CN116904614A - 肉鸽IGF2BP3基因中与生长和屠宰性状相关的Indel分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了肉鸽IGF2BP3基因中与生长和屠宰性状相关的Indel分子标记及其应用，Indel分子标记为肉鸽IGF2BP3基因3'UTR区域存在一个Indel突变，位于肉鸽参考基因组Assembly Cliv_1.0NW_004973668.1Scaffold上物理位置267209‑267233区间25bp的缺失，序列如SEQ ID NO:1所示，生长性状包括活重、体斜长、龙骨长、胸深、胸宽、胫长和胫围；屠宰性状包括屠体重、心脏重、肝脏重、肌胃重、翅膀重、腿肌重、半净膛重和全净膛重。该Indel分子标记用于肉鸽生长和屠宰性状改良辅助育种，大大提高改良育种的准确性，成本低且效率高。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及肉鸽IGF2BP3基因中与生长和屠宰性状相关的Indel分子标记及其应用。
背景技术
据《2021年中国禽业发展报告》统计，国内肉鸽种鸽存栏4080.5万对，商品乳鸽存栏6.02亿只，肉鸽产业以不断增长的商业乳鸽为主，屠宰性状是肉鸽生产的重要经济指标。鸽子的功能基因组学分析为分析表型变异的遗传机制提供了可能，先前的基因组学研究揭示了影响羽冠、羽色、脚羽、虹膜色彩等衍生性状的分子机制。然而，肉鸽分子育种基础研究远远落后于其他家禽，与重要经济性状相关分子标记的挖掘报道较少。由于缺乏有效的分子标记，目前肉鸽的选育主要以表型选育为主，大大降低了育种进展和选择的准确性。另一方面，肉鸽的屠宰性状很难通过活体进行测量，表型数据的获得需要较高的时间和经济成本，无法直接对优秀种鸽进行选育，而通过分子标记辅助选择可以突破这一育种瓶颈。
哺乳动物IGF2 mRNA结合蛋白家族(基因符号：IGF2BP)包含三种具有保守结构域的RNA结合蛋白(IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3)，其中胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)是IGFBP家族的重要成员之一，在细胞发育过程中具有促进生长的作用，作为一种强大的生长因子，对脊椎动物的发育至关重要。IGF2BP3在细胞发育过程中具有促进作用，可与胰岛素样生长因子2(IGF2)结合，在细胞增殖和迁移中发挥重要作用，前期研究表明IGF2BP3基因是影响肉鸽生长性状的重要候选基因。因此，检测IGF2BP3基因的分子标记多态性并开发与肉鸽屠宰性状相关的分子标记将有助于加快育种遗传进展并提高选择的准确性。
发明内容
本发明的主要目的是提供肉鸽IGF2BP3基因中与生长和屠宰性状相关的Indel分子标记，鸽子IGF2BP3基因3'UTR区域存在一个Indel突变，该突变位于鸽参考基因组Assembly Cliv_1.0NW_004973668.1Scaffold上物理位置267209-267233区间25bp的缺失(g.267209_267233del)，经验证该突变与肉鸽的生长和屠宰性状相关，获得肉鸽选育高效的分子标记。
本发明的另一目的是提供肉鸽IGF2BP3基因中与生长和屠宰性状相关的Indel分子标记在肉鸽生长和屠宰性状改良辅助育种中的应用。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供肉鸽IGF2BP3基因中与生长和屠宰性状相关的Indel分子标记，所述Indel分子标记为肉鸽IGF2BP3基因3'UTR区域存在一个Indel突变，该突变位于肉鸽参考基因组Assembly Cliv_1.0NW_004973668.1Scaffold上物理位置267209-267233区间25bp的缺失(g.267209_267233del)，其序列为GAATGGAATAAAGAGTTTAACTCCT(SEQ ID NO:1)。
作为优选，所述生长性状包括活重、体斜长、龙骨长、胸深、胸宽、胫长和胫围；所述屠宰性状包括屠体重、心脏重、肝脏重、肌胃重、翅膀重、腿肌重、半净膛重和全净膛重。
本发明还提供所述肉鸽IGF2BP3基因中与生长和屠宰性状相关的Indel分子标记在肉鸽生长和屠宰性状改良辅助育种中的应用。
作为优选，所述肉鸽品种为欧洲肉鸽。
本发明还提供用于扩增所述肉鸽IGF2BP3基因中与生长和屠宰性状相关的Indel分子标记的引物，其核苷酸序列如下：
