CN105506162B - 长牡蛎快速生长相关的snp标记及其鉴定方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了长牡蛎快速生长相关的SNP标记及其鉴定方法和应用，属于分子生物学DNA标记技术与应用领域。本发明运用高分辨率熔解曲线分析技术和从EST公共数据库中挖掘出的108个SNP位点对连续选育5代的长牡蛎快速生长群体进行基因分型，通过关联分析得到3个与长牡蛎生长性状紧密相关的等位基因。所述3个SNP标记优势等位基因可应用于快速生长长牡蛎亲本的筛选，为快速生长长牡蛎的选育工作提供科学的辅助工具。该方法与传统育种方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点，且操作简单，检测快速、成本低，便于广泛推广使用。

Description

长牡蛎快速生长相关的SNP标记及其鉴定方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种与长牡蛎快速生长相关的SNP标记及其鉴定方法和应用。

背景技术

长牡蛎(Crassostrea gigas)又称太平洋牡蛎，属于瓣鳃纲，珍珠贝目，牡蛎科，自然分布于日本、中国和韩国沿海。长牡蛎具有环境适应性强、生长快、肉质细腻和营养丰富等优点，是世界上养殖范围最广、产量最高的经济贝类。长牡蛎是我国传统的重要养殖品种，但是近年来随着养殖集约化程度的提高和养殖海区环境的恶化，长牡蛎出现死亡率高、出肉率低、个体小型化等问题，严重影响了牡蛎养殖业的健康发展。因此，进行长牡蛎的遗传改良，培育具有优质、高产、抗逆等优良性状的新品种，已成为牡蛎养殖业亟待解决的问题。

传统的杂交、选择等育种手段在贝类的品种遗传改良中已初见成效。但是传统杂交方法费时、费力，育种效率低，且受人为因素影响较大，育种效果并不十分理想。随着分子生物学技术的快速发展，以分子标记为基础的分子标记辅助选择育种技术为水产动物的遗传改良提供了有力工具，可显著提高选择育种的效率和精确性。其中，SNP作为目前最具发展潜力的分子标记，因其在基因组中数量多、分布广且遗传稳定性高，易于实现高通量自动化分析的优势，已被广泛应用于动植物遗传育种研究中。如果SNP标记可以与长牡蛎生长性状相关联，就可以实现从DNA水平上进行选择育种，克服传统方法受人为因素影响较大的缺点，大大提高选择的准确性，并可在早期鉴定出具有优良性状的个体，从而缩短育种周期，加快育种进程。

发明内容

针对现有技术发展的现状，本发明的目的是提供了3个与长牡蛎快速生长相关的SNP等位基因，并建立了一种快速、准确、有效地利用SNP标记检测长牡蛎优良个体的方法，能够在早期就鉴定出具有生长优良性状的长牡蛎个体，大大缩短了长牡蛎育种周期。

为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案如下：

长牡蛎快速生长相关的SNP标记，其特征在于：

第一个SNP标记命名为jl027，其位于NCBI网站上登录号为FQ668499的EST序列的第514个碱基处，突变类型为：A/G；

第二个SNP标记命名为jl090，其位于NCBI网站上登录号为HS232693的EST序列的第615个碱基处，突变类型为：C/T；

第三个SNP标记命名为jl615，其位于NCBI网站上登录号为HS189919的EST序列的第557个碱基处，突变类型为：C/T。

所述的三种SNP标记的筛选方法，包括如下步骤：

1)实验群体的获得：以长牡蛎养殖群体作为繁殖亲本，通过连续5代的选择育种而培育出的长牡蛎快速生长系；对照组为随机选择的长牡蛎养殖群体；快速生长系在壳高、壳长、壳宽、总重及软体部重5项生长指标上显著优于对照组(P<0.01)；

2)验证群体的获得：在长牡蛎养殖群体中，以壳高和总重为选择指标，选出表型值的极大群体和极小群体，记为验证群体，用于验证通过步骤1)实验群体筛选得到的SNP位点；

3)利用从EST序列中开发的具有多态性且分型效果好的SNP标记进行基因分型，运用卡方检验分析SNP标记在快速生长系和对照组中的等位基因频率分布差异，初步筛选出9个SNP位点与生长性状相关联(P<0.0001)；

