CN108949907A - 一种与苏淮猪肌内脂肪含量相关的snp标记引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种与苏淮猪肌内脂肪含量相关的SNP标记引物对及其应用。所述SNP标记位于猪14号染色体上的SCD基因的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体含rs80912566核苷酸位点的分子标记，且具有C/T多态性，所述SNP标记与苏淮猪肌内脂肪含量显著相关(P<0.05)。一种用于检测所述的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。本发明提供的SNP标记与苏淮猪肌内脂肪相关，可以通过鉴定该SNP标记来筛选高肌内脂肪苏淮猪品系，所得的高肌内脂肪苏淮猪品系具有重要的经济效益与社会价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种与苏淮猪肌内脂肪含量相关的SNP标记引物对及其应用。
背景技术
肌内脂肪(IMF)是影响肉质的一个重要指标。研究表明肌内脂肪含量与肉质相关的性状(延展性、多汁性、口味等)呈正相关。猪肉是人们餐桌上的主要肉类之一。数据显示，2016年中国年消费猪肉总量排名世界第一。人们对猪肉的喜爱程度可见一斑。80年代以来，为满足国内市场对猪肉消费量的需求，各地普遍推广应用杜长大杂交组合生产商品瘦肉猪，如杜洛克猪、长白猪、大白猪。但在追求高产的同时，也导致了猪肉品质的严重下降。近年来，伴随着经济增长，人们生活品质快速提升，对猪肉品质的要求也从数量转变为同时追求质量和数量，市场需求方向的转变引导着猪育种思路的改变。虽然肌内脂肪遗传力较高(0.52)，但肌内脂肪活体测定难准确性不高，常规选育困难，因此鉴别影响苏淮猪肌内脂肪的基因位点，利用分子标记辅助选育技术提升猪的肌内脂肪性状具有重要意义。
苏淮猪是由淮安市淮阴种猪场、南京农业大学、江苏省畜牧总站和淮安市农业委员会等单位于1998年开始培育，2011年3月25日获得国家畜禽遗传资源委员会新品种授权，证书为“(农01)新品种证字第18号”。苏淮猪是在新淮猪基础上再导入大白猪血统，通过横交、多世代选育而成，含新淮猪血统50％，大白猪血统50％。近期的一些研究发现，苏淮猪肌内脂肪变异系数较大，且肌内脂肪含量平均值为(1.99±0.04)％，而根据众多的研究结果表明，3.0％-4.0％的肌内脂肪含量是新鲜优质猪肉的一个理想范围。由此可见，对苏淮猪肉质的持续选育已迫在眉睫。
根据猪QTL数据库网站(http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/index)知，目前在猪除16号染色体上没有定位到影响肌内脂肪含量的QTL，其它染色体上都已定位到影响肌内脂肪的QTL，但大部分是利用微卫星标记定位的QTL，置信区间多在10-20cM，无法确定真正的主效基因及其关键变异位点，因此难以直接应用于种猪选育改良。
发明内容
本发明的目的在于针对猪传统肌内脂肪选育耗时费力，选育效果不佳，提供与苏淮猪肌内脂肪相关的SNP标记并将其开发为分子标记。
本发明的另一个目的在于提供用于检测上述SNP标记的引物对和检测方法。
本发明的另一个目的在于提供上述SNP标记的用途。
一种开发与苏淮猪肌内脂肪性状相关的分子标记的方法，以含有国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以苏淮猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，使国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点转化为分子标记。
所述的引物对序列为上游引物：SEQ ID NO：2，下游引物：SEQ ID NO：3。
按照上述的方法得到的分子标记。
所述的分子标记序列优选如SEQ ID NO：1所示，所述的国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点在SEQ ID NO：1中位于第288位，存在C/T多态性。
一种用于检测与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3；所述的与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP标记位于猪14号染色体上的SCD基因的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点的分子标记,且具有C/T多态性，所述SNP标记与苏淮猪肌内脂肪含量显著相关。
一种检测所述的与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP标记的方法，包含PCR扩增苏淮猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的C/T多态性。
所述的方法优选包括以下步骤：
(1)取苏淮猪组织样品提取总DNA；
(2)用已提取的苏淮猪基因组DNA为模板，使用权利要求5所述的引物对进行PCR扩增；
(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在SEQ ID NO：1第288位的C/T多态性。
本发明所述的分子标记、所述的引物对在筛选高肌内脂肪苏淮猪群体中的应用。
一种筛选高肌内脂肪苏淮猪群体的方法，包括检测苏淮猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点的基因型，选育rs80912566核苷酸位点的TT型个体优先作为种猪。
有益效果：
本发明提供的SNP标记与苏淮猪肌内脂肪含量相关，基于该SNP开发的分子标记及引物可用于SNP的检测。因此，可以通过鉴定该SNP标记来筛选高肌内脂肪苏淮猪品系，所得的高肌内脂肪含量苏淮猪品系具有重要的经济效益与社会价值。
附图说明
图1为SCD基因rs80912566位点扩增胶图
图2为SCD基因rs80912566位点分型图示例。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1：
1试验动物来源
江苏省淮安市淮阴种猪场
2提取苏淮猪基因组DNA
采集314头苏淮猪组织样样4份/头，其中1份用于个体DNA提取；
参考天根生物科技公司组织DNA提取试剂盒说明书，提取按以下步骤顺序进行：
①先在缓冲液GD和漂洗液PW中分别加入68mL和200mL无水乙醇，充分混匀。
②采集组织样约100mg置于2mL EP管内，完全剪碎后加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。
③加入20μL蛋白酶K溶液，混匀后放在56℃金属浴中消化过夜，直至耳样组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
④加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，放在70℃金属浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑤加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑥将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，随后以12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
⑦向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中
