CN103290102B - 一种基于pcr的snp分型方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于PCR的SNP分型方法及应用，其步骤是：（1）选择用于实验的植物样品——某一物种多个品系的组织；（2）提取组织的基因组DNA；（3）将基因组DNA纯化后作为PCR扩增的模板；（4）在该物种的SNP数据库挑选AT类型的SNP；（5）筛选出SNP位点前面第三个碱基是G的SNP；（6）用primer3软件设计引物，使正向引物的最后一个碱基位于SNP位点，而且最后一个碱基为T；（7）引入错配，将正向引物的倒数第三个碱基变为A；（8）进行PCR扩增；（9）将PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；（10）观察扩增条带的有无。一种基于PCR的SNP分型方法在油菜聚合育种的应用，方法易行，提供简便，成本低，检测简便，效率高，SNP的分型成功率达到91%。

Description

一种基于PCR的SNP分型方法及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物信息学领域，具体涉及一种通过PCR进行SNP分型的方法，还涉及一种基于PCR的SNP分型方法在油菜聚合育种的应用。该方法快速，简单，成本低，可以广泛应用于疾病诊断和作物育种等领域。

背景技术

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。

理想的分子标记的要求：(1)具有高的多态性；(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3)能明确辨别等位基因；(4)遍布整个基因组；(5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6)选择中性(即无基因多效性)；(7)检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8)开发成本和使用成本尽量低廉；(9)在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。SNP标记是美国学者Lander E于1996年提出的第三代DNA遗传标记。SNP无疑是符合上述要求的最佳选择。

SNP即单核昔酸多态性标记，主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换，以及单碱基的插人/缺失等。SNP的位点极其丰富，几乎遍及整个基因组。据估计基因组中大约平均每1000bp就会出现一个SNP。SNP标记在人群或生物群体中一般只有两种等位型(allele)故亦称为双等位标记(bi-allelic marker)。这样在检测时只需一个“+/-”或“全或无”的方式而无需像检测微卫星标记那样对片段的长度做出测量。

SNP标记分型的手段既有传统的手段如SSCP(single strand conformationpolymorphism)和CAPs(Cleavage Amplification Polymorphisms)等，也有现在较快速的手段如MassARRAY质谱和TaqMan探针方法等，还有基于芯片的检测手段如DNA芯片技术已经开发出来并迅速被应用和趋于成熟。使用高密度的DNA芯片或微列阵可以同时对上万个SNP的分型。目前SNP已经广泛地应用于关联分析，基因精细定位和分子标记辅助育种过程中。但是上述方法都存在一定的缺点：SSCP手段只能用非变性胶，实验条件苛刻，需要常温条件，一般实验室难以达到；CAPs手段实验过程繁琐，一个实验程序需要耗费很长的时间；MassARRAY质谱和TaqMan探针方法及其他芯片方法费用相当高昂，一般实验室难以承担。

本发明基于以上的考虑，实现一种既低廉，简单，又效率高的SNP分型方法，通过设计引物时，在正向引物的3’端引入特定的错配类型和错配位点，使引物对在含某一种SNP基因型的材料中PCR扩增的效率很高，而在另一种SNP位点的材料中PCR扩增的效率很低，从而达到SNP分型的目的。本发明是在与SSR分子标记一样的实验步骤条件下，很大地提高了引物多态性的比率，很大地扩大了覆盖基因组的区域。SSR分子标记在两个材料间多态性比例一般在30％左右，而本发明的分子标记方法在两个材料间多态性比例可以达到90％以上。在与SSR分子标记一样实验成本的前提下，本发明的分子标记方法有更高的效率。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种基于PCR的SNP分型方法，通过设计引物时，在正向引物的3’端引入特定的错配类型和错配位点，使引物对在含某一种SNP基因型的材料中PCR扩增的效率很高，而在另一种SNP位点的材料中PCR扩增的效率很低，从而达到SNP分型的目的。与许多现行的方法相比，其主要优点为快速，简单，成本低，可以广泛应用于疾病诊断和作物育种等领域。

本发明的另一个目的是在于提供了一种基于PCR的SNP分型方法在油菜聚合育种的应用，目前常用的分子标记是SSR，这种分子标记在基因组中分布较少，而且主要位于非编码区，这种特性阻碍了紧密连锁辅助选择标记的开发。而本发明使用的是SNP分子标记，SNP分子标记在基因组分布范围广，而且广泛存在于基因编码区。在人类基因组研究中发现，大约一半的非同义碱基突变是致病来源。而SSR仅仅是紧密连锁的分子标记，导致病变的可能性不大。在聚合育种过程中，实际上聚合的是优良等位基因，若辅助选择标记用SSR，在辅助选择过程中存在目标优良等位基因丢失的可能性，因为SSR本身特性的限制，不能始终与目标优良等位基因共分离。而SNP分子标记可以位于编码区，而且可能是优良等位基因的优异来源，而SSR成为优良等位基因的优异来源的可能性很小。所以，应用本发明方法，能够在与SSR使用同样成本的基础上，达到更好的效果。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于PCR的SNP分型方法，其步骤是：