4)用步骤3)中筛选出的9个SNP位点在验证群体中进行验证，经卡方检验最终得到3个与长牡蛎生长性状相关联的SNP位点(P<0.01)；3个SNP位点的优势等位基因为jl027位点的等位基因G、jl090位点的等位基因C和jl615位点的等位基因C。

所述的3个SNP标记的扩增引物分别为：

jl027-F：GACCAGACCTGGAGCGAGAAC，

jl027-R:TTCACTGCATTGGTAGAATCCTC；

jl090-F:GCGACAGATACCAACAACGTACAG，

jl090-R:CACAGTCCTTGAGATTGTTCTTGAT；

jl615-F:ACTCAAGTCAGCGTACAAATCGTT，

jl615-R:GACACGTTCTGTAGCGGTAGGAG。

所述的SNP标记在筛选快速生长长牡蛎亲本中的应用，其特征在于，该应用为：检测长牡蛎亲本在所述jl027、jl090和jl6153位点的等位基因，将同时具有jl027位点的等位基因G、jl090位点的等位基因C和jl615位点的等位基因C的个体选作亲本。

进一步的，上述应用的具体方法为：1)从待测亲本中剪取闭壳肌样品，提取DNA；

2)以提取得到的DNA为模板，利用所述3个SNP标记的引物进行PCR扩增和高分辨率熔解曲线分析技术对每个亲本样品进行基因分型，将同时存在jl027的等位基因G、jl090的等位基因C、jl615的等位基因C的个体保留，即为长牡蛎快速生长亲本。利用本方法将生产中同时具有这3个优势等位基因的个体选作亲本，可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，从而缩短育种周期，加快育种进程。

进一步的，所述的高分辨率熔解曲线分析的反应体系为：

高分辨率熔解曲线分析的反应条件为：95℃预变性5mim，95℃变性10s；touchdown程序10s，为63℃-60℃，每个循环下降0.5℃；72℃延伸10s，10s末收集单个荧光，40个循环；95℃反应1min，40℃反应1min，同时收集荧光信号，1个循环；70-90℃读取荧光曲线，25次/℃。

本发明的优点和有益效果：

1)本发明选用的SNP标记是从保守性较高的EST序列中开发得到的，这些标记与表达基因紧密连锁或直接位于基因的编码区内，提高了筛选相关基因的效率。

2)本发明通过HRM分析进行基因分型，既保证了检测结果的可靠性，也避免了测序分析的繁琐操作，极大地提高了实验效率。

3)与传统的选育方法相比，本发明具有目的性强、作用效果直接的特点，能够快速获得生长速度快且遗传稳定的长牡蛎个体；本发明操作简单、检测快速成本低，便于广泛推广使用。

附图说明

图1为长牡蛎生长性状相关的SNP标记筛选流程图。

图2为SNP位点jl27的高分辨率熔解曲线图。

图3为SNP位点jl90的高分辨率熔解曲线图。

图4为SNP位点jl615的高分辨率熔解曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细阐述。

实施例：

1、与长牡蛎快速生长相关的SNP标记筛选，筛选流程如图1所示：

1)2014年7月选取24月龄的经连续选育5代的长牡蛎快速生长系的96个个体，对照组为取自荣成市普通养殖群体的96个个体，共计192个个体作为实验群体，用于与生长相关SNP位点的初步筛选；快速生长系群体在壳高、壳长等5项生长指标上显著优于普通养殖群体(P<0.01)，见表1。

表1快速生长系与普通养殖群体生长性状的比较

注：表中数值为平均值±标准误差，同列间标注不同字母的表示该生长性状在两个群体中差异极显著(P<0.01)。

2)2015年12月，在取自乳山市的长牡蛎养殖群体中随机选择300个个体，取48个壳高大于92.24mm且总重大于101.12g的高值个体，作为极大群体，取48个壳高小于90.75mm且总重小于86.55g的低值个体，作为极小群体，此96个个体作为验证群体，用于验证通过步骤1)的实验群体筛选出的SNP位点；