⑧向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，以12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑨重复操作步骤⑧。
⑩将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm离心2min将溶液收集到离心管中。
经过Nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到50ng/μL于-20℃下保存备用。
3、目的片段PCR扩增与测序
用已提取的DNA为模板，根据所设计的引物，进行PCR扩增：取DNA模板1μL、SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示的引物各0.4μL、PCR Mix试剂10μL、双蒸水7.2μL；设置PCR扩增体系：
PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，扩增的目的片段大小约550bp，电泳图见图1，将剩余的扩增产物进行测序，测序结果用DNAman软件与GenBank中猪的相关基因片段序列比对、分析，判读rs80912566位点的基因型，
4统计分析
利用SAS软件一般线性模型进行基因型对表型的影响效应分析。分析模型为
Yijnkl＝ui+Gj+Sn+Bk+Dl+eijkl
其中：Yijkm为猪的肌内脂肪含量；Gj代表第j个SNP的基因型固定效应；Sn代表性别的固定效应；Bk是第k个批次固定效应；Dl是协变量；eijkl为残差。
5结果
表1给出了rs80912566变位点C/T在苏淮猪群体中对肌内脂肪含量的影响效应。由表1可知，rs80912566位点三种基因型之间肌内脂肪含量有显著差异(P<0.05)，其中TT型个体肌内脂肪含量显著高于CT型(P<0.05)，TT型个体肌内脂肪含量高于CC型个体，但是差异不显著。由此可见，在苏淮猪群体中，继代选育rs80912566位点的TT型个体，均可逐步提高苏淮猪群体肌内脂肪含量，达到提高苏淮猪肉质性能的目的。
表1SCD基因rs80912566位点与苏淮猪肌内脂肪的关联分析
注：字母a,b代表每一行不同字母之间显著差异(P<0.05)。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种与苏淮猪肌内脂肪含量相关的SNP标记引物对及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 569
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> gene
<222> (288)
<223> y=t或c
<400> 4
atggcaacgg caggacgagg tggcaccaaa ttcccttcgg ccaatgacgc gccagagtct 60
acagaagccc attagcattt ccccaggggc aggggcagag gcaggggctg cggagaccga 120
gccgcggagt gtctgcagca tccagttttt gcgtctccgg cccccagcaa gccccggctc 180
tctgtctcct cccctctccc gcccatgcgg ttctcccacg gtgagccaac tctgcgcact 240
ttgccccttc ttggcagcga ataaaagggg tcagaggaaa tacaggayac ggtcgcccac 300
tgccagctct agcctttaaa tacccagcct ggggagaccc acgcacagca ggtcgggtgc 360
agacaccgac ccaacgtgca gcaaagggtt ccgagcgcag catcgctgat ctccgcgcaa 420
gagccggctc cagcactagt ctacgctcag tgcggtctgc cacgaactcc tccctgaagt 480
ctcatccctg ggaaagtgat cccaacgtcc gagagcccag atgccggccc acttgctgca 540
agaggaggtg agtttccaag taatggccc 569
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcaacgg caggacgag 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggccattac ttggaaactc ac 22
Claims (9)
1.一种开发与苏淮猪肌内脂肪性状相关的分子标记的方法，其特征在于以含有国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以苏淮猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，使国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点转化为分子标记。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的引物对序列为上游引物：SEQ ID NO：2，下游引物：SEQ ID NO：3。
3.按照权利要求1或2所述的方法得到的分子标记。
4.根据权利要求3所述的分子标记，其特征在于所述的分子标记序列如SEQ ID NO：1所示，所述的国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点在SEQ IDNO：1中位于第288位，存在C/T多态性。
5.一种用于检测与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP标记的引物对，其特征在于上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3；所述的与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP标记位于猪14号染色体上的SCD基因的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点的分子标记,且具有C/T多态性，所述SNP标记与苏淮猪肌内脂肪含量显著相关。
6.一种检测权利要求5中所述的与苏淮猪肌内脂肪性状相关的SNP标记的方法，其特征在于包含PCR扩增苏淮猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的C/T多态性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取苏淮猪组织样品提取总DNA；
(2)用已提取的苏淮猪基因组DNA为模板，使用权利要求5所述的引物对进行PCR扩增；
(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在SEQ ID NO：1第288位的C/T多态性。
8.权利要求3或4所述的分子标记、权利要求5所述的引物对在筛选高肌内脂肪苏淮猪群体中的应用。
9.一种筛选高肌内脂肪苏淮猪群体的方法，其特征在于包括检测苏淮猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点的基因型，选育rs80912566核苷酸位点的TT型个体优先作为种猪。
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