1、选择两个甘蓝型油菜材料中双11号和73290，取5克叶片样品；

2、将步骤1获得的叶片样品用液氮冷冻研磨后提取组织的基因组DNA；其中步骤中提取DNA的方法为CTAB小样法。

3、将基因组DNA纯化后作为PCR扩增的模板；其中步骤中纯化DNA用的是AXYGEN公司的试剂盒，按照用户使用说明来进行。

4、在中双11号和73290两品系间开发的的SNP数据库中共有4种类型SNP：A/G(C/T)，A/C(G/T)，A/T，G/C。挑选A/T类型的SNP用于下一个步骤。该步骤中挑选的SNP是通过油菜两个品系(中双11号和73290)solexa重测序5X数据分析得到的SNP，SNP受reads支持的深度最少为4层。

5、在步骤4的结果中筛选出SNP位点前面第三个碱基是G的SNP；

6、用primer3软件(http://primer3.sourceforge.net/releases.php)设计引物，使正向引物的最后一个碱基位于SNP位点，而且最后一个碱基为T；其中步骤中primer3软件设计引物时Tm值最小为62℃，最大为68℃，最优温度65℃，扩增片段长度为300到500bp之间。

7、引入错配，将正向引物的倒数第三个碱基变为A；引物为PrimerID01-23。

8、按照设计的反应条件进行PCR扩增；

9、将步骤8获得的PCR产物在特定的电压条件和特定的变性聚丙烯酰胺凝胶浓度下电泳；其中步骤中合适的电泳条件为：使用的是北京六一仪器厂的DYCZ-20C型的电泳系统，电泳条件为1800V电压下电泳80分钟。

所述的特定的电压条件是因为在这个电压条件下，电泳过程中所产生的热量能充分散失，而不致电泳温度过高。所述的特定的变性聚丙烯酰胺凝胶浓度下电泳是因为在这个浓度下，凝胶所产生的网孔刚好能达到DNA片段分离的目的。

10、将步骤9获得的凝胶银染后观察扩增条带的有无，有条带的亮度很高，无条带的亮度很低甚至没有，达到分型两种SNP类型的目的。其中步骤中银染的硝酸银浓度为10μg/ml。

本方法同样在芝麻和大豆中得到验证，都达到90％以上的多态性比率。

一种基于PCR的SNP分型方法在油菜聚合育种的应用，其步骤是：

1、找到能改良骨干亲本某些缺陷性状的特殊品系，与骨干亲本杂交配制作图群体。

2、重测序特殊品系和骨干亲本，查找本发明所对应的SNP，在作图群体做基因型鉴定，构建遗传图谱。

3、将作图群体做多点的田间试验，获得表型数据，再与遗传图谱结合分析定位QTL，找到紧密连锁的SNP分子标记及对应的优良等位基因型。

4、在作图群体的株系中选择含有尽可能多优良等位基因型的株系，再与骨干亲本回交，直到保留了所有优良等位基因型，达到改良骨干亲本的目的为止。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、方法易行，操作简便，成本低。目前的SNP分型技术，如TaqMan探针技术，合成一条探针需要约1000元人民币，而我们这项发明仅需要合成一对一般的引物约60元人民币；

2、检测简便。如CAPS在分型SNP时，需要做DNA纯化和酶切等，实验过程繁琐，而本发明仅需要跑PCR再加上凝胶检测，实验过程简单；

3、分型设备简单。如TaqMan探针法分型时需要荧光检测，设备昂贵约需要70万元人民币。而本发明仅需要一般的电泳设备，仅约需要4000元人民币；

4、效率高。本发明SNP的分型成功率达到91％，这是SSR(简单重复序列)分子标记所不能比的；

5、通量可控。目前基于TaqMan探针及芯片技术的SNP分型方法仅适合样本量大或者SNP位点量多的SNP分型，而对一般的QTL(数量性状位点)定位研究，本发明的SNP分型方法最适合，能满足一般实验室的需要。

附图说明

图1、为一种引物设计示意图。

正向引物的最后一个碱基是位于SNP位点，而且是碱基T；3’端倒数第三位的碱基本是G，变为A。

图2、为一种23个SNP分型结果示意图。

a：中双11号；b：73290；1-23：1号-23号SNP；03号SNP两个材料的扩增条带亮度差异不明显，14号SNP在两个材料均未扩增出来，其余的21个SNP位点均能很好地检测到多态性。