表2极大群体与极小群体生长性状的比较

注：表中数值为平均值±标准误差，同列间标注不同字母的表示该生长性状在两个群体中差异极显著(P<0.01)。

3)利用从EST库中开发的具有多态性且分型效果好的108个SNP标记对实验群体进行基因分型，分型结果运用卡方检验分析108个SNP标记在选育群体和普通养殖群体中的等位基因频率分布差异，初步筛选出9个SNP位点与长牡蛎生长性状相关联(P<0.0001)；

4)用步骤3)中筛选出的9个SNP位点在验证群体中进行验证，经卡方检验最终得到3个与生长性状相关联的SNP位点，3个位点的最有利等位基因为jl027位点的等位基因G、jl090位点的等位基因C和jl615位点的等位基因C。所述3个SNP的位点信息如表3所示；SNP位点jl27、jl90和jl615的高分辨率熔解曲线如图2-4所示。

表3长牡蛎生长相关的SNP位点信息

2、筛选得到的三个SNP标记在长牡蛎亲本优选的具体应用为：

1)从待测个体中剪取闭壳肌样品，提取DNA；

2)以提取得到的DNA为模板，利用3个SNP位点相应的引物(见表3)进行PCR扩增和高分辨率熔解曲线(HRM)分型分析，将同时存在jl027的等位基因G、jl090的等位基因C、jl615的等位基因C的个体保留，去除不存在优势等位基因的个体。利用本方法将长牡蛎育种中同时具有这3个优势等位基因的个体选作亲本，可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，从而缩短育种周期，加快育种进程。

3、筛选得到的三个SNP标记在长牡蛎亲本优选的具体应用方法为：

1)亲本DNA的提取

(1)取样品闭壳肌100mg，放于称量纸上，用经过75％酒精及灼烧消毒的解剖刀将组织切成细末，放入1.5ml灭菌离心管中，加入抽提缓冲液400μL(6mol/L尿素，10mmol/LTris-HCl，125mmol/L NaCl，1％SDS，10mmol/L Na₂EDTA·2H₂O，pH 7.5)，蛋白酶K10μL，混匀之后，37℃消化12h。

(2)加入400μL PCI(酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)，旋转混匀20min，室温下5000rpm离心15min，吸取上清液于另外1.5mL离心管中。用PCI再重复此抽提过程2次，每次均加入400μL PCI，旋转混匀20min。用CIA(氯仿：异戊醇＝24:1(v:v))重复上述抽提过程3次，每次均加入与离心管中抽提液等体积的CIA。

(3)加入上清液1/10体积浓度为3M的醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，旋转混匀3-5min，放置-20℃条件下过夜，使DNA充分沉淀。

(4)4℃下12000rpm离心15min。倒去上清液，加入1mL 4℃下预冷的70％酒精，轻轻摇匀，4℃下12000rpm离心1min。再分别用70％和100％酒精分别重复此过程一次。

(5)将1.5ml离心管放至通风处，室温条件晾干至DNA呈白色粉末状，加入50μL TE(10mM Tris-HCl和1mM EDTA的混合溶液，pH 8.0)，4℃下静置溶解。

2)HRM分析的反应体系

3)HRM分析的反应条件

HRM反应条件为：95℃预变性5mim；95℃变性10s，touchdown程序10s(63℃-60℃，每个循环下降0.5℃)，72℃延伸10s，10s末收集单个荧光，40个循环；95℃反应1min，40℃反应1min，同时收集荧光信号，1个循环；70-90℃读取荧光曲线，25次/℃。

以上对本发明的特定实施例进行了说明，但本发明的保护内容不仅仅限定于以上实施例，在本发明的所属技术领域中，只要掌握通常知识，就可以在其技术要旨范围内，进行多样的变换。

<110> 中国海洋大学

<120> 长牡蛎快速生长相关的SNP标记及其鉴定方法和应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 755

<212> DNA

<213> 长牡蛎（Crassostrea gigas)