1st-PCRP:ACGTTGGATGAATGCAGCTCCACTTGCCAG(正向引物5'->3')(SEQ ID NO:3)；
2nd-PCRP:ACGTTGGATGTAGAACAGTCTGTCCCTGTG(反向引物5'->3')(SEQ ID NO:4)。
本发明还提供一种肉鸽生长和屠宰性状改良育种方法，包括以下步骤：
步骤a：提取待检测肉鸽的血液基因组DNA，同时合成序列如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示的两条PCR引物和如SEQ ID NO:5所示的一条UEP引物；
步骤b：通过所述两条PCR引物将含有SNP位点的基因片段从gDNA基因组进行PCR扩增，得到PCR产物；
步骤c：碱性磷酸酶反应；
步骤d：通过所述UEP引物进行单碱基延伸反应；
步骤e：树脂纯化；
步骤f：树脂纯化后的延伸产物进行基因分型，其中DEL.IN基因型为优势基因型，所述待检测肉鸽中DEL.IN杂合子个体作为生长和屠宰性状改良肉鸽留种。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供肉鸽IGF2BP3基因中与生长和屠宰性状相关的Indel分子标记，并将其用于肉鸽生长和屠宰性状改良辅助育种，可以大大提高肉鸽生长和屠宰性状改良育种的准确性，同时加快遗传进展，从而解决实际育种过程需要对肉鸽屠宰后进行胸肌测定成本高且效率低等问题。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
1材料
1.1样品采集
上海金皇鸽业有限公司采集136只28日龄欧洲肉鸽的血样，每只乳鸽进行翅静脉采血1mL于EDTA-K2抗凝剂采血管中，用于后续DNA的提取。
1.2主要试剂及仪器
EDTA-K2真空采血管购自江苏宇力医疗器械有限公司；Eppendorf，German低速离心机；0.1-2.5μL、0.5-50μL、50-200μL、200-1000μL移液器；血液基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；NanoDrop2000分光光度计购于美国Thermo FisherScientific公司；DL2000Marker、琼脂糖、核酸染料均购自北京索莱宝科技有限公司；金牌Mix(green)购自北京擎科生物科技有限公司；电泳仪购于北京六一仪器厂；PCR仪购自BioRad公司。
2方法
2.1血液基因组DNA的提取
采用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组提取试剂盒，从血样中提取基因组DNA，针对所有DNA样本使用Nano Drop2000仪器进行OD值检测，1.25％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，DNA浓度要求在20ng/μL、OD260/OD280值在1.6-2.2之间，OD260/230值>0.6，OD230nm无吸收峰，DNA电泳结果条带清晰，gDNA完整无严重降解，采用Massarray SNP分型平台。
2.2引物设计
根据肉鸽参考基因组Assembly Cliv_1.0NW_004973668.1Scaffold序列信息获得包含待检测Indel位点(g.267209_267233del)在内共计200bp的gDNA序列：
ATTTAAATACTGTCATCTCTTAAATTTCTAGACTTAGTATGGTAAATCATGTTTTTCTTTTCAATTGAGACTTGGTAATTTGGAGTATTTGGGAATAGCTAGAAAGTGAATACTGTAAATGATTTCAATATCCACAAAGTATGGATCATTTTTCATCTGTAATGTGCCCCCCAATGCAGCTCCACTTGCCAGATGCCTCT[GAATGGAATAAAGAGTTTAACTCCT/-]ATCATCAGATAAAGTTGTGTGGTGTCTTTTTAAAGTAACGAGGCACAGGGACAGACTGTTCTAAGTATTTGTGGTGCTTTGATCAAGTTGGTTTTCTGTCCATAACAATAACTGCATAAGGATGAGCAGTCACCCGCAGGTATCCCATAGCTGCCAGGCCATCCAGCAGCCGGGGG(SEQ ID NO:2)。
采用Agena公司的Assay Designer4.0软件进行多重SNP位点的引物设计评估，并根据不同的位点信息酌情调整设计参数，满足最优化标准，采用PAGE引物纯化方法，合成每个SNP位点对应的三条引物，分别为两条PCR引物和一条UEP引物如下：