图3、为一种遗传图谱示意图。

ns162和ns163是本发明的方法开发的分子标记，是油菜抗倒伏性状紧密连锁的分子标记。其他标记为抗倒伏QTL所在染色体的骨架标记及与抗倒伏QTL不紧密连锁的SNP标记，星号表示QTL所在区域。

具体实施方式

通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)，或Draper等人(Blackwell科学出版社，1988)所述的条件，或按照所用试剂制造厂商所建议的条件。所用试剂如未经特别说明，在生化试剂商店均可买到，所用软件均为免费软件。

实施例1：

一种基于PCR的SNP分型方法，其步骤是：

1.利用CTAB法提取叶片总DNA：

A.将适量的甘蓝型油菜中双11号和73290叶片样品从超低温冰箱(-70℃)取出后，立即放入冰冻过的研钵中，加入液氮研磨成粉状；快速装入50ml离心管中，加入在60℃的水浴锅中预热过的提取液(0.2M Tris-Cl，0.25NaCl，25mM EDTA，0.5％(质量比)SDS，pH 7.5)，混合均匀，放入60℃的水浴锅中水浴40min；

B.取出离心管，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1，V/V)，缓慢上下颠倒离心管30-50次，使充分混匀，1300g离心10分钟；

C.取上清于另一离心管中，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1，V/V)，重新抽提一次。取上清，加入0.6倍体积冰冷异戊醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结为止。静止30min，挑出沉淀，70％(体积比)酒精洗2-3次，无水乙醇洗一次，干燥后加无菌水65℃20min溶解；

D.再次加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1，V/V)，重新抽提。取上清，加入0.1倍NaAc(3mol/L，pH5.2)，混匀后缓慢加入2倍体积的冰无水乙醇，静止5min后缓慢转动离心管直至絮状沉淀出现，挑出沉淀转入1.5ml离心管中，70％(体积比)酒精洗2-3次，无水乙醇洗一次，干燥后加无菌水溶解，于-20℃冰箱中保存备用。

2.snp位点的筛选：

中双11号和73290的DNA各1ug送华大基因研究院通过solexa测序获得5X序列数据。将白菜和甘蓝的基因组序列(chiff-401and 02-212)合并作为甘蓝型油菜基因组的参考序列，再用2bwt-builder软件(http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html)将参考序列格式化，然后将两材料测序获得的序列用SOAP软件(http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html)与格式化后的参考序列比对(比对参数-v5)，然后筛选得到匹配唯一位置的比对结果，用soapsnp(http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html)分析得到大量的SNP，两个材料reads支持深度均需达到4X以上，才算中双11号和73290间真实的SNP，再在获得的SNP信息中抽取是A/T类型，3’端向左数三位是G的SNP位点，用于下一步的引物设计。本次共选择了23个SNP位点，其位点信息为SNP01-23所示。

3.引物设计：

先确定正向引物，引物的最优Tm值设为65℃，最低62℃，最高68℃。正向引物的最后一个碱基是位于SNP位点，而且是碱基T，倒数第三位的碱基本是G，变为A，使引物向5’端延长(图1)，用oligotm软件(http://primer3.sourceforge.net/releases.php)检测正向引物的Tm值直到Tm值达到最优为止。正向引物确定后再确定反向引物，利用primer3软件(http://primer3.sourceforge.net/releases.php)固定正向引物位置后，再搜索反向引物，使反向引物的Tm值与正向引物一致，而且扩增产物的长度在300-500bp之间。根据选定的SNP位点信息，设计的23对引物为PrimerID01-23所示。

引物与中双11号DNA模板结合时，仅存在引物与模板间人为引入的一对错配碱基对A-C，不影响PCR扩增的效率。而与73290的DNA模板结合时，由于存在两个错配碱基，SNP位点的T-T错配和3’端第三位的A-C错配，导致PCR扩增的效率极其低，凝胶几乎检测不到扩增产物。

4.PCR扩增和凝胶分型：

(1)PCR体系及程序：

PCR反应程序：

(2)凝胶电泳：

试剂配制：

6％(质量比)PAGE胶：6％(质量比)丙烯酰胺，7mol/L尿素，0.5×TBE缓冲液，灌胶前加入300ul 10％(质量比)NH₄S₂O₄，30ulTEMED；10×TBE：Tris-base 108g，硼酸55g，0.5MEDTA(pH8.0)40ml，定容至1000ml.使用时稀释为0.5×TBE工作液。

