或-20℃长期保存；
(6)毛细管电泳；
电泳样品制备：首先将SNaPshot产物稀释20倍：
试剂范围为：10μL总体积包含：Hi-Di Formamid 9.25μL，GS-120LIZ 0.25μL，SnaPshot产物0.5μL；
95℃变性5min，后迅速冰冷4min；
毛细管电泳：使用3730XLDNA Analyzer对制备好的样品进行毛细管电泳并搜集信号；环境条件：实验室温度：18-25℃；毛细管长度：50cm；加热炉温度：60℃；运行电压：15kV；结果使用GeneMapper V4.0对实验结果进行分析，判断不同基因型。
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