1st-PCRP:ACGTTGGATGAATGCAGCTCCACTTGCCAG(正向引物5'->3')(SEQ ID NO:3)
2nd-PCRP:ACGTTGGATGTAGAACAGTCTGTCCCTGTG(反向引物5'->3')(SEQ ID NO:4)
此为Indel目的片段PCR扩增引物，设计时，为保证引物分子量相近，且Tm值和CG％含量在最适范围内，将引物5'端增加ACGTTGGATG序列标签。
UEP_SEQ:CCCACACAACTTTATCTGATGATAG(单碱基延伸引物序列)(SEQ ID NO:5)
EXT1_SEQ:CCCACACAACTTTATCTGATGATAGA(单碱基延伸突变碱基1后的产物序列)(SEQ ID NO:6)
EXT2_SEQ:CCCACACAACTTTATCTGATGATAGG(单碱基延伸突变碱基2后的产物序列)(SEQ ID NO:7)
3 Mass Array SNP分型步骤
3.1 PCR扩增反应
该步骤反应是通过PCR扩增，将含有SNP位点的基因片段从gDNA基因组扩增，产物长度在100-200bp之间，如表1所示。
表1
| PCR反应组分 | 含量 | 体积/μL |
| Water,HPLC grade | NA | 1.850 |
| PCR Buffer with 15mM MgCl2 | 1.25x | 0.625 |
| MgCl2(25mM) | 1.625mM | 0.325 |
| dNTP Mix(25mM each) | 500μM | 0.100 |
| Primer Mix(500nM each) | 100μM | 1.000 |
| HotStar Taq(5U/μL) | 0.5U/rxn | 0.100 |
| Total | - | 4.000 |
按照如下PCR扩增反应程序，将PCR反应板放置于PCR仪上，启动程序。
表2
3.2碱性磷酸酶(SAP)反应
表3：SAP反应组分
| SAP反应组分 | 含量 | 体积 |
| Water(HPLC grade) | NA | 1.53μL |
| SAP Buffer | 10x | 0.17μL |
| SAP Enzyme | 1U/μL | 0.30μL |
| Total volume | - | 2.00μL |
设置SAP反应程序：37℃20min；85℃5min；4℃∞，并将384孔反应板放置于PCR仪上，启动程序。
3.3单碱基延伸反应：
表4：延伸反应体系
| 延伸反应组分 | 含量 | 体积/μL |
| Water(HPLC grade) | NA | 0.619 |
| iPLEX Buffer Plus | 0.222x | 0.200 |
| iPLEX Termination mix | 1x | 0.200 |
| Primer Mix(7μM:14μM) | 0.625μM:1.25μM | 0.940 |
| iPLEX Enzyme | 1x | 0.041 |
| Volume | - | 2 |
表5：延伸反应程序
3.4树脂纯化
1)在384/6MG Dimple板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干。
2)在384样本板的每个孔中加16μL水。
3)将384样本板轻轻翻转过来扣在Dimple板上，翻转Dimple与384样本板，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中。
4)将384样本板放置翻转离心机中室温旋转混匀30分钟。
启动Mass ARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384-well Spectro CHIPbioarray上。将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF质谱仪分析，检测结果使用YPER4.0软件获取原始数据及基因分型图。
4数据整理与分析
根据基因分型结果，统计各位点不同基因型的个体数。利用excel软件计算IGF2BP3基因Indel(g.267209_267233del)基因频率、基因型频率。采用IBM SPSSStatistics 25软件中一般线性模型分析欧洲肉鸽不同基因型与生长、屠宰性状的关联性，结果以“平均值±标准误”表示。
5结果