<220>

<221> jl027

<223> n=a或g

<400> 1

gatctttgaa ccatgggcaa gagaaaactg ccaggctttc tgtagctact gtggctccac 60

caccgcccaa tctgtctgtc acgacgagtc tccagaggtg tgtgcccaga tggacatctc 120

gatctgtacc tctattgctt actcccagtg ggcccagaaa aactgtatga agacctgcaa 180

catgtgtgcc ggaggaagtg gcttagccat gactactgct gcaccaaagg cctgtcgcta 240

ctcggatgga gttactcatg ctcatggaac atggtggcaa gatggctgca gtgctgatgc 300

taagaactgt acctgtaatg atggaatcgt tgaatgctta cgattgtgcc ctgaatttga 360

aaatctcccc agcggatggc aagttgtaca ggttgccggc caatgccgtc ctgttgtcaa 420

ggttaaggcg accaatgctt gttattacaa tggtgtggct tatgtacaag accagacctg 480

gagcgagaac tgcaaactaa cttgtaaatg cacngacgca gctagaggat tctaccagtg 540

cagtgaaatg tgcccacaac tgcaacttcc tgatgtttgc cactgggaga gtcctccagc 600

aggaaaatgt tgccgaagac caatctgccc atcttacata cagatccaag ggtatcctga 660

tatctaggca ccagtttagt tttttttacc tgtttatgta aaactttatt tttgttacaa 720

ataaatttgt ctctcagcaa aaaaaaaaaa aaaaa 755

<210> 2

<211> 773

<212> DNA

<213> 长牡蛎（Crassostrea gigas)

<220>

<221> jl090

<223> n=c或t

<400> 2

ctgtggaagg actcgggcgt tcagggttgt ttcagtcgat cgcgggagta ccagctcaac 60

gactcggcag aatactactt aaattccttg gacaggatat cccagccctc atatgtcccg 120

actgaacaag acgtcctcag aacgagggtc aaaaccacag gaatcgtgga gacccacttc 180

acattcaaag accttcactt caaaatgttt gatgttggag gtcagaggtc ggagagaaag 240

aaatggattc attgtttcga gggcgtgact gccatcattt tcatcgtggc tatgagtgaa 300

tacgacttaa cactggtgga ggaccaggaa atgaatcgaa tgatggagag catgaagctg 360

ttcgactcaa tctgtaacaa caagtggttc accgacacct ccatcatcct cttcctgaac 420

aagaaggacc tgttcgagga caagatcaag aagtcacccc tcacaatctg tttcccagaa 480

taccaaggtg acaataactt tgaacaagca gcggcctaca ttcagctgca attcgaaaat 540

ctgaacaagc ggaaagacac aaaggaaatc tacacgcatt tcacgtgcgc gacagatacc 600

aacaacgtac agttngtgtt tgatgccgtc acagatgtca ttatcaagaa caatctcaag 660

gactgtggtc tgttttaatc agattgaccc attgacctgt gttcaaggaa gtaaccaaga 720

catggaaaaa agccagtttg gtttggagac ttgatcatgc tgaaatcctc tgt 773

<210> 3

<211> 687

<212> DNA

<213> 长牡蛎（Crassostrea gigas)

<220>

<221> jl615

<223> n=c或t

<400> 3

attgtgttac aatttattaa aaatgtatat aattatacaa tatacatatc atctaacaaa 60

gtaatatttg ctgcataaaa tttctttgga tgataagcga gtaagaattc caggcaactg 120

ataaacgttt tgttaatttg ttaacagcgg gaatccttta aacagcagtc ccatcatcct 180

ctggggcttc tgcccggttc gacaggacag ccagtaattg ttcgtatttt ttctgtcttt 240

ccgttctctc cacagtagct ccttttgctc cccataaaat cctcagatga aactccgtct 300

gaaagacgtc ggatataagg tcctcgaatt tcacagtttt catcacgttt tctgctgtca 360

ctttataaag tccacactga gcggtgatga gtcgtgcagt atctaaatgt atcaataaaa 420

tatccaatcc gctgttctga tcagataatt cccaggggag gtaatctgta agactggact 480

cgtcccgctc cagtagaaaa actaagggcg cgatgtcggg gatggacacg ttctgtagcg 540

gtaggagtcc actaccatcc attaacgatt tgtaagctga cttgagtttc gtgtcaaact 600

ggaaggcact gctagtgtgg ttccgacgta gtattaacca ggtgtctcgc aggcgggtaa 660

tatgttctga tgtgagaccc tccataa 687

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> jl027-F

<400> 4

gaccagacct ggagcgagaa c 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> jl027-R

<400> 5

ttcactgcat tggtagaatc ctc 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> jl090-F