PAGE胶制备：

胶板用10％(质量比)NaOH溶液浸泡24小时，洗净，凉干。长胶板用餐巾纸均匀涂抹反硅烷化剂(AMMMRESCO)，短胶板涂抹1ml硅烷化剂(0.5％(体积比)冰醋酸，1.5ml95％(体积比)乙醇，1-2ul硅烷化剂)，放置5分钟后，用95％(体积比)的乙醇轻轻洗擦以除去多余的反硅烷化剂和硅烷化剂。将玻璃装好，并以边条隔开，小心套入制胶夹(GIBCO/BRL)中。准备就绪后在短胶板上用注射器将50ml(长胶板80ml)变性胶混合液，缓慢注入，以免产生气泡。插入梳子，并用夹子夹牢，凝聚2小时后即可电泳。

电泳：

从制胶夹中取出胶板，擦净玻璃外侧，固定于电泳槽上，上下槽各加500ml 0.5×TBE缓冲液，将梳子拔出后立即冲洗点样孔，接通电源1500伏恒压预热30min。在PCR产物中加入等体积的上样缓冲液(98％(体积比)去离子甲酰胺，10mmol/L EDTA，0.005％(质量比)二甲苯青FF，0.005％(质量比)溴酚蓝)，95℃变性5分钟，冰浴冷却，上样5ul，1800伏恒压电泳80min。当二甲苯青FF到达2/3胶板时停止电泳。

染色：

采用银染法进行染色：10％(体积比)冰醋酸固定至胶板无色，ddH₂O漂洗两次，每次2-3分钟。然后染色0.1AgNO₃，0.56％甲醛(体积比)30分钟。取出胶板，在ddH₂O漂洗10s，再在预冷(4℃)的显影液(3％(质量比)Na₂CO₃，0.56(体积比)％HCHO，2mg/LNa₂S₂O₃.5H₂O)中轻轻摇动至条带清晰可见，然后倒入中止液(10％(体积比)冰乙酸)中，停止显影。用蒸馏水漂洗3分钟，室温(20-25℃)下自然凉干，拍照保存。

5.结果分析：

如图2所示，从左到右共进行了23个SNP位点的分型，a是中双11号，b是73290，可以看出在23个位点中，有21个SNP位点均能很好地检测到多态性(通过扩增条带的有无来体现)，得到了较清晰的分型结果。仅03号SNP两个材料的扩增条带亮度差异不明显，14号SNP在两个材料均未扩增出来。分型成功率达到91％。

实施例2：

农作物传统分子育种方法聚合多个优良性状往往运用SSR标记，这种标记在基因组的密度较低，很难找到功能基因紧密连锁的标记。应用本发明的标记手段，能达到SSR标记所不能达到的连锁程度，大大改进效率。现有材料中双11号(国审油2008030)和73290材料，其中中双11号具有抗裂角，抗倒伏，抗菌核病，角果长，千粒重大等优良性状，而73290具有分枝数多，全株角果数多等优良性状。现在的目标是将73290材料的分枝数多和全株角果数多的优良性状转育到中双11号材料中，达到改良中双11号的目的。

一种基于PCR的SNP分型方法在油菜聚合育种的应用，其步骤是：

1、F2代作图群体的构建。以中双11号为母本，73290为父本，人工杂交获得F1代，再将F1代自交，获得很多F2代。取F2代单株叶片提取DNA，作为F2作图群体的DNA样本，留作以后做基因型鉴定。然后将F2代单株全部分支自交，分单株收获自交种子，作为F2代作图群体的株系，留作以后用于表型鉴定。

2、SNP开发。重测序中双11号和73290，将两个材料的DNA提取出来后，纯化出各1ug提供给华大基因用于测序，测序读长100bp，测序量5G。测序结果用SOAP软件比对(参数-v5)，从比对结果中抽出匹配唯一位置的reads用于SNP鉴定，用SOAPsnp做SNP鉴定，再在SNP鉴定结果中抽出A/T类型的SNP，而且3’端倒数第三位为碱基G的SNP，SNP位点信息为SNP01-23所示。

3、图谱构建。根据实施例1中的引物设计方法设计引物，引物序列为PrimerID01-23所示。然后对本实施例第1步获得的F2代作图群体的DNA样本做基因型鉴定，具体步骤参考实施例1中的第四步。获得作图群体的基因型数据后，用joinmap3(http://www.kyazma.nl/index.php/mc.JoinMap/sc.Updates/)构建遗传图谱(图3)。

4、表型鉴定。将本实施例的第一步获得F2代作图群体的株系做多点的田间试验，考察性状，获得抗倒伏，抗裂角，抗菌核病，全株角果数，角果长度，角果粒数，千粒重等性状的表型鉴定数据(表1)。

5、表1.作图群体的抗倒伏性状表型数据

6、QTL定位。将本实施例的第三步和第四步的结果输入到WinQTLCart2.5软件(http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)用于QTL定位，permutationtest设置为1000次，进行QTL扫描，获得多个性状的QTL数据。