表6：肉鸽IGF2BP3基因Indel(g.267209_267233del)基因频率和基因型频率
在136只欧洲肉鸽群体中对g.267209_267233del突变进行质谱基因分型，分型结果表明，IN纯合子个体123只，杂合子DEL.IN个体13只，如表6所示，DEL等位基因频率为0.05，IN等位基因频率为0.95，DEL.IN基因型为优势基因型。
表7：肉鸽IGF2BP3基因Indel(g.267209_267233del)突变与生长性状的关联分析
SPSS分析结果表明，欧洲肉鸽DEL.IN基因型个体的活重、龙骨长、胸深、胫长、胫围、屠体重、肝脏重、肌胃重、翅膀重、腿肌重、半净膛重、全净膛重均极显著高于IN基因型(P<0.01)，心脏重显著高于IN基因型(P<0.05)，DEL.IN基因型个体的平均活重、屠体重、半净膛重和全净膛重增加了71.7g、61.77g、56.18g和47.38，分别提高13.6％、13.4％、13.3％和13.5％，在肉鸽的育种过程中可以利用该标记筛选DEL.IN个体进行留种来提高肉鸽的生长和屠宰性能。
综上所述，IGF2BP3基因Indel(g.267209_267233del)突变会影响肉鸽的生长和屠宰性状，可以通过基因分型确定该位点是杂合子DEL.IN还是纯合子IN，DEL.IN基因型的生长和屠宰性状均优于IN基因型个体，可以作为肉鸽辅助选择育种的分子标记。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.肉鸽IGF2BP3基因中与生长和屠宰性状相关的Indel分子标记，其特征在于，所述Indel分子标记为肉鸽IGF2BP3基因3'UTR区域存在一个Indel突变，位于肉鸽参考基因组Assembly Cliv_1.0NW_004973668.1Scaffold上物理位置267209-267233区间25bp的缺失，序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述肉鸽IGF2BP3基因中与生长和屠宰性状相关的Indel分子标记，其特征在于，所述生长性状包括活重、体斜长、龙骨长、胸深、胸宽、胫长和胫围；
所述屠宰性状包括屠体重、心脏重、肝脏重、肌胃重、翅膀重、腿肌重、半净膛重和全净膛重。
3.权利要求1或2所述肉鸽IGF2BP3基因中与生长和屠宰性状相关的Indel分子标记在肉鸽生长和屠宰性状改良辅助育种中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肉鸽品种为欧洲肉鸽。
5.一种用于扩增权利要求1或2所述肉鸽IGF2BP3基因中与生长和屠宰性状相关的Indel分子标记的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
6.一种肉鸽生长和屠宰性状改良育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a：提取待检测肉鸽的血液基因组DNA，同时合成序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的两条PCR引物和如SEQ ID NO:5所示的一条UEP引物；
步骤b：通过所述两条PCR引物将含有SNP位点的基因片段从gDNA基因组进行PCR扩增；
步骤c：得到的PCR产物进行碱性磷酸酶反应；
步骤d：步骤c所得产物通过所述UEP引物进行单碱基延伸反应；
步骤e：步骤d所得产物进行树脂纯化，纯化后的延伸产物进行基因分型，其中DEL.IN基因型为优势基因型，所述待检测肉鸽中DEL.IN杂合子个体作为生长和屠宰性状改良肉鸽留种。
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| CN202311113685.6A CN116904614A (zh) | 2023-08-31 | 2023-08-31 | 肉鸽IGF2BP3基因中与生长和屠宰性状相关的Indel分子标记及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
| CN118932080A (zh) * | 2024-09-02 | 2024-11-12 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 与绵羊生长性状相关的InDel分子标记及其应用 |
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