<400> 6

gcgacagata ccaacaacgt acag 24

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<220>

<221> jl090-R

<213> 人工序列

<400> 7

cacagtcctt gagattgttc ttgat 25

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> jl615-F

<400> 8

actcaagtca gcgtacaaat cgtt 24

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> jl615-R

<400> 9

gacacgttct gtagcggtag gag 23

Claims (5)

1.一种长牡蛎SNP标记的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）实验群体的获得：以长牡蛎养殖群体作为繁殖亲本，通过连续5代的选择育种而培育出的长牡蛎快速生长系；对照组为随机选择的长牡蛎养殖群体；快速生长系在壳高、壳长、壳宽、总重及软体部重5项生长指标上显著优于对照组（P<0.01）；

2）验证群体的获得：在长牡蛎养殖群体中，以壳高和总重为选择指标，选出表型值的极大群体和极小群体，记为验证群体，用于验证通过步骤1）实验群体筛选得到的SNP标记位点；

3）利用从EST序列中开发的具有多态性且分型效果好的SNP标记进行基因分型，运用卡方检验分析SNP标记在快速生长系和对照组中的等位基因频率分布差异，初步筛选出9个SNP位点与生长性状相关联（P<0.0001）；

用步骤3）中筛选出的9个SNP位点在验证群体中进行验证，经卡方检验最终得到3个与长牡蛎生长性状相关联的SNP位点（P<0.01）；3个SNP位点的优势等位基因为jl027位点的等位基因G、jl090位点的等位基因C和jl615位点的等位基因C；所述3个SNP位点具体为

第一个SNP标记命名为jl027，其位于NCBI网站上登录号为FQ668499的EST序列的第514个碱基处，突变类型为：A/G；

第二个SNP标记命名为jl090，其位于NCBI网站上登录号为HS232693的EST序列的第615个碱基处，突变类型为：C/T；

第三个SNP标记命名为jl615，其位于NCBI网站上登录号为HS189919的EST序列的第557个碱基处，突变类型为：C/T。

2.长牡蛎SNP标记在筛选快速生长长牡蛎亲本中的应用；所述SNP位点具体为

第一个SNP标记命名为jl027，其位于NCBI网站上登录号为FQ668499的EST序列的第514个碱基处，突变类型为：A/G；

第二个SNP标记命名为jl090，其位于NCBI网站上登录号为HS232693的EST序列的第615个碱基处，突变类型为：C/T；

第三个SNP标记命名为jl615，其位于NCBI网站上登录号为HS189919的EST序列的第557个碱基处，突变类型为：C/T。

3.根据权利要求2所述的SNP标记在筛选快速生长长牡蛎亲本中的应用，其特征在于，该应用为：检测长牡蛎亲本在所述jl027、jl090和jl6153位点的等位基因，将同时具有jl027位点的等位基因G、jl090位点的等位基因C和jl615位点的等位基因C的个体选作亲本。

4.根据权利要求3所述的SNP标记在筛选快速生长长牡蛎亲本中的应用，其特征在于，该应用的具体方法为：

1）从待测亲本中剪取闭壳肌样品，提取DNA；

以提取得到的DNA为模板，利用所述3个SNP标记的引物进行PCR扩增和高分辨率熔解曲线分析技术对每个亲本样品进行基因分型，将同时存在jl027的等位基因G、jl090的等位基因C、jl615的等位基因C的个体保留，即为长牡蛎快速生长亲本。

5.根据权利要求4所述的SNP标记在筛选快速生长长牡蛎亲本中的应用，其特征在于，所述的高分辨率熔解曲线分析的反应体系为：

10×Buffer 1μl dNTP 0.2mM Mgcl₂ 1.5mM 上下游引物 0.2μM Taq酶 0.25U DNA模板 10ng SYTO^®9 5μM ddH₂O 补至10μl

高分辨率熔解曲线分析的反应条件为：95℃预变性5mim，95℃变性10s；touchdown程序10s，为63℃-60℃，每个循环下降0.5℃；72℃延伸10s，10s末收集单个荧光，40个循环；95℃反应1min，40℃反应1min，同时收集荧光信号，1个循环；70-90℃读取荧光曲线，25次/℃。

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