7、株系挑选及回交。从F2代作图群体的株系中挑选含优良QTL基因型的株系(对抗倒伏性状起正向效应的QTL等位基因型)，再与中双11号回交，直到既获得所有73290优良等位基因型，又保留了中双11号原有优良性状从而达到改良中双11号的目的为止。

8、目前已经利用本发明所获得的SNP分子标记辅助选择得到多个改良株系，已经用于品比。

SNP位点信息如下：

SNP01

AAAGAGAGGTGACGATGAAACTTGAGACCCAGTAGATTCGTAACGTTAACGGATGGTTGG[A/T]TGATGCGAATCTTTTCTGGTGGAGAACCAAAACGGCGATGACGGCGTAAGTAACGGCGTG

SNP02

TTCTGTGACATTCTTCTGTAAAGCCTCTTCAACATTTGGTGTTGTGTTCTCTTGTTGGGA[A/T]TGATCTGTGTTGGGCTGCAAAGGAGGAGGCTGGGATGGTAAGTTCTCTGTCTGAGATGCT

SNP03

TGAGGATGAGATGGTGATTCACGTAAACAAATCAGCAAATCCTTCATCTGAGGACTATGG[A/T]ATACCATCGCAGCTTGTGCAGAAATATGTTAAAGGTACATTTATCTTCACTTGAGTCCTT

SNP04

ACCAGCTTAGAAACCAGCTGAGATAGATCAGCATAGAGGAGGCAAGCCAAAGACTGAGGA[A/T]CACATGGTGCATTGTAGTAGTTACATACCTTACGAACAACACCCCCCCCCCCCCCCCCCC

SNP05

GATGTAATGGTTATGGGCACATAAAATTAGAGTGTGTGAATACAAAGAAGATGAAGATGA[A/T]GAGAAGTTGCAGTGATAAGAAGCCAGAGAGAAAAGAAGATGCTCTAAATTTTGTGGCTCT

SNP06

GATCCTAAAGATTCACAATACTCTAAACCCAGCAGATATGTTGACCAAGTGTTTACCTGG[A/T]AGCGCGTTCGAGAAGTGCCTCGTAACGCCGAGGGTCACCGTCTGATCATGTGTCGAAGTA

SNP07

CTTTCTTCCTTACGACATACGCCTCAAGGAGCCTCACGCAGCAGTTTCAGGGATAGTAGG[A/T]AGCACCTTGGCAGCTTGGATCACAGGCCGAGACACGAAGAGGAGGAGTCCGATAACTGCA

SNP08

CATCGCCACTGAGATATGCGCAGCGCTTGTCTTTCTTCACTCCAATAAATCTCATAGCGT[A/T]GTCCACGGTGATTTGAAGGCGGCGAGTGTTCTTCTCGATGCTAATCTCGTTAGCAAGTTA

SNP09

GAGCACTCTCCAGGAAACGCCCTGCCTTTAGAGAGAAGAAGATTCAAGAGGAGTCTCGGA[A/T]CGACACAGACAGAACAAGAACTGAGGAGGCAAAAGACACGAATCTAAACAGTCGCAGACA

SNP10

GAGGCTAAATATTCAAGAAAAAAAGGAAGCTTTCATTCAATAAAAGCTAATAGGCAACGT[A/T]GTATAGGTCCATCAAAAGCTAAAACAGAGTGTAGAGAGCCTAACACAATCATACAGCAAA

SNP11

ATGCATAGCCTCTTCCTCTCGCTCACAGCAGCTCTAGGACTCGGTGGCCTCCCCCTTTGT[A/T]GCATGCTTGCATACGTACTCGGATATGGAAAACCTAGAATTGCACCCGCAGTTGGAGAGA

SNP12

GTATTACCGCAGACACAAAGTCTGTGAGGTTCATGCAAAGGCCTCTTCTGCAACTGTTGC[A/T]GGAGTCAAGCAACGTTTTTGTCAACAATGCAGCAGGTAACCATTTTTCCCTTCAAATATA

SNP13

AAGAGATTCATGCTTAGTCGACACAGCGAGAAACTTGCAATGGCCTTTGGTCTCATCAGC[A/T]CAAACAAAGGCACAAGAATAAGAATAGTAAAAAACCTGAGAGTATGTTCTGATTGTCATT

SNP14

ATTATTGGCTTCAGGTGCGAGGGGAAAGGTGGCTGCACCATGGAGGTCTGATGTAGATGG[A/T]TGGGATGGTCCTAGCTATGCTTCTTCGAGAAACGCTCAGACCAGTTCGAGAAAGACACTT

SNP15

AGTGGTTAAGGAATCTCTGGAAGAAGTTGAAGTTGAGTACTTAATGTTAGCAGAGGAAGC[A/T]TTAGGCAATGACACTTATGATGAGGATGTATGGATGATATACCCCGATGGTACAACGAAT

SNP16

ATAGAATATCAGAAACACTAGAGGCAATAGTGTCAGCTTTGGACTTGGTTTTGTCTTGGC[A/T]ACATTTTCATCGTTTGCGGTTGTCTCTTCACCCATCAGACAAGTACCACCGGCAGATTTG

SNP17

AGGACGATGTCACTACTCCGAGCCTGGATTGAGATCATTCAGGCGGCGCAAGCCTATTGA[A/T]GACGGCAAGACCTCTTGAGAATGCTCTGAGGGATAAATTTCGATCAGCTCTAACTAGTTT

SNP18

AGTCCTTTACAAACCAGAGATCTAGCAGAGATCATACTTCTCCAGCCATATGACGGGAGT[A/T]GGATCGGATCGGTTCAAGGGGTGAAGCATTCCTATAGTACCGTCCTTTAAAGACTCTAGA

VSNP19

CTATGATGCAAGGAACGAGTTACCTGGGTTCGATCTTCACTTGGGACCAAACAAATGGGA[A/T]AGTGTTAAACTGGAGTCTTCTGAGGGAACAGTTTCCAAAGAGATTATATACTCTGTCTTG

SNP20

ACAGTACGGGAAACACTGGTGGTGGCTCTCTTTCTTCTCCGTCTACGTTTCTCAGCAGGT[A/T]AAGATCCACCAACTGTTCGATGATTTGCCTCAACGAGTAGATTTTCATTTGGTTCTTTTG

SNP21

TGGTATCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTTACAGGAGGTTCAAAGGTGAACCCGT[A/T]ATCCGCACGTGGTTTCCGTTTTGCCCAAAGGCCCGTAATCTGCACGTTGTTTCCGATTGC

SNP22

TAAGCTCACCTGCAGGCAATTTTATTTTTTGATTGATGTTAGTGATTTCAACTGGAATGA[A/T]ACATCTACATGTCTCCATATTTATATGGAGAAAGGAGGTAAACCACAGTGAAGAGAAATA

SNP23

AATCCAAACATCCTTAAAAACCTCATTTTTTATAAAAGCATGGTTCAAACACAAGGCCGG[A/T]AAAAGGACTTACTCGGCCAGTCCAATTACATAAAAAAACGGCAATACTGGGCCAGCACAC

分型23个SNP的引物信息如下：

PrimerID	正向引物序列	反向引物序列
			Primer01	CCAGTAGATTCGTAACGTTAACGGATGGTTAGT	GTCGATCTACTCTTCCTCATCATCCTAACCTTCTT
Primer02	AACATTTGGTGTTGTGTTCTCTTGTTGGAAT	ATGCATCTATGAATGAAGGAGATGAAACTAATGATG
			Primer03	ACAAATCAGCAAATCCTTCATCTGAGGACTATAGT	CGGACTTTGGTGGCCACTGGAAT
Primer04	AGAGGAGGCAAGCCAAAGACTGAGAAT	CAGCTATTTCTCTAGCGTGAGATGTTCCTGAGTAT
			Primer05	ATTAGAGTGTGTGAATACAAAGAAGATGAAGATAAT	TCAATTTGTTCCATCTCTAGGATGTTGACTTGA
Primer06	CCAGCAGATATGTTGACCAAGTGTTTACCTAGT	TAAGTTTTCTTCCTTACACAACTCGAATCTCCCTT
			Primer07	CTCACGCAGCAGTTTCAGGGATAGTAAGT	TCATCACACTACTTTGGAACAAGAAGCTTAAGTACC
Primer08	CTTGTCTTTCTTCACTCCAATAAATCTCATAGCATT	CCGGACGATTCTCACTGACAGTCTCAC
			Primer09	CTTTAGAGAGAAGAAGATTCAAGAGGAGTCTCGAAT	GAAGACAACAAAGCTTCGACCTTTGCAAT
Primer10	GAAGCTTTCATTCAATAAAAGCTAATAGGCAACATT	TTTTGTTTACCGTGGTGTTAATAGGACTCTGTTTTT
			Primer11	GACTCGGTGGCCTCCCCCTTTATT	GTTGAGGAAGAATGGCGTTCTCACCAT
Primer12	GCAAAGGCCTCTTCTGCAACTGTTACT	GGTTGGGTGAGTTGATATTGTTTTATCTGATCTGT
			Primer13	GCAATGGCCTTTGGTCTCATCAACT	TGCTGAGCTTTGGGGTTCTGATCCT
Primer14	GCTGCACCATGGAGGTCTGATGTAGATAGT	GCTCCAACAAGTCCAGACAGGGTCC
			Primer15	GTTGAAGTTGAGTACTTAATGTTAGCAGAGGAAACT	CTGCTCCAGTCCGGTCTAGAAAAGTGC
Primer16	TCAGCTTTGGACTTGGTTTTGTCTTGACT	AACGTCACATCCAATCTTGAATCTGAGAAGTAAA
			Primer17	TCAGGCGGCGCAAGCCTATTAAT	CCAGTTATGTCCCTCTCGATTGACAGACA
Primer18	TCATACTTCTCCAGCCATATGACGGGAATT	AGTCGGTGGTTACGACTCTGCCAAATC
			Primer19	TCTTCACTTGGGACCAAACAAATGGAAT	GAAACTTACCGCTACTGTTGCGTGAGGA
Primer20	TCTTTCTTCTCCGTCTACGTTTCTCAGCAGATT	GATGCCTCGAGTAATACCACAAACCCG
			Primer21	TGTTTACAGGAGGTTCAAAGGTGAACCCATT	TTATGTTATCTCCATTGCTAGTGTTCATGTGATCAG
Primer22	TTTTTGATTGATGTTAGTGATTTCAACTGGAATAAT	ATGCGATAGAAATGGGTGTTTTCTAAAGATGTG
			Primer23	AAAGCATGGTTCAAACACAAGGCCAGT	AATTTCTGAGGTTGAGGAAGAGATTTGGGAG

Claims (2)

1.一种基于PCR的SNP分型方法，其步骤是：

A、选择用于实验的植物样品的组织,植物样品为两个甘蓝型油菜品系的叶片样品：中双11号和73290；

B、将步骤A获得的植物样品用液氮冷冻研磨后提取组织的基因组DNA；

C、将基因组DNA纯化后作为PCR扩增的模板；

D、在甘蓝型油菜的SNP数据库挑选A/T类型的SNP，该步骤中挑选的SNP是通过甘蓝型油菜两个品系：中双11号和73290，solexa重测序5X数据分析得到的SNP，SNP受reads支持的深度最低为4X；

E、在步骤D的结果中筛选出SNP位点前面第三个碱基是G的SNP；

F、用primer3软件设计引物，使正向引物的最后一个碱基位于SNP位点，最后一个碱基为T；该步骤中primer3软件设计引物时Tm值最小为62℃，最大为68℃，温度65℃，扩增片段长度为300到500bp之间；

G、引入错配，将正向引物的倒数第三个碱基变为A；所述的引物为PrimerID01-23所示，对应的包含有SNP位点的序列为SNP01-SNP23所示；

H、按照设计的反应条件进行PCR扩增；

J、将步骤H获得的PCR产物在特定的电压条件和特定的非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度下电泳，电泳条件为1800V电压下电泳80分钟；

K、将步骤J获得的凝胶银染后观察扩增条带的有无，银染的硝酸银浓度为10μg/ml；

SNP01

AAAGAGAGGTGACGATGAAACTTGAGACCCAGTAGATTCGTAACGTTAACGGATGGTTGG[A/T]TGATGCGAATCTTTTCTGGTGGAGAACCAAAACGGCGATGACGGCGTAAGTAACGGCGTG

SNP02

TTCTGTGACATTCTTCTGTAAAGCCTCTTCAACATTTGGTGTTGTGTTCTCTTGTTGGGA[A/T]TGATCTGTGTTGGGCTGCAAAGGAGGAGGCTGGGATGGTAAGTTCTCTGTCTGAGATGCT

SNP03

TGAGGATGAGATGGTGATTCACGTAAACAAATCAGCAAATCCTTCATCTGAGGACTATGG[A/T]ATACCATCGCAGCTTGTGCAGAAATATGTTAAAGGTACATTTATCTTCACTTGAGTCCTT

SNP04

ACCAGCTTAGAAACCAGCTGAGATAGATCAGCATAGAGGAGGCAAGCCAAAGACTGAGGA[A/T]CACATGGTGCATTGTAGTAGTTACATACCTTACGAACAACACCCCCCCCCCCCCCCCCCC

SNP05

GATGTAATGGTTATGGGCACATAAAATTAGAGTGTGTGAATACAAAGAAGATGAAGATGA[A/T]GAGAAGTTGCAGTGATAAGAAGCCAGAGAGAAAAGAAGATGCTCTAAATTTTGTGGCTCT

SNP06

GATCCTAAAGATTCACAATACTCTAAACCCAGCAGATATGTTGACCAAGTGTTTACCTGG[A/T]AGCGCGTTCGAGAAGTGCCTCGTAACGCCGAGGGTCACCGTCTGATCATGTGTCGAAGTA

SNP07

CTTTCTTCCTTACGACATACGCCTCAAGGAGCCTCACGCAGCAGTTTCAGGGATAGTAGG[A/T]AGCACCTTGGCAGCTTGGATCACAGGCCGAGACACGAAGAGGAGGAGTCCGATAACTGCA

SNP08

CATCGCCACTGAGATATGCGCAGCGCTTGTCTTTCTTCACTCCAATAAATCTCATAGCGT[A/T]GTCCACGGTGATTTGAAGGCGGCGAGTGTTCTTCTCGATGCTAATCTCGTTAGCAAGTTA

SNP09

GAGCACTCTCCAGGAAACGCCCTGCCTTTAGAGAGAAGAAGATTCAAGAGGAGTCTCGGA[A/T]CGACACAGACAGAACAAGAACTGAGGAGGCAAAAGACACGAATCTAAACAGTCGCAGACA

SNP10

GAGGCTAAATATTCAAGAAAAAAAGGAAGCTTTCATTCAATAAAAGCTAATAGGCAACGT[A/T]GTATAGGTCCATCAAAAGCTAAAACAGAGTGTAGAGAGCCTAACACAATCATACAGCAAA

SNP11

ATGCATAGCCTCTTCCTCTCGCTCACAGCAGCTCTAGGACTCGGTGGCCTCCCCCTTTGT[A/T]GCATGCTTGCATACGTACTCGGATATGGAAAACCTAGAATTGCACCCGCAGTTGGAGAGA

SNP12

GTATTACCGCAGACACAAAGTCTGTGAGGTTCATGCAAAGGCCTCTTCTGCAACTGTTGC[A/T]GGAGTCAAGCAACGTTTTTGTCAACAATGCAGCAGGTAACCATTTTTCCCTTCAAATATA

SNP13

AAGAGATTCATGCTTAGTCGACACAGCGAGAAACTTGCAATGGCCTTTGGTCTCATCAGC[A/T]CAAACAAAGGCACAAGAATAAGAATAGTAAAAAACCTGAGAGTATGTTCTGATTGTCATT

SNP14

ATTATTGGCTTCAGGTGCGAGGGGAAAGGTGGCTGCACCATGGAGGTCTGATGTAGATGG[A/T]TGGGATGGTCCTAGCTATGCTTCTTCGAGAAACGCTCAGACCAGTTCGAGAAAGACACTT

SNP15

AGTGGTTAAGGAATCTCTGGAAGAAGTTGAAGTTGAGTACTTAATGTTAGCAGAGGAAGC[A/T]TTAGGCAATGACACTTATGATGAGGATGTATGGATGATATACCCCGATGGTACAACGAAT

SNP16

ATAGAATATCAGAAACACTAGAGGCAATAGTGTCAGCTTTGGACTTGGTTTTGTCTTGGC[A/T]ACATTTTCATCGTTTGCGGTTGTCTCTTCACCCATCAGACAAGTACCACCGGCAGATTTG

SNP17

AGGACGATGTCACTACTCCGAGCCTGGATTGAGATCATTCAGGCGGCGCAAGCCTATTGA[A/T]GACGGCAAGACCTCTTGAGAATGCTCTGAGGGATAAATTTCGATCAGCTCTAACTAGTTT

SNP18

AGTCCTTTACAAACCAGAGATCTAGCAGAGATCATACTTCTCCAGCCATATGACGGGAGT[A/T]GGATCGGATCGGTTCAAGGGGTGAAGCATTCCTATAGTACCGTCCTTTAAAGACTCTAGA

SNP19

CTATGATGCAAGGAACGAGTTACCTGGGTTCGATCTTCACTTGGGACCAAACAAATGGGA[A/T]AGTGTTAAACTGGAGTCTTCTGAGGGAACAGTTTCCAAAGAGATTATATACTCTGTCTTG

SNP20

ACAGTACGGGAAACACTGGTGGTGGCTCTCTTTCTTCTCCGTCTACGTTTCTCAGCAGGT[A/T]AAGATCCACCAACTGTTCGATGATTTGCCTCAACGAGTAGATTTTCATTTGGTTCTTTTG

SNP21

TGGTATCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTTACAGGAGGTTCAAAGGTGAACCCGT[A/T]ATCCGCACGTGGTTTCCGTTTTGCCCAAAGGCCCGTAATCTGCACGTTGTTTCCGATTGC

SNP22

TAAGCTCACCTGCAGGCAATTTTATTTTTTGATTGATGTTAGTGATTTCAACTGGAATGA[A/T]ACATCTACATGTCTCCATATTTATATGGAGAAAGGAGGTAAACCACAGTGAAGAGAAATA

SNP23

AATCCAAACATCCTTAAAAACCTCATTTTTTATAAAAGCATGGTTCAAACACAAGGCCGG[A/T]AAAAGGACTTACTCGGCCAGTCCAATTACATAAAAAAACGGCAATACTGGGCCAGCACAC

分型23个SNP的引物信息如下：

2.权利要求1所述的一种基于PCR的SNP分型方法在油菜聚合育种的应用。